ES2436547T3 - Procedimiento para el diagnóstico de una granulomatosis de Wegener - Google Patents

Procedimiento para el diagnóstico de una granulomatosis de Wegener Download PDF

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Abstract

Procedimiento in vitro para la detección de una granulomatosis de Wegener en un sujeto que comprendedeterminar la presencia y/o la cantidad de al menos un anticuerpo anti-células endoteliales (AACE) o anti-célulasmusculares lisas vasculares (CMLV), que es un anticuerpo anti-vinculina, en una muestra biológica que procede deun paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina es indicadora de una granulomatosis de Wegener.

Description

Procedimiento para el diagnostico de una granulomatosis de Wegener
La invencion se refiere a un procedimiento in vitro para la deteccion de una granulomatosis de Wegener, que comprende determinar la presencia y/o la cantidad de anticuerpo (Ac) anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas del musculo liso vasculares (CMLV) anti-vinculina, en una muestra biologica procedente de un paciente tal como se define en las reivindicaciones.
Tecnica anterior
Las vasculitis son enfermedades huerfanas, cuya prevalencia es baja, del orden de 24 a 150 por millon de habitantes. Representan un grupo de enfermedades caracterizadas por la presencia de lesiones inflamatorias en las paredes de los vasos. Las vasculitis se clasifican de acuerdo con el tamano de los vasos afectados y responden a diferentes mecanismos patogenos dominantes: una produccion de citocinas proinflamatorias y una activacion de los macrofagos en las vasculitis que afectan a los vasos de gran calibre, tales como la enfermedad de Horton (o arteritis de celulas gigantes); el deposito de complejos inmunes circulantes responsables de la activacion de la via clasica del complemento, y el reclutamiento de neutrofilos en las vasculitis que afectan a los vasos de tamano medio, tales como la periarteritis nodosa asociada a una infeccion con el virus de la hepatitis B; y una activacion de los neutrofilos por los Ac anti-citoplasma de polinucleares neutrofilos (ANCA), preferiblemente en las vasculitis que afectan a vasos de pequeno calibre, tales como la granulomatosis de Wegener y la poliangitis microscopica.
La enfermedad de Horton se caracteriza por cefaleas debidas a la lesion de la arteria temporal, asociadas con un deterioro del estado general, una seudopoliartritis rizomelica en uno de cada dos casos y en la gran mayoria de los casos, un sindrome inflamatorio,
La granulomatosis de Wegener es una vasculitis granulomatosa que afecta principalmente los senos faciales, el pulmon y el rinon, asociada en las formas sistemicas, en el 90% de los casos, a Ac anti-proteinasa 3.
La poliangitis microscopica es una vasculitis necrosante que afecta a los vasos de pequeno calibre y que puede causar un dano glomerular y de los capilares pulmonares responsable de un sindrome neumo-renal, ademas de manifestaciones sistemicas asociadas con la vasculitis.
El sindrome de Churg-Strauss es un asma de aparicion tardia con evolucion grave asociada a hipereosinofilia y vasculitis necrosante.
Actualmente el diagnostico de una vasculitis positiva para ANCA siempre se basa en una biopsia, ya sea una biopsia cutanea, una biopsia renal, una biopsia neuromuscular u otra. Los ANCA constituyen una ayuda importante en el diagnostico de la vasculitis sistemica. Los ANCA anti-mieloperoxidasa (MPO) estan presentes por tanto en el 60 a 75% de los pacientes que padecen poliangitis microscopica y en el 38% de los pacientes que padecen sindrome de Churg-Strauss. En consecuencia, una proporcion significativa de pacientes no tienen ANCA, lo que hace dificil el diagnostico, la evaluacion del pronostico y el tratamiento terapeutico. Hasta la fecha no existe ningun biomarcador identificado durante el curso de la enfermedad de Horton. El diagnostico de la enfermedad de Horton se basa en la mayoria de los casos en una biopsia de la arteria temporal, que es positiva en el 80% de los casos de enfermedad de Horton.
Por lo tanto, existe una necesidad de identificar marcadores inmunologicos de interes para el diagnostico y/o pronostico durante el curso de la enfermedad de Horton y de identificar otros marcadores inmunologicos de interes, diferentes de los ANCA durante el curso de vasculitis positivas para ANCA. El documento de solicitud internacional WO2004/094638, en japones, se refiere a una busqueda de anticuerpos anti-peroxirredoxina 2 en el suero de pacientes que padecen vasculitis, pero parece ser el unico en este campo.
Desde este punto de vista, los inventores se han centrado en anticuerpos (Ac) anti-celulas endoteliales (AACE), anticuerpos anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV). Especialmente los AACE se detectan y parecen tener un papel clave en la patogenesis de las vasculitis (Guilpain y Mouthon, Clinic Rev. Allerg Immunol, Oct. 2008, 35(12):59-65). Por lo tanto, la fijacion de los AACE a las celulas endoteliales puede conducir a la destruccion de la celula diana por un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de los Ac (ADCC), puede inducir la apoptosis y aumentar la expresion de las moleculas de adhesion. Sin embargo, hasta ahora no se habian identificado las dianas antigenicas de estos anticuerpos.
Gobel et al., American Journal of Kidney Diseases, 1996, 28(2):186-194, se refiere a la presencia de autoanticuerpos anti-celulas endoteliales en el suero de pacientes que padecen granulomatosis de Wegener.
Compendio de la invenci6n
Los inventores han identificado ahora dianas antigenicas de los anticuerpos anti-celulas endoteliales (AACE) y de los anticuerpos anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) en las vasculitis, especialmente en la enfermedad de Horton y las vasculitis positivas para ANCA.
Sobre esta base, la invencion proporciona un procedimiento in vitro para la deteccion de una granulomatosis de Wegener en un sujeto, que comprende determinar la presencia y/o la cantidad de al menos un anticuerpo anticelulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV), que es un anticuerpo anti-vinculina, en una muestra biologica que procede de un paciente, indicando la presencia del anticuerpo anti-vinculina una granulomatosis de Wegener.
En una realizacion particular, el procedimiento de la invencion para detectar una granulomatosis de Wegener comprende ademas la determinacion de la presencia y/o la cantidad de al menos otro anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV), estando dirigido el otro anticuerpo mencionado contra un antigeno seleccionado entre el grupo que consiste en FUbp2 (proteina 2 de union al elemento aguas arriba far, del ingles quot;Far upstream element-binding protein 2quot;), caldesmon, proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa, proteina cognada de choque termico de 71 kDa, precursor mitocondrial de la proteina de estres-70, lamina-A/C, ribonucleoproteina K nuclear heterogenea, subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la proteina de choque termico de 60 kDa, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A1, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3, subunidad zeta (theta) de la proteina 1 del complejo T, subunidad beta de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, ribonucleoproteina H nuclear heterogenea, cadena beta de la tubulina, fructosa-bifosfato aldolasa A, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, precursor de calumenina, reticulocalbina-3, subunidad 13 reguladora no ATPasa del proteasoma 26S, pirofosfatasa inorganica, anexina A5, 14-3-3 proteina epsilon, 6fosfogluconolactonasa, galectina-1, precursor mitocondrial de la succinil-CoA:3-cetoacido-coenzima A transferasa 1 y la ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea, en una muestra biologica procedente de un paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina y dicho al menos otro anticuerpo diferente es indicativa de una granulomatosis de Wegener.
Preferiblemente, la presencia de dicho al menos un anticuerpo en la muestra biologica se compara con un valor testigo, en donde la presencia de dicho al menos un anticuerpo en una cantidad superior al valor testigo es indicativa de una vasculitis o de un riesgo de desarrollar vasculitis.
Descripci6n detallada de la invenci6n
Los inventores han utilizado celulas endoteliales de venas umbilicales humanas normales (HUVEC) como fuente de antigenos y han sometido a ensayo los sueros de pacientes que tienen la enfermedad de Horton o una vasculitis sistemica asociada a anticuerpos anti-citoplasma de polinucleares neutrofilos (ANCA) y de sujetos sanos.
Para identificar las dianas de los anticuerpos, los inventores han utilizado una inmunotransferencia bidimensional, en donde la identificacion de los antigenos se realizaba por espectrometria de masas.
Los inventores tambien han sometido a ensayo sueros de pacientes que padecen la enfermedad de Horton.
Definiciones:
La expresion quot;muestra biologicaquot; se refiere a cualquier muestra biologica que procede de un paciente. Ejemplos de muestras incluyen liquidos biologicos, biopsias de tejidos. Preferiblemente, la muestra puede ser sangre, suero, saliva, orina, semen. Mas preferiblemente, la muestra biologica es una muestra de sangre o suero.
El termino quot;pacientequot; se refiere a cualquier sujeto susceptible de ser sometido a ensayo. Preferiblemente, se trata de un ser humano, pero el termino incluye cualquier mamifero, tal como perros, gatos, roedores, ganado, caballos, monos, etc. El paciente se puede someter a ensayo independientemente de su sexo o edad. El paciente puede ser un sujeto con riesgo de vasculitis, que sea asintomatico o que presente signos tempranos o avanzados de vasculitis. El termino quot;diagnosticoquot; significa la identificacion de la patologia o la evaluacion del estado de gravedad de la patologia.
El termino quot;pronosticoquot; significa evaluacion del riesgo de empeoramiento, y de sus consecuencias.
La expresion quot;valor testigoquot; se refiere a un valor basal que se corresponde a la media de los valores obtenidos con la muestra biologica de sujetos sanos, no afectados por una vasculitis o una enfermedad susceptible de causar vasculitis. Puede ser un valorestadistico de referencia.
Para evaluar la evolucion de la patologia, puede ser util someter a ensayo a un paciente y controlar el efecto de un tratamiento o la evolucion de la patologia, sometiendo a ensayo de nuevo al paciente, por ejemplo, con varios meses de intervalo. En ese caso, los resultados de la segunda prueba se comparan con los resultados de la primera prueba, y tambien frecuentemente con el valor denominado quot;testigoquot;.
Una cantidad de anticuerpos quot;superior al valor testigoquot; generalmente significa un aumento estadisticamente significativo, por ejemplo, de al menos dos desviaciones estandar por encima de la media de las densidades opticas de las reactividades de IgG de todos los sujetos sanos.
Por quot;antigeno de capturaquot; se entiende un antigeno, preferentemente fijado a una fase solida que es capaz de retener al menos un anticuerpo mencionado, presente en una muestra biologica, por union por afinidad. El antigeno de captura se puede marcar.
El termino quot;marcadoquot; se refiere tanto a un etiquetado directo (por medio de enzimas, radioisotopos, fluorocromos, compuestos luminiscentes, etc.) como a un etiquetado indirecto (por ejemplo, por medio de anticuerpos que ellos mismos estan marcados de forma directa o con ayuda de reactivos de una quot;pareja de afinidadquot; marcada, tal como, pero no limitadas a las mismas, la pareja de avidina marcada-biotina, etc.
Por quot;vasculitisquot; se entiende cualquier vasculitis sistemica primaria, asi como vasculitis secundarias, en particular, vasculitis medicamentosa, vasculitis asociada a conectividad o vasculitis de origen infeccioso. Las vasculitis dirigidas incluyen por tanto las vasculitis que afectan a los vasos de pequeno calibre, como la granulomatosis de Wegener, la poliangitis microscopica y el sindrome de Churg-Strauss, las vasculitis que afectan a los vasos de calibre medio, como la periarteritis nodosa, las vasculitis que afectan a vasos de gran calibre, tales como la enfermedad de Horton.
Anticuerpos identificados:
Tal y como se indica en la seccion quot;ejemplosquot;, los inventores han identificado diversos anticuerpos anti-celulas
endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV) en pacientes que tienen vasculitis. Estas dianas antigenicas estan implicadas principalmente en el estres oxidativo, el metabolismo celular y el mantenimiento de la homeostasis celular.
La deteccion y/o la cuantificacion de estos anticuerpos se puede utilizar para detectar una vasculitis.
Los antigenos reconocidos por los anticuerpos identificados se enumeran a continuacion (veanse tambien las tablas 1 a 9 de la parte de quot;Ejemplosquot;). Tambien se adjunta un listado de estas secuencias de proteinas. Los numeros de orden en la base de datos Swiss-Prot y las secuencias correspondientes se proporcionan a titulo
indicativo. Vinculina (Swiss-Prot: P18206, SEQ ID NO: 1) FUbp2 (proteina 2 de union al elemento aguas arriba far) (Swiss-Prot: Q92945, SEQ ID NO: 2) Caldesmon (Swiss-Prot: Q92945, SEQ ID NO: 3) Proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa (quot;78 kDa glucose-regulated protein precursorquot;) (Swiss-Prot:
P11021, SEQ ID NO: 4) Proteina cognada de choque termico de 71 kDa (Swiss-Prot: P11142, SEQ ID NO: 5) Precursor mitocondrial de la proteina de estres-70 (Swiss-Prot: P38646, SEQ ID NO: 6) Lamina-A/C (Swiss-Prot: P02545, SEQ ID NO: 7) Ribonucleoproteina K nuclear heterogenea (Swiss-Prot: P61978, SEQ ID NO: 8) Subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T (Swiss-Prot: P48643, SEQ ID NO: 9) Precursor mitocondrial de la proteina de choque termico de 60 kDa (Swiss-Prot: P10809, SEQ ID NO: 10) Precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A1 (Swiss-Prot: P07237, SEQ ID NO: 11) Precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3 (Swiss-Prot: P30101, SEQ ID NO: 12) Subunidad zeta (theta) de la proteina 1 del complejo T (Swiss-Prot: P50990, SEQ ID NO: 13) Subunidad beta de la proteina 1 del complejo T (Swiss-Prot: P78371, SEQ ID NO: 14) Precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa (Swiss-Prot: P25705, SEQ ID NO: 15) Ribonucleoproteina H nuclear heterogenea (Swiss-Prot: P31943, SEQ ID NO: 16) Cadena beta de la tubulina (Swiss-Prot: P07437, SEQ ID NO: 17) Fructosa-bifosfato aldolasa-A (Swiss-Prot: P04075, SEQ ID NO: 18) Precursor de calumenina (Swiss-Prot: O43852, SEQ ID NO: 19) Reticulocalbina-3 (Swiss-Prot: Q96D15, SEQ ID NO: 20)
Subunidad 13 reguladora no ATPasa del proteasoma 26S (Swiss-Prot: Q9UNM6, SEQ ID NO: 21) Pirofosfatasa inorganica (Swiss-Prot: Q15181, SEQ ID NO: 22) Anexina A5 (Swiss-Prot: P08758, SEQ ID NO: 23) 14-3-3 proteina epsilon (Swiss-Prot: P62258, SEQ ID NO: 24) 6-fosfogluconolactonasa (Swiss-Prot: O95336, SEQ ID NO: 25) Galectina-1 (Swiss-Prot: P09382, SEQ ID NO: 26) Precursor mitocondrial de la succinil-CoA:3-cetoacido-coenzima A transferasa 1 (Swiss-Prot: P55809, SEQ ID NO: 27) Ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea (Swiss-Prot: Q14103, SEQ ID NO: 28) Subunidad 7 reguladora de la proteasa 26S (Swiss-Prot: P35998, SEQ ID NO: 29) Hemo oxigenasa 2 (Swiss-Prot: P30519, SEQ ID NO: 30) Histona H2B tipo F-S (Swiss-Prot: P57053, SEQ ID NO: 31) Subunidad alfa tipo-5 del proteasoma (Swiss-Prot: P28066, SEQ ID NO: 32) Subunidad beta tipo-2 del proteasoma (Swiss-Prot: P49721, SEQ ID NO: 33) Proteina 4 asociada al citoesqueleto (Swiss-Prot: Q07065, SEQ ID NO: 34) Descarboxilasa de uroporfirinogeno (Swiss-Prot: P06132, SEQ ID NO: 35) Adenina fosforribosiltransferasa (Swiss-Prot: P07741, SEQ ID NO: 36) Profilina-1 (Swiss-Prot: P07737, SEQ ID NO: 37) Plastina-3 (Swiss-Prot: P13797, SEQ ID NO: 38) Proteina 2 unida al receptor del factor de crecimiento (Swiss-Prot: P62993, SEQ ID NO: 39) Ribonucleoproteina L nuclear heterogenea (Swiss-Prot: P14866, SEQ ID NO: 40) Precursor de la Reticulocalbina-1 (Swiss-Prot: Q15293, SEQ ID NO: 41) Serpina B9 (Swiss-Prot: P50453, SEQ ID NO: 42) Precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la isocitrato-deshidrogenasa [NAD] (Swiss-Prot: P50213, SEQ ID NO: 43) GMP-sintasa [que hidroliza la glutamina] (Swiss-Prot: P49915, SEQ ID NO: 44) Subunidad zeta de la proteina 1 del complejo T (Swiss-Prot: P40227, SEQ ID NO: 45) Cofilina-1 (Swiss-Prot: P23528, SEQ ID NO: 46) Precursor mitocondrial de la aconitato-hidratasa (Swiss-Prot: Q99798, SEQ ID NO: 47) Proteina de la membrana interna de las mitocondrias (Swiss-Prot: Q16891, SEQ ID NO: 48) Ribonucleoproteina K nuclear heterogenea (Swiss-Prot: P61978, SEQ ID NO: 49) Precursor mitocondrial del factor de elongacion Tu (Swiss-Prot: P49411, SEQ ID NO: 50) Alcohol deshidrogenasa [NADP+] (Swiss-Prot: P14550, SEQ ID NO: 51) Acido sialico sintasa (Swiss-Prot: Q9NR45, SEQ ID NO: 52) S-formilglutation hidrolasa (Swiss-Prot: P10768, SEQ ID NO: 53) Subunidad 1 similar a beta-2 de la proteina de union al nucleotido guanina (Swiss-Prot: P63244, SEQ ID NO: 54) Purina nucleosido fosforilasa (Swiss-Prot: P00491, SEQ ID NO: 55)
Prohibitina (Swiss-Prot: P35232, SEQ ID NO: 56) Precursor mitocondrial de la proteina de union a C1q (Swiss-Prot: Q07021, SEQ ID NO: 57) ATPasa del reticulo endoplasmico de transicion (Swiss-Prot: P55072, SEQ ID NO: 58) y Nucleosido difosfato cinasa A (Swiss-Prot: P15531, SEQ ID NO: 59), asi como Anexina A2 (Swiss-Prot: P07355, SEQ ID NO: 60) Alfa-enolasa (Swiss-Prot: P06733, SEQ ID NO: 61) FUbp1 (proteina 1 de union al elemento aguas arriba far) (Swiss-Prot: Q96AE4, SEQ ID NO: 62) Precursor mitocondrial de la dihidrolipoil deshidrogenasa (Swiss-Prot: P09622, SEQ ID NO: 63) Inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa 2 (Swiss-Prot: P12268, SEQ ID NO: 64) Precursor 1 de la tripeptidil-peptidasa (Swiss-Prot: PO14773, SEQ ID NO: 88) Precursor mitocondrial de la fumarato hidratasa (Swiss-Prot: P07954, SEQ ID NO: 65) Ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea (Swiss-Prot: Q14103, SEQ ID NO: 66) Proteina 1 de los dominios PDZ y LIM (Swiss-Prot: O00151, SEQ ID NO: 67) Proteina ribosomica P0 acida 60S (Swiss-Prot: P05388, SEQ ID NO: 68) Proteina 2 del canal selectivo de aniones dependiente de voltaje (Swiss-Prot: P45880, SEQ ID NO: 69) Proteina DJ-1 (Swiss-Prot: Q99497, SEQ ID NO: 70) Peptidil-prolil cis-trans isomerasa A (Swiss-Prot: P62937, SEQ ID NO: 71) Precursor mitocondrial de la peroxido reductasa dependiente de tiorredoxina (Swiss-Prot: P30048, SEQ ID NO: 72) Precursor del miembro 11 de la subfamilia B homologo a DNAJ (Swiss-Prot: Q9UBS4, SEQ ID NO: 73) Glutarredoxina-3 (Swiss-Prot: PO76003, SEQ ID NO: 74) Proteina inhibidora 2 de la disociacion de GDP en Rho (Swiss-Prot: P52566, SEQ ID NO: 75) Glutation-S-transferasa P (Swiss-Prot: P09211, SEQ ID NO: 76) y Peroxirredoxina (Swiss-Prot: P32119, SEQ ID NO: 77) y tambien Proteina putativa de choque termico HSP 90-alfa A2 (Swiss-Prot: Q14568, SEQ ID NO: 78) Subunidad alfa del coatomero (Swiss-Prot: P53621, SEQ ID NO: 79) UDP-glucosa 6-deshidrogenasa (Swiss-Prot: O60701, SEQ ID NO: 80) Actina, citoplasmica 1 (Swiss-Prot: P60709, SEQ ID NO: 81) Miembro E de la familia del dominio de anquirina POTE (Swiss-Prot: Q6S8J3, SEQ ID NO: 82) Nucleofosmina (Swiss-Prot: P06748, SEQ ID NO: 83) Factor de elongacion 2 (Swiss-Prot: P13639, SEQ ID NO: 84) Miembro 1 de la subfamilia A, homologo a DnaJ (Swiss-Prot: P31689, SEQ ID NO: 85) Actina, citoplasmica 2 (Swiss-Prot: P63261, SEQ ID NO: 86) Subunidad 8 reguladora de la proteasa 26S (Swiss-Prot: P62195, SEQ ID NO: 87). Entre los autoanticuerpos detectados, varios son particularmente relevantes. Se trata de los anticuerpos dirigidos contra los siguientes antigenos:
Caldesmon
Proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa
Proteina cognada de choque termico de 71 kDa
Subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T
Precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3
o
Precursor de calumenina,
y especialmente los anticuerpos dirigidos contra vinculina o lamina.
Los seis primeros antigenos son reconocidos por mas del 60% de los grupos de tres sueros de pacientes que padecian granulomatosis de Wegener sometidos a ensayo, dos de ellos (caldesmon y el precursor de calumenina) tambien fueron reconocidos por los grupos de tres sueros de pacientes que tenian sindrome de Churg-Strauss sin ANCA.
Los anticuerpos identificados por los inventores se pueden utilizar en los procedimientos descritos, solos o combinados. La deteccion y/o la cuantificacion se puede realizar con respecto a uno solo de los anticuerpos identificados, o puede referirse a una pluralidad de anticuerpos. Tambien se puede imaginar la realizacion del procedimiento sobre un soporte solido, tal como una microplaca, sobre la que se disponen de forma ordenada y definida los antigenos que se corresponden a la pluralidad de anticuerpos que se van a detectar y/o cuantificar.
De acuerdo con una realizacion, los procedimientos descritos ponen en practica la deteccion de un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en la tabla 1, 8 o 9, para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento de una granulomatosis de Wegener.
Mas particularmente, se describe un procedimiento para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento de una granulomatosis de Wegener, comprendiendo dicho procedimiento la deteccion de un anticuerpo dirigido contra un antigeno seleccionado entre caldesmon, proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa, proteina cognada de choque termico de 71 kDa, subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T, precursor proteico de la disulfuroisomerasa A3 o precursor de calumenina.
De acuerdo con otra realizacion, los procedimientos descritos ponen en practica la deteccion de un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en la tabla 2 o la tabla 5 para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento de una poliangitis microscopica. Mas particularmente, los procedimientos descritos pueden utilizar la deteccion de un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en la tabla 2, 8 o 9 para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento de una poliangitis microscopica con ANCA anti-MPO. Por otra parte, los procedimientos descritos se pueden utilizar para detectar un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en la tabla 5, 8 o 9 para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento de una poliangitis microscopica sin ANCA anti-MPO.
De acuerdo con otra realizacion, los procedimientos descritos ponen en practica la deteccion de un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en la tabla 3 o 4, 8 o 9 para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento del sindrome de Churg-Strauss.
Mas especificamente, los procedimientos descritos ponen en practica la deteccion de un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en la tabla 3, 8 o 9 para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento del sindrome de Churg-Strauss con ANCA anti-MPO.
Por otra parte, los metodos descritos se pueden utilizar para detectar un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en la tabla 4 para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento de un sindrome de Churg-Strauss sin ANCA anti-MPO.
De acuerdo con otra realizacion, los procedimientos descritos ponen en practica la deteccion de un anticuerpo dirigido contra un antigeno identificado en una de las tablas 6, 7, 8 o 9 para el diagnostico, el pronostico o el seguimiento de una enfermedad de Horton, siendo preferentemente el antigeno vinculina o lamina.
Ensayo de los anticuerpos:
La muestra biologica es preferiblemente una muestra de suero, preferiblemente diluido 1:100 o mas, por ejemplo,
1:200 o 1:400.
Ventajosamente, la cantidad de anticuerpo se puede determinar con un inmunoensayo.
La muestra biologica se puede tratar opcionalmente en una etapa preliminar, o se pone directamente en presencia de al menos un antigeno de captura.
El procedimiento de acuerdo con la invencion se puede realizar segun diversos formatos bien conocidos por el experto en la tecnica: en fase solida o en fase homogenea; en una etapa o en dos etapas; en metodo competitivo, a titulo de ejemplos no limitativos.
Segun una realizacion preferida, el antigeno de captura se inmoviliza sobre una fase solida. Se puede utilizar, a titulo de ejemplos no limitativos de fase solida, microplacas, especialmente microplacas de poliestireno, tales como las comercializadas por la empresa Nunc, Dinamarca. Tambien se pueden utilizar particulas o perlas solidas, perlas paramagneticas, tales como las proporcionadas por Dynal o Merck-Eurolab (Francia) (bajo la marca Estapor@) o tambien tubos de ensayo de poliestireno o polipropileno, etc.
Un formato de inmunoensayo para la deteccion de anticuerpos mediante competicion tambien es posible. Otras modalidades de inmunoensayo tambien son posibles y son bien conocidas por la persona experta en la tecnica.
Ensayos de ELISA, radioinmunoensayos o cualquier otra tecnica de deteccion, se pueden utilizar para revelar la presencia de complejos antigeno-anticuerpo formados.
De acuerdo con una realizacion particularmente preferida, el antigeno de captura se corresponde a una proteina completa o a un fragmento de dicha proteina. Por ejemplo, el procedimiento de la invencion comprende poner en contacto una muestra biologica con una proteina completa reconocida por el anticuerpo que se va a detectar y/o cuantificar.
En un ejemplo particular, el antigeno de captura se puede acoplar a una glutation S-transferasa (GST), antes de ser depositado sobre una microplaca. A titulo ilustrativo, las muestras de suero que se van a someter a ensayo, por ejemplo, diluidas 1:100, se incuban sobre la microplaca. Despues del lavado, se anaden anticuerpos anti-Fcy humanos marcados (por ejemplo, con fosfatasa alcalina), los complejos se revelan (por ejemplo, mediante la adicion de un sustrato de la fosfatasa cuya escision se puede detectar mediante la lectura de la absorbancia).
Pacientes diana:
Los pacientes diana padecen una vasculitis, se sospecha que padecen vasculitis o son propensos a desarrollar vasculitis.
Se puede tratar de vasculitis en pacientes positivos para ANCA, o en pacientes que no tienen autoanticuerpos ANCA.
Los metodos descritos permiten diagnosticar, pronosticar o realizar un seguimiento de cualquier tipo de vasculitis y, especialmente, de una granulomatosis de Wegener, una poliangitis microscopica, un sindrome de Churg-Strauss o una enfermedad de Horton.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion sin limitar su alcance.
Ejemplos
Ejemplo 1: Caracterizacion de las dianas antigenicas de los anticuerpos AACE en las vasculitis positivas para ANCA
Los sueros de 45 pacientes que tenian vasculitis positiva para ANCA (15 que tenian granulomatosis de Wegener (WG), 12 que tenian poliangitis microscopica (MPA), 12 que tenian sindrome de Churg-Strauss (CSS)) se sometieron a ensayo en grupos de tres y se compararon con un grupo de sueros de 12 individuos sanos. Las reactividades de las IgG sericas se analizaron mediante electroforesis en gel en dos dimensiones, seguidas de inmunotransferencias utilizando los antigenos de celulas endoteliales de venas umbilicales humanas normales (HUVEC) (veanse Servettaz et al., Proteomics marzo de 2008; 8(5):1000-8).
Las IgG sericas de los grupos de pacientes que padecian WG con ANCA anti-proteinasa 3 (PR3) (n = 5), MPA con ANCA anti-mieloperoxidasa (MPO) (n = 2), MPA sin ANCA anti-MPO (n = 2), CSS con ANCA con anti-MPO (n = 1) y CSS sin ANCA anti-MPO (n = 2), reconocian 107 ± 17, 148, 211, 128 y 101 manchas proteicas, respectivamente, mientras que las IgG sericas de sujetos sanos reconocian 79 manchas proteicas. Las IgG sericas de pacientes que padecian WG con anti-PR3, MPA con anti-MPO, MPA sin anti-MPO, CSS con anti-MPO y CSS sin anti-MPO, reconocian especificamente 37, 12, 22, 15 y 23 manchas proteicas, respectivamente. Los antigenos diana estaban implicados en el estres oxidativo, el metabolismo celular y otras funciones biologicas celulares clave.
Metodo de identificacion:
Electroforesis bidimensional
Los inventores utilizaron un pH de 3 a 10 y un gradiente de acrilamida del 7% al 18% en todos los experimentos, lo que ha permitido estudiar un gran numero de antigenos de 10 a 200 kDa.
Las proteinas se sometieron a un enfoque isoelectrico en el sistema Protean IEF Cell, tal y como se describe en Gorg et al., 2000, Electrophoresis, 21(6):1037-53).
En pocas palabras, inmediatamente despues del enfoque isoelectrico, las muestras se descongelaron y se diluyeron en tampon IPG que contenia urea ultrapura 7 M (VWR, Fontenay-Sous-Bois, Francia), tiourea 2 M (Sigma), 4% de CHAPS (Sigma), 0,002% de Triton X100 (Sigma), 60 1l de vehiculo anfolito de pH 3-10 (Pharmalytes 3-10, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) y azul de bromofenol (Sigma). Para la preparacion de los geles 2-D, se cargaron 100 1g de proteinas de HUVEC sobre tiras de IPG. Estas se rehidrataron y se sometieron a electroforesis automatizada durante 12 horas a 50 V, 1 h a 200 V, 1 h a 1000 V y 7 h a 10.000 V (6 h lineal y 1 h rapido).
Antes de la segunda dimension, las tiras se equilibraron durante 15 min en 10 ml de la primera solucion de equilibrado (Tris 51 mM [Amersham Biosciences], urea 6 mM, 40% (v/v) de glicerol, SDS 52 mM [Amersham Biosciences], DTT 32,4 mM) despues durante 20 min en una segunda solucion de equilibrado (Tris 51 mM, urea 6 mM, 40% [v/v] de glicerol, SDS 52 mM, yodoacetamida 86,5 mM). Las bandas equilibradas se trasladaron a un gel con un gradiente de 7%-18% de poliacrilamida. Diez microlitros de marcadores del peso molecular (PM) Precision Plus Protein Unstained Standards (Bio-Rad), se cargaron en cada gel. La segunda dimension se llevo a cabo en un sistema Laemmli sobre geles con gradientes lineales de 7%-18% de poliacrilamida (20 cm x 20 cm x 1,5 mm): de una solucion al 18,5% de acrilamida PAGE (Amersham Biosciences) 2,5 M, piperazina diacrilamida/diacrilil (PDA) (Bio-Rad) 24,7 mM, Tris-HCl 0,375 M (Amersham Biosciences), pH 8,8, glicerol (Sigma) al 15% (v/v), SDS 3,5 mM, TEMED (Bio-Rad) al 0,05% ( v/v) y persulfato de amonio (APS) (Bio-Rad) 1,6 mM, y se mezclo una solucion al 7% de acrilamida 1,0 M, PDA 10 mM, Tris-HCl 0,375 M, pH 8,8, SDS 3,5 mM, agua bidestilada, TEMED al 0,06% (v/v), y APS 2,4 mM. Los geles de IPG equilibrados se sellaron en la parte superior de los geles de poliacrilamida con 1% de agarosa que contenia azul de bromofenol, y se anadio tampon de electroforesis (Tris 24,8 mM, glicina 192 mM y 0,1% de SDS). Los geles se sometieron a electroforesis inicialmente a 40 V (constante) durante 1 h y despues a 15 mA/gel durante 21 h 15 min.
Electrotransferencia e inmunotransferencia
Los geles se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) mediante transferencia semiseca (Bio-Rad) a 320 mA durante 1 h 30 min. Despues de bloquear con PBS-Tween al 0,2% durante 90 min, las membranas se incubaron durante una noche a 4°C con los grupos de sueros de 3 pacientes, fenotipicamente identicos (granulomatosis de Wegener, poliangitis microscopica o sindrome de Churg-Strauss) y los grupos de sueros de 14 donantes de sangre sanos, con una dilucion de 1:100. Las membranas se lavaron antes de la incubacion con un segundo Ac de conejo anti-Fcy humano acoplado a fosfatasa alcalina (Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 90 min a temperatura ambiente. Las inmunorreactividades se revelaron mediante el uso de un sustrato de NBT-BCIP (Sigma). Las reactividades especificas se determinaron mediante un densitometro (GS-800, Bio-Rad) con ayuda del programa informatico Quantity One (Bio-Rad). Despues las membranas se tineron con oro coloidal (Protogold, British Biocell International, Cardiff, Reino Unido) y se sometieron a un segundo analisis densitometrico para registrar las manchas de proteinas marcadas para cada gel.
Etiquetado de los geles
Los geles analiticos se tineron con nitrato de plata amoniacal.
Analisis de las imagenes de los geles y transferencias 2-D
Las imagenes de los geles y de las membranas obtenidas con ayuda de un densitometro GS-800 (Bio-Rad) se analizaron mediante el sistema de Image Master 2-D Platinum 6 (Amersham Biosciences), antes y despues de la tincion con oro coloidal. Las marcaciones especificas se relacionaron manualmente con manchas proteicas examinadas con IgG en ambas imagenes. El algoritmo transferia automaticamente estas marcas de la imagen de la transferencia 2D tenida con oro coloidal a las imagenes de los geles tenidos con nitrato de plata.
Digestion del gel con tripsina
La digestion del gel se llevo a cabo con el robot Freedom EVO 100 para digestion/manchas (Tecan, Mannedorf, CH). Las manchas se decoloraron dos veces con una mezcla de bicarbonato de amonio 100 mM (ABC) y 50% de ACN durante 45 min a 22°C y despues se secaron con 100% de ACN durante 15 min. A continuacion, se sometieron a un tratamiento con ABC 25 mM que contenia DTT 10 mM durante 1 hora a 60°C y luego se alquilaron con yodoacetamida 55 mM en ABC 25 mM durante 30 minutos en la oscuridad a 22°C. Los trozos de gel se lavaron dos veces en ABC 25 mM y se redujeron dos veces en 100% de ACN durante 15 min y se secaron en 100% de ACN durante 10 min. Las cintas estaban completamente deshidratadas despues de 1 h a 60°C. Los trozos de gel se incubaron en 13 1l de tripsina (Secuencing Grade Modified Trypsin de Promega, WI, EE.UU.; 12,5 1g/ml en ABC 40 mM-10% de ACN, pH 8,0) durante una noche a 40°C. Despues de la digestion, los peptidos se lavaron con 30 1l de ABC 25 mM, se redujeron con 100% de ACN y se extrajeron dos veces con una mezcla de 50% de ACN-5% de acido formico (FA). Los extractos se secaron despues por centrifugacion al vacio (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Por ultimo, los peptidos se desalaron usando C18-ZipTips (Millipore) y dos eluciones, la primera con 50% de ACN5% de FA y luego con 80% de ACN-5% de FA. Las eluciones reagrupadas se pusieron a secar a temperatura ambiente.
Identificacion de las proteinas mediante espectrometria de masas (MS)
Para los analisis MS y MS/MS, se disolvieron los peptidos en 4 1l de CHCA (5 mg/ml en ACN al 50%-TFA al 0,1%). Un microlitro y medio de cada muestra se deposito directamente sobre una placa MALDI (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las gotas se dejaron secar a temperatura ambiente. En el analisis de las muestras se utilizo un espectrometro de masas MALDI-TOF-TOF 4800 (Applied Biosystems). La adquisicion de los espectros y su procesamiento se realizo mediante el programa informatico 4000 series explorer (Applied Biosystems) version 3.5.28193. El calibrado externo de la placa se realizo con 4 puntos depositados en las 4 esquinas de la placa con una mezcla de cinco patrones externos (PepMix 1 LaserBio Labs, Sophia Antipolis, Francia). Las masas de los peptidos se adquirieron por etapas de 50 espectros de 900 a 4000 Da. Los espectros MS se anadieron a partir de 1000 disparos laser con un laser Nd-YAG que funcionaba a 355 nm y 200 Hz. Despues de filtrar los picos contaminantes de tripsina, queratina y de la matriz, se seleccionaron hasta 15 iones parentales para una fragmentacion MS/MS posterior, de acuerdo con su masa, la intensidad de la senal, la relacion senal ruido y la ausencia de masas vecinas en el espectro MS. Los espectros MS/MS fueron adquiridos en modo 1 kV positivo y se anadieron 1.000 disparos 50 a 50. La investigacion en bases de datos se llevo a cabo utilizando el programa informatico Mascot 2.2 (MatrixScience, Londres, Reino Unido) a traves de un GPS Explorer (Applied Biosystems) version 3.6 que combinaba las interrogaciones MS y MS/MS con las proteinas humanas del banco de datos Swissprot 54.5 (www.expasy.org). Los parametros de busqueda fueron los siguientes: posible carbamidometilacion de las cisteinas y posible oxidacion de las metioninas. Estaba permitido hasta una escision tripsinica y una tolerancia de 30 ppm para la exactitud la masa de los precursores y se permitio 0,3 Da para los fragmentos en todas las busquedas de masas tripsinicas.
La identificacion se basaba en una puntuacion Mascot por encima del nivel de significacion (es decir, lt;5%). En el caso en el que los peptidos se corresponden a multiples miembros de una familia de proteinas, la proteina referida es la que tiene el mayor numero de coincidencias (quot;coincidencias de peptidoquot;).
Resultados:
Los inventores han identificado 37 manchas proteicas que se corresponden a 28 antigenos diana diferentes, reconocidos especificamente por las IgG de al menos el 20% de los pacientes que tienen granulomatosis de Wegener, 15 manchas proteicas que se corresponden a 14 antigenos diana reconocidos especificamente por los pacientes que tienen poliangitis microscopica sin Ac anti-MPO, 5 antigenos diana reconocidos especificamente por los pacientes que tienen poliangitis microscopica con Ac anti-MPO, 15 manchas proteicas que se corresponden a 10 antigenos diana reconocidos especificamente por los pacientes que tienen sindrome de Churg-Strauss sin Ac anti-MPO y 7 antigenos diana reconocidos especificamente por los pacientes que tienen sindrome de Churg-Strauss con Ac anti-MPO.
Los resultados detallados se presentan en las tablas 1-5 a continuacion.
Espectrometria de masas
N° enel gel Proteina Numero de orden Swiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado
Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion de iones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
1165 Subunidad 13 reguladora no ATPasadel proteasoma 26S PSD13�HUMAN 43/40 5,5/6,3 1328 Pirofosfatasa inorganica IPYR �HUMAN 33/34 5,5/6 1359 Anexina A5 ANXA5�HUMAN 36/33 4,9/5,3 1480 14-3-3 proteina epsilon 1433E�HUMAN 29/28 4,6/5,2 1514� 6fosfogluconolactonasa 6PGL�HUMAN 28/26 5,7/6,1 1860� Galectina-1 LEG1�HUMAN 15/15 5,3/5,3 2137 Caldesmon CALD1�HUMAN 93/75 5,6/6,9 2151� Precursor mitocondrial de la succinil-CoA:3cetoacido-coenzima A transferasa 1 SCOT �HUMAN 56/60 7,1/6,8 2161� Ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea HNRPD�HUMAN 38/46 7,6/9,3
4/69/1110/124/46/74/42/25/63/3 59359538276214156113200158 2782861156249696877 18475226363442111
MSMS y MS+MSMS
Todas las manchas en esta tabla son reconocidas por los pacientes que padecen granulomatosis de Wegener y no por los sujetos sanos, las manchas con un asterisco sonreconocidas especificamente por los pacientes que padecen granulomatosis de Wegener y no por los pacientes que padecen otras vasculitis. Los antigenos en negrita sonreconocidos por las IgG sericas de mas del 60% de los grupos de 3 sueros de pacientes que padecen granulomatosis de Wegener
Tabla 2. Antigenos diana de los AACE en pacientes que tienen poliangitis microscopica con ANCA anti-MPO
Espectrometria de masas
N° enel gel Proteina Numero de ordenSwiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado
Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion de iones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
851 Subunidad 7 reguladora de la proteasa 26S PRS7�HUMAN 49/50 5,7/6,3 2077 Hemo oxigenasa 2 HMOX2�HUMAN 36/36 5,3/5,8 2088 Histona H2B de tipo F-S H2BFS�HUMAN 14/22 10,4/5,8 2126 Subunidad alfa de tipo-5 del proteasoma PSA5�HUMAN 26/34 4,7/5,7 2143 Subunidad beta de tipo2 del proteasoma PSB2�HUMAN 23/32 6,5/7,1
10/142/72/44/55/5 3067777210236 6854609168 3635332432
Tabla 3. Antigenos diana de los AACE en pacientes que tienen sindrome de Churg-Strauss con ANCA anti-MPO
Espectrometria de masas
N° enel gel Proteina Numero de orden Swiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado
Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion deiones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
671 Proteina 4 asociada alcitoesqueleto CKAP4�HUMAN 5,6/5,2 66/67 1123 Uroporfirinogen descarboxilasa DCUP� HUMAN 41/43 5,8/5,7 1669 Adeninafosforibosiltransferasa APT �HUMAN 20/20 5,8/5,9 1836 Profilina-1 PROF1�HUMAN 15/15 8,4/8,3 2083 Plastina-3 PLST �HUMAN 70/73 5,5/6,3 2146 Proteina 2 unida al receptor del factor de crecimiento GRB2�HUMAN 25/25 5,9/6,4 2152 Ribonucleoproteina L nuclear heterogenea HNRPL HUMAN 64/69 8,5/7,3
3/63/3 6/65/99/175/74/10 8045 25128438810452 3216 6278913719 1275572343224
Tabla 4. Antigenos diana de los AACE en pacientes que tienen sindrome de Churg-Strauss sin ANCA anti-MPO
Espectrometria de masas
N° enel gel Proteina Numero de orden Swiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion deiones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
370 Proteina 2 de union al elemento aguas arribafar FUBP2�HUMAN 73/91 6,8/7,1 382 Proteina 2 de union al elemento aguas arribafar FUBP2�HUMAN 73/91 6,8/7,1 382 Proteina 2 de union al elemento aguas arribafar FUBP2�HUMAN 73/92 6,8/7,3 387 Proteina 2 de union al elemento aguas arribafar FUBP2�HUMAN 73/91 6,8/7,1 387 Proteina 2 de union al elemento aguas arribafar FUBP2�HUMAN 73/91 6,8/7,1 1049 Precursor de lareticulocalbina-1 RCN1�HUMAN 39/46 4,9/4,4 Prec�rsor de la cal�menina C �� N R R 1105 Serpina B9 SPB9�HUMAN 42/43 5,6/6,2 1281 Precursor mitocondrialde la subunidad alfa de la isocitratodeshidrogenasa [NAD] IDH3A�HUMAN 40/37 6,5/6,1 1808 Profilina-1 PROF1�HUMAN 15/15 8,4/8,9 2108 GMP sintasa [que hidroliza la glutamina] GUAA�HUMAN 77/75 6,4/7,1 2132 Subunidad zeta de la proteina 1 del complejo T TCPZ�HUMAN 58/88 6,2/7,5 Caldesm6n C �D �� N R R 2141 Cofilina-1 COF1�HUMAN 18/17 8,2/8,2
4/86/96/92/92/95/86/123/52/37/112/34/6 15117417490901431821193917239242 645959535398645923452068 16161617173031152723640
los antigenos en negrita son reconocidos igualmente por las IgG sericas de mas del 60% en peso de los grupos de 3 sueros de pacientes que padecen granulomatosis de Wegener
Espectrometria de masas
N° enel gel Proteina Numero de orden Swiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado
Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion deiones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
endoplasmico transicional 2162 Nucleosido difosfato cinasa A NDKA�HUMAN 17/16 5,8/6,2
4/5 170 81 36
MSMS y MS+MSMS
Ejemplo 2: Caracterizacion de dianas antigenicas de los anticuerpos AACE en la enfermedad de Horton:
Se han investigado las dianas de los anticuerpos AACE en los sueros de 9 pacientes que tienen enfermedad de Horton, de 12 sujetos sanos y de los grupos de sueros de pacientes que padecen microangiopatia trombotica (4 grupos de tres) o vasculitis (poliangitis microscopica - 4 grupos de tres, enfermedad de Wegener - 5 grupos de tres, y
5 enfermedad de Churg-Strauss - 3 grupos de tres).
Las reactividades de las IgG sericas se analizaron con ayuda de electroforesis en gel bidimensionales seguidas de inmunotransferencia utilizando antigenos de celulas endoteliales de �UVEC, tal y como se describe en el Ejemplo 1. Las IgG sericas de pacientes que padecian la enfermedad de Horton reconocian 162 ± 3 manchas de proteinas en extractos de �UVEC, mientras que las de los sujetos sanos reconocian 79 manchas de proteinas. 28 manchas de
10 proteinas fueron reconocidas por al menos 2/3 de los grupos de pacientes que padecian enfermedad de Horton y no por los sujetos sanos de las cuales se habian identificado 15. 26 manchas de proteinas de �UVEC fueron reconocidas por al menos un grupo de sueros de pacientes que padecian la enfermedad de Horton y no por los sueros testigos ni por los de los sujetos sanos de las cuales 9 se habian identificado.
Los resultados detallados se presentan en las Tablas 6 y 7.
Tabla 6. Manchas de proteinas reconocidas por al menos 2/3 de los grupos de sueros de pacientes que padecen la enfermedad de Horton, y no son reconocidas por los sujetos sanos.
Espectrometria de masas
N° en Proteina Numero de orden PMPI
Numero de peptidos
Puntuacion de
Mejor
Cobertura de la el gel Swiss-Prot teorico/estimadoteorico/estimado
identificados unicos
iones totales
puntuacion de
secuencia (%) (kDa)
iones 557 Proteina 1 de union al FUBP1�HUMAN 67/75 7,2/7,2
3/7
13 elemento aguas arriba far 631 Lamina-A/C LMNA �HUMAN 74/71 6,6/6,9
6/10
15 646 Lamina-A/C LMNA �HUMAN 74/70 6,6/7
12/28
46 784 Precursor mitocondrialDLDH HUMAN 54/59 7,6/7,3
2/2
5 de la dihidrolipoil deshidrogenasa 789 Inosina-5'-IMDH2�HUMAN 56/58 6,4/7,1
4/7
17 monofosfotadeshidrogenasa 2 950 Precursor de laTPP1�HUMAN 61/50 6/6,4
3/5
15 tripeptidil-peptidasa 1 1017 Precursor mitocondrialFUMH �HUMAN 55/48 8,9/8
6/7
24 de la fumaratohidratasa 1085 Ribonucleoproteina D0 HNRPD�HUMAN 38/43 7,6/7,8
3/3
11 nuclear heterogenea 1214 Dominio PDZ y LIM de PDLI1�HUMAN 36/37 6,6/7,4
5/10
44 la proteina 1 1249 Proteina ribosomica RLA0�HUMAN 34/37 5,7/6
2/5
21 acida 60S P0 1352 Proteina 2 del canal VDAC2�HUMAN 32/33 7,5/7,4
4/4
18 selectivo de anion ydependiente del voltaje 1359 Anexina A5 ANXA5�HUMAN 36/33 4,9/5,3
10/12
52 1614 Proteina DJ-1 PARK7�HUMAN 20/25 6,3/6,6
5/5
51 1734 Peptidil-prolil cis-transPPIA�HUMAN 18/18 7,7/8
3/5
36 isomerasa A 1817 Precursor mitocondrialPRDX3�HUMAN 28/15 7,7/6,8
5/6
44 de la peroxido reductasa dependiente
Espectrometria de masas
N° enel gel Proteina Numero de orden Swiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado
Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion deiones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
de tiorredoxina
numero de peptidos identificados unicos despues de las pruebas MSMS y MS-MSMS
Tabla 7 - Manchas de proteinas reconocidas por al menos 1 grupo de sueros de pacientes que padecen la enfermedad de Horton, no reconocidas por los sujetos sanos ni por los sujetos que padecen otra vasculitis o microangiopatia trombotica
Espectrometria de masas
N° enel gel Proteina Numero de orden Swiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado
Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion deiones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
228 Vinculina VINC HUMAN 124/116 5,5/6,6 407 Proteina 2 de union al elemento aguas arribafar FUBP2�HUMAN 73/89 6,8/7,9 820 Subunidad beta de la proteina 1 del complejo T TCPB�HUMAN 57/55 6/6,6 1115 Precursor del miembro11 de la subfamilia B de DnaJ homologo DJB11�HUMAN 40/43 5,8/6,5 1174 Glutarredoxina-3 GLRX3�HUMAN 37/39 5,3/5,9 1328 Pirofosfatasa inorganica IPYR �HUMAN 33/34 5,5/6 1493 Inhibidor 2 de la disociacion de GDP de Rho GDIR2�HUMAN 23/27 5,1/5,7 1607 Glutation Stransferasa P GSTP1�HUMAN 23/25 5,4/6 1633 Peroxiredoxina-2 PRDX2�HUMAN 22/23 5,7/6
3/135/1111/127/84/59/115/108/106/10 5386421316173359246602367 34339211669827711795 151738341847586350
numero de peptidos identificados unicos despues de las pruebas MSMS y MS-MSMS
Ejemplo 3: Caracterizacion de las dianas antigenicas de los anticuerpos anti-celulas musculares vasculares en la enfermedad de Horton y las vasculitis asociadas
Los sueros de 15 pacientes que padecian la enfermedad de Horton (MH) y de 33 pacientes que padecian una vasculitis asociada a los ANCA (15 tenian granulomatosis de Wegener GW, 9 una poliangitis microscopica MPA, 9 5 un sindrome de Churg-Strauss CSS), fueron sometidos a ensayo en grupos de tres y se compararon con un grupo de sueros de 12 individuos sanos. Las reactividades de las IgG sericas se analizaron con ayuda de electroforesis en geles bidimensionales, seguida por inmunotransferencia, esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1, pero utilizando los antigenos de celulas musculares lisas vasculares (CMLV) inmortalizadas, procedentes de la arteria mamaria. Las IgG sericas de los grupos de tres pacientes que padecian enfermedad de Horton (n = 5), GW con
10 ANCA anti-proteinasa 3 (PR3) (n = 5), MPA con o sin anti-mieloperoxidasa (n = 3), CSS con o sin ANCA anti-MPO (n = 3), reconocian 89 ± 28, 94 ± 34, 56 ± 12, 42 ± 16 manchas de proteinas, respectivamente. Varios antigenos fueron reconocidos especificamente por lo menos el 60% de los grupos de pacientes y otros antigenos fueron reconocidos mas intensamente por los pacientes que por los sujetos sanos.
Los resultados detallados se presentan en las Tablas 8 y 9.
Tabla 8: Antigenos reconocidos especificamente por los pacientes
Proteina
Numero de orden Swiss-Prot PM teorico/estimado (kDa) PIteorico/estimado Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion deiones totales Mejorpuntuacion deiones Cobertura de la secuencia (%)
Vinculina
VINC HUMAN 122/124 5,5/6,4 14 39
Proteina putativa de choque termico HSP 90-alfa A2
HS902�HUMAN 39/94 4,6/5,6 5 40
Proteina 2 de union al elemento aguas arriba far
FUBP2�HUMAN 73/88 6,8/7,2 4/10-9 67-46 24 21
Proteina 2 de union al elemento aguas arriba far
FUBP2�HUMAN 73/88 6,8/7,2 5/12-11 84-119 24 25
Proteina 2 de union al elemento aguas arriba far
FUBP2�HUMAN 73/88 6,8/7,8 11 85
Lamina-A/C
LMNA �HUMAN 74/67 6,6/6,5 10 24
Subunidad alfa del coatomero
COPA�HUMAN 138/67 7,7/6,5 3 37
UDP-glucosa 6-deshidrogenasa
UGDH HUMAN 55/66 6,6/6,7 4 46
Proteina disulfuro-isomerasa A3
PDIA3�HUMAN 57/59 6,7/7,5 12 y 16 528-804
Proteina disulfuro-isomerasa A3
PDIA3�HUMAN 57/59 6,0/6,3 14-13 460-362
Subunidad beta de la proteina 1 del complejo T
TCPB�HUMAN 57/57 6,0/6,5 14-14 503-519
Actina, citoplasmica 1
ACTB �HUMAN 42/47 5,3/5,7 5/10-9 390-418 131 53
Miembro E de la familia deldominio de anquirina POTE
POTEE�HUMAN 121/47 5,8/5,7 6 251
Nucleofosmina
NPM HUMAN 33/39 4,6/5,1 3/5-5 83-203 39 24
Anexina A2
ANXA2�HUMAN 39/35 7,6/8,0 13 y 10 650-265
numero de peptidos identificados unicos despues de las pruebas MSMS y MS-MSMS Tabla 9: Antigenos reconocidos con mayor intensidad por los pacientes que por los sujetos sanos.
Proteina
Numero de ordenSwiss-Prot PMteorico/estimado(kDa) PIteorico/estimado Numero de peptidosidentificados unicos Puntuacion deiones totales Mejor puntuacionde iones Cobertura de la secuencia (%)
Factor de elongacion 2
EF2�HUMAN 95/101 6,4/7,4 16 198
Caldesmon
CALD1�HUMAN 93/84 5,6/6,7 3/6-8 72-288 39 9
Inosina-5�-monofosfato deshidrogenasa 2
IMDH2�HUMAN 56/60 6,4/7,1 14 474
Alfa-enolasa
ENOA�HUMAN 47/57 7,0/7,7 7/12-7 245-66 72 44
Miembro 1 de la subfamilia A homologo a DnaJ
DNJA1�HUMAN 45/49 6,7/7,4 9 58
Actina, citoplasmica 2
ACTG �HUMAN 42/45 5,3/5,5 5/7-13 258-430 116 34
Subunidad 8 reguladora de la proteasa 26S
PRS8�HUMAN 46/46 7,1/7,6 15 180
numero de peptidos identificados unicos despues de las pruebas MSMS y MS-MSMS
�IST� DE SEC�ENCI S
lt;110� Assistance Publique - H�pitaux de Paris 5 lt;120� Procedimiento para el diagnostico de una vascularidad
lt;130� B845
10 lt;160� 88
lt;170� PatentIn version 3.3
lt;210� 1
15 lt;211� 1134 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220� 20 lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Vinculina
lt;400� 1
lt;210� 2 lt;211� 710 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� proteina 2 de union al elemento aguas arriba far
lt;400� 2
lt;210� 3 lt;211� 710 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Caldesmon
lt;400� 3
lt;210� 4 lt;211� 654 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa
lt;400� 4
lt;210� 5 lt;211� 646 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� proteina cognada de choque termico de 71 kDa
lt;400� 5
lt;210� 6 lt;211� 679 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor mitocondrial de la proteina de estres-70
lt;400� 6
lt;210� 7 lt;211� 664 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Lamina-A/C
lt;400� 7
lt;210� 8 lt;211� 463 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� ribonucleoproteina K nuclear heterogenea
lt;400� 8
lt;210� 9 lt;211� 541 5 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T
lt;400� 9
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor mitocondrial de la proteina de choque termico de 60 kDa
lt;400� 10
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A1
lt;400� 11
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3
lt;400� 12
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Subunidad zeta (theta) de la proteina 1 del complejo T
lt;400� 13
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Subunidad beta de la proteina 1 del complejo T
lt;400� 14
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa
lt;400� 15
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Ribonucleoproteina H nuclear heterogenea
lt;400� 16
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Cadena beta de la tubulina
lt;400� 17
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Fructosa-bifosfato aldolasa-A
lt;400� 18
lt;210� 19
lt;211� 315
lt;212� PRT
lt;213� Homo sapiens
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA
lt;223� Precursor de calumenina
10 lt;400� 19 lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Reticulocalbina-3
lt;400� 20
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Subunidad 13 reguladora no ATPasa del proteasoma 26S
lt;400� 21 lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Pirofosfatasa inorganica
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Anexina A5
lt;400� 23
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� 14-3-3 proteina epsilon
lt;400� 24
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� 6-fosfogluconolactonasa
lt;400� 25
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Galectina-1
lt;400� 26
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor mitocondrial de la succinil-CoA:3-cetoacido-coenzima A transferasa 1
lt;400� 27
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea
lt;400� 28
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Subunidad 7 reguladora de la proteasa 26S
lt;400� 29
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Hemo oxigenasa 2
lt;400� 30
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Histona H2B tipo F-S
10 lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Subunidad alfa tipo-5 del proteasoma
15 lt;400� 32 lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Subunidad beta tipo-2 del proteasoma
lt;400� 33
5
lt;210� 34 lt;211� 602 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
10
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Proteina 4 asociada al citoesqueleto
lt;400� 34
94
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Descarboxilasa de uroporfirinogeno
lt;400� 35
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Adenina fosforribosiltransferasa
lt;400� 36
5
lt;210� 37 lt;211� 140 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
10
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Profilina-1
lt;400� 37
100
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Plastina-3
lt;400� 38
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Proteina 2 unida al receptor del factor de crecimiento
lt;400� 39 lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Ribonucleoproteina L nuclear heterogenea
lt;400� 40
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor de la Reticulocalbina-1
lt;400� 41
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Serpina B9
lt;400� 42
lt;213� Homo sapiens
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la isocitrato-deshidrogenasa [NAD]
lt;400� 43
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� GMP-sintasa [que hidroliza la glutamina]
lt;400� 44
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Subunidad zeta de la proteina 1 del complejo T
lt;400� 45
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Cofilina-1
lt;210� 47
lt;211� 780
lt;212� PRT
lt;213� Homo sapiens
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA
lt;223� Precursor mitocondrial de la aconitato-hidratasa
10 lt;400� 47
lt;210� 48
5 lt;211� 758
lt;212� PRT
lt;213� Homo sapiens
lt;220� 10 lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA
lt;223� Proteina de la membrana interna de las mitocondrias
lt;400� 48
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Ribonucleoproteina K nuclear heterogenea
lt;400� 49
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Precursor mitocondrial del factor de elongacion Tu
lt;400� 50 lt;210� 51 lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA lt;223� Alcohol deshidrogenasa [NADP+] lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Acido sialico sintasa
lt;400� 52
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� S-formilglutation hidrolasa
lt;400� 53
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Subunidad 1 similar a beta-2 de la proteina de union al nucleotido guanina
lt;400� 54
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Purina nucleosido fosforilasa
lt;400� 55
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Prohibitina
lt;400� 56
lt;220� lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Precursor mitocondrial de la proteina de union al subcompuesto Q del compuesto 1 del complemento
lt;400� 57
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� ATPasa del reticulo endoplasmico
lt;400� 58
lt;220�
lt;221� CARACTER�STICA MISCELANEA 10 lt;223� Nucleosido difosfato cinasa A
lt;400� 59
lt;400� 60
lt;400� 63
lt;400� 64
lt;400� 65
lt;400� 67 lt;400� 68
lt;400� 69 lt;400� 70
5 lt;210� 71 lt;211� 165 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
10 lt;400� 71
5 lt;210� 72 lt;211� 256 lt;212� PRT lt;213� Homo sapiens
10 lt;400� 72
lt;400� 73
lt;400� 74
lt;400� 75
lt;400� 76 lt;213� Homo sapiens
lt;213� Homo sapiens lt;400� 78
lt;400� 79
lt;400� 80
lt;400� 81
lt;400� 82
lt;400� 83
lt;400� 84
lt;400� 85
lt;400� 86
lt;400� 87
lt;400� 88

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Procedimiento in vitro para la deteccion de una granulomatosis de Wegener en un sujeto que comprende determinar la presencia y/o la cantidad de al menos un anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV), que es un anticuerpo anti-vinculina, en una muestra biologica que procede de un paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina es indicadora de una granulomatosis de Wegener.
  2. 2.
    Procedimiento segun la reivindicacion 1, para la deteccion de una granulomatosis de Wegener que comprende ademas determinar la presencia y/o la cantidad de al menos otro anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV), estando dirigido el otro anticuerpo mencionado contra un antigeno seleccionado entre el grupo que consiste en FUbp2 (proteina 2 de union al elemento aguas arriba far), caldesmon, proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa, proteina cognada de choque termico de 71 kDa, precursor mitocondrial de la proteina de estres-70, lamina-A/C, ribonucleoproteina K nuclear heterogenea, subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la proteina de choque termico de 60 kDa, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A1, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3, subunidad zeta de la proteina 1 del complejo T, subunidad beta de la proteina 1 del complejo T, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, ribonucleoproteina H nuclear heterogenea, cadena beta de la tubulina, fructosabifosfato aldolasa A, precursor mitocondrial de la subunidad alfa de la ATP-sintasa, precursor de calumenina, reticulocalbina-3, subunidad 13 reguladora no ATPasa del proteasoma 26S, pirofosfatasa inorganica, anexina A5, 14-3-3 proteina epsilon, 6-fosfogluconolactonasa, galectina-1, precursor mitocondrial de la succinil-CoA:3-cetoacidocoenzima A transferasa 1 y ribonucleoproteina D0 nuclear heterogenea, en una muestra biologica procedente de un paciente, en donde la presencia del anticuerpo anti-vinculina y dicho al menos otro anticuerpo es indicativa de una granulomatosis de Wegener.
  3. 3.
    Procedimiento segun la reivindicacion 1, que comprende ademas la determinacion de la presencia y/o de la cantidad de al menos otro anticuerpo anti-celulas endoteliales (AACE) o anti-celulas musculares lisas vasculares (CMLV), estando dirigido el otro anticuerpo mencionado contra un antigeno seleccionado entre el grupo que consiste en caldesmon, proteina precursora de 78 kDa regulada por glucosa, proteina cognada de choque termico de 71 kDa, subunidad epsilon de la proteina 1 del complejo T, precursor proteico de la disulfuro-isomerasa A3 y precursor de calumenina.
  4. 4.
    Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra biologica es una muestra de sangre o de suero.
  5. 5.
    Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la presencia de dicho al menos un anticuerpo en la muestra biologica se compara con un valor testigo, en donde la presencia de dicho al menos un anticuerpo en una cantidad superior al valor testigo es indicadora de una granulomatosis de Wegener.
  6. 6.
    Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cantidad de dicho al menos un anticuerpo se determina por un inmunoensayo.
  7. 7.
    Procedimiento segun la reivindicacion 6, en donde el inmunoensayo es una prueba de ELISA.
  8. 8.
    Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el paciente es un ser humano.
  9. 9.
    Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el paciente no tiene anticuerpos ANCA.
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