ES2398194T3

ES2398194T3 - Matrices de micropartículas y procedimientos de preparación de las mismas

Info

Publication number: ES2398194T3
Application number: ES02798611T
Authority: ES
Inventors: Michael Seul; Chiu Wo Chau; Hui Huang; Sukanta Banerjee; Ye Hong; Jiacheng Yang
Original assignee: Bioarray Solutions Ltd
Current assignee: Bioarray Solutions Ltd
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2013-03-14
Anticipated expiration: 2022-12-27
Also published as: US20170260577A1; EP1488236A2; KR20040081103A; EP1488236A4; CN1299117C; CA2471693C; JP2005535868A; US20190024156A1; AU2002364034B2; US9611507B2; US20030082587A1; ES2649962T3; HK1074881A1; AU2002364034A1; US20110098201A1; EP2319617A1; WO2003058199A2; CN1656380A; CA2471693A1; WO2003058199A3

Abstract

Un procedimiento para producir biochips que comprende: modelar un sustrato de oblea para formar una pluralidad de regiones de biochip; trazar dicho sustrato de oblea según regiones delineadas de biochip; ensamblar matrices de perlas que comprenden diferentes perlas ópticamente codificadas que tienenbiomoléculas unidas a las mismas, siendo dichas biomoléculas identificadas por dicha codificación óptica, en el quedicho ensamblaje se produce sobre una superficie del sustrato de oblea en dicha pluralidad de regiones de biochip; y singular la oblea para formar una pluralidad de biochips idénticamente funcionalizados.

Description

Matrices de micropartículas y procedimientos de preparación de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a matrices de alta densidad unitaria de micropartículas y procedimientos depreparación de las mismas. La presente invención también se refiere a matrices de múltiples chips y sus procedimientos de fabricación. La presente invención proporciona además procedimientos para realizar bioensayos usando matrices dealta densidad unitaria y matrices de múltiples chips.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un formato de matriz para análisis biológicos y químicos sostiene la promesa de proporcionar rápidamenteresultados precisos, mientras que se minimiza el trabajo [Nature Genetics, 1999 vol. 21 (1) suplemento pág. 3-4]. Normalmente, las matrices de sondas biológicas tales como ADN, ARN o moléculas de proteína se forman tanto por deposición e inmovilización como por síntesis in situ sobre sustratos inertes. En estos procedimientos de la técnicaanterior, la formación de matrices se realiza normalmente uniendo moléculas de sondas directamente a un sustrato, quepuede estar compuesto por materiales orgánicos (tales como materiales poliméricos como nitrocelulosa) o materialesinorgánicos (tales como vidrio o silicio).

El uso de silicio como sustrato proporciona ciertas ventajas relacionadas con los procedimientos bien establecidos de procesamiento de obleas de semiconductores y chips. En el procesamiento de semiconductores, lasobleas se modifican y transforman en una serie de múltiples etapas de procesamiento para crear rasgos deseables. Normalmente, se hace una pluralidad de rasgos idénticos sobre cada oblea simultáneamente por procesamiento enparalelo para formar segmentos individuales sobre una oblea. Se consiguen espectaculares ahorros en el tiempo defabricación fabricando rasgos idénticos usando procesamiento en paralelo o por lotes. Además, el procesamiento por lotes da alta uniformidad de chips y usando ciertos procedimientos de fotolitografía y grabado pueden fabricarse con mucha precisión rasgos muy pequeños (submicrómetros). Por consiguiente, pueden fabricarse estructuras con altas densidades de rasgos sobre un chip muy pequeño. Después de completarse el procesamiento, los segmentos individuales se cortan de obleas en un procedimiento conocido como singulación, para obtener una multiplicidad de chips [Peter Van Zant, “Microchip Fabrication”, 3ª edición, McGraw-Hill 1998].

Las obleas de semiconductores que contienen diferentes chips funcionales pueden combinarse tanto en procedimientos de empaquetamiento finales interconectando diferentes chips o simplemente uniendo dos obleas condiferentes chips funcionales, partiendo luego la pila de obleas. La alta eficiencia del procedimiento de fabricación de semiconductores ha contribuido significativamente al rápido crecimiento de la industria. Se han desarrollado sistemasaltamente sofisticados para la producción, empaquetamiento y control de la calidad de chips.

Los biochips son matrices de diferentes biomoléculas (“sondas”) que pueden unirse a dianas específicas que están unidas a un soporte sólido. Ha habido esencialmente dos procedimientos para preparar biochips.

El primer procedimiento implica disponer alícuotas de disoluciones que contienen moléculas de sondas presintetizadas de interés sobre un sustrato plano, seguido de inmovilizar las moléculas de sondas en posiciones designadas. Por ejemplo, las disoluciones de sonda pueden dispensarse (“aplicarse en puntos”) sobre un sustrato paraformar matrices de sonda posicionalmente codificadas unidimensionales [Kricka, Larry J., “Immunoassay”, Capítulo 18, páginas 389-404, Academic Press, 1996] o bidimensionales [patente de EE.UU. nº 5.807.755 y 5.837.551] de composición personalizada. Las sondas moleculares pueden unirse directamente a una superficie de sustrato o puedenunirse a soportes de fase sólida, que a su vez se depositan sobre o se unen a un sustrato para formar una matriz. Las micropartículas (“perlas”) representan un tipo de tal soporte. Las perlas ofrecen la ventaja de separar el procedimientode preparación y prueba de sustratos del procedimiento de preparación, aplicación y prueba de químicas de sondas y de ensayo [patente de EE.UU. nº 6.251.691]. Las perlas de diversos tamaños y composiciones se han usado extensivamente en análisis químico y bioquímico, además de en síntesis combinatoria.

Los procedimientos de deposición, impresión y aplicación por puntos para la producción de matrices de sondas tienen varias características no deseables. Primero, incluso las tecnologías de deposición e impresión del estado de latécnica sólo producen matrices de baja densidad de rasgos, reflejando dimensiones de puntos típicas de 100micrómetros y separaciones punto a punto de 300 micrómetros. Segundo, los procedimientos de deposición de sondasdescritos hasta la fecha han fracasado en producir puntos uniformes, con variaciones punto a punto significativas.Tercero, los procedimientos de aplicación por puntos, que incluyen variantes tales como deposición electroforética aelectrodos con patrón [patente de Estados Unidos nº 5.605.662] requieren soporte instrumental y logístico sustancialpara implementar la producción de matrices a cualquier escala significativa. En particular, los procedimientos deaplicación por puntos no soportan la fabricación por lotes de matrices de sondas. Es decir, aunque puede usarse unformato de procesamiento por lotes para producir eficientemente sustratos, la posterior etapa de “bio-funcionalizar” estos sustratos aplicando sondas químicas o bioquímicas es ineficaz debido a que no se ajusta a un formato por lotes, sino que en su lugar requiere muchas etapas de aplicación por puntos individuales. Por tanto, este procedimiento de fabricar grandes números de chips funcionalizados idénticos requiere mucho más tiempo y es más caro que un procedimiento que usa procedimientos de procesamiento en paralelo.

El segundo procedimiento de preparación de matrices de sondas implica síntesis fotoquímica in situ de moléculas de sondas lineales tales como oligonucleótidos y péptidos usando un procedimiento similar a fotolitografía, uncomponente convencional del procesamiento de semiconductores. Estos procedimientos se han usado más ampliamente en los últimos años para sintetizar, en un conjunto paralelo de reacciones fotoquímicas de múltiples etapas, conjuntos de oligonucleótidos en secciones de vidrio designadas de vidrio o sustratos similares [patente de Estados Unidos nº 5.143.854; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 13555-13560]. El documento WO 01 98 765 describe el ensamblaje de biochips usando LEAPS.

Aunque el procesamiento en paralelo para generar simultáneamente una multitud de matrices de sondasdirectamente sobre una oblea tiene la ventaja de la escalabilidad y mejora intrínseca en la uniformidad proporcionadapor el procesamiento en lotes, existen graves inconvenientes para la fabricación de matrices de sondas. Primero, sólomoléculas lineales simples relativamente cortas son sintetizadas adecuadamente en una serie de reacciones de unaúnica etapa y, en la práctica, sólo las matrices de oligonucleótidos cortos han sido preparadas por este procedimiento. Segundo, las reacciones frecuentemente no avanzan hasta completitud, conduciendo a heterogeneidad composicionalsignificativa. Tercero, todo el procesamiento de semiconductores debe completarse antes de la introducción de biomoléculas, debido a que las biomoléculas pueden no ser compatibles con los duros entornos en ciertas etapas deprocesamiento de semiconductores. Esta limitación puede excluir que se tome la ventaja completa de la amplia variedadde técnicas de fabricación de semiconductores. Cuarto, si la funcionalización se realiza en un formato de fabricación porlotes, ese procedimiento de fabricación define la composición química o bioquímica (“contenido”) de cada chip sobre la oblea. Es decir, introducir un cambio en el diseño de sondas requiere que el procedimiento de fabricación entero secambie consecuentemente. La personalización, mientras que sea teóricamente factible, requiere un cambio en la secuencia de etapas de enmascarado necesarias requeridas para la síntesis fotoquímica de un conjunto deseado demoléculas de sonda. El coste y los retrasos de tiempo asociados a este procedimiento hacen que la personalización sea poco factible en la práctica.

El documento WO 01/098765 A1 enseña proporcionar diferentes conjuntos de perlas sobre un sustrato deoblea y, por tanto, conduce a biochips que están funcionalizados de forma diferente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las FIGS. 1a y 1b son una ilustración del procedimiento de la invención.

La FIG. 2 muestra un ejemplo de un chip que comprende una matriz de perlas. El chip comprende tres capas(L1, L2, L3). L1 es un sustrato de silicio con una matriz microproducida para acomodar perlas (A1); L2, SiO2 con patrón (100 nm de espesor); L3, es una capa de Si3N4 (5-10 nm de espesor).

La FIG. 3 muestra un ejemplo de diseño de oblea.

La FIG. 4 muestra un ejemplo del diseño de chips que comprenden matrices de perlas. El sustrato es silicio (Si). El patrón de estrella de 12 puntos está sobre una capa de 100 nm de espesor de SiO2. El área dentro de la estrella no tiene cubierta de SiO2, mientras que el área fuera de la estrella tiene una cubierta de SiO2. En el centro hay una matriz de cavidades hexagonales estrechamente compactas. El número total de cavidades es 4012.

La Fig. 5 proporciona ejemplos de estructuras superficiales que pueden usarse para asegurar perlas. H1 es unorificio de retención de una única perla con paredes laterales rectas. H2 es una cavidad piramidal que puede acomodar una perla. H3 es el grupo de postes que confinan una perla. Hx es una cavidad que puede contener una pluralidad deperlas.

La Fig. 6 muestra ejemplos de estructuras de matriz. A1 y A2 son matrices de cavidades rectangulares. A3 es una matriz de cavidades hexagonales.

La Fig. 7 muestra un ejemplo de agrupamiento de chips.

La Fig. 8 ilustra el procedimiento del empaquetamiento de chips. A, B, C, D son chips con diferente funcionalización. Las obleas pueden separarse en chips rompiendo la oblea según las líneas de trazado. Chips individuales con diferentes grupos funcionales que se separaron de diferentes obleas pueden colocarse juntos. Unempaquetamiento de 4 chips consiste en cuatro chips funcionalizados distintos unidos el uno a continuación del otropara aplicación biológica. Los cuatro chips pueden disponerse en una variedad de formas, incluyendo ejemplos nolimitantes formatos cuadrados o lineales.

La Fig. 9 ilustra un procedimiento de ensamblaje de chips moviendo chips libres en filas y columnas.

La Fig. 10 muestra un ejemplo de un diseño de chip que pone una matriz de sondas sobre una esquina decada chip. Combinando cuatro de tales chips en la forma mostrada en el dibujo puede formarse una matriz mayor.

La Fig. 11 ilustra el procedimiento de fabricación para los chips que comprenden matrices de perlas de la invención.

La Fig. 12 es una fotografía de hidrogel formado sobre oblea de silicio.

La Fig. 13a es una ilustración de las imágenes fluorescentes de una matriz de perlas sobre un chip antes de laformación de hidrogel y después de la separación del gel. El número de perlas y posiciones de perlas fueron idénticos. La Fig. 13b es una ilustración de resultados de reacción sobre chip con tratamiento con hidrogel y sin tratamiento conhidrogel.

La Fig. 14 es una ilustración de un soporte de chips móvil y su aplicación conjuntamente con cámaras dereacción.

La Fig. 15 ilustra un ejemplo de una matriz codificada al azar; (b) biblioteca de chips (c) ensamblaje al azar dechips de la biblioteca de chips, (d) embaldosado al azar de matriz

La Fig. 16 es una ilustración del diseño de matrices para el ensamblaje simultáneo o ensamblaje secuencial degrupos de perlas con distintos tamaños.

La Fig. 17 es una ilustración del diseño de soportes de múltiples chips.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención sólo está limitada por sus reivindicaciones.

La presente invención proporciona un procedimiento de procesamiento en paralelo que aprovecha de procedimientos de fabricación de semiconductores. Además, los procedimientos en la presente invención son suficientemente flexibles para tratar requisitos de cantidad diferente y ensayo diferente. La invención combina la flexibilidad de poder seleccionar el contenido de matrices con la densidad de alto rasgo y economías de escala proporcionadas por el ensamblaje de matrices (por lotes) en paralelo. La presente invención proporciona un procedimiento para el ensamblaje de matrices de sondas codificadas al azar presentes en soporte sólido decomposición seleccionable en posiciones designadas dentro de compartimentos delineados sobre un sustrato quepuede luego fraccionarse en una pluralidad de chips que tienen matrices de sondas presentes en soporte. En otra realización, chips singulados (sin sondas presentes en soporte sólido) derivados de uno o más sustratos se ponen encontacto con una población deseada de sondas presentes en soporte sólido para formar chips que tienen la matriz deseada. La formación de matrices de múltiples chips también se proporciona combinando chips preparados a partir dediferentes sustratos que tienen diferentes poblaciones de sondas presentes en soporte. La invención también describe diseños de sustratos y chips presentes en soportes de fase sólida tales como micropartículas químicamente etiquetadas de forma que se optimice el rendimiento de las matrices de micropartículas presentes en el chip en pruebas y ensayos bioanalíticos para diversos analitos diana que incluyen biomoléculas tales como ácidos nucleicos, proteínas, células y similares.

El procedimiento para producir biochips según la presente invención comprende modelar un sustrato de obleapara formar una pluralidad de regiones de biochip; trazar dicho sustrato de oblea según regiones de biochip delineadas; ensamblar matrices de perlas que comprenden diferentes perlas ópticamente codificadas que tienen biomoléculasunidas a las mismas, estando dichas biomoléculas identificadas por dicha codificación óptica, en el que dicho ensamblaje se produce sobre una superficie del sustrato de oblea en dicha pluralidad de regiones de biochip; y singularla oblea para formar una pluralidad de biochips idénticamente funcionalizados. Como se trata anteriormente, lasingulación puede llevarse a cabo antes de ensamblar una matriz de perlas sobre una superficie de chip. (En este contexto, el término “biochip,” como se usa en el presente documento, se refiere a un chip que tiene biomoléculasunidas a su superficie, por ejemplo, para su uso en bioanálisis). Ejemplos no limitantes de biomoléculas incluyenoligonucleótidos, fragmentos de ácido nucleico, proteínas, oligopéptidos, ligandos, receptores, antígenos, anticuerpos y miembros individuales de pares de unión biológica. Además, el término “singular” o “singulación” como se usa en elpresente documento se refiere a un procedimiento para obtener chips rompiendo las conexiones entre regiones de chipindividuales sobre un sustrato o una subunidad de un sustrato que contiene más de un chip. Por tanto, los términos “funcionalización” y “biofuncionalización” como se usa en el presente documento se refieren a un procedimiento para unir biomoléculas (por ejemplo, sondas moleculares) a un sustrato, que incluye unir a la superficie de perlas.

La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de un dispositivo de ensayo que comprende una pluralidad de sondas moleculares. El procedimiento comprende elegir una sonda molecular de una biblioteca de sondas y fijarla a una pluralidad de perlas para formar una subpoblación de perlas. La subpoblación deperlas está fijada a una gran superficie de un sustrato que comprende chips que poseen una etiqueta descodificable queidentifica la oblea de origen. Entonces, la oblea es singulada para producir una pluralidad de biochips. El procedimientose repite con al menos otra subpoblación de perlas que comprende una sonda molecular diferente. Entonces, los biochips resultantes se ensamblan para formar una biomatriz.

Otro aspecto de la presente invención son los dispositivos de ensayo preparados según el procedimientodescrito anteriormente.

Los dispositivos de la presente invención incluyen sustratos que han sido divididos para definir regiones de chip separables. Tales sustratos pueden comprender opcionalmente modelar y dividir adicionalmente para definir subregiones para contener uno o más soportes sólidos, por ejemplo, perlas.

En otra realización, la presente invención comprende los sustratos divididos y opcionalmente modelados que comprenden además una o más poblaciones de sondas de soporte sólido para detectar un analito diana.

Los chips singulados formados por el fraccionamiento de obleas descritas anteriormente, con o sin las matricesde sondas de soporte sólido, también es una realización de la presente invención. Preferentemente, los chips comprenden una matriz de sonda de soporte sólido.

La presente invención también incluye dispositivos de ensayo para detectar uno o más analitos diana. Tales dispositivos de ensayo de la presente invención comprenden uno o más biochips que comprenden una matriz de perlasfuncionalizadas adecuada para detectar uno o más analitos diana deseados. En una realización preferida, una pluralidad de biochips diferente está fijada a un soporte para proporcionar la capacidad para detectar diferentes analitos diana.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para realizar bioensayos que comprende poner en contacto una pluralidad de biochips unidos a un soporte con una disolución que comprende al menos un analito diana, y detectar el analito directamente o indirectamente. La pluralidad de biochips puede comprender al menos una subpoblación de biochips con una matriz biofuncionalizada. Opcionalmente, la pluralidad de biochips puede comprender al menos dos subpoblaciones de biochips en las que los biochips de las diferentes subpoblaciones tienen tamaños diferentes o geometrías de matrices de perlas diferentes.

Todavía otro aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de realización de un ensayousando los dispositivos de ensayo descritos anteriormente. El procedimiento comprende exponer una matriz de biochipsdel dispositivo de ensayo a una disolución que contiene al menos un analito diana y detectar los productos de reacción.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para fabricar un soporte para biochips

que comprende cubrir un sustrato sólido que tiene al menos una gran superficie hidrófila con una capa hidrófobamodelada que se usa para definir espacialmente una matriz de biochips.

La presente invención también proporciona un procedimiento de ensamblaje de matrices de perlas sobre unasuperficie de un sustrato de semiconductor que comprende disponer una película dieléctrica modelada sobre una superficie del sustrato de semiconductor, en el que la película dieléctrica forma límites sobre la superficie del sustrato, y añadir perlas en una disolución a una región del sustrato designado para matrices de perlas, en el que la región sedefine por los límites.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para depositar directamente perlassobre una superficie de un sustrato de semiconductor para formar una matriz de perlas, comprendiendo dicho procedimiento añadir una disolución de perlas a la superficie de un sustrato de semiconductor modelado que contieneestructuras para alojar las perlas y agitar mecánicamente la disolución para inducir a que las perlas se sedimenten en las estructuras.

Todavía otro aspecto de la presente invención es proporcionar una matriz de perlas que comprende unrecubrimiento movible para proteger la matriz de perlas sobre un biochip. En este aspecto, la matriz de perlascomprende una pluralidad de perlas con superficies a las que las sondas moleculares están unidas, y el recubrimientotiene la propiedad de no ser reactivo hacia las sondas moleculares sobre las superficies de las perlas.

La presente invención también proporciona un procedimiento para el control de calidad durante la fabricaciónde un biochip. Este procedimiento comprende codificar ópticamente perlas bio-funcionalizadas, exponer un sustratomodelado que contiene cavidades para alojar perlas a una disolución que contiene las perlas, y obtener ópticamenteimágenes de las perlas para garantizar que las cavidades están sustancialmente ocupadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para diseñar y producir matrices decomposición y disposición deseadas que comprenden entidades químicas o biológicas tales como biomoléculas como ácidos nucleicos y proteínas. Específicamente, los procedimientos de la invención descritos en el presente documentocombinan la flexibilidad de la selección en tiempo real del contenido de matrices y alta densidad de rasgos con las economías de escala proporcionadas por un procedimiento en paralelo para el ensamblaje de una multiplicidad dematrices de sondas codificadas al azar presentadas en soporte sólido de composición seleccionable, en posiciones designadas de compartimentos de oblea delineados (“chips”). La invención también incluye procedimientos para laformación de matrices posicionalmente y composicionalmente codificadas de tales chips. Además, la invención proporciona diseños de obleas y chips que optimizan el rendimiento de soportes de fase sólida tales como micropartículas etiquetadas (“perlas”) y chips etiquetados (“baldosas”) en pruebas y ensayos bioanalíticos que implican biomoléculas y células.

La presente invención proporciona procedimientos y procesos para preparar matrices de alta densidad unitariade micropartículas que están biológicamente o químicamente funcionalizadas. Tales matrices pueden producirse encantidades ajustables, en un formato flexible y con composiciones preseleccionadas. Los procedimientos y procesos dela invención pueden realizarse en un formato de lotes y paralelo. Específicamente, la invención se refiere a la fabricación de tales matrices de micropartículas sobre una o más obleas, de forma que una parte o la totalidad de una oblea específica presente una o más de tales matrices de micropartículas con una composición y funcionalidad quepuede ser preseleccionada. La invención también se refiere al envasado de la matriz resultante de micropartículas en un formato de múltiples chips.

La presente invención proporciona matrices con composiciones que dependen del uso final de la matriz. Pueden prepararse matrices que contienen de aproximadamente una perla a muchos millones. Generalmente, la matriz comprenderá de una a hasta un billón o más, dependiendo del tamaño de las perlas y el sustrato, además del uso final de la matriz. Intervalos preferidos para matriz de alta densidad de rasgos son de aproximadamente 1.000.000.000 (1 billón) a 1 perla/mm2, más preferentemente 1.000.000 a 100 perlas/mm2, lo más preferentemente 100.000 a 1.000 perlas/mm2.

Las micropartículas de la invención son funcionalizadas para incluir entidades químicas o biológicas talescomo, por ejemplo, ADN, ARN y proteínas. Estas entidades pueden seleccionarse dependiendo de la aplicación deinterés, proporcionándose así flexibilidad de selección del contenido de matrices. Además, como una matriz de micropartículas tal tiene una alta densidad de rasgos, puede diseñarse para optimizar el rendimiento de matrices en el ensayo bioanalítico de interés. Ejemplos de tales ensayos se desvelan en el documento PCT/US01/20179 y la patente de EE.UU. No. 6.251.691 que se incorporan todas en el presente documento por referencia.

Los procedimientos del procedimiento general de la presente invención pueden agruparse en cuatro categoríasgenerales, concretamente pre-ensamblaje, ensamblaje, post-ensamblaje y empaquetamiento. Tal agrupación no pretende limitar ciertos procedimientos a ciertos grupos. La Figura 1a y 1b son ilustraciones particulares del procedimiento de la invención como se ha descrito adicionalmente más adelante.

I. Pre-ensamblaje

Los procedimientos de pre-ensamblaje incluyen la implementación de disposición de chips, fabricación de laoblea basándose en tal disposición, opcionalmente trazado de la oblea, seguido de limpieza e inspección, si se requiere. Como se ilustra en la Fig. 1a y 1b, la singulación (como se describe más adelante) puede seguir a los procedimientos de ensamblaje (Fig. 1a) o seguir al procedimiento de fabricación de obleas (Fig. 1b). En el supuesto caso de que se obtengan chips individuales de una oblea, los chips resultantes se agrupan y cada chip puede etiquetarse como se describe más adelante para identificar tal chip basándose en su historia de funcionalización.

1.1 Disposición de chips

Un ejemplo de disposición de chips se muestra en la Figura 2. Debe entenderse que un “chip” puede tener cualquier forma tridimensional. Cada chip comprende un sustrato (por ejemplo, capa 1 (L1)) en el que perlas biofuncionalizadas pueden ensamblarse para formar una matriz de micropartículas. Pueden usarse muchos tipos demateriales como sustrato. Materiales adecuados tienen ciertas características deseables. Estas características pueden clasificarse como mecánicas (por ejemplo, resistencia), eléctricas (por ejemplo, que tienen una impedancia interfacial que puede modificarse), ópticas (por ejemplo, lisura, transparencia, un espectro de absorción óptica bien definido, autofluorescencia mínima, alta reflectividad) y químicas (por ejemplo, aceptadas por procedimientos para definir rasgos precisos o para depositar capas dieléctricas, reactividad superficial que permite enlaces covalentes). Ejemplos no limitantes de sustratos adecuados incluyen semiconductores (por ejemplo, silicio), aislantes (por ejemplo, zafiro, mica y rubí), materiales cerámicos y polímeros (por ejemplo, Mylar™, Kapton™ y Lucite™).

En ciertas realizaciones, el sustrato puede ser una oblea de semiconductor tal como obleas de semiconductores monocristalinas que se usan comúnmente en la industria de dispositivos semiconductores. En otras realizaciones, el sustrato puede ser cualquier sustrato sólido modelable seleccionado para ser inerte para los reactivos usados en la fabricación de chips y bioensayos. Ejemplos no limitantes de tales sustratos incluyen vidrio, plásticos ypolímeros.

La Figura 2 es una ilustración de un chip que tiene una sección transversal rectangular y no pretende limitar otras geometrías del chip. En la Figura 2, L1 se representa como una capa intermedia (aunque no se requieren capassobre ambas capas de L1). La matriz de la cavidad A1 de L1 es donde va a construirse la matriz de perlas. La forma delas cavidades A1 no necesita ser cuadrada. Ejemplos no limitantes de otras formas adecuadas incluyen triángulos, rectángulos, pentágonos, hexágonos y círculos. Una de las funciones de la matriz de cavidades A1 es para ayudar a disponer y asegurar las perlas construyendo estructuras regulares sobre la oblea o chips para confinar el movimiento deperlas sobre la superficie.

Opcionalmente, el chip también puede contener una segunda capa (L2). La capa L2 comprende una capa dedieléctrico aislante modelado (por ejemplo, dióxido de silicio). Un ejemplo de un posible patrón se facilita por la Figura 3, que muestra un patrón con forma de estrella en el centro del chip. El área fuertemente sombreada es el material dieléctrico y el área blanca es donde se quita el dieléctrico. El espesor de la capa de dieléctrico es normalmente, perono se limita a, 100 nm. Si se aplica un campo verticalmente a través del chip, se forma un potencial no uniforme próximo a la superficie del chip debido al patrón de L2. El campo eléctrico puede aplicarse a la superficie según el procedimientoexpuesto en la patente de EE.UU. nº 6.251.691 incorporada en el presente documento por referencia (un procedimientotal se denomina “LEAPS”). Usando LEAPS, perlas en una disolución líquida que se aplica a la superficie del sustrato se someten a un cambio en el gradiente de campo eléctrico lateral cuando se aplica un potencial de CA al sustrato. Estegradiente de campo eléctrico acciona las perlas en la disolución de manera que las perlas se acumularán en el área A1 en la que las estructuras superficiales han sido construidas sobre L1. Por consiguiente, el patrón de L2 puede sercualquier patrón que pueda producir la acumulación de perlas en un área particular del sustrato, aunque debe reconocerse que algunos patrones son más eficaces que otros en hacer que las perlas se acumulen.

El modelado de la capa de dieléctrico L2 según un diseño predeterminado facilita la modificación casipermanente de la impedancia eléctrica de la estructura de electrolito-aislante-semiconductor (EAS) formada por ladisolución de perla-dieléctrico-semiconductor. Modulando espacialmente la impedancia de EAS, el modelado de electrodos determina la corriente iónica en la proximidad del electrodo. Dependiendo de la frecuencia del campo eléctrico aplicado, las perlas tanto buscan, como evitan, regiones de alta corriente iónica. Por tanto, el modeladoespacial transmite el control externo explícito mediante la disposición y forma de las matrices de perlas.

Opcionalmente, un chip que comprende una matriz de perlas puede contener una capa de pasivación protectora que normalmente cubre la superficie. La capa L3 funciona como una interfaz entre el chip y el medio líquido, que puede incluir la suspensión de perlas, muestras de bioensayo o productos químicos de lavado de chips. Por consiguiente, la capa L3 debería ser relativamente robusta contra la corrosión de productos químicos y el entorno ambiente. También debería proteger las sondas funcionales unidas a las perlas del daño electrostático durante elensamblaje de matrices de perlas. En algunas realizaciones, la capa L3 también minimiza la adhesión de perlas a lasuperficie del chip durante el ensamblaje de matrices de perlas. La capa L3 es preferentemente inerte a muestrasbiológicas y es preferentemente no fluorescente en el mismo intervalo de longitud de onda que se usa para la detecciónfluorescente en bioensayos. Además, su existencia no debe crear un cambio en la distribución del campo eléctrico próxima a la superficie del chip que evitara el uso de LEAPS para el ensamblaje de perlas. A modo de ejemplo, la capa L3 puede ser una capa delgada de nitruro de silicio LPCVD (depositado por vapor químico a baja presión) con unespesor de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 Å.

La capa L3 también puede manipularse por tratamientos químicos para alterar las propiedades superficiales. Por ejemplo, una superficie de nitruro de silicio podría oxidarse para dar SiOx (es decir, SiO2 y/u óxido de silicio subestequiométrico) u oxinitruro de silicio (SiOxNy), siendo ambos hidrófilos y facilitaría la dispensión de muestras acuosas. En otras realizaciones, el SiOx o SiOxNy superficial puede funcionalizarse adicionalmente con grupos silanol para dar una superficie hidrófoba.

Finalmente, la cara trasera de cada chip puede recubrirse con un metal o aleación metálica para el contactoeléctrico (preferentemente un contacto óhmico). Por ejemplo, si el chip está hecho de un sustrato de silicio, la cara trasera del chip puede recubrirse con una delgada capa de adhesión de cromo y una capa de oro más gruesa usando procedimientos rutinarios en la industria de los semiconductores. Aunque el recubrimiento de oro es útil debido a que es inerte a la mayoría de los productos químicos y tiene alta conductividad, pueden usarse otros recubrimientos decontacto óhmico si son químicamente compatibles con los otros procedimientos de fabricación. Ejemplos no limitantes incluyen nitruro de titanio/tungsteno y titanio tungsteno/tungsteno. Los chips pueden recubrirse con un metal o aleación metálica antes o después de la singulación.

Opcionalmente, una cara de un chip y/o su cara opuesta paralela puede recubrirse con un material magnéticamente sensible. Esto puede lograrse ensamblando perlas magnéticas sobre cualquiera o ambas caras de las perlas magnéticas del chip usando procedimientos de ensamblaje rutinarios. Pueden usarse procedimientos expuestos en el documento de EE.UU. nº de serie 10/032.657 presentado el 28 de diciembre de 2001, y se incorporan en elpresente documento por referencia. El material magnéticamente sensible también puede funcionalizarse antes del ensamblaje para proporcionar funcionalidad química y biológica adicional. Alternativamente, todas las caras de un chippueden codificarse adsorbiendo al azar perlas sobre el soporte de chips usando procedimientos conocidos en la técnica. La configuración de la matriz proporciona una etiqueta miniaturizada que identifica el chip (“ID de chip”), además de laoblea de origen (“ID de oblea”). Cada ID de chip se saca del número, S, de configuraciones distinguibles de una matrizcodificada al azar de L posiciones, dado por el número de formas en las que n muestras (sin ordenar) de r (k) partículas (indistinguibles), 1 � k � n, pueden distribuirse entre L posiciones:

La ilustración del gran número de combinaciones posibles es el hecho de que una matriz de L=16 posiciones,compuesta por n=4 tipos de perlas distinguibles, cada tipo representado cuatro veces (r(1) = ... r(4) = 4) puede mostrarS(16; 4; r(k) = 4; 1�k�4) = 16! /[(4!)(4!)(4!)(4!)], o aproximadamente 63 millones de configuraciones distinguibles.

En el uso de matrices codificadas al azar para producir varias etiquetas T, en las que T <<S, para muchasaplicaciones de interés práctico, un gran espacio de configuración de tamaño S se muestrea para reducir la probabilidadde duplicación. Una ventaja particular de construir etiquetas usando matrices de perlas codificadas al azar es el hechode que, mediante los procedimientos de la presente invención, se producen fácilmente, económicamente, en formato miniaturizado y en grandes números en una única etapa de procedimiento. Los códigos de ID de chip en forma dematrices de perlas codificadas al azar son fácilmente construidos para compartir subcampos o subcódigos comunes que pueden usarse para determinar si dos o más chips se originaron o no a partir de la misma oblea. Por ejemplo, si un totalde n tipos de perlas se usan para producir ID de chip para chips sobre N obleas, p tipos pueden reservarse, seleccionándose p < n y p tal que 2p > N. Entonces se construyen los subcódigos específicos para oblea que sólocontienen los n-p tipos de perlas restantes. Por ejemplo, dados n=16 tipos de perlas para la construcción de ID de chip que contienen un subcódigo que identifica cada chip que se ha originado en una de N=100 obleas, p=7 tipos de perlaspueden reservarse para la construcción de un código binario de 7 dígitos para identificar cada una de las 100 obleas porla ausencia de hasta siete de los tipos de perlas reservados. Por ejemplo, una de las obleas en el conjunto carecerá de los 7 tipos reservados, otros 7 carecerán de uno de los tipos reservados. Las perlas codificantes están funcionalizadas y llevan moléculas de sondas sobre su superficie. Las partículas magnéticas codificantes también pueden magnetizarse y pueden presentar funcionalidad química y biológica.

Un ejemplo de un chip fabricado se muestra en la Figura 4. El sustrato es una oblea de Si(100) dopada confósforo de tipo n con una resistividad de 1,5-4 ohm-cm. El chip es un cuadrado con 1,75 mm de lado y un espesor de 0,5 mm. La capa L2 tiene 1000 Å de dióxido de silicio térmicamente crecido con un orificio de estrella de 12 puntas en el centro. Las dimensiones de la estrella son como se indican en la Figura 4. En el centro del chip hay una matriz de cavidades hexagonales estrechamente compactas que comprenden 68 filas y 59 columnas. Las dimensiones de las cavidades hexagonales son como se indican en la Figura 4. La capa L3 es una capa de 60 Å de espesor de nitruro de silicio LPCVD que cubre el chip entero, excepto las paredes laterales y fondos de las cavidades hexagonales, en las quesolo hay silicio desnudo con óxido de silicio nativo.

Las Figuras 5a y 5b ilustran ejemplos no limitantes de otras estructuras adecuadas para confinar el movimiento de perlas. El O1 es una cavidad que retiene una única perla o cavidad con paredes laterales rectas. El O2 es una cavidad piramidal inversa que puede acomodar una perla. El O3 es el grupo de postes que confinan una perla. El Ox es una cavidad que puede contener una pluralidad de perlas. El dibujo superior (Fig. 5a) muestra una vista en planta de lasestructuras, mientras que el dibujo inferior (Fig. 5b) muestra una vista en sección transversal. En una realización puedeusarse un compartimento de paredes laterales rectas O1 que sólo acomoda una perla. Esta estructura es útil para confinar perlas en un medio líquido. El área sombreada en la Figura 5 es material de sustrato y el área blanca es espacio vacío. La forma del compartimento no se limita a un cuadrado; por ejemplo, una cavidad piramidal O2 puede usarse como compartimento para contener una única perla. Además, aunque los fondos de las cavidades son preferentemente planos, necesitan serlo en ciertas realizaciones.

La Fig. 6 muestra ejemplos de estructuras de matriz. A1 y A2 son matrices de cavidades rectangulares. A3 es una matriz de cavidades hexagonales. Puede fabricarse una multitud de estructuras sobre un chip u oblea para formar una matriz o una pluralidad de matrices sobre la superficie del chip u oblea. Las estructuras pueden ser todas de tiposidénticos o diferentes de estructuras y/o pueden coexistir estructuras de diferente tamaño. En la Fig. 6 se ilustran tres realizaciones ilustrativas. En los dibujos, las áreas sombreadas son las cavidades. Las áreas no sombreadas son la superficie original del sustrato (que pueden cubrirse con una delgada película). La disposición A1 es una matriz cartesiana regular de cavidades cuadradas. La disposición A2 es una matriz en damero alternante de cavidades cuadradas. La disposición A3 es una matriz de cavidades hexagonales. Aunque las matrices de la presente invenciónno se limitan a matrices regulares, matrices regulares son convenientes para interpretar los resultados de reacción.

Por supuesto, la localización de la matriz sobre un chip no se limita al centro. Por ejemplo, la matriz puede situarse sobre una esquina tal como aquellas mostradas en la Figura 10. Además, puede haber más de una matriz sobre un chip. Por ejemplo, pueden fabricarse cuatro matrices sobre un único chip como se muestra en la Figura 10. En algunas realizaciones, grupos de perlas diferentes se añaden a cada una de las cuatro matrices sobre el chip. Un procedimiento para realizar esta distribución de perlas en un procedimiento a gran escala es usar una máscara que sóloexpone una matriz cada vez sobre cada chip. Se añade un grupo de perlas distinto a las matrices expuestas. Entonces,la máscara se desplaza para exponer otra matriz sobre cada chip y el procedimiento se repite. Después de repetirlo cuatro veces, cada chip tendrá cuatro matrices con cuatro grupos de perlas distintos.

1.2 Fabricación de obleas

Pueden usarse varios procedimientos para conferir una disposición de chip seleccionada sobre la oblea usando técnicas para obleas tales como, por ejemplo, fotolitografía o grabado de material. Los procedimientos seleccionadosdependen de los requisitos de diseño de obleas. Una oblea se somete a uno o más ciclos de fabricación dependiendode diferentes requisitos para dar una oblea completamente fabricada. Cada ciclo de fabricación en este procedimientocomprende, pero no se limita a, tres etapas: (i) crecimiento y/o deposición de material; (ii) litografía; y (iii) grabado. Cadaciclo normalmente produce una capa estructural. Dependiendo de las estructuras diana sobre la oblea, una o más capas pueden fabricarse ciclo por ciclo.

Por ejemplo, el crecimiento o deposición de material puede llevarse a cabo por crecimiento de SiO2 sobre silicio, o deposición de vapor químico de material dieléctrico tal como SiO2, Si3N4 u otros, o deposición de metales tales como aluminio, cromo, oro, titanio u otros. La etapa de litografía puede incluir fotolitografía, litografía por rayos e, litografía por rayos x o litografía por impresión. La etapa de grabado puede incluir la eliminación de una cierta cantidadde material en ciertas áreas como se define por una capa de enmascaramiento tal como, pero no se limitan a, una resina fotosensible. Ejemplos no limitantes de procedimientos de grabado incluyen grabado anisotrópico tal comograbado con iones reactivos, grabado químico húmedo de plano biselado cristalino o grabado isotrópico tal como grabado químico húmedo isotrópico, grabado con vapor o grabado con plasma.

1.3 Trazado de obleas

Para la eficiencia de funcionalización, regiones de chip se delinean después del procedimiento de fabricaciónde obleas, de manera que las regiones de chip sean adecuadas para el procesamiento en paralelo por lotes. Por estemotivo, la presente invención prefiere describir la oblea para delinear áreas que darán lugar a la posterior singulación achips individuales. En otras realizaciones de la presente invención, los chips pueden separarse usando técnicas que no requieren trazado. El fin de las líneas de trazado es producir líneas de rotura para facilitar la separación de chipsindividuales durante la etapa de singulación de obleas sin dañar o romper el chip individual. Debe observarse que, aunque la línea de trazado cederá a la rotura posterior, son suficientemente robustas para permitir las posterioresetapas del procedimiento sin rotura de los chips. A modo de ejemplo, las líneas de trazado pueden producirse usandouna máquina de trazado de obleas (por ejemplo, DISCO, Dynatex o Loomis Industry) para crear líneas de trazado quesólo son una fracción del espesor de la oblea. Esto va seguido de la aplicación de un rodillo en la dirección perpendicular a las líneas de trazado para delinear adicionalmente chips individuales. La oblea puede trazarse usando un trazador de punta de diamante; pueden producirse zanjas entre chips sobre una oblea de silicio por grabado químico usando productos químicos húmedos tales como, por ejemplo, disoluciones de hidróxido potásico/agua a temperatura elevada. La oblea también puede grabarse en seco por grabado con iones reactivos para dar zanjas bien definidas entrelos chips.

1.4 Limpieza e inspección de obleas

Durante la etapa del trazado de obleas pueden generarse polvo o partículas. Para proteger la superficie de laoblea, en una realización de la presente invención, una capa protectora se aplica a la superficie de la oblea. Porejemplo, la capa puede estar en forma de una cinta adhesiva (si no daña la superficie de la oblea), un recubrimiento deresina fotosensible o algún otro recubrimiento orgánico. La capa protectora se elimina después del trazado desprendiéndola de la oblea (por ejemplo, si es una cinta adhesiva) o disolviéndola en un disolvente apropiado. Por ejemplo, una capa de resina fotosensible puede quitarse disolviéndola en acetona y luego aclarando la oblea conalcohol isopropílico. Si se dejan cantidades traza del recubrimiento protector sobre la oblea pueden usarseprocedimientos de limpieza más agresivos. En una realización, la oblea es limpiada por un plasma de oxígeno para eliminar las cantidades traza de material orgánico. En otra realización, la oblea es limpiada por limpieza RCA, un procedimiento de limpieza convencional en la industria de los semiconductores que implica una mezcla de hidróxido deamonio/peróxido de hidrógeno que se calienta a aproximadamente 75ºC. En otra realización, la oblea es limpiada poruna mezcla de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno a temperaturas elevadas (aproximadamente 60ºC).

1.5 Agrupamiento de chips

La Fig. 7 muestra un ejemplo de agrupamiento de chips (C3). C1 es una oblea o cualquier unidad de sustratoque es conveniente para la fabricación por lotes tal como la usada en la industria de los semiconductores; C2 es una subunidad de C1 (sería un C1 completo) que consiste en un número deseado de chips; C3 es un chip, que es la unidadmás pequeña de un biochip. Normalmente, C2 es una unidad integrada para la funcionalización de chips. Después de lafuncionalización, C2 se separa en C3individuales.

1.6 Funcionalización y agrupamiento de perlas

Los términos “microesfera”, “micropartícula”, “perla” y “partícula” se usan indistintamente en el presente documento. La composición de las perlas incluye, pero no se limita a, plásticos, cerámicas, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, sol de torio, grafito de carbono, dióxido de titanio, látex o dextranos reticulados tales como Sepharose, celulosa, nailon, micelas reticuladas y teflón (véase “Microsphere Detection Guide” de Bangs Laboratories, Fishers, IN.) Las partículas no necesitan ser esféricas y pueden ser porosas. Los tamaños de perla pueden oscilar de nanómetros (por ejemplo, 100 nm) a milímetros (por ejemplo, 1 mm), prefiriéndose perlas de aproximadamente 0,2 micrómetros a aproximadamente 200 micrómetros, siendo particularmente preferidas más preferentemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micrómetros.

En algunas realizaciones de la presente invención, las perlas se funcionalizan antes de distribuirse sobre lasuperficie de la oblea, de forma que cada perla tiene un tipo específico de sonda biológica ligada sobre su superficie. Diversos procedimientos para funcionalizar las perlas son adecuados para su uso con la presente invención. El procedimiento apropiado se determina en parte por la naturaleza del material usado para preparar la perla. Por ejemplo,las perlas pueden funcionalizarse uniendo moléculas de agente de unión a las mismas, incluyendo tales moléculas

ácidos nucleicos que incluyen fragmentos de ADN (oligonucleótidos) o de ARN; péptidos o proteínas; aptámeros y moléculas orgánicas pequeñas según procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando una de variasreacciones de acoplamiento conocidas en la técnica (G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996); L. Illum, P. D. E. Jones, Methods in Enzymology 112, 67-84 (1985). En ciertas realizaciones de la invención, lasperlas funcionalizadas tienen moléculas de agente de unión (por ejemplo, ADN, ARN o proteína) covalentemente unidas a las perlas. Las perlas pueden almacenarse en una suspensión en masa tamponada hasta que se necesite. La funcionalización normalmente requiere reacciones de una etapa o dos etapas que pueden realizarse en paralelo usandorobótica de manipulación de líquidos convencional para unir covalentemente distintas funcionalidades deseables a perlas designadas. Pueden usarse perlas de arquitectura núcleo-vaina, estando la vaina compuesta en forma de una capa de bloqueo polimérica cuya composición preferida está seleccionada; y la funcionalización se realiza según laaplicación del ensayo elegido como diana.

En algunas realizaciones de la presente invención, las perlas están codificadas por color con colorantesfluorescentes. Para su uso en diversos ensayos, las perlas pueden comprender sustancias biológicas etiquetadas con colorante adicionales sobre sus superficies. Para detectar la señal de las perlas y ensayo pueden usarse obtención deimágenes microscópicas fluorescentes.

Se establece una biblioteca de perlas preparando subpoblaciones de diferentes grupos de perlas. Cada subpoblación de perlas se prepara fijando un tipo de sonda molecular de una biblioteca de sondas a una pluralidad deperlas, formando la subpoblación. Cada subpoblación de perlas puede distinguirse por la codificación de color concolorante fluorescente u otro procedimiento.

II. Ensamblaje

Las matrices de perlas se ensamblan asegurando las perlas sobre la superficie de una oblea o porción de oblea. Antes de asegurar las perlas a la superficie de la oblea, una biblioteca de perlas puede formarse por codificaciónquímica o tinción de perlas con conjuntos de etiquetas ópticamente distinguibles tales como aquellas que contienen uno

o más colorantes fluoróforos espectralmente distinguibles por longitud de onda de excitación, longitud de onda deemisión, vida del estado excitado o intensidad de emisión. Las etiquetas ópticamente distinguibles se hicieron para ser usadas para teñir perlas en relaciones especificadas, como se ha desvelado, por ejemplo, en Fulwiler, patente deEE.UU. nº 4.717.655. Las tinción también puede llevarse a cabo por hinchamiento de partículas según procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia, (Molday, Dreyer, Rembaum & Yen, J. Mol Biol 64, 75-88 (1975); L.Bangs, “Uniform Latex Particles, Seragen Diagnostics, 1984]. Por ejemplo, hasta doce poblaciones distinguibles deperlas pueden codificarse por hinchamiento y tinción en masa con dos colores, cada una individualmente en cuatroniveles de intensidad, y mezclarse en cuatro relaciones molares nominales. Los códigos de color combinatorios para superficies exteriores e interiores se desvelan en la solicitud internacional nº PCT/US/98/10719, que se incorpora en elpresente documento por referencia en su totalidad. Los códigos de color también se tratan en la patente de Estados Unidos nº 6.327.410, que se incorpora por este documento por referencia en su totalidad.

Hay muchas formas posibles para asegurar perlas sobre la superficie de un chip cuando se forman matrices de perlas. Las cavidades que se forman durante las etapas de fabricación de obleas proporcionan compartimentos queretienen las perlas sobre la superficie del sustrato. La eficacia de asegurar (o inmovilizar) las perlas depende de lasdimensiones de la cavidad con respecto al tamaño de la perla. Dimensiones de cavidades usadas para este fin son deforma que la profundidad de la cavidad sea aproximadamente 0,5 a 1,5 veces el diámetro de las perlas usadas. Máspreferentemente, las dimensiones de la cavidad son de forma que cuando una perla es gravitacionalmente estable en lacavidad, su punto más alto esté por debajo de la parte superior de los bordes, y sólo haya espacio suficiente paraacomodar hasta 1/3 del volumen de otra perla. Además, aunque se prefiere que el tamaño de la cavidad sea mayor queel tamaño de la perla, en esta realización preferida, cada cavidad no debe ser capaz de acomodar más de una perla. Además, los orificios de las cavidades son ligeramente más grandes que las perlas. La matriz hexagonal mostrada en laFigura 4, por ejemplo, es compatible con perlas que tienen un diámetro de 3,2 micrómetros.

Puede no ser necesario usar cavidades en un sustrato que contenga las perlas. Por ejemplo, puede disponerseuna pluralidad de postes sobre una superficie del sustrato para contener las perlas. Se muestra una posible estructura en el dibujo superior (vista en planta) y en el dibujo inferior (vista en perspectiva) de la Figura 5c. En este caso, cada perla está confinada por seis postes alrededor de la misma. El número de postes no está limitado a seis, pero podrían ser tres o más. Además, puede usarse cualquier otra estructura superficial elevada o rebajada, que incluye bloques,postes, bultos e indentaciones. En otras realizaciones pueden usarse grandes cavidades que pueden contener más deuna perla. Por ejemplo, la Figura 5d muestra una gran cavidad con paredes laterales rectas. La visión general en el dibujo superior muestra que las dimensiones horizontales de la cavidad grande son superiores a dos veces la de undiámetro de perla.

Como se ha descrito anteriormente, puede variarse la geometría y tamaño de las cavidades usadas en el ensamblaje de matrices de micro-partículas. En ciertas realizaciones, la geometría y tamaño son variados depositando una capa de óxido de silicio o polímero después de que se formen los orificios por grabado. Por ejemplo, puedenformarse cavidades con perfiles de paredes laterales re-entrantes por este procedimiento de deposición. En este contexto, el término “perfil de paredes laterales re-entrantes” se refiere a la situación en la que el perfil de paredes laterales es de forma que el diámetro del orificio de la cavidad en la superficie sea más pequeño que el diámetro de lacavidad en su fondo. Las cavidades con perfiles de paredes laterales re-entrantes formados por este procedimiento tienen una mayor tasa de retención de perlas durante el procesamiento y ensayo.

Las perlas pueden fijarse a una superficie por enlaces covalentes o por fuerzas de van der Waals, electrostáticas, gravitacionales, magnéticas u otras fuerzas. También pueden usarse combinaciones de tales procedimientos de unión. En una realización pueden producirse matrices de perlas tomando alícuotas de perlas codificadas designadas de depósitos individuales según la composición de matriz especificada. Alícuotas “reunidas” desuspensión se dispensan sobre sustratos seleccionados tales como una oblea delineada en compartimentos.

En otras realizaciones, la matriz de perlas puede prepararse usando LEAPS. En estas realizaciones seproporciona un primer electrodo plano que es sustancialmente paralelo a un segundo electrodo plano (configuración de“sándwich”), estando los dos electrodos separados por un espacio que contiene una disolución de electrolito. Lasuperficie o el interior del primer electrodo plano es modelado por un procedimiento de modelado interfacial, como sedescribe más adelante. Las perlas codificadas y funcionalizadas se introducen en el espacio. Cuando se aplica un voltaje de CA al hueco, las perlas forman una matriz de perlas codificada al azar sobre el primer electrodo (por ejemplo,un chip o una oblea). Alternativamente, una matriz de perlas puede formarse sobre un electrodo sensible a la luz, por ejemplo, chip u oblea) usando LEAPS. Preferentemente, la configuración de sándwich descrita anteriormente también se usa con un electrodo sensible a la luz plano y otro electrodo plano. De nuevo, los dos electrodos están separados por un espacio que contiene una disolución de electrolito. Las perlas funcionalizadas y codificadas se introducen en el hueco, y tras la aplicación de un voltaje de CA en combinación con una luz, forman una matriz sobre el electrodosensible a la luz.

Los sustratos (por ejemplo, chips u obleas) usados en la presente invención pueden modelarse según losprocedimientos de modelado interfacial de LEAPS, por ejemplo, modelando el crecimiento de óxido u otros materialesdieléctricos para crear una configuración deseada de gradientes de impedancia en presencia de un campo eléctrico de CA aplicado. Alternativamente, un sustrato modelado puede obtenerse dopando selectivamente regiones interiores delsustrato. Pueden diseñarse patrones de forma que se produzca una configuración deseada de flujo de fluido inducido por campo de CA y transporte de partículas correspondiente. Los sustratos pueden modelarse sobre una escala deoblea usando tecnología de procesamiento de semiconductores. Además, los sustratos pueden compartimentalizarsedepositando una película delgada de un polímero ópticamente transparente modelable por UV que fija una disposicióndeseada de conductos y compartimentos fluídicos al sustrato para confinar un fluido en uno o más compartimentosdiscretos, acomodando así múltiples muestras sobre un sustrato dado.

La codificación espacial, por ejemplo, puede llevarse a cabo dentro de una única fase líquida en el transcursodel ensamblaje de la matriz, por ejemplo, usando LEAPS para ensamblar matrices de perlas planas en cualquier configuración deseada en respuesta a campos eléctricos alternos y/o según patrones de luz proyectada sobre el sustrato. LEAPS crea gradientes laterales en la impedancia de la superficie de separación entre el chip de silicio y ladisolución para modular las fuerzas electrohidrodinámicas que median en el ensamblaje de la matriz. Los requisitos eléctricos son modestos: se aplican bajos voltajes de CA de normalmente inferiores a 10Vpp a través de un hueco de líquido de normalmente 100 m entre dos electrodos planos. Este procedimiento de ensamblaje es rápido y es ópticamente programable: matrices que contienen miles de perlas se forman en el plazo de segundos bajo un campo eléctrico. La formación de múltiples submatrices también puede producirse en múltiples fases fluidas mantenidas sobre una superficie compartimentalizada de chip. Alternativamente, la codificación espacial se lleva a cabo ensamblandochips separados, llevando cada uno al menos una matriz codificada al azar sacada de un conjunto específico, en configuraciones de múltiples chips designadas.

En una realización, el procedimiento desvelado en el documento PCT/US01/20179, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad (el procedimiento denominado “READ”), puede usarse para preparar matricesde perlas personalizadas que pueden usarse en la realización de análisis biomoleculares multiplexados según la presente invención. Usando READ, la matriz puede prepararse empleando procedimientos de lotes separados para producir sustratos específicos para la aplicación (por ejemplo, chip a la escala de la oblea) y para producir perlas que

están químicamente codificadas y biológicamente funcionalizadas (por ejemplo, a la escala de ѝ108 perlas/100 l de suspensión). Preferentemente, las perlas se someten a etapas de control de calidad (QC) respectivas antes delensamblaje de matrices, tal como la determinación de características morfológicas y eléctricas, incluyendo los ejemplosde las últimas potencial superficial (“zeta”) y conductividad superficial. Además, se realizan ensayos reales sobre perlasen suspensión antes de que se introduzcan al sustrato. Esto es para optimizar las condiciones de ensayo, generalmente con el objetivo de maximizar la sensibilidad y especificidad del ensayo y para minimizar las variaciones perla a perla. Para sustratos, las etapas de QC pueden incluir inspección óptica, elipsometría y mediciones del transporte eléctrico.

Una vez las perlas químicamente codificadas y biológicamente funcionalizadas se combinan con el sustrato(por ejemplo, chip u oblea), LEAPS u otro procedimiento de deposición activo descrito en el presente documento permite el rápido ensamblaje de matrices densas sobre un área designada sobre el sustrato. Ensamblando dentro de lamisma fase fluídica se evitan problemas tales como la variabilidad punto a punto o chip a chip sin la necesidad deremodelar o volver a diseñar el procedimiento. Además, la uniformidad de estos procedimientos permite la caracterización de perlas independiente de chip, además de la optimización de las condiciones de ensayo. Además, pueden formarse múltiples matrices de perlas simultáneamente en compartimentos de fluido discretos mantenidos sobre el mismo chip u oblea. Una vez formadas, estas múltiples matrices de perlas pueden usarse para el procesamientosimultáneo de múltiples muestras. La integración de LEAPS con microfluídica produce una plataforma ópticamente programable miniaturizada auto-contenida para el análisis en paralelo de proteínas y ácidos nucleicos.

Una vez se preparan perlas funcionalizadas y codificadas y luego se combinan con el sustrato, la interacción de unión entre el agente de unión sobre las perlas y un analito puede realizarse tanto antes como después de ensamblar lamatriz codificada al azar sobre el sustrato. Por ejemplo, la matriz de perlas puede formarse después del ensayo,posterior al cual pueden tomarse una imagen del ensayo y una imagen descodificante de la matriz. Alternativamente, lasperlas pueden ensamblarse en una matriz e inmovilizarse por medios físicos o químicos para producir matrices codificadas al azar. Puede aplicarse un voltaje de CC para producir matrices codificadas al azar. El voltaje de CC,normalmente fijado a 5-7 V (para perlas en el intervalo de 2-6 μm y para un tamaño de espacio de 100-150 μm) y aplicado durante < 30 s en configuración de “sesgo inverso” de manera que un sustrato de silicio dopado en n formara elánodo, hace que la matriz se comprima, facilitando el contacto entre perlas adyacentes dentro de la matriz y produce simultáneamente perlas que van a moverse hacia la región de alto campo eléctrico en proximidad inmediata de lasuperficie del electrodo. Las perlas pueden anclarse sobre la superficie por fuerzas de van der Waals o “ataduras” que extienden desde la superficie de la perla, por ejemplo, polilisina y estreptavidina.

Después del ensamblaje de perlas, los chips u obleas se inspeccionan y se obtienen imágenes por microscopíafluorescente para obtener un mapa descodificante. La descodificación puede usarse después para identificar la posición

y funcionalidad de cada perla individual.

El porcentaje de las posiciones de matriz que están llenas es preferentemente superior al 50%, más preferentemente superior al 90%. Para probar cómo de eficazmente retienen las cavidades las perlas en la superficie del sustrato, los chips que comprenden matrices de perlas se colocaron en una disolución acuosa y se agitaron continuamente durante tres días. Una comparación de las imágenes tomadas antes y después de esta prueba revelaron que más del 99% de las perlas sobre todos los chips probados permanecieron en las cavidades.

III. Post-ensamblaje

Durante el post-ensamblaje, las matrices de perlas pueden cubrirse con una superficie protectora. Antes o después de cubrir las perlas, las obleas que comprenden las matrices de perlas se singulan en uno o más chips de perlas.

3.1 Aseguramiento de micropartículas

En ciertas realizaciones de la invención, un gel que cubre el área de la matriz de perlas puede usarse paraevitar que las perlas se desplacen. En otras realizaciones, grupos funcionales químicos sobre los fondos y/o las paredeslaterales de las cavidades pueden usarse para ligar las perlas a la superficie. Un polímero cargado también puede usarse para recubrir los chips antes de la deposición de perlas. La carga del recubrimiento de polímero se elige para ser opuesta a la de las perlas, de manera que las perlas serán electrostáticamente atraídas al polímero. Cuando una perlaestá en una cavidad recubierta con polímero cargado, la atracción colúmbica entre la perla y las paredes laterales y el fondo de la cavidad sirve para contener la perla en la cavidad. De esta forma aumenta la tasa retención de perlas durante el procesamiento y ensayo. En algunas realizaciones, un segundo polímero cargado se deposita sobre lasuperficie de chip después de que las perlas se hayan dispuesto en las cavidades. La carga del segundo polímero seelige para ser la misma que la de la perla, de manera que ningún polímero se deposita sobre la perla, pero la carga superficial sobre el chip se neutraliza. Pueden implementarse varias variantes de estas técnicas con alteración mínima del procedimiento central. Por ejemplo, puede usarse una única capa de polielectrolito, o puede construirse una estructura de múltiples capas (que tiene capas de polímeros positivos y negativos alternas) para dar un recubrimiento con un espesor más uniforme y controlado. Además, en lugar de polímeros, también pueden usarse nanopartículas de polímero cargadas solas o en combinación con polímeros cargados. También puede usarse un recubrimiento de polímero y/o nanopartículas sin carga, pero de baja Tg (temperatura de transición vítrea), para mejorar la adhesión delas perlas a la superficie del chip.

3.2 Protección de matrices ensambladas

Pueden usarse recubrimientos móviles para proteger las perlas bio-funcionalizadas en las matrices de tanto una oblea antes de la singulación en biochips como los propios biochips singulados. Por tanto, se desea tener unaforma para proteger la matriz de perlas del polvo ambiental, suciedad y otros contaminantes mientras que el biochip uoblea está en almacenamiento. La presente invención proporciona recubrimientos protectores para biochips y obleas y procedimientos de preparación de tales recubrimientos. En realizaciones preferidas, los recubrimientos protegen lasperlas en matrices de perlas de la contaminación ambiental y previenen la degradación de las bio-moléculas (porejemplo, sondas) sobre la superficie de las perlas. Además, los recubrimientos pueden quitarse fácilmente de lasuperficie del biochip antes de realizar los bioensayos.

En ciertas realizaciones, el recubrimiento comprende un azúcar no reductor inerte tal como, por ejemplo, trehalosa que no interacciona con restos químicos reactivos tales como grupos amino en péptidos y proteínas y, portanto, previene la degradación o agregación que es común cuando se seca con otros excipientes.

En otras realizaciones, un hidrogel (por ejemplo, un hidrogel de agarosa) puede usarse para prevenir lacontaminación, deshidratación daño físico durante el almacenamiento. Antes de realizar un bioensayo, el hidrogel puede desprenderse de la superficie del sustrato. El acto de desprendimiento no sólo quita el hidrogel, sino que también limpiala superficie de cualquier perla adicional que no esté en las posiciones de matriz definidas por las cavidades u otras estructuras que las contienen. Estas perlas adicionales, que están incorporadas en el hidrogel, pueden recuperarse para uso posterior.

3.3 Singulación de chips

Después de la funcionalización, los grupos de chips (oblea o subunidad de una oblea) son singulados. Si la oblea se trazó previamente, puede singularse rompiendo las conexiones entre los chips. Esto puede hacerse haciendo rodar un rodillo sobre la cara trasera de la oblea en dirección perpendicular a las líneas de trazado, según el procedimiento explicado resumidamente en la patente de Estados Unidos nº 3.790.051. Alternativamente, la singulación puede lograrse por otros procedimientos tales como usando el trazador/interruptor GST fabricado por Dynatex International™. El chip individual obtenido de esta forma ya está listo para empaquetarse. Además de los procedimientos de singulación descritos en el presente documento, cualquier otro procedimiento de singulación talcomo, por ejemplo, corte láser, también puede usarse para lograr los objetivos de la invención.

En algunas realizaciones, la oblea o subunidad es singulada antes de la biofuncionalización. Los chips individuales pueden luego bio-funcionalizarse idénticamente o bio-funcionalizarse exponiendo subpoblaciones de loschips a diferentes grupos bioactivos.

IV. Empaquetamiento

Usando los procedimientos de la presente invención pueden producirse una multiplicidad de chips por el ensamblaje de matrices codificadas al azar de moléculas de sondas presentadas sobre perlas codificadas. Cada chip,cortado de una oblea únicamente identificada, puede contener una o más matrices de perlas codificadas al azar. Este procedimiento de ensamblaje al azar según la invención engloba una realización en la que las sondas presentes en

perlas sobre chips que contienen matrices codificadas al azar son miembros de bibliotecas de sondas más grandes que están presentes sobre chips etiquetados seleccionados de una multiplicidad de obleas. Los chips de diferentes obleas pueden seleccionarse y ensamblarse para formar conjuntos de chips reunidos. Preferentemente, los chips muestran una etiqueta descodificable para identificar la oblea de origen. Las matrices de chips codificadas pueden formarse porensamblaje al azar sobre una superficie plana en un procedimiento también denominado en el presente documentoembaldosado al azar, ilustrado en la Fig. 15d. El embaldosado al azar se refiere a un procedimiento de ensamblaje deun conjunto de chips codificados en una disposición o matriz plana de forma que se permita la inspección óptica de cada chip o parte de cada chip dentro del ensamblaje o matriz.

Esta jerarquía de escalas para el ensamblaje al azar desde el nivel de la matriz de perlas hasta el nivel de lamatriz de chips proporciona flexibilidad para crear rápidamente matrices de grandes conjuntos de sondas de composición personalizada y alta densidad de rasgos. Tales matrices podrían usarse para presentar un gran conjunto de sondas para el perfilado de expresión génica, o para el perfilado de la metilación de ADN por procedimientos deensayo conocidos en la técnica. Además, si se desea exponer múltiples matrices de sondas a reacciones separadas, unprocedimiento de embaldosado al azar de fijar una pluralidad de chips sobre un único soporte como se trata másadelante proporciona un enfoque novedoso rápido y flexible para implementar las estrategias de reunión ydesconvolución conocidas en la técnica Por ejemplo, se producen fácilmente matrices que presentan conjuntos de sondas parcialmente solapantes por construcción y selección adecuada de chips.

Tras el ensamblaje de las matrices de perlas de la presente invención, las obleas se singulan para permitir lamanipulación de chips etiquetados individuales. En el embaldosado al azar, los chips etiquetados que estánseleccionados de una o más obleas se colocan sobre una superficie (preferentemente proporcionada por un sustratoplano) sobre la cual los chips pueden moverse constantemente para formar un ensamblaje de múltiples chips correspondiente a una disposición deseada. Para facilitar el compacto empaquetamiento, los chips pueden diseñarse para mostrar una forma simétrica convexa tal como un cuadrado, triángulo o hexágono. Para reducir la distancia entre matrices de perlas sobre chips adyacentes, los chips pueden diseñarse para mostrar formas de conexión (Fig. 14c).

Ensamblaje por deslizamiento

En esta realización, múltiples obleas singuladas se colocan sobre un sustrato grande común presentando loslados las matrices de sondas hacia abajo. En realizaciones preferidas, las matrices de sondas están empotradas para prevenir el contacto directo con el sustrato. Uno o más chips se seleccionan al azar de cada oblea y, de un modo similar a monedas deslizantes sobre una parte superior de la mesa, se disponen para formar una matriz de chips deslizando los chips en un área de ensamblaje designada. Este procedimiento puede generalizarse a la manipulación de filas y columnas mostrada en la Figura 8. En esta realización, el procedimiento de embaldosado pueden monitorizarse y registrarse por instrumentación óptica y de visión de máquina convencional disponible para la inspección desemiconductores. Esta instrumentación puede usarse para rastrear desde sus obleas de origen respectivas a susposiciones finales respectivas, permitiendo la codificación y descodificación posicional directa de la matriz de chips ensamblada. Tras completarse el procedimiento de ensamblaje, un soporte de múltiples chips (como se describe en elpresente documento) está alineado con una o más matrices de chips dispuestas en el área de ensamblaje y luego sebaja y se une a los chips para formar un ensamblaje de múltiples chips. Para facilitar la unión, los soportes pueden recubrirse previamente con adhesivo o pueden recubrirse con materiales magnéticos, si los chips se han convertido enmagnetizables mediante procedimientos descritos en el presente documento.

Este procedimiento de ensamblaje por deslizamiento usa preferentemente una punta mecánica, tal como undispositivo de succión que puede elevar y manipular chips individuales como se conoce en la técnica. Alternativamente, los chips magnetizables se manipulan usando una aguja magnética que puede seleccionar uno o más chips de cadaoblea. Las obleas (y los chips contenidos sobre ellas) pueden convertirse en magnetizables por la deposición de unmaterial magnético tal como níquel o una aleación de níquel-hierro (“permalloy”) por galvanizado o deposición sin corriente eléctrica como se entiende en la materia, por ejemplo, para semiconductores y cerámicas. Alternativamentepueden introducirse micropartículas paramagnéticas, tanto como una parte de las matrices codificadas al azar de micropartículas que presentan moléculas de sondas o como un rasgo separado, por ejemplo, en forma de una matriz ensamblada en una porción designada de cada chip. La matriz de partículas magnetizables puede estar sobre la caradel chip que contiene la matriz de sondas codificada al azar o sobre la cara opuesta.

El ensamblaje por deslizamiento generalmente implica manipular chips individuales y se vuelva cada vez másdifícil a medida que aumenta el número de chips constituyentes en una matriz de chips. Esta situación es agravada silos chips son pequeños, presentando, por ejemplo, dimensiones lineales de 100 μm o menos. Por ejemplo, chips pequeños de forma cúbica o casi cúbica pueden formarse en esta dimensión a partir de sustratos cerámicos. En estassituaciones, los chips individuales se manipulan mejor mediante procedimientos conocidos en la técnica para la manipulación de micropartículas de vidrio o de polímero de dimensiones similares.

Ensamblaje colectivo

En esta realización, chips que son cortados de obleas individuales se almacenan en suspensión en masausando un tampón de almacenamiento inerte tal como agua de alta pureza que contiene una cantidad traza de azida. Los chips se suspenden por agitación mecánica o magnética. Se forman conjuntos de chips dispensando y mezclando alícuotas de suspensiones seleccionadas. Opcionalmente, una cantidad traza de glucosa u otro componente de alto peso molecular soluble puede añadirse a esta suspensión para aumentar la viscosidad y así mejorar las característicasde flujo. Entonces, la suspensión se deposita sobre un sustrato plano tanto aplicando puntos de alícuotas discretasusando una jeringuilla, pipeta o capilar para lograr deposición al azar como usando procedimientos continuos conocidosen la técnica para producir matrices de partículas coloidales que incluyen aquellas que invocan la acción de flujo yfuerzas capilares [Adachi, E., y col., Langmuir, vol. 11, 1057-1060 (1995); Science, Vol. 276, 233-235 (1997)].

En el caso de deposición al azar, un molde puede proporcionarse sobre el sustrato para guiar la disposición dechips individuales y para contenerlos en posiciones designadas sobre el sustrato. En una realización, los chips pueden

recogerse de la suspensión mixta insertando una malla en la suspensión y retirándola, de forma que los chips individuales son literalmente elevados o “vaciados”. Preferentemente, los chips, particularmente cuando se sitúan sobreun sustrato libre de rasgos plano, se separan entre sí suficientemente de forma que se prevenga el solapamiento parcialy el apilamiento antes de que sean “acumulados” en una configuración de empaquetamiento cerrada. La separación selogra, por ejemplo, por ensamblaje por deslizamiento (véase anteriormente) o por agitación mecánica que se aprovechade la inducción de “modos de tambor” sobre sustratos flexibles tales como sustratos poliméricos, como se pone en práctica en la materia.

En una realización preferida, los chips son “acumulados por medios mecánicos, por ejemplo, arrastrando chipsen un flujo de fluido dirigido paralelo a la superficie del sustrato en una celda de flujo de sándwich en la que los chips son forzados contra una barrera en el extremo lejano de la celda de flujo.

Preferentemente, los chips dentro de un ensamblaje al azar están orientados de manera que expongan la caraactiva que presenta matrices codificadas al azar de sondas. En los casos en los que la cara activa no está expuesta, loschips deben invertirse. La inversión de chips en la orientación preferida se logra por ciclos de agitación mecánica yunión de chips correctamente orientados (recubiertos con un adhesivo de unión activada por calor o luz).Alternativamente, la inversión durante la agitación mecánica es ayudada desplazando el centro de masa hacia la caradeseada del chip, por ejemplo, por metalización. Los chips magnetizables pueden depositarse en presencia de gradiente de campo magnético alineado perpendicularmente a la superficie del sustrato, proporcionando una sedimentación suficientemente lenta en un medio de alta viscosidad para permitir que los chips adopten la correcta orientación a medida que se aproximan a la superficie.

La inversión también se facilita produciendo formas tridimensionales tales como una forma piramidal,orientándose la punta de la pirámide en la dirección opuesta a la superficie activa, como se produce por procedimientosde grabado de semiconductores convencionales.

Los chips pueden empaquetarse en empaquetamientos de un único chip o de múltiples chips. En unempaquetamiento de múltiples chips, los chips que contienen diferentes matrices de biosondas se colocan sobre el mismo soporte. La Figura 8 muestra cuatro chips empaquetados juntos para formar un chip de combinación cuadrado o un chip de combinación lineal. Los cuatro chips pueden unirse con pegamento a un soporte común tal como unportaobjetos de vidrio, o pueden unirse a un soporte por otros procedimientos tales como unión de materiales magnéticos sobre la cara trasera de los chips de manera que se peguen a un soporte magnético. La manipulación dechips no se limita a usar equipo de recogida y colocación. Los chips pueden agruparse en filas o columnas después dela singulación. Estas filas y columnas de chips pueden moverse por barras de confinamiento. La Figura 9 muestra quedisponiendo selectivamente diferentes filas de chip pueden obtenerse diferentes combinaciones de chips.

Otro diseño de empaquetamiento se muestra en la Figura 10. Cuatro chips con matrices sobre las esquinaspueden combinarse para formar un chip con una matriz más grande en el centro. Si las matrices sobre los cuatro chips comprenden distintas sondas funcionales, la matriz grande contendrá cuatro veces más información que un único chip.

Puede producirse una multiplicidad de chips por el ensamblaje de matrices codificadas al azar de sondas que están presentes sobre perlas. Cada chip puede incluir una o más matrices de perlas codificadas al azar y pueden cortarse a partir de una oblea únicamente identificada. En otra realización, los chips que contienen matrices codificadasal azar de sondas sobre perlas pueden ser miembros de bibliotecas de sondas. En esta realización, cada chip en una matriz de múltiples chips muestra una etiqueta descodificable que identifica la oblea de origen.

Puede usarse una superficie de vidrio en forma de un portaobjetos u otra superficie similar para preparar unsoporte de múltiples chips. Para preparar el portaobjetos como soporte, un recubrimiento, tal como Teflon™, puedeaplicarse de tal forma que deje orificios circulares o pocillos (es decir, áreas de vidrio sin ninguna cobertura de teflón). Cada pocillo es un círculo con 6,5 mm de diámetro. Uno o más chips pueden unirse en la superficie de vidrio dentro de un pocillo. Un portaobjetos de vidrio típico tiene 25 x 75 mm y 1 mm de espesor, con una matriz 2 x 5 de pocillos. Con tamaños de chips típicos de 1,75 x 1,75 mm, hasta cuatro chips pueden unirse a la superficie de vidrio en cada pocillo. Cada chip en el mismo pocillo puede tener distintos grupos de perlas que se ensamblaron antes de unirse al soporte. Por ejemplo, si cada chip tiene una matriz que contiene 39 tipos de grupos de perlas, un pocillo con 4 chips distintos tendría un total de 4 x 39 = 156 tipos de perlas. Por otra parte, para chips más grandes (por ejemplo, un cuadrado de 4,5 x 4,5 mm), un pocillo entero es ocupado por un único chip. Para las dimensiones de pocillos descritas en el presentedocumento, cada pocillo puede contener hasta 40 μl de líquido (normalmente una disolución acuosa). Normalmente, unvolumen de 20 μl de disolución de muestra se añade a cada pocillo para reacciones biológicas, de forma que cada chipes totalmente cubierto por la disolución de muestra. Debido a que el recubrimiento de teflón fuera de los pocillos eshidrófobo, las muestras acuosas no se vierten. El formato de un portaobjetos de soporte puede diseñarse para ajustarse a ciertas aplicaciones. Por ejemplo, una única fila de 8 pocillos sobre un portaobjetos puede usarse para analizar 8muestras. Además, puede usarse una matriz de 4 x 8 pocillos para analizar 32 muestras. Similarmente, pueden disponerse más pocillos (por ejemplo, 96, 384 y 1536) sobre un único portaobjetos para analizar más muestras.

En ciertas realizaciones de un soporte de chips móvil, los chips están unidos a un sustrato tal como vidrio,acero inoxidable, materiales de plástico, silicio o materiales cerámicos. La unidad de soporte completa es móvil y puedetransportarse durante el procesamiento para exponer los chips a diferentes medios de reacción, tales como cámaras dereacción, cámaras de lavado y etapas de lectura de señales.

En otras realizaciones, el soporte de chips móvil comprende una cámara o cámaras en las que los chips están asegurados. Alojando los chips dentro del soporte de chips móvil puede minimizarse la contaminación durante el transporte. En ciertas realizaciones, la cámara o cámaras del soporte de chips móvil también sirven de entorno de procesamiento. Pueden admitirse gases reactivos o disoluciones líquidas para diversos fines, tales como realizar unbioensayo o limpiar los chips, en la cámara y posteriormente evacuarla, si se desea. Adicionalmente, el soporte de chips móvil puede poseer medios para cambiar las propiedades termodinámicas de la cámara, tal como la presión o temperatura de la cámara.

V. Ensayos

Los biochips de la invención que comprenden matrices de perlas son útiles para realizar diversos ensayos bioanalíticos y químicos. Una vez ensambladas pueden obtenerse imágenes de las matrices de perlas sobre losbiochips de la invención para registrar señales de ensayo y pueden codificarse para identificar analitos diana unidos a las sondas asociadas a perlas individuales dentro de la matriz. La matriz de perlas proporciona un sistema que puede usarse para leer los resultados de secuencias de ensayo bioanalíticos o químicos de múltiples etapas. Además, múltiples analitos diana pueden detectarse simultáneamente debido a la presencia de una pluralidad de sondas dirigidasa diferentes analitos diana que comprenden las matrices. Además de proporcionar la capacidad para detectar la presencia o ausencia de analitos diana específicos, las matrices de perlas de la invención también encuentranaplicabilidad en la determinación de constantes de afinidad para los analitos diana que se unen a las sondas. Por tanto, los biochips tienen una amplia aplicabilidad para detectar, por ejemplo, biomoléculas tales TNF-alfa e IL-6. Otrasaplicaciones no limitantes incluyen genotipado por análisis de polimorfismos; análisis de expresión génica; perfilado multiplexado cuantitativo de la expresión de citocinas, análisis de genes y productos génicos dentro de la misma muestra de fluido; huella genética por afinidad; y análisis multiplexado de reacción cinética. Otros ensayos y determinaciones analíticas tales como aquellas citadas en la patente de Estados Unidos nº 6.327.410, que se incorpora en el presente documento por referencia, pueden adaptarse para su uso con los biochips de la presente invención.

EJEMPLOS

La presente invención se entenderá mejor a partir de los ejemplos que siguen. Sin embargo, un experto en lamateria apreciará fácilmente que los procedimientos y resultados específicos tratados son meramente ilustrativos de lainvención descrita en las reivindicaciones que siguen después.

Ejemplo 1: Fabricación de obleas y diseño de chips que comprenden matrices de perlas

El procedimiento de fabricación del chip que comprende una matriz de perlas, como se muestra en la Figura 4,se describe en la Figura 11. El sustrato era una oblea de silicio de 100 mm de diámetro, 0,5 mm de espesor, con orientación cristalina de (100), dopada con fósforo tipo n. Un intervalo de resistividad adecuado para estas obleas es 1,5

-: 4 O-cm. Las obleas se fabricaron normalmente en lotes de hasta 25. La primera etapa comprende el crecimiento de SiO2. Las obleas se limpiaron primero por el procedimiento de limpieza RCA que comprende las etapas de (1) poner en remojo las obleas en una mezcla de NH4OH:H2O2 (30%):H2O en una relación de volumen de 1:1:5 a 75ºC durante 10 minutos; (2) aclarar con una limpieza en lotes de agua en cascada usando 18 MO-cm de agua; (3) poner en remojo las obleas en una mezcla de HCl (36%):H2O2 (30%):H2O en una relación de volumen de 1:1:5 a 75ºC durante 10 minutos; y

(4) aclarar con una limpieza en lotes de agua de flujo en cascada hasta que el agua en el baño fue al menos 16 MO-cm. Las obleas se secaron por centrifugación antes de disponerse en un horno horizontal para el crecimiento de SiO2. Las obleas se colocaron verticalmente sobre una navecilla de cuarzo y se introdujeron a un horno de oxidación a 1050ºCque tenía O2+HCl (4%) a una presión de 760 torr (0,1 MPa). El tiempo de oxidación fue 34 minutos. Se obtuvo una capa uniforme de 1.000 Å de SiO2 por este procedimiento, como se verificó usando elipsometría (índice de refracción: n=1,46, variación de espesor: <5%).

Las obleas con SiO2 se recubrieron por centrifugación con resina fotosensible (Shipley 1813) a una tasa de centrifugación de 4000 rpm (tiempo de centrifugación 30 segundos), luego se hornearon sobre una placa caliente a 115ºC durante 60 segundos para eliminar el disolvente. Entonces, la oblea se expuso a luz UV (365-405 nm) en una etapa de litografía de contacto que usó el alineador de máscara de contacto/proximidad 3HR del sistema de Hybrid Technology Groups (HTG). Tras la exposición a UV, la oblea se reveló por el revelador AZ300 MIF durante 60segundos, se aclaró en agua DI y se secó por soplado con una corriente de nitrógeno seco comprimido. Entonces, las obleas se sumergieron en decapante de óxido tamponado (mezcla 6:1 de fluoruro de amonio y 50% de fluoruro dehidrógeno acuoso) durante 2 minutos para grabar el SiO2 sobre el área expuesta (la estrella en la Figura 11). Las obleas se aclararon posteriormente con agua DI, luego se pusieron en remojo en el eliminador de resina fotosensible 1165Microposit a 60ºC durante 60 minutos para eliminar la resina fotosensible. Entonces, las obleas se aclararon en agua DI y se secaron por soplado con el chorro de nitrógeno comprimido seco. Este procedimiento entero produce obleas con una capa de óxido modelada.

Tras la etapa de modelado del óxido, las obleas se limpiaron por el procedimiento de RCA y luego sedispusieron en un horno horizontal para la deposición de nitruro de silicio (Si3N4). Pueden usarse dos tipos de nitruro de silicio: nitruros convencionales y de baja tensión. Las condiciones para la deposición son del siguiente modo: nitruroLPCVD (convencional), presión = 200 mtorr (0,3 hPa), temp = 800ºC, SiCl2H2 = 30 sccm, NH3 = 90 sccm; nitruro LPCVD (baja tensión): presión = 150 mtorr (0,2 hPa), temp = 850ºC, SiCl2H2 = 47sccm, NH3 =10 sccm. Después de 2 a 3 minutos de deposición, el espesor de la película de Si3N4 es entre 60-90 Å.

La siguiente etapa es fabricar las estructuras de matriz. Las obleas se recubrieron por centrifugación con resina fotosensible OCG 12i a una tasa de centrifugación de 4000 rpm (tiempo de centrifugación 30 segundos) y luego se hornearon sobre una placa caliente a 90ºC durante 60 segundos para eliminar el disolvente. Las obleas se expusieron aluz UV (365 nm) y se realizó litografía repetida usando 10x un fotorrepetidor de línea i GCA-6300. Después de laexposición, la oblea se horneó sobre una placa caliente a 115ºC durante 90 segundos antes de revelarse por elrevelador AZ300 MIF durante 60 segundos, aclararse en agua DI y secarse por soplado con corriente de nitrógeno secocomprimido. Las obleas se hornearon en un horno de 90ºC durante 20 minutos. Entonces, las obleas se grabaron en un grabador Plasma Therm 72 para eliminar el nitruro de silicio en el área expuesta (los rasgos hexagonales en lasmatrices) usando grabado con iones reactivos del gas CF4. Luego se usó grabado con iones reactivos de oxígeno para eliminar material polimérico residual sobre los rasgos hexagonales. Las cavidades hexagonales se fabricaron por grabado por iones reactivos profundos (DRIE) usando un grabado de silicio profundo Unaxis SLR 770 ICP (procedimiento de flúor de Bosch autorizado). El procedimiento se ajustó de manera que durara 2-3 minutos para grabar cavidades de 3,8 micrómetros de profundidad. El control de la profundidad está dentro de 0,3 micrómetros. Después delgrabado, las obleas se pusieron en remojo en eliminador de resina fotosensible 1165 Microposit a 60ºC durante 60minutos para eliminar la resina fotosensible. Las obleas se aclararon en agua DI y se secaron por soplado con un chorro

10 15

25 30 35

45 50

de nitrógeno comprimido seco. Entonces, las obleas se procesaron en un separador de resina fotosensible postconectado GaSonics, Aura 1000, por plasma de oxígeno durante 90 segundos para eliminar cualquier polímero residual dentro de las cavidades hexagonales generadas durante el procedimiento de DRIE. Entonces, las obleas se recubrieron por centrifugación con un recubrimiento de resina fotosensible protectora (Shipley 1813, tasa de centrifugación de 4000 rpm, tiempo de centrifugación 30 segundos), luego se hornearon sobre una placa caliente a 115ºC durante 60 segundos para eliminar el disolvente. Las obleas se enviaron a un vendedor comercial para elrecubrimiento de la cara trasera de 500 Å de oro con 100 Å de cromo como capa de adhesión. Las caras traseras de las obleas se separaron de la capa de óxido de silicio nativo inmediatamente antes del procedimiento de recubrimiento usando pulverización con iones argón.

Las obleas fabricadas se cortaron con sierra sobre la superficie para definir cada chip (dimensiones de cada chip, cuadrado de 1,75 x 1,75 mm). La profundidad de los cortes fue 2/3 del espesor de las obleas. Después de cortar con sierra, las obleas se limpiaron poniéndolas en remojo en el eliminador de resina fotosensible 1165 Microposit a 60ºCdurante 60 minutos para eliminar la resina fotosensible, luego aclarando en agua DI y secando por soplado con unacorriente de nitrógeno seco comprimido. Normalmente, las obleas se pusieron luego en remojo en NanoStrip (una mezcla de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de hidrógeno) a 60ºC durante 2 horas, luego se aclararon en agua DI y se secaron por soplado con una corriente de nitrógeno seco comprimido. Después de estos procedimientos, las obleasya están lista para la etapa de ensamblaje de perlas.

Después del ensamblaje de perlas pueden eliminarse las perlas adicionales que no se aseguran en cavidades.Un procedimiento para eliminar perlas sin asegurar es limpiar el chip o superficie de la oblea con aplicadores de algodónhumedecidos. Otro procedimiento es lavar las perlas sin asegurar usando chorros de agua casi paralelos al chip o superficie de la oblea. Todavía otro procedimiento comprende hacer crecer un gel sobre la superficie y posteriormentedesprender el gel.

Ejemplo 2: Funcionalización de perlas y formación de una matriz de perlas

Perlas funcionalizadas con tosilo codificadas por color de 3,2 μm de diámetro se usaron como soportes de fasesólida. Se generaron varios conjuntos de códigos de color distinguibles por tinción de partículas usando procedimientos convencionales (Bangs. L. B., “Uniform Latex Particles”, Seragen Diagnostis Inc., p. 40). Las perlas teñidas sefuncionalizaron con neutravidina (Pierce, Rockford, IL), una proteína de unión a biotina, para mediar en la inmovilizaciónde sondas o cebadores biotinilados. En una reacción de acoplamiento a pequeña escala típica, 200 μl de suspensión que contenía 1% de perlas se lavaron tres veces con 500 μl de tampón fosfato 100 mM/pH 7,4 (tampón A) y seresuspendieron en 500 μl de ese tampón. Después de aplicar 20 μl de 5 mg/ml de neutravidina a la suspensión de perlas, la reacción se dejó avanzar durante la noche a 37ºC. Entonces, las perlas acopladas (es decir, perlas conmoléculas biofuncionales unidas a las mismas) se lavaron una vez con 500 μl de PBS/pH 7,4 con 10 mg/ml de BSA (tampón B), se resuspendieron en 500 μl de ese tampón y se hicieron reaccionar durante 1 hora a 37ºC para bloquear sitios sin reaccionar sobre la superficie de la perla. Después del bloqueo, las perlas se lavaron tres veces con tampón B y se guardaron en 200 μl de ese tampón.

Las sondas (para la detección de moléculas diana) y cebadores (que pueden usarse como moldes paraextender la diana de ADN hibridada para las posteriores reacciones catalíticas para identificar las sondas reaccionadas) que iban a acoplarse a las perlas se biotinilaron en el extremo 5'; un ligador de trietilenglicol de 15 carbonos se insertóentre la biotina y el oligonucleótido para minimizar los efectos disruptivos de la inmovilización superficial en las reacciones posteriores. Para cada cebador se realizó una reacción de unión usando 50 μl de suspensión de perlas. Las perlas se lavaron una vez con 500 μl de Tris 20 mM / pH 7,4, NaCl 0,5 M (tampón C) y se resuspendieron en 300 μl deese tampón. Una disolución de cebador (2,5 μl de una disolución 100 μM) se añadió a la suspensión de perlas y se dejóque reaccionaran durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces, las perlas se lavaron tres veces con Tris 20mM / pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,01% de Triton y se guardaron en Tris 20 mM / pH 7,4, NaCl 150 mM.

Una matriz de perlas a modo de ejemplo se ensambló del siguiente modo. La suspensión de perlas obtenida mediante los procedimientos descritos anteriormente se lavó con agua desionizada (todo el agua usada fue altamentepurificada y se esterilizó con una resistividad de 18 MO-cm o superior) cinco veces antes de suspenderse en 0,01 mMde base TRIS + 0,01% de Triton X-100 en disolución de agua. El contenido de perlas de la suspensión fue 0,5%. Seañadieron dos microlitros de la suspensión de perlas a la superficie de un chip cuadrado de 4,5 mm que comprendía una matriz de perlas por micropipeta. Entonces, el chip se sometió al procedimiento de LEAPS. El electrodo de contador fue un trozo de vidrio recubierto por una capa de óxido de indio y estaño (ITO). El hueco entre la superficie del chip y elvidrio recubierto con ITO fue 100 micrómetros. Se aplicó corriente CA en la secuencia enumerada en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencia de suministro de CA. El voltaje es la mitad de la amplitud pico a pico.

Etapa: Tiempo (minutos) Frecuencia (Hz) Voltaje (± voltios) Función

1: 2 2000 3 CA encendida

2
2: 1000 3 CA encendida

3: 2 500 3 CA encendida

4: 2 2000 3 CA encendida

5: 2 500 3 CA encendida

6: 2 2000 3 CA encendida

5 10

40 45

Etapa: Tiempo (minutos) Frecuencia (Hz) Voltaje (± voltios) Función

7: 2 200 3 CA encendida

8: 2 2000 3 CA encendida

9: 2 200 3 CA encendida

10: 0 200 0 CA parada

Después de completarse la secuencia, las perlas dentro del área extendidas por el patrón con forma de estrella se concentraron en el área de matriz. El patrón de flujo inducido por la presencia del patrón con forma de estrella ayudaa concentrar las perlas. Después de esperar 15 minutos para que las perlas sedimentaran, el dispositivo se dejo lentamente en reposo en agua pura. El recubrimiento de vidrio de ITO se elevó lentamente y el agua se drenólentamente de manera que emergiera la superficie del chip. En este momento, la superficie podría secarse tanto dejando el chip a temperatura ambiente durante un periodo extendido como horneando el chip en un horno a 55ºC durante 5 minutos. El chip secado se dejo remojar en agua pura durante 15 minutos, y la superficie del chip se limpióluego suavemente varias veces con un hisopo de algodón húmedo para eliminar las perlas que no estuvieran en la matriz. El chip se aclaró posteriormente tres veces con agua pura antes de secarse soplando nitrógeno comprimidosobre sus superficies. Finalmente, el chip se inspeccionó por microscopía de luz de fluorescencia para garantizar que no estuvieran perlas adicionales fuera de la matriz.

Ejemplo 3: Formación de una matriz de perlas

Una suspensión de perlas se dispensó directamente sobre el área de matriz sobre un chip. Se usó un aplicador de algodón húmedo (K1) para agitar suavemente la suspensión de perlas sobre la superficie de la matriz. El movimiento de K1 puede ser circular, lineal o de algún otro modo significativo, y es normalmente paralelo a la superficie del chip. Después de agitar la suspensión varias veces, las perlas se movieron a la matriz. Entonces, la superficie del chip se limpió usando K1 para limpiar las perlas adicionales que no estuvieron en la matriz. Este procedimiento puede aumentarse de chips individuales al ensamblaje de múltiples chips a escala de obleas, y puede automatizarse.

Un ejemplo de un procedimiento de procesamiento para formar matrices de perlas es del siguiente modo. Seusaron dos microlitros de 1% de micropartículas (aproximadamente 3,2 micrómetros de diámetro) en 100 microlitros de solución salina tamponada con fosfato (también conocida como PBS: NaCl 150 mM; NaP 100 mM, pH 7,2) para el ensamblaje de ocho matrices de micropartículas sobre chips de silicio (2,5 x 2,5 mm) con 4.000 micropocillos sobre cada chip. Se usaron los siguientes procedimientos:

(1): Se recogieron micropartículas de PBS en un tubo de centrífuga de 1,5 ml por centrifugación (14.000 g, 1 minuto). Pueden usarse otros medios de recogida.

(2): El sobrenadante se desechó por aspiración usando una pipeta de transferencia.

(3): Las partículas se resuspendieron en 5 microlitros de 5% de glicerol en Tris 10 mM a pH 7,5.

(4): Las partículas se recogieron de la disolución de glicerol por centrifugación. Pueden usarse otros medios de recogida.

(5): La disolución de glicerol se aspiró a partir de los sedimentos de partículas.

(6): Los sedimentos se resuspendieron en 1 microlitro de 5% de glicerol, Tris 10 mM, pH 7,5.

(7): Se colocaron ocho chips de silicio sobre una cinta de doble cara unida sobre un portaobjetos de microscopio.

(8): Un volumen de 0,1 microlitros de la suspensión de partículas se pipeteó sobre cada uno de los chips en elárea con 4.000 micropocillos.

(9): Un aplicador de algodón se lavó con agua de un frasco lavador.

(10): El aplicador de algodón húmedo se secó por soplado durante 30 segundos usando aire presurizado. El flujo de aire elimina el agua en exceso del algodón del aplicador. Además, el aire también sopla algunas fibras de la superficie, que hace la bola de algodón más acolchada.

(11): Debido a la evaporación de la suspensión de perlas en el aire y la naturaleza higroscópica del glicerol en la disolución, cuando las etapas 9 y 10 se completaron (aproximadamente 1 - 2 minutos), el contenido de aguaen la suspensión de la etapa 8 alcanzó el equilibrio. Debido al aumento de la viscosidad, la gotita se convirtióen una suspensión. Para ensamblar matrices de micropartículas, la suspensión de perlas se agitó suavemente varias veces con la punta del aplicador de algodón húmedo en un movimiento circular. Las fibras sueltas de labola de algodón transportaron las perlas a los micropocillos sobre la superficie (Figura 3).

(12): La ocupación de las partículas de los micropocillos se examinó usando un microscopio fluorescente. Si laocupación no es satisfactoria, la etapa 11 puede repetirse.

(13): Las partículas en exceso se limpiaron suavemente del chip usando el aplicador de algodón. Para evitaragua en exceso sobre la superficie, el aplicador de algodón no se presionó contra el chip.

(14): El chip se secó soplando sobre la superficie del chip con nitrógeno comprimido.

(15) La micropartícula ensamblada preparada por este procedimiento puede usarse para ensayos o guardarse en disolución a 4ºC para uso posterior.

En este ejemplo, las micropartículas se suspenden en una pequeña cantidad de 5% de glicerol, disolución Tris 10 mM a pH 7,5 para la deposición directa de matrices de micropartículas sobre el chip de silicio. Sin embargo, aunque las partículas pueden suspenderse en otras disoluciones, si LEAPS se usa para ensamblar las perlas, la alta viscosidad de la disolución o concentración iónica puede interferir con LEAPS (por ejemplo, con el ensamblaje de partículas sobre áreas designadas de un sustrato tal como un electrodo modelado o iluminado). Por consiguiente, se recomienda que laconcentración iónica de la suspensión sea aproximadamente 1,0 mM o inferior, preferentemente entre aproximadamente 0,1 mM y 1,0 mM. Además, se recomienda que la viscosidad de la suspensión sea aproximadamente 100 cp o menos.

Además, ciertas sales, tales como fosfato de sodio y cloruro sódico, pueden forman cristales a las elevadasconcentraciones que se producen durante la etapa 11. Tales cristales puede interferir con bio-moléculas sobre lasuperficie de la perla. Por consiguiente, no se recomiendan para su uso en suspensiones de perlas.

Ejemplo 4: Deposición directa

El procedimiento de deposición directa desvelado en la presente solicitud es un simple enfoque para ensamblar eficientemente matrices de micropartículas sobre una superficie sólida. Por ejemplo, un volumen de 0,25 microlitros de 1% de disolución de micropartículas (10 mg/ml, que se corresponde con 168.000 perlas) es suficiente para el ensamblaje de matrices sobre un chip de silicio que contiene 4.000 micropocillos con más del 95% de ocupación. Enotras palabras, se necesita aproximadamente 2% de las perlas en suspensión para llenar los micropocillos en lasuperficie. Además, el procedimiento de ensamblaje se lleva a cabo en disolución de agua a pH neutro, a temperaturaambiente. Estas condiciones suaves aseguran que la reactividad de moléculas tales como ADN, ARN, péptidos y proteínas, cuando se inmovilizan sobre las partículas, permanezca invariable en el ensamblaje. De esta forma, las matrices de micropartículas ensambladas usando este procedimiento son compatibles con diversos ensayos bioquímicos. Además, el procedimiento de ensamblaje puede aumentarse del ensamblaje de un único chip alensamblaje a escala de obleas y puede automatizarse para producir grandes números de matrices de micropartículas.

El procedimiento de deposición directa se ilustra adicionalmente por el siguiente ejemplo. Un volumen de 2 microlitros de una disolución de 1% de micropartículas (micropartículas de aproximadamente 3,5 micrómetros dediámetro) se añadieron a 100 microlitros de solución salina tamponada con fosfato (también conocida como PBS: NaCl 150 mM; NaP 100 mM, pH 7,2) para formar ocho matrices de micropartículas sobre chips de silicio (2,5 x 2,5 mm) con

4.000 micropocillos sobre cada chip. El procedimiento fue del siguiente modo:

(1): Se recogieron micropartículas de PBS en un tubo Eppendorf por centrifugación (14.000 g, 1 minuto).Pueden usarse otros medios de recogida.

(5): La disolución de glicerol se aspiró de los sedimentos de partículas.

(6): Los sedimentos se resuspendieron en 1 microlitro de disolución de 5% de glicerol, Tris 10 mM, pH 7,5.

(7): Ocho chips de silicio se colocaron sobre una cinta de doble cara unida a un portaobjeto de microscopio.

(8): Se pipeteó un volumen de 0,1 microlitros de la suspensión de partículas sobre cada uno de los chips en elárea con 4.000 micropocillos.

(9): El aplicador de algodón se lavó con agua de un frasco lavador.

(10): El aplicador de algodón húmedo se secó por soplado durante 30 segundos usando aire presurizado. El flujo de aire elimina el agua en exceso del aplicador del algodón. Además, el aire también sopla algunas fibrasde la superficie, que hace la bola de algodón más acolchada.

(11): Debido a la evaporación de la suspensión de perlas en el aire y la naturaleza higroscópica del glicerol enla disolución, cuando las etapas 9 y 10 se terminaron (1-2 minutos), el contenido de agua en la suspensión de la etapa 8 alcanzó el equilibrio. Debido al aumento de la viscosidad, la gotita se convirtió en una suspensión. Para ensamblar matrices de micropartículas, la suspensión de perlas se agitó suavemente varias veces con lapunta del aplicador de algodón húmedo en un movimiento circular. Las fibras sueltas de la bola de algodóntransportarán las perlas a los micropocillos sobre la superficie.

(12): La ocupación de las partículas de los micropocillos se examinó usando un microscopio fluorescente. Laetapa 11 se repitió en casos en los que la ocupación no fue satisfactoria.

(14): Después de la etapa 13, las matrices de micropartículas ensambladas ya estuvieron listas para ensayos, o para almacenamiento en disolución a 4ºC para uso posterior.

Para ensamblar matrices usando deposición directa es útil usar micropartículas suspendidas en una pequeña cantidad de 5% de glicerol, disolución Tris 10 mM a pH 7,5: El uso de glicerol concentrado (es decir, superior al 5%) puede aumentar la viscosidad de la suspensión de perlas, y la gravedad específica de la disolución en la gotita sobre elchip (etapa 11). A su vez, esto puede comprender la eficiencia del ensamblaje. Aunque la disolución usada para el procedimiento de deposición directa no se limita a Tris 10 mM, pH 7,5, debe observarse que ciertas sales, tales comofosfato de sodio y cloruro sódico, tienden a formar cristales en concentraciones elevadas tales como en la etapa 11. Los cristales de sales no sólo sirven para reducir la ocupación de las micropartículas en los pocillos, sino que también pueden dañar moléculas sobre la superficie durante el ensamblaje.

También se recomienda guardar los chips ensamblados u obleas que comprenden chips en una cámarahúmeda durante un corto periodo de tiempo (por ejemplo 30 min) para permitir que las perlas sedimenten en lascavidades por gravedad antes de usarse en un ensayo. La centrifugación de matrices ensambladas unidas a unportaobjetos de vidrio puede facilitar el procedimiento de sedimentación.

Los parámetros recomendados para la centrifugación son del siguiente modo:

Centrífuga:: Centrífuga Sorvall modelo RT6000B

Rotor:: Cubeta oscilante Sorvall modelo H1000B

Velocidad:: 2000 rpm

Tiempo:: 5 min

Nota de operación:: Poner la centrífuga en modo refrigerado a 10ºC

Poner el freno en modo apagado

Ralentizar la rampa hasta la velocidad de 0 a 2000 en los primeros 2 min seguido decentrifugación a 2000 rpm 5 min adicionales

Pueden usarse equipo y parámetros equivalentes para este procedimiento.

Los medios de inmersión viscosos son útiles para montar los chips sobre el portaobjetos para examen en microscopio. Un ejemplo es usar medios de montaje que contienen cloruro de tetraetilamonio 2,25 M, Tris 37,5 mM, pH8,0, 25% de glicerol.

Ejemplo 5: Ensamblaje en paralelo de matrices de biochips

La presente invención proporciona procedimientos para el ensamblaje en paralelo de matrices de biochips. En esta realización, las matrices de biochips se forman a partir de chips que se originan a partir de diferentes obleas. Un ejemplo no limitante se ilustra por la Figura 9, que muestra cuatro obleas diferentes que dan lugar a cuatro tipos dechips: A, B, C y D. Las filas o columnas de chips pueden combinarse en cualquier geometría para formar una matriz de chips intermedia. En realizaciones preferidas, los chips tienen una forma geométrica regular (por ejemplo, un cuadrado o rectángulo) y la matriz de chips intermedia correspondiente también tiene una forma geométrica regular. Entonces, lasfilas o columnas se sacan de la matriz de chips intermedia, de forma que las filas o columnas comprendan diferentestipos de chips. Dependiendo de la aplicación, las filas o columnas mezcladas pueden contener más de una copia de uncierto tipo de biochip. Las filas y/o columnas mezcladas formadas en estas realizaciones pueden incorporarse en matrices de biochips para bioensayos. En realizaciones preferidas, el equipo de manipulación de chips semiconductoresse usa para ensamblar la matriz de chips intermedia y para extraer las filas o columnas mezcladas. Usando filas ocolumnas largas de chips para formar la matriz de chips intermedia es posible generar simultáneamente muchas filas o columnas mezcladas. De esta forma, es posible producir a gran escala las filas o columnas mezcladas.

Ejemplo 6: Protección de biochips por recubrimiento de sacáridos

Se ensamblaron perlas funcionalizadas sobre un chip usando procedimientos convencionales. Tras elensamblaje, la superficie del chip se limpió, y 2-4 μl de 1% de disolución de trehalosa (alfa-D-glucopiranosil-alfa-Dglucopiranósido, un disacárido formador de vidrio que se produce naturalmente) en agua DI se dispensaron sobre el chip (dimensión superficial: 1,75 x 1,75 mm) y se dejó que se secaran bajo condiciones ambientales. En el secado se formó una película de vidrio sobre el sustrato y las perlas ensambladas se encapsularon. Aunque la película es estableincluso bajo condiciones de alta humedad, la exposición a agua líquida disuelve la película instantemente.

Para evaluar el efecto de la formación de película sobre la actividad de las partículas funcionalizadas, partículas funcionalizadas con neutravidina se ensamblaron sobre biochips. Algunos biochips se pasivaron con disolución de trehalosa como se ha descrito anteriormente y se sometieron a condiciones ambientales normalesmientras que otros biochips no se recubrieron con disolución de trehalosa pero, en su lugar, se guardaron a 4ºC durante 2 semanas. Se encontró que la bioactividad de los chips bio-recubiertos fue similar a la de los biochips no recubiertosmantenidos a 4ºC.

Ejemplo 7: Hidrogeles como agentes multifuncionales en la limpieza, almacenamiento de obleas y recuperación de partículas

Puede emplearse hidrogel de agarosa como agente de desprendimiento para eliminar las partículas de un chipde un modo que les permita recuperarlas después. El hidrogel también puede usarse como material de almacenamientopara prevenir la deshidratación y el polvo de la oblea y partículas.

Las partículas funcionalizadas se ensamblaron sobre una oblea de 6 pulgadas (15,24 cm) constituida por chips.

Para limpiar las partículas que quedan sobre la superficie, una disolución de 1% de agarosa a 55ºC (punto de fusión 95ºC, temperatura de gelación 50ºC) se vertió sobre la oblea, y se mantuvo bajo condiciones ambientales o a 4ºC hastaque se produjo la gelación. Los geles con diferente espesor, de micrómetros a milímetros, pueden producirse usando separadores de diferente espesor. Los separadores proporcionan una barrera en el borde de la oblea para prevenir quela disolución de agarosa se vierta del borde. Las perlas localizadas sobre la superficie de la oblea, en vez de dentro delas cavidades, se incorporarán en el gel. Después de solidificarse completamente la disolución, la película de gel, además de las perlas incorporadas, puede desprenderse fácilmente. Entonces se aplica una corriente de nitrógeno comprimido para secar por soplado inmediatamente la pequeña cantidad de residuo de agua sobre la superficie. De esta forma, la superficie de la oblea sigue estando limpia.

Para evaluar el efecto del procedimiento de desprendimiento sobre la ocupación, además del efecto de lapelícula del gel de agarosa sobre la actividad de las partículas funcionalizadas, las partículas se ensamblaron sobre los chips y los chips se sometieron luego a ensayos de análisis y extensión descodificantes. La Figura 12 mostró que los procedimientos de desprendimiento no disminuyeron la ocupación (es decir, no se retiraron partículas de las cavidades). Se cree que la viscosidad de la disolución de gel desempeña una función en el mantenimiento de las partículas dentro de los orificios. Con mayores viscosidades de la disolución de gel, la tendencia de la disolución a ir a la cavidad antes de la gelación disminuye, por lo que hay menor probabilidad de que la ocupación sea afectada. Un ensayo de SSP sobre chip indicó que la señal y CV fueron comparables (Figura 13ab), que indica que el gel no afecta la sensibilidad del ensayo.

El gel de agarosa es un hidrogel físicamente reticulado termo-reversible. Con el fin de la recuperación de partículas debe usarse agarosa con punto de fusión ultra bajo (p.f. < 50ºC, temperatura de gelación, 8-17ºC). Posteriormente, el gel de agarosa puede volver a fundirse a 50-55ºC, y las partículas incorporadas pueden recuperarse.Las actividades biológicas de biomoléculas sobre las partículas son retenidas bajo estas condiciones.

Tales hidrogeles hidrófilos no sólo pueden usarse como agente de desprendimiento, sino también como agentede almacenamiento para prevenir la deshidratación, polvo o daño físico de partículas/obleas durante el almacenamientoy el transporte.

EJEMPLO 8: Recubrimiento de polímero

Un lote pequeño de chips individuales limpiados [aproximadamente 5 a 20 en número] se colocaron en un recipiente de teflón pequeño (volumen ѝ 5 ml) llenado con 1 ml de una disolución de 1% (1 mg/ml) de clorhidrato de polialilamina (Mw ѝ 15.000) o una disolución de 0,1% de polilisina (Sigma Aldrich). Los chips se incubaron durante 1-2 h con agitación suave a temperatura ambiente. Después se sacaron de la disolución de polímero y se secaron durante ѝ1 h en el intervalo de temperatura de 50-70ºC. Este tratamiento normalmente deja una película de recubrimiento gruesa eirregular del polímero sobre la superficie del chip. Estos chips modificados se usaron para ensamblar perlas usando protocolos convencionales. La etapa de limpieza de la superficie al final del procedimiento de ensamblaje eliminó la mayoría del polímero en exceso junto con las perlas en exceso. La presencia del recubrimiento de polímero mejoró laadhesión de las perlas a la superficie del chip y la retención de las perlas en las cavidades mejoró considerablementedespués de un tratamiento tal.

Ejemplo 9: Empaquetamiento de biochips para formar soportes de múltiples chips para ensayos biológicos y adición a matrices de perlas y procedimientos de preparación de los mismos

El tipo de empaquetamiento elegido para un biochip particular depende de la aplicación. Normalmente, uno o más biochips se fijan sobre un soporte de chips por comodidad. Los soportes pueden ser tan simples como portaobjetosde vidrio, o pueden ser complicados cartuchos con manipulación fluídica, control de temperatura, registro de señales y otras funciones. Los biochips pueden unirse al soporte permanentemente por pegamento o unirse reversiblemente por diversos medios tales como fuerzas magnéticas o mecánicas.

Ejemplo 9A – Un soporte de múltiples chips hecho de un portaobjetos de vidrio: Para preparar el portaobjetos como un soporte, un recubrimiento de teflón se aplica de tal forma que deje orificios o pocillos circulares (es decir, áreas de vidrio sin ninguna cubierta de teflón). Cada pocillo es un círculo con 6,5 mm de diámetro. Uno o más chips pueden unirse a la superficie de vidrio dentro de un pocillo. Un portaobjetos de vidrio típico tiene 25 x 75 mm y 1 mm de espesor, con una matriz 2 x 5 de pocillos. Con tamaños de chips típicos de 1,75 x 1,75 mm, hasta cuatro chips pueden unirse a la superficie de vidrio en cada pocillo. Cada chip en el mismo pocillo puede tener distintos grupos de perlas que se ensamblaron antes de la unión al soporte. Por ejemplo, si cada chip tiene una matriz que contiene 39 tipos de grupos de perlas, un pocillo con 4 chips distintos tendría un total de 4 x 39 = 156 tipos de perlas. Por otra parte, para chips más grandes (por ejemplo, un cuadrado de 4,5 x 4,5 mm), un pocillo entero es ocupado por un único chip. Para lasdimensiones de pocillos descritas en el presente documento, cada pocillo puede contener hasta 40 μl de líquido (normalmente una disolución acuosa). Normalmente, un volumen de 20 μl de disolución de muestra se añade a cadapocillo para reacciones biológicas, de forma que cada chip sea totalmente cubierto por la disolución de muestra. Debido a que el recubrimiento de teflón fuera de los pocillos es hidrófobo, las muestras acuosas no se vierten. El formato de un portaobjetos de soporte puede diseñarse para ajustarse a ciertas aplicaciones. Por ejemplo, una única fila de 8 pocillos sobre un portaobjetos puede usarse para analizar 8 muestras. Además, puede usarse una matriz de 4 x 8 pocillos paraanalizar 32 muestras. Similarmente, pueden disponerse más pocillos (por ejemplo, 96, 384 y 1536) sobre un únicoportaobjetos para analizar más muestras.

Ejemplo 9B - Soporte de chips móvil: En ciertas realizaciones de un soporte de chips móvil, los chips están unidos a un sustrato tal como vidrio, acero inoxidable, materiales plásticos, semiconductores o materiales cerámicos. La unidad de soporte completa es móvil y puede transportarse durante el procesamiento para exponer los chips a diferentes medios de reacción, tales como cámaras de reacción, cámaras de lavado y etapas de lectura de señales (véase la Figura 14 para una realización).

En otras realizaciones, el soporte de chips móvil comprende una cámara o cámaras en las que los chips están

unidos. Alojando los chips dentro del soporte de chips móvil puede minimizarse la contaminación durante el transporte. En ciertas realizaciones, la(s) cámara(s) del soporte de chips móvil también sirven de entorno de procesamiento. Pueden admitirse gases reactivos o disoluciones líquidas para diversos fines, tales como realizar un bioensayo o limpiarlos chips, en el soporte de chips móvil y posteriormente evacuarse, si se desea. Adicionalmente, el soporte de chips

5 móvil puede poseer medios para cambiar las propiedades termodinámicas de la cámara tales como la presión o temperatura de la cámara.

Ejemplo 10: Ensamblaje de matrices codificadas de chips por embaldosado al azar

Puede producirse una multiplicidad de chips por el ensamblaje de matrices codificadas al azar de sondas que se expresan sobre perlas. Cada chip puede incluir una o más matrices de perlas codificadas al azar y puede cortarse de

10 una oblea únicamente identificada. Como se ilustra en la Figura 15 (a, b, c y d), una matriz codificada al azar de chips puede producirse en un procedimiento de embaldosado. Este procedimiento puede facilitarse por una elección de unaforma de chip apropiada con el fin de facilitar el alineamiento y maximizar la disposición de conexión para reducir ladistancia matriz a matriz.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir biochips que comprende:

modelar un sustrato de oblea para formar una pluralidad de regiones de biochip;

trazar dicho sustrato de oblea según regiones delineadas de biochip;

ensamblar matrices de perlas que comprenden diferentes perlas ópticamente codificadas que tienen

biomoléculas unidas a las mismas, siendo dichas biomoléculas identificadas por dicha codificación óptica, en el que dicho ensamblaje se produce sobre una superficie del sustrato de oblea en dicha pluralidad de regiones de biochip; y singular la oblea para formar una pluralidad de biochips idénticamente funcionalizados.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además la etapa de cortar zanjas en dicha obleamodelada a lo largo de límites entre dichas regiones de biochip.
3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el corte se lleva a cabo usando productos químicos húmedos.
4.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el corte se lleva a cabo usando grabado en seco.
5.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha matriz de perlas se protege por un recubrimientoprotector móvil antes de la singulación.
6.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además fabricar estructuras de confinación de perlas en dichas regiones de biochip, comprendiendo las estructuras de confinación de perlas cavidades para confinar el movimiento de perlas.
7.

El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dichas cavidades se definen por fotolitografía y se forman porgrabado con iones reactivos.
8.

El procedimiento de la reivindicación 7, en el que cada cavidad tiene paredes laterales rectas y una profundidad predeterminada.
9.

El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dichas cavidades tienen perfiles de paredes laterales reentrantes, formándose dichos perfiles modificando las cavidades que tienen paredes laterales rectas depositando posteriormente una capa de material que se adhiere a las paredes laterales de forma que se produzcan los perfiles de paredes laterales reentrantes deseados.
10.

El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho material es dióxido de silicio.
11.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las perlas están codificadas por color.
12.

El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la codificación por colores es con colorantes fluorescentes.
13.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además una etapa para evaluar y controlar la calidad de biochips obteniendo ópticamente imágenes de las perlas para garantizar que las cavidades formadas en dichas regiones de biochip sean sustancialmente ocupadas por perlas.
14.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

seleccionar biochips que se originan a partir de una multiplicidad de sustratos de obleas; ensamblar los biochips seleccionados sobre una superficie plana para formar conjuntos de biochips reunidos; y envasar los conjuntos de biochips reunidos.
15.

El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dichos conjuntos de biochips reunidos forman un dispositivo de ensayo.
16.

El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dichos biochips se ensamblan en un área de ensamblajedeslizando dichos biochips desde una multiplicidad de sustratos de obleas presentes sobre un sustrato común.
17.

El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dichos biochips están etiquetados para identificar el sustratode oblea de origen.
18.

El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dichos biochips se ensamblan al azar.
19.

El procedimiento de la reivindicación 17, en el que biochips de una multiplicidad de sustratos de obleas estánpresentes en una suspensión y, en el que dicha suspensión se deposita sobre un sustrato plano.
20.

El procedimiento de la reivindicación 14, en el que biochips de una multiplicidad de sustratos de oblea se recogen y se colocan sobre una superficie plana común.
21.

Un procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además disponer al menos un biochip en una región de confinamiento de líquido sobre un soporte sustrato.
22.

El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho sustrato de soporte comprende una superficie grande

hidrófila y una capa hidrófoba de modelado.
23.

El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha capa hidrófoba modelada sobre dicho sustrato desoporte define regiones de confinamiento de líquido.
24.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

aplicar un recubrimiento movible a dicha matriz de perlas sobre un biochip, teniendo dicho recubrimiento lapropiedad de ser no reactivo con las biomoléculas sobre las superficies de las perlas.
25.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

disponer una alícuota de una suspensión de perlas sobre una superficie de dicho sustrato de oblea y agitarmecánicamente la suspensión de perlas para inducir a que las perlas se sedimenten en dicha área con estructurassuperficiales para confinar perlas para formar dicha matriz de perlas.
26.

El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la etapa de agitar mecánicamente la suspensión de perlas comprende agitar dicha suspensión con un aplicador de algodón húmedo para aumentar la ocupación de perlas endicha área para confinar perlas.
27.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha región de biochip comprende:

una matriz de cavidades para confinar el movimiento de perlas sobre el sustrato;

una capa de dieléctrico modelada para modificar la impedancia de una estructura de electrolito-aislantesemiconductor cuando el sustrato está en contacto con una disolución de perlas, en el que dicha capa de dieléctricomodelada está posicionada de forma que cuando se aplique un campo eléctrico alternante, perlas en dicha disolución de perlas son accionadas para acumularse en dicha matriz de cavidades; y

una capa de pasivación protectora opcional que cubre una superficie del sustrato.
28.

El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicha capa de dieléctrico aislante modelada define unaregión que tiene un perímetro con forma de estrella.
29.

El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicha matriz de cavidades comprende cavidades que tienenformas seleccionadas del grupo que consiste en triángulos, pentágonos, hexágonos y círculos.
30.

El procedimiento de la reivindicación 27 que comprende:

aplicar una disolución de perlas a una superficie del sustrato, comprendiendo dicha superficie dicha capa dedieléctrico modelada; y

ensamblar una matriz de perlas usando LEAPS, en el que un campo eléctrico con una primera frecuencia seaplica para inducir el movimiento de perlas hacia regiones con dieléctrico y se aplica un segundo campo eléctrico defrecuencia para disponer perlas en dicha matriz de cavidades.
31.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas regiones de biochip comprenden al menos una regiónde contención de perlas y, en el que dicho trazado permite romper dichas regiones de biochip para formar biochips que comprenden una o más regiones de biochip.
32.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos una subpoblación de perlas está fijada a unasuperficie de al menos una región de biochip de dicho sustrato y, en el que dicha subpoblación de perlas comprendeuna biomolécula es una sonda seleccionada de una biblioteca de sondas y fijada a una pluralidad de perlas.
33.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas perlas se cargan y el ensamblaje comprende

depositar un primer polímero cargado sobre la superficie del sustrato de semiconductor de la oblea, teniendo dicho primer polímero cargado una carga de signo opuesto al de las perlas cargadas, depositar las perlas sobre lasuperficie del sustrato de semiconductor de la oblea,

y depositar un segundo polímero cargado sobre la superficie del sustrato de semiconductor de la oblea,teniendo dicho segundo polímero cargado una carga de signo opuesto al del primer polímero cargado.
34.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además una etapa de obtener una pluralidad debiochips de una multiplicidad de sustratos de obleas.
35.

El procedimiento de la reivindicación 34, en el que los biochips se producen rompiendo al menos un sustrato de oblea para formar dicha pluralidad de biochips.
36.

El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dichos biochips se obtienen rompiendo dos o más sustratos de obleas que comprenden diferentes poblaciones de perlas.
37.

El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además:

poner en contacto un soporte de chips móvil que comprende una pluralidad de biochips preparados mediante elprocedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 unidos a un sustrato de soporte con una disolución quecomprende al menos un analito diana, dicha disolución contenida en un dispositivo funcional para contener líquido; y

detectar si los analitos diana reaccionan o no con los biochips.
38. El procedimiento de la reivindicación 37 en el que dicho soporte de chips móvil comprende al menos unacámara que contiene al menos un biochip y medios para cambiar las propiedades termodinámicas de dicha al menos una cámara.

5 39. El procedimiento de la reivindicación 37 que comprende múltiples etapas de procesamiento de poner en contacto dicho soporte de chips móvil con diferentes medios de reacción contenidos en una pluralidad de dispositivos funcionales.
40. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en el que dicho dispositivo funcional está

seleccionado del grupo que consiste en una cámara de reacción, una cámara de lavado o una etapa de lectura de 10 señales.