ES2535719T3 - Procedimiento de diagnóstico de una esclerodermia sistémica o de una hipertensión arterial pulmonar - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro de detección de una esclerodermia sistémica (ScS) o de una hipertensión arterial pulmonar asociada a una esclerodermia (HTAP-ScS) o de una hipertensión arterial pulmonar idiopática (HTAPi) en un sujeto, que comprende la determinación de la presencia y/o de la cantidad de al menos un anticuerpo elegido del grupo constituido por los anticuerpos anti-galectina-1, anti-proteína FAM10A4, anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés, y anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa, en una muestra biológica procedente de un paciente, siendo indicativa de una ScS o de una HTAPi, la presencia de un anticuerpo anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa; siendo indicativa de una HTAP-ScS o de una HTAPi, la presencia de un anticuerpo anti-proteína FAM10A4; siendo indicativa de una ScS, la presencia de un anticuerpo anti-galectina-1; o siendo indicativa de una ScS, de una HTAP-ScS o de una HTAPi, la presencia de una cantidad superior a un valor control de un anticuerpo anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de diagnóstico de una esclerodermia sistémica o de una hipertensión arterial pulmonar

La invención se refiere a un procedimiento in vitro de detección de una esclerodermia sistémica (ScS) o de una hipertensión arterial pulmonar asociada a una esclerodermia (HTAP-ScS), o de una hipertensión arterial pulmonar idiopática (HTAPi) en un sujeto, que comprende la determinación de la presencia y/o de la cantidad de anticuerpos 5 en una muestra biológica procedente de un paciente, como se describe en las reivindicaciones.

Estado de la técnica

La esclerodermia sistémica (ScS) es una enfermedad rara que se caracteriza por la aparición de lesiones fibrosas que afectan a la piel y a ciertas vísceras como el pulmón, el tubo digestivo y el corazón, así como una hiperreactividad vascular que es causa de un fenómeno de Raynaud y de manifestaciones severas como la crisis 10 renal y la hipertensión arterial pulmonar (HTAP). La fisiología de la ScS es compleja y parcialmente comprendida. La aparición de una ScS resulta de la disfunción de tres tipos de células, los linfocitos B y T responsables de una desregulación inmunitaria, las células endoteliales responsables de anomalías vasculares y los fibroblastos responsables de lesiones fibrosas.

El noventa por ciento de los pacientes esclerodérmicos tienen anticuerpos antinucleares (AAN) en su suero. Ciertos 15 auto-anticuerpos son muy específicos de la ScS y mutuamente excluyentes, como los anticuerpos anti-topoisomerasa I (anti-SCI-70) (ATA) (Tamby et al., 2007), presentes con mayor frecuencia en las formas difusas de la enfermedad, los anticuerpos anti-centrómero (ACA), asociados en general a las formas cutáneas limitadas (Moroi et al., 1980), o los anticuerpos anti-ARN polimerasa III asociados a las formas cutáneas difusas y a la aparición de una crisis renal (Bunn et al., 1998). Los AAN no tienen ningún papel patógeno demostrado en el curso de la ScS 20 pero su detección constituye una ayuda para el diagnóstico precoz de la ScS. Otros auto-anticuerpos no específicos de la ScS como los anticuerpos anti-ribonucleoproteína, anti-SSA y anti-SSB, los anticuerpos anti-cardiolipina o el factor reumatoide se encuentran algunas veces en el curso de la ScS. Los anticuerpos anti-células endoteliales (AECA) se pueden detectar en el 28 a 54 % de los pacientes esclerodérmicos. Estos autoanticuerpos son capaces de inducir la expresión de moléculas de adhesión y de provocar una apoptosis de las células endoteliales en 25 presencia de células citotóxicas naturales (« natural killer ») (Bordron et al., 1998). Las dianas de los AECA en el curso de la ScS todavía son mal conocidas y a fecha de hoy no se ha identificado el antígeno específico de la célula endotelial. En cambio, la ADN topoisomerasa 1 (Garcia de la Pena-Lefebvre et. al., 2004) y la proteína centromérica B (Servettaz et al., 2006) han sido identificadas como las dianas de los AECA en los enfermos esclerodérmicos. Los anticuerpos anti-fibroblastos (AFA) han sido identificados en los pacientes esclerodérmicos. Estos anticuerpos son 30 capaces de activar los fibroblastos, de aumentar la expresión de moléculas de adhesión como la molécula-1 de adhesión inter-celular (ICAM) y pro-inflamatorios (aumento de los niveles de ARNm, de IL-1α, de IL-1β y de IL-6) así como la síntesis de colágeno (Chizzolini et al., 2002). Se ha demostrado recientemente que los AFA se pueden fijar sobre la topoisomerasa 1 adsorbida en la superficie de los fibroblastos (Henault et al., 2006). En el ensayo ELISA (ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas), los AFA se han encontrado en el 30 % de los pacientes que 35 presentan una HTAP asociada a una ScS (Tamby et al., 2006).

La hipertensión arterial pulmonar (HTAP) es una patología rara responsable de la aparición de una descompensación cardíaca derecha que puede llevar a la muerte. El diagnóstico de HTAP se establece mediante un cateterismo derecho que permite la medida de la presión arterial pulmonar media superior o igual a 25 mm de Hg en reposo en ausencia de elevación de la presión capilar pulmonar (Rubin, 1997). La aparición de una HTAP es la 40 consecuencia de una obstrucción crónica de las pequeñas arterias pulmonares secundaria a la proliferación de células endoteliales, de células musculares lisas vasculares y de fibroblastos (Dorfmuller et al, 2003). En particular, la neo-muscularización de las pequeñas arterias pulmonares periféricas normalmente no musculares es una característica común a todas las formas de remodelado asociadas a la HTAP.

La HTAP puede ser idiopática, es decir esporádica, pero también familiar, asociada a la toma de anorexígenos 45 (dexfenfluramina), o asociada a un cierto número de patologías incluyendo la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La HTAP puede estar asociada también a colagenosis como la ScS (Hachulla et al, 2005), el síndrome de Sharp (o conectivitis mixta), o más raramente el lupus eritematoso sistémico. Aproximadamente 8 a 12 % de los pacientes esclerodérmicos desarrollan una HTAP, causa de una mortalidad elevada. Además, en el curso de la HTAP idiopática, se encuentran de vez en cuando señales de auto-inmunidad, a 50 saber anticuerpos anti-nucleares o anticuerpos anti-tiroglobulina. La presencia de anticuerpos anti-células endoteliales (Tamby et al, 2005) y de anticuerpos anti-fibroblastos (Tamby et al, 2006) ha sido descrita en el curso de la HTAP idiopática o asociada a la ScS. Sin embargo, no ha sido estudiado el valor predictivo de estos anticuerpos en la aparición de la HTAP y el papel potencial de los fenómenos auto-inmunes en la patogenia de la HTAP idiopática permanece incierto (Mouthon et al, 2005). 55

En la mayor parte de los casos, la HTAP se detecta cuando el paciente presenta una disnea de grado III o IV. Cuando el paciente es atendido por una enfermedad crónica como la ScS, la HTAP se detecta por una ecografía cardíaca anual. La solicitud de patente US 2002/0009749 describe la detección de anticuerpos anti-HMG-1 (proteína 1 del grupo de alta movilidad) y anti-HMG-2 para el diagnóstico de enfermedades auto-inmunes, entre otras la

esclerodermia sistémica. Terrier et al., han identificado los antígenos de anticuerpos anti-fibroblastos presentes en los pacientes afectados de hipertensión arterial pulmonar (Terrier et al., 2008). Sigue haciendo falta un ensayo sencillo y fiable para la detección de una ScS y/o de una HTAP, que sería valioso para un diagnóstico lo más precoz posible y que permitiría poner en marcha rápidamente estrategias terapéuticas para mejorar el estado del paciente y sus posibilidades de sobrevivir. La invención tiene por objeto un ensayo de ese tipo. 5

Resumen de la invención

La invención proporciona ahora un procedimiento in vitro de detección de una esclerodermia sistémica (ScS) o de una hipertensión arterial pulmonar asociada a una esclerodermia (HTAP-ScS) o de una hipertensión arterial pulmonar idiopática (HTAPi) en un sujeto, que comprende la determinación de la presencia y/o de la cantidad de al menos un anticuerpo elegido del grupo constituido por los anticuerpos anti-galectina-1, anti-proteína FAM10A4, anti-10 fosfoproteína 1 inducida por el estrés, y anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa, en una muestra biológica procedente de un paciente,

siendo indicativa de una ScS o de una HTAPi, la presencia de un anticuerpo anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa;

siendo indicativa de una HTAP-ScS o de una HTAPi, la presencia de un anticuerpo anti-proteína FAM10A4; 15

siendo indicativa de una ScS, la presencia de un anticuerpo anti-galectina-1;

o siendo indicativa de una ScS, de una HTAP-ScS o de una HTAPi, la presencia de una cantidad superior a un valor control de un anticuerpo anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés.

Descripción detallada de la invención

La esclerodermia sistémica (ScS) y la hipertensión arterial pulmonar (HTAP) se caracterizan las dos por la presencia 20 de autoanticuerpos (AAc) en el suero de los pacientes, en particular AAc dirigidos contra las células endoteliales y los fibroblastos. Antes de los trabajos presentados a continuación, ningún AAc dirigido contra las células musculares lisas vasculares (CMLV) había sido puesto en evidencia. La caracterización por los inventores de dichos anticuerpos dirigidos contra las CMLV es de una importancia capital, especialmente teniendo en cuenta el papel clave de estas células en la fisiopatología de la ScS, con o sin HTAP, y de la HTAPi. 25

Los inventores se han propuesto identificar los anticuerpos dirigidos contra las CMLV y caracterizar las dianas antigénicas. Para hacer esto, los inventores han utilizado las CMLV de las arterias mamarias internas como fuente de antígenos y han analizado los sueros de pacientes de fenotipo idéntico (pacientes que tienen una ScS sin o con HTAP, pacientes que tienen una HTAP idiopática, o HTAPi, y sujetos sanos). Se han buscado los anticuerpos con ayuda de una técnica de inmunotransferencia en dos dimensiones seguida de una identificación de los antígenos por 30 espectrometría de masas (véase la sección « Ejemplos » más adelante).

Los inventores han podido demostrar así numerosas reactividades de IgG de las que algunas son muy intensas con el conjunto (pool) de los sueros de pacientes analizados en inmunotransferencia en una dimensión, mientras que los sujetos sanos no expresaban casi ninguna reactividad de IgG. Los inventores han caracterizado, en inmunotransferencia en dos dimensiones, varias manchas proteicas reconocidas por al menos el 80 % de las IgG de 35 los conjuntos de sueros de un grupo de pacientes dados, y no por las IgG séricas de un conjunto de sujetos sanos y otras manchas proteicas reconocidas por la gran mayoría de las IgG séricas de los conjuntos de enfermos con una intensidad mayor que la de las IgG séricas del conjunto de sujetos sanos.

Definiciones:

El término « muestra biológica » se refiere a cualquier muestra biológica procedente de un paciente. Los ejemplos 40 de muestras incluyen los líquidos biológicos y las biopsias de tejidos. Los fibroblastos de pacientes esclerodérmicos cultivados a partir de biopsias de la piel constituyen igualmente un ejemplo de muestra biológica. De manera preferente, la muestra puede ser de sangre, suero, saliva, orina, semen. De manera ventajosa preferida, la muestra biológica es una muestra de sangre o de suero.

El término « paciente » se refiere a cualquier sujeto susceptible de ser sometido a ensayo. Con preferencia se trata 45 de un ser humano, pero el término incluye cualquier otro mamífero, tal como perros, gatos, roedores, ganado, caballos, monos etc. El paciente puede ser sometido a ensayo independientemente de su sexo o edad. El paciente puede ser un sujeto en riesgo, puede ser asintomático o puede presentar signos precoces o avanzados de una ScS y/o de una HTAP. Por ejemplo el paciente puede ser un sujeto predispuesto a desarrollar una ScS y/o una HTAP, en particular un sujeto que es portador de una o varias mutaciones en el gen que codifica BMPRII, endoglina o ALK1. 50

El término « diagnóstico » significa la identificación de la patología o la evaluación del estado de gravedad de la patología.

El término « pronóstico » significa la evaluación del riesgo de empeoramiento y de sus consecuencias.

El término « valor control » se refiere a un valor basal que corresponde a la media de los valores obtenidos con la muestra biológica de sujetos sanos, no afectados por una ScS o una HTAP o una enfermedad susceptible de provocar una HTAP. Se puede tratar de un valor estadístico de referencia.

Para evaluar la evolución de la patología, puede ser útil someter a ensayo a un paciente y controlar el efecto de un tratamiento o la evolución de la patología, sometiendo de nuevo a ensayo al paciente, por ejemplo con varios meses 5 de intervalo. En este caso, los resultados de la segunda prueba se comparan con los resultados de la primera prueba, y también frecuentemente con el valor denominado « control ».

Una cantidad de anticuerpos « superior al valor control » significa generalmente un aumento estadísticamente significativo, por ejemplo de al menos dos desviaciones estándar por encima de la media de las densidades ópticas de las reactividades de IgG del conjunto de los sujetos sanos. 10

Por « antígeno de captura », se entiende un antígeno, con preferencia fijado a una base sólida, que es capaz de retener dicho al menos un anticuerpo, presente en una muestra biológica, por unión por afinidad. El antígeno de captura puede ser marcado. El término « marcado » se refiere también tanto a un marcaje directo (por medio de enzimas, radioisótopos, fluorocromos, compuestos luminiscentes, etc.) como a un marcaje indirecto (por ejemplo, por medio de anticuerpos marcados ellos mismos de manera directa o con la ayuda de reactivos de una " pareja de 15 afinidad " marcada, tal como, pero no exclusivamente, la pareja avidina marcada-biotina, etc.).

Anticuerpos identificados:

Como se indica en la sección « Ejemplos », los inventores han identificado varios anticuerpos anti-CMLV en los enfermos que tienen una ScS con o sin HTAP, o que tienen una HTAPi.

La detección y/o la cuantificación de estos anticuerpos se pueden utilizar para detectar una ScS y/o una HTAP, para 20 realizar el pronóstico o el seguimiento de estas patologías, o para evaluar la eficacia de un tratamiento contra estas patologías.

Los antígenos reconocidos por los anticuerpos identificados se enumeran más adelante. El nombre y los números de acceso que corresponden a estos antígenos en la base de datos de secuencias proteicas SWISSPROT se dan en las tablas 1 y 2 de la sección « Ejemplos ». 25

Los inventores han caracterizado varias reactividades contra las CMLV en los sueros de pacientes que no se encuentran en los sueros de sujetos sanos. Los anticuerpos identificados son los anticuerpos anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa, anti-caldesmona, anti-proteína FAM10A4, anti-zixina, anti-galectina 1, anti-precursor A3 de la proteína disulfuro-isomerasa, anti-desmina, anti-periferina, anti-ribonucleoproteína H nuclear heterogénea, anti-cadena beta de la tubulina y anti-polimerasa I y factor de liberación de transcripción. En un modo 30 particular de realización, el procedimiento descrito en este documento comprende la determinación de la presencia de al menos un anticuerpo elegido del grupo constituido por los anticuerpos anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa, anti-caldesmona, anti-proteína FAM10A4, anti-zixina, anti-galectina 1, anti-precursor A3 de la proteína disulfuro-isomerasa, anti-desmina, anti-periferina, anti-ribonucleoproteína H nuclear heterogénea, anti-cadena beta de la tubulina y anti-polimerasa I y factor de liberación de transcripción en una muestra biológica 35 procedente de un paciente, siendo indicativa la presencia de dicho al menos un anticuerpo, de una esclerodermia sistémica y/o de una hipertensión arterial pulmonar o de un riesgo de desarrollar una esclerodermia sistémica y/o una hipertensión arterial pulmonar.

Los inventores han caracterizado igualmente varias reactividades que tienen una intensidad significativamente mayor en los pacientes que en los sujetos sanos. Estas reactividades corresponden a los anticuerpos anti-vimentina, 40 anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés, anti-α-enolasa, anti-triosafosfato isomerasa, anti-precursor de la albúmina sérica, anti-lsozima L1 de la carboxilo-terminal hidrolasa de ubiquitina, anti-actina citoplásmica 2, anti-peroxiredoxina-6, anti-proteína 2 de unión al elemento aguas arriba Far (o anti-proteína 2) anti-precursor de la reticulocabina-1, anti-γ-enolasa, anti-precursor mitocondrial de la peróxido reductasa dependiente de la tioredoxina, anti-proteína de activación de GTPasa específica de Ran y anti-proteína B1 del grupo de alta movilidad. En un modo 45 particular de realización, los anticuerpos que corresponden a las reactividades que tienen mayor intensidad en los pacientes que en los sujetos sanos se utilizan en un procedimiento descrito en este documento que comprende la comparación de la cantidad de al menos un anticuerpo elegido del grupo constituido por los anticuerpos anti-vimentina, anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés, anti-α-enolasa, anti-triosafosfato isomerasa, anti-precursor de la albúmina sérica, anti-lsozima L1 de la carboxilo-terminal hidrolasa de ubiquitina, anti-actina citoplásmica 2, anti-50 peroxiredoxina-6, anti-proteína 2 de unión al elemento aguas arriba Far (o anti-proteína 2) anti-precursor de la reticulocabina-1, anti-γ-enolasa, anti-precursor mitocondrial de la peróxido reductasa dependiente de la tioredoxina, anti-proteína de activación de GTPasa específica de Ran y anti-proteína B1 del grupo de alta movilidad en una muestra biológica procedente de un paciente, con un valor control, siendo indicativa la presencia de dicho al menos un anticuerpo en una cantidad superior al valor control, de una esclerodermia sistémica y/o de una hipertensión 55 arterial pulmonar o de un riesgo de desarrollar una esclerodermia sistémica y/o una hipertensión arterial pulmonar.

La invención se refiere por tanto a la utilización de al menos un anticuerpo dirigido contra las CMLV, en un procedimiento, con preferencia in vitro, de detección de una ScS y/o de una HTAP.

Con preferencia, los anticuerpos dirigidos contra las CMLV utilizados en los procedimientos descritos, se eligen del grupo constituido por los anticuerpos anti-precursor de la albúmina sérica, anti-zixina, anti-galectina-1, anti-lsozima L1 de la carboxilo-terminal hidrolasa de ubiquitina, anti-caldesmona, anti-proteína FAM10A4, anti-proteína 2 de unión al elemento aguas arriba Far, anti-actina citoplásmica 2, anti-γ-enolasa, anti-precursor A3 de la proteína disulfuro-isomerasa, anti-desmina, anti-periferina, anti-ribonucleoproteína H nuclear heterogénea, anti-fosfoproteína 1 5 inducida por el estrés, anti-triosafosfato isomerasa, anti-peroxiredoxina-6, anti-reticulocabina-1, anti-peroxiredoxina-2, anti-precursor mitocondrial de la peróxido reductasa dependiente de la tioredoxina, anti-proteína de activación de GTPasa específica de Ran, anti-proteína B1 del grupo de alta movilidad, anti-cadena beta de la tubulina y anti-polimerasa I y factor de liberación de transcripción.

En un modo particular de realización, los anticuerpos dirigidos contra las CLMV utilizados en los procedimientos 10 descritos, se eligen del grupo constituido por los anticuerpos anti-precursor de la albúmina sérica, anti-zixina, anti-galectina-1, anti-lsozima L1 de la carboxilo-terminal hidrolasa de ubiquitina, anti-caldesmona, anti-proteína FAM10A4, anti-proteína 2 de unión al elemento aguas arriba Far, anti-actina citoplásmica 2, anti-γ-enolasa, anti-precursor A3 de la proteína disulfuro-isomerasa, anti-desmina, anti-periferina, anti-ribonucleoproteína H nuclear heterogénea, anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés, anti-triosafosfato isomerasa, anti-peroxiredoxina-6 y anti-15 reticulocabina-1.

Los anticuerpos identificados por los inventores se pueden utilizar en los procedimientos descritos solos o en combinación. La detección y/o la cuantificación se pueden realizar con respecto a uno solo de los anticuerpos identificados, o pueden implicar a una pluralidad de anticuerpos. Se puede componer así la realización del procedimiento sobre un soporte sólido, por ejemplo una microplaca, sobre la cual se disponen de manera definida y 20 ordenada los antígenos que corresponden a la pluralidad de anticuerpos a detectar y/o cuantificar.

Según un modo de realización de la invención, los procedimientos descritos utilizan la detección de un anticuerpo anti-galectina 1 o anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés.

Según un modo de realización de la invención, los procedimientos descritos utilizan la detección de un anticuerpo anti-galectina 1 para el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento de la ScS. En efecto, los inventores han podido 25 demostrar que este anticuerpo es específico de la ScS, teniendo en cuenta su presencia en los sueros de pacientes de ScS con o sin HTAP asociada, y su ausencia en los sueros de pacientes que sufren de HTAPi.

Según otro modo de realización de la invención, los procedimientos descritos utilizan la detección de un anticuerpo anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa para el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento de la ScS o de la HTAPi. 30

Según otro modo de realización de la invención, los procedimientos descritos utilizan la detección de un anticuerpo anti-proteína FAM10A4 para el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento de la HTAP, ya sea idiopática o asociada a una ScS.

Valoración de los anticuerpos:

La muestra biológica es con preferencia una muestra de suero, con preferencia diluido 1/100, o más, por ejemplo 35 1/200 o 1/400.

De manera ventajosa, la cantidad de anticuerpos se puede determinar mediante un inmunoensayo.

La muestra biológica se puede tratar opcionalmente en una etapa preliminar, o se puede poner directamente en presencia de al menos un antígeno de captura.

El procedimiento según la invención se puede realizar según diversos formatos bien conocidos por los expertos en la 40 técnica: en fase sólida o en fase homogénea; en un tiempo o en dos tiempos; en método competitivo, a titulo de ejemplos no limitativos.

Según un modo de realización preferido, el antígeno de captura se inmoviliza sobre una fase sólida. Se pueden utilizar, a titulo de ejemplos no limitativos de fase solida, las microplacas, especialmente microplacas de poliestireno, tales como las comercializadas por la empresa Nunc, Dinamarca. También se pueden utilizar partículas o perlas 45 sólidas, perlas paramagnéticas, tales como las suministradas por Dynal o Merck-Eurolab (Francia) (bajo la marca Estapor™) o también tubos de ensayo de poliestireno o polipropileno, etc.

Es igualmente posible un formato de inmunoensayo para la detección de anticuerpos por competición. También son posibles otras modalidades de inmunoensayo y son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las valoraciones por ELISA, radioinmunoensayos, o cualquier otra técnica de detección se pueden utilizar para 50 revelar la presencia de los complejos de antígeno-anticuerpo formados.

Según un modo particular de realización preferido, el antígeno de captura corresponde a una proteína completa o a un fragmento de dicha proteína. Por ejemplo, el procedimiento de la invención comprende poner en contacto una muestra biológica con una proteína completa reconocida por el anticuerpo que se va a detectar y/o cuantificar. A

título ilustrativo, la invención comprende poner en contacto una muestra de sangre o de suero con la galectina 1 o la fosfoproteína 1 inducida por el estrés completa, para la detección y/o la cuantificación de los anticuerpos anti-galectina o anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés, en dicha muestra.

En un ejemplo particular, el antígeno de captura se puede acoplar a una glutatión S transferasa (GST), antes de ser depositado sobre una microplaca. 5

A título ilustrativo, las muestras de suero que se van a someter a ensayo, por ejemplo, diluidas 1/100, se incuban sobre la microplaca. Después de lavado, se añaden anticuerpos anti-Fcy humanos marcados (por ejemplo, con una fosfatasa alcalina), siendo revelados los complejos (por ejemplo, mediante la adición de un sustrato de la fosfatasa cuya escisión se puede detectar mediante la lectura de la absorbancia).

Pacientes diana: 10

Los pacientes diana son aquellos susceptibles de desarrollar una ScS y/o una HTAP.

Se puede tratar de un paciente que sufre una HTAP asociada a una conectivitis, tal como una esclerodermia sistémica, al síndrome de Sharp (que es una conectivitis mixta), o a un lupus eritematoso sistémico.

El paciente puede sufrir igualmente una HTAP idiopática o familiar.

Más generalmente, todo paciente afectado de una enfermedad vascular pulmonar puede ser sometido de forma 15 ventajosa al procedimiento de detección de una HTAP tal como se define en la invención.

Además, la HTAP detectada puede ser también una hipertensión porto-pulmonar (es decir una HTAP asociada a una hipertensión portal), o estar asociada a una cardiopatía congénita, o a una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o también puede ser una hipertensión pulmonar post-embólica, que complica la evolución de una bronquitis crónica obstructiva o de una cardiopatía cianógena. 20

Otros pacientes diana son los expuestos a ciertos medicamentos supresores del apetito como la fenfluramina cuya prescripción puede contribuir a la aparición de una HTAP.

Otras personas susceptibles de beneficiarse de este tipo de ensayo son las portadoras de una mutación en el gen que codifica BMPRII, endoglina o ALK1, y que eventualmente no presentan HTAP detectable en la ecografía, con el fin de detectar los individuos susceptibles de desarrollar posteriormente una HTAP. 25

Evaluación de la eficacia de un tratamiento:

Otro objeto de este documento es un procedimiento in vitro de evaluación de la eficacia de un tratamiento contra una ScS y/o una HTAP, que comprende la determinación de la presencia y/o de la cantidad de al menos un anticuerpo tal como se ha definido antes en una muestra biológica procedente de un paciente, a diferentes tiempos antes, en el curso de o después del tratamiento, siendo indicativa de una mejoría de la ScS o de la HTAP, la disminución de la 30 cantidad de dicho al menos un anticuerpo a lo largo del tiempo.

El tratamiento clásico actual de la HTAP asocia un tratamiento sintomático y un tratamiento vasodilatador. El tratamiento sintomático asocia anti-coagulantes, una oxigenoterapia y diuréticos. El tratamiento vasodilatador se apoya sobre las siguientes moléculas: bloqueadores de los canales de calcio, epoprostenol (prostaciclina) prescrito por vía intravenosa en perfusión continua, los inhibidores de los receptores de la endotelina, selectivos o no, en 35 particular el bosentán, el sitaxentán y el ambrisentán, los inhibidores de las fosfodiesterasas de tipo 5 en particular el sildenafilo, el taladafilo, siendo administrado el conjunto de estos medicamentos por vía oral, y el iloprost inhalado, análogo de la prostaciclina, administrado por inhalación. Estos tratamientos se pueden combinar opcionalmente. En caso de fracaso de estas terapias, se puede proponer un trasplante pulmonar o de corazón-pulmones. En el curso de la ScS es clásico prescribir vasodilatadores, en primer lugar los inhibidores cálcicos en el tratamiento del 40 fenómeno de Raynaud, los inhibidores de la bomba de protones y un procinético, la domperidona, en el tratamiento del reflujo gastro-esofágico. Los otros tratamientos dependen de las afecciones presentadas por el paciente: colchicina o corticoides en dosis bajas en caso de afección articular inflamatoria, inhibidores de la enzima de conversión en caso de crisis renal, ciclofosfamida en caso de neumopatía infiltrante difusa evolutiva, tratamiento vasodilatador de una hipertensión arterial pulmonar. 45

Las figuras y ejemplos que siguen ilustran la invención sin limitar su alcance.

Leyendas de las figuras

La figura 1 corresponde a una inmunotransferencia en una dimensión que muestra las reactividades de las IgG séricas de pacientes esclerodérmicos con HTAP (n=3) o sin HTAP (n=6), de pacientes que tienen una HTAP idiopática (n=6) y de sujetos sanos (n=4) con respecto a las proteínas de células musculares lisas vasculares. La 50 HTAP estaba documentada por cateterismo derecho en el conjunto de los pacientes. ScS: esclerodermia sistémica; HTAP: hipertensión arterial pulmonar; HTAPi: hipertensión arterial pulmonar idiopática; HTAP-ScS: hipertensión

arterial pulmonar asociada a una esclerodermia; C: control interno (HTAP-ScS); PBS: solución salina tamponada con fosfato.

La figura 2 corresponde a un gel de referencia en dos dimensiones de un extracto proteico total de células musculares lisas vasculares, teñido con nitrato de plata. La primera dimensión (eje horizontal): pH 3-10, segunda dimensión (eje vertical): gradiente de acrilamida 7-18 %, permiten el recuento de 880 manchas proteicas. 5

La figura 3 es un gráfico que muestra el número de manchas proteicas reconocidas por las IgG de 15 conjuntos de 3 sueros de pacientes fenotípicamente idénticos que tienen una esclerodermia sistémica y/o una HTAP y por un conjunto de 12 sujetos sanos después de ajuste sobre el gel de referencia. La escala de las ordenadas indica el número de reactividades de IgG.

La figura 4 muestra la proporción de las manchas de reactividad reconocidas por las IgG de los sueros de los 10 conjuntos de 3 pacientes en el seno de cada grupo (reconocidas o no por los sujetos sanos). 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %: número de manchas proteicas reconocidas respectivamente por 1/5, 2/5, 3/5, 4/5, 5/5 de los conjuntos de pacientes en un grupo dado.

La figura 5 representa el número de manchas reconocidas por las IgG de los sueros de los conjuntos de pacientes de cada grupo y no reconocidas por los sueros de los sujetos sanos. 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %: número de 15 manchas proteicas reconocidas respectivamente por 1/5, 2/5, 3/5, 4/5, 5/5 de los conjuntos de pacientes en un grupo dado.

La figura 6 muestra la localización de las manchas proteicas candidatos sobre el gel de electroforesis en dos dimensiones de un extracto proteico total de células musculares lisas vasculares, teñido con nitrato de plata. Primera dimensión (eje horizontal): pH 3-10, segunda dimensión (eje vertical): gradiente de acrilamida 7-18 %. 20

La figura 7 muestra la intensidad de las reactividades de las IgG de los 15 conjuntos de 3 sueros de pacientes y del conjunto de sueros de sujetos sanos dirigidas contra la α-enolasa y la fosfoproteína 1 inducida por el estrés sobre membranas de PVDF de los diferentes grupos de enfermos. La zona de membrana de PVDF representada para cada uno de los grupos corresponde a un pHi comprendido entre 6,6 y 7,9 y pesos moleculares comprendidos entre 51 y 70 kDa. 25

La figura 8 es una representación gráfica de la detección de anticuerpos anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés (stress induced phosphoprotein 1 o STIP1) por ELISA en los sueros de pacientes que sufren una ScS, una HTAPi, una HTAP asociada a una ScS y en los sueros de sujetos controles sanos (HC). Los datos registrados corresponden a la densidad óptica de las proteínas a 405 nm (DO405), habiéndose restado el ruido de fondo (DO405 del tampón de bicarbonato). Cada punto representa la reactividad de una muestra de suero. Las barras horizontales únicas 30 indican la media y las barras horizontales dobles indican la desviación estándar. Las muestras se consideran positivas cuando la densidad óptica es superior o igual a la media + 2 desviaciones estándar del control (2 et).

La figura 9 muestra el efecto del suero y de las IgG purificadas de pacientes que tienen una ScS, una ScS-HTAP o una HTAPi, sobre la contracción de una matriz de colágeno por las CMLV de la aorta. Se ha seguido durante 4 días la contracción de matrices de colágeno sembradas con las CMLV, en presencia de SVF (suero de ternera fetal), de 35 suero, o de IgG purificadas de pacientes que tienen una ScS, ScS-HTAP, o una HTAPi. A: fotografías de 4 matrices que corresponden a las 4 condiciones patológicas, incubadas con el suero (A1) o con las IgG purificadas (A2), en los días 0 y 4 (J0 y J4). B: representación gráfica de la cinética de contracción de matrices de colágeno incubadas con el suero (A1) o con las IgG purificadas (A2) de pacientes ScS, ScS-HTAP o HTAPi, o de sujetos sanos emparejados. Para cada condición, se han utilizado 10 sueros o IgG purificadas. *Sueros: Sanos/ScS p = 0,012; IgG purificadas 40 Sanos/HTAPi p = 0,001.

La figura 10 muestra el efecto del suero y de las IgG purificadas de pacientes que tienen una ScS, una ScS-HTAP, o una HTAPi, sobre la contracción de una matriz de colágeno por las CMLV activadas por el TNF-α. La contracción de matrices de colágeno sembradas con las CMLV se ha seguido durante dos días (sueros) o tres días (IgG purificadas), en presencia de SVF, de suero, o de IgG purificadas de pacientes que tienen una ScS, una ScS-HTAP, 45 o una HTAPi. A: fotografías de 4 matrices que corresponden a las 4 condiciones patológicas, incubadas con el suero (A1) o con las IgG purificadas (A2), los días 0 y 2 (suero) o el día 3 (IgG purificadas). B: representación gráfica de la cinética de contracción de matrices de colágeno incubadas con el suero (B1) o con las IgG purificadas (B2) de pacientes ScS, ScS-HTAP o HTAPi, o de sujetos sanos emparejados. Para cada condición, se han utilizado 10 sueros o IgG purificadas. *Sanos/HTAPi p = 0,001; Sanos/ScS-HTAP p = 0,029 50

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Sueros

Los inventores han utilizado los sueros de pacientes que tienen una HTAPi o una ScS con o sin HTAP. La HTAP era detectada por una ecografía cardíaca trans-torácica y confirmada por un cateterismo derecho. Los pacientes 55

esclerodérmicos respondían a los criterios de la Asociación Americana de Reumatología (ARA) y/o a los criterios de Leroy y Medsger. Los sueros se recogían y conservaban a -80 ºC antes de su utilización. Todos los pacientes habían firmado un consentimiento informado en el marco del estudio de HTAP-Ig (Contrato de Investigación y de Investigación Clínica 2005 N° CRC 05066, promotor Assistance Publique-Hôpitaux de Paris).

En un primer tiempo los sueros de 15 pacientes que tienen una HTAPi, 15 pacientes que tienen una HTAP-ScS, 15 5 pacientes que tienen una ScS sin HTAP y de 12 sujetos sanos, han sido sometidos a ensayo en experimentos de inmunotransferencia 1D (1 dimensión). En un segundo tiempo, los mismos sueros han sido sometidos a ensayo en la forma de conjuntos de 3 sueros de pacientes que tienen un fenotipo similar. Un conjunto de 12 sueros de sujetos sanos, diferentes de los utilizados en 1D se ha utilizado como testigo en los experimentos de inmunotransferencia en 2D (2 dimensiones). 10

Células

Las CMLV humanas obtenidas a partir de las arterias mamarias en los pacientes que han sufrido un puente aortocoronario han sido proporcionadas por el Dr. Babett Weksler (Institut Cochin, Paris). Estas células han sido inmortalizadas después de la transducción secuencial lentiviral de la subunidad catalítica de la holoenzima humana telomerasa transcriptasa inversa y del antígeno T del poliomavirus SV40 (Virus del simio 40) en un cultivo primario 15 de CMLV adultas (Weksler et al., 2005). Estas células han sido cultivadas en frascos de 175 cm2 en el medio de cultivo Medio 2 de crecimiento de células del músculo liso (PromoCell, Heidelberg, Alemania) suplementado con 5 % de suero de ternera fetal descomplementado (SVF), 0,5 ng/ml de Factor de crecimiento epitelial (EGF), 2 ng/ml de Factor de crecimiento de fibroblastos básico, 5 μg/ml de insulina, 1 % de penicilina/estreptomicina y 1 % de ciprofloxacino. Estas células han sido utilizadas para los experimentos de inmunotransferencia en 1D y 2D. 20

Las CMLV de aorta humana (Cambrex) han sido utilizadas en los experimentos que evalúan el efecto del suero y de las IgG purificadas de pacientes que tienen una ScS, una ScS-HTAP, o una HTAPi, sobre la contracción de una matriz de colágeno por las CMLV no activadas o activadas por el TNF-α

Extracción de las proteínas

Electroforesis en una dimensión 25

Las CMLV llegadas a la confluencia se despegaban con tripsina, se lavaban con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se centrifugaban a 1600 rpm. a 20 ºC. El sedimento celular se recuperaba a continuación en un tampón que contiene dodecilsulfato de sodio al 2 % (SDS), Tris 62,5 mM pH 6,8, β-mercaptoetanol al 5 % en presencia de inhibidores de proteasas: 1 μg/ml de pepstatina, de aprotinina, de leupeptina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF). Se sometía enseguida la mezcla a sonicación en 4 ciclos de 30 segundos en hielo 30 a 4 ºC a una potencia de 25 W y después se calentaba durante 10 min a 100 ºC. Los extractos proteicos eran divididos seguidamente en alícuotas y conservados a -80 ºC hasta utilización.

Electroforesis en dos dimensiones

Las CMLV llegadas a la confluencia se lavaban 2 veces en PBS desprovisto de Mg2+ y de Ca2+, después se despegaban y se recuperaban en una solución isotónica en ausencia de la enzima que contiene agentes quelantes 35 como EDTA (tampón de disociación de células libre de enzimas basado en PBS, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Se recogían las células y después se centrifugaban durante 5 min a 1300 rpm a 20 ºC. Después de un lavado en una solución isotónica de NaCl, se realizaba una segunda centrifugación. Después de haber repetido esta operación por segunda vez, el sedimento celular se congelaba a -80 ºC en presencia de PMSF 1 mM y de un cóctel de inhibidor de proteasas (Complete Mini, Roche Diagnóstico, Meylan, Francia). 40

En un segundo tiempo, las proteínas se extraían después de tres sonicaciones de 30 s cada una a 4 ºC en un tampón compuesto de urea 5 M, tiourea 2 M, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano (CHAPS) al 2 %, Tris 40 mM y anfolitos Bio-Lyte 3/10 al 0,2 % (ReadyPrep Sequential Extraction Reagent 3, Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos). A continuación se realizaban dos ultracentrifugaciones a 150 000 g durante 25 min cada una a 4 ºC (Optima LE-80K, Beckman, Fullerton, CA, Estados Unidos). Con el fin de evitar la perturbación artefactual del 45 ADN liberado a lo largo de la sonicación, se realizaba una congelación a -80 ºC con el fin de hacer precipitar el ADN. El extracto se descongelaba a continuación, se centrifugaba y se recuperaba el sobrenadante. Finalmente, se medía la concentración en proteínas por el método de Lowry (RC DC Protein Assay, Bio-Rad, Richmond, Estados Unidos). Se añadía ditiotreitol (DTT) al extracto a una concentración final 64 mM antes de la congelación a -80 ºC.

Inmunotransferencia 1D 50

Separación de las proteínas por electroforesis monodimensional

Las proteínas de la muestra eran separadas según su peso molecular (PM) sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes en presencia de SDS (SDS-PAGE) con acrilamida al 10 % (acrilamida al 10 %, bisacrilamida al 0,27 %, Tris/HCl 0,375 M pH 8,8, SDS al 0,1 %, persulfato de amonio al 0,1 %, 0,04 % de tetrametiletilendiamina (TEMED) (Biorad, Hercules, CA, Estados Unidos)). Se depositaban ciento veinte microlitros de proteínas en lo alto 55

de cada gel y se efectuaba la migración en un tampón de migración (Tris /HCl 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,1 %) a 25 mA por gel en amperaje constante con un dispositivo mini-PROTEAN III (Bio Rad) durante aproximadamente 50 min.

Electrotransferencia a partir de geles en una dimensión

Les proteínas así separadas se transferían del gel sobre una membrana de nitrocelulosa (Immunetics Inc., Boston, 5 Massachusetts, Estados Unidos) gracias a un módulo de electrotransferencia semi-seco (Semi Dry Electroblotter A ANCOS, Hoejby, Dinamarca) durante 1 h a 50 mA por módulo de transferencia. Las membranas eran bloqueadas a continuación durante 1 h 30 min en el PBS-Tween 20 al 0,2 % (Sigma) e incubadas durante toda la noche en presencia de sueros que pertenecen a uno de los tres grupos siguientes: ScS asociada o no a una HTAP, HTAPi. Los sueros de 12 sujetos sanos eran utilizados como controles y el PBS-Tween al 0,2 % solo sin Ac era utilizado 10 como testigo negativo.. Cada suero de pacientes se diluía a 1/2 en el PBS-Tween al 0,2 % y los sueros de sujetos sanos se diluían a 1/100.

Después de 5 lavados cortos de 20 s y 5 lavados largos de 5 min en una solución de PBS-Tween al 0,2 %, las membranas eran incubadas durante 1 h 30 min a 20 ºC con un Ac secundario anti-lgG humanas específico del fragmento Fcy humano (Ac anti-Fcγ humano) conjugado con la fosfatasa alcalina (Dako, Glostrup, Dinamarca). 15 Después de 5 lavados cortos y 1 lavado largo en PBS-Tween al 0,2 %, las membranas han sido lavadas en una solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 24 mM, NaCl 136,9 mM, KCl 18,6 mM, pH 8) y las reactividades eran reveladas con ayuda del sustrato de la fosfatasa alcalina (bromo-cloro-indolil-fosfato y nitroazul de tetrazolio (Sigma)) en un tampón que contiene Tris 100 mM, NaCl 100 mM, MgCl 2 5 mM (VWR internacional). La reacción se paraba por los lavados con agua bidestilada, y las membranas se secaban y después se sometían a un barrido con 20 ayuda de un escáner de alta resolución (Perfection 12008 Seiko Epson Corporation, Hirooka, Japón).

Inmunotransferencia 2D

Isoelectroenfoque (IEF)

El isoelectroenfoque permite la separación de las proteínas según su pH isoeléctrico (pHi). Esta etapa se realizaba en gradiente de pH inmovilizado (IPG), es decir que se llevaba a cabo sobre un gel de acrilamida vertido sobre una 25 banda rígida (tira) en la que se había preformado un gradiente de pH, aquí, un gradiente de 3 a 10 (ReadyStrip 17 cm, pH 3-10, Bio-Rad). Las bandas eran colocadas en una cuba horizontal Bio-Rad tipo célula Protean IEF a temperatura ambiente. Cada banda se colocaba en una ranura en presencia de una mezcla que contiene tampón de rehidratación y 100 μg de extractos proteicos de CMLV; era recubierto todo con 2 ml de aceite mineral con el fin de limitar la evaporación. El tampón de rehidratación estaba constituido por urea de alta pureza 7 M (VWR, Fontenay-30 Sous-Bois, Francia), tiourea 2 M (Sigma), CHAPS al 4 % (Sigma), triton X100 al 0,002 % (Sigma), DTT (Sigma), azul de bromofenol, y anfolitos Pharmalytes 3-10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia).

El isoelectroenfoque comprendía una hidratación pasiva de 9 h seguida de una hidratación activa de 12 h de las bandas bajo una tensión de 50 V. A continuación, se realizaba el isoelectroenfoque como sigue: 1 h a 200 V (eliminación del exceso de sales), después subida lineal de la tensión durante 1 h hasta 1000 V, después durante 6 35 h hasta 10.000 V y después durante 1 h hasta 10.000 V.

Separación de las proteínas en gel de acrilamida (SDS-PAGE)

Esta segunda etapa permitía la separación de las proteínas según su peso molecular (PM). Doce geles de 20 x 20 x 0,1 cm con un gradiente de acrilamida de 7 a 18,5 % eran vertidos simultáneamente en una cuba multi-geles (Protean Plus Multi-Casting Chamber, Bio- Rad) asegurando una reproductibilidad óptima y permitiendo la 40 separación de proteínas con un PM comprendido entre 10 y 250 kDa. Antes de realizar la segunda dimensión, las bandas obtenidas al final de la etapa precedente eran puestas en presencia de 2 tampones de equilibrio con el fin de reducir y alcalinizar los grupos sulfhidrilo de las cisteínas. El primer tampón de equilibrio se componía de Tris 50 mM, urea 6 mM, glicerol al 40 %, SDS 52 mM y DTT 32,4 mM. El segundo tampón estaba compuesto de Tris 50 mM, urea 6 mM, glicerol al 40 %, SDS 52 mM y yodoacetamida 86,5 mM. A continuación, las bandas se mantenían en 45 contacto con los geles de acrilamida en una solución de agarosa al 1 % (Agarosa de bajo punto de fusión ultrapura, Gibco BRL Invitrogen) que contiene azul de bromofenol para seguir el frente de la migración. Se habían dispuesto marcadores de PM a ambas partes de la banda. La migración duraba alrededor de 30 h en un tampón de migración (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 3,5 mM, tiosulfato de sodio 1,25 mM (Sigma)) mantenido a 10 ºC (Cuve Protean Plus Dodeca CeII Bio-Rad, Cryostat MultiTemp III Amersham Biosciences) a amperaje constante; 40 V durante 1 h 50 después 80 V durante 1 h y finalmente 15 mA/gel hasta que el frente de migración se había salido de los geles.

Al final de la migración en la segunda dimensión, 11 geles eran transferidos sobre las membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (membranas de transferencia Immobilon-P, poros de 0,45 μm, Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos), mientras que el último gel era teñido con nitrato de plata.

55

Electrotransferencia

La transferencia semiseca se efectuaba a 4 ºC durante 1 h 30 min a amperaje constante (320 mA). Al final de la transferencia, las membranas se sumergían durante 5 min en una solución de PBS compuesta de NaCl 148 mM, NaH2PO4,2H2O 3,5 mM, Na2HPO4,12H2O 17,6 mM, y después se secaban.

Tinción de los geles no transferidos 5

El gel no transferido (llamado también gel de referencia) se teñía con nitrato de plata (Rabilloud et al., 1990) en 5 etapas; fijación (etanol absoluto al 30 %, ácido acético al 5 %), lavado (nitrato de plata 11,8 mM (Sigma), formaldehido 3,45 mM (Sigma), tinción (nitrato de plata al 0,02 %) y finalmente revelado (formaldehido al 37 %, carbonato de sodio, tiosulfato). El gel era conservado a continuación en una solución de conservación (dimetilsulfóxido al 2 % (Sigma), ácido acético al 10 % antes de ser barrido con ayuda de un densitómetro (GS-800, 10 Bio-Rad).

Incubación de las membranas de PVDF con los sueros y revelado de las reactividades

Las membranas de PVDF inicialmente bloqueadas con PBS-Tween al 0,2 % se incubaban toda la noche en presencia de sueros de pacientes que pertenecen a uno de los tres grupos descritos precedentemente: HTAPi, HTAP-ScS o ScS sin HTAP. Para cada membrana, se utilizaba un conjunto de tres sueros que pertenecen a un 15 mismo grupo diluido a 1/100 en una solución de PBS-Tween al 0,2 %. Para cada experimento, se incubaba una membrana con un conjunto de 12 sueros de sujetos sanos diluido en el mismo tampón a 1/100. El revelado de las reactividades se efectuaba como precedentemente en el caso de la inmunotransferencia 1D (Ac anti-Fcγ humano conjugado con fosfatasa alcalina, revelado de las reactividades con ayuda del sustrato de la fosfatasa alcalina) después se secaban las membranas y se fotografiaban con ayuda de un densitómetro (GS-800, Bio-Rad). Las 20 membranas se teñían a continuación con oro coloidal (Protogold®, BioCell, Cardiff, GB) con el fin de revelar el conjunto de las proteínas transferidas a la superficie de las membranas. A continuación se efectuaba una nueva adquisición densitométrica.

Análisis informático

El análisis informático de los geles y membranas era realizado con ayuda de un programa concebido especialmente 25 para el análisis de los geles bidimensionales (Image Master 2D® Platinum 6.0, Buckinghamshire, Inglaterra). La primera etapa consistía en una detección automática de las manchas proteicas en función de los parámetros que se han elegido (número de operaciones efectuadas para eliminar el ruido de fondo, umbral Laplacien y superficie mínima de las manchas a detectar). Las manchas detectadas se controlaban visualmente con ayuda de procedimientos de reconstrucción en 3 dimensiones, con el fin de eliminar los falsos positivos y ver las manchas de 30 reactividad no detectadas por el programa. A continuación, cada mancha proteica reconocida por las IgG de un individuo era emparejada con la proteína correspondiente con ayuda de la fotografía densitométrica de la misma membrana realizada después de la tinción con oro coloidal. Esta etapa se realizaba para cada una de las 16 membranas. Finalmente, las proteínas transferidas sobre las membranas se emparejaban con las proteínas del gel elegido como gel de referencia. Esto permitía recoger todas las informaciones sobre el gel de referencia y poder 35 comparar a continuación las manchas proteicas reconocidas por los sujetos sanos y por los pacientes en el seno de los diferentes grupos estudiados.

Espectrometría de masas

Las manchas proteicas reconocidas como dianas antigénicas eran extraídas por taladro de un nuevo gel de acrilamida cargado con 400 μg de extractos proteicos y coloreado con azul de Coomassie. Cada mancha extraída 40 era colocada en el pocillo de una placa de 96 pocillos y digerida en presencia de tripsina (Promega, Francia) durante toda una noche. Las muestras digeridas eran transferidas seguidamente a otra placa de 96 pocillos depositada después a 4 ºC antes del análisis por espectrometría de masas tipo 'Desorción-ionización mediante láser asistida por matriz-Tiempo de vuelo' (MALDI- TOF) (PerSeptive Biosystems Framingham, MA, Estados Unidos).

Valoración de anticuerpos anti-STIP1 por ELISA 45

La fosfoproteína 1 inducida por el estrés (STIP1) ha sido obtenida de la sociedad Tebu-bio (Tebu-bio, Maryland, USA), se ha diluido en un tampón de bicarbonato y se ha depositado sobre placas de 96 pocillos (Maxisorb, NalgeNunc Int. Rochester, NY, USA) a una concentración final de 3 μg/mL a 4 ºC. La reactividad de las IgG séricas obtenidas a partir de 75 pacientes esclerodérmicos sin HTAP, 74 afectados de HTAPi, 37 pacientes esclerodérmicos con HTAP (ScS-HTAP), y 70 sujetos sanos (HC) ha sido analizada por ELISA contra STIP-1. Los pocillos han sido 50 lavados cinco veces con tampón fosfato (PBS) y bloqueados con ayuda de una solución PBS-seroalbúmina bovina al 1 % durante una hora a 37 ºC. Los sueros han sido diluidos a 1/100 en PBS, introducidos por duplicado e incubados durante una hora a temperatura ambiente. Anticuerpos policlonales de ratones anti-STIP-1 (Tebu-bio, Maryland, USA) han sido diluidos a 1/500 y utilizados como control positivo. Las placas se han lavado como se ha mencionado antes, y los anticuerpos de conejo anti-Fcγ humano conjugados con fosfatasa alcalina (Tebu-bio, 55 Maryland, USA; diluidos a 1/1000), con los anticuerpos de asno anti-lgG de conejo (Jackson ImmunoResearch, West Baltimore Pike, USA; diluidos a 1/10000) se han incubado durante una hora a temperatura ambiente. Las

reactividades se han revelado por la adición de p-nitrofenilfosfato (Sigma-AIdrich, St. Louis, USA) y se ha medido la absorbancia (DO) a 405 nm. El ruido de fondo de densidad óptica (pocillos recubiertos de tampón bicarbonato únicamente) se ha restado del valor de la DO obtenido con las proteínas. Las muestras se han considerado positivas cuando la densidad óptica era superior o igual a la media + 2 desviaciones estándar del control (2et).

Estudio del efecto de los sueros o de las IgG purificadas de pacientes frente a sujetos sanos sobre la contracción de 5 las CMLV o de los fibroblastos

Sueros e IgG purificadas

Los inventores han utilizado los sueros de 10 pacientes esclerodérmicos sin HTAP (denominados en lo sucesivo ScS), 10 pacientes esclerodérmicos con HTAP (ScS-HTAP), y 10 pacientes afectados de HTAPi. Diez sujetos sanos emparejados en cuanto a sexo y edad han sido igualmente sometidos a ensayo. Los pacientes esclerodérmicos 10 responden a los criterios de la Asociación Americana de Reumatología (ARA) y/o a los criterios de Leroy y Medsger. Los sueros se conservaban a -80 ºC antes de su utilización. Todos los pacientes y los sujetos sanos han firmado un consentimiento informado en el marco del estudio HTAP-Ig (Contrato de Investigación y de Investigación Clínica 2005 N° CR C 05066, promotor Assistance Publique-Hôpitaux de Paris; investigador coordinador Luc Mouthon; centro de gestión URC Cochin). 15

Las IgG han sido purificadas del suero de los pacientes y de los sujetos sanos sobre una columna de proteína G sefarosa. Las IgG purificadas han sido cuantificadas por espectrofotometría a 260 y 280 nm. La pureza de las preparaciones de IgG purificadas ha sido determinada por SDS-PAGE.

Cultivo celular

Las CMLV humanas obtenidas a partir de las arterias mamarias de los pacientes que han sufrido un puente 20 aortocoronario inmortalizadas después de la transducción secuencial lentiviral de la subunidad catalítica de la holoenzima humana telomerasa transcriptasa inversa (hTERT) y del antígeno T del poliomavirus SV40 (Virus del simio 40) en un cultivo primario de CMLV adultas (Weksler et al., 2005) han sido proporcionadas por el Dr. Babett Weksler (Institut Cochin, Paris). Estas células han sido cultivadas en medio de cultivo DMEM (Gibco BRL Invitrogen™ Cergy Pontoise, Francia) suplementado con 10 % de suero de ternera fetal (SVF) filtrado y 25 descomplementado, con 1 % de penicilina/estreptomicina y 1 % de ciprofloxacino.

Las CMLV humanas de la aorta (PromoCell, Heidelberg, Alemania) han sido cultivadas en el medio de cultivo Medio 2 de crecimiento de células del músculo liso (PromoCell, Heidelberg, Alemania) suplementado con 5 % de suero de ternera fetal descomplementado (SVF), 0,5 ng/ml de Factor de crecimiento epitelial (EGF), 2 ng/ml de Factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), 5 μg/ml de insulina, 1 % de penicilina/estreptomicina y 1 % de 30 ciprofloxacino.

Contracción de una matriz de colágeno

Las CMLV han sido recogidas con tripsina al 0,25 % EDTA 1 mM (Gibco BRL Invitrogen™ Cergy Pontoise, Francia) neutralizada por 5 % de SVF. Las matrices de colágeno han sido preparadas en placas de 35 mm con 1 ml de medio sin SVF que contienen 500.000 CMLV, 1,65 ml de medio 1 % de suero (SVF, suero de paciente o suero sano) o 128 35 μg/ml de IgG purificadas, y 1 ml de colágeno a 3,35 mg/ml (BD Biosciences, Franklin Lakes, Estados Unidos). Para el ensayo de contracción con activación de las CMLV, se han añadido 40 ng/ml de TNF-α (R&D Systems, Abingdon, England). Después de una incubación de 1 h a 37 ºC que permite la polimerización, se han despegado las matrices dando golpecitos suaves sobre los bordes de la placa, con el fin de iniciar la contracción. Para determinar el grado de contracción del gel, se han realizado fotografías los días 2 y 4, con el fin de medir la superficie de la matriz. Se 40 han comparado los resultados obtenidos con los sueros de sujetos sanos y de pacientes. Se han analizado veinte sueros en cada experimento; los diferentes ensayos de contracción se han verificado gracias al SVF y a un suero de referencia utilizado por duplicado. Este control permitía verificar la buena reproductibilidad del ensayo. Las medidas se han efectuado gracias al programa Image J (Nacional Institute of Health NIH, Estados Unidos).

Resultados 45

Inmunotransferencia 1D

En un primer tiempo, los inventores han ensayado por separado las reactividades de IgG de los sueros de 15 pacientes en cada grupo y de 15 sujetos sanos en inmunotransferencia 1D a una dilución de 1/100. Se han puesto en evidencia numerosas reactividades con los sueros de pacientes (ScS, HTAP-ScS, HTAPi) de las cuales algunas eran muy intensas en comparación con los sueros de sujetos sanos que no presentaban casi ninguna banda de 50 inmunorreactividad de IgG. El número de las bandas de reactividad era más importante en el caso de los pacientes esclerodérmicos con o sin HTAP que en el caso de los pacientes que tienen una HTAPi. Además, ciertas bandas de reactividades parecían específicas de un grupo de enfermos dado, en particular una banda de aproximadamente 90 kDa en ciertos pacientes esclerodérmicos con o sin HTAP (Figura 1). Con el fin de identificar las dianas antigénicas de las IgG anti-CMVL de los pacientes, los inventores han efectuado después las inmunotransferencias 2D. 55

Cartografía de las proteínas de CMLV después de la separación en dos dimensiones

Después de haber hecho migrar 100 μg de extractos proteicos de CMLV preparados como se describe en la sección Materiales y métodos, los inventores han podido separar y después teñir con nitrato de plata 880 manchas proteicas y obtener el gel representado en la figura 2. Los inventores han podido estimar el PM y el pHi de cada una de estas manchas proteicas después de un análisis informático según su disposición en el gel y con ayuda de marcadores de 5 PM; las manchas tenían mayoritariamente un PM comprendido entre 10 y 125 kDa y un pHi comprendido entre 3 y 8.

Inmunotransferencia 2D de las IgG séricas de sujetos sanos y de pacientes con respecto a proteínas de células musculares lisas vasculares

Se han identificado 635 reactividades después del emparejamiento de las reactividades presentes sobre cada una 10 de las dieciséis membranas de PVDF con el gel de referencia, considerando las reactividades de las IgG séricas de los conjuntos de tres pacientes y las del conjunto de sujetos sanos adicionadas.

Sujetos sanos

Se han mezclado los sueros de 12 sujetos sanos y se han analizado sus reactividades. Las IgG de estos sujetos reconocían 150 manchas proteicas de CMVL (Figura 3). Veintiuna manchas proteicas eran específicas de los 15 sujetos sanos (no reconocidas por los pacientes).

Pacientes esclerodérmicos

Los 5 conjuntos de 3 sueros de pacientes afectados de ScS sin HTAP reconocían una media de 127 ± 26 manchas proteicas (figura 3) y un total de 367 manchas diferentes. El 71 % de estas manchas no eran reconocidas por los sujetos sanos. Entre estas 367 manchas, 13 eran comunes a los 5 conjuntos de pacientes esclerodérmicos (de las 20 cuales una sola no era reconocida por los sujetos sanos), 18 comunes a 4 conjuntos sobre 5 (de las cuales 7 no eran reconocidas por los sujetos sanos) y 39 comunes a 3 conjuntos sobre 5 (de las cuales 19 no eran reconocidas por los sujetos sanos) (figura 4).

Las manchas proteicas comunes a los 5 conjuntos de pacientes ScS sin HTAP eran todas igualmente reconocidas por ciertos conjuntos de pacientes afectados de HTAPi y de HTAP-ScS. Sobre las 18 manchas proteicas 25 reconocidas por 4/5 de los conjuntos de pacientes ScS, 9 eran igualmente reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de pacientes de cada uno de los otros dos grupos de enfermos (de las cuales 3 no eran reconocidas por los sujetos sanos), 5 eran reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes HTAP-ScS (de las cuales una no era reconocida por los sujetos sanos), y 3 eran reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes HTAPi (de las cuales 2 no eran reconocidas por los sujetos sanos). Una mancha (5325) era reconocida 30 por un solo conjunto de pacientes HTAP-ScS, por ningún conjunto de pacientes HTAPi y por ningún conjunto de sujetos sanos.

Las IgG de los 5 conjuntos de 3 sueros de pacientes afectados de HTAP-ScS reconocían una media de 145 ± 48 manchas proteicas (figura 4). En total, 264 manchas proteicas diferentes eran reconocidas por las IgG séricas de estos pacientes, de las cuales el 77 % no eran reconocidas por las IgG de los sujetos sanos. Entre estas 264 35 manchas proteicas, 19 eran comunes a los 5 conjuntos de pacientes HTAP-ScS (de las cuales 2 no eran reconocidas por los sujetos sanos), 29 comunes a 4/5 de los conjuntos (de las cuales 9 no eran reconocidas por los sujetos sanos) y 47 comunes a 3/5 de los conjuntos (de las cuales 30 no eran reconocidas por los sujetos sanos) (figura 4).

Las manchas proteicas comunes a los 5 conjuntos de pacientes HTAP-ScS eran igualmente mayoritariamente 40 reconocidas por los pacientes afectados de HTAPi y de HTAP-ScS. Más precisamente, 16 manchas eran reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de pacientes de los otros dos grupos (de las cuales 1 sola no era reconocida por los sujetos sanos), 3 eran reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de pacientes HTAPi (de las cuales 1 sola no era reconocida por los sujetos sanos) y 1 mancha era reconocida por al menos 3/5 de los conjuntos de pacientes ScS. 45

Contrariamente a los pacientes afectados de ScS, la mayoría de las manchas reconocidas por 4/5 de los conjuntos de pacientes HTAP-ScS eran reconocidas por menos de 40 % de los enfermos de los otros dos grupos. Más precisamente, 12 manchas eran reconocidas por menos de 40 % de los enfermos de los otros dos grupos, de las cuales 5 manchas no eran reconocidas por los pacientes ScS (4658, 5206, 4831, 4707, 4659) y 3 manchas no eran reconocidas por los pacientes HTAPi (4656, 5190, 4707). 9 manchas eran reconocidas por al menos 3/5 de los 50 conjuntos de los pacientes ScS y HTAPi (de las cuales 2 no eran reconocidas por los sujetos sanos), 5 eran reconocidas por al menos 3/5 de los pacientes HTAPi (de las cuales 1 no era reconocida por los sujetos sanos) y 3 eran reconocidas por al menos 3/5 de los pacientes ScS (estas 3 manchas eran todas igualmente reconocidas por los sujetos sanos).

55

Pacientes afectados de HTAP idiopática

Las IgG de los 5 conjuntos de 3 sueros de pacientes afectados de HTAPi reconocían una media de 130 ± 25 manchas proteicas (figura 3). En total, 356 manchas proteicas diferentes eran reconocidas por las IgG de estos pacientes, y el 70 % no eran reconocidas por las IgG de los sujetos sanos. Entre estas 356 manchas proteicas, 12 eran comunes a los 5 conjuntos de pacientes (pero todas eran reconocidas por los sujetos sanos), 24 comunes a 4/5 5 de los conjuntos (de las cuales 7 no eran reconocidas por los sujetos sanos) y 54 comunes a 3/5 de los conjuntos (de las cuales 31 no eran reconocidas por los sujetos sanos) (figura 4).

Las manchas proteicas comunes a los 5 conjuntos de pacientes HTAPi eran igualmente mayoritariamente reconocidas por los conjuntos de pacientes afectados de HTAPi o de HTAP-ScS. Más precisamente, 10 eran igualmente reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes ScS y de los pacientes HTAP-ScS, una 10 era reconocida igualmente por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes ScS y otra por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes HTAP-ScS.

Las manchas proteicas reconocidas por 4/5 de los conjuntos de sueros de pacientes HTAPi eran mayoritariamente compartidas con los otros 2 grupos de enfermos. Más precisamente, 15 manchas eran igualmente reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes ScS y 3/5 de los conjuntos de los pacientes HTAP-ScS (de las cuales 15 4 no eran reconocidas por los sujetos sanos), 3 manchas eran igualmente reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes ScS (de las cuales una no era reconocida por los sujetos sanos) y una era también reconocida por al menos 3/5 de los conjuntos de los pacientes HTAP-ScS (y por los sujetos sanos). 5 manchas eran reconocidas por menos del 40 % de los conjuntos de los pacientes ScS o HTAP-ScS (de las cuales 4 no eran reconocidas por los sujetos sanos). Entre estas 4 manchas, una no era reconocida por los pacientes ScS (4735). 20

Comparación de las reactividades de las IgG de pacientes esclerodérmicos con o sin HTAP, de pacientes que tienen una HTAP idiopática y de sujetos sanos e identificación de los antígenos específicos de un grupo de enfermos

Los inventores han comparado los perfiles de reactividad de las IgG del conjunto de sueros de sujetos sanos y de los conjuntos de sueros de pacientes con respecto a las proteínas de CMLV. Cualquiera que sea el grupo de pacientes, la mayor parte de las manchas proteicas no reconocidas por las IgG de sujetos sanos lo eran por un 25 único grupo de pacientes sobre 5 (figura 5). Seleccionando las manchas proteicas reconocidas por al menos 3/5 de los conjuntos de sueros de pacientes de un grupo dado y no por el conjunto de los sujetos sanos, los inventores han identificado 21 manchas proteicas de interés (tabla 1). Aunque el resultado de todas las manchas proteicas digeridas no se ha obtenido todavía, se han podido identificar 13 manchas proteicas interesantes. La localización de estas manchas proteicas sobre el gel de referencia está indicada en la figura 6. Dos manchas (5190, 5325) parecen 30 específicas de la ScS puesto que son reconocidas respectivamente por 3/5 y 4/5 de los conjuntos de pacientes ScS y 4/5 y 1/5 de los conjuntos de pacientes HTAP-ScS, pero por ningún conjunto de pacientes HTAPi. Una de ellas (5325) ha sido identificada como la galectina.

Tabla 1: Identificación de las manchas proteicas reconocidas por las IgG de al menos 4/5 de los conjuntos de pacientes de un grupo dado y no por las IgG del conjunto de sujetos sanos. La identificación de un mismo antígeno candidato para manchas diferentes corresponde a la detección de isoformas de la proteína.

Mancha

pHi PM (kDa) Antígeno candidato Número de conjuntos de pacientes que reconocen el antígeno Nombre y número de acceso Swissprot de los antígenos candidatos

ScS (n=5)

HTAP-ScS (n=5) HTAPi (n=5)

4484

6,7 82 Precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa 4 0 3 GRP78_HUMAN P11021 (SEQ. ID. NO: 18)

4488

6,8 81 Caldesmona 2 2 4 CALD1_HUMAN Q05682 (SEQ. ID. NO: 5)

4735

5,5 51 Proteína FAM10A4 0 2 4 F10A4_HUMAN Q81ZP2 (SEQ. ID. NO: 6)

4787

5,7 46 Actina citoplásmica 2 3 3 4 ACTG_HUMAN P63261 (SEQ. ID. NO: 8)

4660

6,2 60 Precursor A3 de la proteína disulfuro-isomerasa, Desmina, Periferina 1 4 1 PDIA3_HUMAN P30101 (SEQ. ID. NO: 10) DESM_HUMAN P14661 (SEQ. ID. NO: 11) PERI_HUMAN P41219 (SEQ. ID. NO: 12)

4691

6,4 56 Ribonucleoproteína H nuclear heterogénea 1 4 1 HNRH1_HUMAN P31943 (SEQ. ID. NO: 13)

Identificación de los antígenos diana de las IgG anti-CMLV reconocidos con una intensidad significativamente mayor en los enfermos que en los sujetos sanos 5

En un segundo tiempo los inventores han identificado las manchas proteicas de CMLV reconocidas por las IgG de conjuntos de 3 sueros de pacientes y por las IgG del conjunto de sujetos sanos, con la condición que estas manchas proteicas sean reconocidas con una gran intensidad por las IgG de un gran número de conjuntos de 3 sueros de pacientes y con una intensidad mayor que los sujetos sanos. Veintisiete manchas proteicas han respondido a estos criterios (Tabla 2). Las reactividades de las IgG séricas de los diferentes grupos de enfermos con respecto a las 10 manchas proteicas 4576, 4570 y 4576 identificadas como las isoformas de la fosfoproteína inducida por el estrés y con respecto a la mancha 4738 identificada como la α-enolasa se representan en la figura 7. La región seleccionada se representa en la figura 6.

Tabla 2: Identificación de las manchas proteicas reconocidas con una intensidad significativamente mayor en los pacientes que en los sujetos sanos

Mancha

pHi PM (kDa) Antígeno candidato Número de conjuntos de pacientes que reconocen el antígeno Nombre y número de acceso Swissprot de los antígenos candidatos

ScS (n=5)

HTAP-ScS (n=5) HTAPi (n=5)

4757

5,2 49 Vimentina 5 4 5 VIME_HUMAN P08670 (SEQ. ID. NO: 19)

4576

6,9 70 Fosfoproteína 1 inducida por el estrés 5 4 5 STIP1_HUMAN P31948 (SEQ. ID. NO: 14)

4570

7,1 70 Fosfoproteína 1 inducida por el estrés 5 5 5 STIP1_HUMAN P31948 (SEQ. ID. NO: 14)

4575

6,8 70 Fosfoproteína 1 inducida por el estrés 5 4 5 STIP1_HUMAN P31948 (SEQ. ID. NO: 14)

4538

7,4 51 α-enolasa 5 5 5 ENOA_HUMAN P06733 (SEQ. ID. NO: 20)

5052

6,7 27 Triosafosfato isomerasa 3 2 2 TPIS_HUMAN P60174 (SEQ. ID. NO: 15)

4536

6,1 74 Precursor de la albúmina sérica 4 4 4 ALBU_HUMAN P02768 (SEQ. ID. NO: 1)

5063

5,8 26 lsozima L1 de la carboxilo-terminal hidrolasa de ubiquitina 4 1 3 UCHL1_HUMAN P09936 (SEQ. ID. NO: 4)

5064

5,9 26 lsozima L1 de la carboxilo-terminal hidrolasa de ubiquitina 4 1 4 UCHL1_HUMAN P09936 (SEQ. ID. NO: 4)

4463

6,7 85 Zixina 4 3 4 ZYX_HUMAN Q15942 (SEQ. ID. NO: 2)

4539

6,2 73 Precursor de la albúmina sérica 4 4 4 ALBU_HUMAN P02768 (SEQ. ID. NO: 1)

5325

5,4 15 Galectina-1 4 0 1 LEG1_HUMAN P09382 (SEQ. ID. NO: 3)

4734

7,0 51 α-enolasa 4 1 5 ENOA_HUMAN P06733 (SEQ. ID. NO: 20)

5047

6,8 27 Peroxiredoxina-6 2 5 4 PRDX6_HUMAN P30041 (SEQ. ID. NO: 16)

4441

7,4 89 Proteína 2 (proteína 2 de unión al elemento aguas arriba Far) 3 4 3 FUBP2_HUMAN Q92945 (SEQ. ID. NO: 7)

4446

7,2 89 Proteína 2 (proteína 2 de unión al elemento aguas arriba Far) 3 4 2 FUBP2_HUMAN Q92945 (SEQ. ID. NO: 7)

4833

4,9 43 Precursor de la reticulocalbina-1 2 3 5 RCN1_HUMAN Q15293 (SEQ. ID. NO: 17)

4747

5,2 50 γ-enolasa Vimentina 1 3 5 ENOG_HUMAN P009104 (SEQ. ID. NO: 9) VIME_HUMAN P08670 (SEQ. ID. NO: 19)

Valoración con ELISA de anticuerpos anti-STIP1

Los inventores han puesto en evidencia que 56/75 (74,6 %) pacientes esclerodérmicos, 24/74 (32,4 %) pacientes con una HTAPi, 27/37 (73 %) pacientes con una HTAP-ScS y 2/70 (2,8 %) sujetos sanos tenían anticuerpos anti-STIP1. Por lo tanto casi las tres cuartas partes de los pacientes esclerodérmicos, tuvieran o no una HTAP y casi un tercio de los pacientes afectados de HTAPi tenían anticuerpos anti-STIP1, mientras que por regla general estos 5 anticuerpos estaban ausentes en los sujetos sanos.

Efecto de los sueros o de las IgG purificadas de pacientes frente a sujetos sanos sobre la contracción de las CMLV o de los fibroblastos

Los inventores han determinado si los sueros y/o las IgG séricas de pacientes que tienen una ScS y/o una HTAP tenían un efecto sobre la contracción de las CMLV y de los fibroblastos, fenómeno implicado en el remodelado 10 vascular y en la movilidad de las células. Para esto, se han sembrado las células en una matriz de colágeno, y se han incubado en presencia de 1 % de SVF, de sueros, o de IgG purificadas de pacientes que tenían una ScS y/o una HTAP frente a los de sujetos sanos. La retracción cuantificable de la matriz de colágeno refleja la actividad contráctil de las células. El experimento se ha realizado a partir de células sanas y no activadas. Se ha seguido la cinética de contracción de las matrices de colágeno durante 4 días para las CMLV y durante 7 días para los 15 fibroblastos. Los resultados obtenidos con las CMLV se presentan en la figura 9.

CMLV

Para estas células, se han analizado los sueros de 15 pacientes de cada condición patológica (ScS, HTAPi, ScS-HTAP) y de 15 sujetos sanos así como las IgG purificadas de 10 de estos 15 pacientes y de 10 de estos 15 sujetos sanos. El SVF utilizado por duplicado, ha permitido ponderar entre sí los diferentes ensayos. La cinética de 20 contracción de las matrices de colágeno se ha seguido durante 4 días, los experimentos preliminares habían puesto en evidencia que las modificaciones observadas más allá de esto eran mínimas (Figura 9B); las superficies de las matrices de colágeno se han medido los días 2 y 4 con ayuda del programa Image J y se han calculado en porcentaje de la superficie de la matriz inicial.

El día 4 (J4), la media de las superficies de las 15 matrices (en % de la superficie inicial) incubadas con el suero era 25 de 27,8 % ± 6,0 para los ScS, 31,1 % ± 8,3 para los HTAPi, 29,4 % ± 4,7 para los ScS-HTAP, y 34,3 % ± 7,1 para los sujetos sanos. Las 15 superficies de las matrices de colágeno incubadas con el suero de los pacientes ScS diferían significativamente en comparación con las superficies de las 15 matrices incubadas con el suero de los sujetos sanos (p = 0,012). En cambio, las diferencias entre las superficies obtenidas en presencia de los otros dos grupos de sueros de pacientes (HTAPi, ScS-HTAP) y el grupo de sueros de los sujetos sanos no eran significativas. 30

El día 4, la media de las superficies de las 10 matrices (en % de la superficie inicial) incubadas con las IgG purificadas era de 53,9 % ± 8,2 para los ScS, 48,0 % ± 3,2 para los HTAPi, 55,8 % ± 8,9 para los ScS-HTAP, y 34,3 % ± 8,6 para los sujetos sanos. Se nota una diferencia significativa entre las matrices incubadas con las IgG purificadas de pacientes HTAPi y las incubadas con las IgG de sujetos sanos (p = 0,001).

Si se comparan entre sí los dos experimentos (Figura 9B1 vs 9B2), se observa que las matrices incubadas con las 35 IgG purificadas se retraían menos que las incubadas con los sueros.

Ejemplo 2

Los inventores han sometido las muestras de los pacientes afectados de una ScS, de una HTAP-ScS o de una HTAPi, así como las muestras de sujetos sanos, a otro análisis de sus reactividades con el fin de afinar los resultados obtenidos y de identificar otros anticuerpos anti-CMLV. 40

Este estudio ha permitido poner en evidencia reactividades contra la peroxirredoxina-2 (mancha 5122; Swissprot: PRDX2_HUMAN, n°P32119; SEQ ID NO:21), el precursor mitocondrial de la peróxido-reductasa dependiente de la tioredoxina (Precursor mitocondrial de la peróxido-reductasa dependiente de la tioredoxina; mancha 5096; Swissprot: PRDX3_HUMAN, n°P30048; SEQ ID NO:22), de la proteína de activación de GTPasa específica de Ran (Proteína de activación de GTPasa específica de Ran; mancha 5024; Swissprot: RANG_HUMAN, n°P43487; SEQ ID 45 NO:23) y de la proteína B1 del grupo de alta movilidad (mancha 5011; Swissprot: HMGB1_HUMAN, n°P09429; SEQ ID NO:24). Las reactividades contra la cadena beta de la tubulina y contra la polimerasa I y factor de liberación de la transcripción en la mancha 4672. Entre estas reactividades, las dirigidas contra la peroxiredoxina-2, la cadena beta de la tubulina y la polimerasa I y factor de liberación de la transcripción están específicamente presentes en las IgG de los conjuntos de pacientes, y no en las IgG del conjunto de sujetos sanos. Las reactividades contra el precursor 50 mitocondrial de la peróxido-reductasa dependiente de la tioredoxina, la proteína de activación de GTPasa específica de Ran y la proteína B1 del grupo de alta movilidad han sido identificadas en los conjuntos de pacientes y de sujetos sanos, pero de manera significativamente más elevada en los pacientes.

Además, los resultados que se presentan en el ejemplo 1 han podido ser afinados. Los inventores han podido demostrar así que los anticuerpos anti-actina citoplásmica 2 están presentes en los conjuntos de pacientes y de 55 sujetos sanos, pero de manera significativamente más elevada en los pacientes. Han podido demostrar igualmente

la existencia de reactividad contra la galectina 1 y la zixina en las IgG de los conjuntos de pacientes, y no en las IgG del conjunto de sujetos sanos.

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Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento in vitro de detección de una esclerodermia sistémica (ScS) o de una hipertensión arterial pulmonar asociada a una esclerodermia (HTAP-ScS) o de una hipertensión arterial pulmonar idiopática (HTAPi) en un sujeto, que comprende la determinación de la presencia y/o de la cantidad de al menos un anticuerpo elegido del grupo constituido por los anticuerpos anti-galectina-1, anti-proteína FAM10A4, anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés, y 5 anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa, en una muestra biológica procedente de un paciente,

   siendo indicativa de una ScS o de una HTAPi, la presencia de un anticuerpo anti-precursor de la proteína de 78 kDa regulada por la glucosa;

   siendo indicativa de una HTAP-ScS o de una HTAPi, la presencia de un anticuerpo anti-proteína FAM10A4; 10

   siendo indicativa de una ScS, la presencia de un anticuerpo anti-galectina-1;

   o siendo indicativa de una ScS, de una HTAP-ScS o de una HTAPi, la presencia de una cantidad superior a un valor control de un anticuerpo anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el cual la muestra biológica es una muestra de sangre o de suero.
3. 3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, en el cual la cantidad de dicho al menos un anticuerpo se 15 determina por un inmunoensayo.
4. 4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el cual el inmunoensayo es una valoración ELISA.
5. 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el paciente es un ser humano.
6. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el paciente sufre de una esclerodermia sistémica, con o sin hipertensión arterial pulmonar asociada. 20
7. 7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el paciente sufre de una hipertensión arterial pulmonar idiopática.
8. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual la hipertensión arterial pulmonar está asociada a una hipertensión portal, a una cardiopatía congénita, o a una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o es una hipertensión pulmonar post-embólica. 25
9. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual el paciente es un sujeto predispuesto a desarrollar una esclerodermia sistémica o una hipertensión arterial pulmonar asociada a una esclerodermia o una hipertensión arterial pulmonar idiopática
10. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el cual el sujeto es portador de una o varias mutaciones en el gen que codifica BMPRII, endoglina o ALK1. 30
11. 11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho al menos un anticuerpo, un anticuerpo anti-galectina 1.
12. 12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho al menos un anticuerpo, un anticuerpo anti-fosfoproteína 1 inducida por el estrés.

    35