ES2374440T3 - Métodos y composiciones para tratar, inhibir y reversar trastornos del disco intervertebral. - Google Patents

Abstract

Uso de un inhibidor NF-kB en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una degeneración del disco intervertebral, en donde el inhibidor NF-kB se selecciona del grupo que consiste de un oligonucleótido señuelo capaz de unirse al sitio de unión de ADN de NF-kB, un ácido nucleico NF-kB anticodificante, y un siARN NF-kB.

Description

Métodos y Composiciones para Tratar, Inhibir y Reversar Trastornos del Disco Intervertebral

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un inhibidor NF-KB y usos del mismo como se define en las reivindicaciones. También se describe el tratamiento, inhibición y reversión de trastornos del disco intervertebral (IVD) al bloquear los factores de transcripción que incluyen los factores de transcripción, NF-KB, E2F, GATA-3, STAT-1, STAT-3, STAT-6, Ets y AP-1. Más particularmente, la presente invención se relaciona con el restablecimiento de la integridad del disco intervertebral al bloquear la actividad del factor de transcripción.

Antecedentes de la invención

El dolor de espalda es la segunda queja por dolencia más común en los consultorios médicos después del resfriado común y es responsable de una pérdida de algunos 100 millones de días de trabajo anualmente solo en los Estados Unidos. Una proporción principal de estas lesiones de espalda resulta de trastornos del disco intervertebral en la columna. Aunque se desconoce la patogenia exacta de muchos trastornos del disco intervertebral, los trastornos tales como la enfermedad degenerativa del disco se inducen mecánicamente de manera general y están mediados biológicamente.

El IVD consiste de un anillo fibroso externo (AF), que es rico en colágenos que cuentan por su resistencia a la tensión, y un núcleo interno pulposo (NP), que contiene proteoglucanos grandes (PG) que retienen agua para resistir la carga por compresión. Biológicamente, las células de disco en el AF y NP mantienen un balance entre el anabolismo y catabolismo, o metabolismo en estado estable, de sus matrices extracelulares (ECM), y se modulan mediante una variedad de sustancias que incluyen citoquinas, enzimas, sus inhibidores y factores de crecimiento tales como factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factor � de crecimiento transformante (TGF- �), y proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Diversas enzimas, tales como metaloproteinasas de matriz (MMP), y citoquinas, median el proceso catabólico, o degradación de la matriz. La degeneración de un IVD se considera que resulta de un desbalance entre los procesos anabólicos y catabólicos, o la pérdida de metabolismo en estado estable, que se mantienen en el disco normal.

En un IVD normal, el ECM del NP se sintetiza y se mantiene a través de la vida del adulto mediante relativamente pocas células. En el humano adulto, la mayor parte de las células NP son similares a condrocito, mientras que las células NP en los jóvenes tienen un número significativo de células notocordales grandes. No se sabe si ambos tipos de células NP sintetizan el PG hidrófilo de gran peso molecular, llamado agrecán, que constituye la molécula más abundante en el tejido. Estas moléculas de agrecán interactúan extracelularmente con hebras lineales largas de hialuronano (HA), que forman agregados que se llegan a enredar en una red fibrilar hecha principalmente del colágeno tipo II. Las propiedades de inflamación, fluido y transporte de iones, así como también las propiedades mecánicas intrínsecas de la matriz sólida de colágeno-agrecán que rigen el comportamiento de deformación del NP. La red de colágeno da resistencia a la tensión del tejido e impide la expansión de las moléculas de agrecán viscoelásticas, subhidratadas que proporcionan rigidez compresiva y permite al tejido experimentar deformación reversible.

El AF contiene una población relativamente homogénea de células similares a condrocito que sintetizan una matriz rica en colágeno y más pobre en PG que las células de NP, aunque la presencia de diferentes poblaciones de células sugieren las diferencias zonales del metabolismo de la matriz. De forma importante, algunas de las células AF que sintetizan el PG y las moléculas de colágeno no se encuentran normalmente en cantidades significativas en el cartílago. La pérdida progresiva del contenido PG del IVD, con deshidratación posterior del NP, ha estado implicada en la patogenia de la degeneración de IVD.

Desafortunadamente, el tratamiento actual de los trastornos de disco intervertebral, que incluyen degeneración IVD, se ha limitado solo a unos cursos de acción, el más común de estos es la cirugía espinal. Aunque en algunos casos la cirugía espinal logra cerca del 90% de resultados buenos a excelentes, el IVD patológico, con el tiempo, continúa experimentando degeneración y puede aún resultar en discapacidad significativa. Adicionalmente, aunque las técnicas quirúrgicas tales como fusión espinal lumbar tienen un alto índice de éxito si se realizan en pacientes con deformidades o inestabilidades documentadas tales como espondilolistesis y escoliosis, es impredecible el resultado de los procedimientos quirúrgicos para el dolor de espalda sin radiculopatía.

Además de ser frecuentemente incapaz de predecir el resultado, existe un número de inconvenientes para los procedimientos quirúrgicos tales como fusión espinal. Primero, la capacidad del hueso para curar o "fusionar" varía; el índice de éxito promedio de una fusión espinal lumbar es aproximadamente 75 %-80 %. Desafortunadamente, la falla de la fusión se puede asociar con síntomas continuos. Segundo, una fusión espinal en uno o más niveles provocan rigidez y movimiento reducido de la columna. Tercero, tiene una fusión espinal en uno o más niveles

provocarán más tensión que se va a transferir a niveles adyacentes. La tensión transferida puede provocar nuevos problemas para desarrollar otros niveles, que conduce a cirugía de espalda adicional. Por estas razones, numerosos investigadores trabajan en tratamientos alternativos para la fusión espinal que incluye terapia electrotérmica intradiscal (IDET), prótesis de disco, y reparación biológica.

Aunque algunas de las alternativas para fusión espinal son promisorias, aún existen muchas desventajas. Por ejemplo, aunque el IDET puede aliviar el dolor discogénico en los pacientes, no restaura la estructura o las matrices biológicas del disco. Como otro ejemplo, el uso de prótesis de disco en el reemplazo de disco requiere un procedimiento quirúrgico y se asocia con morbilidades quirúrgicas potenciales. Además de las complicaciones potenciales asociadas con cirugía experimentada y anestesia general, las complicaciones asociadas con reemplazo de disco artificial pueden incluir ruptura de la placa de metal, dislocación del implante, e infección. Como la cirugía de reemplazo de articulación, los implantes artificiales pueden fallar con el tiempo debido al uso de materiales y el aflojamiento de los implantes.

Lo que se necesita es un método no invasivo que pueda resultar en la restauración de la estructura del IVD. Actualmente, no existen métodos no invasivos, tales como tratamiento utilizando farmacéuticos que pueden cumplir con estos objetivos. Los esteroides se utilizan actualmente para tratar trastornos del disco intervertebral pero los esteroides pueden tener muchos inconvenientes significativos en los que solo se controlan los síntomas de degeneración de IVD y no detienen, evitan, o revierten lesiones adicionales.

Debido a las desventajas del uso de esteroides, el interés reciente se ha enfocado en el tratamiento de trastornos IVD en compuestos farmacéuticos que pueden tratar o prevenir los trastornos IVD al dirigirse a ciertos mecanismos bioquímicos IVD. La bioquímica del IVD cumple una función importante en sus propiedades mecánicas. El NP es capaz de mantener su presión fluida para balancear las altas cargas externas en el IVD debido a la abundancia de los PG cargados negativamente. Esta malla molecular de los PG atrapado en una red de colágeno confiere al IVD rigidez compresiva y resistencia a la tensión. Una de las estrategias biológicas para la reparación de IVD es mejorar la síntesis de los PG y del colágeno, que pueden restaurar la función biomecánica de la matriz.

En el IVD, el contenido de ECM de los PG y la síntesis de los PG por condrocitos embebidos en el ECM se reduce notablemente con la edad y la degeneración. Se han detectado diversas citoquinas [es decir interleuquina-1, (IL-1)] y proteinasas [es decir, estromelisina y otros MMP] en IVD degenerados o herniados. La interleuquina-1a también estimula la producción de algunos de los MMP, óxido nítrico y prostaglandina E2 mediante células normales IVD mientras se inhibe la síntesis de PG. La pérdida de regulación de estas citoquinas inflamatorias y proteasas contribuye probablemente a los trastornos IVD tales como degradación IVD. Una estrategia para el tratamiento biológico de trastornos IVD tales como degeneración del disco intervertebral es detener o contrarrestar estas citoquinas al suministrar inhibidores u otras sustancias que bloquean sus actividades enzimáticas o catabólicas. Por ejemplo, se ha investigado el antagonista del receptor IL-1 (IL-1 Ra) como un candidato para bloquear la función de IL-1 en el IVD. Otra estrategia para el tratamiento biológico incluye tratar o prevenir los trastornos IVD al prevenir la expresión de los genes que codifican las proteínas activas en los trastornos IVD. Una forma de bloquear la expresión de estos genes es bloquear los factores de transcripción que actúan sobre ellos.

Por ejemplo, los genes de metaloproteinasa de matriz se controlan de manera general mediante diversos factores de transcripción que incluyen los factores de transcripción que actúan en los sitios del factor de transcripción PEA3 y AP-1. Ver Chakroborti et al. MOL CELL BIOCHEM 253: 269-285 (2003). Un ejemplo de un factor de transcripción que cumple una función crítica en la regulación de muchos genes que controlan muchos de los factores bioquímicos activos en los trastornos IVD tales como las Metaloproteinasas de Matriz, es el Factor Nuclear - kappa B (NF-KB), un grupo complejo de factores de transcripción heterodiméricos u homodiméricos. Los miembros de la familia NF-KB incluyen NF-KB1 (p50/p105), NF-KB2 (p52/p100), RelA (p65), RelB, y c-Rel. Estas moléculas se atrapan en el citoplasma como un complejo inactivo mediante IKB. Se ha reportado que la disociación del factor NF-KB de transcripción de este complejo cumple una función de pivote en la regulación de la producción de citoquina inflamatoria, al inducir una transactivación coordinada de tales genes como TNFa, IL-1, IL-6, IL-8, factor que estimula la colonia de granulocito-macrófago (GMCSF), metaloproteinasas y moléculas de adhesión intercelular 1 (ICAM-1). En artritis reumatoides (RA), se ha observado actividad NF- KB en el sinovio.

Se ha hecho la hipótesis de que bloquear los miembros de la familia NF-KB puede ser capaz de reducir la degradación del tejido de cartílago articular. La adición de los oligonucleótidos señuelo NF-KB (ODN) mediante inyección intraarticular en las articulaciones del tobillo posterior bilateral de ratas con artritis inducida por colágeno (CIA) utilizando el virus de hemaglutinina del método de liposoma de Japón (HVJ) ha mostrado una reducción en la severidad de la inflamación de la pata trasera y una supresión marcada de destrucción de las articulaciones. Desafortunadamente, el cartílago de tobillo articular de rata difiere sustancialmente del fibrocartílago encontrado en el disco intervertebral humano. No se ha mostrado que la inhibición de NF-KB evite o trate la degradación de fibrocartílago en cualquier especie. De forma similar, no se ha mostrado que la inhibición de NF-KB tenga efectos biológicos en los fibrocondrocitos principales humanos, específicamente fibrocondrocitos principales humanos in vitro.

Se ha hecho hipotetizado que bloquear ciertas enzimas y citoquinas consideradas que son activas en trastornos IVD en un nivel transcripcional se puede utilizar la prevención o tratamiento de trastornos IVD. No obstante, en la presente invención no existen farmacéuticos efectivos que actúan utilizando este principio. La US 2003113796 describe teta polipéptidos FIL-1 novedosos, purificados y aislados y fragmentos de los mismos, los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, procesos para la producción de formas recombinantes de tales polipéptidos, anticuerpos generados contra estos polipéptidos, péptidos fragmentados derivados de estos polipéptidos, y usos del mismo. Akeda et al. (The Spine Journal, Elsevier, vol. 5, no. 4, 2005, páginas S152-S153) describe que la inyección intra-discal del oligonucleótido señuelo desnudo NFkappaB es efectiva en restaurar la degeneración del disco en el modelo de punción de aguja de anillo de conejo.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la presente invención proporciona usos como se define en las reivindicaciones. También se describe un método para tratar trastornos IVD al administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de factor de transcripción en un disco intervertebral patológico, es decir, uno que tiene un trastorno IVD. Así, la administración del inhibidor del factor de trascripción trata el trastorno de disco intervertebral. En ciertos casos, el factor de transcripción bloqueado mediante el inhibidor del factor de transcripción puede ser NF-KB, E2F, GATA-3, STAT-1, STAT- 3, STAT-6, Ets o AP-1. En este aspecto, el disco intervertebral patológico puede ser in vivo o in vitro. En ciertas realizaciones, tratar los trastornos IVD incluye evitar patología adicional.

Adicionalmente, se proporcionan métodos que evitan los trastornos del disco intervertebral al bloquear los factores de transcripción en tejido de disco intervertebral saludable o el disco intervertebral saludable. El disco intervertebral saludable puede comprender tejido fibroso o células de núcleo pulposo o anillo. Adicionalmente, se proporcionan métodos que estimulan la síntesis de proteoglucano, suprimen la degradación de proteoglucano, o ambos al administrar una cantidad efectiva de un inhibidor del factor de transcripción en un disco intervertebral.

Todavía otro aspecto de la invención comprende un inhibidor NF-KB para el tratamiento o prevención de una degeneración del disco intervertebral como se define en las reivindicaciones. También se describe una composición farmacéutica, que comprende un inhibidor del factor de transcripción, para uso en el tratamiento de trastornos del disco intervertebral como se describe aquí. Dicha composición farmacéutica puede incluir un señuelo de oligodesoxinucleótido desnudo que bloquea la capacidad del factor de transcripción para actuar en el gen de respuesta del factor de transcripción.

Breve descripción de los dibujos

La FIGURA 1 muestra criosecciones de células pulposas de núcleo in vivo (NP) y anillo fibroso (AF) 7 días luego de transfección con ODN desnudo que demuestra la distribución del ODN señuelo marcado con FITC dentro de las células.

La FIGURA 2 es una gráfica que demuestra cambios en % de la altura intervertebral de disco in vivo (DHI) (% DHI = DHI postoperativo / DHI preoperativo x 100) en un IVD de conejo cuando no se punciona (control sin punción), punzado pero no tratado (control de punción), tratado con 1 µg de señuelo, o se trata con 10 µg de señuelo.

La FIGURA 3 muestra las células IVD in vitro luego de transfección con ODN desnudo que demuestra la distribución del ODN de señuelo marcado con FITC dentro de las células.

La FIGURA 4 es una gráfica que demuestra cambios en el % de altura intervertebral del disco in vivo (DHI) (% DHI = DHI postoperativo / DHI preoperativo x 100) en un IVD de conejo cuando no se punciona (control sin punción), se punciona pero no se trata (control de punción), tratado con 1 µg de señuelo, o tratado con 10 µg de señuelo.

La FIGURA 5 muestra secciones histológicas de un IVD de conejo que se ha punzado pero no tratado (control con punción) y un IVD de conejo que se ha punzado y tratado con 1 µg de señuelo.

La FIGURA 6 muestra células pulposas de núcleo in vitro (NP) y anillo fibroso (AF) luego de transfección con ODN desnudo que demuestra la distribución del ODN señuelo marcado con FITC dentro de las células.

La FIGURA 7 muestra un Western Blot que demuestra la regulación por disminución de la expresión de MMP luego del tratamiento con ODN desnudo. Las líneas en la figura corresponden a la Línea 1: control, Línea 2: tratamiento con IL-1 ; Línea 3: tratamiento con señuelo y IL-1 ; Línea 4 mezcladas: tratamiento con señuelo de hebra sencilla y IL-1 ; y Línea 5: tratamiento con señuelo y IL-1 .

La FIGURA 8 demuestra que el tratamiento con ODN señuelo estimula significativamente la acumulación del proteoglucano (PG) en células AF y NP humanas cultivadas.

La FIGURA 9 muestra células pulposas de núcleo in vitro (NP) y anillo fibroso (AF) luego de transfección con ODN desnudo que demuestra la distribución del ODN señuelo marcado con FITC dentro de las células (A, D). B y E son cepas nucleares y C y F son imágenes superpuestas.

La FIGURA 10 demuestra que el tratamiento con ODN señuelo estimula la acumulación del proteoglucano (PG) en células humanas AF y NP cultivadas y que la transfección continua de señuelo suprime la degradación PG inducida por IL-1 .

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Esta invención se basa en el uso de métodos para evitar, tratar o reparar trastornos del disco intervertebral utilizando uno o más compuestos que bloquean la actividad de los factores de transcripción. Este inhibidor del factor de transcripción actúa en los factores de transcripción responsables para controlar los genes para las enzimas y citoquinas involucradas en los trastornos del disco intervertebral. Se describen adicionalmente composiciones farmacéuticas para tratar trastornos IVD, que comprenden uno o más inhibidores del factor de transcripción. De manera general, estos inhibidores del factor de transcripción pueden bloquear la actividad de los factores de transcripción tales como NF-KB, E2F, GATA-3, STAT-1, STAT-3, STAT-6, Ets y AP-1. En una realización, estos compuestos bloquean específicamente la actividad de NF-KB.

También se describen métodos para estimular la síntesis de células y tejidos de disco intervertebral utilizando los métodos y composiciones farmacéuticas descritas aquí. De manera general, los métodos implican administrar o poner en contacto una célula o tejido de disco intervertebral como uno o más inhibidores del factor de transcripción. La célula o tejido de disco intervertebral puede incluir fibrocondrocitos del anillo fibroso o núcleo pulposo. Comúnmente, se pueden aislar los fibrocondrocitos o contener dentro de un fibrocartílago in vivo. En realizaciones típicas, el fibrocartílago y los fibrocondrocitos utilizados con la invención serán de mamífero, que pueden incluir placentarios, monotremas o marsupiales. En algunas realizaciones, el mamífero es un canino, felino, murino, lepórido, úrsido, mustélido, ungulado, ovino, équido, bovino, caprino, cérvido, o un primate diferente a humano o humano. En realizaciones específicas, el fibrocartílago y los fibrocondrocitos se aislarán o se contendrán dentro de un disco intervertebral de un humano.

La presente descripción proporciona métodos de tratamiento o reparación de fibrocartílago directo o indirecto y destrucción de IVD al inhibir la actividad del factor de transcripción. Como se entienden por el artesano experto, la inhibición del factor de transcripción se lleva a cabo al administrar una cantidad efectiva de un inhibidor del factor de transcripción a las células o tejido de un disco intervertebral. Las composiciones y métodos descritos aquí inhiben los factores de transcripción activa en controlar los genes involucrados en trastornos IVD. A lo largo con los discos intervertebrales degenerativos, ejemplos no limitantes de trastornos IVD incluyen dolor de espalda, escoliosis, cervicodinia, hernia, y estenosis del canal espinal (estenosis espinal).

En algunas realizaciones, los compuestos utilizados para bloquear los factores de transcripción actuarán específicamente sobre los factores de transcripción activos en el control de los genes metaloproteinasa de matriz. Para revisión de los ejemplos de los factores de transcripción activos en el control de los genes metaloproteinasa de matriz, por favor ver Vincenti and Brinckerhoff, ARTHRITIS RES 4:157-164 (2002) y Chakroborti et al. MOL CELL BIOCHEM 253: 269-285 (2003). En otras realizaciones, los compuestos utilizados para bloquear los factores de transcripción actuarán específicamente sobre los factores de transcripción activos en controlar los genes de interleuquina. En todavía realizaciones adicionales, los compuestos pueden actuar en los factores de transcripción activos para controlar los genes de metaloproteinasa de matriz y los genes de interleuquina. Como se entiende por el artesano experto, los inhibidores del factor de transcripción se pueden utilizar para bloquear cualquier gen encontrado que esté involucrado en un trastorno del disco intervertebral.

Las cantidades efectivas de uno o más inhibidores del factor de transcripción se administrarán al disco intervertebral. En muchas realizaciones, el disco intervertebral estará in vivo. Cuando el disco intervertebral está in vivo, el inhibidor del factor de transcripción y el compuesto se pueden administrar a través de cualquier método que suministrará una cantidad efectiva del inhibidor del factor de transcripción y el compuesto. El inhibidor del factor de transcripción y el compuesto se puede utilizar para tratar un trastorno de disco intervertebral, tal como un disco herniado, o el inhibidor del factor de transcripción y el compuesto se puede administrar profilácticamente para evitar trastornos del disco intervertebral. De manera general, en muchos trastornos del disco intervertebral, la matriz extracelular exhibe degradación de los componentes cuando se compara con el tejido normal. Esta degradación se puede determinar al medir la presencia de las enzimas conocidas por ser activas en la división de los miembros de la matriz extracelular. La degradación también se puede determinar al medir la altura del disco intervertebral.

De forma sorprendente e inesperada, se encuentra que en algunas realizaciones, bloquear los factores de transcripción en el disco intervertebral resulta en una reversión del daño previo. Por lo general, esto se considera como teoría no limitante que existe reversión cuando se estimula el crecimiento de la matriz extracelular. Como se demuestra por la FIGURA 2, la altura del disco en un modelo de punción anular aumenta cuando se compara con

discos no tratados luego de inyección doble de un inhibidor del factor de transcripción. De forma similar, como se muestra en la FIGURA 5 y la FIGURA 7, las células AF y NP tratadas con un inhibidor del factor de transcripción tienen una capacidad mejorada de la matriz extracelular. Tomados juntos, esto sugiere que el inhibidor del factor de transcripción y los usos de la invención revierten el daño del disco intervertebral previo. Este es el primer caso de un inhibidor del factor de transcripción que resulta en la reversión del daño encontrado en el disco intervertebral patológico.

En ciertas realizaciones de la invención, el disco intervertebral in vivo no ha sufrido una lesión o se vuelve atrófico antes que se administre el inhibidor del factor de transcripción. En otras realizaciones, la presente invención proporciona usos de inhibidores para tratar un trastorno de disco intervertebral, a saber, degeneración del disco intervertebral. La patología en el disco intervertebral puede existir en el anillo fibroso, el núcleo pulposo, o ambos. Un ejemplo no limitante de un disco intervertebral patológico incluye un disco que experimenta degeneración, que puede resultar en hernia de disco. La degeneración también puede resultar en dolor de espalda.

En algunas realizaciones, antes que se agregue un inhibidor del factor de transcripción a un disco intervertebral, se medirá el nivel de patología de disco intervertebral. La medición de la patología de los trastornos del disco intervertebral se puede llevar a cabo en una variedad de formas. En pacientes sintomáticos o asintomáticos, esto puede incluir melografía MRI o CT. También se pueden diagnosticar los trastornos del disco intervertebral al utilizar radiografías de plano, barridos CT, y discografía, un método en donde se colocan agujas espinales en los discos intervertebrales cervicales para identificar los discos sintomáticos.

También se pueden medir los trastornos del disco intervertebral bioquímicamente mediante cambios en la proporción normal y los tipos de proteoglucano y colágeno o mediante un incremento en los niveles de enzimas que degradan la matriz. Adicionalmente, debido a que la expresión de la citoquina aumenta contribuye probablemente con ciertos trastornos del disco intervertebral, la presente invención abarca la medición de las citoquinas como un medio para comprobar trastornos del disco intervertebral. Otras mediciones bioquímicas para detectar los trastornos del disco intervertebral pueden incluir, pero no se limitan a, detectar una reducción en el número total de células o un aumento en el número de células que experimentan apoptosis. Cuando los nervios y vasos sanguíneos crecen en los discos intervertebrales enfermos, que miden el cambio en los factores de angiogenia, también se puede utilizar la vascularización o inervación como marcadores de trastornos del disco intervertebral.

Luego de la administración del inhibidor del factor de transcripción, para determinar la eficacia del tratamiento, la presente invención puede abarcar determinar o medir el nivel de trastorno intervertebral. En algunas realizaciones, la invención puede involucrar determinar o medir el nivel del trastorno intervertebral antes de tratamiento con el fin de establecer la cantidad de inhibidor del factor de transcripción suficientemente necesario para tratar un disco intervertebral patológico. En estas realizaciones de la invención, el nivel de los factores que degradan el fibrocartílago o sus precursores, por ejemplo pro-enzimas, mARN, etc., se puede medir para comprobar la cantidad de degradación de fibrocartílago. De manera general, un factor que degrada el fibrocartílago abarca cualquier compuesto que, cuando está presente, conducirá a la degradación del tejido de fibrocartílago en un disco intervertebral. El factor que degrada el fibrocartílago puede actuar directamente en los fibrocondrocitos o el tejido de fibrocartílago para provocar la degradación, afectar un compuesto que degrada directamente el tejido de fibrocartílago, o afecta un modulador de un compuesto que degrada el tejido de fibrocartílago. Los factores que degradan el fibrocartílago incluyen las enzimas que degradan directamente la matriz de cartílago así como también otros químicos que estimulan la degradación del cartílago, que incluyen citoquinas tales como IL-1. El IL-1 parece provocar indirectamente la degradación del fibrocartílago mediante por lo menos la regulación por aumento de la actividad de la metaloproteinasa de matriz. Ejemplos no limitantes de los métodos para medir los factores que degradan el fibrocartílago incluyen medir la producción de óxido nítrico (NO), detección de proteinasa, o ambas.

Las proteinasas, que ocupan un grupo específico de factores que degradan el fibrocartílago, se pueden detectar en discos intervertebrales patológicos y normales. Estas proteinasas incluyen, pero no se limitan a, metaloproteinasas de matriz (MMP) y miembros de la familia ADAMTS. En la invención, los factores que degradan el fibrocartílago que incluyen las proteinasas se pueden detectar mediante cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos incluyen análisis Western Blot, inmunohistoquímica, detección de los transcriptos de ARN, y zimografía. El fibrocartílago o los fibrocondrocitos del disco intervertebral se pueden tratar con un agente fibrocondro protector antes de la medición de los factores que degradan el fibrocartílago. La detección también se puede conducir antes de poner en contacto, después de poner en contacto, o ambos un factor que degrada el fibrocartílago. En una realización, los factores que degradan el fibrocartílago serán factores naturales. Otra realización de la invención contempla el uso de factores sintéticos que degradan el fibrocartílago. Específicamente, en una realización, el factor que degrada el cartílago puede ser IL-1. En otra realización, el factor que degrada el cartílago puede ser una proteinasa tal como un miembro de la familia ADAMTS.

Para las realizaciones que utilizan el fibrocartílago in vitro y los fibrocondrocitos, se pueden aislar directamente el fibrocartílago y los fibrocondrocitos del tejido intervertebral del disco preexistente. Los fibrocondrocitos utilizados para la preparación del cultivo celular in vitro se pueden aislar mediante cualquier método adecuado conocido en la

técnica. Se conocen diversos materiales de partida y métodos para aislamiento celular. Ver de manera general, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 2d ed., A.R. Liss Inc., New York, pp 137168,1987; Klagsburn, "Large Scale Preparation of Chondrocytes," METHODS ENZYMOL 58:560-564, 1979. El fibrocartílago y los fibrocondrocitos in vitro deben retener su fenotipo de fibrocartílago y producir una matriz asociada con célula que tiene contenidos de colágeno y proteoglucano característicos de la fuente de fibrocartílago de los cuales ellos se aíslan. En algunas realizaciones, los condrocitos se cultivarán en glóbulos de alginato. En otras realizaciones, las células de fibrocartílago, que incluye específicamente células fibrosas del anillo y de núcleo pulposo, se cultivarán hasta que ellas formen un tejido de cartílago, tal como aquellas descritas en las Patente Estadounidense Nos. 6,451,060 y 6,197,061. Luego de la formación del tejido de cartílago, se puede utilizar el tejido de cartílago para probar los efectos de diferentes tipos de inhibidores del factor de transcripción in vitro.

Debido a que se pueden encontrar fibrocondrocitos del disco intervertebral in vivo o in vitro, puede variar el tipo de inhibidor del factor de transcripción y el método de poner en contacto el inhibidor del factor de transcripción con los fibrocondrocitos. Por ejemplo, cuando el fibrocondrocito está in vitro, un inhibidor del factor de transcripción y el compuesto, tal como un oligodesoxi-nucleótido señuelo desnudo se puede agregar o incluir en el medio en el que el fibrocondrocito se mantiene o se cultiva.

Como se utiliza aquí, un "inhibidor del factor de transcripción" o un "inhibidor del factor de transcripción y el compuesto" es cualquier compuesto que inhibe la capacidad de un factor de transcripción para activar o suprimir los genes de respuesta involucrados en los trastornos del disco intervertebral. En algunas realizaciones, los inhibidores del factor de transcripción actuarán sobre los factores de transcripción que activan los genes. En otras realizaciones, los inhibidores del factor de transcripción actuarán sobre los factores de transcripción que inhiben los genes. Un experto en la técnica entiende que un inhibidor único del factor de transcripción puede actuar en ambos factores de transcripción que activan y los factores de transcripción que inhiben diferentes genes. El experto también entiende que el inhibidor del factor de transcripción puede actuar directamente sobre el factor de transcripción que actúa directamente sobre la respuesta del gen o sobre cualquier miembro de la ruta del factor de transcripción que conduce a la actividad transcripcional o la inhibición mediante el factor de transcripción. Por ejemplo, la Solicitud de Patente Estadounidense No. 20040171823 describe polinucleótidos y polipéptidos activos en la ruta NF-KB. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos y polipéptidos de la Solicitud de Patente Estadounidense No. 20040171823 se pueden bloquear utilizando los métodos de la presente invención.

Ejemplos de los compuestos del inhibidor del factor de transcripción incluyen antioxidantes, inhibidores de proteasoma, péptidos, moléculas pequeñas, oligonucleótidos señuelo y los polipéptidos constitutivamente activos o negativos dominantes. Los inhibidores del factor de transcripción también pueden incluir señuelos, moléculas anticodificantes, ribozimas, aptámeros, siARN, anticuerpos y antagonistas. En ciertas realizaciones, los inhibidores del factor de transcripción inhibirán el factor de transcripción antes de la traducción del ARN de factor de transcripción. En otras realizaciones, los inhibidores del factor de transcripción inhibirán el factor de transcripción luego de traducción del ARN del factor de transcripción. Ejemplos específicos de los inhibidores del factor de transcripción basados en no nucleótidos incluyen glutationa, ciclosporina A, estrógeno, y leptomicina B.

Está dentro de los límites de la experimentación de rutina y por lo tanto, dentro del alcance de la invención actual para el experto determinar un inhibidor del factor de transcripción apropiado para un uso particular. Por ejemplo, como está bien demostrado en la técnica, en los casos en donde un inhibidor del factor de transcripción de nucleótido tal como un señuelo o un SiARN se selecciona, el inhibidor del factor de transcripción particular se seleccionará con base en la secuencia de nucleótido. Por ejemplo, cuando el inhibidor del factor de transcripción es un señuelo, la secuencia del señuelo se seleccionará para emparejar cercanamente la secuencia del gen responsable cuando se une normalmente el factor de transcripción. Como otro ejemplo no limitante, cuando el inhibidor del factor de transcripción es un anticuerpo, el anticuerpo se seleccionará con base en su capacidad de interactuar con el factor de transcripción. Así, utilizando el conocimiento actual conocido en la técnica, el experto puede determinar el inhibidor del factor de transcripción apropiado con base en el factor de transcripción que se inhibe y el método deseado de inhibición. En algunas realizaciones, los inhibidores del factor de transcripción serán moléculas naturales. En otras realizaciones, los inhibidores del factor de transcripción serán moléculas sintéticamente diseñadas. Los inhibidores del factor de transcripción pueden actuar como inhibidores generales de inducción de los miembros de la familia del factor de transcripción o como inhibidores de las rutas específicas de inducción. El experto entiende que los inhibidores del factor de transcripción descritos específicamente significan que son solo ilustrativos y se pueden utilizar muchos otros tipos de los inhibidores del factor de transcripción. En algunas realizaciones, se pueden utilizar ciertos inhibidores para evitar o tratar la degradación del fibrocartílago in vitro pero no será apropiado para evitar o tratar la degradación del fibrocartílago in vivo. Para una discusión en profundidad de los ejemplos de los tipos de inhibidores que se pueden utilizar en la invención, ver Epinat & Gilmore, ONCOGENE 18: 6896-6909 (1999) y Barnes, INT J BIOL 29(6): 867 (1997). Las ventajas y desventajas de muchos tipos de inhibidores del factor de transcripción utilizados como agentes terapéuticos se conocen en la técnica.

En una realización de la invención, los oligodesoxi-nucleótidos (ODN) señuelo que se describen en Tomita et al., Rheumatology 39: 749-757 (2000), Patente Estadounidense No.: 6,262,033, Solicitud de Patente Estadounidense

No.: 10/366,718 y Solicitud de Patente PCT No.: PCT/JP02/00990 se utilizarán para inhibir los factores de transcripción. El término "señuelo" se refiere a un compuesto que se une a un sitio en un cromosoma, cuyo factor de transcripción se une a, o un sitio en un cromosoma, cuyo otro factor regulador de transcripción para un gen controlado mediante un factor de transcripción tal como NF-KB (denominado aquí adelante como un sitio de unión objetivo) que se une a, y antagoniza la unión de NF-KB, Ets, u otros factores transcripcionales para estos sitios de unión objetivo.

De manera general, cuando está presente un señuelo dentro del núcleo de una célula, el señuelo entra en conflicto con un factor regulador de transcripción que compite por un sitio de unión objetivo del factor regulador de transcripción. Como resultado, se inhibe una función biológica, que se generaría mediante la unión del factor regulador de transcripción al sitio de unión objetivo. El señuelo contiene por lo menos una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a una secuencia de unión objetivo del sitio de unión objetivo. Se puede utilizar un señuelo para la preparación de una composición farmacéutica descrita aquí mientras que el señuelo puede unirse a una secuencia de unión objetivo.

La inhibición del factor de transcripción mediante el señuelo puede ocurrir en un nivel in vitro e in vivo. En algunas realizaciones, se administrarán los señuelos oligodesoxi-nucleótidos al fibrocartílago antes de que se pueda medir cualquier muerte celular apreciable. En realizaciones individuales, bloquear el factor de transcripción NF-KB se llevará a cabo utilizando señuelos oligodesoxi-nucleótidos con las siguientes secuencias específicas 5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’ (SEQ ID NO.: 1) y 3’-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5’ (SEQ ID NO.: 2). Señuelos para otros factores de transcripción pueden incluir, pero no se limitan a, las siguientes secuencias 5’-GATCTAGGGATTTCCGGGAAATGAAGCT-3’ (SEQ ID NO: 3) (STAT-1 señuelo); 5’-AGCTTGAGATAGAGCT-3’ (SEQ ID NO.: 4) (GATA-3 señuelo ); 5’-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAAATCTAT-3’ (SEQ ID NO.: 5) (STAT-6 señuelo ); 5’-AGCTTGTGAGTCAGAAGCT-3’ (SEQ ID NO.: 6) (AP-1 señuelo ); y 5’-AATTCACCGGAAGTATTCGA3’ (SEQ ID NO.: 7) (Ets señuelo). Cuando se utilizan los oligonucleótidos señuelo, se pueden hacer oligonucleótidos señuelo utilizando métodos de clonación o de síntesis de nucleótido estándar conocidos en la técnica. Estos oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN y pueden contener nucleótidos modificados y/o seudonucleótidos. Por ejemplo, se pueden construir oligonucleótidos _ fosfortioato de los nucleótidos modificados apropiados utilizando técnicas estándar. Tales oligonucleótidos modificados son atractivos debido a la estabilidad aumentada para las nucleasas. Adicionalmente, cuando se utilizan con la presente invención los oligonucleótidos pueden ser de hebra sencilla o de hebra doble y lineales o cíclicos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos serán de hebra doble.

En las realizaciones en donde se utilizan señuelos oligodesoxi-nucleótidos para bloquear los factores de transcripción, los ODN señuelos se pueden introducir en células aplicables y tejidos utilizando una variedad de métodos. En ciertos métodos, las células o el tejido de interés se pueden transfectar utilizando oligodesoxinucleótidos "desnudos". Como se utiliza en este contexto, los oligodesoxinucleótidos "desnudos" describen los ODN que se introducen al administrar simplemente el ODN sin ayudas de transfección, tales como liposomas, que se utilizan comúnmente en terapia de gen. Aunque se conoce en la técnica para transfectar las secuencias de gen utilizando transferencia mediada por adenovirus y para transferir secuencias de gen desnudo que se incorporan en el ADN de las células del disco intervertebral, la presente invención difiere en que el señuelo "desnudo" se transfecta dentro de las células pero actúa como un inhibidor del factor de transcripción durante un periodo sin integrarse en la célula del genoma del disco intervertebral. Los métodos conocidos en la técnica se describen en Zhao et al. Chin Med J 115(3): 409-412 (2002) y la Solicitud de Patente Estadounidense No. 09/199,978,

Es sorprendente e inesperado que la transfección del ODN desnudo señuelo para los fibrocondrocitos in vivo e in vitro resultaría en la acción sostenida del inhibidor del factor de transcripción. Los reportes previos han sugerido que los oligonucleótidos desnudos no se pueden retener en las células. Como se demuestra por la FIGURA 1, se puede visualizar el ODN señuelo en células NP y AF in vivo 7 días post transfección. El ADN Señuelo también se puede visualizar en el citoplasma y el núcleo de las células NP y AF in vitro dos días post-transfección. Aunque otros en la técnica han sugerido que la transfección desnuda del ODN señuelo no resulta en retención apreciable, la transfección del ODN desnudo señuelo puede ser viable en la invención actual debido a que el fibrocartílago del disco intervertebral es una forma especializada de cartílago que difiere del tejido previamente utilizado, tal como cartílago articular.

El experto entiende las muchas diferencias entre el fibrocartílago de un disco intervertebral y el cartílago articular. Por ejemplo, la diferenciación antenatal del fibrocartílago de disco intervertebral es diferente de aquella del cartílago articular en una articulación sinovial. Los discos intervertebrales nunca se afectan directamente por trastornos sinoviales tales como artritis reumatoide. De hecho, el fibrocartílago de disco intervertebral humano tiene una historia de desarrollo específico, compleja cuando se compara con otras articulaciones en el cuerpo. Esto se debe a la presencia del notocordales que no tienen equivalentes en las articulaciones sinoviales. En adultos humanos, el suministro vascular difiere considerablemente entre una articulación sinovial, en la que está bien desarrollado, y el disco intervertebral del adulto, que es la estructura avascular más larga del cuerpo humano. La microscopía electrónica de barrido del disco intervertebral ha mostrado que el núcleo pulposo se compone de gel entrecruzado tridimensional, soportado por una red floja de fibrilos finos que enmallan las células fibroblásticas, y el material

intracelular, con una transición gradual de la red fibrosa hasta las laminillas del anillo. En contraste, una articulación sinovial verdadera contiene numerosos sinoviocitos.

Las composiciones farmacéuticas de los compuestos del inhibidor del factor de transcripción tales como ODN señuelo, se pueden preparar al mezclar uno o más compuestos del inhibidor del factor de transcripción con portadores, excipientes, ligadores, diluyentes farmacéuticamente aceptables o similares, para tratar terapéuticamente, es decir, aliviar los síntomas en parte o completos, detiene la progresión adicional de, reversar o de otra forma aliviar, una variedad de trastornos del disco intervertebral. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad de uno o más compuestos del inhibidor del factor de transcripción suficientes para resultar en el alivio de los síntomas del trastorno del disco intervertebral. Una dosis efectiva también se puede referir a la cantidad de uno o más compuestos del inhibidor del factor de transcripción suficientes para resultar en prevención del trastorno del disco intervertebral. En algunas realizaciones, la dosis efectiva solo prevendrá parcialmente el trastorno del disco intervertebral. En estos casos, el trastorno del disco intervertebral, aunque aún puede existir, será mejor que el trastorno del disco intervertebral esperado si no se ha dado tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar mediante métodos bien conocidos en la técnica tales como procesos de granulación, mezcla, disolución, encapsulación, liofilización, emulsificación o lixiviado convencionales, entre otros. En ciertas realizaciones, los compuestos del inhibidor del factor de transcripción se pueden administrar en una forma sistémica a diferencia de local, tal como inyección como una formulación de liberación sostenida. En algunas realizaciones, se puede administrar una cantidad efectiva de los compuestos del inhibidor del factor de transcripción en cualquier regulador fisiológico satisfactorio tal como una solución de regulador de fosfato (PBS) o en una solución de 5% de lactosa para el disco intervertebral patológico. Las formas de dosificación descritas en la especificación actual se dan por vía de ejemplo y no se deben construir como limitantes de la presente invención.

Las formulaciones de los compuestos de inhibidor del factor de transcripción se pueden diseñar por ser de corta liberación, de liberación rápida, de acción larga, y de liberación sostenida como se describe adelante. Así, las formulaciones farmacéuticas también se pueden formular para liberación controlada o para liberación lenta, tal como se encuentra contenida dentro de una matriz o portador biodegradable.

El inhibidor del factor de transcripción en las composiciones actuales también puede existir en micelas o liposomas,

o alguna otra forma encapsulada, o se puede administrar en una forma de liberación extendida para proporcionar un efecto de almacenamiento y/o liberación prolongada. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas se pueden comprimir en glóbulos o cilindros y se implantan como soportes temporales. Tales implantes pueden emplear materiales inertes conocidos tales como siliconas y polímeros biodegradables.

Una dosis terapéuticamente efectiva de un inhibidor del factor de transcripción puede variar dependiendo de la ruta de administración y forma de dosificación. La dosis exacta se selecciona por un médico en vista de la afección de un paciente que se va a tratar. Las dosis y la administración se ajustan para proporcionar un nivel suficiente de la porción activa, o para mantener un efecto deseado. Se pueden ajustar las dosificaciones específicas dependiendo de las condiciones de la enfermedad, la edad, el peso corporal, las condiciones generales de salud, sexo, y dieta del sujeto, intervalos de dosis, rutas de administración, índice de excreción, y combinaciones de fármacos. Se puede administrar repetidamente la composición farmacéutica de acción sostenida dentro de un cierto intervalo tal como cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas (quincenal), dependiendo de la vida útil y el índice de depuración de una preparación específica. La guía de las dosis específicas y los métodos de suministro se proporcionan en las publicaciones conocidas en la técnica. Cualquiera de las formas de dosificación anteriores que contienen las cantidades efectivas están bien dentro de los límites de la experimentación de rutina y por lo tanto, bien dentro del alcance de la invención actual. En algunas realizaciones, una cantidad efectiva del inhibidor del factor de transcripción será menor de o igual a 500 microgramos. En otras realizaciones, una cantidad efectiva del inhibidor del factor de transcripción será menor que o igual a 200 microgramos.

En una realización, el compuesto o los compuestos del inhibidor del factor de transcripción de una formulación que exhibe un alto índice terapéutico. El índice terapéutico es la relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico que se pueden expresar como la relación entre LD50 y ED50. El LD50 es la dosis letal para el 50% de la población y el ED50 es la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población. Se determinan el LD50 y ED50 mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células de animal o animales experimentales.

En algunas realizaciones, el compuesto o compuestos del inhibidor del factor de transcripción se administran directamente al fibrocartílago in vivo de interés. Por ejemplo, el compuesto inhibidor del factor de transcripción se puede administrar directamente en el disco intervertebral, tal como al inyectar el compuesto del inhibidor del factor de transcripción en el anillo fibroso, el núcleo pulposo, o ambos. Debido a la naturaleza avascular de los discos intervertebrales, la inyección directa en el disco intervertebral tiene el potencial de proporcionar tratamiento de acción más rápida y de dosis inferior que administrar el compuesto del inhibidor del factor de transcripción a través de una ruta diferente.

También se describen equipos que llevan a cabo los métodos descritos anteriormente. Los actuales equipos también pueden incluir uno o más reactivos, reguladores, medios, proteínas, analitos, etiquetas, células, programas de ordenador para analizar los resultados, y/o equipo de laboratorio desechable, tal como platos de cultivo o placas multipozo, con el fin de facilitar fácilmente la implementación de los métodos actuales. Los soportes sólidos pueden incluir glóbulos, platos de cultivo, placas multi-pozo y similares. Ejemplos de los componentes de equipo preferidos se pueden encontrar en la descripción anterior y en los siguientes ejemplos.

Estos métodos actuales se ilustran adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

En todos los ejemplos, se utilizan los ODN señuelo de hebra doble de fosforotioato que tienen las secuencias: 5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC- 3’ (SEQ ID NO.: 1); 3’-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5’ (SEQ ID NO.: 2), diseñadas para ser reconocidas por el sitio de unión NF-KB.

Ejemplo 1: Reversión de la Degeneración intervertebral del Disco In Vivo Luego de Tratamiento con un Inhibidor NF-KB

En este ejemplo, una inyección intra-discal de señuelo NF-KB desnudo es efectiva en restaurar parcialmente la altura del disco en un modelo de punción anular de conejo. Bajo anestesia general veinticuatro conejos blancos de Nueva Zelanda (3 kg), utilizados con la aprobación de la IACUC, reciben una punción en el anillo en dos IVD lumbares no contiguos (L2/3 y L4/5) con una aguja 18G a una profundidad de 5 mm para inducir la degeneración del disco. Los discos en L3/4 sirven como controles sin punción. Los conejos se dividen igualmente en tres grupos, que incluyen un control punzado, un grupo de inyección única y un grupo de inyección doble. Para el grupo de inyección única, en una punción inicial, 1 µg o 10 µg de NF-KB ODN en vehículo 10 µl se inyecta utilizando una aguja 28G al disco L2/3

o L4/5. Para el grupo de doble inyección, cuatro semanas después de la punción inicial y la inyección de señuelo, la misma dosis de NF-KB ODN señuelo se inyecta en los discos punzados. Se toman cada dos semanas rayos X laterales de la columna lumbar para medir la altura de IVD. Ocho semanas después de la primera inyección, se cosechan las espinas lumbares y se toman imágenes MRI sagitales.

Se mide la altura IVD con un programa acostumbrado utilizando el software MathLab y se calcula el porcentaje DHI (%DHI = DHI postoperativo/ DHI preoperativo x100). El MRI sagital de la columna lumbar en L2/3, L3/4 y L4/5 se evalúa para la clasificación MRI de la degeneración de disco utilizando la escala grado MRI (0-3) como se describió previamente. Se evalúan las diferencias entre los grupos para significancia estadística mediante ANOVA repetido y la prueba post hoc PLSD de Fisher. Se aplican la prueba de Friedman y la prueba U de Mann-Whitney para la clasificación MRI.

Como se demuestra por la FIGURA 2, el grupo de punción muestra disco significativamente más angosto en los discos punzados dos semanas después de la punción, que se mantiene hasta ocho semanas (pre-op vs. 2W, 4W, 6W, 8W, todos p<0.01). En el grupo de inyección única, no existen diferencias significativas en el %D de HI entre los discos inyectados con 1 µg o 10 µg de ODN señuelo y los discos de control punzados en cualquier momento. Cuatro semanas después de cirugía inicial, en los animales inyectados doblemente, el DHI de 1 µg y 10 µg de los grupos ODN señuelo no muestran diferencias significativas del grupo punzado, como también se ve en el grupo de inyección único (DHI a 4W, control punzado: 71.4±5.2 %; 1 µg: 75.8±2.4 %; 10 µg: 78.7±2.4 %). Sin embargo, después de la segunda inyección del ODN señuelo en cuatro semanas, la altura del disco se empieza a recuperar y en seis y ocho semanas en los discos inyectados con 1 µg o 10 µg de ODN señuelo, la altura del disco tiende hacia el nivel de control no punzado. La recuperación es significativa en el grupo 10 µg (1 µg, 6W: 80.7±3.2 %, p=0.07; 8W: 81.8± 5.0 %, p=0.12; 10 µg, 6W: 86.1±3.8 %, p<0.01; 8W: 86.7± 4.3 %, p<0.05 vs. control punzado).

Los resultados de la clasificación MRI muestran diferencias significativas entre el grupo punzado y el grupo inyectado con señuelo (Control [punción]: 2.1±0.6; inyección única [1 µg]: 1.4±0.7, p<0.01; inyección única [10 µg]: 1.7±0.7, p<0.05; doble inyección (1 µg): 1.8±0.7, p=0.21; doble inyección (10 µg): 1.7±0.6, p<0.05, vs. control [punción]).

Para examinar la distribución del ODN señuelo in vivo, se inyecta el ODN señuelo marcado con FITC (10 µg) en discos de conejo (L2/3 y L4/5) después de punción en el anillo como se describió anteriormente. En el día 7 después de la inyección, bajo anestesia profunda, los conejos se fijan, utilizando una técnica de fijación de perfusión. Los animales se sacrifican y se retiran los IVD. Se cortan criosecciones (8 µm), y se forman imágenes de las muestras utilizando un microscopio confocal. La FIGURA 1 demuestra que en el día 7 después de inyección, se detecta el ODN señuelo marcado con FITC en los tejidos de núcleo pulposo (NP) y anillo fibroso (AF). Se confirma la intensidad fluorescente en el núcleo y en el citoplasma de las células NP y AF.

Ejemplo 2: Regeneración de Disco Estimulado de Degeneración Intervertebral de Disco In Vivo Luego de Tratamiento con un Inhibidor NF- KB

En este ejemplo, una inyección intra-discal única de señuelo NF-KB desnudo es efectiva en restaurar parcialmente la altura del disco en un modelo de punción anular de conejo. Bajo anestesia general, catorce conejos Blancos de Nueva Zelanda (3 kg), utilizados con la aprobación de la IACUC, reciben una punción en el anillo en dos IVD lumbares no contiguos (L2/3 y L4/5) con una aguja 18G a una profundidad de 5 mm para inducir la degeneración del disco. Los discos en L3/4 sirven como controles no punzados. Los conejos se dividen igualmente en tres grupos, que incluyen un grupo de inyección PBS, un grupo ODN señuelo de 1 µg, y un grupo ODN señuelo de 10 µg. Cuatro semanas después de la punción inicial, se inyecta 1 µg o 10 µg de ODN señuelo en 10 µL de PBS o PBS solo (grupo PBS) utilizando una aguja 28G en el disco L2/3 y L4/5. Se toman cada dos semanas rayos X laterales de la columna lumbar para medir la altura de IVD. Ocho semanas después de la punción inicial, se cosechan espinas lumbares y se toman imágenes MRI sagitales y luego se procesan para análisis histológico.

Se mide la altura IVD con un programa personalizable que utiliza el software MathLab, y se calcula el porcentaje DHI (%DHI = DHI postoperativo/ DHI preoperativo x 100). Los MRI sagitales de la columna lumbar a L2/3, L3/4 y L4/5 se evalúan la clasificación MRI de la degeneración de disco utilizando la escala grado MRI (0-3) como se describió previamente. Se cosechan discos, y las secciones sagitales de los IVD se tiñen con verde Safranin-O/Fast y Hematoxilina y Eosina. Las secciones histológicas se analizan y se clasifican en cuatro parámetros utilizando una escala de grado establecido con grados que varían desde una clasificación normal de 4 a severamente degenerado en una clasificación de 12. Se evalúan las diferencias entre los grupos para significancia estadística mediante ANOVA repetido y la prueba post hoc PLSD de Fisher. La prueba de Friedman y la prueba U de Mann- Whitney se aplican para la clasificación MRI.

Para examinar la distribución del ODN señuelo in vivo, se inyecta ODN señuelo marcado con FITC (10 µg) en discos de conejo (L2/3 y L4/5) cuatro semanas después de punción en el anillo. En el día 7 después de la inyección, bajo anestesia profunda, los conejos se fijan, utilizando una técnica de fijación de perfusión. Los animales se sacrifican y se retiran los IVD. Se cortan criosecciones (8 µm), y se forman imágenes de las muestras utilizando microscopía fluorescente. La FIGURA 3 demuestra que el día 7 después de inyección, se encuentra el ODN señuelo marcado con FITC en el núcleo pulposo y anillo interno del disco punzado. Las imágenes de alta magnificación revelan que la intensidad fluorescente se encuentra en el núcleo y/o en el citoplasma de las células de disco.

Como se demuestra por la FIGURA 4, el grupo de control punzado muestra disco significativo más angosto en los discos punzados dos semanas después de punción, que se mantiene hasta ocho semanas (vs. pre-op, p<0.01). Cuatro semanas después de la punción inicial, el DHI de los grupos de inyección ODN de 1 µg y 10 µg no muestran diferencias significativas del grupo PBS (DHI a 4W, PBS: 74.4±4.1 %; 1 µg: 77.0±2.2 %; 10 µg: 76.3±3.2 %). Sin embargo, después de la inyección de 1 µg o 10 µg de ODN en cuatro semanas, la altura del disco se empieza a recuperar en tiempos de punto de la semana seis y ocho, hacia el nivel del nivel de control no punzado. La recuperación es estadísticamente significativa en el grupo ODN (1 µg) (1 µg, 6W: 90.1±6.4 %, p=0.07; 8W: 85.8± 5.9 %, p<0.05; 10 µg, 6W: 86.1±5.7 %, p=0.17; 8W: 83.6± 5.9 %, p=0.08 vs. control punzado).

El MRI muestra que existe una tendencia para inyección ODN para reducir las clasificaciones de grado comparado con el grupo de control punzado (Control Punzado: 3.50± 0.2; Señuelo [1 µg]: 2.71±0.3, p=0.13; Señuelo [10 µg]: 3.12±0.1, p=0.25 vs. Control Punzado).

En 8 semanas después de la punción inicial, las clasificaciones de grado histológico de discos degenerativos punzados son significativamente mayores en el grupo de control punzado (8.75 ± 0. 75) que en el grupo inyectado con señuelo de 1 µg (6.0 ± 0.53, p<0.05 vs. PBS). Como se muestra en la FIGURA 5, en el grupo de inyección de señuelo (1 µg), se observan números relativamente altos de las células similares a condrocitos y ricos en ECM en el área del núcleo y el límite entre el núcleo y el anillo.

Ejemplo 3: Respuesta Reducida de Células de Disco intervertebral In Vitro de IL-1 Luego de Tratamiento con un Inhibidor NF-KB

Este ejemplo ilustra el uso de la invención para demostrar que un inhibidor NF-KB cuando se agrega a células del disco intervertebral reduce la respuesta de las células a IL-1, un mediador catabólico cuando se mide mediante la producción de los MMP, TIMP-1, IL-6 y NO.

Las células NP y AF de donadores mayores de 65-70 años se aíslan y se cultivan en glóbulos de alginato a 4x106 células/ ml en medio completo (DMEM/ 10% de FBS/ gentamicina /25 µg/ml de ácido ascórbico), que se cambia diariamente. Después de cinco días precultivo en medio completo, los glóbulos se cultivan en medio libre de suero sin antibióticos durante 24 hrs. Las células que luego se transfectan con oligonucléotidos desnudos comprenden señuelos mezclados (SCD) 0.5 µM, un señuelo de hebra sencilla (SSD) 1 µM, y los ODN señuelo (0.5 µM) durante cuatro horas. Las células en donde no se transfecta el oligonucleótido se utilizan como un control. Luego de transfección, se utiliza ODN señuelo marcado con FITC para determinar la eficiencia de transfección. Después de transfección, las células en los glóbulos de alginato se tratan con o sin IL-1 (5 rg/ml) y se incuban durante 48 hrs.

Al final de periodo de incubación, el medio de los diferentes tratamientos se recolecta para Western Blot y análisis de producción NO. Para análisis de Western Blot, mostrado en la FIGURA 7, se utilizan los siguientes anticuerpos: anti-MMP-1, anti-ADAMTS4 (Santa Cruz Biotechnology), anti-MMP-2 y -MMP-3 (Oncogene), anti-MMP-9 y -MMP-13, anti- TIMP-1, anti-IL-6. Para medir la producción de Óxido Nítrico, se utiliza un Equipo de Ensayo de Óxido Nítrico de R&amp;D Systems. Se realiza análisis estadístico utilizando ANOVA de una vía y prueba post hoc PLSD de Fisher.

Para medir la eficiencia de transfección, la presencia del ODN señuelo FITC en el citoplasma y el núcleo se confirma en células NP y AF con microscopio confocal (eficiencia de transfección ' 80%) como se demuestra por la FIGURA

6. Sin la transfección del ODN señuelo, la adición de IL-1 al medio aumenta significativamente los niveles de proteína MMP-1, -2, -3, -9, -13, ADAMTS4 e IL-6, y los niveles de proteína TIMP-1 significativamente reducidos en el medio de las células AF y NP. Como se muestra por el Western Blot de la FIGURA 7, la transfección con señuelo durante cuatro horas reduce significativamente los niveles de proteína de los MMP mejorados por IL-1 en ambos tipos celulares (AF: MMP-1: 62 %; MMP-2: 38 %; MMP-3: 96 %; MMP-9: 97 %; MMP- 13: 43 %; ADAMTS4: 47 %, NP: MMP-1: 31 %; MMP-2: 54 %; MMP-3: 35 %; MMP-9: 43 %; MMP-13: 24 %; ADAMTS4: 42 %) mientras aumenta significativamente en los niveles TIMP-1 se ve en las células NP. La adición de IL-1 también estimula la producción de NO mediante las células NP y AF aproximadamente tres veces. La adición de IL-1 a las células transfectadas con los ODN señuelo (0.5 µM) resulta en una reducción marcada de los niveles NO en el medio, al 50% en células AF y 66% en células NP.

Ejemplo 4: Aumento en el Contenido de Proteoglucano de las Células AF y NP Cultivadas Luego de Tratamiento con el Inhibidor NF-KB

Este ejemplo ilustra el uso de la invención para demostrar que un inhibidor NF-KB cuando se agrega a las células de disco intervertebral aumenta significativamente el contenido de proteoglucano de las células AF y NP durante el cultivo.

Se aíslan células NP y AF y se precultivan en glóbulos de alginato en medio DMEM/10% de FBS durante 14 días. Después de precultivo, las células se dejan sin tratamiento (Cont), se tratan con el oligonucleótido NF-KB de hebra sencilla (SSD) 2 µM durante seis horas, o se tratan con 1 µM (D1) o 10 µM (D10) de un oligonucleótido señuelo NF-KB de hebra doble durante seis horas. Luego de cada tratamiento, las células se cultivan adicionalmente durante dos

o siete días. Al final del cultivo, los glóbulos de alginato que contienen las células NP y AF se digieren con papaína y el contenido de proteoglucano de las células cultivadas se mide mediante el método de unión de tinte azul de dimetilmetileno.

Como se demuestra por la FIGURA 8, la administración de 10 µM de Señuelo NF-KB de doble hebra es solo el tratamiento capaz de aumentar significativamente la cantidad de proteoglucano en células AF y NP cultivadas (** p < .01, * p < .05). Este aumento en el contenido de proteoglucano soporta que la recuperación la altura del disco en los estudios in vivo puede ser mayor que la inhibición de la degradación. La recuperación de la altura del disco y el aumento en la cantidad de proteoglucano demuestra una mejora de la capacidad de las células NP y AF para formar la matriz luego de tratamiento con Señuelo NF-KB de doble hebra.

Ejemplo 5: Supresión de la Capacidad de Unión de ADN Activado IL-1 de NF-KB y Supresión de la Degradación de PG Inducida por IL-1 de las Células de Disco intervertebral In Vitro Luego de Tratamiento con un Inhibidor NF-KB

Este ejemplo demuestra que un inhibidor NF-KB cuando se agrega a las células del disco intervertebral suprime la capacidad de unión del ADN del NF-KB activado por IL-1 . Adicionalmente, la transfección continua de ODN señuelo es efectiva en suprimir la degradación PG inducida por IL-1 .

Las células NP y AF se cortan de los IVD de columnas vertebrales de cadáveres humanos. Las células primero se aíslan mediante digestión secuencial de enzima y se suspenden en 1.2% de glóbulos de alginato a 2x106 células/ml y luego se cultivan en medio completo (DMEM/F12 con 20% de FBS). Después de 14 días de precultivo en medio completo, los glóbulos se cultivan en medio libre de suero sin antibióticos durante 24 hrs, y luego se agrega simplemente ODN señuelo al medio de cultivo de las células de disco durante 4 horas. Se utiliza Señuelo de hebra sencilla (SSD) como el control de nucleótido. El ODN señuelo marcado con FITC se utiliza para determinar la eficiencia de transfección. Dos días después de transfección, se evalúa la citotoxicidad mediante el ensayo LDH.

Como se muestra en la Tabla 1, se dividen las células en los glóbulos de alginato en el control (sin tratamiento) y cinco grupos experimentales. En el grupo experimental &quot;D10c + IL&quot;, las células se transfectan continuamente con ODN Señuelo, que significa que el ODN señuelo está continuamente presente a través del tratamiento de IF-1 .

Tabla 1

Control

D10 IL-1 SSD + IL D10 + IL D10c + IL

Transfección

Ninguno Señuelo 10 µM Ninguno SSD 20 µM Señuelo 10 µM Señuelo 10 µM

Tratamiento 10 0 20 días

Ninguno Ninguno IL-1 5 ng/mL IL-1 5 ng/mL IL-1 5 ng/mL Señuelo + IL-1

Una hora después de estimulación de IL-1 , se aíslan separadamente las fracciones nucleares y citoplásmicas y se fosforilan. Se examina la capacidad de unión del ADN de NF-KB (p65) utilizando el equipo de ensayo del factor de transcripción NF-KB (Motivo Activo). Dos días después del estímulo de IL-1 , la producción de MMP-3 que se secreta en el medio se evalúan mediante un equipo ELISA (Biosource). En los días 10 y 20 después de transfección, la síntesis del proteoglucano (PG) y la acumulación en cada grupo experimental se evalúan mediante un ensayo de filtración rápido después de la precipitación de Azul Alcian y mediante el método DMMB luego de la digestión de papaína, respectivamente. Se realiza el análisis estadístico utilizando ANOVA de una vía y la prueba post hoc de PLSD de Fisher.

Como se muestra en la FIGURA 9, se transfectan uniformemente los ODN señuelo marcados con FITC en las células dentro de los glóbulos de alginato sin utilizar ninguno de los reactivos de transfección. No se observan efectos citotóxicos en células AF o NP mediante la transfección del ODN señuelo (10 µM). El tratamiento de IL-1 induce un aumento significativo en la capacidad de unión del NF- KB fosforilado (p65) al ADN mediante las células AF y NP. La transfección del ODN señuelo resulta en una supresión significativa del aumento inducido por IL-1 de la capacidad de unión por p65-ADN mediante las células AF y NP (AF: IL 171.9 %, D10+IL 84.2 %; NP: IL 245.6 %, D10+IL 152.1 %, % de Control, p<0.01 vs. IL). El tratamiento de IL-1 induce un aumento significativo en la secreción de MMP3 en el medio. La transfección única (D10+IL) o continúa (D10c+IL) de ODN señuelo suprime significativamente la producción de MMP3 en la presencia de la estimulación de IL-1 (AF: IL 199.6 %, D10+IL 173.6; D10c+IL 165.7 % / NP: IL 403.0 %, D10+IL 293.2 %, D10c+IL 266.5 %, % de Control, p<0.05 vs. IL).

En las células NP, la transfección de Señuelo solo (D10) aumenta significativamente la síntesis de PG en los días 10 y 20 (AF: 110.6 %; NP: 113.5 %, % de Control, día 20). La adición de IL-1 induce una reducción significativa en la síntesis de PG (AF: 79.5 %; NP: 69 %, % de Control, día 20). Sin embargo, esta reducción no se suprime mediante la transfección de ODN señuelo en las células AF o NP.

Como se muestra en la FIGURA 10, la adición de Señuelo solo aumenta significativamente el contenido de PG en los glóbulos (grupo D10). La adición de IL-1 reduce significativamente el contenido de PG en las células AF y NP en todos los puntos de tiempo. Sin embargo, esta reducción inducida por IL-1- se suprime significativamente mediante la transfección continua de Señuelo en células AF y NP (AF: IL 73.2 %; D10c+IL 105.8 % / NP: IL 66.8 %; D10c+IL 93.4 %, % de Control, p<0.01 vs. IL, día 20).

Los actuales métodos pueden involucrar cualquiera o todas las etapas o condiciones discutidas anteriormente en diversas combinaciones, según se desee. De acuerdo con lo anterior, será fácilmente evidente para el experto que en algunos de los métodos descritos se pueden eliminar ciertas etapas o se realizan etapas adicionales sin afectar la viabilidad de los métodos. Como se utiliza aquí un significa &quot;uno&quot; o &quot;uno o más.&quot;

Como lo entenderá por un experto en la técnica, para todos los propósitos, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los rangos descritos aquí también abarcan todos los subrangos posibles y combinaciones de subrangos de los mismos. Cualquier rango enumerado se puede reconocer fácilmente como se describe suficientemente y permite que el mismo rango se descomponga en por lo menos mitades iguales, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc. Como un ejemplo no limitante, cada rango discutido aquí se puede descomponer fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. Como también lo entenderá un experto en la técnica todo el lenguaje tal como &quot;hasta,&quot; &quot;por lo menos,&quot; &quot;mayor que,&quot; &quot;menor que,&quot; &quot;más de,&quot; y similares incluyen el número mencionado y se refiere a los rangos que se pueden descomponer posteriormente en subrangos como se discutió anteriormente. De la misma forma, todas las relaciones descritas aquí también incluyen todas las subrelaciones que caben dentro de la relación más amplia.

Un experto en la técnica también reconocerá fácilmente que cuando los miembros se agrupan en una forma común, tal como en un grupo Markush, la presente invención abarca no solo el grupo completo enumerado como un todo, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal. De acuerdo con lo anterior, para todos los propósitos, la presente invención abarca no solo el grupo principal, sino también el grupo principal ausente, uno o más de los miembros del grupo. La presente invención también prevé la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros de grupo en la invención reivindicada.

Aunque se han ilustrado y descrito realizaciones preferidas, cabe entender que se pueden hacer cambios y modificaciones allí de acuerdo con la persona medianamente experta en la técnica sin apartarse de la invención en sus aspectos más amplios como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de un inhibidor NF-KB en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una degeneración del disco intervertebral, en donde el inhibidor NF-kB se selecciona del grupo que consiste de un oligonucleótido señuelo capaz de unirse al sitio de unión de ADN de NF-KB, un ácido nucleico NF-kB anticodificante,

   5 y un siARN NF-kB.

2. 2.

   El uso de la reivindicación 1, en donde el inhibidor NF-kB es un NF-KB Señuelo.

3. 3.

   El uso de la reivindicación 1, en donde el inhibidor NF-kB es un NF-KB Señuelo que tiene la secuencia de la SEQ ID NO.: 1.

4. 4. El uso de la reivindicación 1, en donde una dosis efectiva del inhibidor NF-kB es menor que o igual a 500 10 microgramos.

5. 5.

   El uso de la reivindicación 1, en donde una dosis efectiva del inhibidor NF-kB es menor que o igual a 200 microgramos.

6. 6.

   El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el inhibidor NF-kB se administra en regulador fisiológico.

   15 7. El uso de la reivindicación 6 en donde el regulador fisiológico es una solución de regulador de fosfato o una solución de 5% de lactosa.

7. 8. Un inhibidor NF-kB para uso en el tratamiento o prevención de una degeneración del disco intervertebral, en donde el inhibidor NF-kB se selecciona del grupo que consiste de un oligonucleótido señuelo capaz de unirse al sitio de unión de ADN de NF-KB, un ácido nucleico NF-kB anticodificante, y un siARN NF-kB.

   20 9. El inhibidor NF-kB de la reivindicación 8, en donde el tratamiento o prevención se define adicionalmente en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.