WO2010079811A1 - 椎間板変性関連疾患感受性遺伝子およびその用途 - Google Patents

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WO2010079811A1
WO2010079811A1 PCT/JP2010/050109 JP2010050109W WO2010079811A1 WO 2010079811 A1 WO2010079811 A1 WO 2010079811A1 JP 2010050109 W JP2010050109 W JP 2010050109W WO 2010079811 A1 WO2010079811 A1 WO 2010079811A1
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gene
seq
intervertebral disc
represented
homology
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PCT/JP2010/050109
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見生 永田
美智代 津留
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学校法人久留米大学
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for discriminating a disease related to intervertebral disc degeneration, a method for screening a preventive or therapeutic agent for the disease, a pharmaceutical for preventing or treating the disease.
  • the human race has already suffered a fateful pain called low back pain from the process of evolution, including bipedal walking, and there are very few things that do not experience low back pain in their lifetime.
  • back pain has been increasing due to lifestyle changes.
  • the spine has a gentle S shape when viewed from the side, and the waist that supports it is protected by elastic muscles and an intervertebral disc that acts as a cushion.
  • the intervertebral disc becomes fragile with aging and is damaged by shock, which is said to cause back pain.
  • Low back pain is generally treated by conservative therapy.
  • Conservative therapy is a method in which treatment is performed without resting directly on the lesion by surgery or the like, and a treatment is performed by administering a drug.
  • Conservative therapy for low back pain includes physical therapy (hyperthermia, low-frequency therapy, etc.), drug therapy, brace therapy (such as wearing a corset), block injection, exercise therapy, and traction therapy.
  • a poultice is sometimes used for the purpose of local tension relaxation or blood circulation promotion. Applying these can relieve muscle tension and improve back pain to a certain extent, but it cannot cure back pain.
  • the main complaints of low back pain are lumbar disc herniation and lumbar spinal canal stenosis, intervertebral disc damage, that is, diseases caused by abnormalities such as deformity and degeneration of the disc due to pressure on the disc.
  • intervertebral disc damage that is, diseases caused by abnormalities such as deformity and degeneration of the disc due to pressure on the disc.
  • the elucidation of essential causes such as the onset mechanism has not yet been made. For this reason, it has not been possible to restore the normal part that causes the onset physiologically.
  • Sox9 The protein encoded by the Sox9 [SRY (Sex determining region Y) related-box9] gene recognizes the CCTTGAG sequence together with other HMG box DNA binding proteins. Sox9 acts during chondrocyte differentiation and is associated with steroid synthesis factor 1 to regulate transcription of the anti-Müller tube (AMH) gene. Sox9 deficiency often leads to skeletal malformation syndrome flexion dysplasia accompanied by sex change (see Non-Patent Document 1). In addition, the Msx1 (Home box, Msh-like 1) gene functions in body axis pattern formation (see Non-Patent Document 2).
  • ⁇ ⁇ Drugs that can be used in combination with conservative therapy and have a high curative effect are desired for the healing of low back pain, especially for vertebral disc herniation, lumbar spinal canal stenosis, and intervertebral disc degeneration-related diseases.
  • the inventors conducted gene analysis of the intervertebral discs from the mouse lumbar discs L2 to L6.
  • a mouse standing mouse
  • genetic analysis of the standing mouse lumbar disc was performed over time.
  • the present invention [1] A method for determining whether or not a vertebrate suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease, using a gene-containing sample collected from a test vertebrate, and using Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Analyzing the expression of at least one gene selected from Vdr and Vegfa, [2] The method according to [1], wherein the vertebrate is a human or a mouse.
  • Msx1 is the gene represented by SEQ ID NO: 1 or an ortholog thereof
  • Sox9 is the gene represented by SEQ ID NO: 2 or an ortholog thereof
  • Nfkb1 is the gene represented by SEQ ID NO: 3 or an ortholog thereof
  • Pdgfa is the gene represented by SEQ ID NO: 4 or an ortholog thereof
  • Sparc is the gene represented by SEQ ID NO: 5 or an ortholog thereof
  • Vdr is the gene represented by SEQ ID NO: 6 or an ortholog thereof
  • Vegfa is the gene represented by SEQ ID NO: 7 or an ortholog thereof.
  • a screening method for a preventive or therapeutic agent for intervertebral disc degeneration-related disease [7] The method according to [6], wherein the intervertebral disc degeneration-related disease is intervertebral disc herniation, spinal stenosis or intervertebral disc injury, [8] Msx1 is the gene represented by SEQ ID NO: 1 or an ortholog thereof; Sox9 is the gene represented by SEQ ID NO: 2 or an ortholog thereof; Nfkb1 is the gene represented by SEQ ID NO: 3 or an ortholog thereof; Pdgfa is the gene represented by SEQ ID NO: 4 or an ortholog thereof; Sparc is the gene represented by SEQ ID NO: 5 or an ortholog thereof; The method according to [6] or [7], wherein Vdr is the gene represented by SEQ ID NO: 6 or an ortholog thereof; and Vegfa is the gene represented by SEQ ID NO: 7 or an ortholog thereof.
  • Pdgfa is a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 4;
  • Sparc is a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 5;
  • Vdr is a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 6; and
  • Vegfa is a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 7, [ 11], [14]
  • the pharmaceutical composition according to any one of [11] to [13], wherein the nucleic acid is treated with microbubbles and the affected area is subjected to ultrasonic treatment.
  • the present invention provides a method for determining whether or not a vertebrate suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease. According to this method, it is possible to easily and quickly determine whether or not the patient is suffering from an intervertebral disc degeneration-related disease. In addition, according to this method, it is possible to identify an intervertebral disc whose intervertebral disc pressure has increased due to an excessive load, so it is possible to identify an intervertebral disc that can cause a disc degeneration-related disease and take preventive measures. Become.
  • the present invention also provides a screening method for a prophylactic or therapeutic agent for intervertebral disc degeneration-related diseases. According to this screening method, a prophylactic or therapeutic agent for intervertebral disc degeneration-related diseases can be screened quickly and easily.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for prevention or treatment of intervertebral disc degeneration-related diseases.
  • a disc degeneration-related disease can be performed more rapidly and efficiently than a conventional pharmaceutical composition for intervertebral disc degeneration-related diseases. It can be cured.
  • a pharmaceutical composition in which a gene is incorporated in a vector and a microbubble treatment is used as a poultice as an active ingredient is particularly useful because it can perform genetic therapy and drug therapy simultaneously.
  • FIG. 6 is a diagram comparing expression levels of genes in each lumbar disc (L2 to L6) of standing mice.
  • the vertical axis represents the gene expression level. It is a figure which shows that Msx1 and Sox9 gene which carried out the microbubble process were introduce
  • the “gene” in the present invention may be in any form unless otherwise specified.
  • cDNA complementary DNA prepared from mRNA is included.
  • the present invention relates to a method for determining whether or not a vertebrate suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease.
  • the present invention uses Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa (hereinafter referred to as “genetical samples”) collected from vertebrates.
  • Vertebrate characterized by analyzing the expression of at least one gene selected from “genetic susceptibility gene for intervertebral disc degeneration related to the present invention” or simply “the gene of the present invention”
  • Is a method of determining whether or not the patient suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease hereinafter also referred to as “the determination method of the present invention”).
  • Intervertebral disc degeneration related disease susceptibility genes decrease in intervertebral discs that have been overloaded or affected by intervertebral disc degeneration-related diseases, so by analyzing the expression level of these genes, vertebrates can develop intervertebral disc degeneration. It is possible to determine whether the patient is suffering from a related disease.
  • nucleic acids are first extracted from gene-containing samples collected from vertebrates.
  • the gene-containing sample used in the discrimination method of the present invention is collected from vertebrates.
  • the present invention aims to determine whether or not a vertebrate suffers from an intervertebral disc-related disease. Therefore, tissues constituting the trunk centered on the spine (for example, the spine, Spinal column). Of these, the spine is preferred, the intervertebral disc is particularly preferred, and the lumbar disc is most preferred.
  • vertebrate refers to a vertebrate subject to be tested to determine whether or not it is suffering from an intervertebral disc degeneration-related disease, having a vertebra and causing abnormalities in the intervertebral disc.
  • the animal is not particularly limited as long as the animal has a possibility of suffering from an intervertebral disc degeneration-related disease, and examples thereof include mammals, birds, reptiles, amphibians, fish and jawless species. Mammals or birds are preferred, and humans or mice are particularly preferred.
  • disc degeneration-related diseases refers to all diseases caused by abnormalities in the intervertebral disc such as degeneration of the intervertebral disc, and is not particularly limited.
  • Intervertebral disc abnormalities are various such as excessive load on the intervertebral disc, decrease or degeneration of chondrocytes constituting the intervertebral disc, carcinogenesis of cartilage tissue, decrease of protein (collagen etc.) and sugar (chondroitin sulfate etc.) constituting cartilage tissue Depending on the cause, the abnormalities associated with these discs are known to those skilled in the art.
  • intervertebral disc degeneration-related disease in the present invention include disc herniation (eg, cervical disc herniation, lumbar disc herniation), cancer, disc injury, spinal stenosis (eg, lumbar spinal stenosis), scoliosis. Etc.
  • Nucleic acid extraction from a gene-containing sample is not particularly limited and can be performed according to a conventional method.
  • RNA is extracted, animal tissue or cells are disrupted and solubilized with a solubilizing agent, then protein is removed with a denaturing agent, and the gene is precipitated with ethanol or the like, so that mRNA is extracted from the animal tissue or cells.
  • ISOGEN trade name, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • cDNA is synthesized by performing reverse transcription reaction using reverse transcriptase using this mRNA as a template and oligo (dT) primer.
  • Reverse transcriptases, reagents and the like used for the reverse transcription reaction are known and can be easily prepared by those skilled in the art.
  • the cDNA obtained by reverse transcription can be directly used in the subsequent reaction (for example, microarray etc.), but the disc susceptibility gene of the present invention in the extracted nucleic acid can be used. At least one gene selected from the above may be amplified to obtain an amplification reaction product.
  • a general gene amplification reaction known per se can be used without limitation using the cDNA obtained above as a template.
  • the gene amplification reaction that can be used in the discrimination method of the present invention include the polymerase chain reaction method (PCR method), the Loop-Mediated Isotropic Amplification method (LAMP method), the Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification IC method. (Registered trademark)), real-time PCR method and the like.
  • PCR method polymerase chain reaction method
  • LAMP method Loop-Mediated Isotropic Amplification method
  • LAMP method the Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification IC method.
  • Real-time PCR method Real-time PCR method and the like.
  • Each of the gene amplification reactions can be performed using a commercially available kit according to the manufacturer's instructions, and by using a primer pair capable of amplifying a specific gene region and a probe labeled with a fluorescent dye, a specific gene amplification is performed. Re
  • the primer that can be used to amplify a specific gene region used in the discrimination method of the present invention may be designed by any method known to those skilled in the art, and is not particularly limited. As a result of the alignment of the genomic base sequences, it may be determined based on a portion showing high homology. Although the alignment method is not particularly limited, a homology calculation algorithm such as FASTA or BLAST is preferably used. These methods are known to those skilled in the art.
  • the gene amplification reaction product obtained by the discrimination method of the present invention can be prepared, for example, by applying the gene amplification reaction using the following primers.
  • Primer designs can be determined as appropriate by those skilled in the art, and Primer 3 (version 0.4.0, Pick primers from a DNA sequence (developed by Steve Rosen and Helen Skalesky) (Whitehead Institute Hughes and Howard Institute Hughes) It can also be determined using a medical laboratory)), type: primer design support, license: public domain).
  • These primers can be used for any gene amplification reaction (RT-PCR, real-time PCR, etc.).
  • Msx1 Forward primer: CTCATGGCCGATCACACAGGAGA (SEQ ID NO: 8) Reverse primer: TACTGCTCTCTGCGGAACTT (SEQ ID NO: 9)
  • Sox9 Forward primer: CATGAAGATGACCGACGAG (SEQ ID NO: 10)
  • Reverse primer TGCACACGGGGACTACTATCT (SEQ ID NO: 11)
  • Nfkb1 Forward primer: CTGACCTGAGCCCTCTGGAC (SEQ ID NO: 12)
  • Pdgfa Forward primer: GAGATACCCCCGGGAGTTGAT (SEQ ID NO: 14) Reverse primer: TCTTGCAAACTGCAGGAATG (SEQ ID NO: 15)
  • Sparc Forward primer: CTGCGTGTGAAGAAGATCCCA (SEQ ID NO: 16)
  • Reverse primer TGGGACAGGTACCCCATCAAT (SEQ ID NO: 17)
  • VCAM Forward primer: GGAGACACTGTCATTATCTCTG (SEQ ID NO: 22) Reverse primer: TCCTTTCATGTTGGCTTTTCTGC (SEQ ID NO: 23) (9) Runx: Forward primer: TCTTCCCAAAGCCAGAGTG (SEQ ID NO: 24) Reverse primer: CATGGGAAACTGATAGGATCC (SEQ ID NO: 25) (10) TAZ: Forward primer: CGTGAAGTGGCCCGTTCCC (SEQ ID NO: 26) Reverse primer: AGGTGGTTTCATGTACTTGGTCC (SEQ ID NO: 27) (11) Runx-2: Forward primer: ATGCTTCATTCGCCTCAC (SEQ ID NO: 28) Reverse primer: ACTGCTTGCAGCCCTAAAT (SEQ ID NO: 29) (12
  • the discrimination method of the present invention can be carried out more precisely.
  • the gene amplification reaction is preferably PCR or real-time PCR.
  • Msx1 the case of Msx1 will be described using RT-PCR as an example.
  • the reverse transcription reaction can be performed by a method known per se. For example, using a commercially available kit containing a commercially available oligo dT primer or random hexamer as a primer, a reverse transcription reaction is performed using purified RNA as a template. The reaction is carried out at 42 ° C. to 60 ° C. for 15 minutes to 30 minutes, and after completion of the reaction, the reverse transcriptase is inactivated by heat treatment at 95 ° C. for 2 minutes. Subsequently, the Msx1 gene is amplified by performing PCR using the cDNA obtained by the above operation as a template. For PCR, a gene amplification reaction is performed using, for example, the primer represented by the aforementioned SEQ ID NO: 8 and / or 9.
  • a temperature condition in PCR can be appropriately determined by those skilled in the art based on experience, and is not particularly limited. For example, it can be performed by a step-down PCR method.
  • the reaction conditions for the step-down PCR method include, for example, Predature: 94 ° C. for 2 minutes, Denture: 98 ° C. for 10 seconds, Extension: 74 ° C. for 1 minute for 5 cycles, then Denatur: 98 ° C.
  • Extension for 10 seconds, Extension: 5 cycles of 1 minute at 72 ° C., then: Duration: 98 ° C. for 10 seconds, Extension: 5 cycles of 70 ° C. for 1 minute, and then Extension: 98 ° C. for 10 seconds, Extension: 68 ° C. for 1 minute After 25 cycles, Extension: reaction is performed at 68 ° C. for 7 minutes.
  • a heat block type program temperature control device is used for setting the temperature of the reaction, and an example of such a device is PCR Thermal Cycler (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.). The same reaction solution may be used for the reaction using reverse transcriptase and the PCR reaction.
  • the PCR product thus obtained can be used in subsequent experiments by inserting it into a multicloning site of various vectors (eg, pTA2, manufactured by TOYOBO) using an appropriate restriction enzyme.
  • various vectors eg, pTA2, manufactured by TOYOBO
  • the cDNA mixture obtained by the reverse transcription reaction or the amplification reaction product of the specific gene obtained by the amplification reaction is analyzed, and the test vertebrate suffers from the intervertebral disc degeneration-related disease. It is determined whether or not. By this step, it is possible to determine whether or not the subject vertebrate suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease.
  • the analysis method include a method of comparing the amount of amplification reaction product and a method of analyzing a cDNA mixture by a microarray.
  • the amount of the amplification reaction product can be confirmed according to a conventional method.
  • any conventionally known analysis methods such as gel electrophoresis, Southern blot, dot / slot blot, and sequence analysis, which are methods commonly used in the technical field, can be used, but from the viewpoint of easily using the present invention.
  • the amplification reaction product is preferably confirmed by agarose gel electrophoresis and subsequent gel staining. Agarose electrophoresis can be performed by a method known per se.
  • ethidium bromide As a method of gel staining of the obtained agarose gel, ethidium bromide may be used, but a method of staining with SyBR Safe DNA gel (Invitrogen) that is not harmful to the body and has the same sensitivity as conventional ethidium bromide. It can be preferably used. According to these methods, the amplified reaction product can be detected by observing the stained gel under ultraviolet light.
  • SyBR Safe DNA gel Invitrogen
  • the amount of the amplification reaction product of the gene of the present invention derived from a test vertebrate suspected of suffering from an intervertebral disc degeneration-related disease and the gene of the present invention derived from the same vertebrate not suffering from the disease When the amount of the amplification reaction product of the gene of the present invention in the test vertebrate is decreased, the test vertebrate suffers from or suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease. It can be determined that the possibility is high. Comparison of gene dosage can be performed by a method known per se.
  • the amount of gene when real-time PCR is applied is determined by monitoring the amount of fluorescence using a known amount of DNA diluted in stages as a standard. Examples of the fluorescence monitoring method include an intercalator method, a TaqMan probe method, and a cycling probe method. Those skilled in the art can appropriately determine these methods.
  • cDNA obtained by reverse transcription of mRNA extracted from a tissue is labeled with biotin and hybridized with DNA on a substrate.
  • the array used in the microarray is not particularly limited and may be a known microarray, but an array capable of hybridizing with the gene of the present invention is desirable. By labeling this with fluorescent light and measuring the fluorescence with an arbitrary measuring device, the expression level of mRNA can be measured.
  • the mRNA expression level of the gene of the present invention derived from a test vertebrate suspected of suffering from an intervertebral disc degeneration-related disease and the gene expression of the present invention derived from the same vertebrate not affected by the disease If the mRNA expression level of the gene of the present invention is decreased in the test vertebrate when compared with the mRNA expression level, the test vertebrate suffers from or suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease. It can be determined that the possibility is high. Comparison of mRNA expression levels can be performed by a method known per se.
  • Vertebrates can take various postures in daily life, but in order to support this, the vertebrae, especially the intervertebral discs, can be directly affected by their own weight and change into various forms. At this time, it is known that when the load applied to the intervertebral disc becomes excessive, the intervertebral disc internal pressure increases. Among them, the intervertebral disc that is most heavily loaded by its own weight is the lumbar disc (for example, L1 to L5 in humans and L1 to L6 in mice).
  • the lumbar disc for example, L1 to L5 in humans and L1 to L6 in mice.
  • the intervertebral disc degeneration-related disease susceptibility gene of the present invention is one whose expression decreases due to degeneration of the intervertebral disc, as shown in Examples described later.
  • the gene of the present invention is reduced in expression in the lumbar intervertebral disc that is subject to load due to its own weight and is easily denatured, particularly among the intervertebral discs. It will decrease. That is, by analyzing the expression level of the gene of the present invention, it is possible to understand the degree of intervertebral disc degeneration and the degree of load on the intervertebral disc, and also determine whether or not the subject suffers from an intervertebral disc degeneration-related disease. Is possible.
  • the gene of the present invention is not limited to the site where intervertebral disc degeneration-related diseases have occurred due to a temporary load on the intervertebral disc (with accompanying increase in intervertebral pressure), but disc degeneration itself has not yet been observed, Since the load (the accompanying increase in intervertebral disc pressure) is continuously occurring, the expression is also reduced at sites where intervertebral disc degeneration-related diseases can occur. Therefore, the discriminating method of the present invention has a high possibility of not only suffering from an intervertebral disc degeneration-related disease but also an intervertebral disc degeneration-related disease (specifically, it tends to be an intervertebral disc degeneration-related disease). And the presence of signs of onset).
  • the “gene of the present invention” is not limited to the genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • it may be an ortholog of the gene represented by SEQ ID NO: 1 to 7 having substantially the same biological activity as each gene represented by SEQ ID NO: 1 to 7.
  • Msx1 may be a gene represented by SEQ ID NO: 1 (mouse Msx1 gene, NM — 010835) or an ortholog thereof
  • Sox9 may be a gene represented by SEQ ID NO: 2 (mouse Sox9 gene, NM_011448) or an ortholog thereof
  • the “Nfkb1” may be a gene represented by SEQ ID NO: 3 (mouse Nfkb1 gene, NM_008689) or an ortholog thereof.
  • Pdgfa may be the gene represented by SEQ ID NO: 4 (mouse Pdgfa gene, NM_008808) or an ortholog thereof.
  • “Sarc” may be the gene represented by SEQ ID NO: 5 (mouse Sparc gene, NM_009242) or an ortholog thereof.
  • “Vdr” may be a gene represented by SEQ ID NO: 6 (mouse Vdr gene, NM_009504) or an ortholog thereof, and
  • “Vegfa” is represented by SEQ ID NO: 7. It may be a gene (mouse Vegfa gene, NM_009505) or an ortholog thereof.
  • the genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 7 are respectively queried, and the genome and / or cDNA database of mammals other than mice is searched using BLAST or FASTA.
  • the genome informatics provided by Jackson Laboratories can be used as a keyword to search for accession numbers, gene numbers, and gene names as keywords, and access to the information of the Mammarian Orthology of hit data. Information can be acquired.
  • the “gene of the present invention” is not otherwise defined and has at least one biological activity as long as it has substantially the same biological activity as each of the genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 7. Nucleic acid residue substitution, deletion, modification, insertion or addition (hereinafter, these may be collectively referred to as “conversion” of the nucleic acid) may be made.
  • Msx1 may be a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 1;
  • Sox9 may be a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 2;
  • Nfkb1 may be a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 3;
  • Pdgfa may be a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 4;
  • Sarc may be a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 5;
  • Vdr may be a gene having 80% or more homology with the gene represented by SEQ ID NO: 6;
  • Vegfa is represented by SEQ ID NO: 7. It may be a gene having 80% or more homology with the gene.
  • the “gene of the present invention” also includes DNA that hybridizes with the gene of the present invention under stringent conditions. These DNAs can be genetically engineered to introduce mutations into the DNA encoding the gene of the present invention by using known techniques such as site-directed mutagenesis / PCR (for example) ( Sambrook, Fritsch, and Maniatis, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (2nd ed) (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). To do). Examples of the stringent conditions include hybridization conditions described in the above-mentioned documents.
  • the formamide concentration is 45% (v / v)
  • the salt concentration is 5 ⁇ SSPE
  • the temperature is 42 ° C.
  • the homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more.
  • the ortholog of the gene represented by No. 1 eg, human Msx1 gene (human, NM_002448) etc. is included in Msx1 of the present invention.
  • homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more.
  • the ortholog of the gene represented by No. 2 eg, human Sox9 gene (human, NM — 014587) etc. is included in Sox9 of the present invention.
  • Nfkb1 it is about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more of homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the ortholog of the gene represented by No. 3 eg, human Nfkb1 gene (human, NM — 003998) etc.
  • Nfkb1 of the present invention is included in Nfkb1 of the present invention.
  • homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 is about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more.
  • a gene that has been shown to retain the biological activity that a known Pdgfa gene should have as well as the gene represented by SEQ ID NO: 4 (mouse Pdgfa gene, NM_008808)
  • the ortholog of the gene represented by No. 4 eg, human Pdgfa gene (human, NM — 033023) etc. is included in the Pdgfa of the present invention.
  • the homology of about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 A gene having a nucleotide sequence having a nucleotide sequence having a biological activity that a known Sparc gene should have as well as a gene represented by SEQ ID NO: 5 (mouse Sparc gene, NM_009242)
  • An ortholog of the gene represented by No. 5 eg, a human Sparc gene (human, NM_003118) and the like) is included in the SPARC of the present invention.
  • homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 is about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more.
  • the ortholog of the gene represented by No. 6 eg, human Vdr gene (human, NM_000376), etc. is included in the Vdr of the present invention.
  • the ortholog of the gene represented by No. 7 eg, human Vegfa gene (human, NM_001025366) etc. is included in Vegfa of the present invention.
  • the modification of the nucleic acid residue is not particularly limited, and constitutes a base part, a sugar part, and a phosphate part as long as it has substantially the same biological activity as each gene represented by SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the substituent may be substituted with various substituents or may be replaced with another atom. Such modifications are known to those skilled in the art.
  • the present invention is a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for intervertebral disk degeneration-related diseases.
  • the present invention is selected from Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa in the tissue after treating the intervertebral disc tissue with an agent to be screened.
  • a screening method for a prophylactic or therapeutic agent for intervertebral disc degeneration-related disease hereinafter, also referred to as “screening method of the present invention” characterized by analyzing the expression of at least one gene.
  • the intervertebral disc tissue is first treated with a drug to be screened.
  • the “tissue” is intended to be a group of cells that can be treated with a drug described later and the change can be observed, and an individual animal (mouse, rabbit, etc.) itself.
  • the concept encompasses not only cells of various primary cultures or established strains. That is, tissue drug treatment may be performed in vivo (in vivo) (then, the tissue treated with the drug is collected), and tissue collected from the body is processed in vitro (in vitro). Also good.
  • the tissue is appropriately selected depending on the site where the target gene is mainly expressed.
  • the tissue is preferably spinal tissue, more preferably intervertebral disc tissue, and particularly preferably lumbar disc tissue. .
  • the expression of Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and / or Vegfa in the tissue is examined.
  • the expression at the protein level can also be measured in parallel, thereby predicting the action mechanism of the drug screened in the present invention.
  • Expression at the protein level is not particularly limited as long as it is a method known to those skilled in the art.
  • the drug applied to the screening method of the present invention is not particularly limited, and may be a low molecular compound, a high molecular compound, a protein, a peptide, a gene, etc. that can be used as a prophylactic or therapeutic agent for intervertebral disc degeneration-related diseases. Any substance can be used.
  • This drug may consist of the substance alone, or may take the form of a composition, a medicine, etc. mixed with an arbitrary carrier.
  • the specific method of the screening method of the present invention can be carried out according to the above-described discrimination method of the present invention.
  • expression of the gene of the present invention in the intervertebral disc is performed by extracting mRNA from each of the intervertebral disc that has been treated with the drug and the disc that has not been treated with the drug, reverse transcription of this to obtain cDNA, and amplifying the obtained DNA. This can be done by comparing the amount with and without drug treatment. DNA amplification methods and gene expression level comparison methods are known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid extraction method from the intervertebral disc tissue is not particularly limited, and can be performed by the same method as described above (the method described in the “discrimination method of the present invention”).
  • the extracted mRNA can be reverse transcribed by the same method as described above.
  • An amplification reaction is then obtained for at least one gene selected from Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa.
  • the amplification reaction can be performed by a method similar to the method described above.
  • the amplification reaction product obtained by the amplification reaction is analyzed to determine whether the test drug is effective for intervertebral disc degeneration-related diseases. This step makes it possible to determine whether the test drug is useful as a preventive or therapeutic agent for intervertebral disc degeneration-related diseases.
  • the analysis method include a method of comparing the amounts of amplification reaction products. The amount of the amplification reaction product can be confirmed by the method described in the above “discrimination method of the present invention”.
  • test drug is effective for an intervertebral disc degeneration-related disease is determined by the amplification reaction of the gene of the present invention derived from an intervertebral disc tissue affected by the intervertebral disc degeneration-related disease (hereinafter also referred to as “degenerative disc”). This can be done by comparing the amount with the amount of amplification reaction product derived from the drug-treated degenerated disc. When the amount of the amplification reaction product of the gene of the present invention is increased when the drug is treated, it can be determined that the drug has an effect of improving an intervertebral disc degeneration-related disease, so that the drug prevents or treats an intervertebral disc degeneration-related disease. It is expected to be used as an agent.
  • Comparison of gene dosage can be performed by the method described above. When more accurate determination is required, it may be compared with the case where the amount of the amplification reaction product of the gene of the present invention is used as an index, or when a drug that can be determined not to be a preventive or therapeutic agent is used. desirable.
  • the gene, primer, etc. of the present invention for use in the screening method can be packed together with reagents necessary for a series of operations to form a drug screening kit.
  • the present invention relates to a nucleic acid and pharmacology comprising all or part of at least one gene selected from Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating an intervertebral disc degeneration-related disease comprising a carrier that is allowed above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a nucleic acid comprising all or part of at least one gene selected from Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa (hereinafter also referred to as “the nucleic acid of the present invention”). ) As an active ingredient.
  • the nucleic acid of the present invention is introduced into the intervertebral disc tissue.
  • the expression of a protein encoded by at least one gene selected from Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa is increased, thereby preventing and treating intervertebral disc degeneration-related diseases and improving symptoms caused by the diseases. can do.
  • the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid comprising “a part” of “at least one gene selected from Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa”, the disc tissue of the nucleic acid
  • the protein encoded by the part (hereinafter referred to as “partial protein”) is introduced into the intervertebral disc tissue.
  • the partial protein is not particularly limited as long as it has a function substantially equivalent to the protein encoded by the gene of the present invention. That is, “a part of a protein encoded by all or a part of at least one gene” means any part of each gene as long as the partial protein has a function substantially equivalent to the protein encoded by the gene of the present invention. There may be.
  • the partial protein has substantially the same function as the protein encoded by the gene of the present invention can be appropriately examined by a person skilled in the art by a method known per se.
  • “having substantially equivalent functions” means that the functions of the individual proteins (full length) are maintained even when deletion, conversion, etc. of amino acid sequences occur. It means being.
  • the compounding amount of the nucleic acid of the present invention in the pharmaceutical composition of the present invention is usually from 0.01% to 99% of the composition. However, those skilled in the art will consider the drug efficacy and ease of design. The blending amount can be appropriately determined within this range. In addition, unless otherwise indicated in this specification,% shows weight%.
  • nucleic acid of the present invention contained in the pharmaceutical composition of the present invention can be obtained, for example, based on the following method, but is not limited to this method, and any method known per se can be applied.
  • the cell or tissue used for obtaining the nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and any cell or tissue known to express the nucleic acid of the present invention can be used.
  • Preferred cells or tissues include, for example, normal disc tissue.
  • mRNA is extracted from these cells or tissues.
  • Examples of the method for extracting mRNA include the same methods as described above.
  • cDNA is synthesized by performing reverse transcription reaction using reverse transcriptase from mRNA (that is, poly (A) RNA) using this RNA as a template and using an oligo (dT) primer.
  • a primer is designed so that the gene is amplified, and an amplification reaction product is obtained using the gene amplification reaction described above.
  • the primer design method is not particularly limited, and can be designed by any method known to those skilled in the art by referring to the sequence of each gene (for example, the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 7). May be.
  • An appropriate restriction enzyme site may be inserted into the primer so that it can be subsequently linked to a phage or plasmid vector.
  • the gene to be amplified may be the full length of the gene of the present invention, or may be a part thereof as long as it has a biological activity equivalent to the full length.
  • “having equivalent biological activity” means that, in addition to the above contents, when the nucleic acid of the present invention is introduced into the intervertebral disc tissue, the nucleic acid encoding the full length of the gene of the present invention is introduced. Similarly, it has the effect of preventing and treating intervertebral disc degeneration-related diseases, improving symptoms due to intervertebral disc degeneration-related diseases, and the protein portion encoded by a part of the gene has the same function as the protein encoded by the full-length gene. Including having. By the above operation, the nucleic acid of the present invention can be obtained. In addition, for convenience as a pharmaceutical composition, the nucleic acid of the present invention can be subsequently subjected to substitution, modification and the like without any particular limitation.
  • the nucleic acid of the present invention thus obtained may be contained as it is in the pharmaceutical composition of the present invention, but is preferably contained as a nucleic acid treated with microbubbles.
  • a microbubble refers to a fine bubble having a diameter of 10 ⁇ m to several tens of ⁇ m or less when it is generated.
  • mixing the nucleic acid of the present invention in a microbubble solution to prepare a uniform microbubble and nucleic acid solution is called “microbubble treatment”.
  • the microbubble liquid is not particularly limited, and a commercially available microbubble liquid is used.
  • a microbubble suitably used for the vector of the present invention for example, perflubutane for injection (contrast agent for ultrasonic diagnosis, for injection of sonazoid; Ichisankyo Co., Ltd.) and Otisone (manufactured by Nycomed-Amersham).
  • a microbubble liquid can also be manufactured from arbitrary liquids using a commercially available apparatus. Such a manufacturing method is known and can be easily understood and carried out by those skilled in the art.
  • the volume ratio of the nucleic acid solution to the microbubble liquid, the temperature during mixing, the mixing time, etc. when the nucleic acid is dissolved in the solution are not particularly limited. There is no particular limitation as long as the nucleic acid of the invention diffuses uniformly. Further, the amount of the nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as the nucleic acids are appropriately mixed.
  • the treatment liquid containing the nucleic acid treated with microbubbles may be applied to the affected part as it is as a pharmaceutical composition, or may be used by blending it with an existing medicine such as a poultice.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably used by sonicating the affected area at the time of use. Since the nucleic acid treated with microbubbles is easily introduced into the body by sonication, the pharmaceutical composition of the present invention containing the nucleic acid treated with microbubbles is brought into contact with the affected area, and the nucleic acid is irradiated with ultrasound. Can be directly introduced into the affected area.
  • the form of the nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and various forms that can exist as nucleic acids such as DNA, RNA, primer, siRNA, antisense, and vector can be adopted. However, for convenience of introduction into the affected area and expression in the affected area, it is preferably present as a vector obtained by incorporating the gene of the present invention into a known expression vector, and more preferably as a gene expression vector. That is, the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains, as an active ingredient, a vector comprising all or part of the gene of the present invention (hereinafter also referred to as “the vector of the present invention”).
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing such a vector is encoded by the gene of the present invention in the affected area because the gene expression vector can be directly introduced into the affected area by contacting the affected area and sonicating. Protein can be expressed, and as a result, intervertebral disc degeneration-related diseases can be efficiently prevented and treated.
  • the expression vector constituting the vector of the present invention is not particularly limited as long as the protein encoded by the nucleic acid of the present invention can be expressed, and any known expression vector can be used.
  • Examples of such vectors include viral vectors and non-viral vectors, and appropriate expression vectors can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • Virus vectors include recombinant adenoviruses and retroviruses. More specifically, for example, detoxified retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, vaccinia viruses, poxviruses, polioviruses, synbisviruses, Sendai viruses, SV40, immunodeficiency viruses (HIV), etc. Examples thereof include DNA viruses and RNA viruses.
  • the infection efficiency of adenovirus is known to be much higher than when other viral vectors are used. From this viewpoint, it is preferable to use an adenoviral vector system.
  • examples of non-viral vectors include mammalian cell vectors.
  • a preferred vector for incorporating the gene of the present invention is pCAGGS.
  • pCAGGS is a plasmid vector having a CAG promoter that exhibits a very strong expression in ubiquitous, developed by Professor Junichi Miyazaki of the Department of Stem Cell Control, graduate School of Medicine, Osaka University.
  • Other preferred vectors include commercially available vectors such as pMSCV retrovirus vector (Clonetech) for viral vectors, and pXT1, pSG5 for non-viral mammalian cell vectors. (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL SV40 (Pharmacia) and the like can be mentioned as preferred examples.
  • the vector of the present invention can be constructed by incorporating the gene of the present invention obtained by amplification by the above method into the appropriate expression vector exemplified above.
  • Arbitrary methods can be applied to the insertion of the gene of the present invention into a vector. For example, recombination in Sambrook, Fritsch, and Maniatis, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (2nd ed.) (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • the vector of the present invention can be constructed by inserting the obtained gene into an expression vector using a technique or other homologous recombination techniques. If the expression vector to be used has a multiple cloning site, the gene obtained at the cloning site may be inserted.
  • the vector of the present invention includes a replication origin, a selection marker, and a promoter, and may include an enhancer, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like as necessary.
  • the selection marker is a gene for imparting a phenotype for selecting a transformed host cell to the host, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • neomycin resistance gene, thymidine kinase gene, dihydrofolate reductase and the like can be used for vectors for mammalian cells.
  • the gene of the present invention can be expressed only in a specific tissue by appropriately selecting a promoter.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may use a protein encoded by all or part of the gene of the present invention as an active ingredient instead of the nucleic acid of the present invention or together with the nucleic acid of the present invention. Also by administering to a living body a pharmaceutical composition containing a protein encoded by all or part of the gene of the present invention, it is possible to prevent and treat an intervertebral disc degeneration-related disease and improve the symptoms caused by the disease. Further, the amount of such protein is usually 0.01% to 99% in the pharmaceutical composition, but those skilled in the art will consider the drug efficacy and ease of design within this range. It is possible to determine the blending amount as appropriate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the protein encoded by all or part of the nucleic acid of the present invention or the gene of the present invention alone, or may contain other components.
  • Other components include other vectors for use in combination, other drugs for use in combination, pharmacologically acceptable carriers, and the like.
  • examples of the “other vectors to be used in combination” include vectors containing “genes involved in intervertebral disc degeneration-related diseases” other than the gene of the present invention.
  • examples of the “other drugs to be used in combination” include known drugs for treating pain caused by intervertebral disc degeneration and diseases related to intervertebral disc degeneration, such as neurotropin (manufactured by Nippon Organ Pharmaceutical Co., Ltd.). Can be mentioned. These blending amounts are usually 0.01% to 99% of the composition, but are preferably 0.1% to 10%, more preferably 0.1% from the standpoint of drug efficacy and ease of design. % To 5%.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by appropriately blending a “pharmacologically acceptable carrier” as necessary in the preparation.
  • a “pharmacologically acceptable carrier” examples include excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, solvents, solubilizers, suspending agents, emulsifying agents, and isotonic agents.
  • additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents, sweetening agents, and flavoring agents can be blended.
  • pharmacologically acceptable carriers include, for example, lactose, sucrose, mannitol, corn starch, synthetic or natural gums, excipients such as crystalline cellulose, gelatin, cellulose derivatives, gum arabic, polyvinylpyrrolidone Binders such as carboxymethyl cellulose calcium, sodium carboxymethyl cellulose, starch, corn starch, sodium alginate, polyethylene glycol 6000 and other lubricants, talc, magnesium stearate, sodium stearate and other lubricants, It is not limited to these.
  • the amount of these pharmacologically acceptable carriers to be formulated is not particularly limited, but is usually 0.01% to 99%, preferably 0.1% to 99% of the entire composition. is there.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and may be any known pharmaceutical dosage form.
  • solid dosage forms such as powders, granules, tablets, pills, capsules, patches, suppositories, etc. It can be formulated as a preparation, or an injection, inhalant, syrup, emulsion, suspension or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably formulated as a patch.
  • the nucleic acid of the present invention treated with microbubbles is used as the active ingredient of the pharmaceutical composition, the nucleic acid is fixed at a desired position without flowing. Therefore, it is possible to efficiently introduce a desired vector into a treatment site by ultrasonic treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated as a patch, it is possible to relieve the muscle tension around the intervertebral disc caused by intervertebral disc degeneration by a drug usually contained in the patch. The therapy becomes more effective, and it becomes possible to effectively prevent or treat a disease related to disc degeneration.
  • a method for formulating as a patch a method for applying a microbubble-treated nucleic acid of the present invention to a commercially available patch, or a method for mixing a microbubble-treated nucleic acid of the present invention on a base material of a patch and applying the patch
  • the method of formulating as an agent is mentioned.
  • Those skilled in the art can appropriately select an appropriate method for these methods.
  • Examples of commercially available patches include Falken tape (percutaneous absorption type analgesic / anti-inflammatory agent: manufactured by Yutoku Pharmaceutical Co., Ltd.) and Morus tape (registered trademark) (manufactured by Hisamitsu Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the patch thus obtained has a direct preventive / therapeutic effect on intervertebral disc degeneration-related diseases by the expression of a protein encoding the gene of the present invention that is expressed in the affected area by introducing the nucleic acid of the present invention, and It is extremely useful in that it has indirect preventive and therapeutic effects on intervertebral disc degeneration-related diseases due to the pharmacological effects and analgesic effects inherent in patches.
  • the gene of the present invention has a particularly reduced expression in the lumbar intervertebral disc that is the most loaded among the intervertebral discs.
  • expression is reduced in the lumbar intervertebral disc. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can effectively prevent or treat an intervertebral disc degeneration-related disease in a lumbar intervertebral disc (particularly a lumbar intervertebral disc in the lower part) among intervertebral discs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for intervertebral disc degeneration such as intervertebral disc herniation (eg, cervical disc herniation, lumbar disc herniation), cancer, intervertebral disc injury, spinal canal stenosis (eg, lumbar spinal canal stenosis), and scoliosis.
  • intervertebral disc herniation eg, cervical disc herniation, lumbar disc herniation
  • cancer intervertebral disc injury
  • spinal canal stenosis eg, lumbar spinal canal stenosis
  • scoliosis e.g., intervertebral disc herniation
  • spinal canal stenosis eg, lumbar spinal canal stenosis
  • scoliosis e.g., intervertebral disc herniation
  • spinal canal stenosis eg, lumbar spinal canal stenosis
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the type of disease, administration method, disease state, administration subject, age of administration subject, and the like. It is 1 to 1000 mg orally, preferably 1 to 500 mg orally, and 1 to 500 mg, preferably 1 to 200 mg intravenously, and can be divided into 1 to 6 times, preferably 1 to 3 times.
  • the present invention describes a pharmaceutical composition of the present invention, and that the pharmaceutical composition can or should be used for the prevention or treatment of intervertebral disc degeneration-related diseases.
  • a commercial package is provided that includes a description that includes instructions for the drug. By using the package, it is possible to efficiently prevent or treat disc related degenerative diseases.
  • Example 1 Production of Lumbar Degenerated Mice
  • a 4-week-old healthy mouse was placed in a cylindrical tube to place the mouse in a standing position, and a weight load was applied to the lumbar portion (FIG. 1).
  • the same gravity as that of human bipedal walking could be applied to the mouse lumbar part.
  • the lumbar vertebrae located in the fifth intervertebral disc (L5) and the sixth intervertebral disc (L6) are deformed to have a twisted shape (FIG. 2).
  • the “standing mouse” refers to a mouse in which the lumbar spine is subjected to weight load by being reared in a cylindrical tube and the lumbar spine is degenerated. Although it does not specifically limit as a period of breeding, For example, it is about 3 weeks. “Normal mouse” refers to a mouse raised by a normal method.
  • Example 2 Gene analysis of mouse lumbar discs in a standing state The lumbar disc tissues of normal mice and standing mice were excised using a surgical microscope, RNA was collected by a conventional method, synthesized into cDNA, and then GE Array. The gene expression level was analyzed using Q Series Mouse Osteogenesis Gene Array, MM-026.
  • biotin-labeled cDNA was synthesized using a conventional method. Using this biotin-labeled cDNA as a probe, it was hybridized with a cDNA fragment on the GE Array.
  • the GE Array is a group of genes focused on each application, spotted at a gene density of 100 to 440 per array, and control genes are also spotted. Therefore, it is easy to search for specific gene fluctuations.
  • the probe design is a 60-mer oligonucleotide (between 160 bases from the 3 ′ end) on the 3 ′ end side of mRNA, and the gene-specific probe enhances the characteristics of the probe by a detailed bioinformatics algorithm. Designs are selected that meet many criteria such as design and specificity, sequence complexity, secondary structure, melting temperature, distance to the 3 'end of the transcript, and GC content. The expression level of each gene was quantified by detecting and imaging the amount of biotin remaining on the array by a conventional method and applying the obtained image data to GE Array Expression Analysis Suite for statistical analysis. The analyzed genes are as shown in Table 1-1 to Table 1-4.
  • FIGS. 3-1 to 3-23 and FIGS. 4-1 to 4-13 The results are shown in FIGS. 3-1 to 3-23 and FIGS. 4-1 to 4-13. As a result, it was found that gene expression changes from the normal state to the standing state (FIG. 3). It was also found that the gene expression state changes over time (FIG. 4). Based on this result, the inventors considered that the gene expression pattern of each mouse lumbar intervertebral disc may have changed when a load is applied to the intervertebral disc, and conducted the following experiment.
  • Example 3 Gene analysis of mouse lumbar discs L1 to L6 Lumbar disc tissues of normal mice and standing mice were individually removed with L1, L2, L3, L4, L5, and L6 with a surgical microscope, and RNA was collected. After synthesis into cDNA, the gene was analyzed using GE Array Q Series Mouse Osteogenesis Gene Array, MM-026.
  • biotin-labeled cDNA was synthesized using a conventional method. Using this biotin-labeled cDNA as a probe, it was hybridized with a cDNA fragment on the GE Array.
  • gene groups focused on each application are spotted, and are spotted at a gene density of 100 to 440 per array, and control genes are also spotted. Therefore, it is easy to search for specific gene fluctuations.
  • the probe design is a 60-mer oligonucleotide (between 160 bases from the 3 ′ end) on the 3 ′ end side of mRNA, and the gene-specific probe enhances the characteristics of the probe by a detailed bioinformatics algorithm. Designs are selected that meet many criteria such as design and specificity, sequence complexity, secondary structure, melting temperature, distance to the 3 'end of the transcript, and GC content. The expression level of each gene was quantified by detecting and imaging the amount of biotin remaining on the array by a conventional method and applying the obtained image data to GE Array Expression Analysis Suite for statistical analysis.
  • Example 4 Vector preparation and gene introduction into intervertebral disc degeneration mouse (1) Vector preparation DNA fragments of each gene were purified with QIAEXII Gel Extraction Procedure, treated with restriction enzyme EcoRI, and then blunt-ended with T4 Polynucleotide Kinase. Turned into. On the other hand, the pGL4.75 vector and the pCAGGS vector were also treated with the restriction enzyme EcoRI, dephosphorylated, and ligated with the DNA product to prepare a plasmid. Subsequently, each plasmid 10 pg / 5 ⁇ l TE buffer obtained was transformed with subcloning grade E.
  • coli DH5 ⁇ competent cells and seeded on a plate of LB agar medium (containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin as an antibiotic). Incubated overnight at 37 ° C. to form colonies. Colonies were inoculated on LB liquid medium and then cultured with shaking for 8 hours. The plasmid was then purified on a Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System. 1% agarose electrophoresis was performed to confirm that the gene was inserted into the plasmid, and the inserted sequence was confirmed by DNA sequencing.
  • microbubbles Sonazoid ultrasound diagnostic contrast agent (Daiichi Sankyo Co., Ltd.) 50 ⁇ L of microbubble solution in which 16 ⁇ L / 1 vial is suspended in 2 mL of water and 1.0 mg each gene introduced as an insert Microbubble treatment was performed by mixing 50 ⁇ L of / mL pCAGGS vector plasmid at room temperature. A 1.5 cm large gauze was applied to this to complete a microbubble.
  • the lumbar portion of the intervertebral disc degenerated mouse is shaved, the microbubbles obtained in (2) are brought into close contact with the exposed epithelium, and ultrasonically (probe diameter: 6 mm, ultrasonic intensity: Sonitoron 1000 (manufactured by Rich Mar)). (2 Watts / cm 2, DUTY ratio: 50%) was irradiated to try to introduce the gene into the affected area.
  • the Msx1, Sox9, Nfkb1, Pdgfa, Sparc, Vdr and Vegfa genes introduced into the vector can be efficiently introduced into the affected area by using a microbubble-treated patch and sonicating at the time of use.
  • FIG. 6 for Msx1 and Sox9 genes.
  • the intervertebral disc height of the mouse in which the above gene was introduced into the intervertebral disc degenerated mouse was measured 7 days after the gene introduction, the intervertebral disc height was recovered, so that the intervertebral disc damage can be improved by using the patch of the present invention.
  • FIG. 7 for Msx1 and Sox9 genes.
  • a change in the expression level of the gene of the present invention in particular, a decrease in expression can be an index as to whether or not the disease is affected by an intervertebral disc degeneration-related disease. It shows that the disease can be prevented or treated.
  • an intervertebral disc that can cause an intervertebral disc degeneration-related disease can be identified, so that it is possible to take preventive measures in advance.
  • preventive or therapeutic agents for intervertebral disc degeneration-related diseases can be easily and rapidly screened.

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Abstract

　腰痛の治癒、特に腰椎椎間板ヘルニア、腰部脊柱管狭窄症、椎間板損傷などといった椎間板変性関連疾患の治癒にあたり、保存療法と併用でき、かつ高い治癒効果を示す医薬が望まれている。　本発明は、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を解析することを特徴とする、椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別する方法；椎間板変性関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法；上記遺伝子群から選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部を含んでなる核酸および薬理学上許容される担体を含んでなる椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物などを提供する。

Description

椎間板変性関連疾患感受性遺伝子およびその用途
　本発明は、椎間板変性関連疾患の判別方法、該疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法、該疾患の予防または治療用医薬などに関する。
　人類は二足歩行をはじめた進化の過程から、既に腰痛という宿命的な苦痛を負わされており、一生の間に腰痛を経験しないものはごく僅かである。特に近年はライフスタイルの変化にも起因して、年をとってからの腰痛が増加している。背骨は横から見るとなだらかなＳ字形をしており、それを支えている腰は弾力性のある筋肉や、クッションの役目をする椎間板などで保護されている。しかし椎間板は老化とともに脆くなり、またショックで傷つくため、これらが腰痛を起こす原因といわれている。腰痛の科学的根拠に基づいた医療ガイドラインにおいて腰痛の手術治療を勧めるような論文はなく、一方で薬物療法であっても、物理療法であっても、ともに腰痛の原因となる椎間板変性における根治治療効果が実証されたとの報告はなされていない。
　腰痛疾患の治療は、一般的に保存療法により行われる。保存療法とは、手術などによって病巣に直接手を加えることなく安静にして治療を行う方法であり、また薬物を投与することにより治療を行う方法である。腰痛疾患の保存療法では、理学療法（温熱療法、低周波治療など）、薬物療法、装具療法（コルセットの装着など）、ブロック注射、運動療法、牽引療法などがなされる。また一般的に局所的な緊張緩和や血行促進の目的で湿布剤が用いられる場合もある。これらを適用することにより筋肉の緊張を緩和させ、ある程度までは腰痛を改善することができるものの、腰痛を根治することができるわけではない。
　腰痛を主訴とする疾患は、腰椎椎間板ヘルニアと腰部脊柱管狭窄症、椎間板損傷、すなわち椎間板に圧力がかかることで椎間板が変形・変性するなどといった異常を来すことにより生じる疾患であるが、それらの発症メカニズムなどの本質的な原因解明は未だなされていない。そのため生理学的にも発症の原因となる箇所を正常に回復させることは、未だかつてできていない。
　Ｓｏｘ９［ＳＲＹ（Ｓｅｘ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　Ｙ）ｒｅｌａｔｅｄ－ｂｏｘ９］遺伝子がコードするタンパク質は、他のＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質とともにＣＣＴＴＧＡＧ配列を認識する。Ｓｏｘ９は軟骨細胞分化の間作用し、ステロイド合成因子１を伴い、抗ミュラー管（ＡＭＨ）遺伝子の転写を調節する。Ｓｏｘ９の欠損はしばしば性転換を伴う骨格奇形症候群屈曲肢異形成症に通じる（非特許文献１参照）。また、Ｍｓｘ１（Ｈｏｍｅｏ　ｂｏｘ，Ｍｓｈ－ｌｉｋｅ　１）遺伝子は、体軸のパターン形成で機能する（非特許文献２参照）。
　そのため、これらの遺伝子は体の部分の同一性（左右のバランス）を与えると考えられており、特にＭｓｘ１遺伝子は、発生中の胎児や幼生で肢や他の体節の成長を決定することが分かっている。またこれらの遺伝子の変異は余分な成長を引きおこすことがあることが分かっている（非特許文献３～５参照）。
　発明者らは、骨粗鬆症や骨代謝疾患の治療を目的として、ＢＭＰ－２をエレクトロポレーションにより導入することを特徴とする遺伝子治療を行った（非特許文献６参照）。
　しかしながらいずれの文献においても、椎間板変性と本発明で挙げられた遺伝子との関係についての報告はなく、それを示唆する記載もない。
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２００６　Ｄｅｃ　１２；１０３（５０）：１９００４－９．Ｅｐｕｂ　２００６　Ｄｅｃ　１． Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．２０００　Ａｐｒ；２４（４）：３９１－５． Ｄｅｖ　Ｄｙｎ．　２００１　Ｍａｙ；２２１（１）：１－１３． Ｇｅｎｅｔ．　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．　２００３　Ａｐｒ；２４（３）：２３０－９． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　２００３　Ｄｅｃ；１３０（２４）：６１３１－４２． Ｋｕｒｕｍｅ　Ｍｅｄ．Ｊ．，２００２；４９（１－２）：ｐｐ．１－５．
　腰痛の治癒、特に腰椎椎間板ヘルニア、腰部脊柱管狭窄症、椎間板損傷などといった椎間板変性関連疾患の治癒にあたり、保存療法と併用でき、かつ高い治癒効果を示す医薬が望まれている。
　発明者らは、マウス腰椎椎間板Ｌ２～Ｌ６までの椎間板の遺伝子解析を行った。またヒトとの行動環境との違いを想定し、ヒトの生活環境を想定した立位ゲージに入れることで椎間板に負荷を与えたマウス（立位マウス）を飼育した。次いで経時的に当該立位マウス腰椎椎間板の遺伝子解析を行った。これらの実験により、対軸形成を司る遺伝子を始めとした種々の遺伝子の発現パターンが、上部（マウス：Ｌ２）よりも、下部の腰椎椎間板（マウス：Ｌ６）に近づくほど減少していることを発見した。またこの遺伝子を椎間板損傷モデルマウスに導入したところ、該損傷が改善されることをはじめて見出した。
　本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
［１］脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別する方法であって、被検脊椎動物から採取した遺伝子含有試料を用いて、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を解析することを特徴とする、方法、
［２］脊椎動物が、ヒトまたはマウスである、［１］記載の方法、
［３］椎間板変性関連疾患が、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症または椎間板損傷である、［１］または［２］に記載の方法、
［４］Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子またはそのオルソログであり；そして
Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子またはそのオルソログである、［１］～［３］のいずれか一に記載の方法、
［５］Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；そして
Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子である、［１］～［３］のいずれか一に記載の方法、
［６］椎間板組織をスクリーニングすべき薬剤で処理した後、当該組織中の、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を解析することを特徴とする、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法、
［７］椎間板変性関連疾患が、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症または椎間板損傷である、［６］に記載の方法、
［８］Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子またはそのオルソログであり；そして
Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子またはそのオルソログである、［６］または［７］に記載の方法、
［９］Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；そして
Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子である、［６］または［７］に記載の方法、
［１０］［６］～［９］のいずれか一に記載のスクリーニング方法によって得られる、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤、
［１１］Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部を含んでなる核酸および薬理学上許容される担体を含んでなる、椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物、
［１２］Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子またはそのオルソログであり；そして
Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子またはそのオルソログである、［１１］に記載の医薬組成物、
［１３］Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；そして
Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子である、［１１］に記載の医薬組成物、
［１４］核酸がマイクロバブル処理され、かつ患部を超音波処理して用いることを特徴とする、［１１］～［１３］のいずれか一に記載の医薬組成物、
［１５］核酸がベクターであることを特徴とする、［１４］に記載の医薬組成物、
［１６］貼付剤である、［１５］に記載の医薬組成物、
［１７］椎間板変性関連疾患が、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症または椎間板損傷である、［１１］～［１６］のいずれか一に記載の医薬組成物、
［１８］Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部によってコードされる蛋白質よび薬理学上許容される担体を含んでなる、椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物、
［１９］Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子を導入することを特徴とする、椎間板変性関連疾患の予防または治療方法、
［２０］Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部によってコードされる蛋白質を導入することを特徴とする、椎間板変性関連疾患の予防または治療方法、
［２１］椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部を含んでなる核酸の使用、
［２２］椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部によってコードされる蛋白質の使用、
［２３］［１１］～［１８］のいずれか一に記載の椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物、及び当該医薬組成物が椎間板変性関連疾患の予防または治療に使用することができること又は使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ、
などに関する。
　本発明は、脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別する方法を提供する。本方法によれば、椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを、容易かつ迅速に判別することができる。また本方法によれば、過剰な負荷がかかることで椎間板内圧が上昇した椎間板を特定することができるので、椎間板変性関連疾患の原因となり得る椎間板を特定し、その予防策を講じることが可能となる。
　また本発明は、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法によれば、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤を、迅速かつ容易にスクリーニングすることができる。
　さらに本発明は、椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物によれば、所望の椎間板に対して直接的に遺伝子を導入することができるので、従来の椎間板変性関連疾患に対する医薬組成物よりも迅速かつ効率的に椎間板変性関連疾患を治癒することができる。特に遺伝子をベクターに組みこみ、マイクロバブル処理したものを有効成分として湿布剤とした医薬組成物は、遺伝的治療と薬物的治療が同時に行えるため特に有用である。
立位状態にあるマウスを表す図である。 立位状態で３週間飼育したマウス腰椎のＸ線画像である。 正常マウス（Ｍｏｔｈｅｒ）および立位マウス（Ｒｉｔｕｉ）の、腰椎椎間板内の各遺伝子の発現レベルを比較した図である。縦軸は遺伝子の発現量を示す。 立位マウスの腰椎椎間板内の各遺伝子の発現レベルの経時的変化を示す図である。縦軸は遺伝子の発現量を示し、横軸は時間を示す。 立位マウスの各腰椎椎間板（Ｌ２～Ｌ６）内の各遺伝子の発現レベルを比較した図である。縦軸は遺伝子の発現量を示す。 マイクロバブル処理したＭｓｘ１およびＳｏｘ９遺伝子が変性椎間板に導入されたことを示す図である。 マイクロバブル処理したＭｓｘ１およびＳｏｘ９遺伝子を変性椎間板に導入することで椎間板高が回復したことを示す図である。
　本発明における「遺伝子」は、特に断りのない限りいかなる態様のものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡに加えて、ｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等が含まれる。
　以下、本発明の内容について詳細に述べる。
１．脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別する方法
　本発明は、脊椎動物から採取した遺伝子含有試料を用いて、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａ（以下、これらを総称して「本発明の椎間板変性関連疾患感受性遺伝子」または単に「本発明の遺伝子」と記載する）から選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を解析することを特徴とする、脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別する方法（以下、「本発明の判別方法」ともいう）である。椎間板変性関連疾患感受性遺伝子は、過剰な負荷を受けた椎間板や、椎間板変性関連疾患を羅患している椎間板において減少するので、これらの遺伝子の発現量を解析することで、脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているかを判別することができる。
　本発明の判別方法では、まず脊椎動物から採取した遺伝子含有試料から核酸を抽出する。
　本発明の判別方法で用いられる遺伝子含有試料は、脊椎動物から採取したものである。採取部位としては、本発明が、脊椎動物が椎間板関連疾患に羅患しているか否かを判別することを目的としていることから、背骨を中心とした体幹を構成する組織（例えば、脊椎、脊柱など）が挙げられる。なかでも好ましくは脊椎であり、特に好ましくは椎間板であり、最も好ましくは腰椎椎間板である。
　本明細書中、「脊椎動物」とは、椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別しようとする被検脊椎動物のことをいい、脊椎を有し、椎間板に異常を来すことで椎間板変性関連疾患に羅患する可能性がある動物である限り特に限定されないが、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類および無顎類が挙げられる。好ましくは哺乳類または鳥類であり、特に好ましくはヒトまたはマウスである。
　本明細書中、「椎間板変性関連疾患」とは、椎間板の変性など、椎間板の異常によって生じる疾患全般をいい、特に限定されるものではない。椎間板の異常は、椎間板への過剰な負荷、椎間板を構成する軟骨細胞の減少や変性、軟骨組織の癌化、軟骨組織を構成するタンパク質（コラーゲンなど）や糖（コンドロイチン硫酸など）の減少など種々の原因によるが、これらの椎間板に関連する異常は当業者に公知である。本発明における好ましい椎間板変性関連疾患としては、例えば、椎間板ヘルニア（例、頚椎椎間板ヘルニア、腰椎椎間板ヘルニア）、癌、椎間板損傷、脊柱管狭窄症（例、腰部脊柱管狭窄症）、脊椎側彎症などが挙げられる。
　遺伝子含有試料からの核酸抽出は、特に限定されず常法に従って行うことができる。例えばＲＮＡを抽出する場合、動物組織、または細胞を破砕して可溶化剤によって可溶化した後、変性剤によってタンパク質を除去し、エタノール等で遺伝子を沈殿させることで、動物組織、または細胞からｍＲＮＡを調製することができる。該操作には、市販の抽出キットとして、ＩＳＯＧＥＮ（商品名、ニッポンジーン社製）などを好適に使用することができる。
　次いでこのｍＲＮＡをテンプレートにし、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、逆転写酵素を用いた逆転写反応を行うことでｃＤＮＡを合成する。逆転写反応に用いる逆転写酵素、試薬などは公知であり、当業者であれば容易に準備することができる。
　本発明の判別方法では、逆転写して得られたｃＤＮＡを、後の反応（例えば、マイクロアレイなど）に直接用いることも可能であるが、抽出した核酸中の、本発明の椎間板変性関連疾患感受性遺伝子から選択される少なくとも一つの遺伝子を増幅して、増幅反応物を得てもよい。
　増幅反応としては、上記で得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、自体公知の一般的な遺伝子増幅反応が制限無く用いられる。本発明の判別方法に用いられ得る遺伝子増幅反応としては、例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＬＡＭＰ法）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ法（ＩＣＡＮ法（登録商標））、リアルタイムＰＣＲ法などを挙げることができる。前記遺伝子増幅反応は、いずれも市販のキットを用いて製造業者の指示に従って行うことができ、特定の遺伝子領域を増幅可能なプライマー対と蛍光色素で標識したプローブを用いることにより、特定の遺伝子増幅反応物を検出し、定量することができる。
　本発明の判別方法で用いられる、特定の遺伝子領域を増幅可能なプライマーとしては、当業者に公知の方法であればどのような方法で設計してもよく、特に限定されないが、例えば各遺伝子のゲノム塩基配列をアラインメントした結果、高い相同性を示す部分に基づいて決定してもよい。アラインメントの方法としては特に限定されないが、好ましくはＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどの相同性計算アルゴリズムを利用する。これらの方法は、当業者には公知である。
　本発明の判別方法で得られる上記遺伝子増幅反応物は、例えば以下のプライマーを用いた上記遺伝子増幅反応を適用することによって調製することができる。プライマーのデザインは、当業者であれば適宜決定することができるし、またＰｒｉｍｅｒ３（バージョン０．４．０、Ｐｉｃｋ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ〈開発元：Ｓｔｅｖｅ　Ｒｏｚｅｎ　ａｎｄ　Ｈｅｌｅｎ　Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅおよびハワード・ヒューズ医学研究所）〉、種別：プライマー設計支援、ライセンス：パブリックドメイン）などを用いても決定することができる。これらのプライマーは、どのような遺伝子増幅反応（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲなど）にも用いることができる。
（１）Ｍｓｘ１：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡ（配列番号８）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＴ（配列番号９）
（２）Ｓｏｘ９：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＧＡＧ（配列番号１０）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＴＧＣＡＣＡＣＧＧＧＧＡＡＣＴＴＡＴＣＴ（配列番号１１）
（３）Ｎｆｋｂ１：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＣＴＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣ（配列番号１２）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＧＣＡＧＧＣＴＡＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡ（配列番号１３）
（４）Ｐｄｇｆａ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＧＡＧＡＴＡＣＣＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＡＴ（配列番号１４）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＴＣＴＴＧＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＧ（配列番号１５）
（５）Ｓｐａｒｃ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＣＴＧＣＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡ（配列番号１６）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＴ（配列番号１７）
（６）Ｖｄｒ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＧＡＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧ（配列番号１８）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＡＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＧＧＧＴＡＧＧＴ（配列番号１９）
（７）Ｖｅｇｆａ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＴ（配列番号２０）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴ（配列番号２１）
　上記遺伝子の発現量を調べることに加えて、さらに以下で示される遺伝子の発現量を調べることによって、本発明の判別方法をより精密に実施することが可能である。このような追加の遺伝子増幅反応に適用されるプライマーは、例えば以下の通りである。
（８）ＶＣＡＭ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧ（配列番号２２）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＴＣＣＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＴＣＴＴＧＣ（配列番号２３）
（９）Ｒｕｎｘ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＴＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧ（配列番号２４）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＣＡＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＴＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２５）
（１０）ＴＡＺ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣＣＧＴＴＣＣＣ（配列番号２６）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＡＧＧＴＧＧＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣ（配列番号２７）
（１１）Ｒｕｎｘ－２：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣ（配列番号２８）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＡＣＴＧＣＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＴ（配列番号２９）
（１２）Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＴＴＣＣＡＡＧＴＡＡＧＴＣＣＡＡＣＧＡＡＡＧ（配列番号３０）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＧＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＴ（配列番号３１）
（１３）Ｂｉｇｌｙｃａｎ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＴ（配列番号３２）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧ（配列番号３３）
（１４）Ａｇｇｒｅｃａｎ：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＣＡＡＣＴＡＣＣＣＧＧＣＣＡＴＣＣ（配列番号３４）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＧＡＴＧＧＣＴＣＴＧＴＡＡＴＧＧＡＡＣＡＣ（配列番号３５）
　さらに、表１－１～１－４で示される遺伝子の発現量を調べることによって、本発明の判別方法をより精密に実施することが可能である。
　本発明においては、上記遺伝子増幅反応が、ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲであることが好ましい。以下、Ｍｓｘ１の場合について、ＲＴ－ＰＣＲを例に説明する。
　逆転写反応は自体公知の方法で行うことができる。例えばプライマーとして市販のｏｌｉｇｏ　ｄＴプライマーまたはランダムヘキサマーを含む市販のキットを用いて、精製したＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行う。該反応は４２℃～６０℃で１５分間～３０分間行い、反応終了後は、９５℃で２分間熱処理することにより逆転写酵素を失活させる。ついで、上記操作で得られたｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、Ｍｓｘ１遺伝子を増幅する。ＰＣＲには、例えば前述の配列番号８および／または９で示されるプライマーを用い、遺伝子増幅反応を行う。
　ＰＣＲを行う際のＤＮＡポリメラーゼその他の試薬としては公知のものを適宜使用することができるが、好ましくは市販のキット、例えばＥｘＴａｑポリメラーゼ（商品名、タカラバイオ株式会社製）を使用する。ＰＣＲにおける温度条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に決定することができ特に限定されないが、例えば、ステップダウンＰＣＲ法で行うことが可能である。ステップダウンＰＣＲ方法の反応条件としては、例えば、Ｐｒｅｄｅｎａｔｕｒｅ：９４℃で２分間、Ｄｅｎａｔｕｒｅ：９８℃で１０秒間、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：７４℃で１分間を５サイクル行った後、Ｄｅｎａｔｕｒｅ：９８℃で１０秒間、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：７２℃で１分間を５サイクル行い、次いでＤｅｎａｔｕｒｅ：９８℃で１０秒間、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：７０℃で１分間を５サイクル行い、さらにＤｅｎａｔｕｒｅ：９８℃で１０秒間、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：６８℃で１分間を２５サイクル行った後、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：６８℃で７分間反応させることで行う。また該反応の温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置を用い、このような装置の例としては、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（商品名、タカラバイオ株式会社製）を挙げることができる。また、逆転写酵素を用いる反応と、ＰＣＲ反応には同じ反応液を用いてもよい。
　こうして得られたＰＣＲ産物は、各種ベクター（例、ｐＴＡ２，ＴＯＹＯＢＯ社製）のマルチクローニングサイトに適切な制限酵素を用いて挿入することで、後の実験に用いることができる。
　次いで本発明の判別方法では、逆転写反応により得られたｃＤＮＡ混合物や上記増幅反応により得られた特定の遺伝子の増幅反応物を解析し、被検脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別する。本工程により、被検脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別することが可能である。解析方法としては、増幅反応物量を比較する方法や、ｃＤＮＡ混合物をマイクロアレイで分析する方法などが挙げられる。
　増幅反応物量の確認は、常法に従って行うことができる。例えば当該技術分野で通常用いられる方法である、ゲル電気泳動、サザンブロット、ドット／スロットブロット、シーケンス解析等の従来公知なあらゆる解析方法を用いることができるが、本発明を簡便に利用する観点から、アガロースゲル電気泳動およびそれに続くゲル染色によって増幅反応物の確認をすることが好ましい。アガロース電気泳動は、自体公知の方法で行うことができる。得られたアガロースゲルのゲル染色の方法としては、エチジウムブロマイドを用いてもよいが、体内に有害で無く、従来のエチジウムブロマイドと同等の感度を有するＳｙＢＲ　Ｓａｆｅ　ＤＮＡゲル（インビトロジェン）で染色する方法を好ましく用いることができる。これらの方法によれば、染色したゲルを紫外光下で観察して増幅反応物を検出することができる。そして、椎間板変性関連疾患に羅患していることが疑われる被検脊椎動物由来の本発明の遺伝子の増幅反応物量と、該疾患に羅患していない同じ脊椎動物由来の本発明の遺伝子の増幅反応物量とを比較し、被検脊椎動物における本発明の遺伝子の増幅反応物量が減少している場合は、該被検脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか、または羅患する可能性が高いと判断することができる。遺伝子量の比較は、自体公知の方法で行うことができる。またリアルタイムＰＣＲを適用した場合の遺伝子量は、段階希釈した既知量のＤＮＡをスタンダードとして、蛍光量をモニターして行う。蛍光のモニター方法としては、例えばインターカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法などが挙げられる。これらの方法は、当業者であれば適宜決定することが可能である。
　一方、マイクロアレイを適用する場合は、組織から抽出したｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡをビオチン標識して、基板上のＤＮＡとハイブリダイズさせる。マイクロアレイで用いるアレイとしては特に限定されず、自体公知のマイクロアレイが挙げられるが、本発明の遺伝子とハイブリダイズ可能なアレイが望ましい。これを蛍光標識し、任意の測定装置でその蛍光を測定することで、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。そして、椎間板変性関連疾患に羅患していることが疑われる被検脊椎動物由来の本発明の遺伝子のｍＲＮＡ発現量と、該疾患に羅患していない同じ脊椎動物由来の本発明の遺伝子のｍＲＮＡ発現量とを比較し、被検脊椎動物における本発明の遺伝子のｍＲＮＡ発現量が減少している場合は、該被検脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか、または羅患する可能性が高いと判断することができる。ｍＲＮＡ発現量の比較は、自体公知の方法で行うことができる。
　脊椎動物は日常生活で様々な姿勢をとり得るが、これを支えるために、脊椎、特に椎間板が、自重による負荷を直接的に受け様々な形に変化しうる。この際に椎間板にかかる負荷が過剰になると、椎間板内圧が上昇することがわかっている。なかでも自重による負荷が最もかかる椎間板が腰椎椎間板（例えば、ヒトにおいてはＬ１～Ｌ５、マウスにおいてはＬ１～Ｌ６）である。実際、椎間板変性関連疾患のなかでも、腰椎椎間板（特に下部位；例えばヒトではＬ４またはＬ５、マウスではＬ４～Ｌ６）の傷害が原因で発生する疾患が最も多く、この部位で生じる疾患の早期発見、予防、治療などが望まれる。
　本発明の椎間板変性関連疾患感受性遺伝子は、後述の実施例で示されるように、椎間板の変性によって発現が減少するものである。特に本発明の遺伝子は、特に椎間板の中でも自重による負荷がかかり変性しやすい腰椎椎間板において発現が減少するものであり、なかでも負荷を最も受けるため椎間板内圧が高まりやすい下部位の腰椎椎間板において発現が減少するものである。すなわち本発明の遺伝子の発現量を解析することで、椎間板の変性の程度や椎間板への負荷の程度を理解することができ、椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かをも判別することが可能である。
　また本発明の遺伝子は、一過的な椎間板への負荷（に伴う椎間板内圧の上昇）により椎間板変性関連疾患が生じた部位だけでなく、未だ椎間板の変性自体は認められないものの、椎間板への負荷（に伴う椎間板内圧の上昇）が継続的に生じているために椎間板変性関連疾患が生じうる部位においても発現が減少するものである。従って本発明の判別方法は、椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かだけでなく、椎間板変性関連疾患に羅患する可能性が高いこと（具体的には、椎間板変性関連疾患になりやすいこと、発症の兆候があることなど）も判別することができる。
　本明細書中、「本発明の遺伝子」としては、配列番号１～７で表される遺伝子だけに限定されない。例えば、配列番号１～７で表される各遺伝子と実質的に同等の生物学的活性を有するような、配列番号１～７で表される遺伝子のオルソログであってもよい。具体的には、
（１）「Ｍｓｘ１」としては、配列番号１で表される遺伝子（マウスＭｓｘ１遺伝子，ＮＭ＿０１０８３５）またはそのオルソログであってもよく、
（２）「Ｓｏｘ９」としては、配列番号２で表される遺伝子（マウスＳｏｘ９遺伝子，ＮＭ＿０１１４４８）またはそのオルソログであってもよく、
（３）「Ｎｆｋｂ１」としては、配列番号３で表される遺伝子（マウスＮｆｋｂ１遺伝子，ＮＭ＿００８６８９）またはそのオルソログであってもよく、
（４）「Ｐｄｇｆａ」としては、配列番号４で表される遺伝子（マウスＰｄｇｆａ遺伝子，ＮＭ＿００８８０８）またはそのオルソログであってもよく、
（５）「Ｓｐａｒｃ」としては、配列番号５で表される遺伝子（マウスＳｐａｒｃ遺伝子，ＮＭ＿００９２４２）またはそのオルソログであってもよく、
（６）「Ｖｄｒ」としては、配列番号６で表される遺伝子（マウスＶｄｒ遺伝子，ＮＭ＿００９５０４）またはそのオルソログであってもよく、そして
（７）「Ｖｅｇｆａ」としては、配列番号７で表される遺伝子（マウスＶｅｇｆａ遺伝子，ＮＭ＿００９５０５）またはそのオルソログであってもよい。
　マウス以外の哺乳動物におけるオルソログは、例えば配列番号１～７で表される遺伝子をそれぞれクエリーして、マウス以外の哺乳動物のゲノムおよび／またはｃＤＮＡのデータベースに対してＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡを用いて検索をかけるか、あるいは、例えばＪａｃｋｓｏｎ研究所から提供されるゲノムインフォマティックスでアクセッション番号や遺伝子番号、遺伝子名をキーワードとして検索をかけ、ヒットしたデータのＭａｍｍａｌｉａｎ　Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙの情報にアクセスする等によって、その配列情報を取得することができる。
　また本明細書中、「本発明の遺伝子」としては、他に規定されずかつ配列番号１～７で表される各遺伝子と実質的に同等の生物学的活性を有する限り、１個以上の核酸残基の置換、欠失、修飾、挿入または付加（以下、これらをまとめて核酸の「変換」と記載する場合がある）がなされていてもよい。具体的には、
（１）「Ｍｓｘ１」としては、配列番号１で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であってもよく；
（２）「Ｓｏｘ９」としては、配列番号２で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であってもよく；
（３）「Ｎｆｋｂ１」としては、配列番号３で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であってもよく；
（４）「Ｐｄｇｆａ」としては、配列番号４で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であってもよく；
（５）「Ｓｐａｒｃ」としては、配列番号５で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であってもよく；
（６）「Ｖｄｒ」としては、配列番号６で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であってもよく；そして
（７）「Ｖｅｇｆａ」としては、配列番号７で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であってもよい。
　ここで、「実質的に同等の生物学的活性を有する」とは、上記相同性の範囲内で核酸が変換した場合であっても、各遺伝子が個々に有する生物学的活性を保持していることをいう。また「本発明の遺伝子」には、本発明の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。これらのＤＮＡは、例えば、部位特異的突然変異／ＰＣＲ法などの周知の技術を使用することによって、遺伝子工学的に本発明の遺伝子をコードするＤＮＡ中に変異を導入することも可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ　ｅｄ）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されているような従来の組換え技術を使用する）。上記ストリンジェントな条件としては、上記文献に記載のハイブリダイゼーション条件が挙げられ、具体的には、ホルムアミド濃度：４５％（ｖ／ｖ）、塩濃度：５×ＳＳＰＥ、温度：４２℃の条件下でハイブリダイズさせ、塩濃度：２×ＳＳＰＥ、温度：４２℃の条件下で洗浄するという条件などが挙げられる。
　より詳細には、例えばＭｓｘ１の場合、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ配列番号１で表される遺伝子（マウスＭｓｘ１遺伝子，ＮＭ＿０１０８３５）と同様に公知のＭｓｘ１遺伝子が有するべき生物学的活性を保持することが示された遺伝子や、配列番号１で表される遺伝子のオルソログ（例、ヒトＭｓｘ１遺伝子（ヒト，ＮＭ＿００２４４８）など）は、本発明のＭｓｘ１に含まれる。
　より詳細には、例えばＳｏｘ９の場合、配列番号２で表されるヌクレオチド配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ配列番号２で表される遺伝子（マウスＳｏｘ９遺伝子，ＮＭ＿０１１４４８）と同様に公知のＳｏｘ９遺伝子が有するべき生物学的活性を保持することが示された遺伝子や、配列番号２で表される遺伝子のオルソログ（例、ヒトＳｏｘ９遺伝子（ヒト，ＮＭ＿０１４５８７）など）は、本発明のＳｏｘ９に含まれる。
　より詳細には、例えばＮｆｋｂ１の場合、配列番号３で表されるヌクレオチド配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ配列番号３で表される遺伝子（マウスＮｆｋｂ１遺伝子，ＮＭ＿００８６８９）と同様に公知のＮｆｋｂ１遺伝子が有するべき生物学的活性を保持することが示された遺伝子や、配列番号３で表される遺伝子のオルソログ（例、ヒトＮｆｋｂ１遺伝子（ヒト，ＮＭ＿００３９９８）など）は、本発明のＮｆｋｂ１に含まれる。
　より詳細には、例えばＰｄｇｆａの場合、配列番号４で表されるヌクレオチド配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ配列番号４で表される遺伝子（マウスＰｄｇｆａ遺伝子，ＮＭ＿００８８０８）と同様に公知のＰｄｇｆａ遺伝子が有するべき生物学的活性を保持することが示された遺伝子や、配列番号４で表される遺伝子のオルソログ（例、ヒトＰｄｇｆａ遺伝子（ヒト，ＮＭ＿０３３０２３）など）は、本発明のＰｄｇｆａに含まれる。
　より詳細には、例えばＳｐａｒｃの場合、配列番号５で表されるヌクレオチド配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ配列番号５で表される遺伝子（マウスＳｐａｒｃ遺伝子，ＮＭ＿００９２４２）と同様に公知のＳｐａｒｃ遺伝子が有するべき生物学的活性を保持することが示された遺伝子や、配列番号５で表される遺伝子のオルソログ（例、ヒトＳｐａｒｃ遺伝子（ヒト，ＮＭ＿００３１１８）など）は、本発明のＳｐａｒｃに含まれる。
　より詳細には、例えばＶｄｒの場合、配列番号６で表されるヌクレオチド配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ配列番号６で表される遺伝子（マウスＶｄｒ遺伝子，ＮＭ＿０００９５０４）と同様に公知のＶｄｒ遺伝子が有するべき生物学的活性を保持することが示された遺伝子や、配列番号６で表される遺伝子のオルソログ（例、ヒトＶｄｒ遺伝子（ヒト，ＮＭ＿０００３７６）など）は、本発明のＶｄｒに含まれる。
　より詳細には、例えばＶｅｇｆａの場合、配列番号７で表されるヌクレオチド配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有し、且つ配列番号７で表される遺伝子（マウスＶｅｇｆａ遺伝子，ＮＭ＿００９５０５）と同様に公知のＶｅｇｆａ遺伝子が有するべき生物学的活性を保持することが示された遺伝子や、配列番号７で表される遺伝子のオルソログ（例、ヒトＶｅｇｆａ遺伝子（ヒト，ＮＭ＿００１０２５３６６）など）は、本発明のＶｅｇｆａに含まれる。
　塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　ＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３）にて計算することができる。
　なお、核酸残基の修飾としては特に限定されず、配列番号１～７で表される各遺伝子と実質的に同等の生物学的活性を有する限り、塩基部分、糖部分、燐酸部分を構成する置換基が種々の置換基によって置換されていてもよいし、別の原子に置き換えられていてもよい。その様な修飾は、当業者に公知である。
２．椎間板変性関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法
　本発明は、椎間板組織をスクリーニングすべき薬剤で処理した後、当該組織中の、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を解析することを特徴とする、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう）である。
　本発明のスクリーニング方法では、まず椎間板組織をスクリーニングすべき薬剤で処理する。
　本発明のスクリーニング方法において、「組織」としては、後述する薬剤で処理することができ、且つその変化を観察することが可能な細胞の集団を意図し、動物（マウス、ウサギ等）の個体そのものだけでなく各種初代培養あるいは樹立株等の細胞も包含する概念である。すなわち組織の薬剤処理は、生体内（インビボ）で行われてもよく（その後、薬剤処理した該組織を採取する）、生体から採取した組織を試験管内（インビトロ）で処理することで行われてもよい。当該組織は、標的とする遺伝子が主として発現する部位に応じて適宜選択されるが、本発明の場合、好ましくは脊椎組織であり、より好ましくは椎間板組織であり、特に好ましくは腰椎椎間板組織である。
　所定の組織を採取あるいは準備し、スクリーニングを行う所定の薬剤で処理した後、当該組織におけるＭｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、Ｖｄｒおよび／またはＶｅｇｆａの発現を調べる。遺伝子レベルでの発現状況に加えて、蛋白質レベルでの発現をパラレルに測定することも可能であり、それによって本発明でスクリーニングを実施した薬剤の作用機序を予測することもできる。蛋白質レベルでの発現は、当業者に公知の方法であれば特に限定されない。
　本発明のスクリーニング方法に適用する薬剤としては、特に限定することなく、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤として用いることができると考えられる低分子化合物、高分子化合物、蛋白質、ペプチド、遺伝子等のあらゆる物質を用いることができる。この薬剤は当該物質単独からなるものであってもよいし、任意の担体と混合された組成物、医薬などの形態を採っていてもよい。
　本発明のスクリーニング方法の具体的な手法は、上記した本発明の判別方法に準じて実施できる。例えば薬剤で処理した椎間板および薬剤で処理していない椎間板それぞれからｍＲＮＡを抽出し、これを逆転写してｃＤＮＡを得、得られたＤＮＡを増幅するなどして、椎間板内の本発明の遺伝子の発現量を薬剤処理の有無で比較することによって行うことができる。ＤＮＡの増幅方法、遺伝子発現量の比較方法は、当業者に公知である。
　椎間板組織からの核酸抽出方法としては特に限定されず、上記した方法と同様の方法（「本発明の判別方法」において記載した方法）で行うことができる。また抽出したｍＲＮＡは、上記した方法と同様の方法で逆転写することができる。次いでＭｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子について増幅反応物を得る。当該増幅反応は、上記した方法と同様の方法と同様の方法で行うことができる。
　さらに、上記増幅反応により得られた増幅反応物を解析し、被検薬剤が椎間板変性関連疾患に対して有効か否かを判別する。本工程により、被検薬剤が椎間板変性関連疾患の予防または治療剤として有用か否かを判別することが可能となる。解析方法としては、増幅反応物量を比較する方法などが挙げられる。増幅反応物量の確認は、上記「本発明の判別方法」において記載した方法で行うことができる。
　被検薬剤が椎間板変性関連疾患に対して有効か否かの判別は、椎間板変性関連疾患に羅患している椎間板組織（以下、「変性椎間板」ともいう）由来の本発明の遺伝子の増幅反応物量と、薬剤処理した変性椎間板由来の増幅反応物量とを比較することによって行うことができる。薬剤処理した場合に本発明の遺伝子の増幅反応物量が増加している場合は、該薬剤が椎間板変性関連疾患を改善する効果があると判断できるので、該薬剤が椎間板変性関連疾患の予防または治療剤として用いることが期待される。遺伝子量の比較は、上記した方法で行うことができる。より正確な判定を要する場合には、他の本発明の遺伝子の増幅反応物量を指標とした場合や、予防または治療剤とはなり得ないと判断できる薬剤を用いた場合などと対比することが望ましい。
　また当該スクリーニング方法に用いる為の、本発明の遺伝子、プライマーなどについても一連の操作に必要な試薬を併せて梱包し薬物スクリーニング用キットとすることができる。
３．椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物
　本発明は、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部を含んでなる核酸および薬理学上許容される担体を含んでなる、椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」ともいう）を提供する。
　本発明の医薬組成物は、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部を含んでなる核酸（以下、「本発明の核酸」ともいう）を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の医薬組成物を生体に投与することにより、本発明の核酸が椎間板組織に導入される。これによりＭｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子がコードするタンパク質の発現が上昇するので、椎間板変性関連疾患を予防・治療し、当該疾患による症状を改善することができる。
　なお本発明の核酸が、「Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子」の「一部」を含んでなる核酸である場合は、当該核酸の椎間板組織への導入によって、当該部分によってコードされる蛋白質（以下、「部分蛋白質」と記載）が椎間板組織に導入される。ここで部分蛋白質については、本発明の遺伝子がコードする蛋白質と実質的に同等の機能を有する限り特に限定されない。すなわち「少なくとも一つの遺伝子の全部または一部がコードする蛋白質の一部」は、部分蛋白質が本発明の遺伝子がコードする蛋白質と実質的に同等の機能を有する限り、各遺伝子のいずれの部分であってもよい。
　部分蛋白質が本発明の遺伝子がコードする蛋白質と実質的に同等の機能を有するか否かについては、当業者であれば自体公知の方法によって適宜検討することが可能である。なお「実質的に同等の機能を有する」とは、アミノ酸配列の欠失、変換等が生じた場合であっても、各遺伝子（完全長）から得られる蛋白質が個々に有する機能が維持されていることをいう。
　本発明の医薬組成物中の本発明の核酸の配合量は、通常、組成物の０．０１％～９９％であるが、当業者であれば、薬効発現および設計のしやすさを勘案し、この範囲内で配合量を適宜決定することが可能である。なお本明細書中で特に明示されない限り、％は重量％を示す。
　本発明の医薬組成物が含む「本発明の核酸」は、例えば以下の方法に基づき取得することができるが、当該方法に限定されず、自体公知のあらゆる方法が適用可能である。
　本発明の核酸を得るために用いられる細胞または組織としては特に限定されず、本発明の核酸を発現することが知られているあらゆる細胞または組織を用いることができる。好ましい細胞または組織としては、例えば正常な椎間板組織が挙げられる。
　はじめに、これらの細胞または組織から全ｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡを抽出する方法としては、上記と同様の方法が挙げられる。次いでこのＲＮＡをテンプレートにし、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、ｍＲＮＡ（即ち、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ）から逆転写酵素を用いた逆転写反応を行うことでｃＤＮＡを合成する。
　次いで、増幅したい目的の遺伝子の配列情報に基づき、該遺伝子が増幅されるようにプライマーを設計し、上記の遺伝子増幅反応を利用して増幅反応物を得る。プライマーの設計方法としては特に限定されることなく、各遺伝子の配列（例えば、配列番号１～７で表される配列）を参照し、当業者に公知の方法であればどのような方法で設計してもよい。プライマーには、その後ファージやプラスミドベクターに連結可能なように適当な制限酵素部位を挿入していてもよい。
　増幅する遺伝子は、本発明の遺伝子の全長であってもよいが、全長と同等の生物学的活性を有する限り、その一部であってもよい。ここで「同等の生物学的活性を有する」とは、上記した内容に加えて、本発明の核酸を椎間板組織に導入した場合に、本発明の遺伝子の全長をコードする核酸を導入した場合と同様に、椎間板変性関連疾患の予防・治療効果を奏し、椎間板変性関連疾患による症状が改善されることや、遺伝子の一部がコードするタンパク質部分が、遺伝子全長がコードするタンパク質と同様の機能を有していることも含む。以上の操作によって、本発明の核酸を得ることができる。また本発明の核酸は、医薬組成物としての便宜のために、その後置換、修飾などを特に限定なく行うことができる。
　このようにして得られた本発明の核酸は、そのまま本発明の医薬組成物中に含有されていてもよいが、マイクロバブル処理された核酸として含有されることが好ましい。マイクロバブルとは、発生時に気泡の直径が１０μｍ～数十μｍ以下の微細な気泡のことをいう。また本明細書中、マイクロバブル液に本発明の核酸を混合して、均一なマイクロバブルと核酸の溶液を調製することを「マイクロバブル処理」という。
　マイクロバブル液としては、特に限定されず市販のマイクロバブル液が用いられるが、本発明のベクターに好適に用いられるマイクロバブルとしては、例えば注射用ペルフルブタン（超音波診断用造影剤ソナゾイド注射用；第一三共株式会社）や、オブチゾン（Ｎｙｃｏｍｅｄ－Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）などが挙げられる。またマイクロバブル液は、市販の装置を用いて任意の液体から製造することもできる。その様な製造方法は公知であり、当業者であれば容易に理解し、実施することが可能である。
　マイクロバブル液と核酸の混合に際し、核酸が溶液中に溶解している場合の核酸溶液とマイクロバブル液の体積比、混合中の温度、混合時間などは特に限定されず、マイクロバブル液中に本発明の核酸が均一に拡散する限り、特に限定されない。また本発明の核酸の量は、核酸が適切に混合される限り特に限定されない。マイクロバブル処理した核酸を含む処理液はそれ自体医薬組成物としてそのまま患部に塗布してもよいし、湿布剤などの既成の医薬品に配合して使用してもよい。
　その後、マイクロバブル処理した核酸を体内に導入する目的で、本発明の医薬組成物は、使用時に患部を超音波処理して用いることが好ましい。マイクロバブル処理された核酸は超音波処理することで体内に導入されやすくなるので、マイクロバブル処理された核酸を含む本発明の医薬組成物を患部に接触させ、そこに超音波を当てることで核酸を患部に直接的に導入することが可能となる。
　本発明の核酸の形態としては特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、ベクターなど、核酸として存在し得る種々の形態を採りうる。しかしながら患部への導入および患部における発現の便宜上、本発明の遺伝子を公知の発現ベクターに組み込んでなるベクターとして存在することが好ましく、また遺伝子発現ベクターとして存在することがより好ましい。すなわち本発明の医薬組成物は、好ましくは本発明の遺伝子の全部または一部を含んでなるベクター（以下、「本発明のベクター」ともいう）を有効成分として含有する。
　このようなベクターを含む本発明の医薬組成物は、患部に接触させ、超音波処理することで当該遺伝子発現ベクターを患部に直接的に導入できるので、患部にて本発明の遺伝子にコードされたタンパク質を発現させることができ、結果的に椎間板変性関連疾患を効率よく予防・治療することが可能である。
　本発明のベクターを構成する発現ベクターとしては、本発明の核酸がコードするタンパク質が発現可能なものであれば特に限定されず、公知のいずれの発現ベクターでも使用することができる。このようなベクターとしては、例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどが挙げられ、適切な発現ベクターは、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。
　ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。より具体的には、例えば無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスなどが挙げられる。ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率は、他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。一方、非ウイルスベクターとしては、哺乳類細胞用ベクターが挙げられる。
　本発明の遺伝子を組み込むための好ましいベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳが挙げられる。ｐＣＡＧＧＳは、大阪大学大学院医学系研究科未来開発医療専攻　幹細胞制御分野の宮崎純一教授が開発した、ユビキタスに非常に強い発現力を示すＣＡＧプロモーターを持つプラスミドベクターである。
　また他の好ましいベクターとしては、商業的に入手可能なベクター、例えばウイルスベクターであれば、ｐＭＳＣＶレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）が挙げられ、非ウイルス性哺乳類細胞用ベクターであれば、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ　ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などを好ましい例として挙げることができる。
　本発明のベクターは、上記の方法で増幅して得られた本発明の遺伝子を、上記で例示した適切な発現ベクターに組み込むことによって構築することができる。本発明の遺伝子のベクターへの挿入は、任意の方法を適用することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ　ｅｄ．）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されているような従来の組換え技術、またはその他の相同組換え技術等を使用して、得られた遺伝子を発現ベクターに挿入し、本発明のベクターを構築することができる。使用する発現ベクターにマルチクローニングサイトが存在するのであれば、該クローニングサイトに得られた遺伝子を挿入すればよい。
　本発明のベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
　選択マーカーは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型を宿主に付与するための遺伝子であり、当業者であれば適宜選択することができる。例えば哺乳類細胞用ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素などを使用することができる。またプロモーターを適切に選択することにより、特定の組織のみで本発明の遺伝子を発現させることもできる。
　本発明の医薬組成物は、その有効成分として本発明の核酸の代わりに、または本発明の核酸と共に、本発明の遺伝子の全部または一部がコードする蛋白質を用いるものであってもよい。本発明の遺伝子の全部または一部がコードする蛋白質を含む医薬組成物を生体に投与することによっても、椎間板変性関連疾患を予防・治療し、当該疾患による症状を改善することができる。またこのような蛋白質の配合量は、通常、医薬組成物中の０．０１％～９９％であるが、当業者であれば、薬効発現および設計のしやすさを勘案し、この範囲内で配合量を適宜決定することが可能である。
　本発明の医薬組成物は、本発明の核酸または本発明の遺伝子の全部または一部がコードする蛋白質を単独で含むものであってもよいが、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、併用するための他のベクター、併用するための他の薬剤、薬理学的に許容される担体などが挙げられる。
　ここで、「併用するための他のベクター」としては、本発明の遺伝子以外の、「椎間板変性関連疾患に関与する遺伝子」を含むベクターが挙げられる。また「併用するための他の薬剤」としては、椎間板変性関連疾患や、椎間板変性関連疾患により生ずる疼痛を治療するための公知の薬剤が挙げられ、例えば、ノイロトロピン（日本臓器製薬株式会社製）が挙げられる。これらの配合量は、通常、組成物の０．０１％～９９％であるが、薬効発現および設計のしやすさから、好ましくは０．１％～１０％であり、より好ましくは０．１％～５％である。
　さらに本発明の医薬組成物は、上記したように、製剤上の必要に応じて適宜「薬理学的に許容される担体」を配合して製剤化することができる。薬理学的に許容される担体としては、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤などが挙げられる。必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、香味料などの添加剤を配合することもできる。
　薬理学的に許容される担体の具体例としては、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロースなどの賦形剤、ゼラチン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール６０００などの崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムなどの滑沢剤等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　製剤化する場合のこれらの薬理学的に許容される担体の配合量は特に限定されないが、通常、組成物全体の０．０１％～９９％であり、好ましくは０．１％～９９％である。
　本発明の医薬組成物の剤形としては、特に限定されず自体公知のあらゆる製剤剤形を取りうるが、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、貼付剤、坐剤などの固形製剤、あるいは、注射剤、吸入剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。
　なかでも本発明の医薬組成物は、貼付剤として製剤化されることが好ましい。本発明の医薬組成物を貼付剤として製剤化した場合であって、医薬組成物の有効成分としてマイクロバブル処理した本発明の核酸を用いた場合、当該核酸を流動させることなく所望の位置に固定することができるので、超音波処理することで治療部位に所望のベクターを効率よく導入することが可能となる。本発明の医薬組成物を貼付剤として製剤化した場合は、さらに貼付剤に通常含まれる薬剤により、椎間板変性により生じた椎間板周囲の筋肉の緊張を緩和させることもできるので、周知の保存的薬物療法をさらに効果的なものとし、椎間板変性関連疾患を効果的に予防または治療することが可能となる。
　貼付剤として製剤化する方法としては、市販の貼付剤にマイクロバブル処理した本発明の核酸を塗布して用いる方法や、貼付剤の基材にマイクロバブル処理した本発明の核酸を混合し、貼付剤として製剤化する方法が挙げられる。これらの方法は、当業者であれば適切な方法を適宜選択することが可能である。市販の貼付剤としては、例えばファルケンテープ（経皮吸収型鎮痛消炎剤：祐徳薬品工業株式会社製）や、モーラステープ（登録商標）（久光製薬株式会社製）が挙げられる。このようにして得られた貼付剤は、本発明の核酸が導入されることで患部において発現する本発明の遺伝子をコードするタンパク質の発現による椎間板変性関連疾患の直接的な予防・治療効果、および貼付剤が本来有する薬理効果や鎮痛効果による椎間板変性関連疾患の間接的な予防・治療効果を併せ持つ点で極めて有用である。
　上記したように、特に本発明の遺伝子は、椎間板の中でも最も負荷がかかる腰椎椎間板において発現が特に減少するものであり、さらに自重による負荷を最も受けるため椎間板内圧が高まりやすいと考えられる、下部位の腰椎椎間板において特に発現が減少するものである。従って本発明の医薬組成物は、椎間板のなかでも腰椎椎間板（特に下部位の腰椎椎間板）における椎間板変性関連疾患を効果的に予防または治療することができる。特に本発明の医薬組成物は、椎間板ヘルニア（例、頚椎椎間板ヘルニア、腰椎椎間板ヘルニア）、癌、椎間板損傷、脊柱管狭窄症（例、腰部脊柱管狭窄症）、脊椎側彎症などといった椎間板変性関連疾患の予防・治療用医薬組成物として用いられ得、好ましくは、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症または椎間板損傷の予防・治療用医薬組成物として用いることができる。
　また本発明の医薬組成物は、ヒトに対する医薬としてだけではなく、椎間板変性関連疾患を羅患しうる脊椎動物に対する動物薬としても、同様に適用することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、疾患の種類、投与方法、病態、投与対象、投与対象の年齢などによっても異なるが、例えばヒトの場合、成人（６０ｋｇ）に対して通常、１日当り、経口で１～１０００ｍｇ、好ましくは１～５００ｍｇ、静注で１～５００ｍｇ、好ましくは１～２００ｍｇであり、これを１～６回、好ましくは１～３回に分割して投与することができる。
４．椎間板変性関連疾患の予防または治療用パッケージ
　本発明は、本発明の医薬組成物、及び当該医薬組成物が椎間板変性関連疾患の予防または治療に使用することができること又は使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージを提供する。当該パッケージを用いることで、椎間板変性関連疾患を効率的に予防または治療することができる。
　以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：腰椎変性マウスの作製
　生後４週齢の健常マウスを円柱状の筒に入れることで、マウスを立位状態にして腰椎部分に体重負荷をかけた（図１）。これにより、マウス腰椎部分にヒトの二足歩行と同様の重力をかけることができた。３週間後、レントゲン像で腰椎部分のみの変性を確認した。特に第５椎間板（Ｌ５）、第６椎間板（Ｌ６）に位置する腰椎が変形して、ねじれ形状になっていることがわかる（図２）。
　なお本明細書中「立位マウス」とは、円柱状の筒に入れた状態で飼育することで腰椎に体重負荷がかかり、腰椎が変性したマウスのことをいう。飼育の期間としては特に限定されないが、例えば３週間程度である。また「正常マウス」とは、通常の方法で飼育したマウスのことをいう。
実施例２：立位状態におけるマウス腰椎椎間板の遺伝子解析
　正常マウス、立位マウスそれぞれの腰椎椎間板組織を、手術顕微鏡を用いて摘出し、常法にてＲＮＡを回収、ｃＤＮＡに合成後、ＧＥ　Ａｒｒａｙ　Ｑ　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｍｏｕｓｅ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｇｅｎｅ　Ａｒｒａｙ，ＭＭ－０２６にて、遺伝子発現レベルの解析を行った。
　１００ｎｇから３μｇのトータルＲＮＡをＧＥＡ　ｐｒｉｍｅｒミックスと混合した後、常法を用いてビオチン標識ｃＤＮＡを合成した。このビオチン標識ｃＤＮＡをプローブとして、ＧＥ　Ａｒｒａｙ上のｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。ＧＥ　Ａｒｒａｙは、各アプリケーションに焦点を合わせた遺伝子グループがスポットされてたものであって、１アレイあたり１００から４４０の遺伝子密度でスポットされているものであり、コントロール遺伝子もスポットされている。そのため、特異的な遺伝子の変動を検索しやすい。また、プローブデザインは、ｍＲＮＡの３’末端側、６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（３’末端から１６０塩基の間）で、遺伝子特異的プローブは、バイオインフォマティックスの綿密なアルゴリズムによって、プローブの特性を高めるデザインとその特異性・配列の複雑さ・二次構造・融解温度・転写産物の３’末端への距離・ＧＣ含量のような、多くの基準を満たすものを選定している。
　各遺伝子の発現量は、アレイ上に残存したビオチン量を常法により検出・画像化し、得られた画像データをＧＥ　Ａｒｒａｙ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｕｉｔｅに適用して統計学的解析を行うことで数値化した。解析を行った遺伝子は表１－１～表１－４に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　結果を図３－１～図３－２３および図４－１～図４－１３に示す。
　この結果、通常状態から立位状態にかけて遺伝子の発現が変化することがわかった（図３）。また、経時的に遺伝子の発現状態が変化することも分かった（図４）。この結果に基づき、発明者らは椎間板に負荷をかけた場合、マウス腰椎椎間板毎の遺伝子発現パターンが変化しているのではないかと考え、次の実験を行った。
実施例３：マウス腰椎椎間板Ｌ１～Ｌ６の遺伝子解析
　正常マウスおよび立位マウスそれぞれの腰椎椎間板組織をＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６と個別に手術顕微鏡にて摘出し、ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡに合成後、ＧＥ　Ａｒｒａｙ　Ｑ　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｍｏｕｓｅ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｇｅｎｅ　Ａｒｒａｙ，ＭＭ－０２６にて、遺伝子の解析を行った。
　１００ｎｇから３μｇのトータルＲＮＡをＧＥＡ　ｐｒｉｍｅｒミックスと混合した後、常法を用いてビオチン標識ｃＤＮＡを合成した。このビオチン標識ｃＤＮＡをプローブとして、ＧＥ　Ａｒｒａｙ上のｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。ＧＥ　Ａｒｒａｙは、各アプリケーションに焦点を合わせた遺伝子グループがスポットされたものであって、１アレイあたり１００から４４０の遺伝子密度でスポットされているものであり、コントロール遺伝子もスポットされている。そのため、特異的な遺伝子の変動を検索しやすい。また、プローブデザインは、ｍＲＮＡの３’末端側、６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（３’末端から１６０塩基の間）で、遺伝子特異的プローブは、バイオインフォマティックスの綿密なアルゴリズムによって、プローブの特性を高めるデザインとその特異性・配列の複雑さ・二次構造・融解温度・転写産物の３’末端への距離・ＧＣ含量のような、多くの基準を満たすものを選定している。
　各遺伝子の発現量は、アレイ上に残存したビオチン量を常法により検出・画像化し、得られた画像データをＧＥ　Ａｒｒａｙ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｕｉｔｅに適用して統計学的解析を行うことで数値化した。
　結果を図５－１～図５－３２に示す。
　この結果、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａ遺伝子については、Ｌ２からＬ６に到るにつれて徐々に発現量が減少するパターンを示した。
　従って、これらの遺伝子が腰椎椎間板における椎間板変性関連疾患に関係している可能性が示唆された。
実施例４：ベクターの作成と椎間板変性マウスへの遺伝子導入
（１）ベクターの作製
　各遺伝子のＤＮＡフラグメントをＱＩＡＥＸＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅにて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅにて平滑末端化した。一方ｐＧＬ４．７５ベクターとｐＣＡＧＧＳベクターも制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、脱リン酸化処理し、ＤＮＡ産物とライゲーションを行い、プラスミドを作製した。
　次いで、得られた各プラスミド１０ｐｇ／５μｌ　ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒを用いて、サブクローニンググレードの大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルで形質転換を行い、ＬＢ寒天培地（抗生物質として、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）のプレートに播種し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。コロニーをＬＢ液体培地に播種した後、８時間振盪培養した。次いでＷｉｚａｒｄ　ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍにて、プラスミドを精製した。１％アガロース電気泳動を行ってプラスミドに遺伝子が挿入されていることを確認し、その挿入配列をＤＮＡシークエンスにて確認した。
（２）マイクロバブルの製造
　ソナゾイド超音波診断用造影剤（第一三共株式会社）１６μＬ／１バイアルを水２ｍＬに懸濁したマイクロバブル液の５０μＬと、インサートとして各遺伝子を導入した１．０ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧＧＳベクタープラスミドの５０μＬとを、室温で混合することでマイクロバブル処理した。これに１．５ｃｍ大のガーゼをあて、マイクロバブルを完成させた。
（３）椎間板変性マウスへの遺伝子導入
　ＢＡＬＢ／ｃ　ＡＪｃ１マウス（５週齢、雌）１６匹を立位ゲージに入れ、腰椎へ体重負荷をかけつつ飼育した。３週間後、腰椎部分、特に椎間板部位（Ｌ４－５：第４腰椎－第５腰椎、Ｌ５－６：第５腰椎－第６腰椎）に損傷を生じた（実施例１参照）。当該椎間板変性マウスの腰椎部を剃毛し、露出した上皮に（２）で得られたマイクロバブルを密着させ、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ　１０００（Ｒｉｃｈ　Ｍａｒ社製）で超音波（プローブ直径：６ｍｍ、超音波強度：２ワット／ｃｍ２、ＤＵＴＹ比：５０％）を照射することで患部への遺伝子導入を試みた。
　この結果、ベクターに導入されたＭｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａ遺伝子は、マイクロバブル処理したものを貼付剤とし、使用時に超音波処理することで効率よく患部に導入されることが分かった（図６；Ｍｓｘ１およびＳｏｘ９遺伝子の場合）。また椎間板変性マウスに上記遺伝子を導入したマウスの椎間板高を遺伝子導入の７日後に測定したところ、椎間板高が回復していたので、本発明の貼付剤を用いることによって椎間板損傷が改善されることもわかった（図７；Ｍｓｘ１およびＳｏｘ９遺伝子の場合）。
　これらの結果は、本発明の遺伝子の発現レベルの変化、特に発現の減少が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かの指標となり得ること、本発明の遺伝子を導入することで椎間板変性関連疾患を予防または治療し得ることを示している。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「特許請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本発明によれば、椎間板変性関連疾患の原因となり得る椎間板を特定することができるので、事前にその予防策を講じることが可能となる。また、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤を、容易かつ迅速にスクリーニングすることができる。
　本願は、日本で出願された特願２００９－００２０３３（出願日：２００９年１月７日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (23)

  1. 　脊椎動物が椎間板変性関連疾患に羅患しているか否かを判別する方法であって、被検脊椎動物から採取した遺伝子含有試料を用いて、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を解析することを特徴とする、方法。
  2. 　脊椎動物が、ヒトまたはマウスである、請求項１記載の方法。
  3. 　椎間板変性関連疾患が、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症または椎間板損傷である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子またはそのオルソログであり；そして
    Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子またはそのオルソログである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；そして
    Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　椎間板組織をスクリーニングすべき薬剤で処理した後、当該組織中の、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を解析することを特徴とする、脊椎動物の椎間板変性関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法。
  7. 　椎間板変性関連疾患が、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症または椎間板損傷である、請求項６に記載のスクリーニング方法。
  8. 　Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子またはそのオルソログであり；そして
    Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子またはそのオルソログである、請求項６または７に記載のスクリーニング方法。
  9. 　Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；そして
    Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子である、請求項６または７に記載のスクリーニング方法。
  10. 　請求項６～９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって得られる、椎間板変性関連疾患の予防または治療剤。
  11. 　Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部を含んでなる核酸および薬理学上許容される担体を含んでなる、椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物。
  12. 　Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子またはそのオルソログであり；
    Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子またはそのオルソログであり；そして
    Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子またはそのオルソログである、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　Ｍｓｘ１が、配列番号１で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｓｏｘ９が、配列番号２で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｎｆｋｂ１が、配列番号３で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｐｄｇｆａが、配列番号４で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｓｐａｒｃが、配列番号５で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；
    Ｖｄｒが、配列番号６で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子であり；そして
    Ｖｅｇｆａが、配列番号７で表される遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 　核酸がマイクロバブル処理され、かつ患部を超音波処理して用いることを特徴とする、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 　核酸がベクターであることを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　貼付剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　椎間板変性関連疾患が、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症または椎間板損傷である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 　Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部によってコードされる蛋白質よび薬理学上許容される担体を含んでなる、椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物。
  19. 　Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子を導入することを特徴とする、椎間板変性関連疾患の予防または治療方法。
  20. 　Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部によってコードされる蛋白質を導入することを特徴とする、椎間板変性関連疾患の予防または治療方法。
  21. 　椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部を含んでなる核酸の使用。
  22. 　椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｓｘ１、Ｓｏｘ９、Ｎｆｋｂ１、Ｐｄｇｆａ、Ｓｐａｒｃ、ＶｄｒおよびＶｅｇｆａから選択される少なくとも一つの遺伝子の全部または一部によってコードされる蛋白質の使用。
  23. 　請求項１１～１８のいずれか一項に記載の椎間板変性関連疾患の予防または治療用医薬組成物、及び当該医薬組成物が椎間板変性関連疾患の予防または治療に使用することができること又は使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
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