ES2413484T3 - Procedimientos y composiciones para la biosíntesis recombinante de n-alcanos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir hidrocarburos, que comprende: (i) cultivar una cianobacteria genomanipulada en un medio de cultivo, donde dicha bacteria genomanipuladacomprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasadecarboxilativa recombinante; y (ii) exponer dicha cianobacteria genomanipulada a la luz y al dióxido de carbono, donde dicha exposición dacomo resultado la conversión de dicho dióxido de carbono mediante dicha cianobacteria genomanipulada enn-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano,n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanosproducida es al menos de 0,1% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida poruna cianobacteria idéntica en todo lo demás, cultivada en condiciones idénticas, pero que carece de dichasenzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa.

Description

Procedimientos y composiciones para la biosintesis recombinante de n-alcanos

5 Referencias cruzadas con las solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/224.463 presentada el 9 de julio de 2009, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/228.937, presentada el 27 de julio de 2009, y la solicitud de utilidad de los Estados Unidos 12/759.657, presentada el 13 de abril de 2010, presentadas con anterioridad.

Campo de la invenci6n

La presente divulgacion se refiere a procedimientos para conferir propiedades productoras de alcanos a una

15 cianobacteria hospedadora, de tal manera que el hospedador se puede usar en la produccion comercial de bioalcanos.

Antecedente de la invenci6n

Muchos organismos fotoautotrofos existentes (es decir, plantas, algas, y bacterias fotosinteticas) son poco adecuados para el bioprocesamiento industrial y no han demostrado por tanto viabilidad comercial. Dichos organismos tienen normalmente tiempos de duplicacion lentos (3-72 horas), en comparacion con los organismos heterotrofos industrializados tales como Escherichia co/i (20 minutos), que reflejan bajas productividades totales. Aunque el deseo de una produccion biosintetica de combustibles eficaz ha conducido al desarrollo de

25 microorganismos fotosinteticos que producen esteres de alquilo de acidos grasos, sigue existiendo necesidad de procedimientos para producir hidrocarburos, por ejemp/o, alcanos, utilizando organismos fotosinteticos.

Resumen de la invenci6n

La presente invencion se refiere a procedimientos para producir productos de interes basados en carbono utilizando los genes AAR y ADN, las proteinas y las celulas hospedadoras descritas en el presente documento. En particular, la presente invencion proporciona un procedimiento para producir hidrocarburos que comprende:

(i) cultivar una cianobacteria genomanipulada en un medio de cultivo, donde dicha bacteria genomanipulada

35 comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante;

(ii) exponer dicha cianobacteria genomanipulada a la luz y al dioxido de carbono, donde dicha exposicion da como resultado la conversion de dicho dioxido de carbono mediante dicha cianobacteria genomanipulada en n-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos de 0,1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa. En una realizacion, la cantidad de dichos n-alcanos producida esta entre 0,1% y 5% del peso de celulas secas y al menos dos 45 veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones

identicas, pero que carece de dichas enzimas AAR y ADM. En una realizacion relacionada, la cantidad de n-alcanos producida por la cianobacteria genomanipulada es al menos de 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, o 1% del DCW, y al menos dos veces la cantidad producida por la cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas AAR y ADM recombinantes. En una realizacion relacionada, al menos una de dichas enzimas recombinantes es heterologa con respecto a dicha cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion, dicha cianobacteria no sintetiza alcanos en ausencia de la

55 expresion de una o ambas enzimas recombinantes. En otra realizacion, al menos una de dichas enzimas AAR o ADM recombinantes no es heterologa para dicha cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion relacionada del procedimiento, dicha cianobacteria genomanipulada produce al menos un nalqueno o n-alcanol. En otra realizacion mas, la cianobacteria genomanipulada produce al menos un n-alqueno o nalcanol seleccionado entre el grupo que consiste en n-pentadeceno, n-heptadeceno, y 1-octadecanol. En una realizacion relacionada, dichos n-alcanos comprenden de forma predominante n-heptadecano, n-pentadecano o una de sus combinaciones en una realizacion relacionada, se producen mas n-heptadecano y/o n-pentadecano que todos los otros productos de n-alcano combinados. En otra realizacion adicional relacionada, se producen mas nheptadecano y/o n-pentadecano por la bacteria genomanipulada que cualesquiera otros n-alcano o n-alqueno

65 producidos por la cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion adicional relacionada, se selecciona al menos un n-pentadeceno producido por dicha cianobacteria genomanipulada entre el grupo que consiste en cis-3heptadeceno y cis-4-pentadeceno. En otra realizacion mas relacionada, se selecciona al menos un n-heptadeceno producido por dicha cianobacteria genomanipulada entre el grupo que consiste en cis-4-pentadeceno, cis-6heptadeceno, cis-8-heptadeceno, cis-9-heptadeceno, y cis, cis-heptadec-di-eno.

5 En otra realizacion adicional relacionada, la presente invencion proporciona ademas una etapa de aislamiento de al menos un n-alcano, n-alqueno o n-alcanol procedente de dicha cianobacteria genomanipulada o dicho medio de cultivo. En otra realizacion mas relacionada, la cianobacteria genomanipulada se cultiva en un medio liquido. En otra realizacion mas relacionada, la cianobacteria genomanipulada se cultiva en un fotobiorreactor.

En otra realizacion relacionada, las enzimas AAR y/o ADM estan codificadas por un plasmido. En otra realizacion mas relacionada, las enzimas AAR y/o ADM estan codificadas por genes recombinantes incorporados al genoma de la cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR y/o AQDM estan codificadas por genes que estan presentes en multiples copias en dicha cianobacteria genomanipulada. En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR y/o ADM recombinantes estan codificadas por genes que son 15 parte de un operon, donde la expresion de dichos genes esta controlada por un unico promotor. En otra realizacion mas relacionada, las enzimas AAR y/o ADM recombinantes estan codificadas por genes que se expresan de forma independiente bajo el control de promotores separados. En otra realizacion adicional relacionada, la expresion de las enzimas AAR y/o ADM recombinantes en una cianobacteria genomanipulada esta controlada por un promotor seleccionado entre el grupo que consiste en un promotor cl, un promotor cpcB, un promotor /ac/-trc, un promotor EM7, un promotor aphll, un promotor nirA, y un promotor nir07 (denominado en el presente documento "P(nir07)"). En otra realizacion mas relacionada, las enzimas estan codificadas por genes que son parte de un operon, donde la expresion de dichos genes esta controlada por uno o mas promotores inducibles. En otra realizacion adicional relacionada, al menos un promotor es represible por urea e inducible por nitrato. En una realizacion mas relacionada, el promotor represible por urea e inducible por nitrato es un promotor de tipo nirA, En otra realizacion

25 mas relacionada, el promotor de tipo nirA es P(nir07) (SEC 1D N°: 24).

En otra realizacion adicional relacionada, la especie de cianobacteria que se genomanipula para expresar las enzimas AAR y/o ADM recombinantes produce menos de aproximadamente 0,01% del DCW de n-heptadecano o npentadecano en ausencia de las enzimas AAR y/o ADM recombinantes, un 0,015 del DWC corresponde aproximadamente al limite de deteccion del n-heptadecano y n-pentadecano mediante los procedimientos de deteccion de la cromatografia de gases/ionizacion por llama descritos en el presente documento. En otra realizacion relacionada, la cianobacteria genomanipulada del procedimiento es un organismo termofilo. En otra realizacion mas relacionada, la cianobacteria genomanipulada del procedimiento se selecciona entre el grupo que consiste en un Synechococcus sp. PCC7002 genomanipulado y un Thermosynechococcus e/ongatus BP-1 genomanipulado.

35 En otra realizacion mas relacionada, las enzimas AAR y/o ADM se seleccionan entre el grupo de enzimas relacionadas en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR recombinantes se seleccionan entre el grupo que consiste en SYNPCC7942 1594, t111312, PMT9312 0533, y cce 1430. En otra realizacion mas relacionada, las enzimas ADM recombinantes se seleccionan entre el grupo que consiste en SYNPCC7942 1593, t111313, PMT9312 0532, y cce 0778.

En otra realizacion adicional relacionada, las enzimas AAR y ADM recombinantes tienen las secuencias de aminoacidos de la SEC 1D N°: 10 y la SEC 1D N°: 12, respectivamente. En determinadas realizaciones, las enzimas AAR y ADM recombinantes estan codificadas por las SEC 1D Nos. 9 y 11, respectivamente. En otras realizaciones

45 mas, las enzimas AAR y ADM recombinantes estan codificadas por las SEC 1D Nos 26 y 28, respectivamente, o las SEC 1D Nos: 30 y 31, respectivamente, y tienen las secuencias de aminoacidos de las SEC 1D Nos: 27 y 28, respectivamente. En determinadas realizaciones, las enzimas AAR y ADM estan codificadas por las SEC 1D Nos: 1 y 3, respectivamente, y tienen las secuencias de aminoacidos de las SEC 1D Nos: 2 y 4, respectivamente. En otras realizaciones adicionales, las enzimas AAR y ADM recombinantes estan codificadas por las SEC 1D Nos: 5 y 7, respectivamente, y tienen las secuencias de aminoacidos de las SEC 1D Nos: 6 y 8, respectivamente.

En otra realizacion mas relacionada, el procedimiento comprende cultivar la cianobacteria genomanipulada en presencia de un antibiotico, donde dicho antibiotico selecciona para la presencia de un gen recombinante que codifica una enzima AAR y/o ADM. En determinadas realizaciones, el antibiotico es espectinomicina o kanamicina.

55 En realizaciones relacionadas, la cantidad de espectinomicina en el medio de cultivo esta entre 100 y 700 !g/ml, por ejemplo, 100, 200, 300, 400, 500, 600, o 700 !g/ml de espectinomicina que se pueden anadir al medio de cultivo. En determinadas realizacion es, la cantidad de espectinomicina anadida es de aproximadamente 600 !g/ml, y la cantidad de n-alcanos producida por la cianobacteria genomanipulada es al menos de aproximadamente 3%, 4%, o 5% del DCW.

En otra realizacion, el procedimiento para producir hidrocarburos comprende cultivar una cianobacteria que expresa las enzimas AAR y/o ADM recombinantes en presencia de un sustrato exogeno para una o ambas enzimas. En una realizacion relacionada, el sustrato se selecciona entre el grupo que consiste en un acil-ACP, un acil-CoA, y un aldehido graso. En otra realizacion relacionada, se pueden anadir alcoholes grasos u otros esteres grasos u otros

65 sustratos indirectos exogenos y convertirse en acil-ACP o acil-CoA por la cianobacteria.

Tambien se hace referencia a una composicion que comprende un n-alcano producido mediante cualquiera de los procedimientos biosinteticos recombinantes descritos en el presente documento. Se hace tambien referencia a una composicion que comprende un n-alqueno o n-alcanol producido mediante cualquiera de los procedimientos biosinteticos recombinantes descritos en el presente documento.

5 Se pueden emplear en la presente invencion polinucleotidos aislados que comprenden o consisten en secuencias de acidos nucleicos de las enzimas AAR u ADM, secuencias de acidos nucleicos que son variantes optimizadas de codon de estas secuencias, y secuencias y fragmentos de acidos nucleicos relacionados.

Una enzima AAR se refiere a una enzima con la secuencia de aminoacidos de la proteina SYNPCC7942 1594 (SEC ID N°: 6) o uno de sus homologos, donde un homologo de SYNPCC7942 1594 es una proteina cuya alineacion BLAST (i) cubre > 90% de la longitud de SYNPCC7942 1594, (ii) cubre > 90% de la longitud de la proteina correspondiente, y (iii) tiene > 50% de identidad con SYNPCC7942 1594 (cuando se alinea optimamente utilizando los parametros proporcionados en el presente documento), y retiene la actividad funcional de SYNPCC7942 1594,

15 es decir, la conversion de un acil-ACP (ACP = proteina portadora de acilo) en un alcanal. Una enzima ADM se refiere a una enzima con la secuencia de aminoacidos de la proteina SYNPCC7942 1593 (SEC ID N°: 8) o uno de sus homologos, donde un homologo de SYNPCC7942 1593 se define como una proteina cuya alineacion de la secuencia de aminoacidos (i) cubre > 90% de la longitud de SYNPCC7942 1593, (ii) cubre > 90% de la longitud de la proteina correspondiente, y (iii) tiene > 50% de identidad con SYNPCC7942 1593 (cuando se alinea utilizando los parametros a los que se hace referencia proporcionados en el presente documento), y retienen la actividad funcional de SYNPCC7942 1593, es decir, la conversion de un n-alcanal en un (n-1)-alcano. Las enzimas AAR y ADM se relacionan en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. Los genes que codifican las enzimas AAR o ADM se denominan en el presente documento genes AAR (aar) o genes ADM (adm), respectivamente.

25 Los parametros a los que se hace referencia de BLASTp son: Valor esperado: 10 (por defecto); Filtro: ninguno; Coste por apertura de hueco. 11 (por defecto), Coste por extension de hueco: 1 (por defecto), Alineaciones maximas: 100 (por defecto); Tamano de palabra (por defecto); N° de descripciones: 100 (por defecto); Matriz de penalizacion; matriz de penalizacion: BLOWSUM62.

Aunque los solicitantes se refieren en el presente documento a una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa, los solicitantes lo hacen sin pretender quedar de esta manera vinculados por ningun mecanismo de reaccion concreto a no ser que se indique de forma expresa. Por ejemplo, cuando la enzima codificada por SYNPCC7942 1593 o cualquier otro gen ADM lleva a cabo una reaccion decarbonilasa o decarboxilasa, esto no afecta la utilidad de la presente invencion de los solicitantes, a no ser que se muestre de forma expresa lo contrario

35 en el presente documento.

Tambien se hace referencia a polipeptidos aislados que comprenden o consisten de secuencias de polipeptidos seleccionadas entre el grupo que consiste en las secuencias relacionadas en la Tabla 1 y la Tabla 2, y las secuencias, fragmentos y fusiones de los polipeptidos relacionado. Se hace referencia tambien a los anticuerpos que se unen especificamente a los polipeptidos aislados.

Tambien se hace referencia a los procedimientos para expresar una secuencia de acido nucleico heterologa que codifica AAR y ADM en una celula hospedadora que carece de actividad catalitica para AAR y ADM (confiriendo por tanto capacidad de producir n-alcano a la celula hospedadora) o para expresar un acido nucleico que codifica AAR y

45 ADM en una celula hospedadora que comprende la actividad de AAR y/o ADM naturales (lo que potencia por tanto la capacidad de producir n-alcano en la celula hospedadora).

La presente invencion proporciona ademas una celula hospedadora genomanipulada, donde dicha bacteria genomanipulada comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante, y donde dicha cianobacteria, cuando se cultiva en presencia de luz y dioxido de carbono, produce n-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos nalcanos producidos es al menos de un 0,1% de peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas

55 enzimas acil-ACP reductasa y alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes. En las realizaciones relacionadas, el hospedador celular comprende una actividad acil-ACP reductasa recombinante. En determinadas realizaciones, la actividad donante de electrones es una ferredoxina. En determinadas realizaciones relacionadas. La celula hospedadora es capaz de fotosintesis.

Tambien se hace referencia a un polinucleotido aislado o recombinante que comprende o consiste de una secuencia de acido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) SEC 1D Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 30 o 31, (b) una secuencia de acido nucleico que es una variante degenerada de las SEC 1D Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 30 o 31, (c) una secuencia de acido nucleico al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos un 99,2%, al menos un 99,3% al menos un 99,4%, al menos un 99,5%, 65 al menos un 99,6%, al menos un 99,7, al menos un 99,8% o al menos un 99,9% identica a la SEC 1D N°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 30 o 31; (d) una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de

aminoacidos de la SEC 1D N°: 2, 4, 6, 8, 10, 27 o 29, (e) una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,1%, al menos 99,2%, al menos 99,3%, al menos 99,4%, al menos 99,5%, al menos 99,6%, al menos 99,7%, al menos 99,8% o al menos 99,9 identico a la SEC 1D N°: 2, 4, 6,

5 8, 10, 12, 27 o 30; y (f) una secuencia de acido nucleico que se hibrida en condiciones de restriccion con las SEC 1D Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 30 o 31. En casos relacionados, la secuencia de acido nucleico codifica un polipeptido que tiene actividad acil-ACP reductasa o actividad alcanal monooxigenasa decarboxilativa.

Se hace referencia tambien a un polipeptido aislado soluble con actividad alcanal monooxigenasa decarboxilativa donde, en algunos casos, el polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos de una de las proteinas relacionadas en la Tabla 2. En casos relacionados, el polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos identica a, o al menos identica en un 95% a la SE 1D N°: 4, 8, 12 o 29.

Se hace referencia tambien a un procedimiento para sintetizar un n-alcano a partir de un acil-ACP in vitro, que

15 comprende: poner en contacto un acil-ACP con una acil-ACP reductasa recombinante, donde dicha acil-ACP reductasa convierte dicho acil-ACP en un n-alcanal, a continuacion, poner en contacto dicho n-alcanal con una alcanal monooxigenasa decarboxilativa soluble recombinante en presencia de un donante de electrones, donde dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa convierte dicho n-alcanal en un (n-1) alcano. Se hace referencia tambien a un procedimiento para sintetizar un n-alcano a partir de un n-alcanal in vitro, que comprende: poner en contacto dicho n-alcanal con una alcanal monooxigenasa decarboxilativa soluble en presencia de un donante de electrones, donde dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa convierte dicho n-alcanal en un (n-1) alcano. En determinados casos relacionados, el donante de electrones es una proteina ferredoxina.

Tambien se hace referencia a celulas de cianobacterias genomanipuladas que comprenden enzimas AAR y ADM

25 recombinantes, donde dichas celulas comprenden entre 0,1% y 5%, o entre 2% y 5% de peso de celulas secas de nalcanos, donde dichos n-alcanos son de forma predominante n-pentadecano, n-heptadecano, o una de sus combinaciones.

Tambien se hace referencia a procedimientos para usar uno de los vectores de expresion y/o transformacion dados a conocer en el presente documento para transformar un microorganismo, por ejemp/o, una cianobacteria.

En otra realizacion adicional del procedimiento para producir hidrocarburos, las enzimas AAR y ADM son al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% identicas a la SEQ 1D N°: 6 y a la SEQ 1D N°: 8. En una realizacion relacionada, la cianobacteria genomanipulada produce n-pentadecano

35 y n-heptadecano, donde el porcentaje en masa del n-pentadecano con respecto a n-pentadecano mas el nheptadecano es al menos del 20%. En otra realizacion mas relacionada, la cianobacteria genomanipulada produce n-pentadecano y n-heptadecano, donde el porcentaje en masa del n-pentadecano con respecto al n-pentadecano mas n-heptadecano es menor del 30%. En otra realizacion adicional relacionada, la cianobacteria genomanipulada produce n-pentadecano y n-heptadecano, donde el porcentaje en masa del n-pentadecano con respecto al npentadecano mas el n-heptadecano esta entre 20% y 30%.

En otra realizacion mas del procedimiento para producir hidrocarburos, las enzimas AAR y ADM son al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos 99%, o 100% identicas a la SEC 1D N°: 10 y a la SEC 1D N°: 12, respectivamente. En una realizacion relacionada, la cianobacteria genomanipulada produce n45 pentadecano y n-heptadecano, donde el porcentaje en masa del n-pentadecano con respecto al n-pentadecano mas n-heptadecano es al menos del 50%. En otra realizacion mas relacionada, el, porcentaje en masa del n-pentadecano con respecto a n-pentadecano mas n-heptadecano es de menos del 60%. En otra realizacion adicional relacionada, el porcentaje en masa del n-pentadecano con respecto al n-pentadecano mas n-heptadecano esta entre 50% y 60%.

En otra realizacion adicional del procedimiento para producir hidrocarburos, la cianobacteria genomanipulada comprende al menos dos enzimas ADM recombinantes distintas y al menos dos enzimas AAR recombinantes distintas. En una realizacion relacionada, dicha cianobacteria genomanipulada comprende al menos un operon que codifica las enzimas AAR y ADM que son al menos un 95% identicas a la SEC 1D N°: 27 y a la SEC 1D N°: 20, respectivamente. En otra realizacion mas relacionada, dicha cianobacteria genomanipulada comprende al menos un

55 operon que codifica las enzimas AAR y ADM que son al menos un 95% identicas a la SEC 1D N°: 10 y a la SEC 1D N°. 12, respectivamente. En otra realizacion adicional relacionada, la expresion de dichas enzimas AAR y ADM esta controlada por un promotor inducible, por ejemplo, un promotor P(nir07). En otra realizacion mas relacionada, dichas enzimas ADM y AAR recombinantes estan cromosomicamente integradas. En otra realizacion adicional relacionada dicha cianobacteria genomanipulada produce n-alcanos en presencia de un inductor, y donde al menos un 95% de dichos n-alcanos son n-pentadecano y n-heptadecano, y donde el porcentaje en masa de n-pentadecano con respecto a n-pentadecano mas n-heptadecano es al menos un 80%.

En otra realizacion mas del procedimiento para producir hidrocarburos, la cianobacteria genomanipulada comprende enzimas AAR y ADM recombinantes que son al menos un 95% identicas a la SEC 1D N°: 10 y a la SEC 1D N°: 12, 65 respectivamente. En una realizacion relacionada, las enzimas AAR y ADM recombinantes estan bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo, un promotor P(nir07). En otra realizacion adicional relacionada, la cianobacteria

genomanipulada produce al menos un 0,5% del DCW de los n-alcanos en presencia de un inductor, y donde dichos n-alcanos comprenden n-pentadecano y n-heptadecano, y donde el porcentaje en masa de n-pentadecano con respecto a n-pentadecano mas n-heptadecano es al menos del 50%.

5 Tambien se hace referencia a un procedimiento para modular las cantidades relativas de n-pentadecano en una cianobacteria genomanipulada, que comprende controlar la expresion de una o mas enzimas AAR y/o ADM recombinantes en dicha cianobacteria, donde dichas enzimas AAR y/o ADM son al menos un 95% identicas a las enzimas AAR y ADM de las SEC 1D Nos: 10, 12, 27 o 29.

Tambien se hace referencia a una cianobacteria genomanipulada, donde dicha cianobacteria genomanipulada comprende uno o mas genes recombinantes que codifican una enzima AAR, una enzima ADM, o ambas enzimas, donde al menos uno de dichos genes recombinantes esta bajo el control de un promotor inducible por nitrato.

Tambien se hace referencia a un gen recombinante, donde dicho gen comprende un promotor para controlar la

15 expresion de dicho gen, donde dicho promotor comprende una secuencia de acido nucleico contigua identica a la SEC 1D N°: 24.

Tambien se hace referencia a una molecula de ADN aislada que comprende un promotor, donde dicho promotor comprende una secuencia de acido nucleico contigua identica a la SEC 1D N°: 24.

Tambien se hace referencia a una cepa bacteriana genomanipulada seleccionada entre el grupo que consiste en JCC1469, JCC1281, JCC1683, JCC1685, JCC1076, JCC1170, JCC1221, JCC879 y JCC1084t.

Estas y otras realizaciones de la presente invencion se describen adicionalmente en las Figuras, la Descripcion, los 25 Ejemplos y las Reivindicaciones, en el presente documento.

Breve descripci6n de las figuras

La Figura 1 representa graficamente, en el panel A, una ruta enzimatica para la produccion de n-alcanos basandose en la actividad secuencial de (1) una enzima AAR (por ejemplo, t11l1312, y (2) una enzima ADM (por ejemplo, t111313; B, Biosintesis de n-alcanal mediante acil-CoA. Los acil-Coa son normalmente intermedios de degradacion de los acidos grasos, C, Biosintesis de n-alcanal mediante acil-ACP. Las acil-ACP son normalmente intermedios de la biosintesis de acidos grasos. Se resaltan los tres tipos diferentes de ACP reductasa. (i) �-cetoacil-ACP reductasa,

(ii) enoil-ACP reductasa, y (iii) acil-ACP reductasa. Acil-ACP reductasa, una nueva enzima, genera el sustrato de la

35 alcanal monooxigenasa decarboxilativa. CoA, coenzima A; ACP, proteina portadora de acilo; D, una ruta biosintetica alternativa de los alcanos mediada por acil-CoA. Vease la descripcion adicional en el Ejemplo 1, en el presente documento.

La Figura 2 representa las cuentas totales de 9 a 2700000 de los cromatogramas de iones de los extractos de aglomerados celulares de JCC9a y JCC1076 en BHT (Hidroxitolueno butilado)-acetona, asi como los patrones autenticos de n-alcano y n-1-alcanol. Los picos asignados mediante el Procedimiento 1 se identifican en fuente normal, los del Procedimiento 2 en cursiva.

La Figura 3 representa graficamente los espectros de fragmentacion de la MS de los picos de JCC1076 asignados

45 mediante el Procedimiento 1 (espectro de masas de la parte superior de cada panel), representado graficamente frente a los hallazgos de su respectiva biblioteca N1ST (espectro de masas de la parte inferior de cada panel). A, npentadecano; B, 1-tetradecanol, C, n-heptadecano; D, 1-hexadecanol.

La Figura 4A representa las cuentas totales de 0 a 7500000 de los cromatogramas de iones de los extractos de los aglomerados celulares de JCC1113 y JCC1114 en BHT-acetona, asi como los patrones autenticos de n-alcano C13-C20 y n-1 alcanol C14, C16 y C19, B, representa las cuentas totales de 0 a 720000 de los cromatogramas de iones de los extractos de aglomerados celulares de JCC1113 y JCC1114 en BHT-acetona, asi como los patrones autenticos de n-alcano y n-alcanol mencionados en 4A.

55 La Figura 5 representa graficamente los espectros de fragmentacion de la MS de los picos de JCC1113 asignados mediante el Procedimiento 1 (espectro de masas de la parte superior de cada panel, representado graficamente frente a los hallazgos de su respectiva biblioteca N1ST (espectro de masas de la parte inferior de cada panel). A, ntridecano, B, n-tetradecano, C, n-pentadecano; D, n-hexadecano; E, n-heptadecano; F, 1-hexadecanol.

La Figura 6 representa las cuentas totales de 0 a 6100000 de los cromatogramas de iones de los extracto de aglomerados celulares de JCC1170 y JCC1169 en BHT-acetona frente a los de las cepas JCC1113 y JCC1114 del control. No se observaron productos de hidrocarburos en JCC1169. El pico sin identificar en JCC1170 es probablemente cis-11-octadecenal.

65 La Figura 7 representa graficamente los espectros de fragmentacion de la MS de los picos de JCC1170 asignados mediante el Procedimiento 1 (espectro de masas de la parte superior de cada panel), representados graficamente frente a los hallazgos de su respectiva biblioteca N1ST (espectro de masas de la parte inferior de cada panel). A, 1tetradecanol; B, 1-hexadecanol.

La Figura 8A representa las cuentas totales de 0 a 75000000 del cromatograma de iones de los aglomerados

5 celulares de JCC1221, JCC1220, JCC1160b, JCC1160a, JCC1160 y JCC879, asi como de los patrones autenticos de n-alcano C13-C20 y C14, C16, y de n-alcanol C18. El doblete alrededor de los 18,0 minutos corresponde al nonadecdi-eno y al 1-nonadeceno, respectivamente (no se muestran los datos), n-alquenos que se producen naturalmente por JCC138, 8B representa las cuentas totales de 0 a 2250000 de los cromatogramas de iones de los aglomerados celulares de los extractos de JCC1221 y JCC879 en BHT-acetona, asi como de los patrones autenticos de n-alcano y n-alcanol mencionados en 8A.

La Figura 9 representa graficamente los espectros de fragmentacion de la MS de los picos de JCC1221 asignados mediante el Procedimiento 1 (espectro de masas de la parte superior de cada panel) representados graficamente frente a los hallazgos de su respectiva biblioteca N1ST (espectro de masas de la parte inferior de cada panel). A, n

15 tridecano, B, n-tetradecano, C, n-pentadecano, D, n-hexadecano, E, n-heptadecano, F, 1-octadecanol

La Figura 10 representa graficamente la produccion de n-alcano intracelular como una funcion de la concentracion de espectinomicina en JCC1221.

La Figura 11 representa las cuentas totales de 0 a 1080000 de los cromatogramas de iones de los extractos de aglomerados celulares de JCC1281 en BHT-acetona frente a la cepa JCC138 del control asi como de los patrones autenticos de n-alcanos.

La Figura 12 representa graficamente los espectros de fragmentacion de los picos de JCC1281 asignados mediante

25 el Procedimiento 1 (espectro de masas de la parte superior de cada panel), representados graficamente frente a los hallazgos de su respectiva biblioteca N1ST (espectro de masas de la parte inferior de cada panel). A, n-pentadecano; B, n-heptadecano.

La Figura 13 representa graficamente los espectros de fragmentacion de la MS de los picos de JCC3 asignados mediante el Procedimiento 1 (espectro de la parte superior de cada panel), representados graficamente frente a los hallazgos de su respectiva biblioteca N1ST (espectro de masas de la parte inferior de cada panel). A, n-pentadecano, B, n-hexadecano; C, n-heptadecano.

La Figura 14 representa graficamente el aumento de la produccion intracelular de n-alcanos en JCC1084t en

35 comparacion con la cepa JCC1084 del control. Las barras de error representan la desviacion estandar de tres observaciones independientes.

La Figura 15 representa las cuentas totales de 0 a 31500000 de los cromatogramas de iones de los extractos de aglomerados celulares de JCC1113 y JCC1221 en BHT-acetona, asi como de los patrones autenticos de n-alcano.

Descripci6n detallada de la invenci6n

A no ser que se defina de otra forma en el presente documento, los terminos cientificos y tecnicos utilizados en la presente invencion tendran los mismos significados que entienden comunmente las personas normalmente expertas

45 en la tecnica, Ademas, a no ser que se requiera otra cosa segun el contexto, los terminos en singular incluiran el plural y los terminos en plural incluiran el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en, y las tecnicas de, bioquimica, enzimologia, biologia molecular y celular, microbiologia, genetica y quimica de las proteinas y acidos nucleicos e hibridacion descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comunmente utilizadas en la materia.

Los procedimientos y tecnicas de la presente invencion se llevan a cabo generalmente de acuerdo con los procedimientos convencionales bien conocidos en la tecnica y se describen en diversas referencias generales y mas especificas que las enumeradas y descritas a lo largo de la presente memoria a no ser que se indique otra cosa. Veanse, por ejemplo, Sambrook y col., molecular Cloning. A Laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor

55 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel y col.; Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y suplementos hasta el 2002); Harlow y Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990); Taylor y Drickamer, 1ntroduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N. J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol 1, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol 11, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)

Se debera entender que los siguientes terminos tienen los siguientes significados, a no ser que se indique otra cosa:

El termino "polinucleotido" o "molecula de acido nucleico" se refiere a una forma polimerica de nucleotidos de al

65 menos 10 bases de longitud. El termino incluye moleculas de ADN (por ejemplo, ADN c o ADN genomico o sintetico) y moleculas de ARN (por ejemp/o, ARNm o ARN sintetico), asi como analogos de ADN o ARN que contienen analogos de nucleotidos no naturales, enlaces internucleosidos no naturales, o ambos. El acido nucleico puede estar en cualquier conformacion topologica. Por ejemplo, el acido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario, tricatenario, cuadruplexado, parcialmente bicatenario, ramificado, en forma de horquilla, circular o en conformacion padlock inmovilizada

5 A no ser que se indique otra cosa, y como ejemplo de todas las secuencias descritas en el presente documento bajo el formato general "SEC 1D N°:", acido nucleico que comprende la SEC 1D N°: 1" se refiere a un acido nucleico, al menos una porcion de la cual tiene tanto (i) la SEC 1D N°: 1, como la SEC 1D N°: 1, o (ii) una secuencia complementaria a la SEC 1D N°: 1. La eleccion entre las dos viene dictada por el contexto. Por ejemplo, si se utiliza el acido nucleico como una sonda, la eleccion entre los dos viene dictada por el requerimiento de que la sonda sea complementaria a la diana deseada.

Un ARN, ADN o un polimero mixto "aislado" es uno que esta sustancialmente separado del resto de componentes celulares que acompanan naturalmente al polinucleotido natural en su celula hospedadora natural, por ejemplo,

15 ribosomas, polimerasa y secuencias genomicas con las que se asocia naturalmente.

Tal como se usa en el presente documento, una molecula organica "aislada" (por ejemplo, un alcano, alqueno, o alcanal) es una molecula que esta sustancialmente separada de los componentes celulares (lipidos de membrana, cromosomas, proteinas) de la celula hospedadora a partir de la cual se origina, o del medio donde se ha cultivado la celula hospedadora. El termino no requiere que la biomolecula se haya separado del resto de productos quimicos, aunque determinadas biomoleculas aisladas se pueden purificar hasta casi la homogeneidad.

El termino "recombinante" se refiere a una biomolecula, por ejemp/o, un gen o proteina, que (1) ha sido eliminada de su entorno donde se produce naturalmente, (2) no esta asociada con todo o parte de un polinucleotido cuyo gen se

25 encuentra en la naturaleza, (3) se une de manera operable a un polinucleotido con el que no esta unido en la naturaleza, o (4) no se produce en la naturaleza. El termino "recombinante" se puede usar en referencia a aislados de ADN clonados, analogos de polinucleotidos quimicamente sintetizados, o analogos de polinucleotidos que se sintetizan biologicamente en sistemas heterologos, asi como proteinas y/o ARNm codificados por dichos acidos nucleicos.

Tal como se usa en el presente documento, una secuencia de acido nucleico endogeno en el genoma de un organismo (o el producto de proteina codificado de esta secuencia) se considera "recombinante" en el presente documento si una secuencia heterologa se coloca adyacente a la secuencia de acido nucleico endogeno, de tal manera que se altera la expresion de esta secuencia de acido nucleico endogeno. En este contexto, una secuencia

35 heterologa es una secuencia que no es adyacente naturalmente a la secuencia de acido nucleico endogeno tanto si como si no la secuencia heterologa es la propia endogena (que se origina a partir de la misma celula hospedadora o de su progenie) o exogena (que se origina a partir de una celula hospedadora diferente o de su progenie). A modo de ejemplo, se puede sustituir una secuencia promotora (por ejemp/o, mediante recombinacion homologa) del promotor natural de un gen en el genoma de una celula hospedadora, de tal manera que este gen tiene un modelo de expresion alterado. Este gen se ha convertido ahora en "recombinante" debido a que se ha separado de al menos alguna de las secuencias que le flanquean naturalmente.

Un acido nucleico se considera tambien "recombinante" si contiene cualquier modificacion que no se produce naturalmente en el acido nucleico correspondiente en un genoma: Por ejemplo, una secuencia de codificacion

45 endogena se considera "recombinante" si contiene una insercion, eliminacion o mutacion puntual introducida de forma artificial, por ejemp/o, mediante la intervencion humana. Un "acido nucleico recombinante" incluye tambien un acido nucleico integrado en un cromosoma de una celula hospedadora en un sitio heterologo y una construccion de acido nucleico presente como un episoma.

Tal como se usa en el presente documento, la frase "variante degenerada" de una secuencia de acido nucleico de referencia abarca secuencias de acido nucleico que se pueden traducir, de acuerdo con el codigo genetico estandar, para proporcionar una secuencia de aminoacidos identica a la traducida a partir de la secuencia de acido nucleico de referencia. El termino "oligonucleotido degenerado" o "cebador degenerado" se usa para significar un oligonucleotido capaz de hibridarse con secuencias de acido nucleico diana que no son necesariamente identicas en la secuencia

55 pero que son homologas entre si en el interior de uno o mas segmentos particulares.

El termino "porcentaje de identidad de la secuencia" o "identica" en el contexto de las secuencias de acido nucleico se refiere a los restos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una maxima correspondencia. La comparacion de la longitud de la identidad de la secuencia puede ser en torno a un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleotidos, normalmente al menos aproximadamente 20 nucleotidos, de forma mas normal al menos aproximadamente 24 nucleotidos, tipicamente al menos aproximadamente 28 nucleotidos, de forma mas tipica, y preferentemente al menos aproximadamente 36 o mas nucleotidos. Existen numerosos algoritmos diferentes conocidos en la tecnica que se pueden utilizar para medir la identidad de la secuencia de nucleotidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleotidos se pueden comparar utilizando FASTA, Gap o Bestfit, 65 que son programas de la Version 10.0 del Paquete Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA proporciona alineaciones y un porcentaje de identidad de la secuencia de las regiones del mejor

solapamiento entre las secuencias por las que se interroga y las secuencias que se buscan. Pearson, Methods Enzymol. 183. 63-98 (1990). Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad entre las secuencias de acido nucleico utilizando FASTA con sus parametros por defecto (un tamano de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuacion) o utilizando Gap con sus parametros por defecto tal como se proporciona en la version

5 6.1 de GCG. De forma alternativa, se pueden comparar las secuencias utilizando el programa informatico BLAST (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215. 403-410 (1990), Gish y States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993), Madden y col., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang y Madden, Genome res. 7: 649-656 81997), especialmente blastp o tblastn (Altschul y col., Nucleic Acids res. 25: 3389-3402 (1997)).

El termino "homologia sustancial" o "similitud sustancial", cuando se refiere a un acido nucleico o uno de sus fragmentos indica que, cuando se alinea optimamente con inserciones o eliminaciones de nucleotidos adecuadas con otro acido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad en la secuencia de nucleotidos en al menos aproximadamente un 76%, 80%, 85%, de forma preferible al menos aproximadamente 90%, y lo mas

15 preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleotidos, tal como se ha medido mediante el algoritmo bien conocido de identidad de la secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, tal como se ha descrito anteriormente.

De forma alternativa, existe una homologia o similitud sustancial cuando un acido nucleico o uno de sus fragmentos se hibrida con otro acido nucleico, a una hebra de otro acido nucleico, o a la hebra complementaria del mismo, en condiciones de hibridacion restrictivas. "Condiciones de hibridacion restrictivas" y "condiciones de lavado restrictivas" en el contexto de los experimentos de hibridacion del acido nucleico dependen de numerosos parametros fisicos diferentes. La hibridacion del acido nucleico se vera afectada por condiciones tales como la concentracion salina, la temperatura, los disolventes, la composicion de bases de las especies que se hibridan, la longitud de las regiones

25 complementarias, y el numero de bases de nucleotidos incorrectamente emparejadas entre los acidos nucleicos que se hibridan, tal como apreciara facilmente el experto en la tecnica. Una persona normalmente experta en la tecnica conoce como variar estos parametros para conseguir una restriccion concreta de la hibridacion.

En general, se lleva a cabo una "hibridacion restrictiva" a aproximadamente 25° C por debajo del punto de fusion termico (Tm) del ADN hibrido especifico bajo un conjunto particular de condiciones. Se lleva a cabo un "lavado restrictivo" a temperaturas de aproximadamente 5° C por debajo de la Tm del ADN hibrido especifico bajo un conjunto particular de condiciones. La Tm es la temperatura a la cual la el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente emparejada. Vease Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring harbar Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), pagina 9.51. Para los fines del presente

35 documento, se definen "condiciones de restriccion" para la hibridacion en fase de solucion tal como la hibridacion acuosa (es decir, exenta de formamida) en 6xSSC (en el que 20xSSC contiene NaCl 3,0 M y citrato de sodio 0,3 M), SDS al 1% a 65° C durante 8-12 horas, seguido por dos lavados en 0,2xSSC, SDS al 0,1% a 65° C durante 20 minutos. Un operario experto apreciara que se producira hibridacion a 65° C a diferentes velocidades dependiendo de numerosos factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que se estan hibridando.

Los acidos nucleicos (denominados tambien como polinucleotidos) usados en la presente invencion pueden incluir hebras de ARN, ADNc, ADN genomico de sentido directo y sentido contrario, y formas sinteticas y polimeros mixtos de los anteriores. Se pueden modificar quimica o bioquimicamente o pueden contener bases de nucleotidos no 45 naturales o derivatizados, como apreciaran facilmente los expertos en la tecnica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcas, metilacion, sustitucion de uno o mas de los nucleotidos que se producen naturalmente con un analogo, modificaciones entre nucleotidos tales como enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriesteres, fosforamidatos, carbamatos, etc), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc), restos colgantes (por ejemplo, polipeptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos alfa anomericos, etc). Se incluyen tambien moleculas sinteticas que imitan polinucleotidos por su capacidad para unirse a una secuencia designada mediante enlaces hidrogeno y otras interacciones quimicas. Se conocen en la tecnica dichas moleculas e incluyen, por ejemplo, aquellas donde los enlaces peptidicos sustituyen los enlaces fosfato en la estructura de la molecula. Otras modificaciones pueden incluir, por ejemplo, analogos donde el anillo de ribosa contiene un resto de puente u otra

55 estructura tal como las modificaciones que se encuentran en acidos nucleicos "bloqueados".

El termino "mutado", cuando se aplica a secuencias de acido nucleico significa que se pueden insertar, eliminar o cambiar nucleotidos en una secuencia de acido nucleico en comparacion con una secuencia de acido nucleico de referencia. Se puede hacer una unica alteracion en un locus (una mutacion puntual) o se pueden insertar, eliminar o cambiar multiples nucleotidos en un unico locus. Ademas, se pueden realizar una o mas alteraciones en cualquiera de numerosos loci en el interior de una secuencia de acido nucleico. Una secuencia de acido nucleico se puede mutar mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica que incluye, pero no se limita a tecnicas de mutagenesis tales como "PCR propensa a error" (un procedimiento para llevar a cabo la PCR en condiciones donde la fidelidad del copiado de la ADN polimerasa es baja, de tal manera que se obtiene una alta tasa de mutaciones 65 puntuales a lo largo de la longitud completa del producto de la PCR; veanse, por ejemplo, Leung y col., Technique, 1:11-15 (1989) y Caldwell y Joyce, PCR Methods Applic. 2: 28-33 (1992)); y "mutagenesis dirigida a

oligonucleotidos" (un procedimiento que permite la generacion de mutaciones especificas de sitio en cualquier segmento de ADN clonado de interes; vease, por ejemplo, Reidhaar-Olson y Sauer, Science 241: 53-57 (1988)).

El termino "atenuado", tal como se usa en el presente documento se refiere generalmente a una eliminacion

5 funcional, que incluye una mutacion, eliminacion parcial o completa, insercion, u otra variacion realizada a una secuencia genica o una secuencia que controla la transcripcion de una secuencia genica, que reduce o inhibe la produccion del producto genico, o vuelve el producto genico no funcional. En algunos casos, se describe una eliminacion funcional como una mutacion de inactivacion genetica. La atenuacion incluye tambien cambios en la secuencia de aminoacidos mediante la alteracion de la secuencia de acido nucleico, colocando el gen bajo el control de un promotor menos activo, la regulacion por defecto, que expresa el ARN interferente, las ribozimas o las secuencias de sentido contrario que dirigen el gen de interes, o mediante cualquier otra tecnica conocida en la materia. En un ejemplo, la sensibilidad de una enzima particular para retroalimentar la inhibicion o la inhibicion producida por la composicion que no es un producto o un reactivo (sin retroalimentacion especifica de la ruta) esta disminuida de tal manera que la actividad de la enzima no esta impactada por la presencia de un compuesto. En

15 otros casos, una enzima que ha sido alterada para ser menos activa se puede denominar como atenuada.

Eliminaci6n: la eliminacion de uno o mas nucleotidos a partir de una molecula de acido nucleico o uno o mas aminoacidos procedentes de una proteina, uniendose juntas las regiones en cualquier lado.

Inactivaci6n genetica: un gen cuyo nivel de expresion o actividad se ha reducido a cero. En algunos ejemplos, un gen se inactiva geneticamente mediante la eliminacion de parte o toda su secuencia de codificacion. En otros ejemplos, un gen se inactiva geneticamente mediante la introduccion de uno o mas nucleotidos en su marco de lectura abierto, lo que da como resultado la traduccion de un producto de proteina sin sentido o no funcional de cualquier otra forma.

25 Se pretende que el termino "vector" tal como se usa en el presente documento se refiera a una molecula de acido nucleico capaz de trasportar otro acido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que generalmente se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al que se pueden unir segmentos de ADN adicionales, pero tambien incluye moleculas bicatenarias lineales tales como las que resultan de la amplificacion mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o a partir del tratamiento de un plasmido circular con una enzima de restriccion. Otros vectores incluyen cosmidos, cromosomas artificiales bacterianos (CAB) y cromosomas artificiales de levadura (CAL). Otro tipo de vector es un vector virico, donde los segmentos de ADN adicionales pueden estar unidos en el genoma virico (descrito con mas detalle a continuacion). Determinados vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula hospedadora donde se introducen (por ejemplo, vectores que tienen

35 un origen de replicacion que funciona en la celula hospedadora). Se pueden integrar otros vectores en el genoma de una celula hospedadora tras la introduccion en la celula hospedadora, y replicarse por tanto junto con el genoma del hospedador. Ademas, determinados vectores a los que se hace referencia son capaces de dirigir la expresion de genes a los que se unen de manera operativa. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresion recombinante" (o simplemente "vectores de expresion").

Secuencias de control de la expresion "unidas de manera operativa" o "unidas de manera operable" se refiere a una union donde la secuencia control de la expresion es contigua al gen de interes para controlar el gen de interes, asi como las secuencias control de la expresion que actuan en trans o a distancia para controlar el gen de interes.

45 El termino "secuencia control de la expresion" tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleotidos que son necesarias para alterar a la expresion de las secuencias de codificacion a las cuales se unen de manera operativa. Las secuencias control de la expresion son secuencias que controlan la transcripcion, acontecimientos post-transcripcionales y traduccion de las secuencias de acidos nucleicos. Las secuencias control de la expresion incluyen el inicio de la transcripcion, la terminacion, secuencias promotoras y potenciadoras, senales eficaces de procesamiento del ARN tales como senales de corte y empalme y senales de poliadenilacion, secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmico; secuencias que potencian la eficacia de la traduccion (por ejemplo, sitios de union a ribosoma), secuencias que potencian la estabilidad de la proteina, y cuando se desea, secuencias que potencian la secrecion de las proteinas. La naturaleza de dichas secuencias control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, las mencionadas secuencias control incluyen generalmente

55 el promotor, el sitio de union a ribosoma, y la secuencia de terminacion de la transcripcion. El termino "secuencias control" se pretende que incluya, como minimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresion, y puede incluir tambien componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias lider y secuencias de ligandos.

Se pretende que el termino "celula hospedadora recombinante" (o sencillamente "celula hospedadora"), tal como se usa en el presente documento, se refiera a una celula en la cual se ha introducido un vector recombinante. Debe entenderse que se pretende que dichos terminos se refieran no solo a la celula sujeto concreta, sino a la progenie de dicha celula. Debido a que se pueden producir determinadas modificaciones en sucesivas generaciones debido a cualquier mutacion o influencia ambiental, dicha progenie puede no, de hecho, ser identica a la celula progenitora, 65 sino que esta incluida tambien en el alcance del termino "celula hospedadora" tal como se usa en el presente documento. Una celula hospedadora recombinate puede ser una celula aislada o una linea celular que crece en

cultivo o puede ser una celula que reside en un tejido u organismo vivo.

El termino "peptido" tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipeptido corto, por ejemplo, uno que tiene normalmente menos de aproximadamente 50 aminoacidos de longitud y mas normalmente menos de 5 aproximadamente 30 aminoacidos de longitud. El termino, tal como se usa en el presente documento, abarca analogos y mimeticos que imitan la funcion estructural y de esta manera la funcion biologica.

El termino "polipeptido" abarca las proteinas que se producen naturalmente y las proteinas que no se producen naturalmente, y sus fragmentos, mutantes, derivados y analogos. Un polipeptido puede ser monomerico o polimerico, ademas, un polipeptido puede comprender numerosos dominios diferentes cada uno de los cuales tiene una o mas actividades distintas.

El termino "proteina aislada" o "polipeptido aislado" es una proteina o polipeptido que en virtud de su origen o fuente de derivacion (1) no esta asociado con los componentes asociados naturalmente que acompanan a este en su 15 estado natural, (2) existe en una pureza que no se encuentra en la naturaleza, donde se puede adjudicar la pureza con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, esta exento de otras proteinas procedentes de la misma especie) (3) se expresa por una celula de diferentes especies, o (4) no se produce en la naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipeptido que se encuentra en la naturaleza o incluye analogos o derivados de aminoacidos que no se encuentran en la naturaleza u otras uniones diferentes de los enlaces peptidicos estandar). De esta manera, un polipeptido que esta sintetizado quimicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la celula a partir de la cual se origina naturalmente estara "aislado" de sus componentes asociados naturalmente. Un polipeptido o proteina se puede volver sustancialmente exento de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, utilizando tecnicas de purificacion de proteinas bien conocidas en la materia. Tal como se define de esta manera, "aislado" no requiere necesariamente que la proteina, el polipeptido, el peptido u el oligopeptido descrito de

25 esta manera se haya retirado fisicamente de su ambiente natural.

El termino "fragmento de polipeptido" tal como se usa en el presente documentos se refiere a un polipeptido que tiene una eliminacion, por ejemplo, una eliminacion en el extremo terminal y/o en el extremo carboxi en comparacion con un polipeptido de longitud completa. En una realizacion preferida, el fragmento de polipeptido es una secuencia contigua donde la secuencia de aminoacido del fragmento es identica a las posiciones correspondientes en la secuencia que se produce naturalmente. Los fragmentos tienen al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoacidos de longitud, preferentemente al menos 12, 14, 16 o 18 aminoacidos de longitud, de forma mas preferible al menos 20 aminoacidos de longitud, de manera mas preferible al menos 25, 30, 35, 49 o 45, aminoacidos de longitud, incluso de forma mas preferible al menos 50 o 60 aminoacidos de longitud, e incluso de manera mas preferible al menos 70

35 aminoacidos de longitud.

Un "derivado modificado" se refiere a los polipeptidos o a sus fragmentos que son sustancialmente homologos en la secuencia estructural primaria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones quimicas y bioquimicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoacidos que no se encuentran en el polipeptido natural. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilacion, carboxilacion, fosforilacion, glicosilacion, ubiquinacion, marcado, por ejemplo, con radionucleidos, y diversas modificaciones enzimaticas, como sera facilmente apreciado por los expertos en la tecnica. Se conocen en la tecnica una variedad de procedimientos para marcar polipeptidos y de sustituyentes de marcas utiles para dichos fines, e incluyen isotopos radioactivos tales como 1251, 32P, 35S, y 3H, ligandos que se pueden unir a antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoroforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas,

45 y antiligandos que pueden servir como miembros especificos de un par de enlace para un ligando marcado. La eleccion de la marca depende de la cantidad requerida, el sentido de la conjugacion con el cebador, los requerimientos de estabilidad, y la instrumentacion disponible. Son bien conocidos en la tecnica los procedimientos para marcar polipeptidos. Vease, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y los Suplementos hasta el 2002).

El termino "proteina de fusion" se refiere a un polipeptido que comprende un polipeptido o fragmento acoplado con secuencias de aminoacidos heterologas. Las proteinas de fusion son utiles debido a que se pueden construir para contener dos o mas elementos funcionales deseados procedentes de dos o mas tipos de proteinas diferentes. Una proteina de fusion comprende al menos 10 aminoacidos contiguos procedentes de un polipeptido de interes, de

55 forma mas preferible al menos 20 o 30 aminoacidos, incluso de forma mas preferible al menos 40, 50 o 60 aminoacidos, aun de forma mas preferible 75, 100 o 125 aminoacidos. Las fusiones que incluyen la totalidad de las proteinas a las que se hace referencia tienen particular utilidad. El polipeptido heterologo incluido en la proteina de fusion de la presente invencion tiene al menos 6 aminoacidos de longitud, a menudo al menos 8 aminoacidos de longitud, y de forma util al menos 15, 20, y 25 aminoacidos de longitud. Las fusiones que incluyen polipeptidos mas grandes tales como la region Fc de la 1gG, e incluso proteinas completas, tales como la proteina fluorescente verde (PFV), proteinas que contienen cromoforos, tienen una particular utilidad. Las proteinas de fusion se pueden producir de forma recombinante construyendo una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido o uno de sus fragmentos en marco con una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina o peptido diferente y que a continuacion expresa la proteina de fusion. De forma alternativa, una proteina de fusion se puede producir

65 quimicamente reticulando el polipeptido o uno de sus fragmentos con otra proteina.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" se refiere a un polipeptido, al menos una porcion del cual esta codificada por al menos un gen de la inmunoglobulina, o uno de sus fragmentos, y que se puede unir especificamente a una molecula diana deseada. El termino incluye las formas que se producen naturalmente, asi como fragmentos y derivados.

5 Los fragmentos comprendidos en el alcance del termino "anticuerpo" incluyen los producidos por la digestion de diversas proteasas, los producidos por escision quimica y/o disociacion quimica y los producidos de forma recombinante, siempre que los fragmentos sigan siendo capaces de unirse de forma especifica a una molecula diana. Entre dichos fragmentos estan Fab, Fab', Fv, F(ab').sub.2, y los fragmentos monocatenarios Fv(scFv).

Los derivados comprendidos en el alcance del termino incluyen anticuerpo (o sus fragmentos) que se han modificado en la secuencia, pero que siguen siendo capaces de unirse de forma especifica a una molecula diana, incluyendo, anticuerpos quimericos interespecies y humanizados; fusiones de anticuerpo; complejos de anticuerpos heteromericos y fusiones de anticuerpos, tales como diacuerpos (anticuerpos biespecificos), diacuerpos

15 monocatenarios, e intracuerpos (vease, por ejemplo, 1ntracellular Antibodies. Research and Disease Applications, (Marasco, ed., Springer-Verlag, Nueva York, 1nc, 1998).

Tal como se usa en el presente documento, se pueden producir anticuerpos mediante cualquier tecnica conocida, incluyendo el cosechado a partir del cultivo celular de linfocitos B, el cosechado a partir del cultivo de hibridomas, sistemas de expresion recombinante y expresion en fago.

El termino "analogo no peptidico" se refiere a un compuesto con propiedades que son analogas a las del polipeptido de referencia. Un compuesto no peptidico se puede denominar tambien un "peptido mimetico" o un "peptidomimetico". Veanse, por ejemp/o, Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (1992);

25 Jung, Combinatorial peptide and Nonpeptide Librairies: A Handbook, John Wiley (1997); Bodanszky y col., Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag (1993), Synthetic Peptides: A Users Guide, (Grant, ed., W. H. Freeman and Co., 1992); Evans y col., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber y Freldinger, Trends Neurosci., 8: 392-396 (1985); y las referencias citadas en cada uno de los anteriores. Dichos compuestos se desarrollan a menudo con ayuda de modelizacion molecular informatizada. Los mimeticos de peptido que son estructuralmente similares a los peptidos utiles a los que se hace referencia en el presente documento se pueden utilizar para producir un efecto equivalente.

Un "polipeptido mutante" o "muteina" se refiere a un polipeptido cuya secuencia contiene una insercion, duplicacion, eliminacion, redisposicion o sustitucion de uno o mas aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos

35 de una proteina nativa o natural. Una muteina puede tener una o mas sustituciones puntuales de aminoacidos, en las que se ha cambiado un unico aminoacido en una posicion por otro aminoacido, una o mas inserciones y/o eliminaciones en el que uno o mas aminoacidos se insertan o eliminan, respectivamente, en la secuencia de la proteina que se produce naturalmente, y/o truncamientos de la secuencia de aminoacidos en cualquiera o en ambos extremos amino o carboxi. Una muteina puede tener la misma actividad, pero preferentemente tiene una diferente actividad biologica en comparacion con la proteina que se produce naturalmente.

Una muteina tiene al menos un 85% de homologia de la secuencia global con su homologa natural. 1ncluso se prefieren mas las muteinas que tienen al menos un 90% de homologia de la secuencia global con la proteina natural.

45 En una realizacion incluso mas preferida, una muteina presenta al menos un 95% de identidad de la secuencia, incluso de forma mas preferible un 98%, incluso de manera mas preferible un 99% e incluso de forma mas preferible un 99,9% de identidad de la secuencia global.

Se puede medir la homologia de la secuencia mediante cualquier algoritmo comun de analisis de la secuencia, tal como Gap o Bestfit.

Las sustituciones de aminoacidos pueden incluir aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidacion, (3) alteran la afinidad de union para formar complejos de proteinas, (4) 55 alteran la afinidad de la union o la actividad enzimatica, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquimicas

o funcionales de dichos analogos.

Tal como se usa en el presente documento, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vease, 1mmunology-A Synthesis (Golub y Gren eds., Sinauer Associates, Sunderlans, Mass., 2a ed., 1991). Pueden ser tambien adecuados como componentes de los polipeptidos a los que se hace referencia en el presente documento los estereoisomeros (por ejemplo, los D-aminoacidos) de los veinte aminoacidos convencionales, aminoacidos no naturales tales como a, aminoacidos a-disustituidos, N-alquil aminoacidos, y otros aminoacidos no convencionales. Los ejemplos de aminoacidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γcarboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 365 metilhistidina, 5-hidroxilisina, N-metilarginina, y otros aminoacidos e iminoacidos similares (por ejemplo, 4hidroxiprolina). En la notacion de los polipeptidos utilizados en el presente documento, el extremo izquierdo

corresponde al extremo amino terminal y el extremo derecho corresponde al extremo carboxi terminal, de acuerdo con la utilizacion y la convencion establecidas.

Una proteina tiene una "homologia" o es "homologa" de una segunda proteina si la secuencia de acido nucleico que

5 codifica la proteina tiene una secuencia similar a la secuencia del acido nucleico que codifica la segunda proteina. De forma alternativa, una proteina tiene una homologia con una segunda proteina si las dos proteinas tienen secuencias de aminoacidos "similares". (De esta manera, el termino "proteinas homologas" se define para indicar que las dos proteinas tienen secuencias de aminoacidos similares). Tal como se usa en el presente documento, la homologia entre dos regiones de la secuencia de aminoacidos (especialmente con respecto a las similitudes estructurales previstas) se interpreta como la implicacion de la similitud en la funcion.

Cuando se usa "homologo" en referencia a proteinas o peptidos, se reconoce que las posiciones de los restos que no son identicos difieren a menudo en sustituciones conservativas de aminoacidos. Una "sustitucion conservativa de aminoacido" es una en la que un resto de aminoacido esta sustituido por otro resto de aminoacido que tiene una

15 cadena secundaria (grupo R) con similares propiedades quimicas (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion conservativa de aminoacidos no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de una proteina. En los casos donde dos o mas secuencias de aminoacidos difieren entre si en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de la secuencia o el grado de homologia se pueden ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitucion. Los expertos en la tecnica conocen bien los medios para llevar a cabo este ajuste. Vease, por ejemplo, Pearson, 1994, Methods Mol. Biol 24: 307-31 y 25: 365-89.

Cada uno de los siguientes seis grupos contienen aminoacidos que tienen sustituciones conservativas entre si; 1)Serina (S), Treonina (T), 2) Acido Aspartico (D), Acido Glutamico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q), 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) 1soleucina (1); Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V), y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y),

25 triptofano (W).

La homologia de secuencias de los polipeptidos, que se denomina tambien porcentaje de identidad de la secuencia, se mide normalmente utilizando software de analisis de secuencias. Vease, por ejemplo, el Paquete de Software de Analisis de Secuencias del Grupo de Genetica 1nformatizada (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705. El software de analisis de proteinas empareja secuencias similares utilizando una medida de la homologia asignada a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, que incluyen sustituciones conservativas de aminoacidos. Por ejemplo, CGC contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que se pueden utilizar con parametros por defecto para determinar la homologia de la secuencia o la identidad de la secuencia entre polipeptidos estrechamente relacionados, tales como polipeptidos homologos de

35 diferentes especies de organismos o entre una proteina natural y una de sus muteinas. Vease, por ejemplo, GCG Version 6.1.

Un algoritmo preferido cuando se compara una secuencia polipeptidica concreta con una base de datos que contiene un gran numero de secuencias de diferentes organismos es el programa informatico BLAST (Altschul y col.,

J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), Gish y States, Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden y col., Meth. Enzymol.

266: 131-141 (1996); Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang y Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997), de forma especial blastp o tblastn (Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).

Los parametros preferidos para BLASTp son: Valor esperado. 10 (por defecto), Filtro: seg (por defecto); Penalizacion

45 por apertura de hueco: 11 (por defecto); Penalizacion por extension de hueco. 1 (por defecto); alineaciones maximas: 100 (por defecto); Tamano de palabra: 11 (por defecto), N° de descripciones: 100 (por defecto), Matriz de penalizacion: BLOWSUM62.

La longitud de las secuencias polipeptidicas comparadas para homologia sera de al menos de aproximadamente 16 restos de aminoacidos, usualmente de al menos de aproximadamente 20 restos, mas usualmente de al menos de aproximadamente 24 restos, de forma tipica de al menos de aproximadamente 28 restos, y preferentemente mas de aproximadamente 35 restos. Cuando se inicia una busqueda en una base de datos que contiene secuencias de un gran numero de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoacidos. Se puede medir la busqueda en la base de datos utilizando secuencias de aminoacidos mediante algoritmos diferentes de blastp

55 conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden comparar las secuencias de polipeptidos utilizando FASTA, un programa de CGC Version 6.1. FASTA proporciona alineaciones y un porcentaje de identidad de secuencias de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias por las que se interroga y las secuencias que se buscan. Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990). Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad de la secuencia entre secuencias de aminoacidos utilizando FASTA con sus parametros por defecto (un tamano de palabra de 2 y la matriz de puntuacion PAM250), tal como se proporciona en GCG Version 6.1.

"Union especifica" se refiere a la capacidad de dos moleculas de unirse entre si con preferencia a unirse a otras moleculas en el entorno. Normalmente, "union especifica" discrimina sobre union fortuita en una reaccion en al menos dos veces, mas normalmente en al menos 10 veces, a menudo en al menos 100 veces. Normalmente, la 65 afinidad o avidez de una reaccion de union especifica, tal como se ha cuantificado mediante la constante de disociacion, es aproximadamente de 10-7 M o mas fuerte (por ejemp/o, aproximadamente 10-8 M, 10-9 M o incluso

mas fuerte).

"Porcentaje de peso de celulas secas" se refiere a una medida de la produccion de hidrocarburo obtenida como sigue: se centrifugo un volumen de cultivo definido para aglomerar las celulas. Se lavaron las celulas y a 5 continuacion se deshidrataron en al menos un ciclo de microcentrifugacion y aspiracion. Los aglomerados celulares se liofilizaron durante la noche, y el tubo que contenia la masa de celulas secas se peso de nuevo de tal manera que se pudo calcular la masa de aglomerados celulares en p 0,1 mg. Al mismo tiempo las celulas se procesaron para la determinacion del peso de celulas secas, se cosecho una segunda muestra del cultivo en cuestion, se lavo y se deshidrato. El aglomerado celular resultante, que correspondia a 1-3 mg del peso de celulas secas, se extrajo a continuacion sometiendolo a vortizacion en aproximadamente 1 ml de acetona mas hidroxitolueno butilado (BHT) como antioxidante y un patron interno, por ejemp/o, n-heptacosano. A continuacion se aglomeraron los desechos celulares mediante centrifugacion y se capturo el sobrenadante (extractante) para el analisis mediante CG. Para una cuantificacion precisa de los n-alcanos, se utilizo la deteccion por ionizacion de llama (F1D) por oposicion al recuento de iones totales mediante MS. Se calcularon las concentraciones de n-alcano en los extractos biologicos utilizando

15 las relaciones de calibracion entre el area del pico CG-F1D y las concentraciones conocidas de patrones autenticos de n-alcano. Conociendo el volumen del extractante, se pueden determinar las concentraciones resultantes de las especies de n-alcano en el extractante, y el peso de celulas secas del aglomerado celular extraido, el porcentaje de peso de celulas secas que comprende n-alcanos.

El termino "region" tal como se usa en el presente documento se refiere a una parte fisicamente contigua de la estructura primaria de una biomolecula. En el caso de las proteinas, una region esta definida por una parte contigua de la secuencia de aminoacidos de dicha proteina.

El termino "dominio" tal como se usa en el presente documento se refiere a la estructura de una biomolecula que

25 contribuye a una funcion conocida o supuesta de la biomolecula. Los dominios pueden ser coextensivos con regiones o porciones de los mismos; los dominios pueden incluir tambien regiones no contiguas distintas de una biomolecula. Los ejemplos de dominios de proteinas incluyen, pero no se limitan a, un dominio 1g, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmico.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "molecula" significa cualquier compuesto, incluyendo, pero sin limitarse a, una molecula pequenas, peptido, proteina, azucar, nucleotido, acido nucleico, lipido, etc, y dicho compuesto puede ser natural o sintetico.

"Productos de interes basados en carbono" incluyen alcoholes tales como etanol, propanol, isopropanol, butanol,

35 alcoholes grasos, esteres de acidos grasos, esteres de ceras, hidrocarburos y alcanos tales como propano, octano, diesel, Jet Propellant 8 (JP8), polimeros tales como tereftalato, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, polioles, polihidroxialcanoatos (PHA), poli-beta-hidroxibutirato (PHB), acrilato, acido adipico, ε-caprolactona, isopreno, caprolactama, caucho, productos quimicos genericos tales como lactato, acido Docosahexanoico (DHA), 3hidroxipropionato, γ-valerolactona, lisina, serina, aspartato, acido aspartico, sorbitol, ascorbato, acido ascorbico, isopentenol, lanosterol, omega-3 DHA, licopeno, itaconato, 1,3-butadieno, etileno, propileno, succinato, citrato, acido citrico, glutamato, malato, acido 3-hidroxipropionico (HPA), acido lactico, THF, gamma butirolactona, pirrolidonas, hidroxibutirato, acido glutamico, acido levulinico, acido acrilico, acido malonico, productos quimicos especializados tales como carotenoides, isoprenoides, acido itaconico; productos farmaceuticos y productos intermedios farmaceuticos tales como acido 7-aminodeacetoxicefalosporanico (7-ADCA)/cefalosporina, eritromicina, policetidos,

45 estatinas, paclitaxel, docetaxel, terpenos, peptidos, esteroides, acidos grasos omega y otros productos de interes mencionados adecuados. Dichos productos son utiles en el contexto de los biocombustibles, productos quimicos industriales y especializados, tales como intermedios utilizados para preparar productos adicionales tales como suplementos nutritivos, nutraceuticos, polimeros, sustitutivos de la parafina, productos para el cuidado personal y productos farmaceuticos.

Biocombustible: Un biocombustible se refiere a cualquier combustible que se deriva de una fuente biologica. Biocombustible se puede referir a uno o mas hidrocarburos, uno o mas alcoholes, uno o mas esteres grasos o una de sus mezclas.

55 Hidrocarburo: El termino se refiere generalmente a un compuesto quimico que consiste en los elementos carbono (C), hidrogeno (H) y opcionalmente oxigeno (O). Existen esencialmente tres tipos de hidrocarburos, por ejemplo, hidrocarburos aromaticos, hidrocarburos saturados e hidrocarburos insaturados tales como alquenos, alquinos, y dienos. El termino incluye tambien combustibles, biocombustibles, plasticos, ceras, disolventes y aceites. Los hidrocarburos abarcan biocombustibles, asi como plasticos, ceras, disolventes y aceites.

A no ser que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente una persona normalmente experta en la tecnica a la cual la presente invencion pertenece. Se describen a continuacion los procedimientos y materiales a modo de ejemplo, aunque se pueden utilizar tambien en la practica de la presente invencion procedimientos y materiales similares o equivalentes 65 a los descritos en el presente documento, y seran evidentes para los expertos en la tecnica. En caso de conflicto, tendra prioridad la presente memoria, incluyendo las definiciones. Los materiales, procedimientos, y ejemplos son

unicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

A lo largo de esta memoria y de las reivindicaciones, la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprenden"

o "que comprende" se entendera que implican la inclusion de un entero o grupo de enteros indicados pero no la 5 exclusion de cualquier otro entero o grupo de enteros.

Secuencias de acidos nucleicos

Los alcanos, conocidos tambien como parafinas, son compuestos quimicos que consisten unicamente de los elementos carbono (C) e hidrogeno (H) (es decir, hidrocarburos), donde estos atomos estan unidos entre si de forma exclusiva mediante enlaces individuales (es decir, son compuestos saturados) sin ninguna estructura ciclica. Los nalcanos son lineales, es decir, alcanos no ramificados. Las enzimas AAR y ADM juntas funcionan para sintetizar nalcanos a partir de moleculas de acil-ACP.

15 Pueden emplearse en la presente invencion moleculas de acido nucleico aisladas de los genes que codifican las enzimas AAR y la ADM, y sus variantes. Las secuencias de acido nucleico de longitud completa a modo de ejemplo para los genes que codifican la AASR se han presentado como las SEC 1D Nos: 1, 5, y 13, y las secuencias de aminoacidos correspondientes se han presentado como las SEC 1D Nos: 2, 6, y 10, respectivamente. Las secuencias de acido nucleico de longitud completa a modo de ejemplo para los genes que codifican la ADM se han presentado como las SEC 1D Nos. 3, 7, 14, y las secuencias de aminoacidos correspondientes se han presentado como las SEC 1D Nos. 4, 8, y 12, respectivamente. Los acidos nucleicos adicionales incluyen cualquiera de los genes que codifican las enzimas AAR y ADM en la Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente.

Se puede expresar una molecula de acido nucleico aislado que tiene una secuencia de acido nucleico que

25 comprende o consiste de un gen que codifica la AAR y la ADM, y los homologos, variantes y sus derivados en una celula hospedadora de interes. Se puede emplear una molecula de acido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que es una version optimizada del codon de los genes AAR y ADM descritos en el presente documento (por ejemplo, SEC 1D N°. 9, y SEC 1D N°: 11, que estan optimizadas para la expresion de los genes AAR y ADM de Proch/orococcus marinus M1T 9312 en Synechoccocus sp. PCC 7002). Se puede emplear una molecula de acido nucleico y los homologos, variantes y derivados de la molecula que comprenden o consisten en una secuencia que es una variante del gen AAR o ADM que tiene al menos un 76% de identidad con el gen natural. La secuencia de acido nucleico puede ser preferentemente un 80%, 85%, 90%, 98%, 99%, 99,9% o incluso de mayor identidad con el gen natural.

35 La molecula de acido nucleico puede codificar un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC 1D N°: 2, 4, 6, 8, 10 o 12. Preferentemente, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia polipeptidica de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad con la SEC 1D N°: 2, 4, 6, 8, 10 o 12 y la identidad puede ser incluso de forma mas preferible un 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% o incluso mas.

Se pueden emplear moleculas de acido nucleico que se hibridan en condiciones restrictivas con las moleculas de acido nucleico anteriormente descritas. Tal como se ha definido anteriormente, y se conoce bien en la tecnica, se llevan a cabo hibridaciones restrictivas a aproximadamente 25° C por debajo del punto de fusion termico (Tm) del ADN hibrido especifico bajo un conjunto particular de condiciones, donde la Tm es la temperatura a la cual el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. El lavado restrictivo se lleva a cabo a

45 temperaturas aproximadamente 5° C inferiores a la Tm bajo un conjunto particular de condiciones.

Tambien se hace referencia a las moleculas de acido nucleico que comprenden un fragmento de una cualquiera de las secuencias de acido nucleico anteriormente descritas. Estos fragmentos contienen preferentemente al menos 20 nucleotidos contiguos. De forma mas preferible, los fragmentos de las secuencias de acido nucleico contienen al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o incluso mas nucleotidos contiguos.

Los fragmentos de secuencias de acido nucleico muestran utilidad en una variedad de sistemas y procedimientos. Por ejemplo, los fragmentos se pueden usar como sondas en diversas tecnicas de hibridacion. Dependiendo del procedimiento, las secuencias de acido nucleico diana pueden ser tanto de ADN como de ARN. Las secuencias de 55 acido nucleico diana pueden estar fraccionadas (por ejemplo, mediante electroforesis en gel) antes de la hibridacion,

o se puede llevar a cabo la hibridacion sobre las muestras in situ. Un experto en la tecnica apreciara que las sondas de acido nucleico de secuencias conocidas encuentran utilidad en la determinacion de la estructura cromosomica (por ejemplo, mediante transferencia Southern) y en la medida de la expresion del gen (por ejemplo, mediante transferencia Northern). En dichos experimentos, los fragmentos de las secuencias se marcan preferentemente de forma detectable, de tal manera que se puede detectar su hibridacion especifica con las secuencias diana y opcionalmente cuantificarse. Un experto en la tecnica apreciara que se pueden usar fragmentos de acido nucleico en una amplia variedad de tecnicas de inmunotransferencia no especificamente descritas en el presente documento.

Debe apreciarse tambien que los fragmentos de acido nucleico dados a conocer en el presente documento

65 encuentran tambien utilidad como sondas cuando se inmovilizan sobre micromatrices. Son bien conocidos en la tecnica los procedimientos para crear micromatrices mediante deposicion y fijacion de acidos nucleicos sobre sustratos soporte. Revisado en DNA Microarrays. A Practical Approach (Practical Approach Series), Schena (ed.), Oxford University Press (1999) (1SBN: 0199637768); Nature Genet. 21(1) (supl.): 1-60 (1999); Microarray Biochip. Tools y Technology, Schena (ed.), Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) (1SBN: 1881299376). El analisis de, por ejemplo, las micromatrices que utilizan la expresion genica que comprenden

5 fragmentos de secuencias de acido nucleico, tales como los fragmentos de secuencias de acido nucleico dados a conocer en el presente documento, son una utilidad bien establecida para los fragmentos de secuencias en el campo de la biologia celular y molecular. Se describen otros usos para los fragmentos de secuencias inmovilizados sobre micromatrices en Gerhold y col., Trends Biochem. Sci. 24. 168-173 (1999) y Zweiger, Trends Biotechnol. 17: 429-436 (1999); DNA Microarrays. A Practical Approach (Practical Approach Series), Schena (ed.), Oxford University Press (1999) (1SBN: 0199637768); Nature Genet. 21(1) (supl). 1-60 (1999); Microarray Biochip: Tools and Technology, Schena (ed.), Eaton Publishing Company/Biotechniques Books Division (2000) (1SBN: 1881299376).

Tal como se conoce bien en la tecnica, se pueden medir las actividades de las enzimas de diversas maneras. Por ejemplo, la pirofosforolisis de OMP puede seguirse espectroscopicamente (Grubmeyer y col., (1993) J. Biol. Chem. 15 268: 20299-20304). De forma alternativa, la actividad de la enzima puede ser seguida utilizando tecnicas cromatograficas, tales como mediante cromatografia liquida de alto rendimiento (Chung y Sloan, (1986) J. Chromatogr. 371. 71-81) Como otra alternativa, se puede medir la actividad de forma indirecta determinando los niveles de producto preparado procedentes de la actividad de la enzima. Estos niveles se pueden medir con tecnicas que incluyen la extraccion en una solucion acuosa de cloroformo/metanol tal como se conoce y describe en la tecnica (Cf. M. Kates (1986) Techniques of Lipidology, 1solation, analysis and 1dentification of Lipids. Elsevier Science Publishers, Nueva York (1SBN: 0444807322). Las tecnicas mas modernas incluyen la utilizacion de la cromatografia de gases hifenada con la espectrometria de masas (Niessen, W. M. A (2001). Current practice of gas chromatography-mass spectrometry, Nueva York, N. Y: Marcel Dekker. (1SBN: 0824704738)). Las tecnicas modernas adicionales para la identificacion de la actividad de la proteina recombinante y los productos que incluyen

25 la cromatografia liquida-espectrometria de masas (LCMS), la cromatografia liquida de alto rendimiento (HPLC), la electroforesis capilar, la espectrometria de masas con analizador de tiempo de vuelo con ionizacion por desorcion laser asistida por matriz (MALD1-TOF MS), la resonancia magnetica nuclear (RMN), la espectroscopia del infrarrojo cercano, la viscometria (Knothe, G (1997) Am. Chem. Soc. Symp. Series, 666. 172-208) la valoracion para determinar los acidos grasos libres (Komers (1997) Fett/lipid, 9982). 52-54), los procedimientos enzimaticos (Bailer 81991) Fresenius J. Anal. Chem. 340(3): 186), los procedimientos basados en propiedades fisicas, los procedimientos quimicos humedos, etc, se pueden usar para analizar los niveles y la identidad del producto producido por los organismos de la presente invencion. Pueden ser tambien adecuados otros procedimientos y tecnicas para la medida de la actividad enzimatica, como sabra un experto en la tecnica.

35 Vectores

Se pueden emplear vectores, que incluyen los vectores de expresion, que comprenden las moleculas de acido nucleico anteriores, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. En un primer caso, los vectores incluyen las moleculas de acido nucleico aislado descritas anteriormente. En un caso alternativo, los vectores incluyen moleculas de acido nucleico aislado anteriormente descritas unidas de manera operable a una o mas secuencias de control de la expresion: Los vectores pueden usarse de esta manera para expresar un polipeptido AAR y/o ADM que contribuye a una actividad productora de n-alcano por una celula hospedadora.

Se conocen bien en la tecnica los vectores utiles para la expresion de acidos nucleicos en procariotas 45

Polipeptidos aislados

Se pueden usar tambien en la presente invencion polipeptidos aislados (que incluyen muteinas, variantes alelicas, fragmentos, derivados, y analogos) codificados por las moleculas de acido nucleico referidas. En un caso, el polipeptido aislado comprende la secuencia polipeptidica que corresponde a la SEC 1D N°: 2, 4, 6, 8, 10 o 12. En un caso alternativo, el polipeptido aislado comprende una secuencia polipeptidica al menos un 85% identica a la SEC 1D N°: 2, 4, 6, 8, 10 o 12. Preferentemente el polipeptido aislado tiene al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 98,1%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% o incluso mas identidad con la SEC 1D N°: 2, 4, 6, 8, 10 o 12.

55 De acuerdo con otros casos, se proporcionan polipeptidos aislado que comprenden un fragmento de las secuencias polipeptidicas anteriormente descritas. Estos fragmentos incluyen preferentemente al menos 20 aminoacidos contiguos, de forma mas preferible al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o incluso mas aminoacidos contiguos.

Los polipeptidos incluyen tambien fusiones entre las secuencias polipeptidicas anteriormente descritas y los polipeptidos heterologos. Las secuencias heterologas pueden, por ejemplo, incluir secuencias disenadas para facilitar la purificacion, por ejemplo, etiquetas de histidina, y/o proteinas de visualizacion expresadas de forma recombinante. Otros ejemplos no limitantes de fusiones de proteinas incluyen las que permiten mostrar la proteina

65 codificada sobre la superficie de un fago o una celula, fusiones con proteinas intrinsecamente fluorescentes, tales como la proteina fluorescente verde (PFV), y fusiones con la region Fc de la 1GG.

Transformantes de celulas hospedadoras

Se hace referencia tambien a las celulas hospedadoras transformadas con moleculas o vectores de acido nucleico, y

5 a sus descendientes. En algunos casos, estas celulas trasportan las secuencias de acido nucleico sobre vectores, que pueden ser vectores, pero que no necesitan replicarse de forma libre. En otros casos, los acidos nucleicos se han integrado en el genoma de las celulas hospedadoras.

En un caso, la celula hospedadora comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican AAR o ADM que expresan AAR o ADM en la celula hospedadora.

En un caso alternativo, las celulas hospedadoras pueden estar mutadas mediante recombinacion con una perturbacion, eliminacion o mutacion del acido nucleico aislado de tal manera que se reduce o elimina la actividad de las proteinas AAR y/o ADM en la celula hospedadora, en comparacion con la celula hospedadora que carece de la

15 mutacion.

Microorganismos seleccionados o genomanipulados para la producci6n de productos de interes basados en carbono

Microorganismo: 1ncluye especies microbianas procariotas y eucariotas procedentes de los Dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo el ultimo levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas, o protistas superiores. Los terminos "celulas microbianas" y "microbios" se usan de forma indistinta con el termino microorganismo.

Se puede transformar una variedad de organismos hospedadores para producir un producto de interes, los

25 organismos fotoautotrofos incluyen plantas y algas eucariotas, asi como cianobacterias procariotas, bacterias verdes del azufre, bacterias verdes no del azufre, bacterias purpuras del azufre, y bacterias purpuras no del azufre. La presente invencion emplea cyanobacterium, otros organismos estan a los que se hace referencia unicamente por referencia.

Los extremofilos que sean cianobacterias son organismos adecuados. Dichos organismos resisten diversos parametros ambientales tales como temperatura, radiacion, presion, gravedad, vacio, desecacion, salinidad, pH, tension de oxigeno, y agentes quimicos. Los extremofilos incluyen los hipertermofilos, que crecen a o por encima de 80° C tales como Pyro/obus fumarii; termofilos, que crecen entre 60-80° C tales como Synechococcus /ividis; mesofilos, que crecen entre 15-60° C y psicrofilos, que crecen a o por debajo de 15° C tales como Psychrobacter y 35 algunos insectos. Los organismos tolerantes a la radiacion incluyen Deinococcus radiodurans. Los organismos tolerantes a la presion incluyen los piezofilos, que toleran la presion de 130 MPa. Los organismos tolerantes al peso incluyen los barofilos. Se contemplan tambien los organismos tolerantes a la hipergravedad (por ejemplo, > 1 g), a la hipogravedad (por ejemplo, < 1 g). Los organismos tolerantes al vacio incluyen los tardigrados, insectos, microbios y semillas. Los organismos tolerantes a la desecacion y anhidrobioticos incluyen los xerofilos tales como Artemia sa/ina; nematodos, microbios, hongos y liquenes. Los organismos tolerantes a la salinidad incluyen los halofilos (por ejemplo, NaCl 2-5 M) Ha/obacteriacea y Duna/ie//a sa/ina. Los organismos tolerantes al pH incluyen los alcalifilos tales como Natronobacterium, Baci//us firmus OF4, Spiru/ina spp. (por ejemplo, pH > 9) y acidofilos tales como Cyanidium ca/darium, Ferrop/asma sp. (por ejemplo, pH bajo. Los anaerobios, que no pueden tolerar el O2 tales como Methanococcus jannaschii, los microaerofilos, que toleran algo de O2 tales como C/ostridium y, se contemplan

45 tambien los organismos aerobios, que requieren O2. Los organismos tolerantes al gas, que toleran CO2 puro incluyen Cyanidium ca/darium y los organismos tolerantes a metales que incluyen metalotolerantes tales como Ferrop/asma acidarmanus (por ejemplo, Cu, As, Cd, Zn), Ra/stonia sp. CH34 (por ejemplo, Zn, Co, Cd, Hg, Pb). Gross, Michael. Life on de Edge: Amazing Creatures Thriving en extreme Environments. Nueva York: Plenum (1998) y Seckbach, J. "Search por Life in the Universe with Terrestrial MicrobesWhich Thrive Under Extreme Conditions" En Cristiano Batalli Cosmovici, Stuart Bowyer, y Dan Werheimer, eds., Astronomical and Biochemical Origins and the Search for Life in the Universe, p 511. Milan: Editrice Compositori (1997).

Las algas y las cianobacterias incluyen, pero no se limitan a los siguientes generos: Acanthoceras, Acanthococcus, Acaryoch/oris, Achnanthes, Achnanthidium, Actinastrum, Actinoch/oris, Actinocyc/us, Actinotaenium, Amphichrysis, 55 Amphidinium, Amphikrikos, Amphip/eura, Amphiprora, Amphithrix, Amphora, Anabaena, Anabaenopsis, Aneumastus, Ankistrodesmus, Ankyra, Anomoeoneis, Apatococcus, Aphanizomenon, Aphanocapsa, Aphanochaete, Aphanothece, Apiocystis, Apistonema, Arthrodesmus, Artherospira, Ascochioris, Asterione//a, Asterococcus, Audouine//a, Au/acoseira, Badi//aria, Ba/biania, Bambusina, Bangia, Basichiamys, Batrachospermum, Binuc/earia, Bitrichia, Buidingia, Botrydiopsis, Botrydium, Botryococcus, Botryosphaerei/a, Brachiomonas, Brachysira, Brachytrichia, Brebissonia, Bu/bochaete, Bumi//eria, Bumi//eriopsis, Ca/oneis, Ca/othrix, Campy/odiscus, Capsosiphon, Carteria, Catena, Cavinu/a, Centritractus, Centrone//a, Ceratium, Chaetoceros, Chaetoch/oris, Chaetomorpha, Chaetone//a, Chaetonema, Chaetope/tis, Chaetophora, Chaetosphaeridium, Chamaesiphon, Chara, Characiochioris, Characiopsis, Characium, Chara/es, Chi/omonas, Ch/ainomonas, Ch/amydob/epharis, Ch/amydocapsa, Ch/amydomonas, Ch/amydomonopsis, Ch/amydomyxa, Ch/amydonephris, Ch/orangie//a, 65 Ch/orangiopsis, Ch/ore//a, Ch/orobotrys, Ch/orobrachis, Ch/orochytrium, Ch/orococcum, Ch/orog/oea, Ch/orog/oeopsis, Ch/orogonium, Ch/oro/obion, Ch/oromonas, Ch/orophysema, Ch/orophyta, Ch/orosaccus, Ch/orosarcina, Choricystis, Chromophyton, Chromui/na, Chroococdidiopsis, Chroococcus, Chroodacty/on, Chroomonas, Chroothece, Chrysamoeba, Chrysapsis, Chrysidiastrum, Chrysocapsa, Chrysocapse//a, Chrysochaete, Chrysochromu/ina, Chrysococcus, Chrysocrinus, Chryso/epidomonas, Chryso/ykos, Chrysonebu/a, Chrysophyta, Chrysopyxis, Chrysosaccus, Chrysophaere/ia, Chrysostephanosphaera, C/odophora, C/astidium, C/osteriopsis, 5 C/osterium, Coccomyxa, Cocconeis, Coe/astre//a, Coe/astrum, Coe/osphaerium, Coenoch/oris, Coenococcus, Coenocystis, Co/acium, Co/eochaete, Co//odictyon, Compsogonopsis, Compsopogon, Conjugatophyta, Conochaete, Coronastrum, Cosmarium, Cosmioneis, Cosmoc/adium, Crateriportu/a, Craticu/a, Crina/ium, Crudigenia, Crucigenieu/a, Cryptoau/ax, Cryptomonas, Cryptophyta, Ctenophora, Cyanodictyon, Cyanonephron, Cyanophora, Cyanophyta, Cyanothece, Cyanothomonas, Cyd/onexis, Cycbostephanos, Cyc/oteu/a, Cy/indrocapsa, Cy/indrocystis, Cy/indrospermum, Cy/indrotheca, Cymatop/eura, Cymbe//a, Cymbe//onitzschia, Cystodinium Dacty/ococcopsis, Debarya, Denticu/a, Dermatochrysis, Dermocarpa, Dermocarpe//a, Desmatractum, Desmidium, Desmococcus, Desmonema, Desmosiphon, Diacanthos, Diacronema, Diadesmis, Diatoma, Diatome//a, Dice//u/a, Dichothrix, Dichotomococcus, Dicranochaete, Dictyoch/oris, Dictyococcus, Dictyosphaerium, Didymocystis, Didymogenes, Didymosphenia, Di/abifi/um, Dimorphococcus, Dinobryon, Dinococcus, Dip/ochioris, Dip/oneis, Dip/ostauron, 15 Distrionei/a, Docidium, Draparna/dia, Duna/ie//a, Dysmorphococcus, Ecba//ocystis, E/akatothrix, E//erbeckia, Encyonema, Enteromorpha, Entoc/adia, Entomoneis, Entophysa!is, Epichrysis, Epipyxis, Epithernia, Eremosphaera, Euastropsis, Euastrum, Eucapsis, Eucocconeis, Eudorina, Eug/ena, Eug/enophyta, Eunotia, Eustigmatophyta, Eutreptia, Fa//acia, Fischere//a, Fragi/aria, Fragi/ariforma, Franceia, Frustu/ia, Curci//a, Gemine//a, Genicu/aria, G/aucocystis, G/aucophyta, G/enodiniopsis, G/enodiniurn, G/oeocapsa, G/oeochaete, G/oeochrysis, G/oeococcus, G!oeocystis, G/oeodendron, G!oeornonas, G/oeop/ax, G/oeothece, G/oeoti/a, G/oeotrichia, G/oiodictyon, Go/enkinia, Go/enkiniopsis, Gornontia, Gomphocymbe//a, Gomphonema, Gornphosphaeria, Gonatozygon, Gongrosia, Gongrosira, Goniochioris, Goniurn, Gonyostornum, Granu/ochioris, Granu/ocystopsis, Groenb/adia, Gymnodiniurn, Gymnozyga, Gyrosigma, Haematococcus, Hafniomonas, Ha//assia, Hammatoidea, Hannaea, Hantzschia, Hapa/osiphon, Hap/otaeniurn, Haptophyta, Has/ea, Hemidinium, Hemitoma, Heribaudie//a, Heterornastix, Heterothrix, 25 Hibberdia, Hi/denbrandia, Hi//ea, Ho/opedium, Hornoeothrix, Hormanthonema, Hormoti/a, Hya/obrachion, Hya/ocardium, Hya/odiscus, Hya/ogonium, Hya/otheca, Hydrianum, Hydrococcus, Hydroco/eum, Hydrocoryne, Hydrodictyon, Hydrosera, Hydrurus, Hye//a, Hymenomonas, /sthmoch/oron, Johannesbaptistia, Juranyie//a, Karayevia, Kathab/epharis, Katodinium, Kephyrion, Keratococcus, Kirchnerie//a, K/ebsormidium, Ko/besia, Ko/ie//a, Konzarekia, Korshikovie//a, Kraske//a, Lagerheimia, Lagynion, Lamprothamnium, Lernanea, Lepocinc/is, Leptosira, Lobococcus, Lobocystis, Lobomonas, Lutico/a, Lyngbya, Ma//eoch/oris, Ma//omonas, Mantonie//a, Marssonie//a, Martyana, Mastigoco/eus, Gastog/o/a, Me/osira, Merismopedia, Mesostigma, Mesotaenium, Micractinium, Micrasterias, Microchaete, Microco/eus, Microcystis, Microg/ena, Micromonas, Microspora, Microthamnion, Mischococcus, Monochrysis, Monodus, Monomastix, Monoraphidium, Monostrorna, Mougeotia, Mougeotiopsis, Myoch/oris, Myromecia, Myxosarcina, Naege/ie//a, Nannoch/oris, Nautococcus, Navicu/a, Neg/ecte//a, Neidium, 35 Nephroc/amys, Nephrocytium, Nephrodie//a, Nephrose/mis, Netrium, Nite//a, Nite//opsis, Nitzschia, Nodu/aria, Nostoc, Ochromonas, Oedogonium, O/igochaetophora, Onychonema, Oocardium, Oocystys, Opephora, Ophiocytium, Orthoseira, Osci//atoria, Oxyneis, Pachyc/ade//a, Pa/me//a, Pa/modictyon, Pnadorina, Pannus, Para/ia, Pascherina, Pau/schu/zia, Pediastrum, Pedine//a, Pedinomonas, Pedinopera, Pe/agodictyon, Penium, Peranema, Peridiniopsis, Peridinium, Peronia, Petroneis, Phacotus, Phacus, Phaeaster, Phaeodermatium, Phaeophyta, Phaeosphaera, Phaeothamnion, Phormidium, Phycope/tis, Phy//arioch/oris, Phy//ocardium, Phy//omitas, Pinnu/aria, Pitophora, P/aconeis, P/anctonema, P/anktosphaeria, P/anothidium, P/ectonema, P/eodorina, P/eurastrum, P/eurocapsa, P/euroc/adia, P/eurodiscus, P/eurosigma, P/eurosira, P/eurotaenium, Poci//omonas, Podohedra, Po/yb/epharides, Po/ychaetophora, Po/yedrie//a, Po/yedriopsis, Po/ygonioch/oris, Poiyepidomonas, Po/ytaenia, Po/ytoma, Po/ytorne//a, Porphyridium, Posteriochromonas, Prasinoch/oris, Prasinoc/adus, Prasinophyta, Prasio/a, Prochiorphyta, 45 Proch/orothrix, Protoderma, Protosiphon, Provaso/ie//a, Prymnesium, Psammodictyon, Psammothidium, Pseudanabaena, Pseudenoc/onium, Psuedocarteria, Pseudochate, Pseudocharacium, Pseudococcomyxa, Pseudodictyosphaerium, Pseudokephynon, Pseudoncobyrsa, Pseudoquadrigu/a, Pseudosphaerocystis, Pseudostaurastrum, Pseudostaurosira, Pseudotetrastrum, Pteromonas, Punctastruata, Pyramich/amys, Pyramimonas, Pyrrophyta, Quadrich/oris, Quadricoccus, Quadnigu/a, Radiococcus, Radiofi/um, Raphidiopsis, Raphidoce/is, Raphidonema, Raphidophyta, Peimeria, Rhabdoderma, Rhabdomonas, Rhizoc/onium, Rhodomonas, Rhodophyta, Rhoicosphenia, Rhopa/odia, Rivu/aria, Rosenvingie//a, Rossithidium, Roya, Scenedesmus, Scherife/ia, Schizochiamyde//a, Schizoch/amys, Schizomenis, Schizothrix, Schroederia, Sco/ioneis, Scotie//a, Scotie//opsis, Scotinfie/dia, Scytonema, Se/enastnim, Se/enochioris, Se//aphora, Semiorbis, Sideroce/is, Diderocystopsis, Dimonsenia, Siphononema, Siroc/adium, Sirogonium, Ske/etonema, Sorastrum, Spermatozopsis, Sphaere//ocystis, 55 Sphaere//opsis, Sphaerodinium, Sphaerop/ea, Sphaerozosma, Spiniferomonas, Spirogyra, Spirotaenia, Spiru/ina, Spondy/omorum, Spondy/osium, Sporotetras, Spume//a, Staurastrum, Stauerodesmus, Stauroneis, Staurosira, Staurosire//a, Stenopterobia, Stephanocostis, Stephanodiscus, Stephanoporos, Stephanosphaera, Stichococus, Stichog/oea, Stigeoc/onium, Stigonema, Stipitococcus, Stokesie//a, Strombomonas, Sty/ochrysa/is, Sty/odinium, Sty/oyxis, Sty/osphaeridium, Surire//a, Sykidion, Symp/oca, Synechococcus, Synechocystis, Synedra, Synochromonas, Synura, Tabe//ania, Tabu/aria, Tei/ingia, Temnogametum, Tetmemorus, Tetrach/ore//a, Tetracyc/us, Tetradesmus, Tetraednie//a, Tetraedron, Tetrase/mis, Tetraspora, Tetrastrum, Tha/assiosira, Thamniochaete, Thorakoch/oris, Thorea, To/ype//a, To/ypothrix, Trache/omonas, Trachydiscus, Trebouxia, Trentepho/ia, Treubaria, Tribonema, Tnchodesmium, Trichodiscus, Trochiscia, Tryb/ione//a, U/othrix, Urog/ena, Uronema, Uroso/enia, Urospora, Uva, Vacuo/aria, Vaucheria, Vo/vox, Vo/vu/ina, Weste//a, Wo/oszynskia, Xanthiditium, Xanthophyta, 65 Xenococcus, Zygnema, Zygnemopsis, y Zygonium. Se pueden emplear los generos de las cianobacterias en la presente invencion. En la Tabla 1 y la Tabla 2 del presente documento se proporciona tambien una lista parcial de

cianobacterias que se pueden genomanipular para expresar enzimas AAR y ADM recombinantes. Las cianobacterias adicionales incluyen miembros del genero Chamaesiphon, Chroococcus, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanothece, Dacty/ococcopsis, G/oeobacter, G/oeocapsa, G/oeothece, Microcystis, Proch/orococcus, Prochioron, Synechococcus, Synechocystis, Cyanocystis, Dermocarpe//a, Stanieria, Xenococcus, Chroococcidiopsis,

5 Myxosarcina, Arthrospira, Borzia, Crina/ium, Geit/erinemia, Lepto/yngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microco!eus, Osci//atoria, P/anktothrix, Prochiorothnix, Pseudanabaena, Spiru/ina, Starria, Symp/oca, Trichodesmium, Tychonema, Anabaena, Anabaenopsis, Aphanizomenon, Cyanospira, Cy/indnospermopsis, Cy/indrospermurn, Nodu/aria, Nostoc, Scy/onema, Ca/othrix, Rivu/aria, To/ypothrix, Ch/orog/oeopsis. Fischere//a, Geitieria, Lyengarie//a, Nostochopsis. Stigonema y Thermosynechococcus.

Otros organismos adicionales a los que se hace referencia incluyen celulas sinteticas o celulas producidas por genomas sinteticos, tal como se ha descrito en Venter y col., publicacion de patente de los Estados Unidos n° 2007/0264688, y sistemas de tipo celular o de celulas sinteticas, tal como se ha descrito en Glass y col., publicacion de patente de los Estados Unidos n° 2007/0269862.

15 Los organismos a los que se hace referencia para la fabricacion de n-alcanos de acuerdo con los procedimientos dados a conocer en el presente documento incluyen las cianobacterias: Synechococcus sp PCC 7002, Synechococcus sp. PCC 7942, Synechocystis sp. PCC 6803, y Thermosynechococcus e/ongatus BP-1.

Un organismo adecuado para la seleccion o la genomanipulacion es la fijacion autotrofica de CO2 a los productos. Esto cubriria la fotosintesis y la metanogenesis. Esta tambien cubierta la acetogenesis, que abarca los tres tipos de fijacion del CO2, el ciclo de Calvin, la ruta de la acetil CoA y la ruta de la TCA reductora. La capacidad de usar dioxido de carbono como la unica fuente de carbono celular (autotrofia) se encuentra en casi todos los grupos principales de procariotas. Las rutas de fijacion del CO2 difieren entre los grupos, y no existe un modelo de

25 distribucion claro de las cuatro rutas autotroficas actualmente conocidas. Veanse, por ejemplo, Fuchs, G, 1989. Alternative pathways of autotrophic CO2 fixation, p. 365-383. En H. G. Schlegel, y B. Bowien (ed.), Autotrophic bacteria. Springer-Verlag, Berlin, Alemania. El ciclo de las pentosas fosfato reductoras (ciclo de Calvin-Bassham-Benson) representa la ruta de fijacion del CO2 en casi todas las bacterias autotrofas aerobias, por ejemplo, las cianobacterias.

Para producir n-alcanos mediante la expresion recombinante de las enzimas AAR y ADM, se utiliza una cianobacteria genomanipulada, por ejemp/o, una especie de Synechococciis o Thermosynechococcus.

Productos de interes basados en carbono: Hidrocarburos y alcoholes

35 En diversas realizaciones de la presente invencion, se pueden producir los hidrocarburos deseados de determinada longitud de cadena o una mezcla con alcoholes de determinada longitud de cadena. En determinados aspectos, la celula hospedadora de cyanobacterium genomanipulada produce al menos uno de los siguientes productos de interes basados en carbono. 1-dodecanol, 1-tetradecanol, 1-pentadecanol, n-tridecano, n-tetradecano, 15:1 npentadecano, n-pentadecano, 16:1 n-hexadeceno, n-hexadecano, 17:1 n-heptadeceno, n-heptadecano, 16:1 nhexadecen-ol, n-hexadecan-1-ol y n-octadecen-1-ol, tal como se muestra en los Ejemplos en el presente documento, siempre que la celula hospedadora produzca un hidrocarburo. En otros aspectos, la longitud de la cadena de carbono varia de C10 a C20. De acuerdo con esto, la presente invencion proporciona la produccion de diversas longitudes de la cadena de alcanos, alquenos y alcanoles adecuados para uso como combustibles y productos

45 quimicos.

En aspectos preferidos, los procedimientos proporcionan el cultivo de celulas hospedadoras de cyanobacterium genomanipuladas para una secrecion directa de productos con una facil recuperacion sin necesidad de extraer la biomasa. Estos productos de interes basados en carbono se secretan directamente en el medio. Debido a que la presente invencion permite la produccion de diversas longitudes de cadena de hidrocarburos y alcoholes definidos, los productos secretados son facilmente recuperados o separados. Los productos, por tanto, se pueden usar directamente o usarse con un minimo procesamiento.

Composiciones de combustible

55 En diversos casos, las composiciones producidas mediante los procedimientos de la presente invencion se usan como combustibles. Dichos combustibles cumplen los estandares de las normas ASTM, por ejemplo, las especificaciones de los estandares para los aceites de combustibles de diesel D 975-09b, y Jet A, Jet A-1 y Jet B tal como se ha especificado en la Especificacion D 1655-68 de las normas ASTM. Las composiciones de combustible pueden requerir la mezcla de algunos productos para producir un producto uniforme. El procedimiento de mezclado es relativamente sencillo, pero la determinacion de la cantidad a incluir de cada componente en la mezcla es mucho mas dificil. Las composiciones de combustible pueden, por tanto, incluir hidrocarburos aromaticos y/o ramificados, por ejemplo, 75% de saturado y 25% de aromatico, donde algunos de los hidrocarburos saturados son ramificados y algunos son ciclicos. Preferentemente, los procedimientos de la presente invencion producen una matriz de

65 hidrocarburos, tales como C13-C17 o C10-C15 para alterar el punto de neblina. Ademas, las composiciones pueden incluir aditivos de combustibles, que se usan para potenciar el comportamiento de un combustible o motor. Por ejemplo, se pueden usar aditivos de combustibles para alterar el punto de congelacion/gelificacion, el punto de neblina, la lubricidad, la viscosidad, la estabilidad oxidativa, la calidad de la ignicion, el nivel de octanos, y el punto de deflagracion. Las composiciones de combustibles pueden comprender tambien, entre otros, antioxidantes, disipadores estaticos, inhibidores de la corrosion, inhibidores de la formacion de hielo, biocidas, desactivadores

5 metalicos y mejoradores de la estabilidad termica.

Ademas de las muchas ventajas ambientales de la presente invencion tales como la conversion del CO2 y la fuente renovable, otras ventajas de las composiciones de combustibles dadas a conocer en el presente documento incluyen el bajo contenido de azufre, emisiones bajas, que estan exentas o sustancialmente exentas de alcohol y

10 que tienen un elevado numero de cetano

Huella ecol6gica del carbono

Los productos basados en carbono producidos biologicamente, por ejemplo, etanol, acidos grasos, alcanos,

15 isoprenoides, representan nuevas materias primas para los combustibles, tales como alcoholes, diesel y gasolina. Dichos biocombustibles no se han producido utilizando la biomasa, pero utilizan CO2 como su fuente de carbono. Estos nuevos combustibles pueden distinguirse de los combustibles derivados del carbono petroquimico sobre la base de la doble huella ecologica isotopica del carbono. Dichos productos, derivados y sus mezclas pueden distinguirse completamente de sus homologos derivados por via petroquimica sobre la base del 14C (fM) y la doble

20 huella ecologica isotopica del carbono, que indica nuevas composiciones de la materia.

Existen tres isotopos del carbono que se producen naturalmente; 12C, 13C, y 14C. Estos isotopos se producen en el carbono total del subsuelo, en fracciones de 0,989, 0,011, y 10-12, respectivamente. Los isotopos 12C y 13C son estables, mientras que 14C se descompone naturalmente a 14N, una particula beta, y un antineutrino en un proceso

25 con una vida media de 5730 anos. El isotopo 14C se origina en la atmosfera, debido principalmente al bombardeo de neutrones de 14N producido en ultima instancia por la radiacion cosmica. Debido a su vida media relativamente corta (en terminos geologicos), 14C se encuentra en niveles extremadamente bajos en el carbon fosil. En el curso de 1 millon de anos sin exposicion a la atmosfera, exactamente 1 parte en 1050 seguira siendo 14C.

30 La relacion 13C:12C varia de forma ligera, pero mensurable entre las fuentes de carbono natural. Generalmente estas diferencias se expresan como desviaciones de la relacion 13C:12C en un material patron. El patron internacional del carbon es la Belemnita Pee Dee, una forma de caliza que se encuentra en Carolina del Sur, con una fraccion de 13C de 0,0112372. Para una fuente de carbono a, la desviacion de la relacion 13C:12C procedente de la Belemnita Pee Dee, se expresa como: δa = (RalRsJ - 1, donde Ra = relacion 13C:12C en la fuente natural, y Rs = relacion 13C:12C en la

35 Belemnita Pee Dee, el patron. Por conveniencia, δa se expresa en partes por mil, o %. Un valor negativo de δa muestra un sesgo hacia 12C sobre 13C en comparacion con la Belemnita Pee Dee. La Tabla A muestra δa y la fraccion de 14C de algunas fuentes naturales de carbono.

TABLA A

Variaciones de 13C:12C en fuentes de carbono natural

Fuente

- . (%) Referencias

Carbono del subsuelo

32,5 Farquhar y col. (1989) Plant Mol. Biol., 40:503-37

Combustibles fosiles

26 Farquhar y col. (1989) Plant Mol. Biol., 40: 503-37

D1C* oceanico

0-1,5 Goericke y col. (1994) Capitulo 9 en Stab/e lsotopes in Eco/ogy and Environmenta/ Science, por K. Lajtha y R. H. Michener, Blackwell Publishing; 1viev (2010) Separation Sci. Techno/. 36: 1819-1914.

CO2 atmosferico

6-8 1viev (2010) Separation Sci. Technol. 36:1819-1914, Farquhar y col. (1989) Plant Mol. Biol., 40: 503-37

D1C* en agua dulce

6-14 Dettman y col. (1999) Geochim. Cosmochim. Acta 63: 1049-1057

Belemnita Pee Dee

0 1viev (2010) Separation Sci. Technol. 36: 1819-1914

* DIC = carbono inorganico disuelto

40 Los procesos biologicos discriminan a menudo entre isotopos de carbono. La abundancia natural de 14C es muy pequena, y por tanto, la discriminacion frente a 14C es dificil de medir. La discriminacion biologica entre 13C y 12C, sin embargo, esta bien documentada. Para un producto biologico p, los inventores pueden definir cantidades similares que las anteriores: δp = (RplRsJ -1, donde Rp = relacion 13C:12C en el producto biologico, y = relacion 13C:12C en la

45 Belemnita Pee Dee, el patron. La Tabla B muestra las desviaciones medidas en la relacion 13C:12C para algunos productos biologicos.

TABLA B

Variaciones de 13C:12C en productos biol6gicos seleccionados

Producto

- � (%) -D (%)* Referencias

Azucar/almidon de las plantas procedente de CO2 atmosferico

18-28 10-20 1viev (2010) Separation Sci. Technol. 36: 18191914

Variaciones de 13C:12C en productos biol6gicos seleccionados

Producto

- (%) -D (%)* Referencias

Biomasa de cianobacterias procedente de D1C marino

18-31 16,5-31 Goericke y col. (1994) capitulo 9 en Stable 1sotopes in Ecology and Environmental Science, por K. Lajtha y R. H. Michener, Blackwell Publishing; Sakata y col. (1997) Geochim. Cosmochim. Acta, 61: 5379-89

Lipidos de cianobacterias procedentes de D1C marino

39-40 37,5-40 Sakata y col. (1997) Geochim. Cosmochim. Acta, 61: 5379-89

Lipidos de algas procedentes de D1C marino

17-28 15,5-28 Goericke y col. (1994) capitulo 9 en Stable 1sotopes in Ecology and Environmental Science, por K. Lajtha y R. H. Michener, Blackwell Publishing; Abelseon y col. (1961) Proc. Natl. Acad. Sci., 47: 623-32

Biomasa de algas procedente de D1C de agua dulce

17-36 3-30 Marty y col. (2008) Limnol. Oceanogr.: Methods 6.51-63

Lipidos de E. coli procedentes de azucares de plantas

15-27 Casi 0 Monson y col. (1980) J. Biol. Chem., 255. 11435-41

Lipidos de cianobacterias procedentes de carbon fosil

63,5-66 37,5-40 -

Biomasa de cianobacterias procedente de carbon fosil

42,5-57 16,5-31 -

* D = discriminaci6n mediante un proceso biol6gico en su utilizaci6n de 12C frente a 13C (vease texto)

La Tabla B introduce una nueva cantidad, D. Esta es la discriminacion mediante un proceso biologico en su utilizacion de 12C frente a 13C. Los inventores definen D como sigue: D = (RplRaJ -1. Esta cantidad es muy similar a δa y δp, excepto que los inventores comparan ahora el producto biologico directamente con la fuente de carbono mas

5 bien que con un patron. Utilizando D, los inventores pueden combinar los efectos del sesgo de una fuente de carbono y un proceso biologico para obtener el sesgo del producto biologico en comparacion con el patron. Resolviendo para δp, los inventores obtienen: δp = (DJ(δaJ + D + δa, y, debido a que (DJ(δaJ es generalmente muy pequeno en comparacion con los otros terminos, δp ≈δa + D.

10 Para que un producto biologico tenga un proceso de produccion con una D conocida, los inventores pueden estimar por tanto δp sumando δa y D. Los inventores suponen que D funciona independientemente de la fuente de carbono. Esto se ha llevado a cabo en la Tabla B para los lipidos y la biomasa de cianobacterias producidos a partir de carbon fosil. Tal como se muestra en la Tabla A y en la Tabla B, anteriores, los productos de cianobacterias preparados a partir de carbon fosil (en la forma de, por ejemplo, gas fluido u otras emisiones) tendran una δp mayor

15 que la de productos biologicos comparables preparados a partir de otras fuentes, distinguiendolos sobre la base de composicion de la materia de estos otros productos biologico. Ademas, cualquier producto derivado unicamente de carbon fosil tendra una fraccion despreciable de 14C, mientras que los productos preparados a partir del carbono del subsuelo tendran una fraccion de 14C de aproximadamente 10-12.

20 De acuerdo con esto, en determinados aspectos, se produjeron diversos productos de interes caracterizados como δp (%) de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 66 y -D (%) de aproximadamente 37,5 a aproximadamente 40.

Anticuerpos

25 Se hace referencia tambien a anticuerpos aislados, que incluyen fragmentos y derivados de los mismos que se unen especificamente a los polipeptidos aislados y a los fragmentos de polipeptidos a los que se hace referencia en el presente documento o se hace referencia a uno o mas de los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos aislados. Los anticuerpos pueden ser especificos de epitopos lineales, epitopos discontinuos o epitopos conformacionales de dichos polipeptidos o fragmentos de polipeptidos, tanto presentes en el polipeptido como en su

30 conformacion natural o, en algunos casos, presentes en los polipeptidos como desnaturalizados, como, por ejemplo, mediante la solubilizacion en SDS. Entre los fragmentos de anticuerpo utiles estan Fab, Fab', Fv, F(ab')2 y una unica cadena de fragmentos Fv.

Por "unido especificamente" y "union especifica" se entiende aqui la capacidad del anticuerpo para unirse a una

35 primera especie molecular de forma preferente a la union con otra especie molecular, con la que el anticuerpo y la primera especie molecular estan premezclados. Se dice especificamente que un anticuerpo "reconoce" una primera especie molecular cuando se une especificamente a esta primera especie molecular.

Como se conoce bien en la tecnica, el grado con el que un anticuerpo puede discriminar entre especies moleculares

40 en una mezcla dependera, en parte, de la similitud conformacional de las especies en la mezcla; normalmente, los anticuerpos de la presente invencion discriminaran sobre la union accidental con polipeptidos no relacionados en al menos dos veces, mas normalmente en al menos 5 veces, normalmente en mas de 10 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, y a menudo en mas de 100 veces, y ocasionalmente en mas de 500 veces o 1000 veces.

Usualmente, la afinidad o avidez de un anticuerpo al que se hace referencia en el presente documento (o multimero de anticuerpo, como en el caso de un pentameros de 1gM) por un polipeptido o fragmentos de polipeptido a los que

5 se hace referencia en el presente documento sera al menos de aproximadamente 1 x 10-6 N, de forma usual al menos de aproximadamente 5 x 10-7 M, de manera provechosa al menos aproximadamente 1 x 10-7 M, con afinidades y avideces de 1 x 10-8 M, 5 x 10-9 M, 1 x 10-10 M e incluso, demostrandose mucho mas util.

Los anticuerpos aislados pueden ser formas que se producen naturalmente, tales como 1gG, 1gM, 1gD, 1gE, e 1gA, procedentes de cualquier especie de mamifero. Por ejemplo, los anticuerpos se obtienen de manera provechosa a partir de especies que incluyen roedores-normalmente raton, pero tambien rata, cobaya, y hamster-lagomorfos, normalmente conejos, y tambien mamiferos mas grandes, tales como ovejas, cabras, vacas y caballos. Habitualmente, el animal queda inmunizado de forma positiva, de acuerdo con los protocolos de inmunizacion normalizados, con el polipeptido o fragmento de polipeptido referido en el presente documento.

15 Virtualmente, todos los fragmentos de 8 o mas aminoacidos contiguos de los polipeptidos a los que se hace referencia en el presente documento se pueden usar eficazmente como inmunogenos cuando se conjugan a un vehiculo, normalmente una proteina tal como la tiroglobulina de bovino, la hemocianina de lapa californiana, o la albumina de suero bovino, utilizando de forma conveniente un enlazador bifuncional. Se puede conferir tambien inmunogenicidad mediante la fusion del polipeptido y fragmentos del polipeptido a los que se hace referencia en el presente documento con otros restos. Por ejemplo, se pueden producir peptidos mediante sintesis en fase solida sobre una matriz ramificada de nucleo de polilisina, estos peptidos antigenicos multiples (MAP) proporcionan una elevada pureza, una avidez aumentada, una definicion quimica precisa y una seguridad mejorada en el desarrollo de vacunas. Veanse, por ejemplo, Tam y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 5409-5413 (1988); Posnett y col., J. Biol.

25 Chem. 263, 1719-1725 (1988).

Los protocolos para la inmunizacion estan bien establecidos en la tecnica. Dichos protocolos incluyen a menudo multiples inmunizaciones tanto con, como sin adyuvantes tales como el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, teniendo los anticuerpos policlonales determinadas ventajas en la deteccion inmunohistoquimica de las proteinas a las que se hace referencia en el presente documento y teniendo los anticuerpos monoclonales ventajas en la identificacion y en la distincion de epitopos concretos de las proteinas a las que se hace referencia en el presente documento. Tras la inmunizacion, se pueden producir los anticuerpos utilizando cualquier tecnica aceptada en la materia. Las celulas hospedadoras para la produccion de anticuerpos recombinantes-tanto anticuerpos completos, fragmentos de

35 anticuerpos, como derivados de anticuerpos-pueden ser procariotas o eucariotas. Los hospedadores procariotas son particularmente utiles para producir anticuerpos de expresion en fago, como se conoce bien en la tecnica. Las celulas eucariotas, que incluyen celulas de mamiferos, insectos, plantas y hongos son tambien utiles para la expresion de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y derivados de anticuerpos. Pueden prepararse tambien anticuerpos mediante traduccion exenta de celulas.

Los anticuerpos aislados, incluyendo los fragmentos y derivados de los mismos, pueden marcarse de manera provechosa. Tambien se hace referencia a anticuerpos marcados que se unen de forma especifica a uno o mas de los polipeptidos y fragmentos de polipeptidos a los que se hace referencia en el presente documento. La eleccion de la marca depende, en parte, del uso deseado. En algunos casos, los anticuerpos pueden marcarse de manera

45 provechosa con una enzima. De forma alternativa, los anticuerpos pueden marcarse con oro coloidal o con un fluoroforo. Para la deteccion secundaria, utilizando avidina, estreptavidina, captavidina o neutravidina marcadas, los anticuerpos se pueden marcar de manera provechosa con biotina. Cuando se usan los anticuerpos, por ejemplo, para aplicaciones de transferencia Western, pueden marcarse de manera provechosa con radioisotopos, tales como 33P, 32P, 35S, 3H y 1251. Como se entendera, el uso de las marcas descritas anteriormente no esta restringido a ninguna aplicacion concreta.

Los siguientes ejemplos son a fin ilustrativo y no se pretende que limiten el alcance de la presente invencion.

Ejemplo 1

55 Una ruta para la sintesis enzimatica de n-alcanos. En la Figura 1A se muestra un proceso enzimatico para la produccion de n-alcanos con cianobacterias basandose en la actividad secuencial de (1) una enzima AAR, por ejemp/o t111312, una acil-ACP reductasa, y (2) una enzima ADM, por ejemp/o, t111313, una presunta alcanal monooxigenasa decarboxilativa, que utiliza ferredoxina reducida como donante de electrones. La actividad de AAR es distinta de la actividad de la acil-CoA reductasa relativamente bien caracterizada presentada por proteinas tales como Acr1 de Acinetobacter ca/coaceticus (Reiser S y Somerville C (1997) J. Bacteriol. 179: 2969-2975). Se ha identificado previamente una actividad de la ADM membranosa en preparaciones microsomicas de insectos (Reed JR y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10000-10004, Reed JR y col. (1995) Musca domestica. Biochemistry

34: 16221-16227.

65 Las Figuras 1B y 1C resumen los nombres y las actividades de las enzimas implicadas en la biosintesis de los nalcanales. La Figura 1B representa graficamente la relativamente bien caracterizada actividad de la acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) presentada por proteinas tales como Acr1 de Acinetobacter calcoaceticus. En la Figura 1C, las dos reductasas relacionadas con ACP bien conocidas que estan implicadas en la biosintesis de los acidos grasos, -cetoacil-ACP reductasa (EC 1.1.1.100) y enoil-ACP reductasa (EC 1.3.1.9, 1.3.1.10) se sometieron a

5 contraste con la acil-ACP reductasa (AAR) (no se asigno todavia n° EC) que se cree que esta implicada en la ruta biosintetica de los n-alcanos en cianobacterias. La diferencia clave entre la AAR y la acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) es que la ACP es la portadora del acilo mas bien que la coenzima A. en apoyo de esta distincion, se ha demostrado que la acil-CoA reductasa Acr1 de Acinetobacter calcoaceticus puede generar unicamente alcanales a partir de acil-CoA y no acil-ACP (Resier S y Somerville C (1997) J Bacteriol. 179: 2969-2975).

10 La ADM carece tambien de un numero EC asignado actualmente. Se sabe que una alcanal monooxigenasa (EC 1.14.14.3), denominada a menudo luciferasa cataliza la conversion de n-alcanal en acido n-alcanoico. Esta actividad es distinta de la actividad de la ADM (n-alcanal a (n-1)-alcano) propuesta en el presente documento, aunque ambas usan n-alcanal y oxigeno molecular como sustratos.

15 AAR y ADM hom6logos de cianobacterias para la producci6n de n-alcanos. En este ejemplo, los genes AAR y ADM homologos de cianobacterias (por ejemplo, homologos de la proteina PCC 7942 SYNPCC7942 1594 de Synechococcus e/ongatus y/o de la proteina SYNPCC7942 1593, respectivamente) se identificaron utilizando un programa de busqueda BLAST. Estas proteinas se pueden expresar en una variedad de organismos (bacterias,

20 levaduras, plantas, etc) a fin de generar y aislar n-alcanos y otros productos de interes basados en carbono deseados procedentes de los organismos. La invencion utiliza cianobacterias. Una busqueda en la base de datos de proteinas BLAST no redundantes desvelo los homologos de cada proteina en otras cianobacterias.

Para determinar el grado de similitud entre homologos de la proteina PCC 7942 de SYNPCC7942 1594 de

25 Synechococcus e/ongatus, se sometio a investigacion la secuencia de la proteina de 341 aminoacidos utilizando BLAST (http://blast.nc-bi.nim.nih.gov/ frente a la base de datos de proteinas no redundantes "nr". Se capturaron los homologos como proteinas emparejadas cuyas alineaciones (i) cubrieron > 90% de la longitud de SYNPCC7942 1594, (ii) cubrieron > 90% de la longitud de la proteina emparejada, y (iii) tuvieron > 50% de identidad con SYNPCC7942 1594 (Tabla 1).

TABLA 1

Hom6logos de la proteina SYNPCC7942 1594 (AAR)

Organismo

SEC ID N°: N° de acceso del Hom6logo Puntuaci6n de BLAST valor E

Synechococcus e/ongatus PCC 7942

6 (SYNPCC7942 1594J nla

Synechococcus e/ongatus P00 7942 [cianobacteria] tax1d 1140

23 YP 400611.1 706, 0.0

Synechococcus e/ongatus P00 6301 [cianobacteria] tax1d 269084

24 YP 170761.1 706, 0.0

Anabaena variabi/is ATCC 29413 [cianobacteria] tax1d 240292

25 YP 323044.1 538, 4e-151

Nostoc sp., PCC 7120 [cianobacteria] tax1d 103690

26 NP 489324.1 535, 3e-150

'Nostoc azo//ae' 0708 [cianobacteria] tax1d 551115

27 ZP 03763674.1 533, 1e-149

Cyanothece sp. PCC 7425 [cianobacteria] tax1d 395961

28 YP 002481152.1 526, 9e-148

Nodu/aria spumigena CCY 9414 [cianobacteria] tax1d 313624

29 ZP 01628095.1 521, 3e-146

Lyngbya sp. PCC 8106 [cianobacteria] tax1d 313612

30 ZP 01619574.1 520, 6e-146

Nostoc punctiforme P00 73102 [cianobacteria] tax1d 63737

31 YP 001865324.1 520, 7e-146

Trichodesmium erythraeum 1MS1O1 [cianobacteria] tax1d 203124

32 YP 721978.1 517, 6e-145

Thermosynechococcus e/ongatus BP-1

2 NP 682102.1 516, 2e-144

Hom6logos de la proteina SYNPCC7942 1594 (AAR)

Organismo

SEC ID N°: N° de acceso del Hom6logo Puntuaci6n de BLAST valor E

[cianobacteria] tax1d 197221

Acaryochioris marina MB1C11017 [cianobacteria] tax1d 329726

33 YP 001518341.1 512,2e-143

Cyanothece sp. PCC 8802 [cianobacteria] tax1d 395962

34 ZP 03142196.1 510, 8e-143

Cyanothece sp. PCC 8801 [cianobacteria] tax1d 41431

35 YP 002371106.1 510,8e-143

Microco/eus chthonop/astes PCC 7420 [cianobacteria] tax1d 118168

36 YP 002619867.1 509, 2e-142

Arthrospira maxima CS-328 [cianobacteria] tax1d 513049

37 zP 03273554.1 507, 7e-142

Synechocystis sp. P00 6803 [cianobacteria] tax1d 1148

38 NP 442146.1 504, 5e-141

Cyanothece sp. CCY 0110 [cianobacteria] tax1d 391612

39 ZP 01728620.1 501, 4e-140

Synechococcus sp. PCC 7335 [cianobacteria] tax1d 91464

40 YP 002711557.1 500, le-139

Cyanothece sp. ATCC 51142 [cianobacteria] tax1d 43989

41 YP 001802846.1 489, 2e-136

G/oeobacter vio/aceus POC 7421 [cianobacteria] tax1d 251221

42 NP 926091.1 487, 7e-136

Microcystis aeruginosa N1ES-843 [cianobacteria] tax1d 449447

43 YP 001660322.1 486, le-135

Crocosphaera watsonii WH 8501 [cianobacteria] tax1d 165597

44 ZP 00516920.1 486, 1e-135

Microcystis aeruginosa PCC 7806 [cianobacteria] tax1d 267872

45 embCA090781.1 484, 8e-135

Synechococcus sp. WH 5701 [cianobacteria] tax1d 69042

46 ZP 01085337.1 471, 4e-131

Synechococcus sp. RCC307 [cianobacteria] tax1d 316278

47 YP 001227841.1 464, 8e-129

Synechococcus GOM 306 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 364150

48 gbABD96327.1 462 , 2e-128

Synechococcus sp. WH 8102 [cianobacteria] tax1d 84588

49 NP 897828.1 462, 2e-128

Synechococcus sp. WH 7803 [cianobacteria] tax1d 32051

50 YP 001224378.1 459, 2e-127

Synechococcus GOM 5D20 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 364154

51 gbABD96480.1 458, 3e-127

Synechococcus sp. WH 7805 [cianobacteria] tax1d

52 ZP 01123215.1 457, 5e-127

Hom6logos de la proteina SYNPCC7942 1594 (AAR)

Organismo

SEC ID N°: N° de acceso del Hom6logo Puntuaci6n de BLAST valor E

59931

Synechococcus 5B2 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 359140

gbABB92249.1 457, 8e-127

Synechococcus sp. RS9917 [cianobacteria] tax1d 221360

54 ZP 01079773.1 456, 2e-126

Synechococcus sp. CC9902 [cianobacteria] tax1d 316279

55 YP 377636.1 454, 6e-126

Proch/orococcus marinus subsp. marinus cepa CCMP1375 [cianobacteria] tax1d 167539

56 NP 874926.1 453, 9e-126

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9313 [cianobacteria] tax1d 74547

57 NP 895058.1 453, 1e-125

Synechococcus GOM 3M9 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 364149

58 gbABD96274.1 452, 2e-125

Synechococcus GOM 4P21 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 364153

59 gbABD96442.1 452, 2e-125

Synechococcus sp. BL107 [cianobacteria] tax1d 313625

60 ZP 01469469.1 452, 2e-125

Cyanobium sp. PCC 7001 [cianobacteria] tax1d 180281

61 YP 002597253.1 451, 4e-125

Proch/orococcus marinus cepa NATL1A [cianobacteria] tax1d 167555

62 YP 001014416.1 449, 2e-124

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9515 [cianobacteria] tax1d 167542

63 YP 001010913.1 447, 6e-124

Synechococcus sp. CC9605 [cianobacteria] tax1d 110662

64 YP 3 81056.1 447, 8e-124

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9211 [cianobacteria] tax1d 93059

65 YP 001550421 .1 446, 2e-123

Proch/orococcus marinus subsp. pastoris cepa CCMP1986 [cianobacteria] tax1d 59919

66 NP 892651.1 446, 2e-123

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9301 [cianobacteria] tax1d 167546

67 YP 001090783.1 445, 3e-123

Synechococcus sp. RS9916 [cianobacteria] tax1d 221359

68 ZP 01472595.1 445, 3e-123

Proch/orococcus marinus cepa NATL2A

69 YP 293055.1 445, 4e-123

Hom6logos de la proteina SYNPCC7942 1594 (AAR)

Organismo

SEC ID N°: N° de acceso del Hom6logo Puntuaci6n de BLAST valor E

[cianobacteria] tax1d 59920

Proch/orococcus marinus cepa. M1T 9202 [cianobacteria] tax1d 93058

70 YP 002673377.1 444, 7e-123

Synechococcus sp. CC9311 [cianobacteria] tax1d 64471

71 YP 731192.1 443, 1e-122

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9215 [cianobacteria] tax1d 93060

72 YP 001483815.1 442, 2e-122

Proch/orococcus marinus cepa AS9601 [cianobacteria] tax1d 146891

73 YP 001008982.1 442, 3e-122

Synechococcus sp. JA-3-3Ab [cianobacteria] tax1d 321327

74 YP 473 896.1 441, 5e-122

Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13) [cianobacteria] tax1d 321332

75 YP 478638.1 440,8e-122

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9312 [cianobacteria] tax1d 74546

76 YP 397030.1 436, 1e-120

Para determinar el grado de similitud entre homologos de la proteina PCC 7942 SYNPCC7942 1593 de Synechococcus e/ongatus, se sometio a investigacion la secuencia de la proteina de 231 aminoacidos utilizando BLAST (http:Hblast.nc-bi-nim.nih.gov/) frente a la base de datos de proteinas no redundantes "nr". Se capturaron los

5 homologos como proteinas emparejadas cuyas alineaciones (i) cubrieron > 90% de la longitud de SYNPCC7942 1593, (ii) cubrieron > 90% de la longitud de la proteina emparejada, y (iii) tuvieron > 50% de identidad con SYNPCC7942 1593 (Tabla 2).

TABLA 2

Hom6logos de la proteina SYNPCC7942 1593 (ADM)

Organismo

SEC ID NO: N° de acceso del hom6logo Puntuaci6n BLAST Valor E

Synechococcus e/ongatus PCC 7942 [cianobacterias]

8 (SYNPCC7942 1593J nla

Synechococcus e/ongatus PCC 7942 [cianobacterias] tax1d 1140

77 YP 400610.1 475, 1e-132

Synechococcus e/ongatus PCC 6301 [cianobacterias] tax1d 269084

78 YP 170760.1 475, 2e-132

Arthrospira maxima CS-328 [cianobacterias] tax1d 513049

79 ZP 03273 549.1 378, 3e-103

Microco/eus chthonop/astes PCC 7420 [cianobacterias] tax1d 118168

80 YP 00261 9869.1 376, 1e-102

Lyngbya sp. PCC 8106 [cianobacteria] tax1d 313612

81 ZP 01619575.1 374, sue-102

Nodu/aria spumigena CCY 9414 [cianobacteria] tax1d 313624

82 ZP 01628096.1 369, 1e-100

Hom6logos de la proteina SYNPCC7942 1593 (ADM)

Organismo

SEC ID NO: N° de acceso del hom6logo Puntuaci6n BLAST Valor E

Microcystis aeruginosa N1ES-843 [cianobacteria] tax1d 449447

83 YP 001660323.1 367, sue-100

Microcystis aeruginosa PCC 7806 [cianobacteria] tax1d 267872

84 emb1CAO9O78O.1 364, 3e-99

Nostoc sp. PCC 7120 [cianobacteria] tax1d 103690

85 NP 489323.1 363, 1e-98

Anabaena variabi/is ATCC 29413 [cianobacteria] tax1d 240292

86 YP 323043.1 362, 2e-98

Crocosphaera watsonii WH 8501 [cianobacteria] tax1d 165597

87 ZP 00514700.1 359, 1e-97

Trichodesmium erythraeum 1MS1O1 [cianobacteria] tax1d 203124

88 YP 721979.1 358, 2e-97

Synechococcus sp. PCC 7335 [cianobacteria] tax1d 91464

89 YP 002711558.1 357, 6e-97

'Nostoc azo//ae' 0708 [cianobacteria] tax1d 551115

90 ZP 03763673.1 355, 3e-96

Synechocystis sp. PCC 6803 [cianobacteria] tax1d 1148

91 NP 442147.1 353, 5e-96

Cyanothece sp. ATCC 51142 [cianobacteria] tax1d 43989

92 YP 001802195.1 352, 2e-95

Cyanothece sp. CCY 0110 [cianobacteria] tax1d 391612

ZP 0 1728578.1 352, 2e-95

Cyanothece sp. PCC 7425 [cianobacteria] tax1d 395961

YP 00248 1151.1 350, 7e-95

Nostoc punctiforme PCC 73102 [cianobacteria] tax1d 63737

95 YP 00 1865325.1 349, 1e-94

Acaryochioris marina MB1C11O17 [cianobacteria] tax1d 329726

96 YP 001518340.1 344, 4e-93

Cyanothece sp. PCC 8802 [cianobacteria] tax1d 395962

ZP 03142957.1 342, 1e-92

Cyanothece sp. PCC 8801 [cianobacteria]tax1d 41431

98 YP 002370707.1 342, 1e-92

Thermosynechococcus e/ongatus BP-1 [cianobacteria] tax1d 197221

4 NP 682103.1 332, 2e-89

Synechococcus sp. JA-2-39'a(2-13) [cianobacteria] tax1d 321332

99 YP 478639.1 319, 1e-85

Synechococcus sp. RCC307 [cianobacteria] tax1d 316278

100 YP 001227842.1 319, 1e-85

Synechococcus sp. WH 7803 [cianobacteria] tax1d 32051

101 YP 0012243 77.1 313, 8e-84

Synechococcus sp. WH 8102 [cianobacteria] tax1d 84588

102 NP 897829.1 311, 3e-83

Synechococcus sp. WH 7805 [cianobacteria] tax1d 59931

103 zP 01123214.1 310, 6e-83

Synechococcus GOM 3012 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 364151

104 gbABD96376.1 309, 1e-82

Synechococcus sp. JA-3-3Ab [cianobacteria] tax1d 321327

105 YP 473897.1 309, 1e-82

Synechococcus GOM 306 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 364150

106 gb1A8D96328.1 309, 1e-82

Hom6logos de la proteina SYNPCC7942 1593 (ADM)

Organismo

SEC ID NO: N° de acceso del hom6logo Puntuaci6n BLAST Valor E

Synechococcus GOM 3M9 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 364149

107 gb1ABD96275.1 308, 2e-82

Synechococcus sp. CC9311 [cianobacteria] tax1d 64471

108 YP 731193.1 306, 7e-82

Synechococcus 5B2 de tipo A marino sin cultivar [cianobacteria] tax1d 359140

109 gb1ABB9225O.1 306, 9e-82

Synechococcus sp. WH 5701 [cianobacteria] tax1d 69042

110 zP 01085338.1 305, 3e-81

G/oeobacter vio/aceus PCC 7421 [cianobacteria] tax1d 251221

111 NP 926092.1 303, 8e-81

Synechococcus sp. RS9916 [cianobacteria] tax1d 221359

112 ZP 01472594.1 303, 9e-81

Synechococcus sp. RS9917[cianobacteria] tax1d 221360

113 zP 01079772.1 300, 6e-80

Synechococcus sp. CC9605[cianobacteria] tax1d 110662

114 YP 381055.1 300, 7e-80

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9303 [cianobacteria] tax1d 59922

115 YP 001 016795.1 294, 4e-78

Cyanobium sp. PCC 7001 [cianobacteria] tax1d 180281

116 YP 002597252.1 294, 6e-78

Proch/orococcus marinus cepa. M1T 9313 [cianobacteria] tax1d 74547

117 NP 895059.1 291, 3e-77

Synechococcus sp. CC9902 [cianobacteria] tax1d 316279

118 YP 37763 7.1 289, 1e-76

Proch/orococcus marinus cepa. M1T 9301 [cianobacteria] tax1d 167546

119 YP 001090782.1 287, 5e-76

Synechococcus sp. BL107 [cianobacteria] tax1d 313625

120 ZP 01469468.1 287, 6e-76

Proch/orococcus marinus cepa. AS9601 [cianobacteria] tax1d 146891

121 YP 001008981.1 286, 2e-75

Proch/orococcus marinus cepa M1T 9312 [cianobacteria] tax1d 74546

12 YP 397029.1 282, 1e-74

Proch/orococcus marinus subsp. pastoris cepa CCMP1986 [cianobacteria] tax1d 59919

122 NP 892650.1 280, 9e-74

Las secuencias de aminoacidos a las que se hace referencia en la Tabla, tales como las secuencias que aparecen en la base de datos NCB1 el 9 de julio de 2009, por el numero de acceso, se incorporan por referencia en el presente documento

5 Una enzima AAR de la Tabla 1, y/o una enzima ADM de la Tabla 2, o ambas, se pueden expresar en una celula hospedadora de interes, donde el hospedador puede ser un hospedador heterologo o el hospedador natural, es decir, la especie a partir de la cual se derivaron los genes. Se hace referencia tambien a un procedimiento para impartir capacidad a la sintesis de n-alcano en un organismo heterologo, que carece de homologos naturales de

10 AAR y/o ADM, genomanipulando el organismo para expresar un gen que codifica una de las enzimas relacionadas en la Tabla 1 o la Tabla 2. Se hace referencia tambien a los procedimientos para modular la sintesis de n-alcano en un organismo que expresa ya una o ambas enzimas AAR y ADM aumentando la expresion de las enzimas naturales, o aumentando la expresion del gen natural mediante la expresion recombinante de las enzimas AAR y/o ADM heterologas. Ademas, se hace referencia tambien a los procedimientos para modular el grado de sintesis de

15 alcano variando determinados parametros, que incluyen la identidad y/o la compatibilidad de los donantes de electrones, condiciones de cultivo, promotores para expresar las enzimas AAR y/o ADM, y similares.

Si el hospedador carece de un donante de electrones adecuado o carece de los niveles suficientes de un donante de electrones adecuado para conseguir la produccion de la cantidad deseada de n-alcano, dicho donante de electrones se puede introducir tambien de forma recombinante. Las directrices para optimizar los donantes de electrones para la reaccion catalizada por las proteinas ADM recombinantes descritas en el presente documento, se pueden resumir como sigue.

1.

En una cianobacteria, los electrones se lanzan desde el fotosistema 1 a la ferredoxina y desde la ferredoxina a la enzima ADM.

2.

En bacterias que carecen del fotosistema 1, los electrones se pueden lanzar desde el NADPH a la ferredoxina mediante la accion de la ferredoxina-NADP+ reductasa (EC 1.18.1.2) y desde la ferredoxina a la enzima ADM.

3.

En las bacterias que carecen de fotosistema 1, los electrones se pueden lanzar desde el NADPH a la flavodoxina mediante la accion de la ferredoxina-NADP+ reductasa (EC 1.18.1.2) y desde la flavodoxina a la enzima ADM.

4.

En las bacterias que carecen de fotosistema 1, los electrones se pueden lanzar desde el NADPH a la

15 ferredoxina mediante la accion de Trichomonas vagina/is NADH deshidrogenasa y desde la ferredoxina a la enzima ADM.

5. En todas las bacterias, los electrones se pueden lanzar desde el piruvato a la ferredoxina mediante la accion de la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (EC 1.2.7.1), y desde la ferredoxina a la enzima ADM.

Ademas de la produccion in vivo de n-alcanos descrita anteriormente, se pueden purificar las proteinas AAR y ADM codificadas por los genes relacionados en las Tablas 1 y 2. Cuando se incubaron in vitro con un donante de electrones adecuado (por ejemp/o, una ferredoxina, tal como se ha descrito anteriormente), las proteinas catalizaran la sintesis enzimatica de n-alcanos in vitro a partir de materiales de partida adecuados (por ejemplo, un acil-ACP o n-alcanal).

25 Ademas de las rutas para la sintesis de n-alcano descritas anteriormente, la presente invencion proporciona tambien una ruta alternativa, concretamente, acil-CoA - n-alcanal - (n-1)-alcano, mediante las sucesivas actividades de la acil-CoA reductasa (ACR) y la ADM. Normalmente, la acil-CoA es el primer intermedio en las rutas metabolicas de la oxidacion de los acidos grasos, de esta manera, tras la importacion en la celula, los acidos grasos anadidos de forma exogena se conviertes en acil-CoA mediante la acil-CoA sintetasa (Figura 1B). La acil-CoA se puede derivar tambien de forma biosinteticamente pura como sigue: acil-ACP - acido graso libre - acil-CoA, mediante las actividades de la acil-ACP tioesterasa citoplasmica (EC 3.1.2.14; es la senal lider menos TesA de E. co/i) y la acil-CoA sintetasa endogena y/o heterologa. Por tanto, se hace referencia tambien a un procedimiento para la biosintesis de n-alcanos, mediante la ruta acil-ACP - acido graso libre intracelular - acil-CoA -n-alcanal - (n-1)-alcano

35 (Figura 1D), catalizada por las sucesivas actividades de la acil-ACP tioesterasa, la acil-CoA sintetasa, la acil-CoA reductasa, y ADM. Por ejemplo, la acil-CoA reductasa Acr1 de Acinetobacter ca/coaceticus y la ADM de Synechococcus sp. Se puede usar PCC7942 (SYNPCC7942 1593) para transformar E. co/i, que se cultiva en presencia de acidos grasos libres exogenos. Las celulas capturan los acidos grasos libres como acil-CoA, que se convierte a continuacion en n-alcanal mediante Acr1, y desde alli en (n-1)-alcano mediante la ADM.

Ejemplo 2

Producci6n de n-alcanos, n-alquenos, y alcoholes grasos en Escherichi. coli K-12 mediante la expresi6n heter6loga de PCC7942 1593 (.dm) ySYNPCC7942 1594 (..r) de Synechococcus elong.tus

45 Se amplifico mediante la PCR la secuencia operonica YNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594 natural a partir del ADN genomico de PCC7942 de Synechococcus e/ongatus y se clono en el vector pJB5 de recombinacion homologa de pAQ1 mediante Ndel y EcoR1. El plasmido resultante se denoto pJB823. Esta construccion coloco el operon SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594 bajo el control transcripcional del promotor aphll constitutivo. Se proporciona la secuencia de pJB823 como SEC ID N°: 15. Los productos intracelulares de hidrocarburos de E.co/i K12 EP1400TM (Epicentre) que contienen pJB823, JCC1076, se compararon con los de EP1400TM que contienen pJB5, la cepa JCC9a control, mediante cromatografia de gases-espectrometria de masas (GC-MS). Se hicieron crecer cultivos clonales de JCC9a y JCC1076 durante la noche a 37° C en Caldo de Luria (LB) que contiene glucosa al 2%, 100 !g/ml de carbenicilina, 50 !g/ml de espectinomicina, 50 !g/ml de estreptomicina, y 1x Solucion de 1nduccion

55 CopyCutter (Epicentre). Para cada cepa, se recogieron 15 ml de cultivo saturado mediante centrifugacion. Los aglomerados celulares se lavaron vigorosamente mediante tres ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y a continuacion se deshidrataron tanto como fue posible mediante tres ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion se extrajeron los aglomerados celulares sometiendolos a vortizacion durante cinco minutos en 0,8 ml de acetona que contenian 100 !g/ml de hidroxitolueno butilado (BHT, un antioxidante general) y 100 !g/ml de araquidato de etilo (EA; un indicador interno de la eficacia de la extraccion). Los desechos celulares se aglomeraron mediante centrifugacion, y se pipetearon 700 !l del extractante en un vial de GC. Estas muestras de JCC9a y JCC1067 en acetona, junto con los patrones autenticos, se analizaron a continuacion mediante GC-MS.

65 El cromatografo de gases fue un Agilent 7890A GC equipado con un espectrometro de masas por impacto de electrones 5975C. Se inyectaron muestras liquidas (1,0 !l) en el CG con un muestreador liquido automatico 7683 equipado con una jeringuilla de 10 !l. La temperatura de entrada del CG fue de 290° C y se utilizo una inyeccion split-less. La columna capilar fue una Agilent HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 !m). El gas portador era helio a un caudal de 1,0 ml/min. El programa de temperatura del horno del CG era de 50° C, mantenido 1 min/10° C por min a 290° C/mantenido 9 min. La temperatura de la interfase CG-MS era de 290° C. La temperatura de la fuente del MS

5 era de 230° C, y la temperatura del cuadripolo fue de 150°C. El intervalo de masas era de 26-600 amu. Se buscaron las correspondencias de los espectros de fragmentacion del MS con la base de datos N1ST del MS, version 2008.

Los picos presentes en los cromatogramas CG-MS de ion total se asignaron quimicamente en una de dos maneras. En la primera, la asignacion se llevo a cabo asegurando que el tiempo de retencion y el espectro de masas de 10 fragmentacion correspondian al tiempo de retencion y al espectro de masas de fragmentacion, respectivamente, de un patron autentico -se hace referencia a esto como "Procedimiento 1", y esencialmente no tiene ambiguedad. En ausencia de patrones autenticos, solo se puede conseguir una asignacion quimica en grado de tentativa; esto se llevo a cabo integrando conjuntamente los siguientes datos para el pico en cuestion. (i) la estructura del espectro de fragmentacion, especialmente con respecto al peso del ion molecular, y al grado al cual se asemeja a un espectro de 15 masas de la "envuelta" caracteristica de un hidrocarburo, (ii) el tiempo de retencion, especialmente con respecto a su compatibilidad cualitativa con el compuesto asignado, por ejemp/o, los n-alquenos cis insaturados se eluyen ligeramente antes que sus homologos n-alcanos saturados, y (iii) la probabilidad de que el compuesto asignado sea quimicamente compatible con el funcionamiento de la AAR-ADM y las rutas relacionadas en el organismo hospedador en cuestion, por ejemp/o, los aldehidos grasos generados por la AAR se espera que se conviertas en

20 los correspondientes alcoholes grasos por las deshidrogenasas del hospedador en E. co/i si no se accionan los suficientemente rapido por la ADM. Esta segunda solucion para la asignacion del pico se denomina "Procedimiento 2". En el cromatograma CG-MS de ion total de la Figura 2, asi como en todos los mencionados cromatogramas en las posteriores figuras, los picos quimicamente asignados mediante el Procedimiento 1 se marcaron en fuente normal, mientras que los asignados mediante el Procedimiento 2 se marcaron en fuente cursiva.

25 En la Figura 2 se muestran los cromatogramas de ion total (T1C) de los extractantes de aglomerados celulares en acetona. Se muestran tambien los T1C de los patrones autenticos de n-alcano C8-C20 (Sigma 04070), asi como 1tetradecanol (Sigma 185388) mas 1-hexadecanol (Sigma 258741) mas 1-octadecanol (Sigma 258768). En la Tabla 3 se detallas los hidrocarburos identificados en JCC1076, pero no en la cepa control JCC9a. Estos hidrocarburos son

30 n-pentadecano (1), 1-tetradecanol (1), n-heptadeceno (2), n-heptadecano (1), y 1-hexadecanol (1), donde el numero entre parentesis indica el procedimiento de asignacion del pico de CG-MS. En la Figura 3 se muestran los espectros de fragmentacion de los picos del Procedimiento 1, representados graficamente frente a sus hallazgos de biblioteca respectivos

35 TABLA 3

Hidrocarburos detectados mediante CG-MS en extractantes de aglomerados celulares en acetona de JCC1076 pero no en JCC9a, en orden creciente de tiempos de retencion

Compuesto

JCC9a JCC1O76 Asignaci6n del pico de CG-MS Is6mero candidato

n-pentadecano

- + Procedimiento 1

1-tetradecanol

- + Procedimiento 1

n-heptadeceno

- + procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 238) cis-7-heptadeceno

n-pentadecano

- + Procedimiento 1

1-hexadecanol

- + Procedimiento 1

"-" no detectado; "+" detectado.

La formacion de estos cinco productos es consistente con el funcionamiento incompleto esperado, es decir, acil-ACP

-

aldehido graso -alcohol graso, y el funcionamiento completo esperado, es decir, acil-ACP -aldehido graso alcano/alqueno, de la ruta de AAR-ADM en E. co/i, cuyas cadenas ramificadas de acil-ACP principales incluyen los

40 grupos 12:0, 14:0, 16:0, 18:0, 16:1L9cis, y 18.1Lcis-ACP acilo (Heipieper HJ (2005), App/ Environ Microbio/ 71: 3388) Suponiendo que n-heptadeceno (2) se deriva de 18:1L11cis-ACP, este corresponderia a cis-7-heptadeceno. En vez de esto, se identifico un isomero de n-heptadeceno como el hallazgo de la biblioteca de fragmentacion de MS de mayor confianza para este tiempo de retencion con el ion molecular de peso molecular 238 esperado; tambien, como se esperaba, este se eluye ligeramente antes que el n-heptadecano.

Ejemplo 3

Producci6n de n-alcanos, n-alquenos, y alcoholes grasos en Escherichi. coli B mediante la expresi6n heter6loga de PCC7942 SYNPCC7942 1593 (.dm) ySYNPCC7942 1594 (..r) de Synechococcus elong.tus

La secuencia operonica SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594 natural se escindio de pJB823 utilizando Nde1 y EcoR1, y se clono en el vector de expresion comercial pCDFDuetTM-1 (Novagen) cortado con Ndel y Mfel. El 5 plasmido resultante se denoto pJB855 (SEC ID N°: 16). Esta construccion coloco el operon SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594 bajo el control transcripcional del promotor T7lacO inducible.

Se compararon los productos intracelulares de hidrocarburo de E. co/i BL21 /DE3) (Novagen) que contienen pJB855, JCC1113, con los de E. co/i BL21 (DE3) que contienen pCDDuetTM-1, la cepa JCC114 control, mediante 10 cromatografia de gases-espectrometria de masas (CG-MS). Los cultivos clonales iniciadores de JCC1114 y JCC1113 se hicieron crecer durante la noche a 37° C en medio minimo M9 suplementado con 6 mg/l de FeSO4s7H2O, 50 !g de espectinomicina, y glucosa al 2% como fuente de carbono; este medio se denomina M9fs. Se utilizo cada cultivo iniciador para inocular un cultivo de 32 ml de M9fs a una DO600 inicial de 0,1. Los cultivos inoculados se hicieron crecer a 37° C a 300 rpm hasta que se hubo alcanzado una DO600 de 0,4, en cuyo momento 15 se anadio 1PTG hasta una concentracion final de 1 mM. Tras la adicion del inductor, se hicieron crecer los cultivos en las mismas condiciones durante 17 horas mas. Para cada cepa, se recogieron a continuacion mediante centrifugacion 12 ml de cultivo saturado. Se lavaron los aglomerados celulares vigorosamente mediante 3 ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y a continuacion se deshidrataron tanto como fue posible mediante 3 ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion se extrajeron los aglomerados celulares 20 sometiendolos a vortizacion durante 5 minutos en 0,7 ml de acetona que contenian 20 !g/ml de BHT y 20 !g/ml de EA. Los desechos celulares se aglomeraron mediante centrifugacion, y se pipetearon 600 !l del sobrenadante en un vial de CG. Estas muestras de JCC1114 y JCC1113, junto con los patrones autenticos, se analizaron a continuacion mediante CG-MS tal como se describe en el Ejemplo 2. El la Figura 4 se muestran los T1C de los extractantes de los aglomerados celulares de JCC1114 y JCC1113 en acetona; los patrones de n-alcano y 1-alcanol son como en el

25 Ejemplo 2. En la Tabla 4 se detallan los hidrocarburos identificados en JCC1113 pero no en la cepa JCC1114 del control

TABLA 4

Hidrocarburos detectados mediante CG-MS en extractantes de aglomerados celulares en acetona de JCC1113 pero no en JCC1114 en orden creciente de tiempos de retencion

Compuesto

JCCI1I4 JCCIII3 Asignaci6n del pico de CG-MS Is6mero candidato

n-tridecano

- Procedimiento 1

n-tetradecano

- + Procedimiento 1

n-pentadeceno

- + Procedimiento 2 ( MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 210) cis-7-pentadeceno

1-dodecanol

- + Procedimiento 2

n-pentadecano

- + Procedimiento 1

n-hexadeceno

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 224) cis-8-hexadeceno

n-hexadecano

- + Procedimiento 1

1-tetradecanol

- + Procedimiento 1

n-heptadeceno

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 238) cis-7-heptadeceno

n-heptadecano

- + Procedimiento 1

1-pentadecanol

- + Procedimiento 2

1-hexadecenol

- + Procedimiento 2 cis-9-hexadecen-1-ol

1-hexadecanol

- Procedimiento 1

1-octadecenol

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 250) cis-11-octadecen-1-ol

"-" no detectado; "+" detectado.

30 Estos hidrocarburos son n-tridecano (1), n-tetradecano (1), n-pentadeceno (2), 1-dodecanol (2), n-pentadecano (1),

n-hexadeceno (2), n-hexadecano (1), 1-tetradecanol (1), n-heptadeceno (2), n-heptadecano (1), 1-pentadecanol (2), 1-hexadecenol (2), y 1-octadecenol (2), donde el numero entre parentesis indica el procedimiento de asignacion del pico de CG-MS. En la Figura 5 se muestran los espectros de fragmentacion de la MS de los picos del Procedimiento 1, representados frente a sus hallazgos de biblioteca respectivos. Los productos principales fueron n-pentadeceno y

5 n-heptadeceno.

La formacion de estos catorce productos es consistente tanto con el funcionamiento esperado incompleto, es decir, acil-ACP -aldehido graso -alcohol graso, como con el funcionamiento esperado completo, es decir, acil-ACP aldehido graso -alcano/alqueno, de la ruta Aar-Adm en E. co/i, cuya cadenas ramificadas de acil-ACP principales incluyen los grupos 12:0, 14:0, 16:0, 18:0 16:1L9cis y 18:1L11cis acilo (Heipieper HJ (2005) Adaptation of Escherichia coli to Ethanol on the Level of Membrane Fatty Acid Composition. App/ Environ Microbio/ 71:3388). Suponiendo que n-pentadeceno (2) se deriva de 16:1Lcis-ACP, este corresponderia a cis-7 pentadeceno. Asi, se identifico un isomero de n-pentadeceno cono el hallazgo de la biblioteca de fragmentacion de MS de mayor confianza para este tiempo de retencion, con el ion molecular de peso molecular 210 esperado; tambien, tal como se 15 esperaba, este se eluye ligeramente antes que el n-pentadecano. Con respecto a 1-dodecanol (2), podria no obtenerse un espectro de fragmentacion suficientemente limpio para el pico debido al solapamiento, mucho mas grande que en el pico de n-pentadecano (1), Su presencia, sin embargo, es consistente con la existencia de 12:0-ACP en E. co/i, y su tiempo de retencion es exactamente el que se ha extrapolado a partir de la relacion entre el numero de carbonos de 1-alcanol y el tiempo de retencion observado, para los patrones autenticos del 1tetradecanol, 1-hexadecanol, y 1-octadecanol que se analizaron. Suponiendo que n-hexadeceno (2) se deriva del nivel de traza del grupo insaturado de17:1L9cis acilo esperado en la poblacion de acil-ACP de E.co/i debida al inicio raro de la cadena de acilo con propionil-CoA en oposicion a malonil-CoA, corresponderia a cis-8-hexadeceno. Asi, se identifico un isomero de n-hexadeceno como el hallazgo de la biblioteca de fragmentacion de MS de mayor confianza para este tiempo de retencion, con el ion molecular de peso molecular 224 esperado: tambien, como se 25 esperaba, este se eluye ligeramente antes que n-heptadecano. Con respecto a 1-pentadecanol (2), podria no obtenerse un espectro de fragmentacion suficientemente limpio para el pico debido a su baja abundancia. Su presencia, sin embargo, es consistente con la existencia de un nivel traza del grupo 15:0 acilo esperado en la poblacion de acil-ACP de E. co/i debida al inicio raro de la cadena de acilo con propionil-CoA en oposicion a malonil-CoA, y su tiempo de retencion es exactamente el que se ha interpolado a partir de la relacion entre el numero de carbonos del 1-alcanol y el tiempo de retencion observado para los patrones autenticos de 1-tetradecanol, 1hexadecanol, y 1-octadecanol que se hicieron avanzar. Ademas, se identifico 1-pentadecanol como el hallazgo de la biblioteca de fragmentacion del MS de mayor confianza para este tiempo de retencion en extractos en acetona de JCC1170, un derivado que expresa Aar sin Adm (vease el Ejemplo 4). Con respecto a 1-hexadecanol (2), podria no obtenerse un espectro de fragmentacion suficientemente limpio para este pico debido a su baja abundancia; sin

35 embargo, suponiendo que este se deriva de 16:1L9cis-ACP, este corresponderia a cis-9-hexadecen-1-ol. Tambien, tal como se esperaba, este se eluye ligeramente antes que 1-hexadecanol. Finalmente, suponiendo que noctadecenol (2) se deriva de 18:11L9cis-ACP, este corresponderia a cis-11-octadecen-1-ol. Asi, se identifico un isomero de n-octadecen-1-ol como el hallazgo de la biblioteca de fragmentacion de MS de mayor confianza para este tiempo de retencion, con el ion molecular de peso molecular 250 esperado; tambien, tal como se esperaba, este se eluye ligeramente antes que 1-octadecanol.

Ejemplo 4

Producci6n de alcoholes grasos en Escherichi. coli B mediante la expresi6n heter6loga de

45 SYNPCC7942 1594 (..r) de Synechococcus elong.tus sin expresi6n simultanea de SYNPCC7942 1593 (.dm)

A fin de ensayar la hipotesis de que se requieren AAR y ADM para la biosintesis de alcanos, asi como la prediccion de que la expresion de AAR solamente debe dar como resultado la produccion de alcoholes grasos solo en E. co/i (debido a la deshidrogenacion no especifica de los aldehidos grasos generados), se crearon construcciones de expresion que contenian simplemente SYNPCC7942 1593 (ADM) y simplemente SYNPCC7942 1594 (AAR). De acuerdo con esto, las secuencias de codificacion de SYNPCC7942 1593 y SYNPCC7942 1594 se amplificaron mediante la PCR individualmente y se clonaron mediante Ndel y Mfe1 en el vector de expresion comercial pCDFDuetTM-1 (Novagen). Los plasmidos resultantes se denotaron pJB881 /SYNPCC7942 1593 solo) y pJB882

55 (SYNPCC7942 1594 solo); en cada construccion, la secuencia de codificacion se coloco bajo el control transcripcional del promotor T7/acO.

Los productos intracelulares de hidrocarburo de E. co/i BL21 (DE3) (Novagen) que contienen pJB881, JCC1169, y de E. co/i BL21 (DE3) (Novagen) que contienen pJB882, JCC1170, se compararon con los de E. co/i BL21 (DE3) que contienen pCDFDuetTM-1, la cepa JCC114 del control negativo, asi como la cepa JCC1113 de SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594 (Ejemplo 3) mediante cromatografia de gases-espectrometria de masas (CG-MS), se hicieron crecer los cultivos clonales de JCC1169, JCC1170, JCC1114, y JC1113, se extrajeron, y se analizaron mediante CG MS tal como se describe en el Ejemplo 3, con la siguiente excepcion. El cultivo de JCC1170 se hizo crecer durante la noche en medio M9fs sin 1PTG, debido a que el cultivo no crece si se ha anadido

65 1PTG. De forma presumible, esto ha sido debido a la acumulacion toxica en exceso de alcoholes grasos que se produjo incluso en ausencia de inductor.

En la Figura 6 se muestran los T1C de los extractantes de aglomerados celulares de JCC1169, JCC1114, y JCC1113 en acetona; se han omitido las trazas de patrones de n-alcano y 1-alcanol. En la Tabla 5 se detallan los hidrocarburos identificados en JCC1170, pero no en la cepa JCC1114 del control.

TABLA 5

Hidrocarburos detectado mediante CG-MS en extractantes de aglomerados celulares de JCC1170 pero no en JCC1114 en orden creciente de tiempos de retencion

Compuesto

JCCI1I4 JCCI17O Asignaci6n del pico de CG-MS Is6mero candidato

1-tetradecanol

- + Procedimiento 1

1-pentadecanol

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 182)

1 -hexadecenol

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 222) cis-9-hexadecen-1-ol

1-hexadecanol

- + Procedimiento 1

1-octadecenol

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 250) cis-11-octadecen-1-ol

"-" no detectado;'+' detectado.

Estos hidrocarburos son 1-tetradecanol (1), 1-pentadecanol (2), 1-hexadecanol (2), 1-hexadecanol (1), 1octadecanol (2) donde el numero entre parentesis indica el procedimiento de asignacion del pico de CG-MS. En la

10 Figura 7 se muestran los picos del Procedimiento 1 de los espectros de fragmentacion de la MS, representados graficamente frente a sus hallazgos de biblioteca respectivos. No se identificaron hidrocarburos en JCC1169, cuyas trazas fueron indistinguibles de las de JCC1114, tal como se esperaba debido a la ausencia de generacion de un sustrato de aldehidos grasos por AAR.

15 La ausencia de produccion de alcanos, alquenos, y alcanoles grasos en JCC1169, la produccion solamente de alcoholes grasos en JCC1170, y la produccion de alcanos, alquenos, y alcanoles grasos en JCC1113 (tal como se describe en el Ejemplo 3) son todas consistentes con el mecanismo propuesto de biosintesis de alcanos por AAR y ADM en E. co/i. De esta manera, la formacion de cinco alcoholes grasos en JCC1170 es consistente con que solamente AAR este activa, y activa sobre la cadena lineal de los grupos acil-ACP (vease el Ejemplo 3). Con

20 respecto a 1-pentadecanol (2), su presencia es consistente con la existencia del nivel traza de grupo 15:0 acilo esperado en la poblacion de acil-ACP de E. co/i debido al inicio raro de la cadena de acilo con propionil CoA en oposicion a la malonil CoA y su tiempo de retencion es exactamente el que se ha interpolado a partir de la relacion entre el numero de carbonos del 1-alcanol y el tiempo de retencion observado, para los patrones autenticos del 1tetradecanol, 1-hexadecanol, y 1-octadecanol que se han hecho avanzar. Lo mas importante, el pico del 1

25 pentadecanol (2) presenta un espectro de masas de fragmentacion de tipo envuelta con el ion molecular de peso molecular 182 esperado. A diferencia del caso de JCC1113, podria obtenerse ahora un espectro de fragmentacion limpio a partir del pico de 1-hexadecanol candidato debido a una abundancia creciente. El mejor hallazgo de la biblioteca fue un 1-hexadecenol con el ion molecular de peso molecular 222 esperado. Suponiendo que se derive de

16: 1L9cis hexadecenil-ACP, la asignacion isomerica seria cis-9-hexadecen-1-ol, tambien, como se esperaba, este

30 se eluye ligeramente antes que 1-hexadecanol. Suponiendo que n-octadecenol (2) se deriva de 18:1L9cis-ACP, este corresponderia a cis-11-octadecen-1-ol. En vez de esto, se identifico un isomero de n-octadecen-1-ol como el hallazgo de la biblioteca de fragmentacion de MS de mayor confianza para este tiempo de retencion, con el ion molecular de peso molecular 250 esperado; tambien, como se esperaba, este se eluye ligeramente antes que 1octadecanol. Existe tambien un pico secundario sin identificar en JCC1170 que se eluye en la cola del 1

35 hexadecenol y cuyo espectro de masas de fragmentacion no fue lo suficientemente limpio para permitir una posible identificacion. Se teorizo que este podria ser el producto del aldehido C18 primario esperado de la actividad individual de AAR en E. co/i, es decir, cis-11-octadecenal.

Ejemplo 5

40 Producci6n de n-alcanos, n-alquenos, y alcoholes grasos en PCC 7002 de Synechococcus sp., mediante la expresi6n heter6loga de PCC7942 SYNPCC7942 1593 (.dm) y SYNPCC7942 1594 (..r) de Synechococcus elong.tus

45 Con el fin de ensayar si la expresion heterologa de AAR y ADM conduciria a la biosintesis de alcanos deseada en una cianobacteria hospedadora, el operon SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594 se expreso en PCC 7002 (JCC138) de Synechococcus sp. De acuerdo con esto, el plasmido pJB823 se transformo en JCC138, generando la cepa JCC1160. La secuencia y la anotacion de este plasmido se proporcionaron como la SEC ID N°: 15, y se describen en el Ejemplo 2. En esta construccion, el operon SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594 se coloco

5 bajo el control transcripcional del promotor aphll constitutivo. Regiones de homologia en la direccion 5' y en la direccion 3' de 50 pares de bases dirigen la integracion de la recombinacion homologa en el plasmido pAQ1 de JCC138 natural con un alto numero de copias, y un gen aadA permite la seleccion de los transformantes en virtud de su resistencia a la espectinomicina.

10 Para ensayar el efecto de promotores potencialmente fuertes, se generaron tambien construcciones directamente analogas a pJB823 que sustituyeron al promotor aphll con lo siguiente: el promotor de cro del fago lambda (Pcl), el promotor de cpcB de PCC 6803 de Synechocystis sp (PcpcB), el promotor trc junto con una copia en la direccion 5' del casete del promotor /ac/ (P/ac/-trc), el promotor EM7 sintetico (PEM7). Los promotores se intercambiaron mediante los sitios Notl y Nde1 que flanqueaban el promotor en la direccion 5' del operon SYNPCC7942 1593

15 SYNPCC7942 1594 en el vector pJB823. Los plasmidos finales correspondientes fueron como sigue: pJB886 (Pc/), pJB887 (PcpccB), pJB889 (P/ac/-trc), pJB888 (PEM7), y pJB823 (Paphll). Estas secuencias de pJB886, pJB889, y pJB888, son identicas a la secuencia de pJB823 excepto en la region entre los sitios Not1 y Nde1, donde difieren de acuerdo con el promotor usado. Las secuencias de las diferentes regiones promotoras se proporcionan como SEC ID N°: 19 (Pc/), SEC ID N°: 20 (PcpcB), SEC ID N°: 21 (P/ac/-trc), y la SEC ID N°: 22 (PEM7). La secuencia del

20 promotor Paphll se presenta en la SEC ID N°: 15.

pJB886, pJB887, pJB889, pJB888, pJB823, asi como pJB5 (el vector de direccion pAQ1 vacio que carece completamente de la secuencia operonica SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594) se transformaron naturalmente en JCC138 utilizando un protocolo de transformacion de cianobacterias normalizado, generando las 25 cepas JCC1221 (Pcl), JCC1220 (PcpcB), JCC1160b (P/ac/-trc), JCC1160a (PEM7), JCC1160 (Paphll), y JCC879 (PJB5), respectivamente. De forma breve, se anadieron 5-10 !g de ADN plasmido a 1 ml de cultivo de JCC138 puro que se habia hecho crecer a una DO730 de aproximadamente 1,0. La mezcla de ADN-celulas se incubo a 37° C durante 4 horas en la oscuridad con un mezclado suave, se plaqueo en placas A+, y se incubo en una fotoincubadora (Percival) durante 24 horas, en cuyo momento se reforzo la espectinomicina hasta una concentracion 30 final de 50 !g/ml. Aparecieron colonias resistentes a la espectinomicina tras 5-8 dias de incubacion adicional en condiciones de luminosidad durante 24 horas (� 100 !mol de fotones m-2 s-1). Tras un ciclo de purificacion de las colonias en placas A+ suplementadas con 100 !g/ml de espectinomicina, se hicieron crecer colonias individuales de cada una de las seis cepas transformadas en tubos de ensayo durante 4-8 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 3% a � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion.

35 El medio de crecimiento usado para el cultivo liquido fue A+ con 200 !g/ml de espectinomicina.

A fin de comparar los productos intracelulares de hidrocarburo de las cepas JCC1221, JCC1220, JCC1160b, JCC1160a, JCC1160, y JCC879, y se recogio mediante centrifugacion una cantidad 24 ml, DO730, de celulas (� 2,4 x 109 celulas) de cada cepa de los cultivos de las tubos de ensayo anteriormente mencionados. Los aglomerados 40 celulares se lavaron vigorosamente mediante 3 ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y a continuacion se deshidrataron tanto como fue posible mediante 3 ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion se extrajeron los aglomerados celulares sometiendolos a vortizacion durante 5 minutos en 0,7 ml de acetona que contenias 20 !g/ml de BHT y 20 !g/ml de EA. Los desechos celulares se aglomeraron mediante centrifugacion, y se pipetearon 600 !l del sobrenadante en un vial de CG. A continuacion se analizaron los seis

45 extractantes, junto con los patrones autenticos mediante CG-MS tal como se describe en el Ejemplo 2.

En la Figura 8, se muestran los T1C de los extractantes de los aglomerados celulares de JCC1221, JC1220, JCC1160b, JCC1160a, JCC1160, y JCC879 en acetona; los patrones de n-alcano y 1-alcanos son como en el Ejemplo 2; Consistente con una gama de fuerzas del promotor, y con la funcion de la ruta AAR-ADM, hubo un

50 intervalo de acumulacion de hidrocarburos, siendo el orden de acumulacion Pc/ > PcpcB > P/ac/-trc > PEM7 > Paphll (Figura 8A).

En JCC1160, se encontro que aproximadamente un 0,2% del peso de celulas secas estaba en forma de n-alcanos y n-alcan-1-ol (excluyendo n-nonadec-1-eno). De este 0,2%, aproximadamente tres cuartos correspondian a n

55 alcanos, siendo los productos principales n-heptadecano y n-pentadecano. Estos hidrocarburos no se detectaron en JCC879. En la Tabla 6A se resumen los datos.

Tabla 6A Hidrocarburos detectados en extractos de JCC1160 y JCC879 en acetona El mayor acumulador fue JCC1221 (Pcl). Los hidrocarburos identificados en JCC1221, pero no en la cepa JCC879 del control, se detallan en la Tabla 6B, Tabla 6C, y en la Figura 8B. Estos hidrocarburos son n-tridecano (1), ntetradecano (1), n-pentadecano (2), n-pentadecano (1), n-hexadecano (1), n-heptadec-di-eno (2), tres isomeros de nheptadeceno (2), n-heptadecano (1), y 1-octadecanol (1), donde el numero entre parentesis indica el procedimiento de asignacion del pico de CG-MS

� aproximado de peso de celulas secas

Compuesto

JCC879 JCCII6O

n-pentadecano

no detectado 0,024%

n-hexadecano

nd 0,004%

n-heptadecano

nd 0,110%

� aproximado de peso de celulas secas

Compuesto

JCC879 JCCII6O

n-octadecan-1-ol

nd 0,043%

Total 0,181� � de productos que son n-alcanos 76�

Tabla 6B n-alcanos cuantificado en extracto de JCC1221 en acetona

Compuesto

� de peso de celulas secas de JCC1221

n-tridecano

< 0,001%

n-tetradecano

0,0064%

n-pentadecano

0,40%

n-hexadecano

0,040%

n-heptadecano

1,2%

Total

1,67�

10 En la Figura 9 se muestran los picos de los espectros de fragmentacion de MS del Procedimiento 1, representados graficamente frente a sus hallazgos de biblioteca respectivos. Los unicos alcanos/alquenos observados en JCC879 fueron 1-nonadeceno y una pequena cantidad de nonadec-di-eno, alquenos que se conocen por ser sintetizados naturalmente por JCC138 (Winters K y col. (1996) Science 163: 467-468). Los productos principales observados en JCC1221 fueron n-pentadecano (�25%) y n-heptadecano (�75%), el resto lo fue relativamente en niveles traza.

15 La formacion de n-pentadecano y n-heptadecano en JCC1221, asi como el resto de nueve productos de hidrocarburo trazas, es consistente con el funcionamiento virtualmente completo de la ruta ADM-AAR en JCC138, es decir, 16:0 hexadecil-ACP -n-hexadecanal -n-pentadecano y 18:0 octadecil-ACP -n-octadecanal -nheptadecano. En vez de esto, se sabe que las especies acil-ACP principales en el organismo son C18:0 y C18:0

20 (Murata n y col. (1992) Plant Cell Physiol 33: 933-941). Se produce relativamente mucho menos alcohol graso con respecto a la expresion de AAR-ADM en E. co/i (Ejemplo 3), que la esperada, dada la presencia en JCC138 del sistema ferredoxina/ferredoxina-NADPH reductasa de cianobacterias que puede regenerar el sitio activo diferrico de la ADM, evitando por tanto la acumulacion de hexadecanal y octadecanal que podria a la vez deshidrogenar de forma no especifica a los correspondientes 1-alcanoles. De esta manera, en JCC1221, solo se observo un pico muy

25 pequeno correspondiente a 1-octadecanol (1) (Figura 8).

Se cree que el resto de hidrocarburos traza observados en JCC1221 son isomeros insaturados de n-pentadecano y n-heptadecano (Tabla 6C). Se ha teorizado que todos estos alquenos se han generado mediante acontecimientos de desaturacion tras la produccion de los correspondientes alcanos por la SYNPCC7942 1593 Adm. Esto contrasta 30 con la situacion en E. co/i en la que se introdujeron dobles enlaces en la cadena de acilo en crecimiento mientras que esta estaba unida a la proteina portadora de acilo (Ejemplo 3). Se sabe que JCC138 tiene una variedad de desaturasas de acilo-lipidos especificas de la posicion que, aunque nominalmente activas solo en los acidos grasos esterificados con glicerolipidos, podrian actuar potencialmente sobre alcanos no reactivos de otra forma producidos de manera no fisiologica mediante la accion de AAR y ADM. Las desaturasas de JCC138, es decir, DesA, DesB, y

35 DesC, introducen dobles enlaces en cis en las posiciones L9, L12, y L15 de las cadenas de acilo C18, y en las posiciones L9 y L12 de las cadenas de acilo C16 (Murata N y Wada H (1995) Biochem J. 308: 1-8). Se cree que el pico de n-pentadeceno candidato es cis-4-pentadeceno (Tabla 6C).

Suponiendo tambien que el heptadecano podria servir ademas como sustrato para las desaturasas de JCC138, y

40 que podria desaturarse en las posiciones analogas a los restos de L9, L12, y L15 del acilo C18, existen cuatro isomeros no saturados teoricamente posibles: cis 3-heptadeceno, cis-6-heptadeceno, cis-8-heptadeceno, y cis-9heptadeceno. Estos isomeros no incluyen la unica especie de n-heptadecano nominalmente observada en E. co/i, cis-7-heptadeceno (Ejemplo 2). Se cree que los tres picos mas cercanos al pico de n-heptadecano denotado por los subindices 1, 2, y 3 en la Tabla 6c y en la Figura 8B -abarca al menos tres de estos cuatro isomeros

45 monoinsaturados de heptadecano. Consistente con esto, los picos de n-heptadeceno2 y n-heptadeceno3 tienen los iones moleculares esperados de masa 238 en sus espectros de fragmentacion de tipo envuelta. Existen muchas posibilidades isomericas, de acuerdo con esto, para los presuntos picos de cis, cis-heptadec-di-eno, que tienen un espectro de fragmentacion de tipo envuelta con los iones moleculares de masa 236 esperados. Tal como se esperaba, todas las presentes especies de heptadeceno se eluyen ligeramente antes de n-heptadecano.

TABLA 6C

Alcanos y alquenos detectados mediante CG-MS en extractantes de aglomerados celulares de JCC1221 en acetona pero no en JCC879 en orden creciente de tiempo de retencion. "-", no detectado, "+", detectado.

Compuesto

JCC879 JCCI22I Asignaci6n del pico de GC-MS Is6mero candidato

n-tridecano

- + Procedimiento 1

n-tetradecano

- + Procedimiento 1

n-pentadeceno

- + Procedimiento 2 cis-4-pentadeceno

n-pentadecano

- Procedimiento 1

n-hexadecano

- + Procedimiento 1

n-heptadec-dieno

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 236) cis, cis-heptadec-di-eno

n-heptadeceno3

Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 238) cis-[316/8/9]-heptadeceno

n-heptadeceno2

- + Procedimiento 2 (MS de tipo envuelta con ion molecular de masa 238) cis-[3/6/8/9]-heptadeceno

n-heptadecene1

- + Procedimiento 2 cis-[3/6/8/9]-heptadeceno

n-heptadecano

- + Procedimiento 1

1-octadecanol

- + Procedimiento 1

Ejemplo 6

Acumulaci6n intracelular de n-alcanos hasta un 5� de peso de celulas secas en PCC 7002 de Synechococcus sp., mediante la expresi6n heter6loga de PCC7942 SYNPCC7942 1593 (.dm) y

10 SYNPCC7942 1591 (..r) de Synechococcus elong.tus

A fin de cuantificar con mas precision el nivel de acumulacion intracelular de productos de n-alcano en el alcanogeno JCC1221 (Ejemplo 5), se cuantificaron los niveles de n-pentadecano y n-heptadecano, asi como los productos con una cantidad relativa de trazas n-tetradecano y n-hexadecano, con respecto al peso de celulas secas (DCW). 15 Basandose en la hipotesis de que la extension de la produccion de n-alcano podria correlacionarse de forma positiva con el nivel de expresion del operon SYNPCC7942 1593-SYNPCC7942 1594, se determinaron los niveles de nalcanos normalizados para el DCW como una funcion de la concentracion de espectinomicina del medio de crecimiento. La explicacion racional fue la mayor presion selectiva de la espectinomicina, el mayor numero de copias relativas de pAQ1, y el mayor numero de copias de aadA unidas al operon SYNPCC7942 1593

20 SYNPCC7942 1594.

Un cultivo iniciador clonal de JCC1221 se hico crecer en medio A+ suplementado con 100 !g/ml de espectinomicina durante 7 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 3% a � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion. En este punto, el cultivo se uso para inocular 30 ml de medio JB2.1 25 por triplicado (documento PCT/US2009/006516) en cultivos en cultivos en matraces suplementados con 100, 200, 300, 400, o 600 !g/ml de espectinomicina. El medio JB2.1 consiste en 18,0 g/l de cloruro sodico, 5 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado, 4,0 g/l de nitrato de sodio, 1,0 g/l de Tris, 0,6 g/l de cloruro de potasio, 0,3 g/l de cloruro de calcio (anhidro), 0,2 g/l de fosfato potasico monobasico, 34,3 mg/l de acido borico, 29,4 mg/l de EDTA (sal disodica dihidratada), 14,1 mg/l de citrato ferrico (111) hidratado, 4,3 mg/l de cloruro de manganeso tetrahidratado,

30 315, 0 !g/l de cloruro de cinc, 30,0 !g/l de oxido de molibdeno (V1), 12,2 !g/l de cloruro de cobalto (11) hexahidratado, 10,0 !g/l de vitamina B12, y 3,0 !g/l de sulfato de cobre (11) pentahidratado. Los 15 cultivos se hicieron crecer durante 10 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 3% a � 10 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion.

Para cada cultivo, se utilizaron 5-10 ml para la determinacion del peso de celulas secas. Para hacerlo, se centrifugo un volumen definido de cultivo -que correspondia a aproximadamente 20 mg del DCW-para aglomerar las celulas. Las celulas se transfirieron a un tubo eppendorf prepesado, y a continuacion se lavaron mediante 2 ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y se deshidrataron en tres ciclos de microcentrifugacion y 5 aspiracion. Los aglomerados celulares secos se congelaron a -80° C durante dos horas y a continuacion se liofilizaron durante la noche, en cuyo momento, el tubo que contenia la masa de celulas secas se peso de nuevo de tal manera que la masa del aglomerado celular podria calcularse con un error de p 0,1 mg. Ademas, para cada cultivo, se utilizaron 0,3-0,8 ml para la extraccion en acetona de los aglomerados celulares para el analisis de CG. Para hacerlo, se microcentrifugo un volumen definido de cultivo -que correspondia a aproximadamente 1,4 mg del 10 DCW, para aglomerar las celulas. A continuacion se lavaron las celulas mediante 2 ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y a continuacion se deshidrataron en 4 ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion se extrajeron los aglomerados celulares deshidratados sometiendolos a vortizacion durante 1 minuto en 1,0 ml de acetona que contenian 50 !g/nl de BHT y 160 !g/ml de patron interno de n-heptacosano (Sigma 51559). Los desechos celulares se aglomeraron mediante centrifugacion, y se pipetearon 700 !l del sobrenadante en un vial

15 de CG.

Se cuantificaron las concentraciones de n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano en los quince extractantes mediante cromatografia de gases/deteccion de ionizacion por llama (CG/F1D). Las areas de picos de n-alcano desconocidas en las muestras biologicas se convirtieron en concentraciones mediante relaciones 20 de calibracion lineal determinadas entre concentraciones de patrones autenticos de n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano conocidos y sus correspondientes areas de picos de CG-F1D. Se utilizo un equipo Agilent 7890A CG/F1D equipado con un automuestreador de la serie 7683. Se inyecto 1 !l de cada muestra en la entrada del CG (divisor 5:1, presion 20 psi (137,90 kPa), tiempo de pulso. 0,3 min, tiempo de purga, 0,2 min, flujo de purga. 15 ml/min) y una temperatura de entrada de 280° C. La columna era una HP-5MS (Agilent, 30 m x 0,25 mm x

25 0,25 !m) y el gas portador fue helio a un flujo de 1,0 ml/min. El programa de temperatura del horno del CG era de 50° C, mantenidos durante un minuto; un aumento de 10° C/min hasta 280° C, mantenidos durante diez minutos. Se calculo la produccion de n-alcano como un porcentaje del DCW extraido en acetona.

Consistente con el escalado entre la presion de pAQ1 selectiva y la extension de la produccion intracelular de n

30 alcano en JCC1221, hubo una relacion groseramente positiva entre el % de n-alcanos con respecto al DCW y la concentracion de espectinomicina (Figura 10). Para todos los cultivos de JCC1221, los n-alcanos fueron � 25% de npentadecano y � 75% de n-heptadecano. La produccion minima de n-alcano fue de � 1,8% del DCW en 100 !g/ml de espectinomicina y 5,0% de los cultivos de 600 !g/ml de espectinomicina.

35 Ejemplo 7

Producci6n de n-alcanos en PCC 7002 de Synechococcus sp., mediante la expresi6n heter6loga de MIT 9312 PMT312 0532 (adm) yPMT9312 0533 (aar) de Prochlorococcus m.rinus

40 Se selecciono la pareja Adm/Aar candidata procedente de M1T9312 de Proch/orococcus marinus para el ensayo funcional mediante la expresion heterologa en JCC138 debido a la homologia de aminoacidos relativamente baja (: 62%) de estas proteinas por sus homologos de PCC7942 de Synechococcus e/ongatus, SYNPCC7942 1593 y SYNPCC7942 1594. De forma especifica, la proteina PMT9312 0532 de 252 aminoacidos presenta solo un 62% de identidad de aminoacidos con la proteina SYNPCC7942 1593 de 232 aminoacidos, donde los aminoacidos 33-246

45 de la primera se alinean con los aminoacidos 11-224 de la ultima. La proteina PMT9312 0533 de 347 aminoacidos presenta solo un 61% de identidad de aminoacidos con la proteina SYNPCC7942 1594 de 342 aminoacidos, donde los aminoacidos 1-337 de la inicial se alinean con los aminoacidos 1-339 de la ultima.

Se sintetizo una version optimizada del codon y del sitio de restriccion del operon PMT9312 0532-PMT9312 0533

50 mediante el ADN 2.0 (Menlo Park, CA) flanqueados por los sitios Ndel y EcoR1. Se clono el operon en el vector pJB5 de recombinacion homologa de pAQ1 mediante Ndel y EcoR1, de tal manera que el operon PMT9312 0532-PMT9312 0533 se coloco bajo el control transcripcional del promotor aphll. La secuencia del vector pJB947 se proporciona como la SEC ID N°: 17.

55 Se transformo pJB947 en JCC138 tal como se describe en el Ejemplo 5, generando la cepa JCC1281. Se compararon los productos de hidrocarburo de esta cepa con los de la cepa JCC879 del control negativo, que correspondian al JCC138 transformado con pJB5 vacio (vease el Ejemplo 5). Se recogio mediante centrifugacion una cantidad de 8 ml, DO730, de celulas (� 8 x 108 celulas) de cada cepa, haciendolas crecer en medio A+ suplementado con 200 !g/ml de espectinomicina, tal como se describe en el Ejemplo 5. Los aglomerados celulares

60 se lavaron vigorosamente mediante 3 ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y a continuacion se deshidrataron durante 5 minutos tanto como fue posible mediante 3 ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion se extrajeron los aglomerados celulares sometiendolos a vortizacion durante 5 minutos en 0,7 ml de acetona que contenian 20 !g/ml de BHT y 20 !g/ml de EA, Los desechos celulares se aglomeraron mediante centrifugacion, y se pipetearon 600 !l del sobrenadante en un vial de CG. Se analizaron las muestras mediante CG

65 MS tal como se describe en el Ejemplo 5.

En la Figura 11 se muestran los T1C de los extractantes de aglomerados celulares de JCC1281 y JCC879 en acetona; los patrones de n-alcano son como en el Ejemplo 6. Los hidrocarburos identificados en JCC1281, pero no en la cepa JCC879 del control, fueron n-pentadecano (1) y n-heptadecano (1), donde el numero entre parentesis indica el procedimiento de asignacion del pico de CG-MS. En la Figura 12 se muestran los espectros de

5 fragmentacion de MS de los picos del procedimiento 1, representados graficamente frente a sus hallazgos de biblioteca respectivos (tal como se senala en el Ejemplo 5, los unicos alcanos/alquenos observados en JCC879 fueron 1-nonadeceno y una cantidad mas pequena de nonadec-di-eno, alquenos que son conocidos por ser sintetizados naturalmente por JCC138). La cantidad de n-alcanos producida en JCC1281 es al menos de 0,1% del peso de celulas secas, y al menos 2 veces superior que la cantidad producida por JCC879. La relacion de npentadecano. N-heptadecano (� 40%: �60%) en JCC1281 fue superior que la observada en JCC1221 (� 25%. � 75%), sugiriendo que el PMT9312 0532 (ADM) y/o el PMT9312 0533 (AAR) presentan mayor actividad hacia los sustratos C16 con respecto a los sustratos C18, en comparacion con SYNPCC7942 1593 (ADM) y/o SYNPCC7942 1594 (AAR)

15 Ejemplo 8

Aumento de la producci6n de n-alcano natural en BP-1 de Thermosynechococcus elong.tus mediante la expresi6n en exceso del oper6n tII1313 natural (.dm) -tII1312 (..r)

Los genes que codificaban BP-1 t111312 (AAR) y t111313 (ADM) de Thermosynechococcus e/ongatus se incorporaron en uno o mas plasmidos (por ejemplo, derivados de pJB5), que comprendian promotores de diferente fuerza. Los plasmidos se utilizaron para transformar BP-1 de Thermosynechococcus e/ongatus. Se midio la expresion en exceso de los genes en las celulas transformadas como se vera para la cantidad de n-alcanos, particularmente heptadecano, producidos por las celulas transformadas, de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 3. Se

25 pueden aislar tambien los n-alcanos y otros productos de interes basados en carbono a partir de la celula o del cultivo celular, segun se necesite.

BP-1 de Thermosynechococcus e/ongatus natural, denominado JCC3, produce naturalmente n-heptadecano como el producto intracelular de hidrocarburo principal, con trazas de n-hexadecano y n-pentadecano. Estos n-alcanos se identificaron mediante CG-MS utilizando el Procedimiento 1; en la Figura 13 se muestran los espectros de fragmentacion. De forma breve, se hizo crecer una colonia de JCC3 en medio B-HEPES hasta una DO730 final de � 4, en cuyo punto se cosecho una cantidad de 5 ml, DO730, de celulas, se extrajeron en acetona, y se analizaron mediante CG-MS tal como se detalla en el Ejemplo 5.

35 En un esfuerzo por aumentar la produccion de n-alcano, la secuencia operonica tll1313-tll1312 natural procedente de este organismo se amplifico mediante la PCR y se clono en el vector pJB825 de integracion cromosomica de BP1 de Thermosynechococcus e/ongatus. Esta construccion coloca el operon tll1313-tll1312 bajo el control transcripcional del promotor cl constitutivo. La secuencia del plasmido resultante, pJB825t, se muestra en la SEC ID N°: 18.

pJB825 y pJB825t se transformaron de forma natural en JCC3 utilizando un protocolo de transformacion de cianobacterias normalizado, generando las cepas JCC1084 y JCC1084t, respectivamente. De forma breve, se anadieron 25 !g del ADN plasmido a 0,5 ml del cultivo de JCC3 concentrado (DO730 � 100) que se habia hecho crecer originalmente a una DO730 de aproximadamente 1,0 en B-HEPES a 45° C en aire enriquecido en CO2 al 3% a

45 � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion. La mezcla de ADN se incubo a 37° C durante 4 horas en la oscuridad con mezclado suave, preparandose hasta 7 ml con medio B-HEPES reciente y a continuacion se incubo en condiciones de luz continua (� 100 !mol de fotones m-2 s-1) en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion. En este punto, se recogieron las celulas mediante centrifugacion y se mezclaron diluciones en serie con agar molido en la parte superior y se plaquearon sobre la superficie de las placas suplementadas con B-HEPES con 60 !g/ml de kanamicina. Aparecieron colonias de transformantes en la capa superior del agar en un plazo de alrededor de 7 dias tras la incubacion en una fotoincubadora (Percival) en aire enriquecido al 1% con una irradiancia de � 100 !mol de fotones m-2 s-1. A continuacion se hicieron crecer colonias individuales de JCC1084 y JCC1084t por triplicado a una DO730 de � 6 en B-HEPES/cultivo liquido con 60 !g/ml de kanamicina, y se cuantificaron sus productos intracelulares de hidrocarburo mediante CG-F1D.

55 Una cantidad de 3,5 ml, DO730, de celulas (� 3,5 x 108 celulas) de cada cultivo por replicado de cada cepa se recogio mediante centrifugacion. Los aglomerados celulares se lavaron vigorosamente mediante 3 ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y a continuacion se deshidrataron tanto como fue posible mediante 3 ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion los aglomerados celulares se extrajeron sometiendolos a vortizacion durante 1 minuto en 0,7 ml de acetona que contenian 20 !g/ml de BHT y 20 !g/ml de n-heptacosano. Los desechos celulares se aglomeraron mediante centrifugacion, y se pipetearon 600 !l del sobrenadante en un vial de CG. Los dos extractantes, junto con los patrones autenticos de n-alcano C8-C20 (Sigma 04070), se analizaron a continuacion mediante CG acoplada con deteccion por ionizacion de llama (F1D) tal como se describe en el Ejemplo

6. La cuantificacion de n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano mediante CG-F1D, y los pesos de celulas 65 secas se capturaron tal como se describe en el Ejemplo 6.

Consistente con la creciente expresion de tll1313-tll1312 en JCC1048t con respecto a la cepa JCC1084 del control, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano fueron � 500%, � 100%, y � 100% mas, respectivamente, en JCC1084t con respecto al % de sus niveles del DCW en JCC1084 (Figura 14). La concentracion de n-alcano en ambas cepas fue menor del 1%. La concentracion de n-alcano en JCC1084t fue al menos de 0,62% y al menos dos

5 veces como mucho el n-alcano que se produjo con respecto a JCC 1084.

Ejemplo 9

Comparaci6n de productos intracelulares de hidrocarburo de JCC1113 (un derivado de E� coli) y JCC1221 (un derivado de PCC 7002 de Synechococcus s� .), expresando ambas cepas de forma heter6loga SYNPCC7942 1593 (adm) y SYNPCC7942 1594 (aar)

En la Figura 15 se muestran los T1C de CG-MS de los extractantes de aglomerados celulares de JCC1113 y JCC1221, junto con el T1C de los patrones autenticos de n-alcano C8-C20 (Sigma 04070). Estas dos cepas se

15 derivaron de E. co/i BL21 (DE3) y PCC7002 de Synechococcus sp., respectivamente, y se describen en detalle en los Ejemplos 3 y 5, respectivamente. JCC1113 sintetiza de forma predominante n-heptadeceno y n-pentadecano, mientras que JCC1221 sintetiza de forma predominante n-heptadecano y n-pentadecano. Esta figura resalta visualmente los diferentes tiempos de retencion del isomero de n-heptadeceno producido en JCC1113 y nheptadeceno producido en JCC1221.

Ejemplo 10

Producci6n de hidrocarburos en levaduras

25 Se llevaron a cabo los procedimientos de la presente invencion en cianobacterias. La genomanipulacion de dichos organismos puede incluir la optimizacion de genes para la transcripcion y/o la traduccion eficaz de la proteina codificada. Se puede seguir la expresion de cada proteina introducida en las etapas de la transcripcion y la traduccion mediante tecnicas de transferencia Northern y transferencia Western, respectivamente.

El uso de diversos vectores de expresion de levaduras incluye genes que codifican las actividades que promueven las rutas de la ADM o la AAR, un promotor, un marcador seleccionable y dirigir regiones flanqueantes. Dichos promotores, terminadores, marcadores y regiones flanqueantes estan facilmente disponibles en la tecnica. En una realizacion preferida, se selecciona el promotor en cada caso para proporcionar una expresion optima de la proteina codificada mediante este ORF para permitir una catalisis suficiente de la reaccion enzimatica deseada. Esta etapa

35 requiere seleccionar un promotor que sea tanto constitutivo como inducible, y que proporcione niveles regulados de transcripcion. En otra realizacion, el terminador seleccionado permite una terminacion suficiente de la transcripcion. En una realizacion, el locus en el cual se localiza la construccion del plasmido relevante (que codifica el promotor, el ORF y el terminador), se determina mediante la seleccion de la region flanqueante.

Las cepas genomanipuladas se pueden transformar con una gama de diferentes genes para la produccion de los productos de interes basados en carbono, y estos genes se integran de forma estable para asegurar que la actividad deseada se mantiene a lo largo del procedimiento de fragmentacion.

Ejemplo 11

45 Cuantificaci6n de la relaci6n n-pentadecano:n-heptadecano intracelular de las cepas PCC 7002 de Synechococcus sp., que expresan de forma constitutiva SYNPCC7942 1593 mas SYNPCC7942 1594 (..r) de Synechococcus elong.tus (.dm) heter6logas o MIT 9312 PMT9312 0532 (.dm) mas PMT9312 0533 (..r) de Prochlorococcus m.rinus (..r) en pA�1

En el Ejemplo 5 ("Produccion de n-alcanos, n-alquenos, y alcoholes grasos en PCC7002 de Synechococcus sp. mediante la expresion heterologa de PCC7942 SYNPCC7942 1593 (adm) y SYNPCC7942 1594 (aar) de Synechococcus e/ongatus y en el Ejemplo 7 ("Produccion de n-alcanos en PCC 7002 de Synechococcus sp mediante la expresion heterologa de M1T 9312PMT9312 0532 (adm) y PMT9312 0533 (aar) de Proch/orococcus

55 marinus", se analizaron los productos intracelulares de hidrocarburo de las cepas JCC138 (PCC7002 de Synechococcus sp.) que expresaban pCC7942 de Synechococcus e/ongatus sp. y se analizaron los operones admaar de M1T 9312 de Proch/orococcus marinus mediante CG-MS. En este Ejemplo, se aplico la CG-F1D (Cromatografia de gases-Deteccion mediante ionizacion por llama) para medir con mas precision estos productos con respecto al peso de celulas secas. De especial interes fue la relacion entre n-pentadecano y n-heptadecano. A este respecto, debe senalarse que PCC7942 de Synechococcus e/ongatus sp., sintetiza naturalmente npentadecano como el n-alcano intracelular principal mientras que M1T 9312 de Proch/orococcus marinus sintetiza naturalmente n-pentadecano como el n-alcano intracelular principal.

Se compararon las cuatro cepas siguientes. (1) JCC138, que correspondia a PCC 7002 de Synechococcus sp.,

65 natural, (2) JCC879, que correspondia a la cepa JCC138 del control negativo transformada con el plasmido pJB5 dirigido a pAQ1 descrita en el Ejemplo 5, (3) JCC1469, que correspondia a

JCC138LSYNPCC7002 A1173::gent(JCC1218) transformada con el plasmido pJB886 dirigido a pAQ1 que codificaba adm-aar de PCC7942 que expresaba de forma constitutiva Synechococcus elong.tus sp., descrita en el Ejemplo 5, y (4) JCC1281, que correspondia a JCC138 transformada con el plasmido pJB947 dirigido a pAQ1 que codificaba adm-aar de M1T 9312 de Proch/orococcus marinus expresada de forma constitutiva, descrita en el 5 Ejemplo 7. Se hizo crecer un cultivo iniciador clonal de cada cepa durante hasta 5 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 2% a � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron (11 (1nfors) con agitacion en A+ (JCC138), A+ suplementado con 100 !g/ml de espectinomicina (JCC879 y JCC1281), o A+ suplementado con 100 !g/ml de espectinomicina y 50 !g/ml de gentamicina (JCC1469). En este punto, se utilizo cada cultivo iniciador para inocular 30 ml de medio JB2.1 de cultivos de matraces sin suplemento de antibioticos (JCC138) o con 400

10 !g/ml de espectinomicina (JCC879, JCC1469, y JCC1281). A continuacion se hicieron crecer los ocho cultivos durante 14 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 2% a � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion.

Para cada cultivo, se recogio mediante centrifugacion una cantidad de 25 ml, DO730, de celulas en un tubo eppendorf

15 prepesado. Se lavaron las celulas mediante dos ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y se deshidrataron mediante dos ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. Los aglomerados celulares humedos se congelaron a -80° C durante dos horas y a continuacion se liofilizaron durante la noche, en cuyo momento, el tubo que contenia la masa de celulas secas se peso de nuevo de tal manera que la masa del aglomerado celular (� 6 mg) podria calcularse con un error de + 0,1 mg. En paralelo, se recogio una cantidad de 4 ml, DO730, de celulas de cada

20 cultivo mediante centrifugacion en un tubo eppendorf, se lavaron vigorosamente mediante tres ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y a continuacion se deshidrataron tanto como fue posible mediante tres ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion se extrajeron los aglomerados celulares deshidratados sometiendolos a vortizacion durante 15 segundos en 1 ml de acetona que contenia 23,6 mg/l de BHT y 24,4 mg/l de patron interno de n-heptacosano (C27) (ABH); los desechos celulares se aglomeraron mediante

25 centrifugacion, y 450 !l del sobrenadante se sometieron a CG-F1D. Se calculo el DCW extraido con acetona como 4/25, o 16%, del DCW medido para una cantidad de 25 ml, DO730, de celulas. En paralelo con las ocho extracciones de muestras biologicas, se extrajeron seis tubos eppendorf vacios con ABH de la misma manera. Se evaluo la eficacia de la extraccion/inyeccion de todos los extractantes de ABH calculando la relacion entre el area del pico de CG-F1D del n-heptacosano de la muestra y el area del pico de CG-F1D de n-heptacosano promedio de los seis tubos

30 del control vacios - unicamente se aceptaron las relaciones de 100% p 3% (Tabla 7).

Se cuantificaron las concentraciones de n-tridecano (C13), n-tetradecano (C14), n-pentadecano (C15), n-hexadecano (C16), n-heptadecano (C17), y n-octadecano (C18), en los ocho extractantes mediante (CG/F1D). Las areas del pico de n-alcano desconocido en las muestras biologicas se convirtieron en concentraciones mediante relaciones de 35 calibracion lineal determinadas entre concentraciones de patrones autenticos conocidos de n-tridecano, ntetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, n-heptadecano, y n-octadecano y sus areas de picos de CG-F1D correspondientes. Basandose en estas relaciones de calibracion mediante regresion lineal, se calcularon intervalos de confianza del 95% (1C del 95%) para concentraciones de n-alcano interpoladas en las muestras biologicas; se utilizo la interpolacion en todos los casos, nunca la extrapolacion. Se notificaron intervalos de confianza del 95% 40 como porcentajes 1C% -95% en la Tabla 1 -de la concentracion interpolada en cuestion. Las condiciones de CG-F1D fueron como sigue. Se utilizo un equipo Agilent 7890A GC/F1D equipado con un automuestreador 7683. Se inyecto 1 !l de cada muestra en la entrada del CG (division 8:1, presion) y una temperatura de entrada de 290° C. La columna era una HP-5MS (Agilent, 20 m x 0,18 mm x 0,18 !m) y el gas portador era helio, con un flujo de 1,0 ml/min. El programa de temperatura del horno de CG fue 80° C, mantenidos durante 0,3 minutos, un aumento de

45 17,6° C/min a 290° C, mantenido durante 6 minutos. Se expreso la produccion de n-alcano como un porcentaje del DCW extraido con acetona. El coeficiente de variacion del area del pico de CG-F1D del n-heptacosano de los seis tubos vacios del control fue de 1,0%.

Se resumen los datos de la CG-F1D en la Tabla 7. Tal como se esperaba, las cepas JCC138 y JCC879 del control,

50 no fabricaron n-alcanos, mientras que las cepas JCC1469 y JCC1281 fabricaron n-alcanos, � un 98% de los cuales comprendia n-pentadecano y n-heptadecano. JCC1469 fabrico significativamente mas n-alcanos en porcentaje del DCW (� 1,9%), en comparacion con JCC 1281 (� 0,7%), lo que explica probablemente la DO730 final relativamente baja de los cultivos de JCC1469. Para los cultivos de JCC121 duplicados que expresaban adm-aar de PCC7942 de Synechococcus e/ongatus sp, el porcentaje por masa de n-pentadecano con respecto a n-pentadecano mas n

55 heptadecano fue del 26,2% y del 25,3%, mientras que fue del 57,4% y del 57,2% para los cultivos de JCC1221 duplicados que expresaban adm-aar de M1T 9312 de Proch/orococcus marinus (Tabla 7). Este resultado confirma cualitativamente que estos dos diferentes operones adm-aar generan distribuciones de longitud diferentes del producto de n-alcano cuando se expresan in vivo en una cianobacteria hospedadora.

TABLA 7

Cepa

DO730 C27-Eficacia de extracci6n�inyecci6n normalizada C15 como � del DC� (IC del 95�) C17 como � del DC� (IC del 95�) � de masa de (C15+C17)�(C13+C14+ C15+C16+C17) � de masa de C15�(C15+C17)

JCC138 n° 1

12,5 98% nd nd na na

JCC138 n° 2

13,5 99% nd nd na na

JCC879 n° 1

9,8 100% nd nd na na

JCC879 n° 2

8,5 101% nd nd na na

JCC1469 n° 1

3,1 101% 0,60% (1,1%) 1,69% (0,7%) 97,8% 26,2%

JCC1469 n° 2

3,2 102% 0,36% (1,0%) 1,05% (1,1%) 98,0% 25,3%

JCC1281 n° 1

9,7 101% 0,26% (1,2%) 0,19% (0,9%) 97,2% 57,4%

JCC1281 n° 2

4,8 101% 0,51% (1,9%) 0,38% (1,1%) 97,2% 57,2%

Tabla 7 Se cuantificaron n-pentadecano y n-heptadecano mediante CG-F1D en extractantes de aglomerados 5 celulares de JCC138, JCC879, JCC1469, y JCC1281 en acetona. No se detecto n-octadecano en ninguna de las muestras; nd: no detectado, na: no aplicable

Ejemplo 12

10 Cuantificaci6n de la relaci6n n-pentadecano:n-heptadecano intracelular de las cepas PCC 7002 de Synechococcus sp. que expresan de manera inducible MIT 9312 PMT9312 0532 (.dm) mas PMT9312 0533 (..r) de Prochlorococcus m.rinus heter6loga integrada cromos6micamente con o sin ATCC 51142 Cce 0778 (.dm) mas Cce 1430 (..r) de �y.nothece sp., heter6loga

15 A fin de confirmar que la expresion heterologa de Aar y Adm procedente del cromosoma podria conducir a la acumulacion intracelular de n-alcano, el operon adm-aar de M1T9312 de Proch/orococcus marinus (que codifica PMT9312 0532 mas PMT9312 0533) descrito en el Ejemplo 7 se integro cromosomicamente en el locus SYNPCC702 A0358. Para hacerlo, se construyo un vector de direccion de SYNPCC7002 A0358 (pJB1279� SEC ID N°: 23) que contenia regiones de 750 pb de homologia en la direccion 5' y en la direccion 3 disenado para

20 sustituir de forma recombinante el gen SYNPCC7002 A0358 con un casete de resistencia a la espectinomicina en la direccion 3' de un sitio de multiple clonacion (MCS) situado entre dichas regiones de homologia. En vez de utilizar un promotor constitutivo para expresar el operon adm-aar, se empleo un promotor inducible. Especificamente, un promotor de tipo nirA represible por urea, inducible por nitrato, P(nir07) (SEC ID N°: 24), se inserto en el MCS mediante Not1 y Nde1, generando el vector pJB1279 basico de recombinacion homologa.

25 Se clonaron dos operones en la direccion 3' de P(nir07) de pJB1279 para generar dos construcciones experimentales, donde dichos operones se colocaron bajo el control transcripcional de P(nir07). El primer operon comprendia solo el operon PMT9312 0532-PMT9312 0533 de Proch/orococcus anteriormente mencionado, insertado mediante Nde1 y EcoRi, dando como resultado el plasmido final pJB286alk p; la secuencia de este operon

30 era exactamente tal como se describe en el Ejemplo 7. El segundo operon comprendia (1) el mismo operon admaar de PR4T9312 05 32-PMT9312 0533 de Proch/orococcus, seguido por (2) un operon adm-aar derivado de los genes cce 0778 (SEC 1D N°: 31) y cce 1430 (SEC 1D N° 30) de ATCC51142 de Cyanothece sp., respectivamente, insertados mediante EcoR1 (seleccionando la orientacion correcta mediante cribado), dando como resultado el plasmido final pJb1256. Debe senalarse que ATCC551142 de Cyanothece sp sintetiza naturalmente n-pentadecano

35 como el n-alcano intracelular principal. Este operon adm-aar de Cyanothece (SEC ID N°: 25) se optimizo para el codon y el sitio de restriccion antes de la sintesis por el ADN2.0 (Menlo Park, CA). El operon expresa proteinas con secuencias de aminoacidos identicas a las de las enzimas AAR y ADM procedentes de ATCC51142 de Cyanothece sp. (SEC ID Nos: 27 y 29, respectivamente). El operon completo en el plasmido pJB1256, comprende, por tanto, 4 genes -ADM y AAR de PMT9312 de Proch/orococcus y ADM y AAR de ATCC51141 de Cyanothece sp. -bajo el

40 control de un unico promotor P(nir07).

pJB1279, pJB286alk p, y pJB1256 se transformaron de forma natural en JCC138 exactamente tal como se describe en el Ejemplo 5, generando las cepas JCC1683c, JCC1683, y JCC1685, resistentes a la espectinomicina, respectivamente. Como primera prueba, un cultivo iniciador clonal de cada una de estas tres cepas, asi como JCC138, se hicieron crecer durante hasta 5 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 2% a � 100 !g/ml de espectinomicina (JCC1683c, JCC1683, y JCC1685). En este punto, se utilizo cada cultivo iniciador para inocular 30 ml del medio JB2.1 mas un matraz de cultivo con urea 3 mM sin suplemento de antibioticos (JCC138) o 100

5 !g/ml de espectinomicina (JCC1683c, JCC1683, y JCC1685). A continuacion se hicieron crecer los cuatro cultivos durante 14 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 2% a � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion.

Se recogio una cantidad de 20 ml, DO730, de celulas mediante centrifugacion, en un tubo eppendorf prepesado. Las

10 celulas se lavaron mediante dos ciclos de resuspension en agua Milli-Q y microcentrifugacion, y se deshidrataron mediante dos ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. Los aglomerados celulares humedos se congelaron a -80° C durante dos horas y a continuacion se liofilizaron durante la noche, en cuyo momento, el tubo que contenia la masa de celulas secas se peso de nuevo de tal manera que la masa del aglomerado celular (� 6 mg) podria calcularse con un error de p 0,1 mg. En paralelo, se recogio una cantidad de 3,5 ml, DO730, de celulas de cada

15 cultivo mediante centrifugacion, y a continuacion se deshidrato tanto como fue posible mediante tres ciclos de microcentrifugacion y aspiracion. A continuacion se extrajeron los aglomerados celulares deshidratados sometiendolos a vortizacion durante 15 segundos en 1,0 ml de acetona que contenian 18,2 mg/l de BHT y 16,3 mg/l de patron interno de n-heptacosano (C27) (ABH); los desechos celulares se aglomeraron mediante centrifugacion, y 500 !l del sobrenadante se sometieron a CG-F1D. Se calculo el DCW extraido con acetona como 3,5/20, o 17,5%

20 del DCW medido para una cantidad de 20 ml, DO730, de celulas. En paralelo a las extracciones de las cuatro muestras biologicas, se extrajeron ocho tubos eppendorf vacios con ABH de la misma manera. Se evaluo la eficacia de la extraccion/inyeccion de todos los extractantes de ABH calculando la relacion entre el area del pico de CG/F1D de n-heptacosano de la muestra y el area promedio del pico de CG-F1D de n-heptacosano de los seis controles de tubos vacios - se aceptaron unicamente relaciones de 100% p 11% (Tabla 8).

25 Se cuantificaron las concentraciones de n-tridecano (C13), n-tetradecano (C14), n-pentadecano (C15), n-hexadecano (C16), n-heptadecano (C17), y n-octadecano (C18), en los cuatro extractantes mediante (CG/F1D) tal como se describe en el Ejemplo 11, las condiciones de CG-F1D fueron como sigue. Se utilizo un Agilent 7890A GC/F1D equipado con un automuestreador de la serie 7683. Se inyecto 1 !l de cada muestra en la entrada del CG (division 5.1, presion) y

30 una temperatura de entrada de 290° C. La columna era una HP-5 (Agilent, 30 m x 0,32 mm x 0,25 !m) y el gas portador era helio a un flujo de 1,0 ml/min. El programa de temperatura del horno de CG fue de 50° C, mantenido durante 1,0 minutos, un aumento de 10° C/min hasta 290° C, mantenido durante 9 minutos, se calculo la produccion de n-alcano como un porcentaje del DCW extraido con acetona. El coeficiente de variacion del area del pico de CG-F1D del n-heptacosano de los ocho tubos del control fue de 3,6%.

35 En la Tabla 8 se resumen los datos de CG-F1D. Tal como se esperaba, las cepas JCC138 y JCC1683c del control no fabricaron n-alcanos, mientras que JCC683 y JCC1685 fabricaron n-alcanos, el 97% de los cuales comprendia npentadecano y n-heptadecano. JCC1685 fabrico significativamente mas n-alcanos en porcentaje del DCW (� 0,42%) en comparacion con JCC1683 (� 0,16%), lo que explicaba probablemente la DO730 final relativamente baja del

40 cultivo de JCC1685. Para el adm-aar de M1T 9312 de Proch/orococcus marinus que expresaba JCC1683, el porcentaje en masa de n-pentadecano con respecto al n-pentadecano mas n-heptadecano fue del 53,2%, cuantitativamente acorde con el de JCC1281 que expresaba el mismo operon en pAQ1 (57,3%; Tabla 7). En contraste, para JCC1685, que expresa adicionalmente el adm-aar de ATCC51142 de Cyanothece sp, el porcentaje en masa de n-pentadecano con respecto al n-pentadecano mas n-heptadecano fue del 83,7%. Este resultado

45 demuestra que la expresion in vivo de cce 0778 y de cce 1430 en una cianobacteria hospedadora tiene un sesgo en la distribucion de la longitud del producto de n-alcano hacia n-pentadecano - incluso mas de los que hace la expresion de PMT9312 0532 y PMT9312 0533. La cantidad total de n-alcano intracelular producida por los integrantes cromosomicos JCC1683 y JCC1685 es aparentemente menor que la de los transformantes basados en pAQ1 tales como JCC1469, debido presumiblemente a una combinacion de una expresion de un numero bajo de

50 copias (es decir, cromosoma frente a pAQ1 de alto numero de copias), y la transcripcion parcialmente reprimida debido a la presencia inicial de urea en el medio de crecimiento -de (Pnir07) en comparacion con los promotores constitutivos P(aphllJ (JCC1281) y P(c/J (JCC1469).

TABLA 8

Cepa

DO730 C27-Eficacia de extracci6n�inyecci6n normalizada C15 como � del DC� C17 como � del DC� � de masa de (C15+C17)�(C13+C14+ C15+C16+C17) � de masa de C15�(C15+C17)

JCC 138

17.0 110% nd nd na na

JCC1683c

13.4 108% nd nd na na

JCC1683

12.2 111% 0,083% (7,6%) 0,073% (12,5%) 97,3% 53,2%

Cepa

DO730 C27-Eficacia de extracci6n�inyecci6n normalizada C15 como � del DC� C17 como � del DC� � de masa de (C15+C17)�(C13+C14+ C15+C16+C17) � de masa de C15�(C15+C17)

JCC1685

10.0 110% 0,341% (13,0%) 0,066% (8,8%) 96,7% 83,7%

Tabla 8 Se cuantificaron n-pentadecano y n-heptadecano mediante CG-F1D en extractantes de aglomerados celulares de JCC138, JCC1683c, JCC1683, y JCC1685 en acetona. No se detecto n-octadecano en ninguna de las muestras, nd: no detectado, na: no aplicable.

5 A fin de confirmar la represibilidad de la urea/inducibilidad del nitrato de P(nir07), se determino la distribucion del producto intracelular de n-alcano de JCC1685 a partir de cultivos en crecimiento tanto en medio JB2.1, que contenia unicamente nitrato como fuente de nitrogeno o bien en JB2.1 suplementado con urea 6 mM, urea que se esta utilizando de forma preferente como fuente de nitrogeno con respecto al nitrato y se proporciona a una

10 concentracion tal que llega a agotarse cuando el cultivo alcanza una DO730 de � 4. JCC1683c en JB2.1 se analizo en paralelo como un control negativo. De acuerdo con esto, se hizo crecer un cultivo iniciador clonal de JCC1683c y JCC1685 durante 5 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 2% a � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion en medio A+ suplementado con 100 !g/ml de espectinomicina. En este momento, se utilizo cada cultivo iniciador para inocular 30 ml de medio JB2.1 por duplicado en matraces de

15 cultivo suplementados con 400 !g/ml de espectinomicina; ademas el cultivo iniciador JCC1685 se utilizo para inocular 30 ml de medio JB2.1 por duplicado mas urea 6 mM en matraces de cultivo suplementados con 400 !g/ml de espectinomicina. A continuacion se hicieron crecer los seis cultivos durante 14 dias a 37° C a 150 rpm en aire enriquecido con CO2 al 2% a � 100 !mol de fotones m-2 s-1 en una fotoincubadora Multitron 11 (1nfors) con agitacion. Se determinaron los n-alcanos intracelulares como un porcentaje del DCW exactamente tal como se describe en el

20 Ejemplo 11; en la Tabla 9 se resumen los datos. Consistente con la represibilidad de la urea de P(nir07), los nalcanos como un porcentaje del DCW de JCC185 fueron significativamente mayores en ausencia de urea (� 0,59%) en comparacion con en presencia de urea (� 0,15%). Esto explica probablemente la DO730 final relativamente baja de los cultivos sin urea.

TABLA 9

Cepa

Medio DO730 C27-Eficacia de extracci6n�inyecci6n normalizada C15 como� del DC� (95�) IC en �) C17 como � del DC� (95�) IC en �) n-alcanos como � del DC� � de masa de (C15+C17)�(C13+C14+ C15+ C16+C17) � de masa de C15�(C15+C17)

JCC1683c n°1

JB2.1 9,5 101% nd nd na na na

JCC1683c n°2

JB2.1 9,5 101% nd nd na na na

JCC1685 n° 1

JB2.1 + 6mM 7,4 102% 0,076%(7,1%) 0,067%(1,5%) 0,14% 100% 53,2%

JCC1685 n° 2

JB2.1 + 6mM 6,4 102% 0,090%(3,3%) 0,051%(2,3%) 0,15% 94,6% 63,9%

JCC1685 n° 1

JB2.1 1,2 101% 0,42%(1,4%) 0,14%(1,1%) 0,57% 97,9% 74,9%

JCC1685 n° 2

JB2.1 3,3 102% 0,49%(1,6%) 0,11%(1,6%) 0,60% 100% 81,4%

Tabla 9 Se cuantificaron n-pentadecano y n-heptadecano mediante La CG-F1D de los extractantes de aglomerados celulares de JCC1683c y JCC1685 en acetona como una funcion de la urea en el medio de crecimiento. No se detecto n-octadecano en ninguna de las muestras; nd; no detectado, na: no aplicable.

L1STADO 1NFORMAL DE SECUENC1AS

SEC 1D N°: 1 ThermoSynechococcus e/ongatus BP-1; Secuencia de acido nucleico de t111312 (AAR)

SEC 1D N°: 2 ThermoSynechococcus e/ongatus BP-1; Secuencia de aminoacidos de t111312 (AAR)

SEC 1D N°: 3 ThermoSynechococcus e/ongatus BP-1; secuencia de acido nucleico de tll1313 (ADM)

SEC 1D N°: 4 ThermoSynechococcus e/ongatus BP-1; secuencia de aminoacidos de tll313 (ADM)

SEC 1D N°: 5 Synechococcus e/ongatus PCC 7942; secuencia de acido nucleico de SYNPCC7942 1594 (AAR)

SEC 1D N°: 6 Synechococcus e/ongatus PCC 7942; secuencia de aminoacidos de SYNPCC7942 1594 (AAR)

SEC 1D N°: 7 Synechococcus e/ongatus PCC 7942; secuencia de acido nucleico de SYNPCC7942 1593 (ADM)

SEC 1D N°: 8 Synechococcus e/ongatus PCC 7942; secuencia de aminoacidos de SYNPCC7942 1593 (ADM)

SEC 1D N°: 9 Proch/orococcus marinus M1T9312; secuencia de acido nucleico optimizada de PMT9312 0533 (AAR)

SEC 1D N°: 10 Proch/orococcus marinus M1T9312; secuencia de proteina de PMT9312 0533 (AAR)

SEC 1D N°: 11 Proch/orococcus marinus M1T9312; secuencia de acido nucleico optimizada de PMT9312 0532 (ADM)

SEC 1D N°: 12 Proch/orococcus marinus M1T9312; secuencia de proteina de PMT9312 0532 (ADM)

10 SEC 1D N°: 13 Proch/orococcus marinus M1T9312; secuencia de acido nucleico de PMT9312 0533 (AAR)

15 SEC 1D N°: 14 Proch/orococcus marinus M1T9312; secuencia de acido nucleico de PMT9312 0532 (ADM)

SEC 1D N°: 15

plasmido JB823

1a secuencia subrayada

Region de homologia cadena arriba para pAQ 1

1a secuencia en minusculas con doble subrayado

Sitio Not1 para cambio de promotor

1a secuencia en cursiva

Promotor de aph//

2a secuencia en minusculas con doble subrayado

Sitio Nde/ para cambio de promotor

1a secuencia en negrita

Secuencia codificante de SYNPCC7942 1593 (adm)

1a secuencia en minusculas

Secuencia intergenica

2a secuencia en negrita 2a secuencia en cursiva

Secuencia codificante de SYNPCC7942 1594 (aarJ Secuencia codificante de aadA, marcador de seleccion specR

2a secuencia subrayada

Region de homologia cadena abajo para pAQ 1

2a secuencia en minusculas

Cadena principal del vector

5

SEC 1D N°: 16 plasmido pJB855

1a secuencia en negrita Secuencia codificante de SYNPCC7942 1593

2a secuencia en negrita Secuencia codificante de SYNPCC7942 1594

Secuencia en cursiva Marcador de seleccion de espectinomicina aadA (complemento

inverso)

SEC 1D N°: 17

plasmido pJB947

5

1a secuencia subrayada

Region de homologia cadena arriba para pAQ1

1a secuencia en cursiva

Promotor de aph//

1a secuencia en negrita

Secuencia codificante de PMT9312 0532 (admJ

1a secuencia en minusculas

Secuencia intergenica

10

2a secuencia en negrita PMT9312 0533 (aarJ

2a secuencia en cursiva

Secuencia codificante de aadA; marcador de seleccion de espectinomicina

2a secuencia subrayada

Region de homologia cadena abajo para pAQ1

2a secuencia en minusculas

Cadena principal del vector

SEC 1D N°: 18

plasmido pJB825t

5

1a secuencia subrayada

Region de homologia cadena arriba para sitio de integracion cromosomica TS1

1a secuencia en cursiva

Promotor de c/ con secuencia de union al ribosoma rbcL de JCC138

1a secuencia en negrita

Secuencia codificante de tll1313 (admJ

1a secuencia en minusculas

Secuencia intergenica nativa

10

2a secuencia en negrita 2a secuencia en cursiva Secuencia codificante de tll1312 (aarJ Secuencia codificante de kanHTK; marcador de seleccion de kanamicina termoestable

2a secuencia subrayada

Region de homologia cadena abajo para sitio de integracion cromosomica TS1

2a secuencia en minusculas

Cadena principal del vector

SEC 1D N°: 19 Promotor de c/ usado para la transcripcion en pJB886. Los sitios Not/ y Nde/ terminales usados para los cambios de promotor estan en mayusculas.

SEC 1D N°: 20 10 Promotor de cpcB usado para la transcripcion en pJB887.

SEC 1D N°: 21 Promotor de /ac/-/rc usado para la transcripcion en pJB889. Los sitios Not/ y Nde/ terminales usados para cambios de promotor estan en mayusculas.

SEC 1D N°: 22

10 Promotor de EM7 usado para la transcripcion en pJB888. Los sitios Notl y Ndel usados para cambios de promotor estan en mayusculas.

15 SEC 1D N°: 23

Secuencia de ADN de pJB1279.

1a secuencia subrayada Region de homologia cadena arriba para SYNPCC7002 A0358

1a secuencia en cursiva Promotor de P(nir07); este promotor es una construccion sintetica basada en el

promotor de nirA de Synechococcus sp. PCC 7942. (Shin-lchi Maeda et al. (1998)

J. Bacteriol., 180: 4080-4088. 2a secuencia en cursiva Secuencia codificante de aadA; marcador de seleccion de espectinomicina 2a secuencia subrayada Region de homologia cadena abajo para SYNPCC7002 A0358 Secuencia en minusculas Cadena principal del vector de E. co/i (pUC ori, kanJ

SEC 1D N°: 24 Promotor de P(nir07); este promotor es una construccion sintetica basada en el promotor de nirA de Synechococcus sp. PCC 7942. (Shin-lchi Maeda et al. (1998). cis-Acting Sequences Required for NtcB-Dependent, Nitrite-Responsive Positive Regulation of the Nitrate Assimilation Operon in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7942. J. Bacteriol. 180: 4080-4088

SEC 1D N°: 25

Secuencia de ADN de operon sintetico que codifica los genes adm y aar de Cyanothece sp. ATCC 51142 1a secuencia subrayada Sitio de EcoR1 usado para subclonar el operon en pJB286alk p Secuencia en cursiva Secuencia UTR 3� que contiene secuencia de union al ribosoma 1a secuencia en negrita Secuencia codificante de cce 0778 (admJ Secuencia en minusculas Secuencia intergenica 2a secuencia en negrita Secuencia codificante de cce 1430 (aarJ 2a secuencia subrayada Sitio EcoR1 usado para subclonar el operon en pJB286alk p SEC 1D N°: 26 Cyanothece sp. ATCC 51142; secuencia codificante de nucleotidos optimizada de aar SEC 1D N°: 27 Cyanothece sp. ATCC 51142; secuencia de aminoacidos de AAR

SEC 1D N°: 28 Cyanothece sp. ATCC 51142; secuencia codificante de nucleotidos optimizada de adm

SEC 1D N°: 29 Cyanothece sp. ATCC 51142; secuencia de aminoacidos de ADM SEC 1D N°: 30 Secuencia codificante de cce 1430 de Cyanothece sp. ATCC 51142 (aarJ

SEC 1D N°: 31 Secuencia codificante de cce 0778 de Cyanthece sp. ATCC 51142 (admJ

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para producir hidrocarburos, que comprende:

   (i)

   cultivar una cianobacteria genomanipulada en un medio de cultivo, donde dicha bacteria genomanipulada comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante; y

   (ii)

   exponer dicha cianobacteria genomanipulada a la luz y al dioxido de carbono, donde dicha exposicion da como resultado la conversion de dicho dioxido de carbono mediante dicha cianobacteria genomanipulada en n-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos de 0,1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, donde al menos una de dichas enzimas recombinantes es heterologa con respecto a dicha cianobacteria genomanipulada.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, donde dicha cianobacteria genomanipulada produce ademas al menos un n-alqueno o n-alcanol.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicacion 3, donde dicha cianobacteria genomanipulada produce al menos un nalqueno o n-alcanol seleccionado entre el grupo que consiste en n-pentadeceno, n-heptadeceno, y 1-octadecanol.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicacion 3, donde dichos n-alcanos comprenden de forma predominante nheptadecano, n-pentadecano o una de sus combinaciones.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicacion 3, que comprende ademas aislar al menos un n-alcano, n-alqueno o nalcanol a partir de dicha cianobacteria genomanipulada o dicho medio de cultivo.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, donde dichas enzimas estan codificadas por un plasmido.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicacion 1 donde dichas enzimas estan codificadas por genes recombinantes incorporados en el genoma de dicha cianobacteria genomanipulada.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicacion 1 donde dichas enzimas estan codificadas por genes que estan presentes en multiples copias en dicha cianobacteria genomanipulada.

10. 10.

    El procedimiento de la reivindicacion 1 donde dichas enzimas estan codificadas por genes que son parte de un operon, y donde la expresion de dichos genes esta controlada por un unico promotor.

11. 11.

    Una cianobacteria genomanipulada, donde dicha bacteria genomanipulada comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante; y donde dicha cianobacteria, cuando se cultiva en presencia de luz y dioxido de carbono, produce n-alcanos, donde al menos uno de dichos n-alcanos se selecciona entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, nhexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos un 0,1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en condiciones identicas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa y alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes.

12. 12.

    La cianobacteria genomanipulada de la reivindicacion 11, donde dichas enzimas estan codificadas por genes que estan presentes en multiples copias en dicha cianobacteria genomanipulada; preferentemente donde dichas enzimas estan codificadas por un plasmido.

13. 13.

    La cianobacteria genomanipulada de la reivindicacion 11 o 12, donde dichas enzimas estan codificadas por genes que son parte de un operon, y donde la expresion de dichos genes esta controlada por un unico promotor.

14. 14.

    La cianobacteria genomanipulada de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la expresion de las enzimas acil-ACP reductasa o alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes en dicha cianobacteria genomanipulada esta controlada por un promotor seleccionado entre el grupo que consiste en un promotor cl, un promotor cpcB, un promotor lacl-trc, un promotor EM7, y un promotor aph11.

15. 15.

    La cianobacteria genomanipulada de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde dicha cianobacteria genomanipulada es un termofilo.

16. 16.

    Uso de una bacteria genomanipulada que comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante para producir n-alcanos cultivando dicha cianobacteria genomanipulada en presencia de luz y dioxido de carbono, donde al menos dichos n-alcanos se seleccionan entre el grupo que consiste en n-tridecano, n-tetradecano, n-pentadecano, n-hexadecano, y n-heptadecano, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos un 0,1% del peso de celulas secas y al menos dos veces la cantidad producida por una cianobacteria identica en todo lo demas, cultivada en identicas condiciones, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa y alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes.

17. 17.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 6, SEC 1D N°: 10, o SEC 1D N°: 27, o donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 8; SEC 1D N°: 12 o SEC 1D N°: 29.

18. 18.

    La cianobacteria genomanipulada de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 6, SEC 1D N°: 10, o SEC 1D N°: 27, o donde la secuencia de aminoacidos de dicha enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa es al menos un 95% identica a la SEC 1D N°: 8, SEC 1D N°: 12 o SEC 1D N°: 29.

19. 19.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las secuencias de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa y dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa son al menos un 95% identicas a (i) la SEC 1D N°: 6 y la SEC 1D N°: 8, respectivamente; (ii) la SEC 1D N°: 10 y la SEC 1D N°: 12, respectivamente, o (iii) la SEC 1D N°: 27 y la SEC 1D N°: 29, respectivamente.

20. 20.

    La cianobacteria genomanipulada de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, donde las secuencias de aminoacidos de dicha enzima acil-ACP reductasa y dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa son al menos un 95% identica a (i) la SEC 1D N°: 6 y la SEC 1D N°. 8, respectivamente; (ii) la SEC 1D N°: 10 y la SEC 1D N°: 12; o (iii) la SEC 1D N°: 27 y la SEC 1D N°: 29, respectivamente.

    .