ES2375801T3

ES2375801T3 - Col�?geno y �?cido hialurónico reticulado y sus usos.

Info

Publication number: ES2375801T3
Application number: ES08837704T
Authority: ES
Inventors: Jacqueline Anne Schroeder; Gregory S. Dapper; Kenneth C. Olson
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2007-10-09
Filing date: 2008-10-08
Publication date: 2012-03-06
Anticipated expiration: 2028-10-08
Also published as: WO2009048930A2; WO2009048930A3; US8703118B2; US20140227361A1; CA2702588A1; EP2404624A1; DK2211924T3; BRPI0817855A2; US20090093755A1; AU2008310957A1; EP2211924B1; US8697044B2; ATE536192T1; EP2211924A2; AU2008310957B2; US20120164098A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de un implante, que comprende: poner en contacto ácido hialurónico (AH) con un agente reticulante, para permitir la reticulación del AH por medio del agente reticulante, formando, de esta manera, una primera composición; poner en contacto la primera composición con colágeno, para permitir la reticulación del colágeno por medio del agente reticulante, formando, de esta manera, una segunda composición, poner en contacto la segunda composición con una solución de AH para permitir la reticulación del AH en la solución por medio del agente reticulante, produciendo, de esta manera, un implante, en el que el agente reticulante es, preferentemente, divinil sulfona (VS) o 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE), por lo cual una concentración de la VS para formar la primera composición es, preferentemente, de 500-10.000 ppm, más preferentemente 5.000 ppm y, opcionalmente, comprende también poner en contacto la segunda composición con un agente anestésico local, tal como lidocaína, por lo cual la concentración de lidocaína en el implante es, preferentemente, de 1-7 mg/ml y, más preferentemente, de 2,7-3,3 mg/ml.

Description

Colágeno y ácido hialurónico reticulado y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a composiciones y a procedimientos para la producción de materiales para el aumento de tejidos blandos. Más específicamente, la invención proporciona un implante de colágeno (Cgn) y ácido hialurónico (AH) reticulado de composición y estabilidad ("persistencia") mejoradas, para aumentar los tejidos blandos en mamíferos.

Antecedentes de la invención

Tanto el colágeno como el AH se encuentran naturalmente en la piel. Aunque las relaciones colágeno : AH varían con la edad, la exposición al sol, el tipo de piel y otros factores, la consecución de una correspondencia con la composición de la piel podría tener un efecto positivo sobre la duración y la biocompatibilidad de un relleno dérmico.

El documento WO02/17713 divulga una matriz bicapa realizada en colágeno y ácido hialurónico, en la que las capas están reticuladas químicamente con un agente reticulante seleccionado de entre divinil sulfona. La matriz es usada como andamiaje para biomateriales.

El documento US2004/127699 se refiere a un procedimiento para la producción de derivados de ácido hialurónico (AH) reticulados con otro polímero, en particular múltiples derivados de ácido hialurónico reticulado dobles.

Milena REHAKOVA et al., divulga materiales compuestos de colágeno y ácido hialurónico y su modificación mediante reticulación química usando glioxal.

El documento WO2007/070617 divulga un implante bioabsorbible y un procedimiento para la producción de dicho implante que comprende un material compuesto que incluye un derivado de ácido hialurónico y al menos un miembro del grupo que consiste en una célula, un factor de crecimiento celular y un factor de diferenciación celular.

El documento WO2008/157608 se refiere a un procedimiento de preparación de un andamiaje compuesto así como el andamiaje correspondiente que comprende un material compuesto poroso, multi-capa.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a implantes de colágeno y AH reticulado para aumentar el tejido blando en mamíferos, según se divulga en la reivindicación 14, y a un procedimiento para la preparación de un implante, según se divulga en la reivindicación 1. El procedimiento comprende poner en contacto AH con un agente reticulante para permitir la reticulación del AH por medio del agente reticulante, formando, de esta manera, una primera composición; poner en contacto la primera composición con colágeno para permitir la reticulación del colágeno por medio del agente reticulante, formando, de esta manera, una segunda composición; y poniendo en contacto la segunda composición con una solución de AH para permitir la reticulación del AH en la solución por medio del agente reticulante, produciendo, de esta manera, un implante.

Muchos agentes reticulantes pueden ser usados en un procedimiento de la invención, incluyendo, y no limitándose a, divinil sulfona (VS), 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE), radiación ultravioleta, radiación gamma, radiación de haz de electrones y glutaraldehído. Por ejemplo, cuando se usa VS como agente reticulante, la concentración de la VS para la formación de la primera composición puede ser de 500-10.000 ppm y, preferentemente, de aproximadamente 5.000 ppm. La reticulación del AH con VS, para formar la primera composición, puede ocurrir a aproximadamente 50-60ºC.

Cuando se practica el procedimiento de la invención, la concentración y el pH del AH para formar la primera composición puede ser de aproximadamente 30 mg/ml o superior, y 9-12, respectivamente. En algunas realizaciones, el colágeno para poner en contacto con la primera composición es soluble; en algunas realizaciones, la concentración de colágeno para poner en contacto con la primera composición es de 10-50 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 30 mg/ml; en algunas realizaciones, el pH del colágeno para poner en contacto con la primera composición es de 2-3; en algunas realizaciones, el colágeno para poner en contacto con la primera composición es colágeno del tipo I, II, III, IV o V, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el pH de la segunda composición es de 6-8 y, preferentemente, de aproximadamente 7. La concentración de la solución de AH para poner en contacto con la segunda composición puede ser de 3-15% peso/volumen y, preferentemente, de 5-10% peso/volumen. La reticulación del AH en la solución por medio del agente reticulante puede ocurrir a un pH de 7,0-7,6.

Un procedimiento de la invención puede comprender, además, poner en contacto la segunda composición con un

agente anestésico local, tal como lidocaína. La concentración de lidocaína puede ser de 1-7 mg/ml y, preferentemente, de 2,7-3,3 mg/ml, en el implante.

Un implante, preparado según un procedimiento descrito anteriormente, se encuentra dentro de la invención. En particular, la presente invención proporciona un implante que comprende un núcleo de AH reticulado por medio de un agente reticulante, una capa intermedia de colágeno que rodea y que está reticulada, por medio del agente reticulante, al núcleo, y una capa exterior de AH que rodea y que está reticulada por el agente reticulante a la capa de colágeno. Tal como se ha indicado anteriormente, el agente reticulante puede ser VS, BDDE, radiación ultravioleta, radiación gamma, radiación de haz de electrones o glutaraldehído. El implante puede comprender, además, aproximadamente 10 ppm o menos de agente reticulante no reticulado al AH o al colágeno. En algunas realizaciones, el 5-50% de los grupos amina en el colágeno son modificados por el agente reticulante. En algunas realizaciones, el módulo de elasticidad del implante es mayor de aproximadamente 0,002 kg/cm2 o el implante puede tener una fuerza de extrusión a través de una aguja de calibre 24 o mayor de aproximadamente 50 Newtons

o menor.

La invención se refiere también a un implante preparado por medio del procedimiento descrito anteriormente, en el que el agente reticulante es VS o BDDE, en el que la concentración de la VS, para formar la primera composición, es de 500-10.000 ppm, preferentemente de aproximadamente 5.000 ppm, y en el que la reticulación del AH por medio de la VS, para formar la primera composición, ocurre a 50-60ºC. En algunas realizaciones del implante preparado mediante el procedimiento descrito anteriormente, la concentración del AH para formar la primera composición es de aproximadamente 30 mg/ml o superior y el pH del AH para formar la primera composición es de 9-12. En algunas realizaciones del implante preparado mediante el procedimiento descrito anteriormente, el colágeno para poner en contacto con la primera composición es soluble y la concentración del colágeno para poner en contacto con la primera composición es de 10-50 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 30 mg/ml. En algunas realizaciones del implante preparado mediante el procedimiento descrito anteriormente, el pH del colágeno para poner en contacto con la primera composición es de 2-3 y el colágeno para poner en contacto con la primera composición es colágeno del tipo I, II, III, IV o V, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones del implante preparado por el procedimiento descrito anteriormente, el pH de la segunda composición es de 6-8, preferentemente de aproximadamente 7. En algunas realizaciones del implante preparado por el procedimiento descrito anteriormente, la concentración de la solución de AH para poner en contacto con la segunda composición es de 3-15% peso/volumen, preferentemente de 5-10% peso/volumen. En algunas realizaciones del implante preparado por el procedimiento descrito anteriormente, la reticulación del AH en la solución, por medio del agente reticulante, ocurre a un pH de 7,0-7,6.

La presente invención proporciona también un producto envasado. El producto comprende una jeringa y una aguja. La jeringa es cargada con un implante de la invención.

Lo indicado anteriormente y otras características de la presente invención y la manera para su obtención y su uso se harán más evidente, y se entenderán mejor, con referencia a la descripción siguiente, tomada en conjunción con los dibujos adjuntos. Los dibujos representan sólo realizaciones típicas de la invención y, por lo tanto, no limitan su alcance.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra un procedimiento representativo para la preparación de HAVSCgn.

La Figura 2 muestra el módulo de elasticidad y de viscosidad durante un barrido de frecuencias de HAVSCgn.

La Figura 3 representa los efectos la degradación por hialuronidasa (enzimática) de HAVSCgn en relación con CaptiqueTM sobre el módulo de elasticidad.

Las Figuras 4A y 4B son gráficos de FT-IR (transformada de Fourier - infrarrojo) para HACgn no reticulado y HAVSCgn reticulado, respectivamente.

La Figura 5 muestra la persistencia de HAVSCgn en relación con CaptiqueTM y CosmoPlast®.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que el AH reticulado a una alta concentración y recubierto, a continuación, con colágeno y AH, produce un implante de larga duración. Más específicamente, la invención se refiere al AH y colágeno reticulado usando VS para formular un corrector de arrugas con una correspondencia fisiológica, al que se hace referencia como HAVSCgn.

En general, en primer lugar, el AH es reticulado a una alta concentración. A continuación, el agente reticulante residual se hace reaccionar con colágeno, seguido por la adición de una solución de AH para una utilización

completa del agente reticulante y un efecto de laminación. El gel resultante tiene un alto módulo de elasticidad y, aún así, puede ser extruido a través de una aguja de calibre fino, con una fuerza mínima. La combinación de colágeno y AH imita los componentes naturales de la piel y es una composición ideal para aumentar el tejido blando en los mamíferos. El gel de AH y colágeno de la presente invención tiene propiedades reológicas y de estabilidad de volumen o de persistencia mejoradas en comparación con una formulación de AH de un solo componente, tal como CaptiqueTM, o una formulación de un solo componente de colágeno, tal como CosmoPlast®.

El procedimiento de la presente invención implica obtener AH, ya sea en forma sólida o líquida, y reticular el AH como una solución concentrada, seguido por la adición de colágeno y, finalmente, más AH. El colágeno de la presente invención se deriva principalmente de materiales de origen mamífero, tal como tendón o dermis bovina o porcina, o tejido de placenta humana. También se puede usar colágeno producido a partir de un cultivo celular de fibroblasto humano, o colágeno producido, de manera recombinante, expresado a partir de una línea celular.

Primero, se añade una base (por ejemplo, NaOH) a AH, para ajustar el pH a 9-12. Se añade un agente reticulante al AH y la reacción se deja continuar. A continuación, se añade colágeno (pH 2-3). El colágeno reacciona con el agente reticulante para unirse, de manera covalente, a AH. El agente reticulante es consumido ligeramente en la reticulación del colágeno. Se añade una solución de AH como un lubricante y depurador de agente reticulante. La formulación final tiene un núcleo de AH reticulado con el colágeno ligeramente reticulado y que rodea el núcleo de AH. El AH soluble adicional consume el agente reticulante residual y añade un beneficio de lubricación. Generalmente, puede usarse cualquier agente reticulante que induce enlaces covalentes que unen las moléculas de colágeno y AH. Los ejemplos de dichos agentes reticulantes incluyen, pero no están limitados a, VS, BDDE, radiación ultravioleta, radiación gamma, radiación con haz de electrones y glutaraldehído.

La reticulación de AH y colágeno con VS se proporciona, en la presente memoria, como un ejemplo. Se añade una base a AH (30 mg/ml o superior) para elevar el pH a 9-12. Se añade VS (500-10.000 ppm, y preferentemente 5.000 ppm). Se permite que la reticulación de AH por VS prosiga a una temperatura elevada de 50ºC a 60ºC, durante aproximadamente 1 hora. El AH reticulado es enfriado y se añade colágeno ácido (10-50 mg/ml, y preferentemente 30 mg/ml, pH 2-3) para llevar el pH a -7 (por ejemplo, 6-8). Se deja que la reacción prosiga durante la noche a temperatura ambiente. Se añade AH soluble (3-15% peso/volumen y, preferentemente, 5-10% peso/volumen). Opcionalmente, puede añadirse lidocaína para una concentración final de lidocaína de 2,7-3,3 mg/ml. Se deja que la reacción prosiga durante 8 horas - 2 semanas, a temperatura ambiente y pH 7,0-7,6. El AH depurador no sólo disminuye la cantidad de VS residual, sino que funciona también como un agente de recubrimiento, que a su vez reduce la fuerza de extrusión del implante resultante (HAVSCgn). El HAVSCgn contiene poco VS residual (10 ppm

o menos) y tiene una fuerza de extrusión baja (por ejemplo, 50 Newtons o menos) a través de una aguja de calibre fino (> 24 Gaue). El 5-50% de grupos amina en el colágeno son modificados por VS (es decir, pérdida de grupos amina libres) en el implante.

La HAVSCgn es una formulación con un alto módulo de elasticidad (> 200 Pa), aún así con una meseta de extrusión baja. El módulo elástico (G') puede ser determinado con un reómetro Bohlin, midiendo la relación de la tensión a la deformación multiplicada por el coseno del ángulo de fase. La fuerza de extrusión puede ser determinada tal como se indica a continuación: El implante es introducido en una jeringa universal de 1 cc. A continuación, una aguja (por ejemplo, una aguja 30G1/2, Becton Dickinson Precision Glide) es encajada, a continuación, en la jeringa con una conexión Luer. La jeringa, llenada con el implante y equipada con la aguja, es colocada en el elemento de sujeción de un dispositivo Instron, Modelo 4201, y el émbolo es desplazado a una velocidad constante de 50 mm/minuto. A continuación, la meseta de fuerza es calculada e indicada en Newtons.

Un implante de colágeno-AH reticulado de la invención puede ser homogeneizado y tamizado adicionalmente forzando la formulación a través de un tamiz con un tamaño de poro definido. La formulación puede ser introducida también en jeringas equipadas con una aguja de calibre #25 o mayor, para su inyección. En el caso de las formulaciones usadas para el aumento dérmico, el término "inyectable" significa que la formulación puede ser dispensada desde jeringas que tienen un diámetro tan pequeño como #25, bajo una presión manual normal con una meseta de extrusión suave.

Las etapas descritas anteriormente para la preparación de colágeno-AH reticulado y la introducción del implante en jeringas son realizadas, preferentemente, en condiciones estériles, usando materiales estériles.

La invención proporciona un aumento de tejido blando inyectable que imita los componentes naturales de la piel. La composición de la presente invención puede ser inyectada por vía intradérmica o subcutánea para aumentar el tejido blando y para reparar o corregir anomalías congénitas, defectos adquiridos o defectos cosméticos. Los ejemplos de dichas afecciones incluyen anomalías congénitas, tales como microsomía hemifacial, hipoplasia malar y cigomática, hipoplasia mamaria unilateral, pectus excavatum, agenesia pectoral (anomalía de Polonia), e insuficiencia velofaríngea secundaria para reparación del paladar hendido o paladar hendido submucoso (como un implante retrofaríngeo); defectos adquiridos (post-traumáticos, post quirúrgicos o post infecciosos), tales como cicatrices deprimidas, atrofia subcutánea (por ejemplo, secundaria a lupus eritematoso discoide), lesiones 4 5

queratósicas, enoftalmia en el ojo no nucleado (también síndrome de surco superior), acné en la cara , esclerodermia lineal con atrofia subcutánea, deformidad nasal de tipo “silla de montar”, enfermedad de Romberg y parálisis unilateral de las cuerdas vocales; y defectos estéticos, como las líneas glabelares, pliegues nasolabiales profundos, arrugas geográficas circum-orales, mejillas hundidas e hipoplasia mamaria.

La presente invención proporciona un relleno de AH-colágeno para aumentar y rellenar defectos y huecos de tejidos blandos con un material que da volumen a los tejidos blandos. El colágeno-AH reticulado de la invención es particularmente útil para una profunda corrección y remodelación de la dermis. La composición y la persistencia superiores hacen que sea ideal para las áreas que son difíciles de corregir y en las que un bolo biocompatible puede proporcionar una resistencia mecánica al cuerpo.

Ejemplo

Preparación de HA VSCgn

Se obtuvo AH de Lifecore Biomedical, Chaska, Minnesota. Se añadió una base (NaOH) a AH para ajustar el pH a un intervalo de 9-12.

A continuación, se añadió VS (TCI AMERICA, 9211 N. Harborgate Street, Portland, OR 97203, EE.UU.), químicamente puro, a AH para permitir que la reacción de reticulación prosiga a una temperatura elevada entre 50ºC y 60ºC. El AH reticulado fue enfriado y se añadió colágeno.

Colágeno humano, de tipo I, digerido con pepsina, purificado, fue obtenido de Inamed Biomaterials, 48490 Milmont Drive, Fremont, CA 94538. Fue precipitado aumentando el pH a 7,0-7,6 con una solución de fosfato de sodio y, a continuación, centrifugando a 17.000 x g durante 5-7 minutos. El sobrenadante fue decantado asépticamente de la botella de centrifugación. El pelet de colágeno fue succionado asépticamente en un recipiente de homogeneización y fue homogeneizado. Se mezclaron 0,05 M de tampón HCl y WFI (agua para inyección) filtrada, estéril, con el homogeneizado, para reducir el pH final a 2-3.

El colágeno fue añadido al AH reticulado mientras el colágeno era soluble. La VS fue consumida y, como resultado, el colágeno fue reticulado ligeramente al colágeno y al AH. AH adicional, en una solución, fue añadido al final para consumir la VS residual y para añadir un beneficio de lubricación. La formulación final tenía un núcleo de AH reticulado con colágeno ligeramente reticulado con el núcleo de AH. El AH adicional fue reticulado a colágeno y AH para mejorar la formulación. La VS residual después de la adición de la solución de AH libre, según fue detectada mediante HPLC en fase reversa, se indica en la Tabla 1.

Tabla 1. Consumo de divinil sulfona

Formulación: Divinil sulfona residual

30 mg/ml AH + 5.000 ppm VS: 1.776 ppm

30 mg/ml AH + 5.000 ppm VS + 5% solución AH: 18 ppm

30 mg/ml AH + 5.000 ppm VS + 10% solución AH: 0 ppm

La VS reacciona, principalmente, con los grupos amina sobre el colágeno y los grupos hidroxilo en el AH. El porcentaje de grupos amina modificados en el colágeno fue determinado mediante un ensayo de amina libre usando TNBS (sulfonato de trinitrobenceno). El colágeno no modificado fue utilizado como control. La formulación de HAVSCgn, 2674-1, tenía aproximadamente el 15% de los grupos amina modificados.

La reacción de VS con el AH prosigue, principalmente, con los grupos hidroxilo de AH y los grupos vinilo de VS y resulta en la formación de un enlace éter.

R - OH + CH2 = CH - SO2 - CH = CH2 • (2)

R - O - CH2 - CH2 - SO2 - CH2 - CH2 - O - R

La Figura 4 muestra espectros FT-IR obtenidos para HACgn no reticulado (una mezcla de AH no reticulado y colágeno no reticulado) y la formulación HAVSCgn. Los picos de absorción representativos en ambas muestras fueron asignados a las aminas primarias en 3.500-3.300 cm-1 y alcohol o grupos OH en 3.650-3.200 cm-1, que se superpone al enlace éter en 1.300 cm-1. El HAVSCgn reticulado tenía un pico de éter, mientras que la muestra no reticulada no tenía un pico en 1.300 cm-1.

Reología de HAVSCgn

La Figura 2 muestra un ensayo de barrido de frecuencia usando un reómetro Bohlin para determinar el módulo de elasticidad (G') y el módulo de viscosidad (G'') de HAVSCgn. El módulo de elasticidad refleja la elasticidad de un

5 material, e indica la fuerza y la estabilidad de la estructura tridimensional de HAVSCgn. La estabilidad de la estructura tridimensional se refiere a la capacidad de HAVSCgn para resistir la deformación, para mantener una forma tridimensional. Cuanto más alto sea el valor de G' a una frecuencia dada, más elástica será la HAVSCgn. El módulo de viscosidad refleja la viscosidad de un material. Cuanto más alto sea el valor de G'' a una frecuencia dada, más viscosa será la composición de gel de HAVSCgn.

10 Resistencia a enzima

El efecto de la hialuronidasa sobre el módulo de elasticidad fue estudiado para HAVSCgn y CaptiqueTM (una formulación de AH reticulado con VS). La hialuronidasa fue obtenida de Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701, número de catálogo L5002592). Los implantes fueron pesados a aproximadamente 2 ± 1 gramos. Se diluyeron 5 mg de hialuronidasa con 10 ml de solución PBS a -50 U/ml. Se

15 añadieron 0,020 ml de solución de hialuronidasa a cada muestra de implante de 2 gramos. Las muestras fueron incubadas a 37ºC durante 30 minutos, 1,5 horas, 3 horas y 5 horas. El módulo de elasticidad y el ángulo de fase fueron ensayados a 5 Hz, usando un reómetro Bohlin CVO-100 a 20ºC, con una separación de 500 mm y una placa paralela (PP20). Tal como se muestra en la Figura 3, HAVSCgn era más resistente a la hialuronidasa que CaptiqueTM.

20 Biocompatibilidad

La biocompatibilidad de HAVSCgn fue ensayada y demostró ser biocompatible. La seguridad de los HAVSCgn fue evaluada a través de un estudio de citotoxicidad y de múltiples estudios de implantación subcutánea en conejos. El estudio de citotoxicidad fue realizado usando el procedimiento de elución de la norma ISO. Tal como se muestra en la Tabla 2, HAVSCgn no causó lisis celular o toxicidad.

25 Tabla 2 Citotoxicidad de HAVSCgn

Ensayo: Puntuación

Monocapa confluente: 0

Redondeo porcentual: 0

Porcentaje de células sin gránulos intracitoplásmicos: 0

Lisis porcentual: 0

Grado: 0

Reactividad: Ninguna

Se realizó un estudio de implantación subcutánea en ratas para determinar la persistencia de HAVSCgn. Como parte del estudio de implantación en ratas, se realizó una evaluación macroscópica del sitio de implantación. No hubo formación de cápsulas o una reacción adversa para todos los puntos temporales estudiados (Tabla 3).

Tabla 3 Evaluaciones microscópicas y macroscópicas de implantación subcutánea en ratas

Punto temporal: HAVSCgn

4 semanas: Sin formación de cápsulas ni reacción adversa. No irritante.

9 semanas: Sin formación de cápsulas ni reacción adversa. No irritante.

13 semanas: Sin formación de cápsulas ni reacción adversa. No irritante.

24 semanas: Sin formación de cápsulas ni reacción adversa. No irritante.

Efectividad

Para evaluar la efectividad, la persistencia de HAVSCgn (2674-1) en relación con CosmoPlast® y CaptiqueTM fue evaluada usando recuperación de peso húmedo en el modelo subcutáneo en ratas, que se considera que es una buena medida de la capacidad de un implante para mantener la corrección de arrugas (McPherson et al., 1988, Development and Biochemical Characterization of Injectable Collagen, J Dermatol Surg Oncol 14, Suppl 1). Tal como se muestra en la Figura 5, HAVSCgn tenía una mayor recuperación de peso húmedo que CosmoPlast® y CaptiqueTM después de la implantación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la preparación de un implante, que comprende:

poner en contacto ácido hialurónico (AH) con un agente reticulante, para permitir la reticulación del AH por medio del agente reticulante, formando, de esta manera, una primera composición;

poner en contacto la primera composición con colágeno, para permitir la reticulación del colágeno por medio del agente reticulante, formando, de esta manera, una segunda composición,

poner en contacto la segunda composición con una solución de AH para permitir la reticulación del AH en la solución por medio del agente reticulante, produciendo, de esta manera, un implante, en el que el agente reticulante es, preferentemente, divinil sulfona (VS) o 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE), por lo cual una concentración de la VS para formar la primera composición es, preferentemente, de 500-10.000 ppm, más preferentemente 5.000 ppm y, opcionalmente, comprende también poner en contacto la segunda composición con un agente anestésico local, tal como lidocaína, por lo cual la concentración de lidocaína en el implante es, preferentemente, de 1-7 mg/ml y, más preferentemente, de 2,7-3,3 mg/ml.
2.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la reticulación del AH por la VS, para formar la primera composición, ocurre a 50-60ºC.
3.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración del AH, para formar la primera composición, es de 30 mg/ml o superior y/o la concentración de la solución de AH, para poner en contacto con la segunda composición, es de 3-15% peso/volumen, preferentemente, de 5-10% peso/volumen.
4.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el pH del AH, para formar la primera composición, es de 9-12 y/o el pH de la segunda composición es de 6-8, preferentemente de 7.
5.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el colágeno, para poner en contacto con la primera composición, es soluble.
6.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración del colágeno, para poner en contacto con la primera composición, es de 10-50 mg/ml, preferentemente de 30 mg/ml.
7.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el pH del colágeno, para poner en contacto con la primera composición, es de 2-3.
8.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el colágeno, para poner en contacto con la primera composición, es colágeno de tipo I, II, III, IV o V, o una combinación de los mismos.
9.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la reticulación del AH en la solución por el agente reticulante ocurre a un pH de 7,0-7,6.
10.

Implante preparado según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11.

Producto envasado, que comprende una jeringa y una aguja, en el que la jeringa es cargada con el implante según la reivindicación 10.
12.

Implante según la reivindicación 10, para su uso en el rellenado de huecos y defectos y para incrementar el volumen de tejido en un mamífero.
13.

Implante para su uso según la reivindicación 12, en el que el implante es administrado mediante inyección intradérmica o subcutánea.
14.

Implante, que comprende:

un núcleo de AH reticulado por un agente reticulante; tal como VS o BDDE,

una capa intermedia de colágeno que rodea y está reticulada por el agente reticulante al núcleo;

y

una capa exterior de AH que rodea y está reticulada por el agente reticulante a la capa de colágeno, por lo cual el implante, preferentemente, tiene una fuerza de extrusión a través de una aguja de calibre 24 o superior de 50 Newtons o menos, y el implante comprende, opcionalmente, un agente anestésico local, tal como lidocaína, en el que la concentración de la lidocaína en el implante es, preferentemente, de 1-7 mg/ml y, más preferentemente, de 2,7-3,3 mg/ml.
15.

Implante según la reivindicación 14, que comprende además 10 ppm o menos de agente reticulante no reticulado al AH o al colágeno.
16.

Implante según la reivindicación 14, en el que el 5-50% de los grupos amina en el colágeno están modificados por el agente reticulante.
17.

Implante según la reivindicación 14, en el que el módulo de elasticidad del implante es mayor de 200 Pa.