ES2383158T3 - Un nuevo virus de influencia canina y la vacuna correspondiente - Google Patents

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Abstract

Un virus de la influenza del serotipo H3N2 que tiene: (i) una proteína hemaglutinina (HA) representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 10; y (ii) una proteína neuraminidasa (NA) representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12.

Description

Un nuevo virus de influenza canina y la vacuna correspondiente
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a nuevos virus de influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) y A/Canine/Korea/03/07 (H3N2), una composición de vacuna que contiene al menos uno de los virus como ingrediente activo, siendo tales vacunas utilizadas para prevenir o tratar enfermedades que resultan de la infección por el virus de la influenza, y un kit de ensayo para la detección de los virus.
Antecedentes en el estado del arte
La influenza, causada por el virus de la Influenza tipo A de la familia Orthomyxoviridae, es la enfermedad de mayor importancia económica en los seres humanos, cerdos, caballos y aves de corral.
Los virus de la influenza tipo A se clasifican además con base en las características de dos proteínas de superficie conocidas como hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). El virus de influenza tipo A se expresa como una combinación del subtipo H (hemaglutinina) y del subtipo N (neuraminidasa) (por ejemplo, H9N2). Existen 16 diferentes subtipos H y 9 subtipos N, dando como resultado un total de 144 diferentes combinaciones posibles de subtipos H y N de virus de la influenza tipo A.
La influenza es una zoonosis. Los virus de tipo A son los patógenos humanos más virulentos entre los tres tipos de influenza, y causan la enfermedad más grave. Además, son muy propensos a mutar y se transmiten fácilmente de una especie a otra, causando una pandemia. En consecuencia, el estallido de una pandemia de influenza se está convirtiendo en un gran problema que debe ser resuelto. Además, existen diferentes informes de que los virus de influenza están infectando nuevas especies que hasta ahora se creía que eran resistentes a la infección por el virus.
La influenza canina se refiere a nuevas variedades del virus de la influenza tipo A que causan influenza en los caninos. Debido a la falta de exposición previa a este virus, los perros no tienen inmunidad natural a este virus. Por lo tanto, todas las especies y edades son susceptibles a este virus. Los perros con influenza canina pueden sufrir de neumonía aguda, mostrando los síntomas de una tos severa, fiebre alta y rinorrea.
Se ha encontrado que un virus de la influenza altamente contagioso ha sido el causante de las muertes del perro de carreras galgo de una enfermedad respiratoria en una pista de la Florida en 2004. Entonces, ya que se han reportaron brotes del mismo en Texas, Alabama, Arkansas y otros estados en los EE.UU., la influenza canina fue considerada como una nueva epidemia en los perros. Un estudio epidemiológico mostró que el virus, aislado de un perro con la influenza canina, era casi idéntico al virus de la influenza equina H3N8, lo que indica la creación de la influenza canina como resultado de la transmisión de caballos a perros. Existen informes del virus de la influenza equina H3N8 que causa la neumonía hemorrágica en perros de carreras y de aislamiento del virus de la influenza humana H3N8 de los perros. Sin embargo, debe hallarse suficiente evidencia serológica y virológica, para la influenza canina.
Además, se han reportado casos de brote de influenza aviar en los caninos. Se infiere que el mecanismo epidemiológico de la transmisión de la influenza de las aves a los perros tiene dos vías: una es por la alimentación de los perros con aves crudas que portan la influenza, tales como patos, gallinas, etc.; y la otra forma principal de que el virus de la influenza se propague es de los perros infectados a los perros sanos en las gotitas respiratorias al toser y estornudar. Como tal, se infiere que la influenza canina se establece después de que los perros infectados son expuestos a ambientes nuevos y entran en contacto con los perros sanos. Es importante prevenir la influenza canina ya que los virus de la influenza canina pueden provocar una infección secundaria con diferentes grados de mortandad. No existe vacuna disponible para los perros en este momento.
El número de acceso en la base de datos del GenBank AY862607 divulga un gen que codifica para la hemaglutinina del virus de la influenza tipo A virus. El número de acceso en la base de datos del GenBank AY862641 divulga un gen que codifica para la neuraminidasa del virus de la influenza tipo A.
Choi et al., Virology 2005 332 (2): 529 - 537 divulga virus de la influenza aviar en los mercados de aves de corral vivas en Corea y su potencial patógeno
Problema técnico
En relación con la presente invención, la investigación profunda y exhaustiva sobre la producción del virus de la influenza en los caninos, realizada por los presentes inventores con base en los antecedentes anteriormente
mencionados, resultó en el hallazgo de que los virus de la influenza de algunos perros en Corea eran variantes del serotipo A, que se diferencian de los virus de influenza anteriores y, a pesar de pertenecer a un grupo aviar, mostró transmisión entre especies entre aves y perros a través de análisis virológico, serológico, patológico y filogenético. Además, se ha desarrollado con éxito una vacuna altamente estable contra a estos virus.
Solución Técnica
Un objetivo de la presente invención es el de proporcionar un nuevo virus de la influenza canina del serotipo H3N2.
Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína constituyente del virus de la influenza.
Aún un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una composición de vacuna contra el nuevo virus.
Es todavía un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un kit de análisis para la detección del virus de la influenza del serotipo H3N2, que incluye al virus de la presente invención o a una proteína HA y NA del mismo.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia completa de aminoácidos codificada por un gen que codifica para NA del virus de influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) en comparación con aquellos de los virus de la influenza A/Dove/Korea/S11/03 (H3N2), A/Duck/Korea/S7/03 (H3N2) y A/Chicken/Korea/S6/03 (H3N2).
La Figura 2 muestra la secuencia completa de aminoácidos codificada por un gen que codifica para HA del virus de la influenza A/Equine/Jilin/1/1989 (H3N8) en comparación con aquellos de los virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Dove/Corea/S11/03 (H3N2), A/Duck/Korea/S7/03 (H3N2) y A/Chicken/Korea/S6/03 (H3N2).
La Figura 3 muestra una secuencia parcial de aminoácidos codificada por un gen que codifica para HA del virus de la influenza A/Equine/Jilin/1/1989 (H3N8) en comparación con los virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Canine/Korea/02/07 (H3N2), A/Canine/Korea/03/07 (H3N2), A/Dove/Korea/S11/03 (H3N2), A/Duck/Korea/S7/03 (H3N2) y A/Chicken/Korea/S6/03 (H3N2).
La Figura 4 muestra un árbol filogenético para el gen que codifica para HA, enraizado con el virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2).
La Figura 5 muestra un árbol filogenético para el gen que codifica para NA, enraizado con el virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2).
La Figura 6 es un gráfico que muestra los cambios en la temperatura corporal, el título de los anticuerpos y la producción de la progenie viral durante una semana en animales inmunizados con la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) y los animales no inmunizados con la misma.
La Figura 7 muestra lesiones histopatológicas en los órganos y los pulmones de los animales inmunizados con virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) (grupo inmunizado B, D y F) y los animales no inmunizados con la misma (control, A y C): (A) el revestimiento epitelial de la columna pseudoestratificada en un órgano normal del grupo de control 9 días después de la inoculación agresiva (amplificación 400 veces), (B) órgano necrótico (n), metaplasia escamosa (s), e hiperplasia epitelial e inflamación crónica sobre tejido conectivo (C) en el grupo inmunizado 9 días después de la inoculación agresiva (amplificación 400 veces), (C) alvéolos normales del grupo de control 3 días después de la inoculación agresiva (amplificación 200 veces), (D) bronquitis necrotizante difusa severa y bronquiolitis purulenta en el lumen bronquial del grupo inmunizado 3 días después del grupo agresivo (amplificación 100 veces); (E) bronquiolitis necrotizante severa en el grupo inmunizado 6 días después de la inoculación agresiva (llena de células necrotizantes separadas y neutrófilos, e inflamación crónica leve o moderada observada alrededor de los bronquiolos (amplificación 200 veces), (F) alveolitis necrotizante severa en el grupo inmunizado 9 días después de inoculación agresiva (infiltración necrotizante de las células en el conducto alveolar (ad) y en los alvéolos (a) (amplificación 200 veces) teñido con H & E).
Mejor modo de realizar la invención
De acuerdo con un aspecto de la misma, la presente invención pertenece a nuevos virus de la influenza canina serotipo H3N2.
Los nuevos virus de influenza canina serotipo H3N2 de acuerdo con la presente invención tienen una proteína hemaglutinina (HA) representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 10 y una proteína neuraminidasa (NA) representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
Cuando se compara con el virus de la influenza equina H3N8 previamente conocido, se encontró que el virus de la influenza canina de la presente invención tenía un cambio muy característico en la secuencia de aminoácidos, como el analizado para la secuencia completa de aminoácidos de la neuraminidasa (NA) (FIG. 1) y la secuencia completa de aminoácidos de la hemaglutinina (HA) (FIG. 2). En particular, las secuencias de aminoácidos de la HA de A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) y A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) se alteran en forma característica para tener N (Asparagina) en la posición 27, I (Isoleucina) en la posición 127, T (Treonina) en la posición 142, T (Treonina) en la posición 176, N (Asparagina) en la posición 188, S (Serina) en la posición 209, I (Isoleucina) en la posición 212 e I (Isoleucina) en la posición 252 (FIG. 3).
Además, los nuevos virus de la influenza canina de acuerdo con la presente invención pueden incluir además una proteína seleccionada entre una proteína no estructural (NS), codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 3, una proteína matriz (M) codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 4, una nucleoproteína (NP) codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 5, una polimerasa (PA), codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 6, una proteína polimerasa 2 (PB2) codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 7, una proteína polimerasa 1 (PB1) codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 8, y combinaciones de las mismas.
Tal como se utiliza aquí para hemaglutinina o neuraminidasa, el término "homología" pretende hacer referencia a la similitud con una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre. En general, un homólogo de la proteína tiene el mismo sitio activo que el prototipo de la misma. La comparación de la homología entre las secuencias de aminoácidos se puede se puede hacer a simple vista o mediante un software. La homología entre dos o más secuencias de aminoácidos puede ser calculada y expresada como porcentajes utilizando software disponible comercialmente.
Los virus de la influenza canina de la presente invención comprenden A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) y A/Canine/Korea/03/07 (H3N2).
Las proteínas del virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) muestran una homología del 95,5 a 98,9% con aquellas del virus de la influenza aviar. Por ejemplo, el virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) de la presente invención comparte la homología más alta con A/Dove/Korea/S11/03 (H3N2) con respecto a los genes que codifican para HA (hemaglutinina) y NA (neuraminidasa) y con A/Chicken/Nanchang/7-010/2000 (H3N6) en relación con un gen que codifica para NS (no estructural). Como para los genes de PB1 (proteína básica de la polimerasa 1), PB2, PA (polimerasa), NP (nucleoproteína) y M (matriz), muestran homologías altas con los virus de la influenza aviar que se encuentran en Hong Kong, Japón y China. El virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) fue depositado en el Instituto Coreano de Investigación de Biociencia y Biotecnología, ubicado en (Mokpo?) el 19 de septiembre de 2007, con el número de acceso 11205BP de la KCTC.
El virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) tiene un gen que codifica para la hemaglutinina (HA) que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1 y el gen que codifica para la neuraminidasa (NA) que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 2. Se da la secuencia completa de nucleótidos de HA, junto con la secuencia completa de aminoácidos de la misma, en la SEQ ID NO. 9, mientras que la secuencia completa de nucleótidos de NA se da, junto con la secuencia completa de aminoácidos de la misma, en la SEQ ID NO. 11. Además, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 3 está contenida en el gen que codifica para NS, el nucleótido de la SEQ ID NO. 4 está contenido en el gen que codifica para M, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 5 está contenida en el gen que codifica para NP, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 6 está contenida en el gen que codifica para PA, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 7 está contenida en el gen que codifica para PB2, y la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 8 está contenida en el gen que codifica para PB1.
El virus de la influenza A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) de la presente invención tiene un gen que codifica para HA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 13 y un gen que codifica para NA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 14. Se encontró que este virus era sustancialmente el mismo que el de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), ya que se analizó que las secuencias de nucleótidos para HA y NA y las secuencias de aminoácidos comparten 98% de homología entre los dos virus. El virus de la influenza A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) fue depositado en la Colección de Cultivos Tipo de Corea (KCTC) del Instituto Coreano de Investigación de Biociencia y Biotecnología, ubicado en Eoeun-dong, Yusung Gu, Daejeon City, Corea del Sur el 19 de septiembre de 2007, con el número de acceso 11206BP de la KCTC.
El virus de la influenza A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) tiene un gen que codifica para HA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 1 y un gen que codifica para NA que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 16. Se identificó que este virus es sustancialmente el mismo que el virus de la influenza A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) y el virus de la influenza A/Canine/Korea/03/07 (H3N2), ya que se analizó que las secuencias de nucleótidos para HA y NA y las secuencias de aminoácidos comparten un 99% de homología entre el virus de la influenza A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) y el virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) y un 98% de homología entre el virus de la influenza A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) y el virus de la influenza A/Canine/Korea/02/07 (H3N2). El virus de la influenza A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) fue depositado en la Colección de Cultivos Tipo de Corea (KCTC) del Instituto Coreano de Investigación de Biociencia y Biotecnología, ubicado en Eoeun-dong, Yusung Gu, Daejeon City, Corea del Sur el 19 de septiembre de 2007, con el número de acceso 11207BP de la KCTC.
Los virus de la influenza canina de acuerdo con la presente invención, aislados de la cavidad nasal de los perros coreanos, tienen la relación filogenética mostrada en los diagramas filogenéticos de las FIGS. 4 y 5. Los árboles filogenéticos de las FIGS. 4 y 5, ambos basados en el virus de la influenza A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), se construyeron para el gen que codifica para HA y el gen que codifica para NA. Como se observa en estos árboles filogenéticos de los genes que codifican para HA y NA, los virus de la influenza de la presente invención, junto con los virus de la influenza aviar, forman un grupo que es diferente del grupo al cual pertenecen los virus H3N8 aislados de caballos y de perros.
Cuando se utilizan para infectar perros, los virus de la influenza canina de acuerdo con la presente invención mostraron patogenicidad, causando fiebre y neumonía, y por lo tanto son virus epidémicos en los perros en Corea. Cuando se los administra con vacunas contra los virus de la influenza canina de la presente invención, se encontró que la mayor parte de los perros tienen inmunidad a los virus y para suprimir la propagación y la generación de virus a través de os mismos.
De acuerdo con otro aspecto de la misma, la presente invención pertenece a un gen que codifica una proteína hemaglutinina (HA) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 10. Preferiblemente, el gen tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 9.
Además, la presente invención se relaciona con un gen que codifica una proteína neuraminidasa (NA) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12. Preferiblemente, el gen tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 11.
De acuerdo con un aspecto adicional del mismo, la presente invención se relaciona con una composición de vacuna que puede proporcionar inmunidad para los virus de la influenza canina.
Preferiblemente, la composición de vacuna de la presente invención contiene al virus de la influenza canina o a un antígeno del mismo como un ingrediente activo. El virus de la influenza canina para su uso en la composición de la vacuna se selecciona de entre A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Canine/Korea/02/07 (H3N2), A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) y combinaciones de los mismos.
El primer antígeno útil en la presente invención es una proteína hemaglutinina (HA) que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 10.
El segundo antígeno útil en la presente invención es una proteína neuraminidasa (NA) que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
La vacuna de acuerdo con la presente invención puede incluir una vacuna viva atenuada o muerta, una vacuna de subunidades, una vacuna sintética, y una vacuna modificada por ingeniería genética, con preferencia por una vacuna viva debido a la capacidad de la misma para inducir una respuesta inmune efectiva.
Tal como se usa aquí, el término "vacuna viva" se refiere a una vacuna preparada a partir de un virus que ha sido atenuado, pero todavía se puede replicar en las células del organismo huésped. El término "atenuación", como se usa aquí, se pretende que signifique reducción artificial de la toxicidad de los agentes patógenos mediante la mutación de un gen implicado en el metabolismo esencial del patógeno de tal manera que pierda patogenicidad, pero retenga antigenicidad. Generalmente, la atenuación se logra a través de radiación ultravioleta, tratamiento químico, o por medio de un subcultivo secuencial de orden superior in vitro. Una alteración genética explícita, tal como la supresión de un nucleótido específico en una secuencia conocida para proporcionar toxicidad o la inserción de un nucleótido en un genoma viral, también puede resultar en atenuación.
Tal como se usa aquí, el término "vacuna muerta", también llamado vacuna inactivada, se refiere a una suspensión de virus muerto utilizado como un antígeno para producir inmunidad. Los ejemplos de vacunas muertas incluyen vacunas de virus enteros y vacunas de virus fraccionados. La vacuna de virus muertos puede ser fácilmente producida usando métodos conocidos. Por ejemplo, se puede obtener una vacuna de un virus entero por tratamiento de un virus con formalina. Las vacunas de virus fraccionados se preparan a partir de envolturas de virus después de tratamiento con éter.
El término "vacuna de subunidades" se refiere a una vacuna compuesta de proteína HA y de proteína NA que se separa del organismo virulento por extracción. Es menos probable que cause reacciones adversas que la vacuna del virus entero.
Por el término "vacuna sintética" se entiende una vacuna que consiste principalmente de la proteína HA y de la proteína NA modificadas genéticamente o sintetizadas químicamente.
Una vacuna modificada por medio de ingeniería genética puede estar libre de un gen específico que es responsable de la patogenicidad o pueden contener un gen modificado.
Además, la vacuna contra la influenza de la presente invención puede ser utilizada en combinación con otros organismos inactivados o antígenos para preparar una vacuna mixta o compleja contra diferentes enfermedades incluida la influenza. El término "vacuna mixta", como se usa aquí, pretende referirse a una vacuna preparada a partir de una mezcla viral del virus de la influenza canina de la presente invención y al menos un virus diferente. El término "vacuna compleja" significa una vacuna preparada a partir de un virus y de bacterias. Por ejemplo, los virus de la influenza canina de la presente invención pueden mezclarse o combinarse con virus de la parainfluenza canina, virus del moquillo canino, adenovirus canino, y / o Bordetella bronchiseptica.
La vacuna contra el virus de la influenza canina de acuerdo con la presente invención puede ser preparada utilizando un método que comprende: (a) inyectar el virus de la influenza canina de la presente invención en un huevo embrionado y proliferar el virus en él; (b) tratar un fluido corioalantoico del huevo embrionado con formalina PBL (beta-propiolactona) o BEI (etilenimina binaria); y recolectar el virus inactivado del fluido corioalantoico tratado químicamente.
En la etapa (a), se inyecta el virus de la influenza canina en un huevo embrionado de 9 -11 días de edad y se incuba a 30 - 40º C durante 24 a 72 horas. En la etapa (b), se obtiene un fluido corioalantoico a partir del huevo incubado utilizando un método convencional, se lo trató con 0,005 - 0,2% (v / p) de formalina, BEI o BPL y se incubó a una temperatura baja para inactivar el virus. En la etapa (c), se recogió el virus inactivado a partir del fluido corioalantoico tratados con formalina, BEI o BPL por centrifugación o por filtración. Entonces, se absorbió el virus sobre gel de hidróxido de aluminio. Este método puede comprender técnicas bien conocidas, o puede ser modificado en versiones más fácilmente realizables.
Además, la composición de la vacuna de la presente invención puede incluir además un medio, un adyuvante, y / o un excipiente. Se puede utilizar como medio agua destilada o solución salina fisiológica. Los ejemplos del adyuvante útil en la composición de la vacuna incluyen un adyuvante completo o incompleto de Freund, gel de hidróxido de aluminio, aceite vegetal o mineral, etc. Los ejemplos del excipiente incluyen fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, y sulfato de potasio y aluminio, pero no se limita a ellos. En la práctica, pueden aplicarse todos los materiales conocidos para uso en la preparación de la vacuna por parte de aquellos expertos en la técnica a la composición de la vacuna de la presente invención.
Preferiblemente, la composición de la vacuna de la presente invención puede incluir al virus de la influenza canina en una cantidad de 25 HAU (unidad de hemaglutinación). Cuando se usa el virus de la influenza canina en una cantidad menor a 25 HAU, la vacuna no puede inducir la producción de anticuerpos en forma efectiva. Por otro lado, una cantidad superior a 25 HAU puede ser antieconómica.
La composición de la vacuna de acuerdo con la presente invención se puede preparar en forma de dosificaciones orales o en formas de dosificación no orales. Preferible son formas de dosificación no orales que pueden ser administradas a través de vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, o epidural.
La composición de la vacuna de acuerdo con la presente invención puede ser aplicada a todos los individuos que son susceptibles a A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) o A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) y actúan como huéspedes, incluidos los humanos, animales domésticos, aves de corral, y aves, tales como perros, cerdos, pollos, patos, pavos, etc.
De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la presente invención se relaciona con composiciones para la vacuna para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el virus de la influenza, en individuos que se encuentran en riesgo.
Tal como se usa aquí, el término "enfermedad relacionada con el virus de la influenza" se refiere a una enfermedad que resulta de la infección con el virus de la influenza. Los ejemplos del mismo incluyen la sinusitis paranasal, el asma espasmódica, la timpanitis, la fibrosis quística, la bronquitis, la neumonía, la diarrea, etc. (Pitkäranta y Hayden, 1998. Ann. Med.), pero no se limitan a estos.
El término "individuos", tal como se usa aquí, pretende referirse a todos los vertebrados, incluyendo los seres humanos, que ya están infectadas con, o pueden ser infectados con los virus de la influenza. Por medio de la administración con la composición de la vacuna de la presente invención, las enfermedades pueden ser efectivamente prevenidas y tratadas. Por ejemplo, los humanos infectados con diferentes subtipos o variantes de los virus de la influenza pueden ser tratados con la composición de la vacuna de la presente invención. Además, los pollos o los cerdos pueden ser inmunizados con la composición de la vacuna con el fin de tomar precauciones contra la influenza. La composición de la vacuna de la presente invención puede ser administrada en combinación con terapias convencionales contra las enfermedades relacionadas con el virus de la influenza.
Tal como se usa aquí, el término "prevención" significa todas las acciones para inhibir la infección por el virus de la influenza o retrasar el brote de la influenza a través de la administración de la composición de la vacuna de acuerdo con la presente invención. El término "tratamiento", significa todas las acciones por medio de las cuales los síntomas que resultan de la infección por el virus de la influenza se alivian o tienden a mejorar a través de la administración de la composición de la vacuna de acuerdo con la presente invención.
En una cantidad farmacéuticamente efectiva, se administra la composición de la vacuna de acuerdo con la presente invención. El término "cantidad farmacéuticamente efectiva", como se usa aquí, pretende referirse a una cantidad que es útil para tratar las enfermedades relacionadas con el virus de la influenza en una proporción razonable de beneficio con respecto al peligro para la terapia con el medicamento. Las dosis del compuesto de la presente invención dependen del tipo y de la severidad de las enfermedades, de la actividad del fármaco, de la sensibilidad al fármaco, de la frecuencia y del periodo de tiempo que dura su administración, de la vía de administración, de la tasa de eliminación, y de factores bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los fármacos administrados en forma simultánea, etc. La composición de la vacuna de la presente invención puede ser utilizada como una medicina única o en combinación con otros medicamentos administrados al mismo tiempo o en forma secuencial, y puede ser administrada en dosis únicas o en dosis múltiples. Teniendo en cuenta los factores mencionados anteriormente, es importante determinar la dosis que provoca máximos efectos terapéuticos sin efectos secundarios indeseables, lo cual es fácil para aquellos capacitados en la técnica.
De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la presente invención se relaciona con un kit de ensayo para la detección del virus de la influenza serotipo H3N2, que comprende al virus de la influenza de la presente invención o a una proteína HA y NA del mismo.
A través de una reacción del complejo antígeno-anticuerpo, el virus de la influenza de la presente invención o una proteína HA y NA del mismo son útiles en la detección específica de los virus de la influenza, así como en la exterminación de los virus de la influenza en células infectadas con el mismo.
Este kit de ensayo comprende herramientas/reactivos utilizados generalmente en el campo inmunológico, así como al virus de la influenza de la presente invención. Los ejemplos de las herramientas/reactivos incluyen portadores adecuados, marcadores que producen señales detectables, solubilizantes, detergentes, amortiguadores, estabilizantes, etc., pero no se limitan a ellos. Cuando los marcadores son enzimas, el kit puede comprender además sustratos para analizar la actividad enzimática y terminadores de la reacción. Los ejemplos de portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, portadores solubles, tales como amortiguadores fisiológicamente aceptables bien conocidos en la técnica, por ejemplo, PBS, portadores insolubles, tales como poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, poliacrilonitrilo, resina de flúor, dextrano para entrecruzamiento, polisacárido, etc., micropartículas magnéticas, tales como látex recubierto con metal, papel, vidrio, metal, agarosa, y combinaciones de los mismos.
En cuanto a un ensayo para la formación de complejos antígeno-anticuerpo, los ejemplos del mismo incluyen tinción inmunohistoquímica, un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), transferencias tipo Western, un ensayo de inmunoprecipitación, un ensayo de inmunodifusión, un ensayo de fijación del complemento, FACS, y un chip de proteína, pero no se limita a ellos.
Los marcadores para permitir el análisis cualitativo o cuantitativo del complejo antígeno-anticuerpo se ejemplifican por medio de enzimas, compuestos fluorescentes, ligandos, compuestos luminiscentes, micropartículas, moléculas redox y radioisótopos, pero no se limitan a estos. Los ejemplos de enzimas útiles como marcadores detectables incluyen ß-glucuronidasa, ß-D-glucosidasa, ß-D-galactosidasa, ureasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, acetilcolina esterasa, glucosa oxidasa, una combinación de hexoquinasa y GDPasa, ARNasa, una combinación de glucosa oxidasa y luciferasa, fosfofructoquinasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa, fosfoenolpiruvato descarboxilasa, y ß-lactamasa, pero no se limita a ellas. Los ejemplos ilustrativos, no limitativos de los compuestos fluorescentes útiles en la presente invención incluyen fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina. Un derivado de biotina puede ser utilizado como el ligando, pero nolimita el alcance de la presente invención. Éster de acridinio, luciferina y luciferasa son útiles como luminiscentes, pero esta lista no pretende limitar el alcance de la presente invención. Micropartículas ilustrativas, no limitantes incluyen oro coloidal, látex revestido, etc. Como moléculas redox útiles en la presente invención, están ferroceno, complejo de rutenio, viológeno, quinona, ion Ti, ion Cs, diimida, 1,4-benzoquinona, hidroquinona, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [Ru(bpy)3]2+, y [Mo(CN)8]4-, que se presentan únicamente para efectos ilustrativos, pero no se pretende que limiten el alcance de la presente invención. Los ejemplos de radioisótopos útiles en la presente invención incluyen 3H, 14C, 32P, 35S, 35Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, y 186Re, pero no se limitan a ellos.
Ejemplos
Una mejor comprensión de la presente invención puede ser obtenida a través de los siguientes ejemplos, que se exponen como ilustración, pero no deben interpretarse como limitantes de la presente invención.
Ejemplo 1: Muestreo del espécimen y aislamiento del virus
Los especímenes se tomaron de los perros que fueron tratados en hospitales veterinarios ubicados en Kyeonggi-Do, Corea: Un perro Schnauzer miniatura de cinco años sufría de rinorrea durante tres días y de estornudos durante dos días y luego se recuperó de la gripe; un perro Cocker Spaniel de tres años de edad que sufría de fiebre, tos, rinorrea y falta de apetito y que finalmente murió; un perro de Yorkshire Terrier y dos perros Jindo que sufrían de tos severa, fiebre y rinorrea y que murieron 2 días después de la hospitalización.
Se identificó que todos estos animales estaban infectados con el virus de la influenza tipo A según el análisis realizado con un kit rápido, adquirido de Anigen, y RT-PCR. No se detectaron otros patógenos en los perros.
Las muestras (secreciones nasales) de los animales fueron inoculadas en huevos de 11 días de edad, después de lo cual se muestreó fluido corioalantoico de los mismos. Se encontró que el fluido añadió eritrocitos de pollo. Los virus aislados de los animales fueron identificados serológicamente como un serotipo H3N2. Estos virus fueron llamados A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), A/Canine/Korea/02/07 (H3N2) y A/Canine/Korea/03/07 (H3N2) y fueron depositados en la Colección Coreana para Cultivos Tipo (KCTC) del Instituto de Investigación de Corea de Biociencia y Biotecnología, ubicado en Eoeun-dong, Yusung Gu, ciudad de Daejeon, Corea del Sur el 19 de septiembre de 2007, con los números de acceso KCTC 11205BP, KCTC 11206BP y KCTC 11207BP, respectivamente.
Ejemplo 2: Características genéticas de los virus aislados.
Las características genéticas de los virus aislados en el ejemplo 1 se determinaron mediante análisis genéticos. Se utilizó como molde ARN total del virus de la influenza aislado del fluido corioalantoico utilizando Trizol LS para la RT-PCR utilizando iniciadores hexámeros al azar, seguido por PCR utilizando los iniciadores que se muestran en la Tabla 1. Las secuencias de los iniciadores para amplificar los genes H3, N2, PBL, PB2, PA, NP, M y NS fueron diseñadas utilizando un programa Primer 3 modificado (Instituto Whitehead/Centro MT para Investigación del Genoma).
Se mezcló ADNc (2 pl) con una mezcla de reactivos {2,5 μl, amortiguador Taq ADN polimerasa 10X, MgCl2 1,5 mM, los dNTP (2,5 mM / μl) 2,0 μl, 1 μl de cada iniciador (10 pmol), 1 μl de Taq ADN polimerasa (Promega, EUA))} y el se ajustó el volumen final a 25 μl con agua destilada para preparar una mezcla de PCR. Se inició la PCR por medio de la desnaturalización a 94º C durante 10 min, y se realizó con 32 ciclos de desnaturalización a 96º C durante 30 segundos, hibridación a 53º C durante 30 segundos, y extensión a 72° C durante 2 minutos, seguido por extensión a 72º C durante 10 min. Se terminó la PCR a 4º C. El producto de la PCR así obtenido se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio. Los datos de la secuencia así obtenidos se analizaron con el software Bioedit.
Tabla 1
Secuencias del iniciador para la PCR
Genes Objetivo
Secuencia del iniciador (5' - 3') Productos de la PCR
H3
CARATTGARGTGACHAATGC (SEQ ID NO 15) 720 pb
GGTGCATCTGAYCTCATTA (SEQ ID NO 16)
N2
TGTTCCGTTTCATTTGGGAA (SEQ ID NO 17) 477 pb
CCAACAAGCCCTGAACACAC (SEQ ID NO 18)
PB1
AAAGTGCCAGCACAAAATGC (SEQ ID NO 19) 764 pb
TTCTCACAGATGCTCCTCGC (SEQ ID NO 20)
PB2
TCATGGAGGTCGTTTTTCCA (SEQ ID NO 21) 661 pb
TGAATCAGCCTTCTGGTTGC (SEQ ID NO 22)
PA
GAAGTGAGCGCCAAAATTGA (SEQ ID NO 23) 477 pb
CTCTGGCTCATCGCTGTCAT (SEQ ID NO 24)
NP
ACGGTCTGCACTCATCCTGA (SEQ ID NO 25) 602 pb
GCCCCTGGAAAGACACATCT (SEQ ID NO 26)
M
AACATTCCATGGGGCTAAGG (SEQ ID NO 27) 456 pb
CGGCAATAACGAGAGGATCA (SEQ ID NO 28)
NS
GACTGGTTCATGCTCATGCC (SEQ ID NO 29) 844 pb
GAGAGAGTGAAGGTCCCCCA (SEQ ID NO 30)
Se secuenciaron las bases de ocho segmentos de genes de A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) y se compararon con los genes del GenBank (SEQ ID NOS. 1 a 12). Se encontró que los virus de acuerdo con la presente invención tienen 5 95,5 a 98,9% de homología con los virus de la influenza aviar previamente conocidos (Tabla 2). Particularmente, los virus de acuerdo con la presente invención compartían la mayor homología con S11, que se aisló en Corea, en términos de los genes que codifican para HA y NA, y con una cepa aislada de pollos en China en términos del gen que codifica para NS. En cuanto a los genes que codifican para PBL, PB2, PA, NP y M, se detectaron grandes homologías entre los virus de la presente invención y los virus de la influenza aviar aislados en Hong Kong, Japón y
10 China. Se encontró que los genes que codifican para HA y NA tienen 98% - 99% de homología entre los virus de la presente invención, A/Canine/Korea/01/07, los A/Canine/Korea/02/07 y / A/Canine/Korea/03 07, lo que indica que son sustancialmente los mismos.
Tabla 2
Comparación de la homología genética de los virus de la influenza canina
Virus
Gen Virus altamente homólogos Tipo de Virus de la Influenza del Segmento de ARN Homología (%) Nos. de registro
A/Canino/Korea/ 01/07
HA A/Chicken/Korea/ S6/03 (H3N2) Aviar 96,6 AY862607
NA
A/Dove/Korea/ S11/03 (H3N2) Aviar 97,4 AY862644
PB1
A/Duck/Yangzhou/ 02/2005 (H8N4) Aviar 98,9 EF061124
PB2
A/Duck/Zhejiang/ 11/2000 (H5N1) Aviar 97,6 A585523
PA
A/Duck/Hokkaido/ 120/2001 (H6N2) Aviar 95,9 AB286878
NP
A/Duck/Hong Kong/ Y439/97 (H9N2) Aviar 95,5 AF156406
M
A/Duck/Jiang Xi/ 1850/2005 (H5N2) Aviar 97,5 EF597295
NS
A/Chicken/Nanchang/ 7-010/2000 (H3N6) Aviar 97,5 AT180648
Ejemplo 3: Filogenia de los virus aislados
Se determinó la posición de A/Canine/Korea/01/07 en un árbol filogenético usando un algoritmo de alineamiento
5 Clustal y el software MEGALIGN (DNASTAR, Madison, WI). Desde un punto de vista de los genes que codifican para HA y NA, se identificó que el virus de la presente invención pertenecía a un grupo diferente del grupo de los virus H3N8 previamente aislados de caballos y perros, y mostraron una relación genética muy estrecha con los virus H3N2 aislados en Corea (FIGS. 4 y 5).
Ejemplo 4: Ensayo para determinar la patogenicidad de los virus aislados
10 A fin de examinar la patogenicidad de los mismos, se inoculó A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) en perros.
Diez sabuesos de 10 semanas de edad se dividieron en un grupo de prueba de 7 perros y un grupo control de 3 perros. A los siete sabuesos en el grupo de prueba se les administró por vía intranasal y oral el virus aislado (2 ml) con un título de HA de 1:64 (106,9 EID50/0,1 ml), mientras que los tres sabuesos en el grupo control se les administró por vía intranasal y oral PBS libre de patógenos (solución salina de amortiguador de fosfato, 2 ml), seguido por un 15 seguimiento de los síntomas clínicos durante 7 días. La descarga de virus a través de las excreciones y de rinorrea se controló utilizando la RT-PCR durante 10 días a partir del día de la inoculación. Se llevó a cabo un estudio serológico mediante un ELISA competitivo (Animal Genetics Inc., Corea) con una NP recombinante (nucleoproteína) que sirve como antígeno. Se analizaron también las muestras de suero con el fin de detectar los anticuerpos con la
NP recombinante, según lo recomendado por la OIE. Dos sabuesos del grupo de prueba y un sabueso del grupo de control fueron sometidos uno por uno a eutanasia con 1 ml de xilazina a los 3, 6 y 9 días después de la inoculación y se llevó a cabo la autopsia a fin de observar las lesiones patológicas.
Del día 2 al día 7 después de la inoculación, se observaron los sabuesos que sufrían de síntomas clínicos, incluyendo los estornudos y rinorrea. La temperatura rectal se mantuvo a 39º C en los sabuesos del grupo de control durante todo el experimento, pero aumentó a 40,14º C en promedio en los sabuesos del grupo de prueba 24 h después de la inoculación (FIG. 6).
Las pruebas serológicas fueron negativas para los virus en todos los perros del experimento antes de la inoculación, y se mantuvieron negativas en los sabuesos en el grupo de prueba durante el experimento. Los ELISA mostraron un porcentaje de inhibición mucho mayor en el grupo de prueba que en el grupo de control 6 días después de la inoculación, lo que indica que se produjeron anticuerpos. En forma muy interesante, se encontró que los sabuesos inoculados tenían un título de HI de 1:80 8 días después de la inoculación.
Se encontró el virus en la secreción nasal de los sabuesos inoculados durante 6 días después de la inoculación, pero no se detectó en la excreción. Típicamente, el virus de la influenza canina comenzó a ser descargado de los perros 1 día después de la infección y alcanzó un pico con un título de 106,0 EID50/0,1 ml 4 días después de la infección.
Se encontró que las lesiones histopatológicas se limitaban a los pulmones. Histológicamente, se descubrieron graves lesiones necróticas en las vías respiratorias altas (bronquios) y las vías respiratorias inferiores (bronquiolos y alveolos). La bronquiolitis y la bronquitis, aunque algo diferente en la extensión de las mismas, se produjeron en todos los sabuesos inoculados (figura 7).
En consecuencia, se identificó que el virus aislado era patógeno en los perros, causando un aumento de la temperatura corporal y la neumonía. Además, se encontró que los virus fueron descargados durante 6 días.
Ejemplo 5: Preparación de la vacuna
El virus de la influenza canina recientemente aislado A/Canine/Korea/01/07 (H3N2) fue sembrado en las membranas corioalantoicas de huevos embrionados de 10 días de edad. Tres días más tarde, se recolectó una muestra de fluido corioalantoico como carga viral. A esta carga viral se le añadió formalina al 0,2%, seguido por incubación a temperatura ambiente durante 24 horas para la inactivación de la misma. Se determinó que la carga viral se inactivaba cuando no se detectaba progenie viral después de que la carga viral había sido nuevamente inoculada en los huevos embrionados. Se concentró la carga viral inactivada en 25 HAU o superior. Se mezcló esta carga en una relación de 7:3 con gel de hidróxido de aluminio por medio de agitación a 10.000 rpm durante 10 min. Después de una prueba negativa para los virus, se utilizó la mezcla como vacuna.
Ejemplo 6: Inoculación agresiva después de la vacunación
La vacuna preparada fue inyectada por vía subcutánea en una dosis de 0,5 ml en diez perros sabuesos, cada uno de 10 semanas de edad, y adicionalmente inyectada en la misma forma que tres semanas más tarde. Dos semanas después de la inyección secundaria, se inocularon agresivamente los sabuesos con una dosis de 2 ml a través de una vía oral o intranasal, con el virus aislado A/Canine/Korea/01/07 (H3N2), que tiene un título de HA de 1:64 (106,9 EID50/0,1 ml). Como control, se inocularon tres sabuesos con PBS antes de la inoculación agresiva. Se controlaron los animales experimentales por medio de la temperatura corporal, la producción de virus, los síntomas clínicos y el título de anticuerpos durante el experimento.
Incluso después de la inoculación, los sabuesos vacunados no mostraron cambios corporales, no descargaron progenie viral, y no mostraron síntomas clínicos. En contraste, el control aumentó la temperatura corporal una semana después de la inoculación (Tabla 3). La PCR mostró que se descargó la progenie viral en los tres sabuesos en el grupo control, pero no fue descargada por ninguno de ellos 6 días después de la inoculación (Tabla 4). Además, se observó que el grupo control sufría de síntomas clínicos, incluyendo rinorrea y tos, tal como la tos de las perreras o la tos productora de húmeda. En cuanto al título de anticuerpos, comienza a aumentar con respecto al anticuerpo de ELISA para la nucleoproteína y el anticuerpo HI para hemaglutinina durante el período de tiempo experimental que se inicia 7 días después de la inoculación agresiva en los sabuesos vacunados (Tabla 5). Sin embargo, el control comenzó a aumentar en el título de anticuerpos con nucleoproteína y hemaglutinina que se inicia 7 días después de la inoculación agresiva.
Por lo tanto, se encontró que los sabuesos vacunados tienen una defensa contra la inoculación agresiva, lo que indica que la composición de la vacuna de la presente invención es útil como una vacuna contra el virus de la influenza.
Tabla 3
Temperatura corporal en animales vacunados y no vacunados después de inoculación agresiva (refuerzo el día 21, inoculación agresiva el día 35)
Días después de la vacunación
Grupo vacunado Control (no vacunado)
0
37,8 ± 0,1 38,2 ± 0,2
7
37,6 ± 0,2 37,8 ± 0,1
14
38,4 ± 0,1 38,0 ± 0,2
21
38,2 ± 0,1 37,6 ± 0,1
28
38,1 ± 0,2 38,3 ± 0,1
35
38,3 ± 0,2 37,6 ± 0,1
36
40,2 ± 0,3 38,3 ± 0,2
37
40,6 ± 0,1 38,0 ± 0,3
38
39,84 ± 0,2 38,0 ± 0,2
39
39,3 ± 0,1 37,6 ± 0,1
40
38,9 ± 0,2 38,3 ± 0,1
41
38,7 ± 0,1 37,6 ± 0,1
42
38,6 ± 0,1 38,0 ± 0,1
49
38,0 ± 0,1 38,0 ± 0,1
* No. de positivos de la PCR / No. de PCR Analizados
Tabla 4 (continuación)
Descarga de virus de animales vacunados y no vacunados después de inoculación agresiva (refuerzo el día 21, inoculación agresiva el día 35)
Días después de la vacunación
Grupo vacunado Control (no vacunado)
0
0/10* 0/3
7
0/10 0/3
14
0/10 0/3
21
0/10 0/3
28
0/10 0/3
Descarga de virus de animales vacunados y no vacunados después de inoculación agresiva (refuerzo el día 21, inoculación agresiva el día 35)
Días después de la vacunación
Grupo vacunado Control (no vacunado)
35
0/10 0/3
36
0/10 3/3
37
0/10 3/3
38
0/10 3/3
39
0/10 3/3
40
0/10 2/3
41
0/10 0/3
42
0/10 0/3
49
0/10 0/3
* Valor positivo de PI
Tabla 5
Título de anticuerpos en animales vacunados y no vacunados después de inoculación agresiva (refuerzo el día 21, inoculación agresiva el día 35)
Días después de la vacunación
Grupo vacunado Control (no vacunado)
ELISA*
HI ELISA HI
0
14 < 10 12 < 10
7
89 10 20 < 10
14
87 40 14 < 10
21
96 40 19 < 10
28
89 80 26 < 10
35
94 80 18 < 10
42
92 80 97 80
49
98 160 92 160
Aplicación industrial
Como se ha descrito hasta ahora, la presente invención proporciona nuevos virus de la influenza canina y una vacuna contra los mismos. Capaz de inducir una inmunidad efectiva contra el virus de la influenza canina, la vacuna es útil en la prevención y el tratamiento de las enfermedades relacionadas con el virus de la influenza en perros y en los individuos infectados en forma secundaria por los perros.
<110> Animal Genetics, Inc.
<120> Un nuevo virus de influenza canina y la vacuna correspondiente 5 <160> 32
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 722
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen parcial que codifica para HA de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 1
15 <210> 2
<211> 477
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Gen parcial que codifica para NA de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 2
<210> 3
<211> 240
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen parcial que codifica para NS de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 3
10 <210> 4
<211> 406
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Gen parcial que codifica para M de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 4 <210> 5
<211> 582
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen parcial que codifica para NP de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 5
<210> 6
<211> 438
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Gen parcial que codifica para PA de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 6 <210> 7
<211> 592
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen parcial que codifica para PB2 de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 7
10 <210> 8
<211> 603
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Gen parcial que codifica para PB1 de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 8 <210> 9
<211> 1701
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen completo que codifica para HA de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<220>
<221> CDS
10 <222> (1)..(1698)
<223> Aminoácidos de HA de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 9
<210> 10
<211> 566
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<400> 10
<210> 11
<211> 1410
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen completo que codifica para NA de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<220>
<221> CDS
10 <222> (1)..(1407)
<223> Aminoácidos de NA de A/Canine/Korea/01/07(H3N2)
<400> 11
<210> 12
<211> 469
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<400> 12
<210> 13
<211> 722
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen parcial que codifica para HA de A/Canine/Korea/02/07(H3N2)
<400> 13 <210> 14
<211> 477
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Gen parcial que codifica para NA de A/Canine/Korea/02/07(H3N2)
<400> 14
<210> 15
<211> 722
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Gen parcial que codifica para HA de A/Canine/Korea/03/07(H3N2)
<400> 15
5 <210> 16
<211> 477
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Gen parcial que codifica para NA de A/Canine/Korea/03/07(H3N2)
<400> 16
<210> 17
<211> 20
15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para H3
<400> 17 carattgarg tgachaatgc
<210> 18
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para H3
<400> 18 ggtgcatctg ayctcatta
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para N2
<400> 19 tgttccgttt catttgggaa
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para N2
<400> 20 ccaacaagcc ctgaacacac
<210> 21
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para PB1
<400> 21 aaagtgccag cacaaaatgc
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para PB1
<400> 22 ttctcacaga tgctcctcgc
<210> 23
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para PB2
<400> 23 tcatggaggt cgtttttcca
<210> 24
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para PB2
<400> 24
tgaatcagcc ttctggttgc
<210> 25
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para PA
<400> 25 gaagtgagcg ccaaaattga
<210> 26
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para PA
<400> 26 ctctggctca tcgctgtcat
<210> 27
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para NP
<400> 27 acggtctgca ctcatcctga
<210> 28
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para NP
<400> 28 gcccctggaa agacacatct
<210> 29
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para M
<400> 29 aacattccat ggggctaagg
<210> 30
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para M
<400> 30 cggcaataac gagaggatca
<210> 31
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para NS
<400> 31 gactggttca tgctcatgcc
<210> 32
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> iniciador para NS
<400> 32 gagagagtga aggtccccca 20

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un virus de la influenza del serotipo H3N2 que tiene:
    (i)
    una proteína hemaglutinina (HA) representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 10; y
    (ii)
    una proteína neuraminidasa (NA) representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12.
  2. 2.
    El virus de la influenza del serotipo H3N2 de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una proteína seleccionada entre una proteína estructural (NS) codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 3, una proteína matriz (M) codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 4, una nucleoproteína (NP) codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 5, una polimerasa (PA) codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 6, una proteína polimerasa 2 básica (PB2) codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 7, una proteína polimerasa 1 básica (PB1) codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 8, y combinaciones de las mismas.
  3. 3.
    El virus de la influenza del serotipo H3N2 de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene el número de acceso KCTC 11205BP.
  4. 4.
    El virus de la influenza del serotipo H3N2 de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene el número de acceso KCTC 11206BP.
  5. 5.
    El virus de la influenza del serotipo H3N2 de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene el número de acceso KCTC 11207BP.
  6. 6.
    Una secuencia de nucleótidos, que codifica una secuencia de aminoácidos de la hemaglutinina (HA) de la reivindicación 1.
  7. 7.
    La secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 6, representada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 9.
  8. 8.
    Una secuencia de nucleótidos, que codifica una secuencia de aminoácidos de la neuraminidasa (NA) de la reivindicación 1.
  9. 9.
    Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 8, representada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 11.
  10. 10.
    Una composición de una vacuna contra el virus de la influenza, que contiene como ingrediente activo al virus de una de las reivindicaciones 1 a 5 o a una proteína HA y NA de la misma.
  11. 11.
    La composición de la vacuna contra el virus de la influenza 10, para ser administrada a perros.
  12. 12.
    La composición de la vacuna contra el virus de la influenza 10, que comprende además un gel de hidróxido de aluminio o aceite como adyuvante.
  13. 13.
    La composición de la vacuna contra el virus de la influenza 10, que comprende además al menos un patógeno diferente del ingrediente activo.
  14. 14.
    La composición de la vacuna contra el virus de la influenza 10, en donde la composición de la vacuna es una vacuna viva atenuada.
  15. 15.
    La composición de la vacuna contra el virus de la influenza 10, que comprende al virus de la influenza en una cantidad de 25 HAU o superior.
  16. 16.
    La composición de la vacuna contra el virus de la influenza 10, en donde el ingrediente activo está contenido en una cantidad del 90% o superior.
  17. 17.
    Un virus de la influenza del serotipo H3N2 de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades resultantes de la infección con el virus de la influenza.
  18. 18.
    Un kit de ensayo para detectar una virus de la influenza del serotipo H3N2, que comprende al virus de una de las reivindicaciones 1 a 5 o una proteína HA y NA del mismo.
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