JP4174203B2 - 骨損傷の受け易さを判定する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コラーゲンＩα１の多型性及びメチルテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）遺伝子における多型性のスクリーニングに基づき、骨損傷に対する危険性を判定する方法に関する。また本発明は、好ましくは、危険があると特定されたそれらの対象における骨損傷を予防する方法及び患者の治療に対する応答を判定する方法をも提供する。また、キット及び医薬といった本発明の方法を実施するための手段をも提供する。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の減少、骨微細構造の劣化及び骨折等の骨損傷の危険の増大により特徴付けられる一般的な疾患である。骨粗鬆症は生活の質に影響する主要な公共的な健康問題であり、健康維持に関する費用を増大させる。ヨーロッパ人口のうち、５０才より上では３人に１人の女性、そして１２人に１人の男性が危険な状態にある。米国では英国の疾患発生率より２５％高い２５００万人が、日本及びヨーロッパを合わせるとさらに５０００万人がこの疾患にかかっている。次世紀中頃までには、骨粗鬆症を患うヒトの数は西側では２倍になると予想されるが、アジア及び南アメリカでは６倍に増大するであろう。骨折は骨粗鬆症の最も深刻な結末であり、とりわけ股関節部の骨折は世界中で年間１７０万人が罹患する。生活レベルの向上と老齢人工の増大につれ、２０５０年までに股関節部骨折の数は世界で６００万を越えるであろうと予想される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
骨粗鬆症の治療は、満足すべきものではない。特に骨粗鬆症の結果としての骨損傷が一旦起これば、骨を治癒させることの他に医師ができることはほとんどない。高齢では、これは時間のかかる、また痛みを伴う過程となるであろう。骨粗鬆症進行の危険を有する人々を診断すると、より有効な予防手段が可能となる。これらの疾患予防の戦略としては、成人初期の骨密度を発達させること、そして後の生活における骨損失を可能な限り少なくすることが挙げられる。骨損失には、生活スタイル、栄養及びホルモン因子の変化が影響することが示されている。
【０００４】
骨粗鬆症は、種々の表現型を遺伝的に決定するいくつかの遺伝子が変異した複合的遺伝特性であると考えることができる。低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）は、骨粗鬆症の臨床的に最も重要な特徴である骨折についての重要な危険因子である。ファミリーの隔離分析では、ＢＭＤが多遺伝子制御の下にある一方、さらに骨代謝回転の生物化学的マーカーが強い遺伝的成分を有することも示された。ＢＭＤとの関連で幾つかの候補遺伝子が分析された。最も遺伝的な分析では、骨折の危険の決定因子としてのＢＭＤに焦点をあて、分析の終点として骨折自体にはそれほど焦点を当てていない。最近、最も豊富な骨基質タンパク質をコードするＣＯＬＩＡ１遺伝子のＳｐＩ多型性、及びビタミンＤ受容体遺伝子のハプロタイプがＢＭＤとは無関係な骨粗鬆症骨折の危険の増大に関連することが見いだされた（ＷＯ００／１５８３９）。
【０００５】
ホモシステインは、短命の高反応性アミノ酸であり、メチオニンの代謝の中間体として形成される。この代謝の鍵酵素のいずれかの深刻な欠乏が、血漿ホモシステインのレベルが高く上昇することにより特徴付けられるホモシスチン尿症という珍しい常染色体劣性疾患を引き起こし、これは主として眼、並びに三器官系、すなわち血管系、骨系及び中枢神経系に影響する一連の臨床的発現を伴う。ホモシスチン尿症患者の初期骨粗鬆症（年齢１６才では５０％）発症の根底にある病理生物学的メカニズムは完全には理解されていないが、考えられる説明としてコラーゲン架橋の阻害が示唆された（マックジック，ブイエイ、セントルイス：シー．ブイ．モスビー、間接組織の遺伝可能な障害，第３版、1966，155 頁) 。ホモシスチン尿症患者の皮膚生検中のコラーゲンが酸性溶解性の増大を示し、そしてコラーゲン架橋の量が減少したという発見により、この仮説についてのいくらかの証拠が提供されてきた。イン・ビトロ実験では、ホモシステインが、単離されたコラーゲンの溶液中での架橋及び原繊維形成を阻害することを示した（ジャクソン，エスエイチ、Clin. Chim. Acta 1973; 45: 215-7.5) 。より最近の研究は、ホモシスチン尿症患者の血清中のＩ型コラーゲンの架橋量の減少を示した。これもマックジックの仮説を支持する（レベック，ビーら、Biochem Biophys Acta 1996; 1315: 159-62.6)。
【０００６】
血漿ホモシステインのレベルが穏やかに上昇することが、共通の状態であり、アルツハイマー病（クラークら、Arch. Neurol. 1998 55: 1449-1455) 等の認識低下に対するだけでなく、アテローム性動脈硬化症及び血栓塞栓症（バウシェイら JAMA 1995 274: 1049-1057)に対しても主要な危険因子である。一つの研究は、年齢による骨損失にホモシステイン血漿レベルの増大が関与すること示唆した（ミヤオら、J Bone Min Res 15 S459 (abstract)(2000) が、他のどの研究でも骨格系の疾患とホモシステイン血漿レベルの穏やかな上昇との関係を調べてはいない。
【０００７】
ホモシステイン代謝の鍵酵素の一つが、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）である。この酵素が機能的に変化した変異型、ＭＴＨＦＲ Ｃ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）トランジションが記載されている（カングら、AM JHum Genet 1991 48:536-545 及びフロスら Nat Genet 1995 10: 111-113)。この多型性はホモシステインレベルの穏やかな上昇と関連しており、ある研究では多型性と血管疾患との関連を見いだしたが（ガラハー，ピーエムら、Circulation 1996; 94: 2154-8、クルジトマンズ, エルエイら、Am J Hum Genet 1996; 58:35-41 、モリタ, エイチら Circulation 1997; 95:2032-6、及びウェルチ, ジーエヌら、N Engl J Med 1998; 338:1042-50) 、他の研究ではこれを確認できなかった（フレッチャーら、Hum Genet 1998 103: 11-21)。最近、この変異型は低骨ミネラル密度と関連することも見いだされた（ミヤオら、Calcif Tissue Int 2000; 66: 190-194)。
【０００８】
骨粗鬆症はこの疾患への罹り易さの根底にあるいくつかの遺伝子の変異型を有する多遺伝子性特性と考えることができる。最も豊富な骨基質タンパク質をコードするＣＯＬＩＡ１遺伝子の変異型を含む幾つかの遺伝子における変異型がＢＭＤと関連することが見出された。Ｓｐ１結合部位内のＣＯＬＩＡ１のプロモーター領域に位置するＴ対立遺伝子のこの多型性は、低ＢＭＤと関連し、そして骨粗鬆症骨折の素因と関連することが分かった（ウィターリンデンら、N Engl J Med1998 338: 1016-1021、及びグラントら、Nat Genet 1996 14: 203-205) 。最近、Ｔ対立遺伝子は２（Ｉ）コラーゲン鎖に対する１（Ｉ）コラーゲン鎖の異常生産を惹き起こし、それが骨強度を下げる結果となることが示された（マンら、JClin Invest 2001 107: 899-907)。
【０００９】
該タンパク質配列の位置２２２にＶａｌ残基を有するＭＴＨＦＲの変異が、恐らく血漿ホモシステインレベルの上昇を介して、低骨ミネラル密度と関連することが示されたが、それは骨損傷それ自体に対する危険の増大を指示するものとして用いることはできなかった。骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラル密度とは無関係であり得ること、及び危険対立遺伝子が異なるかもしれないことがこれまでも示されてきた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記のように、現状では、骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラル密度とは無関係であると考えられることから、骨損傷がどのような遺伝的原因によって生じるのかが全く不明であり、骨損傷を受け易い被験体を発見する方法はもちろん骨損傷を受け易い被験体の予防法や治療法を提供することもできない状態にある。しかしながら、本発明者らは、ここに、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子（すなわち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有する被験体での骨折のし易さ即ち骨折の危険とＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在との間には相関関係があるという驚くべき事実を発見した。この事実に基づき鋭意研究を重ねた結果本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】
即ち、本発明の骨子は、
（１）ＭＴＨＦＲの多型性及びコラーゲンＩα１の多型性のどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工程を含む、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（２）ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）多型性、及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程により、被験体の骨損傷の受け易さを判定する上記（１）記載の方法、
（３）ＭＴＨＦＲの多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程により、コラーゲンＩα１のＳｐ１多型性のｓ対立遺伝子を持つことが特定された被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（４）該多型性がＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ多型性である、上記（３）記載の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（５）該対立遺伝子がＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の関連部分の増幅により決定されるものである、上記（１）〜（４）いずれかに記載の方法、
（６）上記（１）〜（５）いずれかに記載の方法であって、コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多型性の対立遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多型性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含む方法、
（７）上記（１）〜（６）いずれかに記載の方法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子に存在する該対立遺伝子（単数又は複数）が骨損傷の危険と関連するか否かを判定する工程をさらに含む方法、
（８）被験体の試料中に存在する該対立遺伝子（単数又は複数）と骨損傷の危険の既知の程度を有する被験体に存在するＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子の対立遺伝子とを比較する工程を含む、上記（７）記載の方法、並びに
（９）上記の方法に使用するキット、
に関する。以下に本発明の実施の態様について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の第１の側面では、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法が提供される。この方法はコラーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲにどの多型性の対立遺伝子が存在するかを決定する工程を含んでいる。
【００１３】
こうして、本発明によれば、個体の骨損傷の受け易さの特定及び治療法又は予防法の開発が可能となる。例えば、骨損傷の危険のある被験体がその生活スタイルを改善し、定期的運動及び健康的食事等の骨強化法を行うことにより、又は損傷の危険を減少させる医薬を服用することにより損傷を避けることができよう。典型的には、本発明の第一の側面の方法は、コラーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲの多型性を分析して骨損傷の受け易さを判定する工程を含む。この方法は、多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定するために、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の分析を含んでもよい。この方法は、一つ以上の特定の対立遺伝子が存在するか否かを決定する工程を含んでもよい。この方法は、被験体がコラーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲの対立遺伝子についてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを決定する工程をさらに含んでもよい。
【００１４】
ＭＴＨＦＲ遺伝子は、フロストら（前記）に記載されたヌクレオチド配列の位置６７７に遺伝性の多型性を含んでいる。さらに、ＭＴＨＦＲの配列及びＣ６７７Ｔ多型性の同定の仕方についての方法論がゴイェットら、Nature Genetics 7195-200 (1994)及びゴイェットら、Mammalian Genome 9 652-656 (1998) に記載されている。この多型性はヌクレオチド配列（本明細書中では「参照」配列と呼ぶ）のＴ残基がＣ残基に置換することから成り、これによりタンパク質配列のアラニンをバリンに変換する。この改変はＨｉｎｆ１制限酵素部位を創出する。そこで、この制限酵素がこの多型性をスクリーニングするのに用いることができる。この遺伝的多型性をＣ６７７Ｔと記載する。この番号は該ヌクレオチド配列に関する多型性の位置を指し、「Ｃ」は参照配列即ち野性型配列に存在するヌクレオチドであり、そして「Ｔ」は変異型配列のその位置に存在するヌクレオチド残基である。同様に、アミノ酸多型性はＡｌａ２２２Ｖａｌと記載される。本発明の目的では、特定のヌクレオチド配列又はタンパク質にどの対立遺伝子が存在するかの決定は、被験体の遺伝子型又は表現型のそれぞれを決定する工程と呼ばれうる。
【００１５】
コラーゲンＩα１（１７ｑ２２）は、イントロン１中でエキソン２の前の４３７ヌクレオチドの遺伝子にＧからＴへの多型性を有する。Ｇ−４３７／ｉｎ１Ｔと記載される多型性は、Ｓｐ１転写因子結合部位中にあり、後述のプライマー等の適切なミスマッチプライマーにより増幅すると、ＭｓｃＩ制限酵素消化により検出することができる。こうして、もしＴ対立遺伝子が存在すれば、ミスマッチが導入され、これがＭｓｃＩ制限部位を導入する。この対立遺伝子をＳ／ｓと記載する。ここで、ｓは多型性部位でのＴ対立遺伝子の存在を示す。本明細書中、この多型性を「ＳｐＩ多型性」と呼ぶ。
【００１６】
本発明は、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子（すなわち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有する被験体での骨折などの、骨折のし易さ即ち骨折の危険（相互に交換して用いうる用語である）とＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在との間には相関関係があるという驚くべき発見に基づく。コラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子に加えて、ＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子を有する被験体は、最も低い骨折の危険を付与するＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝子を有する被験体に比べて骨折について高い危険を示すこととなる。これらの結果は予想され得なかった。なぜなら、これまでの研究ではこれらの危険対立遺伝子が骨ミネラル密度とはほとんど無関係に骨折の危険を予想することを示していたからである。この事実は本明細書中で提示する結果により支持される。本明細書の結果は、骨損傷の危険が最も高いこれらの個体が低い骨ミネラル密度を有する被験体ではないことを示す。ＭＴＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子をスクリーニングすることにより、骨損傷の受け易さを、骨ミネラル密度の分析の必要なしに評価できる。
【００１７】
本発明の第一の側面の方法は、存在する対立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定する工程をさらに含むことが好ましい。これは、被験体に存在する対立遺伝子と骨損傷の危険に関連することが知られている対立遺伝子とを比較することにより実施することができる。例えば、可視化した詳細対立遺伝子及びそれと関連する相対的骨損傷危険を用いて、被験体の遺伝子型又は表現型が骨損傷危険の高低と関連するか否かを決定することができる。
【００１８】
本発明の方法は、イン・ビトロで実施できる。本方法は、被験体の身体から採取した組織試料又は体液試料について実施することが好ましい。こうして、本発明は、非侵襲的な診断方法であって、その結果骨損傷の受け易さの指標を提供するが、治療に関してすぐさま医学的決定がなされる診断には至らない方法に関する。
【００１９】
本発明は、骨損傷の危険を判定することが望まれるいかなる被験体についても実施できる。かかる被験体はほ乳類であることが好ましい。被験体はヒトであることが好ましく、女性であることが、最も好ましい。
【００２０】
骨損傷は、骨折、破壊又は破砕といった構造的損傷のいかなる形態であってもよい。またこれらの用語は、骨の生物学的分解又は劣化をも含む。通常、骨損傷という用語には、低骨ミネラル密度は含まれない。これは骨損傷の危険が骨ミネラル密度と無関係であるという発見と一致する。骨折は臨床的に最も重要な終点であると定義しうるので、本発明の第一の側面の方法は好ましくは骨折の危険を判定する方法に関する。通常このような骨損傷が骨粗鬆症の結果であるとはいえ、本発明の目的にとって、まず被験体が骨粗鬆症であると診断されているか否かは重要でない。
【００２１】
第一の側面の別の実施態様では、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩα１のＳｐ１多型性に対立遺伝子を有する被験体において、ＭＴＨＦＲ多型性の対立遺伝子の存在を決定する工程を含む方法が提供される。好ましい実施態様では、この方法はＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が被験体に存在するかを決定する工程を含んでいる。
【００２２】
本発明の第一の側面の好ましい特徴では、この方法は被験体の遺伝物質を分析して、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ多型性及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が存在しているかを決定する工程を含む。この被験体は、さらに、各対立遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性に分類される。この方法は存在する対立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定する追加の工程を含むことが好ましい。この工程では、コラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子を有する被験体では、ＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の増大と関連し、ＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の減少と関連する。Ｔ対立遺伝子についてホモ接合性であれば被験体の骨損傷の受け易さがさらに増大する一方、Ｃ対立遺伝子についてホモ接合性であれば受け易さはさらに減少するであろう。このように、Ｃ対立遺伝子についてのホモ接合性は骨損傷に対し予防性があると考えてよい。本発明の別の実施態様では、ＭＴＨＦＲのＣ６７７ＴのＣ対立遺伝子をスクリーニングすることにより骨損傷の受け易さを判定する方法が提供される。
【００２３】
第一の側面の別の好ましい特徴では、この方法は被験体のＭＴＨＦＲタンパク質を分析して、Ａｌａ２２２Ｖａｌ多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程を含むことができる。またこの方法は、存在する対立遺伝子が骨損傷危険の増大と関連するか否かを決定するための追加の工程をさらに含むことができる。この追加の工程では、位置２２２のバリン残基の存在が骨損傷危険の増大を示し、そしてこの位置のアラニン残基が骨損傷危険の減少又は正常を示す。
【００２４】
第一の側面の別の好ましい特徴では、骨損傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多型性及び／又はＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ多型性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含む方法が提供される。この方法で、コピー数の増大は骨損傷危険の増大と関連する。
【００２５】
また本発明は、骨折の危険を判定するのに有用なＭＴＨＦＲ遺伝子の他の多型性をスクリーニングする工程を含むことができる。
【００２６】
本発明は、当該技術分野で知られるいかなる適切な方法を用いて実施してもよい。まず、組織試料又は体液試料を被験体から採取することが好ましい。適切な試料の例としては、血液、口腔若しくは頬の細胞、毛根を含む頭髪試料が挙げられる。他の適切な試料も、当業者は承知しているであろう。次に、遺伝物質又はタンパク質を適切な方法を用いて試料から抽出する。遺伝物質はＤＮＡ又はＲＮＡであればよいが、ＤＮＡを用いることが好ましい。例えば、遺伝物質又はタンパク質をサムブルックら（Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbou Laboratory Press) に記載された技術を用いて抽出するとよい。次に、抽出したＤＮＡ又はタンパク質を用いて、例えばサザンブロット分析後制限酵素消化する方法、ＰＣＲ増幅後制限酵素消化し、必要であればゲル電気泳動により消化生成物を分離する方法、任意の適切な方法により関連する遺伝子断片の配列決定をする方法、パターンの違いが一つ以上の特定の対立遺伝子の存在を示すような、例えばＰＡＡ又はアガロースゲル上でヘテロ二本鎖パターンを可視化する方法、分離の程度が一つ以上の多型性制限部位の存在又は非存在に左右される、変性勾配ゲルを用いたＤＮＡ断片の分離法、パターンが一つ以上の多型性制限部位の存在又は非存在に左右されるＳＳＣＰ分析を用いる分離法、ハイブリダイゼーションパターンが対立遺伝子の種々の組み合わせに特異的となる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用する方法、既知突然変異を検出するためのＯＬＡ、タックマン（Taqman) 又はドットブロットといった方法、目的対立遺伝子に対する蛍光標識プローブを用いたＤＮＡ部位の可視化法、及びＲＦＬＰ分析といった適切な技術により、被験体の遺伝子型又は表現型を決定することができる。
【００２７】
タンパク質を分析する場合は、このタンパク質の異なる多型性型の間を識別できる抗体の使用、免疫アッセイ、移動度変位分析、又はタンパク質サイズの差を検出できる他の技術、及びタンパク質活性の変化を検出するアッセイといった方法が適切であろう。
【００２８】
本発明を実施するに際し、特定の制限酵素を使用することが望ましい場合は、当業者は同様の特異性を有する酵素的又は化学的操作を用いうることを理解しているであろう。例えば、本明細書中に記載する酵素と類似の特異性を有する制限酵素（アイソシゾマー）を用いてもよく、またＤＮＡ又はＲＮＡ切断特異性を持つ化学的分解法を用いてもよい。
【００２９】
被験体の遺伝子型又は表現型を決定するのに適する他の任意の技術も本発明に用いることができる。
【００３０】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により実施し、該断片がＭＴＨＦＲのものである場合は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、７０、１００、１５０又は２００塩基長となるコピーを生産することが好ましい。増幅する断片がコラーゲンＩα１遺伝子のものである場合は、少なくとも５０塩基対長、好ましくは２００塩基対長の断片を増幅するようにＰＣＲプライマーを選択するとよい。ＰＣＲ技術は当該技術分野ではよく知られ、前記遺伝子の適切な領域、すなわちＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１７０から１１００までの領域及びコラーゲンＩα１遺伝子の第１イントロンを増幅するためのプライマーを特定することは通常の知識を有する者の範囲内である。好ましい技術は一塩基伸長であり、本方法にとって多型性部位を含む断片を増幅することが唯一必要である。このように、６７７多型性部位の直ぐ周囲の領域を増幅することが要求される。ＰＣＲ技術はＥＰ−Ａ−０２００３６２及びＥＰ−Ａ−０２０１１８４に記載されている。
【００３１】
第一の側面の好ましい特徴では、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１７０から１１００までの領域の一部分を含む断片を増幅する工程、及びＭＴＨＦＲにどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工程を含む方法が提供される。当該技術分野の熟練者は、ＭＴＨＦＲ遺伝子の該部分を増幅するのに適切なプライマーを容易に入手できるであろう。このようなプライマーの例として、
１． ５'-ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＧＡ-３'及び／又は
２． ５'-ＡＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧ-３'
が挙げられる。
【００３２】
コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定するには、コラーゲンＩα１遺伝子の第１イントロンの少なくとも一部分を増幅し、その後ＭｓｃＩ制限部位の存在を決定するとよい。適切なプライマーとしては、
１． ５'-ＴＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＡＣＴＴＴＴＴＧＧ-３'及び／又は
２． ５'-ＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣ-３'
が挙げられる。
【００３３】
さらなるプライマー配列は、グラントら（Nature 14 203-205 (1996)) に記載されている。
【００３４】
遺伝子の増幅された部分が関連対立遺伝子を含む遺伝子の前記規定部分より大きい場合は、ＭＴＨＦＲ遺伝子のｈｉｎｆＩ制限部位又はコラーゲンＩα１遺伝子のＳｐＩ部位を含むＭＴＨＦＲ又はコラーゲンＩα１遺伝子配列が含まれないようにすることが好ましい。
【００３５】
本発明の第二の側面では、被験体の骨損傷を予防する方法が提供される。この被験体は好ましくは本発明の第一の側面の方法を用いて、骨損傷危険があると診断されていることが好ましい。この側面において、予防には、被験体の骨損傷危険を減少するためのいかなる手段も含まれる。
【００３６】
治療は予防的又は緩和的処置の形態であればよい。好ましい治療方法は、血漿中のホモシステインのレベルを減少させ、そしてＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子の効果を効果的に逆転させるために、葉酸又は葉酸塩を投与する方法である。葉酸と並行して、又はそれに替わるものとして投与される他の適切な治療法には、生活スタイル、定期的運動及び骨を強くするための食事の変更及びホルモン治療が挙げられる。骨の損失を減少させるための医薬製剤などの他の適切な治療も、医師及び当業者に知られている。例として、タンパク同化ステロイド、ビスホスホネート、ビタミンＤ製剤、カルシウム補強剤及びホルモン補充療法が挙げられる。
【００３７】
第二の側面の好ましい実施態様では、骨損傷の予防に使用するための医薬品製造における葉酸の使用が提供される。
【００３８】
医薬品の投与は、任意の有効な経路、例えば経口又は非経口経路により行われる。非経口送達方法には、局所、動脈内、皮下、骨髄内、静脈内又は鼻腔内投与が挙げられる。経口投与後の皮下注射が摂取経路として好ましく、また持続的に作用する固定化法も用いうる。活性成分に加えて、これらの医薬品には、賦形剤及び薬学的に使用できる製剤への活性化合物の処理を促進させる他の化合物等の適切な薬学的に許容しうる担体を含めてもよい。製剤化及び投与の技術についてのさらなる詳細は、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 」（Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版に記載されている。
【００３９】
経口投与のための医薬品は、経口投与に適した投与量で、当該技術分野でよく知られた薬学的に許容しうる担体を用いて製剤化できる。このような担体により、患者の摂取に適した錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として医薬組成物を製剤化できる。
【００４０】
経口使用のための医薬品は、活性成分と固体賦形剤とを混合することにより、必要であれば、所望に応じ適切な添加化合物を加えた後、得られた混合物を摩砕しそして顆粒の混合物を処理することにより錠剤又は糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質の増量剤である。これらには、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質に加えて、乳糖、蔗糖、マンニトール又はソルビトール、トウモロコシ、ムギ、コメ、イモ又は他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、及びアラビア及びトラガカント等のガムが含まれるが、これらに限定されない。必要な場合は、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム等のその塩といった、崩壊剤又は溶解剤を加えてもよい。
【００４１】
糖衣錠コアには、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒若しくは溶媒混合物などをも含む濃縮糖溶液などの適切な被覆剤で被覆する。着色料又は色素を錠剤又は糖衣錠被覆剤に加えて、生産物の特定又は活性化合物の量（すなわち、投与量）を特定してもよい。
【００４２】
経口に用いうる医薬品には、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等の被覆剤でできた軟性、密封カプセル剤及びゼラチンからできた押し嵌め式カプセル剤が挙げられる。押し嵌め式カプセル剤には、活性成分をラクトース又はデンプン等の充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び任意選択的に安定剤と混合して含めることができる。軟カプセル剤には、活性化合物を脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体に、安定剤と共に又は安定剤を用いずに、溶解又は懸濁するとよい。
【００４３】
非経口投与のための医薬品としては、活性化合物の水溶液が挙げられる。注射用には、本発明の医薬を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液又は生理的緩衝食塩水等の生理的適合緩衝液中で製剤化する。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増大させる物質を含めてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液を適切な油性注射懸濁剤として調製してもよい。適切な親油性溶媒又はビークルとしては、ゴマ油等の脂肪油又はオレイン酸エチル又はトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。さらに、懸濁剤には、高濃度溶液の調製を可能とするために、化合物の溶解性を増大する適切な安定剤又は薬剤を含めてもよい。
【００４４】
局所又は経鼻投与には、浸透させるべき特別な障壁に対し適切な浸透剤を製剤化に用いる。このような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られている。
【００４５】
本発明の医薬品は、当該技術分野で知られる方法（例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠調製、すりつぶし、乳化、カプセル化、封入化又は凍結乾燥処理などの手段により）と同様の方法で製造することができる。またこの医薬品は、例えば持続的放出又は標的化放出などの適切な放出特性を与えるために、慣用手段例えば被覆により改良してもよい。
【００４６】
この医薬品は塩として提供してもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸を用いて形成できるが、これらに限定されない。塩は、対応する遊離塩基の形態である水性又は他のプロトン溶媒ではより溶解し易い傾向がある。他の場合では、好ましい調製物は、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトールに、ｐＨ４．５〜５．５の範囲で調製された凍結乾燥粉末である。これは使用の前に緩衝液と混合して用いられる。
【００４７】
許容しうる担体中に製剤化されたこのような医薬品を調製した後、それを適切な容器に入れ、示した状態の治療のためのラベルを貼る。
【００４８】
骨損傷の予防のために適切な医薬品としては、意図された目的を達成するのに有効な量の活性成分を含む組成物が挙げられる。実際に投与される量は、治療される個体に依存し、望みの効果が重大な副作用なしに達成されるような最適な量であることが好ましい。治療的に有効な投与量の決定は、充分に当該技術分野の熟練者の能力内にある。もちろん、熟練者は分割投与や部分投与も本発明の範囲内であると理解するであろう。
【００４９】
いかなる化合物でも、治療上有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイ又は適切な動物モデル（例えば高血圧には、霊長類、ラット及びモルモット並びに他の実験室小動物）のどちらかで見積もることができる。これらのアッセイでは、下流の処理活性だけでなく、受容体活性も考慮すべきである。また望ましい濃度範囲及び投与経路を決めるために、動物モデルも用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な投与量及び投与経路を決定することができる。
【００５０】
治療上有効な量とは、症状又は状態を改善する薬剤の量を指す。このような化合物の治療上の有効性及び毒性は、標準的薬学操作により細胞培養又は実験動物において決定できる（例えば、ＥＤ50、集団の５０％が治療上有効な投与量、及びＬＤ50、集団の５０％が死に至る投与量）。治療効果と毒性効果の間の投与量の比が治療指数であり、定量ＥＤ50／ＬＤ50として表せる。大きい治療指数を示す医薬品が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに使用するための投与量範囲を決定する際に有用である。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか全くないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。この投与量は、採用される投与形態、患者の感受性及び投与経路により、この範囲内で変動する。
【００５１】
正確な用量は、治療する患者の観点で各医師により選択される。活性部分の充分なレベルを提供するよう、又は所望の効果を維持するように、用量及び投与を調整する。長時間作用する医薬品を、具体的製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、１週間毎又は２週間に１回投与してもよい。具体的用量及び送達方法についてのガイダンスは、文献に記載されている（参照により本明細書にインコーポレートされる米国特許第４，６５７，７６０号、第５、２０６，３４４号、第５，２２５，２１２号を参照）。
【００５２】
本発明の第三の側面では、治療に対する被験体の応答を予測する方法であって、ＭＴＨＦＲ及び／又はコラーゲンＩα１の多型性のどの対立遺伝子（単数又は複数）が被験体に存在するかを決定する工程を含む方法が提供される。これは、第一の側面に従ってなされうる。この方法は被験体が骨損傷を受け易いか否かを判定する工程を含むことが好ましい。治療剤又は予防剤の効果は根底にある骨損傷の原因に依存し、場合によっては、特定の治療の採用を避けることが好ましいであろう。例えば、ある遺伝子の特定の対立遺伝子が存在するか否かが、どれが最適な予防法であるかに関して有用な指示を与えることになる。例えば、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子を有するが、ＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子を有しない被験体は、葉酸投与から利益を得ることはなさそうである。また本発明のこの側面は、骨損傷の治療に使用しうる薬剤を特定するのにも有用であろう。
【００５３】
本発明の第四の側面では、ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子の多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定するのに有用なキットであって、（ｉ）ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一部を増幅するための一つ以上の核酸プライマー分子、及び（ii）該遺伝子中にどの対立遺伝子が存在するかを決定する手段を含むキットを提供する。ＭＴＨＦＲ及びコラーゲンＩα１の多型性はそれぞれＣ６７７Ｔ多型性及びＳｐＩ多型性であることが好ましい。タンパク質分析のためのキットは、タンパク質の異なる多型性間を識別できる抗体、及び移動度変位分析又は免疫アッセイを実施するために必要な薬剤を含んでいるとよい。またこのキットは対立遺伝子（単数又は複数）と骨損傷危険の間の相関関係を示す手段を含むことが好ましい。
【００５４】
プライマー分子はＭＴＨＦＲ遺伝子の少なくとも一部及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の第１イントロンの一部の増幅に適することが好ましい。適切なプライマーの例は上に記述している。
【００５５】
ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子にどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する手段は、前記の方法のいずれかで使用するために必要な任意の薬剤又は分子を含んでもよい。例えば、ＰＣＲ後のＤＮＡ消化を用いる場合は、この手段はＰＣＲ薬剤及び一つ以上のｈｉｎｆＩ及び／又はＭｓｃＩ制限酵素を含むことが好ましい。この方法がサザンブロット、ヘテロ二本鎖可視化又は蛍光標識技術を採用する場合は、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の適切な領域に結合するプローブを含むとよい。必要であれば、このようなプローブは、例えばニック翻訳、放射標識若しくは蛍光標識又はランダムプライマー伸長により検出されるように標識し、それにより標識していないヌクレオチドは標識分子合成のための鋳型として働く。プローブを標識する他の方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００５６】
存在する対立遺伝子と骨損傷危険とを相関させる手段は、ＭＴＨＦＲ多型性のＴ対立遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子のＳ対立遺伝子の存在が骨折危険増大と関連することを示すようなチャート又は視覚化手段の形態であってもよい。
【００５７】
第五の側面の好ましい特徴では、キットは被験体のＤＮＡ配列との比較のために対照のＤＮＡ又はタンパク質試料を含んでいてもよい。対照試料は、ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一つ以上の対立遺伝子の配列を含む。
【００５８】
さらなる側面では、第一の側面の方法における第四の側面のキットの使用が提供される。
【００５９】
本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の各側面にも当てはまる。
【００６０】
ここに本発明を以下の実施例及び図を参照して詳細に記載する。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００６２】
本研究の目的は、ＢＭＤ及び骨折の危険を判定するに際し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺伝子の二つの機能的多型性間の相互作用を調べることであった。さらに、ホモシステイン血清レベルとＢＭＤ及び骨折危険との関連を研究した。
【００６３】
研究被験体
「ロッテルダム研究」は、オランダ王国、ロッテルダム市のオムールド地区に居住する５５歳以上の７９８３人の被験体についての集団に基づくコホート研究である。この研究は、いくつかの潜在的決定因子に関して高齢者の疾患発病を記録するように計画した（ホフマンら、Eur J Epidemiol 1991 7: 403-422)。全体で１０，２７５人であり、そのうち９１６１人（８９％）は独立して生活しており、１９９１年に研究に参加するよう招かれた。独立して生活しているこれらの被験体の全体的な回答率は、自宅面接については７７％、及び身体特徴の測定、ＢＭＤ及び血液採取といった研究センター内での検査については７１％であった。ロッテルダム研究は、Medical Ethics Committee of the Erasmus University Medical School により承認され、書面によるインフォームド・コンセントを各被験体から得た。ホモシステイン、ＭＴＨＦＲ遺伝子型、ＣＯＬＩＡ１遺伝子型並びにＢＭＤ及び骨折の間の関係の分析は、研究に参加した女性のサンプルで実施した。
【００６４】
ＭＴＨＦＲ遺伝子、ＣＯＬＩＡ１遺伝子と、骨折の危険及びＢＭＤとの間の関連の分析のため、女性下部集団を研究した。ＢＭＤのベースライン測定はこの研究から独立して生活している５９３１人について得たが、これらのうち１４５３人は歩行補助器の使用のため、真性糖尿病のため、利尿薬、エストロゲン、甲状腺ホルモン又は細胞成長抑制薬治療の使用のため排除した。残りの被験体から、年齢５５〜８０才の女性１５３３人の無作為サンプルを研究した。
【００６５】
ホモシステインレベル、骨折危険及びＢＭＤ間の関連の分析は、異なるグループの女性について行った。女性４５９人のサンプルを無作為に総集団から選んだ。４４人の女性については、身体測定データ及び骨折についての追跡データが得られず、最終的に研究グループは女性４１５人となった。
【００６６】
測定
実験の始めに、靴及び室内着を着用せずに起立姿勢で身長及び体重を測定した。身長（メートル）の二乗で割ったキログラム体重（ｋｇ／ｍ2 ）をボディーマス指数（ＢＭＩ）としてコンピュータ処理した。以前に記載された（バーガーら、Bone Miner 1994 25: 1-13）ように、大腿部付け根及び腰椎（椎骨）で、二重エネルギーＸ線吸光光度計（ＤＥＸＡ）（ルマール DPX-L濃度計、ルワール社、マジソン、WI、USA ）により骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した。前年度の食事からのカルシウム摂取（ｍｇ／日）を、食事頻度の質問により評価し、エネルギー摂取により調整した。現在の喫煙状況を質問し評価した。
【００６７】
９５６人の女性（６２％）について、第四胸椎から第五腰椎までの椎骨の側面Ｘ線写真を、ベースライン調査（１９９０年から１９９３年）及び追跡検診（１９９７年から１９９９年）の両方について得た。追跡Ｘ線写真を、マックロスキー／カニス法（McCloskey ら、Osteoporosis Int 1993 3: 138-147) により椎骨骨折の存在を数えた。椎骨骨折が存在する場合は、ベースラインＸ線写真をよく調べ、骨折が付随的(incident)であるか主体的(prevalent) なものであるかを確かめた。
【００６８】
股関節部、手首及び他の骨折を含む付随的非椎骨骨折を記録し、確認し、そして平均７年間の追跡期間にわたって医師が分類した。追跡は、１９９１年１月１日、又はその後の研究に含まれた時点に開始した。本研究についての追跡は１９９９年１２月３１日か、参加者が死亡した場合はそれより早い時点で終了した。
【００６９】
ホモシステイン測定
ベースライン調査から絶食でない血清試料を得た。試料を直ぐに氷の上におき、エクス・ビボ形成による総ホモシステイン濃度の増大を妨ぐのに充分であることが分かっている（ウビンクら、Clin Chim Acta 1992 207: 119-128）６０分以内に処理した。総ホモシステインの測定まで、血清を−２０℃で凍結して保存した。アラキ及びサコ（J Chromatogr 1987 422: 43-52）に従って、かつウビンクら（J Chromatogr 1991 565: 441-446）により改良された高圧液体クロマトグラフィーを用いて、総ホモシステインを蛍光誘導体として測定した。
【００７０】
ＣＯＬＩＡ１及びＭＴＨＦＲ遺伝子型の決定
標準的操作に従って末梢静脈血試料からゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の多型性を、以前に記載されている二対立遺伝子制限部位を導入するミスマッチプライマー（グラントら、前記）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により検出した。この試験は、二つの対立遺伝子Ｇ及びＴを、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の第１イントロンのＳｐ１結合部位の第１塩基における、それぞれグアニン及びチミジンの存在により識別する。ＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多型性は、多型性を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅により検出し、その後この断片を、以前に記載されたように（フロスら、前記）ＨｉｎｆＩで消化した。この試験では、二つの対立遺伝子Ｃ及びＴを、タンパク質のコドン２２２における、それぞれアラニン又はバリンにより識別する。
【００７１】
統計分析
研究グループ間のベースラインでの年齢の差を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）の平均により評価した。ベースラインの特徴での他の全ての差を共変量として、年齢又は年齢及びＢＭＩと共に試験する共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）により比較し、ありうる攪乱効果を調整した。被験体を、そのホモシステインレベルに従った遺伝子型又は１／３ずつにグループ分けした。カイ二乗分析を用いて、ハーディ−ヴァインベルグ平衡からの逸脱を試験した。ＢＭＤと異なる遺伝子型若しくはホモシステインレベル間の関連を調べるために、多変量線形回帰モデルを用いた。椎骨骨折の危険を見積もるために、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のオッズ比を、ロジスティック回帰モデルを用いて計算した。非椎骨骨折危険を見積もるためＣｏｘ比例危険モデルを用い、それにより追跡期間における潜在的差を考慮に入れた。
【００７２】
結果
Ａ．ＭＴＨＦＲ遺伝子、ＣＯＬＩＡ１遺伝子及び骨粗鬆症終点
研究被験体の特徴
「ロッテルダム研究」の女性のベースラインの特徴及び本研究の集団の特徴を表１に示す。本研究のグループは、ロッテルダム研究に比べて平均５．６歳若いが、８０才以上の女性を排除しているためである。この研究被験体は、平均して１．９％低く調整されたボディーマス指数（ＢＭＩ）及び１．３％低く調整された腰椎ＢＭＤを有していた。ベースラインのカルシウム摂取、被験体の喫煙率又は大腿部付け根ＢＭＤに関しては、有意差はなかった。
【００７３】
ＭＴＨＦＲ、ＣＯＬＩＡ１及びＢＭＤの間の関連
表２は、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ変異型及びＣＯＬＩＡ１のＳｐ１多型性の両者の遺伝子型頻度を示す。ＣＯＬＩＡ１多型性の対立遺伝子頻度（Ｇ対立遺伝子が８２％、そしてＴ対立遺伝子が１８％）及び遺伝子型分布は、以前の研究の白色人種について報告されたものと同様であり（ウィターリンデンら、前記、ビーバンら、N Engl J Med 1998 339: 351-352、及びラングダールら、J Bone MinerRes 1998 13: 1384-1389 、及びキーンら、Arthritis Rheus 1999 42m 285-290）、それらはハーディ−ヴァインベルグの平衡（ＨＷＥ）から逸脱しなかった。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、身長、喫煙習慣又は食事からのカルシウム摂取において有意差がなかった（データは示さず）。ＧＧ遺伝子型の平均体重は、ＧＴ及びＴＴ遺伝子型グループに比べて有意に高かった（ｐ＝０．０５）。先に報告されたように、大腿骨付け根及び腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意の遺伝子−用量効果が見い出された。年齢及びＢＭＩについて調整後、ＧＧグループに比べてＴＴ遺伝子型を有する個体では大腿骨付け根ＢＭＤは０．２ＳＤ低く、腰椎ＢＭＤは０．４ＳＤ低かった。
【００７４】
ＭＴＨＦＲ多型性の対立遺伝子頻度は、Ｃ対立遺伝子が７７％、Ｔ対立遺伝子が３３％であり、そして遺伝子型分布は、以前の研究の白色人種について報告されたものと同様であり（ボットーら、Am J Epidemiol 200 151: 862-877)、それらはＨＷＥから逸脱しなかった。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、ＢＭＩ、食事からのカルシウム摂取及び喫煙習慣において有意差がなかった（データは示さず）。大腿骨付け根及び腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意な遺伝子−用量効果を見い出した。年齢及びＢＭＩについて調整後、ＣＣグループに比べてＴＴ遺伝子型を有するグループにおける両部位の骨ミネラル密度は０．２ＳＤ低かった。
【００７５】
ＭＴＨＦＲ変異型及びＣＯＬＩＡ１変異型の間の相互作用
ＢＭＤ及び／又は骨折危険を判定するに際し両遺伝的変異型の相互作用を研究するために、被験体を４グループ、すなわちＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１についての危険対立遺伝子を持たない参照グループ、ＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＣＯＬＩＡ１危険対立遺伝子は存在しないグループ、ＣＯＬＩＡ１危険対立遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＭＴＨＦＲは存在しないグループ、及びＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１の両方の危険対立遺伝子（単数又は複数）が存在するグループに区分した。四つの遺伝子型グループについてのベースライン身体測定及び食事に関する測定に有意な差は見られなかった（データは示さず）。大腿骨付け根及び腰椎の両者での骨ミネラル密度は、四つの遺伝子グループ間で有意に異なった（表３）。両部位について、ＭＴＨＦＲか又はＣＯＬＩＡ１のいずれかに危険対立遺伝子が存在する場合と比べて、両遺伝子座に危険対立遺伝子が存在する場合はＢＭＤの減少が見られた。
【００７６】
遺伝子型とＢＭＤ間の関連における年齢関連の変化
骨ミネラル密度に及ぼす遺伝的効果を、損失速度の差によるだけでなく、最大骨量の差として観察できた。従って、本発明者らは被験体を８．３年カテゴリーに分割して、ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１相互作用とＢＭＤとの関連に及ぼす年齢効果を調べた。図１及び図２は、組み合わせた対立遺伝子のグループと参照グループの間の差が、最高齢女性グループ（年齢７１．６才から８０才）の大腿骨付け根及び腰椎の両者では、両端の遺伝子型グループの間で０．５ＳＤまで年齢と共に増大することを示す。
【００７７】
遺伝子型と骨折危険の間の関連
表４は、そのＭＴＨＦＲ／ＣＯＬＩＡ１遺伝子型に従ってグループ分けした女性の付随的非椎骨骨折及び椎骨骨折の分布を示す。ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１の両者について少なくとも一つの危険対立遺伝子を保持する女性では、非椎骨骨折の過剰発現が観察された。椎骨骨折の存在に関しては、４遺伝子グループ間に有意差はなかった。ロジスティック回帰分析では、危険対立遺伝子の組み合わせを担持する女性は非椎骨骨折について１．９倍危険が増大することを示した。年齢及びＢＭＩ又は大腿骨付け根のＢＭＤについて調整すると、危険の評価は本質的に変わらなかった。
【００７８】
ＭＴＨＦＲ／ＣＯＬＩＡ１遺伝子型とＢＭＤとの関連は年齢に依存するので、非椎骨骨折の危険に及ぼす年齢効果も評価した。労力の理由で、女性を中央値６５．７５に従って２つの年齢グループに分割した。表５は、両危険対立遺伝子を担持する高齢女性が、とりわけより多くの非椎骨折を有することを示す。ロジスティック回帰分析では、２．５倍高い危険を示した。この危険計算を大腿骨付け根でＢＭＤについて調整すると、骨折危険は参照グループに比べて２．１倍の高さを維持した。
【００７９】
Ｂ ホモシステインレベルと骨折の危険
血清中のホモシステインレベルのベースラインの三分画に従って４１５人の女性を三つのカテゴリーに区分した。ベースラインの特徴の比較（表６）では、最も高い１／３の女性では、最も低い１／３に比べて平均５才高く（ｐ＜０．００１）、喫煙者は多く、そしてその平均の食事からのカルシウム摂取は１４％低いことを示した。三つの三分画は、大腿骨付け根及び腰椎でのＢＭＩ及びＢＭＤに関して有意な差はなかった。
【００８０】
表７は、ホモシステインタータイルに従った骨折分布を示す。最も高い１／３の女性は、最も低い１／３の女性に比べて有意に多くの非椎骨骨折及び椎骨骨折を経験していた。中間の１／３でも、最も低い１／３に比べてより多くの椎骨骨折を経験していた。ロジスティック回帰分析では、最も高い１／３の女性には非椎骨骨折では２．１倍高い骨折の危険が、そして椎骨骨折では３．６倍高い骨折の危険があった。これらの危険の見積は、年齢及びＢＭＩについて調整した後も本質的に変化しなかった。ＢＭＤ、食事からのカルシウム摂取又は喫煙のような他の可能な攪乱因子について調整した場合も、危険の見積は変化しなかった（データは示さず）。
【００８１】
【表１】
【００８２】
【表２】
【００８３】
【表３】
【００８４】
【表４】
【００８５】
【表５】
【００８６】
【表６】
【００８７】
【表７】
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、骨粗鬆症による骨折の危険を持つか否かを被験体の遺伝子を検査することにより、非侵襲的に診断することが可能となり、これによって、骨粗鬆症による骨折の危険を有する被験体の予防措置を講ずることも可能となった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、大腿部付け根の骨密度における年齢に関する差を示す。
【図２】図２は、腰椎の骨密度における年齢に関する差を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、コラーゲンＩα１の多型性及びメチルテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）遺伝子における多型性のスクリーニングに基づき、骨損傷に対する危険性を判定する方法に関する。また本発明は、好ましくは、危険があると特定されたそれらの対象における骨損傷を予防する方法及び患者の治療に対する応答を判定する方法をも提供する。また、キット及び医薬といった本発明の方法を実施するための手段をも提供する。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の減少、骨微細構造の劣化及び骨折等の骨損傷の危険の増大により特徴付けられる一般的な疾患である。骨粗鬆症は生活の質に影響する主要な公共的な健康問題であり、健康維持に関する費用を増大させる。ヨーロッパ人口のうち、５０才より上では３人に１人の女性、そして１２人に１人の男性が危険な状態にある。米国では英国の疾患発生率より２５％高い２５００万人が、日本及びヨーロッパを合わせるとさらに５０００万人がこの疾患にかかっている。次世紀中頃までには、骨粗鬆症を患うヒトの数は西側では２倍になると予想されるが、アジア及び南アメリカでは６倍に増大するであろう。骨折は骨粗鬆症の最も深刻な結末であり、とりわけ股関節部の骨折は世界中で年間１７０万人が罹患する。生活レベルの向上と老齢人工の増大につれ、２０５０年までに股関節部骨折の数は世界で６００万を越えるであろうと予想される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
骨粗鬆症の治療は、満足すべきものではない。特に骨粗鬆症の結果としての骨損傷が一旦起これば、骨を治癒させることの他に医師ができることはほとんどない。高齢では、これは時間のかかる、また痛みを伴う過程となるであろう。骨粗鬆症進行の危険を有する人々を診断すると、より有効な予防手段が可能となる。これらの疾患予防の戦略としては、成人初期の骨密度を発達させること、そして後の生活における骨損失を可能な限り少なくすることが挙げられる。骨損失には、生活スタイル、栄養及びホルモン因子の変化が影響することが示されている。
【０００４】
骨粗鬆症は、種々の表現型を遺伝的に決定するいくつかの遺伝子が変異した複合的遺伝特性であると考えることができる。低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）は、骨粗鬆症の臨床的に最も重要な特徴である骨折についての重要な危険因子である。ファミリーの隔離分析では、ＢＭＤが多遺伝子制御の下にある一方、さらに骨代謝回転の生物化学的マーカーが強い遺伝的成分を有することも示された。ＢＭＤとの関連で幾つかの候補遺伝子が分析された。最も遺伝的な分析では、骨折の危険の決定因子としてのＢＭＤに焦点をあて、分析の終点として骨折自体にはそれほど焦点を当てていない。最近、最も豊富な骨基質タンパク質をコードするＣＯＬＩＡ１遺伝子のＳｐＩ多型性、及びビタミンＤ受容体遺伝子のハプロタイプがＢＭＤとは無関係な骨粗鬆症骨折の危険の増大に関連することが見いだされた（ＷＯ００／１５８３９）。
【０００５】
ホモシステインは、短命の高反応性アミノ酸であり、メチオニンの代謝の中間体として形成される。この代謝の鍵酵素のいずれかの深刻な欠乏が、血漿ホモシステインのレベルが高く上昇することにより特徴付けられるホモシスチン尿症という珍しい常染色体劣性疾患を引き起こし、これは主として眼、並びに三器官系、すなわち血管系、骨系及び中枢神経系に影響する一連の臨床的発現を伴う。ホモシスチン尿症患者の初期骨粗鬆症（年齢１６才では５０％）発症の根底にある病理生物学的メカニズムは完全には理解されていないが、考えられる説明としてコラーゲン架橋の阻害が示唆された（マックジック，ブイエイ、セントルイス：シー．ブイ．モスビー、間接組織の遺伝可能な障害，第３版、1966，155 頁) 。ホモシスチン尿症患者の皮膚生検中のコラーゲンが酸性溶解性の増大を示し、そしてコラーゲン架橋の量が減少したという発見により、この仮説についてのいくらかの証拠が提供されてきた。イン・ビトロ実験では、ホモシステインが、単離されたコラーゲンの溶液中での架橋及び原繊維形成を阻害することを示した（ジャクソン，エスエイチ、Clin. Chim. Acta 1973; 45: 215-7.5) 。より最近の研究は、ホモシスチン尿症患者の血清中のＩ型コラーゲンの架橋量の減少を示した。これもマックジックの仮説を支持する（レベック，ビーら、Biochem Biophys Acta 1996; 1315: 159-62.6)。
【０００６】
血漿ホモシステインのレベルが穏やかに上昇することが、共通の状態であり、アルツハイマー病（クラークら、Arch. Neurol. 1998 55: 1449-1455) 等の認識低下に対するだけでなく、アテローム性動脈硬化症及び血栓塞栓症（バウシェイら JAMA 1995 274: 1049-1057)に対しても主要な危険因子である。一つの研究は、年齢による骨損失にホモシステイン血漿レベルの増大が関与すること示唆した（ミヤオら、J Bone Min Res 15 S459 (abstract)(2000) が、他のどの研究でも骨格系の疾患とホモシステイン血漿レベルの穏やかな上昇との関係を調べてはいない。
【０００７】
ホモシステイン代謝の鍵酵素の一つが、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）である。この酵素が機能的に変化した変異型、ＭＴＨＦＲ Ｃ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）トランジションが記載されている（カングら、AM JHum Genet 1991 48:536-545 及びフロスら Nat Genet 1995 10: 111-113)。この多型性はホモシステインレベルの穏やかな上昇と関連しており、ある研究では多型性と血管疾患との関連を見いだしたが（ガラハー，ピーエムら、Circulation 1996; 94: 2154-8、クルジトマンズ, エルエイら、Am J Hum Genet 1996; 58:35-41 、モリタ, エイチら Circulation 1997; 95:2032-6、及びウェルチ, ジーエヌら、N Engl J Med 1998; 338:1042-50) 、他の研究ではこれを確認できなかった（フレッチャーら、Hum Genet 1998 103: 11-21)。最近、この変異型は低骨ミネラル密度と関連することも見いだされた（ミヤオら、Calcif Tissue Int 2000; 66: 190-194)。
【０００８】
骨粗鬆症はこの疾患への罹り易さの根底にあるいくつかの遺伝子の変異型を有する多遺伝子性特性と考えることができる。最も豊富な骨基質タンパク質をコードするＣＯＬＩＡ１遺伝子の変異型を含む幾つかの遺伝子における変異型がＢＭＤと関連することが見出された。Ｓｐ１結合部位内のＣＯＬＩＡ１のプロモーター領域に位置するＴ対立遺伝子のこの多型性は、低ＢＭＤと関連し、そして骨粗鬆症骨折の素因と関連することが分かった（ウィターリンデンら、N Engl J Med1998 338: 1016-1021、及びグラントら、Nat Genet 1996 14: 203-205) 。最近、Ｔ対立遺伝子は２（Ｉ）コラーゲン鎖に対する１（Ｉ）コラーゲン鎖の異常生産を惹き起こし、それが骨強度を下げる結果となることが示された（マンら、JClin Invest 2001 107: 899-907)。
【０００９】
該タンパク質配列の位置２２２にＶａｌ残基を有するＭＴＨＦＲの変異が、恐らく血漿ホモシステインレベルの上昇を介して、低骨ミネラル密度と関連することが示されたが、それは骨損傷それ自体に対する危険の増大を指示するものとして用いることはできなかった。骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラル密度とは無関係であり得ること、及び危険対立遺伝子が異なるかもしれないことがこれまでも示されてきた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記のように、現状では、骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラル密度とは無関係であると考えられることから、骨損傷がどのような遺伝的原因によって生じるのかが全く不明であり、骨損傷を受け易い被験体を発見する方法はもちろん骨損傷を受け易い被験体の予防法や治療法を提供することもできない状態にある。しかしながら、本発明者らは、ここに、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子（すなわち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有する被験体での骨折のし易さ即ち骨折の危険とＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在との間には相関関係があるという驚くべき事実を発見した。この事実に基づき鋭意研究を重ねた結果本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】
即ち、本発明の骨子は、
（１）ＭＴＨＦＲの多型性及びコラーゲンＩα１の多型性のどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工程を含む、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（２）ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）多型性、及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程により、被験体の骨損傷の受け易さを判定する上記（１）記載の方法、
（３）ＭＴＨＦＲの多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程により、コラーゲンＩα１のＳｐ１多型性のｓ対立遺伝子を持つことが特定された被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（４）該多型性がＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ多型性である、上記（３）記載の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（５）該対立遺伝子がＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の関連部分の増幅により決定されるものである、上記（１）〜（４）いずれかに記載の方法、
（６）上記（１）〜（５）いずれかに記載の方法であって、コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多型性の対立遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多型性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含む方法、
（７）上記（１）〜（６）いずれかに記載の方法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子に存在する該対立遺伝子（単数又は複数）が骨損傷の危険と関連するか否かを判定する工程をさらに含む方法、
（８）被験体の試料中に存在する該対立遺伝子（単数又は複数）と骨損傷の危険の既知の程度を有する被験体に存在するＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子の対立遺伝子とを比較する工程を含む、上記（７）記載の方法、並びに
（９）上記の方法に使用するキット、
に関する。以下に本発明の実施の態様について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の第１の側面では、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法が提供される。この方法はコラーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲにどの多型性の対立遺伝子が存在するかを決定する工程を含んでいる。
【００１３】
こうして、本発明によれば、個体の骨損傷の受け易さの特定及び治療法又は予防法の開発が可能となる。例えば、骨損傷の危険のある被験体がその生活スタイルを改善し、定期的運動及び健康的食事等の骨強化法を行うことにより、又は損傷の危険を減少させる医薬を服用することにより損傷を避けることができよう。典型的には、本発明の第一の側面の方法は、コラーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲの多型性を分析して骨損傷の受け易さを判定する工程を含む。この方法は、多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定するために、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の分析を含んでもよい。この方法は、一つ以上の特定の対立遺伝子が存在するか否かを決定する工程を含んでもよい。この方法は、被験体がコラーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲの対立遺伝子についてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを決定する工程をさらに含んでもよい。
【００１４】
ＭＴＨＦＲ遺伝子は、フロストら（前記）に記載されたヌクレオチド配列の位置６７７に遺伝性の多型性を含んでいる。さらに、ＭＴＨＦＲの配列及びＣ６７７Ｔ多型性の同定の仕方についての方法論がゴイェットら、Nature Genetics 7195-200 (1994)及びゴイェットら、Mammalian Genome 9 652-656 (1998) に記載されている。この多型性はヌクレオチド配列（本明細書中では「参照」配列と呼ぶ）のＴ残基がＣ残基に置換することから成り、これによりタンパク質配列のアラニンをバリンに変換する。この改変はＨｉｎｆ１制限酵素部位を創出する。そこで、この制限酵素がこの多型性をスクリーニングするのに用いることができる。この遺伝的多型性をＣ６７７Ｔと記載する。この番号は該ヌクレオチド配列に関する多型性の位置を指し、「Ｃ」は参照配列即ち野性型配列に存在するヌクレオチドであり、そして「Ｔ」は変異型配列のその位置に存在するヌクレオチド残基である。同様に、アミノ酸多型性はＡｌａ２２２Ｖａｌと記載される。本発明の目的では、特定のヌクレオチド配列又はタンパク質にどの対立遺伝子が存在するかの決定は、被験体の遺伝子型又は表現型のそれぞれを決定する工程と呼ばれうる。
【００１５】
コラーゲンＩα１（１７ｑ２２）は、イントロン１中でエキソン２の前の４３７ヌクレオチドの遺伝子にＧからＴへの多型性を有する。Ｇ−４３７／ｉｎ１Ｔと記載される多型性は、Ｓｐ１転写因子結合部位中にあり、後述のプライマー等の適切なミスマッチプライマーにより増幅すると、ＭｓｃＩ制限酵素消化により検出することができる。こうして、もしＴ対立遺伝子が存在すれば、ミスマッチが導入され、これがＭｓｃＩ制限部位を導入する。この対立遺伝子をＳ／ｓと記載する。ここで、ｓは多型性部位でのＴ対立遺伝子の存在を示す。本明細書中、この多型性を「ＳｐＩ多型性」と呼ぶ。
【００１６】
本発明は、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子（すなわち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有する被験体での骨折などの、骨折のし易さ即ち骨折の危険（相互に交換して用いうる用語である）とＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在との間には相関関係があるという驚くべき発見に基づく。コラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子に加えて、ＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子を有する被験体は、最も低い骨折の危険を付与するＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝子を有する被験体に比べて骨折について高い危険を示すこととなる。これらの結果は予想され得なかった。なぜなら、これまでの研究ではこれらの危険対立遺伝子が骨ミネラル密度とはほとんど無関係に骨折の危険を予想することを示していたからである。この事実は本明細書中で提示する結果により支持される。本明細書の結果は、骨損傷の危険が最も高いこれらの個体が低い骨ミネラル密度を有する被験体ではないことを示す。ＭＴＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子をスクリーニングすることにより、骨損傷の受け易さを、骨ミネラル密度の分析の必要なしに評価できる。
【００１７】
本発明の第一の側面の方法は、存在する対立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定する工程をさらに含むことが好ましい。これは、被験体に存在する対立遺伝子と骨損傷の危険に関連することが知られている対立遺伝子とを比較することにより実施することができる。例えば、可視化した詳細対立遺伝子及びそれと関連する相対的骨損傷危険を用いて、被験体の遺伝子型又は表現型が骨損傷危険の高低と関連するか否かを決定することができる。
【００１８】
本発明の方法は、イン・ビトロで実施できる。本方法は、被験体の身体から採取した組織試料又は体液試料について実施することが好ましい。こうして、本発明は、非侵襲的な診断方法であって、その結果骨損傷の受け易さの指標を提供するが、治療に関してすぐさま医学的決定がなされる診断には至らない方法に関する。
【００１９】
本発明は、骨損傷の危険を判定することが望まれるいかなる被験体についても実施できる。かかる被験体はほ乳類であることが好ましい。被験体はヒトであることが好ましく、女性であることが、最も好ましい。
【００２０】
骨損傷は、骨折、破壊又は破砕といった構造的損傷のいかなる形態であってもよい。またこれらの用語は、骨の生物学的分解又は劣化をも含む。通常、骨損傷という用語には、低骨ミネラル密度は含まれない。これは骨損傷の危険が骨ミネラル密度と無関係であるという発見と一致する。骨折は臨床的に最も重要な終点であると定義しうるので、本発明の第一の側面の方法は好ましくは骨折の危険を判定する方法に関する。通常このような骨損傷が骨粗鬆症の結果であるとはいえ、本発明の目的にとって、まず被験体が骨粗鬆症であると診断されているか否かは重要でない。
【００２１】
第一の側面の別の実施態様では、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩα１のＳｐ１多型性に対立遺伝子を有する被験体において、ＭＴＨＦＲ多型性の対立遺伝子の存在を決定する工程を含む方法が提供される。好ましい実施態様では、この方法はＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が被験体に存在するかを決定する工程を含んでいる。
【００２２】
本発明の第一の側面の好ましい特徴では、この方法は被験体の遺伝物質を分析して、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ多型性及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が存在しているかを決定する工程を含む。この被験体は、さらに、各対立遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性に分類される。この方法は存在する対立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定する追加の工程を含むことが好ましい。この工程では、コラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子を有する被験体では、ＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の増大と関連し、ＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の減少と関連する。Ｔ対立遺伝子についてホモ接合性であれば被験体の骨損傷の受け易さがさらに増大する一方、Ｃ対立遺伝子についてホモ接合性であれば受け易さはさらに減少するであろう。このように、Ｃ対立遺伝子についてのホモ接合性は骨損傷に対し予防性があると考えてよい。本発明の別の実施態様では、ＭＴＨＦＲのＣ６７７ＴのＣ対立遺伝子をスクリーニングすることにより骨損傷の受け易さを判定する方法が提供される。
【００２３】
第一の側面の別の好ましい特徴では、この方法は被験体のＭＴＨＦＲタンパク質を分析して、Ａｌａ２２２Ｖａｌ多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程を含むことができる。またこの方法は、存在する対立遺伝子が骨損傷危険の増大と関連するか否かを決定するための追加の工程をさらに含むことができる。この追加の工程では、位置２２２のバリン残基の存在が骨損傷危険の増大を示し、そしてこの位置のアラニン残基が骨損傷危険の減少又は正常を示す。
【００２４】
第一の側面の別の好ましい特徴では、骨損傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多型性及び／又はＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ多型性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含む方法が提供される。この方法で、コピー数の増大は骨損傷危険の増大と関連する。
【００２５】
また本発明は、骨折の危険を判定するのに有用なＭＴＨＦＲ遺伝子の他の多型性をスクリーニングする工程を含むことができる。
【００２６】
本発明は、当該技術分野で知られるいかなる適切な方法を用いて実施してもよい。まず、組織試料又は体液試料を被験体から採取することが好ましい。適切な試料の例としては、血液、口腔若しくは頬の細胞、毛根を含む頭髪試料が挙げられる。他の適切な試料も、当業者は承知しているであろう。次に、遺伝物質又はタンパク質を適切な方法を用いて試料から抽出する。遺伝物質はＤＮＡ又はＲＮＡであればよいが、ＤＮＡを用いることが好ましい。例えば、遺伝物質又はタンパク質をサムブルックら（Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbou Laboratory Press) に記載された技術を用いて抽出するとよい。次に、抽出したＤＮＡ又はタンパク質を用いて、例えばサザンブロット分析後制限酵素消化する方法、ＰＣＲ増幅後制限酵素消化し、必要であればゲル電気泳動により消化生成物を分離する方法、任意の適切な方法により関連する遺伝子断片の配列決定をする方法、パターンの違いが一つ以上の特定の対立遺伝子の存在を示すような、例えばＰＡＡ又はアガロースゲル上でヘテロ二本鎖パターンを可視化する方法、分離の程度が一つ以上の多型性制限部位の存在又は非存在に左右される、変性勾配ゲルを用いたＤＮＡ断片の分離法、パターンが一つ以上の多型性制限部位の存在又は非存在に左右されるＳＳＣＰ分析を用いる分離法、ハイブリダイゼーションパターンが対立遺伝子の種々の組み合わせに特異的となる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用する方法、既知突然変異を検出するためのＯＬＡ、タックマン（Taqman) 又はドットブロットといった方法、目的対立遺伝子に対する蛍光標識プローブを用いたＤＮＡ部位の可視化法、及びＲＦＬＰ分析といった適切な技術により、被験体の遺伝子型又は表現型を決定することができる。
【００２７】
タンパク質を分析する場合は、このタンパク質の異なる多型性型の間を識別できる抗体の使用、免疫アッセイ、移動度変位分析、又はタンパク質サイズの差を検出できる他の技術、及びタンパク質活性の変化を検出するアッセイといった方法が適切であろう。
【００２８】
本発明を実施するに際し、特定の制限酵素を使用することが望ましい場合は、当業者は同様の特異性を有する酵素的又は化学的操作を用いうることを理解しているであろう。例えば、本明細書中に記載する酵素と類似の特異性を有する制限酵素（アイソシゾマー）を用いてもよく、またＤＮＡ又はＲＮＡ切断特異性を持つ化学的分解法を用いてもよい。
【００２９】
被験体の遺伝子型又は表現型を決定するのに適する他の任意の技術も本発明に用いることができる。
【００３０】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により実施し、該断片がＭＴＨＦＲのものである場合は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、７０、１００、１５０又は２００塩基長となるコピーを生産することが好ましい。増幅する断片がコラーゲンＩα１遺伝子のものである場合は、少なくとも５０塩基対長、好ましくは２００塩基対長の断片を増幅するようにＰＣＲプライマーを選択するとよい。ＰＣＲ技術は当該技術分野ではよく知られ、前記遺伝子の適切な領域、すなわちＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１７０から１１００までの領域及びコラーゲンＩα１遺伝子の第１イントロンを増幅するためのプライマーを特定することは通常の知識を有する者の範囲内である。好ましい技術は一塩基伸長であり、本方法にとって多型性部位を含む断片を増幅することが唯一必要である。このように、６７７多型性部位の直ぐ周囲の領域を増幅することが要求される。ＰＣＲ技術はＥＰ−Ａ−０２００３６２及びＥＰ−Ａ−０２０１１８４に記載されている。
【００３１】
第一の側面の好ましい特徴では、被験体の骨損傷の受け易さを判定する方法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１７０から１１００までの領域の一部分を含む断片を増幅する工程、及びＭＴＨＦＲにどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工程を含む方法が提供される。当該技術分野の熟練者は、ＭＴＨＦＲ遺伝子の該部分を増幅するのに適切なプライマーを容易に入手できるであろう。このようなプライマーの例として、
１． ５'-ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＧＡ-３'及び／又は
２． ５'-ＡＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧ-３'
が挙げられる。
【００３２】
コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定するには、コラーゲンＩα１遺伝子の第１イントロンの少なくとも一部分を増幅し、その後ＭｓｃＩ制限部位の存在を決定するとよい。適切なプライマーとしては、
１． ５'-ＴＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＡＣＴＴＴＴＴＧＧ-３'及び／又は
２． ５'-ＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣ-３'
が挙げられる。
【００３３】
さらなるプライマー配列は、グラントら（Nature 14 203-205 (1996)) に記載されている。
【００３４】
遺伝子の増幅された部分が関連対立遺伝子を含む遺伝子の前記規定部分より大きい場合は、ＭＴＨＦＲ遺伝子のｈｉｎｆＩ制限部位又はコラーゲンＩα１遺伝子のＳｐＩ部位を含むＭＴＨＦＲ又はコラーゲンＩα１遺伝子配列が含まれないようにすることが好ましい。
【００３５】
本発明の第二の側面では、被験体の骨損傷を予防する方法が提供される。この被験体は好ましくは本発明の第一の側面の方法を用いて、骨損傷危険があると診断されていることが好ましい。この側面において、予防には、被験体の骨損傷危険を減少するためのいかなる手段も含まれる。
【００３６】
治療は予防的又は緩和的処置の形態であればよい。好ましい治療方法は、血漿中のホモシステインのレベルを減少させ、そしてＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子の効果を効果的に逆転させるために、葉酸又は葉酸塩を投与する方法である。葉酸と並行して、又はそれに替わるものとして投与される他の適切な治療法には、生活スタイル、定期的運動及び骨を強くするための食事の変更及びホルモン治療が挙げられる。骨の損失を減少させるための医薬製剤などの他の適切な治療も、医師及び当業者に知られている。例として、タンパク同化ステロイド、ビスホスホネート、ビタミンＤ製剤、カルシウム補強剤及びホルモン補充療法が挙げられる。
【００３７】
第二の側面の好ましい実施態様では、骨損傷の予防に使用するための医薬品製造における葉酸の使用が提供される。
【００３８】
医薬品の投与は、任意の有効な経路、例えば経口又は非経口経路により行われる。非経口送達方法には、局所、動脈内、皮下、骨髄内、静脈内又は鼻腔内投与が挙げられる。経口投与後の皮下注射が摂取経路として好ましく、また持続的に作用する固定化法も用いうる。活性成分に加えて、これらの医薬品には、賦形剤及び薬学的に使用できる製剤への活性化合物の処理を促進させる他の化合物等の適切な薬学的に許容しうる担体を含めてもよい。製剤化及び投与の技術についてのさらなる詳細は、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 」（Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版に記載されている。
【００３９】
経口投与のための医薬品は、経口投与に適した投与量で、当該技術分野でよく知られた薬学的に許容しうる担体を用いて製剤化できる。このような担体により、患者の摂取に適した錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として医薬組成物を製剤化できる。
【００４０】
経口使用のための医薬品は、活性成分と固体賦形剤とを混合することにより、必要であれば、所望に応じ適切な添加化合物を加えた後、得られた混合物を摩砕しそして顆粒の混合物を処理することにより錠剤又は糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質の増量剤である。これらには、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質に加えて、乳糖、蔗糖、マンニトール又はソルビトール、トウモロコシ、ムギ、コメ、イモ又は他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、及びアラビア及びトラガカント等のガムが含まれるが、これらに限定されない。必要な場合は、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム等のその塩といった、崩壊剤又は溶解剤を加えてもよい。
【００４１】
糖衣錠コアには、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒若しくは溶媒混合物などをも含む濃縮糖溶液などの適切な被覆剤で被覆する。着色料又は色素を錠剤又は糖衣錠被覆剤に加えて、生産物の特定又は活性化合物の量（すなわち、投与量）を特定してもよい。
【００４２】
経口に用いうる医薬品には、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等の被覆剤でできた軟性、密封カプセル剤及びゼラチンからできた押し嵌め式カプセル剤が挙げられる。押し嵌め式カプセル剤には、活性成分をラクトース又はデンプン等の充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び任意選択的に安定剤と混合して含めることができる。軟カプセル剤には、活性化合物を脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体に、安定剤と共に又は安定剤を用いずに、溶解又は懸濁するとよい。
【００４３】
非経口投与のための医薬品としては、活性化合物の水溶液が挙げられる。注射用には、本発明の医薬を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液又は生理的緩衝食塩水等の生理的適合緩衝液中で製剤化する。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増大させる物質を含めてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液を適切な油性注射懸濁剤として調製してもよい。適切な親油性溶媒又はビークルとしては、ゴマ油等の脂肪油又はオレイン酸エチル又はトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。さらに、懸濁剤には、高濃度溶液の調製を可能とするために、化合物の溶解性を増大する適切な安定剤又は薬剤を含めてもよい。
【００４４】
局所又は経鼻投与には、浸透させるべき特別な障壁に対し適切な浸透剤を製剤化に用いる。このような浸透剤は、当該技術分野で一般に知られている。
【００４５】
本発明の医薬品は、当該技術分野で知られる方法（例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠調製、すりつぶし、乳化、カプセル化、封入化又は凍結乾燥処理などの手段により）と同様の方法で製造することができる。またこの医薬品は、例えば持続的放出又は標的化放出などの適切な放出特性を与えるために、慣用手段例えば被覆により改良してもよい。
【００４６】
この医薬品は塩として提供してもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸を用いて形成できるが、これらに限定されない。塩は、対応する遊離塩基の形態である水性又は他のプロトン溶媒ではより溶解し易い傾向がある。他の場合では、好ましい調製物は、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトールに、ｐＨ４．５〜５．５の範囲で調製された凍結乾燥粉末である。これは使用の前に緩衝液と混合して用いられる。
【００４７】
許容しうる担体中に製剤化されたこのような医薬品を調製した後、それを適切な容器に入れ、示した状態の治療のためのラベルを貼る。
【００４８】
骨損傷の予防のために適切な医薬品としては、意図された目的を達成するのに有効な量の活性成分を含む組成物が挙げられる。実際に投与される量は、治療される個体に依存し、望みの効果が重大な副作用なしに達成されるような最適な量であることが好ましい。治療的に有効な投与量の決定は、充分に当該技術分野の熟練者の能力内にある。もちろん、熟練者は分割投与や部分投与も本発明の範囲内であると理解するであろう。
【００４９】
いかなる化合物でも、治療上有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイ又は適切な動物モデル（例えば高血圧には、霊長類、ラット及びモルモット並びに他の実験室小動物）のどちらかで見積もることができる。これらのアッセイでは、下流の処理活性だけでなく、受容体活性も考慮すべきである。また望ましい濃度範囲及び投与経路を決めるために、動物モデルも用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な投与量及び投与経路を決定することができる。
【００５０】
治療上有効な量とは、症状又は状態を改善する薬剤の量を指す。このような化合物の治療上の有効性及び毒性は、標準的薬学操作により細胞培養又は実験動物において決定できる（例えば、ＥＤ50、集団の５０％が治療上有効な投与量、及びＬＤ50、集団の５０％が死に至る投与量）。治療効果と毒性効果の間の投与量の比が治療指数であり、定量ＥＤ50／ＬＤ50として表せる。大きい治療指数を示す医薬品が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに使用するための投与量範囲を決定する際に有用である。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか全くないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。この投与量は、採用される投与形態、患者の感受性及び投与経路により、この範囲内で変動する。
【００５１】
正確な用量は、治療する患者の観点で各医師により選択される。活性部分の充分なレベルを提供するよう、又は所望の効果を維持するように、用量及び投与を調整する。長時間作用する医薬品を、具体的製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、１週間毎又は２週間に１回投与してもよい。具体的用量及び送達方法についてのガイダンスは、文献に記載されている（参照により本明細書にインコーポレートされる米国特許第４，６５７，７６０号、第５、２０６，３４４号、第５，２２５，２１２号を参照）。
【００５２】
本発明の第三の側面では、治療に対する被験体の応答を予測する方法であって、ＭＴＨＦＲ及び／又はコラーゲンＩα１の多型性のどの対立遺伝子（単数又は複数）が被験体に存在するかを決定する工程を含む方法が提供される。これは、第一の側面に従ってなされうる。この方法は被験体が骨損傷を受け易いか否かを判定する工程を含むことが好ましい。治療剤又は予防剤の効果は根底にある骨損傷の原因に依存し、場合によっては、特定の治療の採用を避けることが好ましいであろう。例えば、ある遺伝子の特定の対立遺伝子が存在するか否かが、どれが最適な予防法であるかに関して有用な指示を与えることになる。例えば、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子を有するが、ＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子を有しない被験体は、葉酸投与から利益を得ることはなさそうである。また本発明のこの側面は、骨損傷の治療に使用しうる薬剤を特定するのにも有用であろう。
【００５３】
本発明の第四の側面では、ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子の多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定するのに有用なキットであって、（ｉ）ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一部を増幅するための一つ以上の核酸プライマー分子、及び（ii）該遺伝子中にどの対立遺伝子が存在するかを決定する手段を含むキットを提供する。ＭＴＨＦＲ及びコラーゲンＩα１の多型性はそれぞれＣ６７７Ｔ多型性及びＳｐＩ多型性であることが好ましい。タンパク質分析のためのキットは、タンパク質の異なる多型性間を識別できる抗体、及び移動度変位分析又は免疫アッセイを実施するために必要な薬剤を含んでいるとよい。またこのキットは対立遺伝子（単数又は複数）と骨損傷危険の間の相関関係を示す手段を含むことが好ましい。
【００５４】
プライマー分子はＭＴＨＦＲ遺伝子の少なくとも一部及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の第１イントロンの一部の増幅に適することが好ましい。適切なプライマーの例は上に記述している。
【００５５】
ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子にどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する手段は、前記の方法のいずれかで使用するために必要な任意の薬剤又は分子を含んでもよい。例えば、ＰＣＲ後のＤＮＡ消化を用いる場合は、この手段はＰＣＲ薬剤及び一つ以上のｈｉｎｆＩ及び／又はＭｓｃＩ制限酵素を含むことが好ましい。この方法がサザンブロット、ヘテロ二本鎖可視化又は蛍光標識技術を採用する場合は、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の適切な領域に結合するプローブを含むとよい。必要であれば、このようなプローブは、例えばニック翻訳、放射標識若しくは蛍光標識又はランダムプライマー伸長により検出されるように標識し、それにより標識していないヌクレオチドは標識分子合成のための鋳型として働く。プローブを標識する他の方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００５６】
存在する対立遺伝子と骨損傷危険とを相関させる手段は、ＭＴＨＦＲ多型性のＴ対立遺伝子及びコラーゲンＩα１遺伝子のＳ対立遺伝子の存在が骨折危険増大と関連することを示すようなチャート又は視覚化手段の形態であってもよい。
【００５７】
第五の側面の好ましい特徴では、キットは被験体のＤＮＡ配列との比較のために対照のＤＮＡ又はタンパク質試料を含んでいてもよい。対照試料は、ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一つ以上の対立遺伝子の配列を含む。
【００５８】
さらなる側面では、第一の側面の方法における第四の側面のキットの使用が提供される。
【００５９】
本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の各側面にも当てはまる。
【００６０】
ここに本発明を以下の実施例及び図を参照して詳細に記載する。
【００６１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００６２】
本研究の目的は、ＢＭＤ及び骨折の危険を判定するに際し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺伝子の二つの機能的多型性間の相互作用を調べることであった。さらに、ホモシステイン血清レベルとＢＭＤ及び骨折危険との関連を研究した。
【００６３】
研究被験体
「ロッテルダム研究」は、オランダ王国、ロッテルダム市のオムールド地区に居住する５５歳以上の７９８３人の被験体についての集団に基づくコホート研究である。この研究は、いくつかの潜在的決定因子に関して高齢者の疾患発病を記録するように計画した（ホフマンら、Eur J Epidemiol 1991 7: 403-422)。全体で１０，２７５人であり、そのうち９１６１人（８９％）は独立して生活しており、１９９１年に研究に参加するよう招かれた。独立して生活しているこれらの被験体の全体的な回答率は、自宅面接については７７％、及び身体特徴の測定、ＢＭＤ及び血液採取といった研究センター内での検査については７１％であった。ロッテルダム研究は、Medical Ethics Committee of the Erasmus University Medical School により承認され、書面によるインフォームド・コンセントを各被験体から得た。ホモシステイン、ＭＴＨＦＲ遺伝子型、ＣＯＬＩＡ１遺伝子型並びにＢＭＤ及び骨折の間の関係の分析は、研究に参加した女性のサンプルで実施した。
【００６４】
ＭＴＨＦＲ遺伝子、ＣＯＬＩＡ１遺伝子と、骨折の危険及びＢＭＤとの間の関連の分析のため、女性下部集団を研究した。ＢＭＤのベースライン測定はこの研究から独立して生活している５９３１人について得たが、これらのうち１４５３人は歩行補助器の使用のため、真性糖尿病のため、利尿薬、エストロゲン、甲状腺ホルモン又は細胞成長抑制薬治療の使用のため排除した。残りの被験体から、年齢５５〜８０才の女性１５３３人の無作為サンプルを研究した。
【００６５】
ホモシステインレベル、骨折危険及びＢＭＤ間の関連の分析は、異なるグループの女性について行った。女性４５９人のサンプルを無作為に総集団から選んだ。４４人の女性については、身体測定データ及び骨折についての追跡データが得られず、最終的に研究グループは女性４１５人となった。
【００６６】
測定
実験の始めに、靴及び室内着を着用せずに起立姿勢で身長及び体重を測定した。身長（メートル）の二乗で割ったキログラム体重（ｋｇ／ｍ2 ）をボディーマス指数（ＢＭＩ）としてコンピュータ処理した。以前に記載された（バーガーら、Bone Miner 1994 25: 1-13）ように、大腿部付け根及び腰椎（椎骨）で、二重エネルギーＸ線吸光光度計（ＤＥＸＡ）（ルマール DPX-L濃度計、ルワール社、マジソン、WI、USA ）により骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した。前年度の食事からのカルシウム摂取（ｍｇ／日）を、食事頻度の質問により評価し、エネルギー摂取により調整した。現在の喫煙状況を質問し評価した。
【００６７】
９５６人の女性（６２％）について、第四胸椎から第五腰椎までの椎骨の側面Ｘ線写真を、ベースライン調査（１９９０年から１９９３年）及び追跡検診（１９９７年から１９９９年）の両方について得た。追跡Ｘ線写真を、マックロスキー／カニス法（McCloskey ら、Osteoporosis Int 1993 3: 138-147) により椎骨骨折の存在を数えた。椎骨骨折が存在する場合は、ベースラインＸ線写真をよく調べ、骨折が付随的(incident)であるか主体的(prevalent) なものであるかを確かめた。
【００６８】
股関節部、手首及び他の骨折を含む付随的非椎骨骨折を記録し、確認し、そして平均７年間の追跡期間にわたって医師が分類した。追跡は、１９９１年１月１日、又はその後の研究に含まれた時点に開始した。本研究についての追跡は１９９９年１２月３１日か、参加者が死亡した場合はそれより早い時点で終了した。
【００６９】
ホモシステイン測定
ベースライン調査から絶食でない血清試料を得た。試料を直ぐに氷の上におき、エクス・ビボ形成による総ホモシステイン濃度の増大を妨ぐのに充分であることが分かっている（ウビンクら、Clin Chim Acta 1992 207: 119-128）６０分以内に処理した。総ホモシステインの測定まで、血清を−２０℃で凍結して保存した。アラキ及びサコ（J Chromatogr 1987 422: 43-52）に従って、かつウビンクら（J Chromatogr 1991 565: 441-446）により改良された高圧液体クロマトグラフィーを用いて、総ホモシステインを蛍光誘導体として測定した。
【００７０】
ＣＯＬＩＡ１及びＭＴＨＦＲ遺伝子型の決定
標準的操作に従って末梢静脈血試料からゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の多型性を、以前に記載されている二対立遺伝子制限部位を導入するミスマッチプライマー（グラントら、前記）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により検出した。この試験は、二つの対立遺伝子Ｇ及びＴを、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の第１イントロンのＳｐ１結合部位の第１塩基における、それぞれグアニン及びチミジンの存在により識別する。ＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多型性は、多型性を含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅により検出し、その後この断片を、以前に記載されたように（フロスら、前記）ＨｉｎｆＩで消化した。この試験では、二つの対立遺伝子Ｃ及びＴを、タンパク質のコドン２２２における、それぞれアラニン又はバリンにより識別する。
【００７１】
統計分析
研究グループ間のベースラインでの年齢の差を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）の平均により評価した。ベースラインの特徴での他の全ての差を共変量として、年齢又は年齢及びＢＭＩと共に試験する共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）により比較し、ありうる攪乱効果を調整した。被験体を、そのホモシステインレベルに従った遺伝子型又は１／３ずつにグループ分けした。カイ二乗分析を用いて、ハーディ−ヴァインベルグ平衡からの逸脱を試験した。ＢＭＤと異なる遺伝子型若しくはホモシステインレベル間の関連を調べるために、多変量線形回帰モデルを用いた。椎骨骨折の危険を見積もるために、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のオッズ比を、ロジスティック回帰モデルを用いて計算した。非椎骨骨折危険を見積もるためＣｏｘ比例危険モデルを用い、それにより追跡期間における潜在的差を考慮に入れた。
【００７２】
結果
Ａ．ＭＴＨＦＲ遺伝子、ＣＯＬＩＡ１遺伝子及び骨粗鬆症終点
研究被験体の特徴
「ロッテルダム研究」の女性のベースラインの特徴及び本研究の集団の特徴を表１に示す。本研究のグループは、ロッテルダム研究に比べて平均５．６歳若いが、８０才以上の女性を排除しているためである。この研究被験体は、平均して１．９％低く調整されたボディーマス指数（ＢＭＩ）及び１．３％低く調整された腰椎ＢＭＤを有していた。ベースラインのカルシウム摂取、被験体の喫煙率又は大腿部付け根ＢＭＤに関しては、有意差はなかった。
【００７３】
ＭＴＨＦＲ、ＣＯＬＩＡ１及びＢＭＤの間の関連
表２は、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ変異型及びＣＯＬＩＡ１のＳｐ１多型性の両者の遺伝子型頻度を示す。ＣＯＬＩＡ１多型性の対立遺伝子頻度（Ｇ対立遺伝子が８２％、そしてＴ対立遺伝子が１８％）及び遺伝子型分布は、以前の研究の白色人種について報告されたものと同様であり（ウィターリンデンら、前記、ビーバンら、N Engl J Med 1998 339: 351-352、及びラングダールら、J Bone MinerRes 1998 13: 1384-1389 、及びキーンら、Arthritis Rheus 1999 42m 285-290）、それらはハーディ−ヴァインベルグの平衡（ＨＷＥ）から逸脱しなかった。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、身長、喫煙習慣又は食事からのカルシウム摂取において有意差がなかった（データは示さず）。ＧＧ遺伝子型の平均体重は、ＧＴ及びＴＴ遺伝子型グループに比べて有意に高かった（ｐ＝０．０５）。先に報告されたように、大腿骨付け根及び腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意の遺伝子−用量効果が見い出された。年齢及びＢＭＩについて調整後、ＧＧグループに比べてＴＴ遺伝子型を有する個体では大腿骨付け根ＢＭＤは０．２ＳＤ低く、腰椎ＢＭＤは０．４ＳＤ低かった。
【００７４】
ＭＴＨＦＲ多型性の対立遺伝子頻度は、Ｃ対立遺伝子が７７％、Ｔ対立遺伝子が３３％であり、そして遺伝子型分布は、以前の研究の白色人種について報告されたものと同様であり（ボットーら、Am J Epidemiol 200 151: 862-877)、それらはＨＷＥから逸脱しなかった。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、ＢＭＩ、食事からのカルシウム摂取及び喫煙習慣において有意差がなかった（データは示さず）。大腿骨付け根及び腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意な遺伝子−用量効果を見い出した。年齢及びＢＭＩについて調整後、ＣＣグループに比べてＴＴ遺伝子型を有するグループにおける両部位の骨ミネラル密度は０．２ＳＤ低かった。
【００７５】
ＭＴＨＦＲ変異型及びＣＯＬＩＡ１変異型の間の相互作用
ＢＭＤ及び／又は骨折危険を判定するに際し両遺伝的変異型の相互作用を研究するために、被験体を４グループ、すなわちＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１についての危険対立遺伝子を持たない参照グループ、ＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＣＯＬＩＡ１危険対立遺伝子は存在しないグループ、ＣＯＬＩＡ１危険対立遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＭＴＨＦＲは存在しないグループ、及びＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１の両方の危険対立遺伝子（単数又は複数）が存在するグループに区分した。四つの遺伝子型グループについてのベースライン身体測定及び食事に関する測定に有意な差は見られなかった（データは示さず）。大腿骨付け根及び腰椎の両者での骨ミネラル密度は、四つの遺伝子グループ間で有意に異なった（表３）。両部位について、ＭＴＨＦＲか又はＣＯＬＩＡ１のいずれかに危険対立遺伝子が存在する場合と比べて、両遺伝子座に危険対立遺伝子が存在する場合はＢＭＤの減少が見られた。
【００７６】
遺伝子型とＢＭＤ間の関連における年齢関連の変化
骨ミネラル密度に及ぼす遺伝的効果を、損失速度の差によるだけでなく、最大骨量の差として観察できた。従って、本発明者らは被験体を８．３年カテゴリーに分割して、ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１相互作用とＢＭＤとの関連に及ぼす年齢効果を調べた。図１及び図２は、組み合わせた対立遺伝子のグループと参照グループの間の差が、最高齢女性グループ（年齢７１．６才から８０才）の大腿骨付け根及び腰椎の両者では、両端の遺伝子型グループの間で０．５ＳＤまで年齢と共に増大することを示す。
【００７７】
遺伝子型と骨折危険の間の関連
表４は、そのＭＴＨＦＲ／ＣＯＬＩＡ１遺伝子型に従ってグループ分けした女性の付随的非椎骨骨折及び椎骨骨折の分布を示す。ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１の両者について少なくとも一つの危険対立遺伝子を保持する女性では、非椎骨骨折の過剰発現が観察された。椎骨骨折の存在に関しては、４遺伝子グループ間に有意差はなかった。ロジスティック回帰分析では、危険対立遺伝子の組み合わせを担持する女性は非椎骨骨折について１．９倍危険が増大することを示した。年齢及びＢＭＩ又は大腿骨付け根のＢＭＤについて調整すると、危険の評価は本質的に変わらなかった。
【００７８】
ＭＴＨＦＲ／ＣＯＬＩＡ１遺伝子型とＢＭＤとの関連は年齢に依存するので、非椎骨骨折の危険に及ぼす年齢効果も評価した。労力の理由で、女性を中央値６５．７５に従って２つの年齢グループに分割した。表５は、両危険対立遺伝子を担持する高齢女性が、とりわけより多くの非椎骨折を有することを示す。ロジスティック回帰分析では、２．５倍高い危険を示した。この危険計算を大腿骨付け根でＢＭＤについて調整すると、骨折危険は参照グループに比べて２．１倍の高さを維持した。
【００７９】
Ｂ ホモシステインレベルと骨折の危険
血清中のホモシステインレベルのベースラインの三分画に従って４１５人の女性を三つのカテゴリーに区分した。ベースラインの特徴の比較（表６）では、最も高い１／３の女性では、最も低い１／３に比べて平均５才高く（ｐ＜０．００１）、喫煙者は多く、そしてその平均の食事からのカルシウム摂取は１４％低いことを示した。三つの三分画は、大腿骨付け根及び腰椎でのＢＭＩ及びＢＭＤに関して有意な差はなかった。
【００８０】
表７は、ホモシステインタータイルに従った骨折分布を示す。最も高い１／３の女性は、最も低い１／３の女性に比べて有意に多くの非椎骨骨折及び椎骨骨折を経験していた。中間の１／３でも、最も低い１／３に比べてより多くの椎骨骨折を経験していた。ロジスティック回帰分析では、最も高い１／３の女性には非椎骨骨折では２．１倍高い骨折の危険が、そして椎骨骨折では３．６倍高い骨折の危険があった。これらの危険の見積は、年齢及びＢＭＩについて調整した後も本質的に変化しなかった。ＢＭＤ、食事からのカルシウム摂取又は喫煙のような他の可能な攪乱因子について調整した場合も、危険の見積は変化しなかった（データは示さず）。
【００８１】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【発明の効果】
本発明により、骨粗鬆症による骨折の危険を持つか否かを被験体の遺伝子を検査することにより、非侵襲的に診断することが可能となり、これによって、骨粗鬆症による骨折の危険を有する被験体の予防措置を講ずることも可能となった。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、大腿部付け根の骨密度における年齢に関する差を示す。
【図２】図２は、腰椎の骨密度における年齢に関する差を示す。
Claims (10)
- ヒト被験体の非椎骨骨折の生じ易さをイン・ビトロで分析する方法であって、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）多型性及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多型性について、どの対立遺伝子が存在するかを決定する工程を含み、ヒト被験体から採取された試料について実施される方法。
- コラーゲンＩα１のＳｐ１多型性のｓ対立遺伝子を持つことが特定されたヒト被験体の非椎骨骨折の生じ易さをイン・ビトロで分析する方法であって、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ多型性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程を含み、ヒト被験体から採取された試料について実施される方法。
- 請求項１〜請求項２のいずれか１項に記載の方法であって、該対立遺伝子がＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の関連部分の増幅により決定されるものである方法。
- 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法であって、コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多型性の対立遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多型性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含む方法。
- ヒト被験体の血液又は組織試料について実施される、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
- 被験体が女性である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法における使用のためのキットであって、（ｉ）ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一部を増幅するための一つ以上の核酸プライマー分子、及び（ii）該遺伝子にどの対立遺伝子が存在するかを決定するための手段を含むキット。
- 請求項７記載のキットであって、該対立遺伝子と非椎骨骨折の危険の間の相関関係を示す手段をさらに含むキット。
- 請求項７記載のキットであって、ヒト被験体のＤＮＡ配列との比較のためにＤＮＡ又はタンパク質の対照試料を含むキット。
- 請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法における請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載のキットの使用。
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