JP2003116547A - 骨損傷の受け易さを判定する方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】骨損傷の受け易さを遺伝的に解明し、主体の骨
損傷の受け易さを判定する方法を提供する。 【解決手段】ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺
伝子の多形性をスクリーニングする工程を含む、主体の
骨損傷の受け易さを判定する方法及び手段を提供する。
特に、この方法は、主体の骨損傷の危険を判定するた
め、ＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多形性にどの対立遺
伝子が存在するかを決定する工程を含むことが好まし
い。この方法は、コラーゲンＩα１遺伝子の多形性部位
にどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程と組み合
わせて行うことが好ましい。この方法は、治療に対する
患者の応答を予測することに用いることもできる。ま
た、主体の骨損傷を予防するための医薬も提供する。
損傷の受け易さを判定する方法を提供する。 【解決手段】ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１遺
伝子の多形性をスクリーニングする工程を含む、主体の
骨損傷の受け易さを判定する方法及び手段を提供する。
特に、この方法は、主体の骨損傷の危険を判定するた
め、ＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多形性にどの対立遺
伝子が存在するかを決定する工程を含むことが好まし
い。この方法は、コラーゲンＩα１遺伝子の多形性部位
にどの対立遺伝子が存在するかを決定する工程と組み合
わせて行うことが好ましい。この方法は、治療に対する
患者の応答を予測することに用いることもできる。ま
た、主体の骨損傷を予防するための医薬も提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コラーゲンＩα１
の多形性及びメチルテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨ
ＦＲ）遺伝子における多形性のスクリーニングに基づ
き、骨損傷に対する危険性を判定する方法に関する。ま
た本発明は、好ましくは、危険があると特定されたそれ
らの対象における骨損傷を予防する方法及び患者の治療
に対する応答を判定する方法をも提供する。また、キッ
ト及び医薬といった本発明の方法を実施するための手段
をも提供する。
の多形性及びメチルテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨ
ＦＲ）遺伝子における多形性のスクリーニングに基づ
き、骨損傷に対する危険性を判定する方法に関する。ま
た本発明は、好ましくは、危険があると特定されたそれ
らの対象における骨損傷を予防する方法及び患者の治療
に対する応答を判定する方法をも提供する。また、キッ
ト及び医薬といった本発明の方法を実施するための手段
をも提供する。
【０００２】
【従来の技術】骨粗鬆症は、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）
の減少、骨微細構造の劣化及び骨折等の骨損傷の危険の
増大により特徴付けられる一般的な疾患である。骨粗鬆
症は生活の質に影響する主要な公共的な健康問題であ
り、健康維持に関する費用を増大させる。ヨーロッパ人
口のうち、５０才より上では３人に１人の女性、そして
１２人に１人の男性が危険な状態にある。米国では英国
の疾患発生率より２５％高い２５００万人が、日本及び
ヨーロッパを合わせるとさらに５０００万人がこの疾患
にかかっている。次世紀中頃までには、骨粗鬆症を患う
ヒトの数は西側では２倍になると予想されるが、アジア
及び南アメリカでは６倍に増大するであろう。骨折は骨
粗鬆症の最も深刻な結末であり、とりわけ股関節部の骨
折は世界中で年間１７０万人が罹患する。生活レベルの
向上と老齢人工の増大につれ、２０５０年までに股関節
部骨折の数は世界で６００万を越えるであろうと予想さ
れる。
の減少、骨微細構造の劣化及び骨折等の骨損傷の危険の
増大により特徴付けられる一般的な疾患である。骨粗鬆
症は生活の質に影響する主要な公共的な健康問題であ
り、健康維持に関する費用を増大させる。ヨーロッパ人
口のうち、５０才より上では３人に１人の女性、そして
１２人に１人の男性が危険な状態にある。米国では英国
の疾患発生率より２５％高い２５００万人が、日本及び
ヨーロッパを合わせるとさらに５０００万人がこの疾患
にかかっている。次世紀中頃までには、骨粗鬆症を患う
ヒトの数は西側では２倍になると予想されるが、アジア
及び南アメリカでは６倍に増大するであろう。骨折は骨
粗鬆症の最も深刻な結末であり、とりわけ股関節部の骨
折は世界中で年間１７０万人が罹患する。生活レベルの
向上と老齢人工の増大につれ、２０５０年までに股関節
部骨折の数は世界で６００万を越えるであろうと予想さ
れる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】骨粗鬆症の治療は、満
足すべきものではない。特に骨粗鬆症の結果としての骨
損傷が一旦起これば、骨を治癒させることの他に医師が
できることはほとんどない。高齢では、これは時間のか
かる、また痛みを伴う過程となるであろう。骨粗鬆症進
行の危険を有する人々を診断すると、より有効な予防手
段が可能となる。これらの疾患予防の戦略としては、成
人初期の骨密度を発達させること、そして後の生活にお
ける骨損失を可能な限り少なくすることが挙げられる。
骨損失には、生活スタイル、栄養及びホルモン因子の変
化が影響することが示されている。
足すべきものではない。特に骨粗鬆症の結果としての骨
損傷が一旦起これば、骨を治癒させることの他に医師が
できることはほとんどない。高齢では、これは時間のか
かる、また痛みを伴う過程となるであろう。骨粗鬆症進
行の危険を有する人々を診断すると、より有効な予防手
段が可能となる。これらの疾患予防の戦略としては、成
人初期の骨密度を発達させること、そして後の生活にお
ける骨損失を可能な限り少なくすることが挙げられる。
骨損失には、生活スタイル、栄養及びホルモン因子の変
化が影響することが示されている。
【０００４】骨粗鬆症は、種々の表現型を遺伝的に決定
するいくつかの遺伝子が変異した複合的遺伝特性である
と考えることができる。低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）
は、骨粗鬆症の臨床的に最も重要な特徴である骨折につ
いての重要な危険因子である。ファミリーの隔離分析で
は、ＢＭＤが多遺伝子制御の下にある一方、さらに骨代
謝回転の生物化学的マーカーが強い遺伝的成分を有する
ことも示された。ＢＭＤとの関連で幾つかの候補遺伝子
が分析された。最も遺伝的な分析では、骨折の危険の決
定因子としてのＢＭＤに焦点をあて、分析の終点として
骨折自体にはそれほど焦点を当てていない。最近、最も
豊富な骨基質タンパク質をコードするＣＯＬＩＡ１遺伝
子のＳｐＩ多形性、及びビタミンＤ受容体遺伝子のハプ
ロタイプがＢＭＤとは無関係な骨粗鬆症骨折の危険の増
大に関連することが見いだされた（ＷＯ００／１５８３
９）。
するいくつかの遺伝子が変異した複合的遺伝特性である
と考えることができる。低骨ミネラル密度（ＢＭＤ）
は、骨粗鬆症の臨床的に最も重要な特徴である骨折につ
いての重要な危険因子である。ファミリーの隔離分析で
は、ＢＭＤが多遺伝子制御の下にある一方、さらに骨代
謝回転の生物化学的マーカーが強い遺伝的成分を有する
ことも示された。ＢＭＤとの関連で幾つかの候補遺伝子
が分析された。最も遺伝的な分析では、骨折の危険の決
定因子としてのＢＭＤに焦点をあて、分析の終点として
骨折自体にはそれほど焦点を当てていない。最近、最も
豊富な骨基質タンパク質をコードするＣＯＬＩＡ１遺伝
子のＳｐＩ多形性、及びビタミンＤ受容体遺伝子のハプ
ロタイプがＢＭＤとは無関係な骨粗鬆症骨折の危険の増
大に関連することが見いだされた（ＷＯ００／１５８３
９）。
【０００５】ホモシステインは、短命の高反応性アミノ
酸であり、メチオニンの代謝の中間体として形成され
る。この代謝の鍵酵素のいずれかの深刻な欠乏が、血漿
ホモシステインのレベルが高く上昇することにより特徴
付けられるホモシスチン尿症という珍しい常染色体劣性
疾患を引き起こし、これは主として眼、並びに三器官
系、すなわち血管系、骨系及び中枢神経系に影響する一
連の臨床的発現を伴う。ホモシスチン尿症患者の初期骨
粗鬆症（年齢１６才では５０％）発症の根底にある病理
生物学的メカニズムは完全には理解されていないが、考
えられる説明としてコラーゲン架橋の阻害が示唆された
（マックジック，ブイエイ、セントルイス：シー．ブ
イ．モスビー、間接組織の遺伝可能な障害，第３版、19
66，155 頁) 。ホモシスチン尿症患者の皮膚生検中のコ
ラーゲンが酸性溶解性の増大を示し、そしてコラーゲン
架橋の量が減少したという発見により、この仮説につい
てのいくらかの証拠が提供されてきた。イン・ビトロ実
験では、ホモシステインが、単離されたコラーゲンの溶
液中での架橋及び原繊維形成を阻害することを示した
（ジャクソン，エスエイチ、Clin. Chim. Acta 1973; 4
5: 215-7.5) 。より最近の研究は、ホモシスチン尿症患
者の血清中のＩ型コラーゲンの架橋量の減少を示した。
これもマックジックの仮説を支持する（レベック，ビー
ら、Biochem BiophysActa 1996; 1315: 159-62.6)。
酸であり、メチオニンの代謝の中間体として形成され
る。この代謝の鍵酵素のいずれかの深刻な欠乏が、血漿
ホモシステインのレベルが高く上昇することにより特徴
付けられるホモシスチン尿症という珍しい常染色体劣性
疾患を引き起こし、これは主として眼、並びに三器官
系、すなわち血管系、骨系及び中枢神経系に影響する一
連の臨床的発現を伴う。ホモシスチン尿症患者の初期骨
粗鬆症（年齢１６才では５０％）発症の根底にある病理
生物学的メカニズムは完全には理解されていないが、考
えられる説明としてコラーゲン架橋の阻害が示唆された
（マックジック，ブイエイ、セントルイス：シー．ブ
イ．モスビー、間接組織の遺伝可能な障害，第３版、19
66，155 頁) 。ホモシスチン尿症患者の皮膚生検中のコ
ラーゲンが酸性溶解性の増大を示し、そしてコラーゲン
架橋の量が減少したという発見により、この仮説につい
てのいくらかの証拠が提供されてきた。イン・ビトロ実
験では、ホモシステインが、単離されたコラーゲンの溶
液中での架橋及び原繊維形成を阻害することを示した
（ジャクソン，エスエイチ、Clin. Chim. Acta 1973; 4
5: 215-7.5) 。より最近の研究は、ホモシスチン尿症患
者の血清中のＩ型コラーゲンの架橋量の減少を示した。
これもマックジックの仮説を支持する（レベック，ビー
ら、Biochem BiophysActa 1996; 1315: 159-62.6)。
【０００６】血漿ホモシステインのレベルが穏やかに上
昇することが、共通の状態であり、アルツハイマー病
（クラークら、Arch. Neurol. 1998 55: 1449-1455) 等
の認識低下に対するだけでなく、アテローム性動脈硬化
症及び血栓塞栓症（バウシェイら JAMA 1995 274: 1049
-1057)に対しても主要な危険因子である。一つの研究
は、年齢による骨損失にホモシステイン血漿レベルの増
大が関与すること示唆した（ミヤオら、J Bone Min Res
15 S459 (abstract)(2000) が、他のどの研究でも骨格
系の疾患とホモシステイン血漿レベルの穏やかな上昇と
の関係を調べてはいない。
昇することが、共通の状態であり、アルツハイマー病
（クラークら、Arch. Neurol. 1998 55: 1449-1455) 等
の認識低下に対するだけでなく、アテローム性動脈硬化
症及び血栓塞栓症（バウシェイら JAMA 1995 274: 1049
-1057)に対しても主要な危険因子である。一つの研究
は、年齢による骨損失にホモシステイン血漿レベルの増
大が関与すること示唆した（ミヤオら、J Bone Min Res
15 S459 (abstract)(2000) が、他のどの研究でも骨格
系の疾患とホモシステイン血漿レベルの穏やかな上昇と
の関係を調べてはいない。
【０００７】ホモシステイン代謝の鍵酵素の一つが、メ
チレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）であ
る。この酵素が機能的に変化した変異型、ＭＴＨＦＲ
Ｃ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）トランジションが記
載されている（カングら、AM JHum Genet 1991 48:536-
545 及びフロスら Nat Genet 1995 10: 111-113)。こ
の多形性はホモシステインレベルの穏やかな上昇と関連
しており、ある研究では多形性と血管疾患との関連を見
いだしたが（ガラハー，ピーエムら、Circulation 199
6; 94: 2154-8、クルジトマンズ, エルエイら、Am J Hu
m Genet 1996; 58:35-41 、モリタ, エイチら Circulat
ion 1997; 95:2032-6、及びウェルチ, ジーエヌら、N E
ngl J Med 1998; 338:1042-50) 、他の研究ではこれを
確認できなかった（フレッチャーら、Hum Genet 1998 1
03: 11-21)。最近、この変異型は低骨ミネラル密度と関
連することも見いだされた（ミヤオら、Calcif Tissue
Int 2000; 66: 190-194)。
チレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）であ
る。この酵素が機能的に変化した変異型、ＭＴＨＦＲ
Ｃ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）トランジションが記
載されている（カングら、AM JHum Genet 1991 48:536-
545 及びフロスら Nat Genet 1995 10: 111-113)。こ
の多形性はホモシステインレベルの穏やかな上昇と関連
しており、ある研究では多形性と血管疾患との関連を見
いだしたが（ガラハー，ピーエムら、Circulation 199
6; 94: 2154-8、クルジトマンズ, エルエイら、Am J Hu
m Genet 1996; 58:35-41 、モリタ, エイチら Circulat
ion 1997; 95:2032-6、及びウェルチ, ジーエヌら、N E
ngl J Med 1998; 338:1042-50) 、他の研究ではこれを
確認できなかった（フレッチャーら、Hum Genet 1998 1
03: 11-21)。最近、この変異型は低骨ミネラル密度と関
連することも見いだされた（ミヤオら、Calcif Tissue
Int 2000; 66: 190-194)。
【０００８】骨粗鬆症はこの疾患への罹り易さの根底に
あるいくつかの遺伝子の変異型を有する多遺伝子性特性
と考えることができる。最も豊富な骨基質タンパク質を
コードするＣＯＬＩＡ１遺伝子の変異型を含む幾つかの
遺伝子における変異型がＢＭＤと関連することが見出さ
れた。Ｓｐ１結合部位内のＣＯＬＩＡ１のプロモーター
領域に位置するＴ対立遺伝子のこの多形性は、低ＢＭＤ
と関連し、そして骨粗鬆症骨折の素因と関連することが
分かった（ウィターリンデンら、N Engl J Med1998 33
8: 1016-1021、及びグラントら、Nat Genet 1996 14: 2
03-205) 。最近、Ｔ対立遺伝子は２（Ｉ）コラーゲン鎖
に対する１（Ｉ）コラーゲン鎖の異常生産を惹き起こ
し、それが骨強度を下げる結果となることが示された
（マンら、JClin Invest 2001 107: 899-907)。
あるいくつかの遺伝子の変異型を有する多遺伝子性特性
と考えることができる。最も豊富な骨基質タンパク質を
コードするＣＯＬＩＡ１遺伝子の変異型を含む幾つかの
遺伝子における変異型がＢＭＤと関連することが見出さ
れた。Ｓｐ１結合部位内のＣＯＬＩＡ１のプロモーター
領域に位置するＴ対立遺伝子のこの多形性は、低ＢＭＤ
と関連し、そして骨粗鬆症骨折の素因と関連することが
分かった（ウィターリンデンら、N Engl J Med1998 33
8: 1016-1021、及びグラントら、Nat Genet 1996 14: 2
03-205) 。最近、Ｔ対立遺伝子は２（Ｉ）コラーゲン鎖
に対する１（Ｉ）コラーゲン鎖の異常生産を惹き起こ
し、それが骨強度を下げる結果となることが示された
（マンら、JClin Invest 2001 107: 899-907)。
【０００９】該タンパク質配列の位置２２２にＶａｌ残
基を有するＭＴＨＦＲの変異が、恐らく血漿ホモシステ
インレベルの上昇を介して、低骨ミネラル密度と関連す
ることが示されたが、それは骨損傷それ自体に対する危
険の増大を指示するものとして用いることはできなかっ
た。骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラ
ル密度とは無関係であり得ること、及び危険対立遺伝子
が異なるかもしれないことがこれまでも示されてきた。
基を有するＭＴＨＦＲの変異が、恐らく血漿ホモシステ
インレベルの上昇を介して、低骨ミネラル密度と関連す
ることが示されたが、それは骨損傷それ自体に対する危
険の増大を指示するものとして用いることはできなかっ
た。骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラ
ル密度とは無関係であり得ること、及び危険対立遺伝子
が異なるかもしれないことがこれまでも示されてきた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記のように、現状で
は、骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラ
ル密度とは無関係であると考えられることから、骨損傷
がどのような遺伝的原因によって生じるのかが全く不明
であり、骨損傷を受け易い主体を発見する方法はもちろ
ん骨損傷を受け易い主体の予防法や治療法を提供するこ
ともできない状態にある。しかしながら、本発明者ら
は、ここに、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子（すなわ
ち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有する主体で
の骨折のし易さ即ち骨折の危険とＭＴＨＦＲのＴ対立遺
伝子の存在との間には相関関係があるという驚くべき事
実を発見した。この事実に基づき鋭意研究を重ねた結果
本発明を完成するに至った。
は、骨粗鬆症等の疾患の終点としての骨損傷が骨ミネラ
ル密度とは無関係であると考えられることから、骨損傷
がどのような遺伝的原因によって生じるのかが全く不明
であり、骨損傷を受け易い主体を発見する方法はもちろ
ん骨損傷を受け易い主体の予防法や治療法を提供するこ
ともできない状態にある。しかしながら、本発明者ら
は、ここに、コラーゲンＩα１危険対立遺伝子（すなわ
ち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有する主体で
の骨折のし易さ即ち骨折の危険とＭＴＨＦＲのＴ対立遺
伝子の存在との間には相関関係があるという驚くべき事
実を発見した。この事実に基づき鋭意研究を重ねた結果
本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】即ち、本発明の骨子は、（１）Ｍ
ＴＨＦＲの多形性及びコラーゲンＩα１の多形性のどの
対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工
程を含む、主体の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（２）ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）
多形性、及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多形性のどの対
立遺伝子が存在するかを決定する工程により、主体の骨
損傷の受け易さを判定する上記（１）記載の方法、
（３）ＭＴＨＦＲの多形性のどの対立遺伝子が存在する
かを決定する工程により、コラーゲンＩα１のＳｐ１多
形性のｓ対立遺伝子を持つことが特定された主体の骨損
傷の受け易さを判定する方法、（４）該多形性がＭＴＨ
ＦＲのＣ６７７Ｔ多形性である、上記（３）記載の骨損
傷の受け易さを判定する方法、（５）該対立遺伝子がＭ
ＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の関
連部分の増幅により決定されるものである、上記（１）
〜（４）いずれかに記載の方法、（６）上記（１）〜
（５）いずれかに記載の方法であって、コラーゲンＩα
１遺伝子のＳｐ１多形性の対立遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺
伝子のＣ６７７Ｔ多形性の対立遺伝子のコピー数を決定
する工程を含む方法、（７）上記（１）〜（６）いずれ
かに記載の方法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラー
ゲンＩα１遺伝子に存在する該対立遺伝子（単数又は複
数）が骨損傷の危険と関連するか否かを判定する工程を
さらに含む方法、（８）主体の試料中に存在する該対立
遺伝子（単数又は複数）と骨損傷の危険の既知の程度を
有する主体に存在するＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲン
Ｉα１遺伝子の対立遺伝子とを比較する工程を含む、上
記（７）記載の方法、並びに（９）上記の方法に使用す
るキット、に関する。以下に本発明の実施の態様につい
て詳細に説明する。
ＴＨＦＲの多形性及びコラーゲンＩα１の多形性のどの
対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工
程を含む、主体の骨損傷の受け易さを判定する方法、
（２）ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ（Ａｌａ２２２Ｖａｌ）
多形性、及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多形性のどの対
立遺伝子が存在するかを決定する工程により、主体の骨
損傷の受け易さを判定する上記（１）記載の方法、
（３）ＭＴＨＦＲの多形性のどの対立遺伝子が存在する
かを決定する工程により、コラーゲンＩα１のＳｐ１多
形性のｓ対立遺伝子を持つことが特定された主体の骨損
傷の受け易さを判定する方法、（４）該多形性がＭＴＨ
ＦＲのＣ６７７Ｔ多形性である、上記（３）記載の骨損
傷の受け易さを判定する方法、（５）該対立遺伝子がＭ
ＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の関
連部分の増幅により決定されるものである、上記（１）
〜（４）いずれかに記載の方法、（６）上記（１）〜
（５）いずれかに記載の方法であって、コラーゲンＩα
１遺伝子のＳｐ１多形性の対立遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺
伝子のＣ６７７Ｔ多形性の対立遺伝子のコピー数を決定
する工程を含む方法、（７）上記（１）〜（６）いずれ
かに記載の方法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラー
ゲンＩα１遺伝子に存在する該対立遺伝子（単数又は複
数）が骨損傷の危険と関連するか否かを判定する工程を
さらに含む方法、（８）主体の試料中に存在する該対立
遺伝子（単数又は複数）と骨損傷の危険の既知の程度を
有する主体に存在するＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲン
Ｉα１遺伝子の対立遺伝子とを比較する工程を含む、上
記（７）記載の方法、並びに（９）上記の方法に使用す
るキット、に関する。以下に本発明の実施の態様につい
て詳細に説明する。
【００１２】本発明の第１の側面では、主体の骨損傷の
受け易さを判定する方法が提供される。この方法はコラ
ーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲにどの多形性の対立遺伝子
が存在するかを決定する工程を含んでいる。
受け易さを判定する方法が提供される。この方法はコラ
ーゲンＩα１及びＭＴＨＦＲにどの多形性の対立遺伝子
が存在するかを決定する工程を含んでいる。
【００１３】こうして、本発明によれば、個体の骨損傷
の受け易さの特定及び治療法又は予防法の開発が可能と
なる。例えば、骨損傷の危険のある主体がその生活スタ
イルを改善し、定期的運動及び健康的食事等の骨強化法
を行うことにより、又は損傷の危険を減少させる医薬を
服用することにより損傷を避けることができよう。典型
的には、本発明の第一の側面の方法は、コラーゲンＩα
１及びＭＴＨＦＲの多形性を分析して骨損傷の受け易さ
を判定する工程を含む。この方法は、多形性のどの対立
遺伝子が存在するかを決定するために、ＤＮＡ、ＲＮＡ
又はタンパク質の分析を含んでもよい。この方法は、一
つ以上の特定の対立遺伝子が存在するか否かを決定する
工程を含んでもよい。この方法は、主体がコラーゲンＩ
α１及びＭＴＨＦＲの対立遺伝子についてホモ接合性で
あるかヘテロ接合性であるかを決定する工程をさらに含
んでもよい。
の受け易さの特定及び治療法又は予防法の開発が可能と
なる。例えば、骨損傷の危険のある主体がその生活スタ
イルを改善し、定期的運動及び健康的食事等の骨強化法
を行うことにより、又は損傷の危険を減少させる医薬を
服用することにより損傷を避けることができよう。典型
的には、本発明の第一の側面の方法は、コラーゲンＩα
１及びＭＴＨＦＲの多形性を分析して骨損傷の受け易さ
を判定する工程を含む。この方法は、多形性のどの対立
遺伝子が存在するかを決定するために、ＤＮＡ、ＲＮＡ
又はタンパク質の分析を含んでもよい。この方法は、一
つ以上の特定の対立遺伝子が存在するか否かを決定する
工程を含んでもよい。この方法は、主体がコラーゲンＩ
α１及びＭＴＨＦＲの対立遺伝子についてホモ接合性で
あるかヘテロ接合性であるかを決定する工程をさらに含
んでもよい。
【００１４】ＭＴＨＦＲ遺伝子は、フロストら（前記）
に記載されたヌクレオチド配列の位置６７７に遺伝性の
多形性を含んでいる。さらに、ＭＴＨＦＲの配列及びＣ
６７７Ｔ多形性の同定の仕方についての方法論がゴイェ
ットら、Nature Genetics 7195-200 (1994)及びゴイェ
ットら、Mammalian Genome 9 652-656 (1998) に記載さ
れている。この多形性はヌクレオチド配列（本明細書中
では「参照」配列と呼ぶ）のＴ残基がＣ残基に置換する
ことから成り、これによりタンパク質配列のアラニンを
バリンに変換する。この改変はＨｉｎｆ１制限酵素部位
を創出する。そこで、この制限酵素がこの多形性をスク
リーニングするのに用いることができる。この遺伝的多
形性をＣ６７７Ｔと記載する。この番号は該ヌクレオチ
ド配列に関する多形性の位置を指し、「Ｃ」は参照配列
即ち野性型配列に存在するヌクレオチドであり、そして
「Ｔ」は変異型配列のその位置に存在するヌクレオチド
残基である。同様に、アミノ酸多形性はＡｌａ２２２Ｖ
ａｌと記載される。本発明の目的では、特定のヌクレオ
チド配列又はタンパク質にどの対立遺伝子が存在するか
の決定は、主体の遺伝子型又は表現型のそれぞれを決定
する工程と呼ばれうる。
に記載されたヌクレオチド配列の位置６７７に遺伝性の
多形性を含んでいる。さらに、ＭＴＨＦＲの配列及びＣ
６７７Ｔ多形性の同定の仕方についての方法論がゴイェ
ットら、Nature Genetics 7195-200 (1994)及びゴイェ
ットら、Mammalian Genome 9 652-656 (1998) に記載さ
れている。この多形性はヌクレオチド配列（本明細書中
では「参照」配列と呼ぶ）のＴ残基がＣ残基に置換する
ことから成り、これによりタンパク質配列のアラニンを
バリンに変換する。この改変はＨｉｎｆ１制限酵素部位
を創出する。そこで、この制限酵素がこの多形性をスク
リーニングするのに用いることができる。この遺伝的多
形性をＣ６７７Ｔと記載する。この番号は該ヌクレオチ
ド配列に関する多形性の位置を指し、「Ｃ」は参照配列
即ち野性型配列に存在するヌクレオチドであり、そして
「Ｔ」は変異型配列のその位置に存在するヌクレオチド
残基である。同様に、アミノ酸多形性はＡｌａ２２２Ｖ
ａｌと記載される。本発明の目的では、特定のヌクレオ
チド配列又はタンパク質にどの対立遺伝子が存在するか
の決定は、主体の遺伝子型又は表現型のそれぞれを決定
する工程と呼ばれうる。
【００１５】コラーゲンＩα１（１７ｑ２２）は、イン
トロン１中でエキソン２の前の４３７ヌクレオチドの遺
伝子にＧからＴへの多形性を有する。Ｇ−４３７／ｉｎ
１Ｔと記載される多形性は、Ｓｐ１転写因子結合部位中
にあり、後述のプライマー等の適切なミスマッチプライ
マーにより増幅すると、ＭｓｃＩ制限酵素消化により検
出することができる。こうして、もしＴ対立遺伝子が存
在すれば、ミスマッチが導入され、これがＭｓｃＩ制限
部位を導入する。この対立遺伝子をＳ／ｓと記載する。
ここで、ｓは多形性部位でのＴ対立遺伝子の存在を示
す。本明細書中、この多形性を「ＳｐＩ多形性」と呼
ぶ。
トロン１中でエキソン２の前の４３７ヌクレオチドの遺
伝子にＧからＴへの多形性を有する。Ｇ−４３７／ｉｎ
１Ｔと記載される多形性は、Ｓｐ１転写因子結合部位中
にあり、後述のプライマー等の適切なミスマッチプライ
マーにより増幅すると、ＭｓｃＩ制限酵素消化により検
出することができる。こうして、もしＴ対立遺伝子が存
在すれば、ミスマッチが導入され、これがＭｓｃＩ制限
部位を導入する。この対立遺伝子をＳ／ｓと記載する。
ここで、ｓは多形性部位でのＴ対立遺伝子の存在を示
す。本明細書中、この多形性を「ＳｐＩ多形性」と呼
ぶ。
【００１６】本発明は、コラーゲンＩα１危険対立遺伝
子（すなわち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有
する主体での骨折などの、骨折のし易さ即ち骨折の危険
（相互に交換して用いうる用語である）とＭＴＨＦＲの
Ｔ対立遺伝子の存在との間には相関関係があるという驚
くべき発見に基づく。コラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子
に加えて、ＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子を有する主体は、
最も低い骨折の危険を付与するＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝
子を有する主体に比べて骨折について高い危険を示すこ
ととなる。これらの結果は予想され得なかった。なぜな
ら、これまでの研究ではこれらの危険対立遺伝子が骨ミ
ネラル密度とはほとんど無関係に骨折の危険を予想する
ことを示していたからである。この事実は本明細書中で
提示する結果により支持される。本明細書の結果は、骨
損傷の危険が最も高いこれらの個体が低い骨ミネラル密
度を有する主体ではないことを示す。ＭＴＨＦＲ遺伝子
の対立遺伝子をスクリーニングすることにより、骨損傷
の受け易さを、骨ミネラル密度の分析の必要なしに評価
できる。
子（すなわち、ＳｐＩ部位のＴ又はｓ対立遺伝子）を有
する主体での骨折などの、骨折のし易さ即ち骨折の危険
（相互に交換して用いうる用語である）とＭＴＨＦＲの
Ｔ対立遺伝子の存在との間には相関関係があるという驚
くべき発見に基づく。コラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子
に加えて、ＭＴＨＦＲのＴ対立遺伝子を有する主体は、
最も低い骨折の危険を付与するＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝
子を有する主体に比べて骨折について高い危険を示すこ
ととなる。これらの結果は予想され得なかった。なぜな
ら、これまでの研究ではこれらの危険対立遺伝子が骨ミ
ネラル密度とはほとんど無関係に骨折の危険を予想する
ことを示していたからである。この事実は本明細書中で
提示する結果により支持される。本明細書の結果は、骨
損傷の危険が最も高いこれらの個体が低い骨ミネラル密
度を有する主体ではないことを示す。ＭＴＨＦＲ遺伝子
の対立遺伝子をスクリーニングすることにより、骨損傷
の受け易さを、骨ミネラル密度の分析の必要なしに評価
できる。
【００１７】本発明の第一の側面の方法は、存在する対
立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定する工
程をさらに含むことが好ましい。これは、主体に存在す
る対立遺伝子と骨損傷の危険に関連することが知られて
いる対立遺伝子とを比較することにより実施することが
できる。例えば、可視化した詳細対立遺伝子及びそれと
関連する相対的骨損傷危険を用いて、主体の遺伝子型又
は表現型が骨損傷危険の高低と関連するか否かを決定す
ることができる。
立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定する工
程をさらに含むことが好ましい。これは、主体に存在す
る対立遺伝子と骨損傷の危険に関連することが知られて
いる対立遺伝子とを比較することにより実施することが
できる。例えば、可視化した詳細対立遺伝子及びそれと
関連する相対的骨損傷危険を用いて、主体の遺伝子型又
は表現型が骨損傷危険の高低と関連するか否かを決定す
ることができる。
【００１８】本発明の方法は、イン・ビトロで実施でき
る。本方法は、主体の身体から採取した組織試料又は体
液試料について実施することが好ましい。こうして、本
発明は、非侵襲的な診断方法であって、その結果骨損傷
の受け易さの指標を提供するが、治療に関してすぐさま
医学的決定がなされる診断には至らない方法に関する。
る。本方法は、主体の身体から採取した組織試料又は体
液試料について実施することが好ましい。こうして、本
発明は、非侵襲的な診断方法であって、その結果骨損傷
の受け易さの指標を提供するが、治療に関してすぐさま
医学的決定がなされる診断には至らない方法に関する。
【００１９】本発明は、骨損傷の危険を判定することが
望まれるいかなる主体についても実施できる。かかる主
体はほ乳類であることが好ましい。主体はヒトであるこ
とが好ましく、女性であることが、最も好ましい。
望まれるいかなる主体についても実施できる。かかる主
体はほ乳類であることが好ましい。主体はヒトであるこ
とが好ましく、女性であることが、最も好ましい。
【００２０】骨損傷は、骨折、破壊又は破砕といった構
造的損傷のいかなる形態であってもよい。またこれらの
用語は、骨の生物学的分解又は劣化をも含む。通常、骨
損傷という用語には、低骨ミネラル密度は含まれない。
これは骨損傷の危険が骨ミネラル密度と無関係であると
いう発見と一致する。骨折は臨床的に最も重要な終点で
あると定義しうるので、本発明の第一の側面の方法は好
ましくは骨折の危険を判定する方法に関する。通常この
ような骨損傷が骨粗鬆症の結果であるとはいえ、本発明
の目的にとって、まず主体が骨粗鬆症であると診断され
ているか否かは重要でない。
造的損傷のいかなる形態であってもよい。またこれらの
用語は、骨の生物学的分解又は劣化をも含む。通常、骨
損傷という用語には、低骨ミネラル密度は含まれない。
これは骨損傷の危険が骨ミネラル密度と無関係であると
いう発見と一致する。骨折は臨床的に最も重要な終点で
あると定義しうるので、本発明の第一の側面の方法は好
ましくは骨折の危険を判定する方法に関する。通常この
ような骨損傷が骨粗鬆症の結果であるとはいえ、本発明
の目的にとって、まず主体が骨粗鬆症であると診断され
ているか否かは重要でない。
【００２１】第一の側面の別の実施態様では、主体の骨
損傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩ
α１のＳｐ１多形性に対立遺伝子を有する主体におい
て、ＭＴＨＦＲ多形性の対立遺伝子の存在を決定する工
程を含む方法が提供される。好ましい実施態様では、こ
の方法はＳｐ１多形性のどの対立遺伝子が主体に存在す
るかを決定する工程を含んでいる。
損傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩ
α１のＳｐ１多形性に対立遺伝子を有する主体におい
て、ＭＴＨＦＲ多形性の対立遺伝子の存在を決定する工
程を含む方法が提供される。好ましい実施態様では、こ
の方法はＳｐ１多形性のどの対立遺伝子が主体に存在す
るかを決定する工程を含んでいる。
【００２２】本発明の第一の側面の好ましい特徴では、
この方法は主体の遺伝物質を分析して、ＭＴＨＦＲのＣ
６７７Ｔ多形性及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多形性の
どの対立遺伝子が存在しているかを決定する工程を含
む。この主体は、さらに、各対立遺伝子についてヘテロ
接合性又はホモ接合性に分類される。この方法は存在す
る対立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定す
る追加の工程を含むことが好ましい。この工程では、コ
ラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子を有する主体では、ＭＴ
ＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の増大と関連
し、ＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の減
少と関連する。Ｔ対立遺伝子についてホモ接合性であれ
ば主体の骨損傷の受け易さがさらに増大する一方、Ｃ対
立遺伝子についてホモ接合性であれば受け易さはさらに
減少するであろう。このように、Ｃ対立遺伝子について
のホモ接合性は骨損傷に対し予防性があると考えてよ
い。本発明の別の実施態様では、ＭＴＨＦＲのＣ６７７
ＴのＣ対立遺伝子をスクリーニングすることにより骨損
傷の受け易さを判定する方法が提供される。
この方法は主体の遺伝物質を分析して、ＭＴＨＦＲのＣ
６７７Ｔ多形性及びコラーゲンＩα１のＳｐ１多形性の
どの対立遺伝子が存在しているかを決定する工程を含
む。この主体は、さらに、各対立遺伝子についてヘテロ
接合性又はホモ接合性に分類される。この方法は存在す
る対立遺伝子が骨損傷の危険と関連するか否かを決定す
る追加の工程を含むことが好ましい。この工程では、コ
ラーゲンＩα１のｓ対立遺伝子を有する主体では、ＭＴ
ＨＦＲのＴ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の増大と関連
し、ＭＴＨＦＲのＣ対立遺伝子の存在が骨損傷危険の減
少と関連する。Ｔ対立遺伝子についてホモ接合性であれ
ば主体の骨損傷の受け易さがさらに増大する一方、Ｃ対
立遺伝子についてホモ接合性であれば受け易さはさらに
減少するであろう。このように、Ｃ対立遺伝子について
のホモ接合性は骨損傷に対し予防性があると考えてよ
い。本発明の別の実施態様では、ＭＴＨＦＲのＣ６７７
ＴのＣ対立遺伝子をスクリーニングすることにより骨損
傷の受け易さを判定する方法が提供される。
【００２３】第一の側面の別の好ましい特徴では、この
方法は主体のＭＴＨＦＲタンパク質を分析して、Ａｌａ
２２２Ｖａｌ多形性のどの対立遺伝子が存在するかを決
定する工程を含むことができる。またこの方法は、存在
する対立遺伝子が骨損傷危険の増大と関連するか否かを
決定するための追加の工程をさらに含むことができる。
この追加の工程では、位置２２２のバリン残基の存在が
骨損傷危険の増大を示し、そしてこの位置のアラニン残
基が骨損傷危険の減少又は正常を示す。
方法は主体のＭＴＨＦＲタンパク質を分析して、Ａｌａ
２２２Ｖａｌ多形性のどの対立遺伝子が存在するかを決
定する工程を含むことができる。またこの方法は、存在
する対立遺伝子が骨損傷危険の増大と関連するか否かを
決定するための追加の工程をさらに含むことができる。
この追加の工程では、位置２２２のバリン残基の存在が
骨損傷危険の増大を示し、そしてこの位置のアラニン残
基が骨損傷危険の減少又は正常を示す。
【００２４】第一の側面の別の好ましい特徴では、骨損
傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩα
１遺伝子のＳｐ１多形性及び／又はＭＴＨＦＲのＣ６７
７Ｔ多形性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含
む方法が提供される。この方法で、コピー数の増大は骨
損傷危険の増大と関連する。
傷の受け易さを判定する方法であって、コラーゲンＩα
１遺伝子のＳｐ１多形性及び／又はＭＴＨＦＲのＣ６７
７Ｔ多形性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含
む方法が提供される。この方法で、コピー数の増大は骨
損傷危険の増大と関連する。
【００２５】また本発明は、骨折の危険を判定するのに
有用なＭＴＨＦＲ遺伝子の他の多形性をスクリーニング
する工程を含むことができる。
有用なＭＴＨＦＲ遺伝子の他の多形性をスクリーニング
する工程を含むことができる。
【００２６】本発明は、当該技術分野で知られるいかな
る適切な方法を用いて実施してもよい。まず、組織試料
又は体液試料を主体から採取することが好ましい。適切
な試料の例としては、血液、口腔若しくは頬の細胞、毛
根を含む頭髪試料が挙げられる。他の適切な試料も、当
業者は承知しているであろう。次に、遺伝物質又はタン
パク質を適切な方法を用いて試料から抽出する。遺伝物
質はＤＮＡ又はＲＮＡであればよいが、ＤＮＡを用いる
ことが好ましい。例えば、遺伝物質又はタンパク質をサ
ムブルックら（Molecular Cloning - A Laboratory Man
ual, Cold Spring Harbou Laboratory Press) に記載さ
れた技術を用いて抽出するとよい。次に、抽出したＤＮ
Ａ又はタンパク質を用いて、例えばサザンブロット分析
後制限酵素消化する方法、ＰＣＲ増幅後制限酵素消化
し、必要であればゲル電気泳動により消化生成物を分離
する方法、任意の適切な方法により関連する遺伝子断片
の配列決定をする方法、パターンの違いが一つ以上の特
定の対立遺伝子の存在を示すような、例えばＰＡＡ又は
アガロースゲル上でヘテロ二本鎖パターンを可視化する
方法、分離の程度が一つ以上の多形性制限部位の存在又
は非存在に左右される、変性勾配ゲルを用いたＤＮＡ断
片の分離法、パターンが一つ以上の多形性制限部位の存
在又は非存在に左右されるＳＳＣＰ分析を用いる分離
法、ハイブリダイゼーションパターンが対立遺伝子の種
々の組み合わせに特異的となる対立遺伝子特異的オリゴ
ヌクレオチドを使用する方法、既知突然変異を検出する
ためのＯＬＡ、タックマン（Taqman) 又はドットブロッ
トといった方法、目的対立遺伝子に対する蛍光標識プロ
ーブを用いたＤＮＡ部位の可視化法、及びＲＦＬＰ分析
といった適切な技術により、主体の遺伝子型又は表現型
を決定することができる。
る適切な方法を用いて実施してもよい。まず、組織試料
又は体液試料を主体から採取することが好ましい。適切
な試料の例としては、血液、口腔若しくは頬の細胞、毛
根を含む頭髪試料が挙げられる。他の適切な試料も、当
業者は承知しているであろう。次に、遺伝物質又はタン
パク質を適切な方法を用いて試料から抽出する。遺伝物
質はＤＮＡ又はＲＮＡであればよいが、ＤＮＡを用いる
ことが好ましい。例えば、遺伝物質又はタンパク質をサ
ムブルックら（Molecular Cloning - A Laboratory Man
ual, Cold Spring Harbou Laboratory Press) に記載さ
れた技術を用いて抽出するとよい。次に、抽出したＤＮ
Ａ又はタンパク質を用いて、例えばサザンブロット分析
後制限酵素消化する方法、ＰＣＲ増幅後制限酵素消化
し、必要であればゲル電気泳動により消化生成物を分離
する方法、任意の適切な方法により関連する遺伝子断片
の配列決定をする方法、パターンの違いが一つ以上の特
定の対立遺伝子の存在を示すような、例えばＰＡＡ又は
アガロースゲル上でヘテロ二本鎖パターンを可視化する
方法、分離の程度が一つ以上の多形性制限部位の存在又
は非存在に左右される、変性勾配ゲルを用いたＤＮＡ断
片の分離法、パターンが一つ以上の多形性制限部位の存
在又は非存在に左右されるＳＳＣＰ分析を用いる分離
法、ハイブリダイゼーションパターンが対立遺伝子の種
々の組み合わせに特異的となる対立遺伝子特異的オリゴ
ヌクレオチドを使用する方法、既知突然変異を検出する
ためのＯＬＡ、タックマン（Taqman) 又はドットブロッ
トといった方法、目的対立遺伝子に対する蛍光標識プロ
ーブを用いたＤＮＡ部位の可視化法、及びＲＦＬＰ分析
といった適切な技術により、主体の遺伝子型又は表現型
を決定することができる。
【００２７】タンパク質を分析する場合は、このタンパ
ク質の異なる多形性型の間を識別できる抗体の使用、免
疫アッセイ、移動度変位分析、又はタンパク質サイズの
差を検出できる他の技術、及びタンパク質活性の変化を
検出するアッセイといった方法が適切であろう。
ク質の異なる多形性型の間を識別できる抗体の使用、免
疫アッセイ、移動度変位分析、又はタンパク質サイズの
差を検出できる他の技術、及びタンパク質活性の変化を
検出するアッセイといった方法が適切であろう。
【００２８】本発明を実施するに際し、特定の制限酵素
を使用することが望ましい場合は、当業者は同様の特異
性を有する酵素的又は化学的操作を用いうることを理解
しているであろう。例えば、本明細書中に記載する酵素
と類似の特異性を有する制限酵素（アイソシゾマー）を
用いてもよく、またＤＮＡ又はＲＮＡ切断特異性を持つ
化学的分解法を用いてもよい。
を使用することが望ましい場合は、当業者は同様の特異
性を有する酵素的又は化学的操作を用いうることを理解
しているであろう。例えば、本明細書中に記載する酵素
と類似の特異性を有する制限酵素（アイソシゾマー）を
用いてもよく、またＤＮＡ又はＲＮＡ切断特異性を持つ
化学的分解法を用いてもよい。
【００２９】主体の遺伝子型又は表現型を決定するのに
適する他の任意の技術も本発明に用いることができる。
適する他の任意の技術も本発明に用いることができる。
【００３０】増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
技術により実施し、該断片がＭＴＨＦＲのものである場
合は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、７
０、１００、１５０又は２００塩基長となるコピーを生
産することが好ましい。増幅する断片がコラーゲンＩα
１遺伝子のものである場合は、少なくとも５０塩基対
長、好ましくは２００塩基対長の断片を増幅するように
ＰＣＲプライマーを選択するとよい。ＰＣＲ技術は当該
技術分野ではよく知られ、前記遺伝子の適切な領域、す
なわちＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１７０から１１
００までの領域及びコラーゲンＩα１遺伝子の第１イン
トロンを増幅するためのプライマーを特定することは通
常の知識を有する者の範囲内である。好ましい技術は一
塩基伸長であり、本方法にとって多形性部位を含む断片
を増幅することが唯一必要である。このように、６７７
多形性部位の直ぐ周囲の領域を増幅することが要求され
る。ＰＣＲ技術はＥＰ−Ａ−０２００３６２及びＥＰ−
Ａ−０２０１１８４に記載されている。
技術により実施し、該断片がＭＴＨＦＲのものである場
合は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、７
０、１００、１５０又は２００塩基長となるコピーを生
産することが好ましい。増幅する断片がコラーゲンＩα
１遺伝子のものである場合は、少なくとも５０塩基対
長、好ましくは２００塩基対長の断片を増幅するように
ＰＣＲプライマーを選択するとよい。ＰＣＲ技術は当該
技術分野ではよく知られ、前記遺伝子の適切な領域、す
なわちＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１７０から１１
００までの領域及びコラーゲンＩα１遺伝子の第１イン
トロンを増幅するためのプライマーを特定することは通
常の知識を有する者の範囲内である。好ましい技術は一
塩基伸長であり、本方法にとって多形性部位を含む断片
を増幅することが唯一必要である。このように、６７７
多形性部位の直ぐ周囲の領域を増幅することが要求され
る。ＰＣＲ技術はＥＰ−Ａ−０２００３６２及びＥＰ−
Ａ−０２０１１８４に記載されている。
【００３１】第一の側面の好ましい特徴では、主体の骨
損傷の受け易さを判定する方法であって、ＭＴＨＦＲ遺
伝子のヌクレオチド１７０から１１００までの領域の一
部分を含む断片を増幅する工程、及びＭＴＨＦＲにどの
対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工
程を含む方法が提供される。当該技術分野の熟練者は、
ＭＴＨＦＲ遺伝子の該部分を増幅するのに適切なプライ
マーを容易に入手できるであろう。このようなプライマ
ーの例として、 １． ５'-ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＧＡ-３'及び／又は ２． ５'-ＡＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧ-３' が挙げられる。
損傷の受け易さを判定する方法であって、ＭＴＨＦＲ遺
伝子のヌクレオチド１７０から１１００までの領域の一
部分を含む断片を増幅する工程、及びＭＴＨＦＲにどの
対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決定する工
程を含む方法が提供される。当該技術分野の熟練者は、
ＭＴＨＦＲ遺伝子の該部分を増幅するのに適切なプライ
マーを容易に入手できるであろう。このようなプライマ
ーの例として、 １． ５'-ＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＧＡ-３'及び／又は ２． ５'-ＡＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧ-３' が挙げられる。
【００３２】コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多形性の
どの対立遺伝子が存在するかを決定するには、コラーゲ
ンＩα１遺伝子の第１イントロンの少なくとも一部分を
増幅し、その後ＭｓｃＩ制限部位の存在を決定するとよ
い。適切なプライマーとしては、 １． ５'-ＴＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＡＣＴＴＴＴＴＧＧ- ３'及び／又は ２． ５'-ＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣ-３' が挙げられる。
どの対立遺伝子が存在するかを決定するには、コラーゲ
ンＩα１遺伝子の第１イントロンの少なくとも一部分を
増幅し、その後ＭｓｃＩ制限部位の存在を決定するとよ
い。適切なプライマーとしては、 １． ５'-ＴＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＧＣＧＧＡＣＴＴＴＴＴＧＧ- ３'及び／又は ２． ５'-ＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣ-３' が挙げられる。
【００３３】さらなるプライマー配列は、グラントら
（Nature 14 203-205 (1996)) に記載されている。
（Nature 14 203-205 (1996)) に記載されている。
【００３４】遺伝子の増幅された部分が関連対立遺伝子
を含む遺伝子の前記規定部分より大きい場合は、ＭＴＨ
ＦＲ遺伝子のｈｉｎｆＩ制限部位又はコラーゲンＩα１
遺伝子のＳｐＩ部位を含むＭＴＨＦＲ又はコラーゲンＩ
α１遺伝子配列が含まれないようにすることが好まし
い。
を含む遺伝子の前記規定部分より大きい場合は、ＭＴＨ
ＦＲ遺伝子のｈｉｎｆＩ制限部位又はコラーゲンＩα１
遺伝子のＳｐＩ部位を含むＭＴＨＦＲ又はコラーゲンＩ
α１遺伝子配列が含まれないようにすることが好まし
い。
【００３５】本発明の第二の側面では、主体の骨損傷を
予防する方法が提供される。この主体は好ましくは本発
明の第一の側面の方法を用いて、骨損傷危険があると診
断されていることが好ましい。この側面において、予防
には、主体の骨損傷危険を減少するためのいかなる手段
も含まれる。
予防する方法が提供される。この主体は好ましくは本発
明の第一の側面の方法を用いて、骨損傷危険があると診
断されていることが好ましい。この側面において、予防
には、主体の骨損傷危険を減少するためのいかなる手段
も含まれる。
【００３６】治療は予防的又は緩和的処置の形態であれ
ばよい。好ましい治療方法は、血漿中のホモシステイン
のレベルを減少させ、そしてＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子
の効果を効果的に逆転させるために、葉酸又は葉酸塩を
投与する方法である。葉酸と並行して、又はそれに替わ
るものとして投与される他の適切な治療法には、生活ス
タイル、定期的運動及び骨を強くするための食事の変更
及びホルモン治療が挙げられる。骨の損失を減少させる
ための医薬製剤などの他の適切な治療も、医師及び当業
者に知られている。例として、タンパク同化ステロイ
ド、ビスホスホネート、ビタミンＤ製剤、カルシウム補
強剤及びホルモン補充療法が挙げられる。
ばよい。好ましい治療方法は、血漿中のホモシステイン
のレベルを減少させ、そしてＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子
の効果を効果的に逆転させるために、葉酸又は葉酸塩を
投与する方法である。葉酸と並行して、又はそれに替わ
るものとして投与される他の適切な治療法には、生活ス
タイル、定期的運動及び骨を強くするための食事の変更
及びホルモン治療が挙げられる。骨の損失を減少させる
ための医薬製剤などの他の適切な治療も、医師及び当業
者に知られている。例として、タンパク同化ステロイ
ド、ビスホスホネート、ビタミンＤ製剤、カルシウム補
強剤及びホルモン補充療法が挙げられる。
【００３７】第二の側面の好ましい実施態様では、骨損
傷の予防に使用するための医薬品製造における葉酸の使
用が提供される。
傷の予防に使用するための医薬品製造における葉酸の使
用が提供される。
【００３８】医薬品の投与は、任意の有効な経路、例え
ば経口又は非経口経路により行われる。非経口送達方法
には、局所、動脈内、皮下、骨髄内、静脈内又は鼻腔内
投与が挙げられる。経口投与後の皮下注射が摂取経路と
して好ましく、また持続的に作用する固定化法も用いう
る。活性成分に加えて、これらの医薬品には、賦形剤及
び薬学的に使用できる製剤への活性化合物の処理を促進
させる他の化合物等の適切な薬学的に許容しうる担体を
含めてもよい。製剤化及び投与の技術についてのさらな
る詳細は、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 」
（Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版に記載さ
れている。
ば経口又は非経口経路により行われる。非経口送達方法
には、局所、動脈内、皮下、骨髄内、静脈内又は鼻腔内
投与が挙げられる。経口投与後の皮下注射が摂取経路と
して好ましく、また持続的に作用する固定化法も用いう
る。活性成分に加えて、これらの医薬品には、賦形剤及
び薬学的に使用できる製剤への活性化合物の処理を促進
させる他の化合物等の適切な薬学的に許容しうる担体を
含めてもよい。製剤化及び投与の技術についてのさらな
る詳細は、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 」
（Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版に記載さ
れている。
【００３９】経口投与のための医薬品は、経口投与に適
した投与量で、当該技術分野でよく知られた薬学的に許
容しうる担体を用いて製剤化できる。このような担体に
より、患者の摂取に適した錠剤、ピル、糖衣錠、カプセ
ル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤
等として医薬組成物を製剤化できる。
した投与量で、当該技術分野でよく知られた薬学的に許
容しうる担体を用いて製剤化できる。このような担体に
より、患者の摂取に適した錠剤、ピル、糖衣錠、カプセ
ル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤
等として医薬組成物を製剤化できる。
【００４０】経口使用のための医薬品は、活性成分と固
体賦形剤とを混合することにより、必要であれば、所望
に応じ適切な添加化合物を加えた後、得られた混合物を
摩砕しそして顆粒の混合物を処理することにより錠剤又
は糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、炭水化物又はタ
ンパク質の増量剤である。これらには、ゼラチン及びコ
ラーゲンなどのタンパク質に加えて、乳糖、蔗糖、マン
ニトール又はソルビトール、トウモロコシ、ムギ、コ
メ、イモ又は他の植物由来のデンプン、メチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキ
シメチルセルロースナトリウム等のセルロース、及びア
ラビア及びトラガカント等のガムが含まれるが、これら
に限定されない。必要な場合は、架橋ポリビニルピロリ
ドン、寒天、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム
等のその塩といった、崩壊剤又は溶解剤を加えてもよ
い。
体賦形剤とを混合することにより、必要であれば、所望
に応じ適切な添加化合物を加えた後、得られた混合物を
摩砕しそして顆粒の混合物を処理することにより錠剤又
は糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、炭水化物又はタ
ンパク質の増量剤である。これらには、ゼラチン及びコ
ラーゲンなどのタンパク質に加えて、乳糖、蔗糖、マン
ニトール又はソルビトール、トウモロコシ、ムギ、コ
メ、イモ又は他の植物由来のデンプン、メチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキ
シメチルセルロースナトリウム等のセルロース、及びア
ラビア及びトラガカント等のガムが含まれるが、これら
に限定されない。必要な場合は、架橋ポリビニルピロリ
ドン、寒天、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム
等のその塩といった、崩壊剤又は溶解剤を加えてもよ
い。
【００４１】糖衣錠コアには、アラビアガム、タルク、
ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレン
グリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適切な有機溶媒若しくは溶媒混合物などをも含む濃縮糖
溶液などの適切な被覆剤で被覆する。着色料又は色素を
錠剤又は糖衣錠被覆剤に加えて、生産物の特定又は活性
化合物の量（すなわち、投与量）を特定してもよい。
ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレン
グリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適切な有機溶媒若しくは溶媒混合物などをも含む濃縮糖
溶液などの適切な被覆剤で被覆する。着色料又は色素を
錠剤又は糖衣錠被覆剤に加えて、生産物の特定又は活性
化合物の量（すなわち、投与量）を特定してもよい。
【００４２】経口に用いうる医薬品には、ゼラチン及び
グリセロール又はソルビトール等の被覆剤でできた軟
性、密封カプセル剤及びゼラチンからできた押し嵌め式
カプセル剤が挙げられる。押し嵌め式カプセル剤には、
活性成分をラクトース又はデンプン等の充填剤又は結合
剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、
及び任意選択的に安定剤と混合して含めることができ
る。軟カプセル剤には、活性化合物を脂肪油、液体パラ
フィン又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体
に、安定剤と共に又は安定剤を用いずに、溶解又は懸濁
するとよい。
グリセロール又はソルビトール等の被覆剤でできた軟
性、密封カプセル剤及びゼラチンからできた押し嵌め式
カプセル剤が挙げられる。押し嵌め式カプセル剤には、
活性成分をラクトース又はデンプン等の充填剤又は結合
剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、
及び任意選択的に安定剤と混合して含めることができ
る。軟カプセル剤には、活性化合物を脂肪油、液体パラ
フィン又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体
に、安定剤と共に又は安定剤を用いずに、溶解又は懸濁
するとよい。
【００４３】非経口投与のための医薬品としては、活性
化合物の水溶液が挙げられる。注射用には、本発明の医
薬を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液又
は生理的緩衝食塩水等の生理的適合緩衝液中で製剤化す
る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の
粘度を増大させる物質を含めてもよい。さらに、活性化
合物の懸濁液を適切な油性注射懸濁剤として調製しても
よい。適切な親油性溶媒又はビークルとしては、ゴマ油
等の脂肪油又はオレイン酸エチル又はトリグリセリド等
の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。
さらに、懸濁剤には、高濃度溶液の調製を可能とするた
めに、化合物の溶解性を増大する適切な安定剤又は薬剤
を含めてもよい。
化合物の水溶液が挙げられる。注射用には、本発明の医
薬を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液又
は生理的緩衝食塩水等の生理的適合緩衝液中で製剤化す
る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナ
トリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の
粘度を増大させる物質を含めてもよい。さらに、活性化
合物の懸濁液を適切な油性注射懸濁剤として調製しても
よい。適切な親油性溶媒又はビークルとしては、ゴマ油
等の脂肪油又はオレイン酸エチル又はトリグリセリド等
の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。
さらに、懸濁剤には、高濃度溶液の調製を可能とするた
めに、化合物の溶解性を増大する適切な安定剤又は薬剤
を含めてもよい。
【００４４】局所又は経鼻投与には、浸透させるべき特
別な障壁に対し適切な浸透剤を製剤化に用いる。このよ
うな浸透剤は、当該技術分野で一般に知られている。
別な障壁に対し適切な浸透剤を製剤化に用いる。このよ
うな浸透剤は、当該技術分野で一般に知られている。
【００４５】本発明の医薬品は、当該技術分野で知られ
る方法（例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠調
製、すりつぶし、乳化、カプセル化、封入化又は凍結乾
燥処理などの手段により）と同様の方法で製造すること
ができる。またこの医薬品は、例えば持続的放出又は標
的化放出などの適切な放出特性を与えるために、慣用手
段例えば被覆により改良してもよい。
る方法（例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠調
製、すりつぶし、乳化、カプセル化、封入化又は凍結乾
燥処理などの手段により）と同様の方法で製造すること
ができる。またこの医薬品は、例えば持続的放出又は標
的化放出などの適切な放出特性を与えるために、慣用手
段例えば被覆により改良してもよい。
【００４６】この医薬品は塩として提供してもよく、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等
の多くの酸を用いて形成できるが、これらに限定されな
い。塩は、対応する遊離塩基の形態である水性又は他の
プロトン溶媒ではより溶解し易い傾向がある。他の場合
では、好ましい調製物は、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジ
ン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトー
ルに、ｐＨ４．５〜５．５の範囲で調製された凍結乾燥
粉末である。これは使用の前に緩衝液と混合して用いら
れる。
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等
の多くの酸を用いて形成できるが、これらに限定されな
い。塩は、対応する遊離塩基の形態である水性又は他の
プロトン溶媒ではより溶解し易い傾向がある。他の場合
では、好ましい調製物は、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジ
ン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトー
ルに、ｐＨ４．５〜５．５の範囲で調製された凍結乾燥
粉末である。これは使用の前に緩衝液と混合して用いら
れる。
【００４７】許容しうる担体中に製剤化されたこのよう
な医薬品を調製した後、それを適切な容器に入れ、示し
た状態の治療のためのラベルを貼る。
な医薬品を調製した後、それを適切な容器に入れ、示し
た状態の治療のためのラベルを貼る。
【００４８】骨損傷の予防のために適切な医薬品として
は、意図された目的を達成するのに有効な量の活性成分
を含む組成物が挙げられる。実際に投与される量は、治
療される個体に依存し、望みの効果が重大な副作用なし
に達成されるような最適な量であることが好ましい。治
療的に有効な投与量の決定は、充分に当該技術分野の熟
練者の能力内にある。もちろん、熟練者は分割投与や部
分投与も本発明の範囲内であると理解するであろう。
は、意図された目的を達成するのに有効な量の活性成分
を含む組成物が挙げられる。実際に投与される量は、治
療される個体に依存し、望みの効果が重大な副作用なし
に達成されるような最適な量であることが好ましい。治
療的に有効な投与量の決定は、充分に当該技術分野の熟
練者の能力内にある。もちろん、熟練者は分割投与や部
分投与も本発明の範囲内であると理解するであろう。
【００４９】いかなる化合物でも、治療上有効な投与量
は、最初に細胞培養アッセイ又は適切な動物モデル（例
えば高血圧には、霊長類、ラット及びモルモット並びに
他の実験室小動物）のどちらかで見積もることができ
る。これらのアッセイでは、下流の処理活性だけでな
く、受容体活性も考慮すべきである。また望ましい濃度
範囲及び投与経路を決めるために、動物モデルも用いら
れる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて
有用な投与量及び投与経路を決定することができる。
は、最初に細胞培養アッセイ又は適切な動物モデル（例
えば高血圧には、霊長類、ラット及びモルモット並びに
他の実験室小動物）のどちらかで見積もることができ
る。これらのアッセイでは、下流の処理活性だけでな
く、受容体活性も考慮すべきである。また望ましい濃度
範囲及び投与経路を決めるために、動物モデルも用いら
れる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて
有用な投与量及び投与経路を決定することができる。
【００５０】治療上有効な量とは、症状又は状態を改善
する薬剤の量を指す。このような化合物の治療上の有効
性及び毒性は、標準的薬学操作により細胞培養又は実験
動物において決定できる（例えば、ＥＤ50、集団の５０
％が治療上有効な投与量、及びＬＤ50、集団の５０％が
死に至る投与量）。治療効果と毒性効果の間の投与量の
比が治療指数であり、定量ＥＤ50／ＬＤ50として表せ
る。大きい治療指数を示す医薬品が好ましい。細胞培養
アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに使
用するための投与量範囲を決定する際に有用である。こ
のような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか全く
ないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にあることが好まし
い。この投与量は、採用される投与形態、患者の感受性
及び投与経路により、この範囲内で変動する。
する薬剤の量を指す。このような化合物の治療上の有効
性及び毒性は、標準的薬学操作により細胞培養又は実験
動物において決定できる（例えば、ＥＤ50、集団の５０
％が治療上有効な投与量、及びＬＤ50、集団の５０％が
死に至る投与量）。治療効果と毒性効果の間の投与量の
比が治療指数であり、定量ＥＤ50／ＬＤ50として表せ
る。大きい治療指数を示す医薬品が好ましい。細胞培養
アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに使
用するための投与量範囲を決定する際に有用である。こ
のような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか全く
ないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にあることが好まし
い。この投与量は、採用される投与形態、患者の感受性
及び投与経路により、この範囲内で変動する。
【００５１】正確な用量は、治療する患者の観点で各医
師により選択される。活性部分の充分なレベルを提供す
るよう、又は所望の効果を維持するように、用量及び投
与を調整する。長時間作用する医薬品を、具体的製剤の
半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、１
週間毎又は２週間に１回投与してもよい。具体的用量及
び送達方法についてのガイダンスは、文献に記載されて
いる（参照により本明細書にインコーポレートされる米
国特許第４，６５７，７６０号、第５、２０６，３４４
号、第５，２２５，２１２号を参照）。
師により選択される。活性部分の充分なレベルを提供す
るよう、又は所望の効果を維持するように、用量及び投
与を調整する。長時間作用する医薬品を、具体的製剤の
半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、１
週間毎又は２週間に１回投与してもよい。具体的用量及
び送達方法についてのガイダンスは、文献に記載されて
いる（参照により本明細書にインコーポレートされる米
国特許第４，６５７，７６０号、第５、２０６，３４４
号、第５，２２５，２１２号を参照）。
【００５２】本発明の第三の側面では、治療に対する主
体の応答を予測する方法であって、ＭＴＨＦＲ及び／又
はコラーゲンＩα１の多形性のどの対立遺伝子（単数又
は複数）が主体に存在するかを決定する工程を含む方法
が提供される。これは、第一の側面に従ってなされう
る。この方法は主体が骨損傷を受け易いか否かを判定す
る工程を含むことが好ましい。治療剤又は予防剤の効果
は根底にある骨損傷の原因に依存し、場合によっては、
特定の治療の採用を避けることが好ましいであろう。例
えば、ある遺伝子の特定の対立遺伝子が存在するか否か
が、どれが最適な予防法であるかに関して有用な指示を
与えることになる。例えば、コラーゲンＩα１危険対立
遺伝子を有するが、ＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子を有しな
い主体は、葉酸投与から利益を得ることはなさそうであ
る。また本発明のこの側面は、骨損傷の治療に使用しう
る薬剤を特定するのにも有用であろう。
体の応答を予測する方法であって、ＭＴＨＦＲ及び／又
はコラーゲンＩα１の多形性のどの対立遺伝子（単数又
は複数）が主体に存在するかを決定する工程を含む方法
が提供される。これは、第一の側面に従ってなされう
る。この方法は主体が骨損傷を受け易いか否かを判定す
る工程を含むことが好ましい。治療剤又は予防剤の効果
は根底にある骨損傷の原因に依存し、場合によっては、
特定の治療の採用を避けることが好ましいであろう。例
えば、ある遺伝子の特定の対立遺伝子が存在するか否か
が、どれが最適な予防法であるかに関して有用な指示を
与えることになる。例えば、コラーゲンＩα１危険対立
遺伝子を有するが、ＭＴＨＦＲ危険対立遺伝子を有しな
い主体は、葉酸投与から利益を得ることはなさそうであ
る。また本発明のこの側面は、骨損傷の治療に使用しう
る薬剤を特定するのにも有用であろう。
【００５３】本発明の第四の側面では、ＭＴＨＦＲ遺伝
子及びコラーゲンＩα１遺伝子の多形性のどの対立遺伝
子が存在するかを決定するのに有用なキットであって、
（ｉ）ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺
伝子の一部を増幅するための一つ以上の核酸プライマー
分子、及び（ii）該遺伝子中にどの対立遺伝子が存在す
るかを決定する手段を含むキットを提供する。ＭＴＨＦ
Ｒ及びコラーゲンＩα１の多形性はそれぞれＣ６７７Ｔ
多形性及びＳｐＩ多形性であることが好ましい。タンパ
ク質分析のためのキットは、タンパク質の異なる多形性
間を識別できる抗体、及び移動度変位分析又は免疫アッ
セイを実施するために必要な薬剤を含んでいるとよい。
またこのキットは対立遺伝子（単数又は複数）と骨損傷
危険の間の相関関係を示す手段を含むことが好ましい。
子及びコラーゲンＩα１遺伝子の多形性のどの対立遺伝
子が存在するかを決定するのに有用なキットであって、
（ｉ）ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺
伝子の一部を増幅するための一つ以上の核酸プライマー
分子、及び（ii）該遺伝子中にどの対立遺伝子が存在す
るかを決定する手段を含むキットを提供する。ＭＴＨＦ
Ｒ及びコラーゲンＩα１の多形性はそれぞれＣ６７７Ｔ
多形性及びＳｐＩ多形性であることが好ましい。タンパ
ク質分析のためのキットは、タンパク質の異なる多形性
間を識別できる抗体、及び移動度変位分析又は免疫アッ
セイを実施するために必要な薬剤を含んでいるとよい。
またこのキットは対立遺伝子（単数又は複数）と骨損傷
危険の間の相関関係を示す手段を含むことが好ましい。
【００５４】プライマー分子はＭＴＨＦＲ遺伝子の少な
くとも一部及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の第１イ
ントロンの一部の増幅に適することが好ましい。適切な
プライマーの例は上に記述している。
くとも一部及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の第１イ
ントロンの一部の増幅に適することが好ましい。適切な
プライマーの例は上に記述している。
【００５５】ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩ
α１遺伝子にどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在す
るかを決定する手段は、前記の方法のいずれかで使用す
るために必要な任意の薬剤又は分子を含んでもよい。例
えば、ＰＣＲ後のＤＮＡ消化を用いる場合は、この手段
はＰＣＲ薬剤及び一つ以上のｈｉｎｆＩ及び／又はＭｓ
ｃＩ制限酵素を含むことが好ましい。この方法がサザン
ブロット、ヘテロ二本鎖可視化又は蛍光標識技術を採用
する場合は、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラー
ゲンＩα１遺伝子の適切な領域に結合するプローブを含
むとよい。必要であれば、このようなプローブは、例え
ばニック翻訳、放射標識若しくは蛍光標識又はランダム
プライマー伸長により検出されるように標識し、それに
より標識していないヌクレオチドは標識分子合成のため
の鋳型として働く。プローブを標識する他の方法は、当
該技術分野でよく知られている。
α１遺伝子にどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在す
るかを決定する手段は、前記の方法のいずれかで使用す
るために必要な任意の薬剤又は分子を含んでもよい。例
えば、ＰＣＲ後のＤＮＡ消化を用いる場合は、この手段
はＰＣＲ薬剤及び一つ以上のｈｉｎｆＩ及び／又はＭｓ
ｃＩ制限酵素を含むことが好ましい。この方法がサザン
ブロット、ヘテロ二本鎖可視化又は蛍光標識技術を採用
する場合は、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラー
ゲンＩα１遺伝子の適切な領域に結合するプローブを含
むとよい。必要であれば、このようなプローブは、例え
ばニック翻訳、放射標識若しくは蛍光標識又はランダム
プライマー伸長により検出されるように標識し、それに
より標識していないヌクレオチドは標識分子合成のため
の鋳型として働く。プローブを標識する他の方法は、当
該技術分野でよく知られている。
【００５６】存在する対立遺伝子と骨損傷危険とを相関
させる手段は、ＭＴＨＦＲ多形性のＴ対立遺伝子及びコ
ラーゲンＩα１遺伝子のＳ対立遺伝子の存在が骨折危険
増大と関連することを示すようなチャート又は視覚化手
段の形態であってもよい。
させる手段は、ＭＴＨＦＲ多形性のＴ対立遺伝子及びコ
ラーゲンＩα１遺伝子のＳ対立遺伝子の存在が骨折危険
増大と関連することを示すようなチャート又は視覚化手
段の形態であってもよい。
【００５７】第五の側面の好ましい特徴では、キットは
主体のＤＮＡ配列との比較のために対照のＤＮＡ又はタ
ンパク質試料を含んでいてもよい。対照試料は、ＭＴＨ
ＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一つ以
上の対立遺伝子の配列を含む。
主体のＤＮＡ配列との比較のために対照のＤＮＡ又はタ
ンパク質試料を含んでいてもよい。対照試料は、ＭＴＨ
ＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一つ以
上の対立遺伝子の配列を含む。
【００５８】さらなる側面では、第一の側面の方法にお
ける第四の側面のキットの使用が提供される。
ける第四の側面のキットの使用が提供される。
【００５９】本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な
変更を加えて他の各側面にも当てはまる。
変更を加えて他の各側面にも当てはまる。
【００６０】ここに本発明を以下の実施例及び図を参照
して詳細に記載する。
して詳細に記載する。
【００６１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。
【００６２】本研究の目的は、ＢＭＤ及び骨折の危険を
判定するに際し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺
伝子の二つの機能的多形性間の相互作用を調べることで
あった。さらに、ホモシステイン血清レベルとＢＭＤ及
び骨折危険との関連を研究した。
判定するに際し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺
伝子の二つの機能的多形性間の相互作用を調べることで
あった。さらに、ホモシステイン血清レベルとＢＭＤ及
び骨折危険との関連を研究した。
【００６３】研究主体
「ロッテルダム研究」は、オランダ王国、ロッテルダム
市のオムールド地区に居住する５５歳以上の７９８３人
の主体についての集団に基づくコホート研究である。こ
の研究は、いくつかの潜在的決定因子に関して高齢者の
疾患発病を記録するように計画した（ホフマンら、Eur
J Epidemiol 1991 7: 403-422)。全体で１０，２７５人
であり、そのうち９１６１人（８９％）は独立して生活
しており、１９９１年に研究に参加するよう招かれた。
独立して生活しているこれらの主体の全体的な回答率
は、自宅面接については７７％、及び身体特徴の測定、
ＢＭＤ及び血液採取といった研究センター内での検査に
ついては７１％であった。ロッテルダム研究は、Medica
l Ethics Committee of the Erasmus University Medic
al School により承認され、書面によるインフォームド
・コンセントを各主体から得た。ホモシステイン、ＭＴ
ＨＦＲ遺伝子型、ＣＯＬＩＡ１遺伝子型並びにＢＭＤ及
び骨折の間の関係の分析は、研究に参加した女性のサン
プルで実施した。
市のオムールド地区に居住する５５歳以上の７９８３人
の主体についての集団に基づくコホート研究である。こ
の研究は、いくつかの潜在的決定因子に関して高齢者の
疾患発病を記録するように計画した（ホフマンら、Eur
J Epidemiol 1991 7: 403-422)。全体で１０，２７５人
であり、そのうち９１６１人（８９％）は独立して生活
しており、１９９１年に研究に参加するよう招かれた。
独立して生活しているこれらの主体の全体的な回答率
は、自宅面接については７７％、及び身体特徴の測定、
ＢＭＤ及び血液採取といった研究センター内での検査に
ついては７１％であった。ロッテルダム研究は、Medica
l Ethics Committee of the Erasmus University Medic
al School により承認され、書面によるインフォームド
・コンセントを各主体から得た。ホモシステイン、ＭＴ
ＨＦＲ遺伝子型、ＣＯＬＩＡ１遺伝子型並びにＢＭＤ及
び骨折の間の関係の分析は、研究に参加した女性のサン
プルで実施した。
【００６４】ＭＴＨＦＲ遺伝子、ＣＯＬＩＡ１遺伝子
と、骨折の危険及びＢＭＤとの間の関連の分析のため、
女性下部集団を研究した。ＢＭＤのベースライン測定は
この研究から独立して生活している５９３１人について
得たが、これらのうち１４５３人は歩行補助器の使用の
ため、真性糖尿病のため、利尿薬、エストロゲン、甲状
腺ホルモン又は細胞成長抑制薬治療の使用のため排除し
た。残りの主体から、年齢５５〜８０才の女性１５３３
人の無作為サンプルを研究した。
と、骨折の危険及びＢＭＤとの間の関連の分析のため、
女性下部集団を研究した。ＢＭＤのベースライン測定は
この研究から独立して生活している５９３１人について
得たが、これらのうち１４５３人は歩行補助器の使用の
ため、真性糖尿病のため、利尿薬、エストロゲン、甲状
腺ホルモン又は細胞成長抑制薬治療の使用のため排除し
た。残りの主体から、年齢５５〜８０才の女性１５３３
人の無作為サンプルを研究した。
【００６５】ホモシステインレベル、骨折危険及びＢＭ
Ｄ間の関連の分析は、異なるグループの女性について行
った。女性４５９人のサンプルを無作為に総集団から選
んだ。４４人の女性については、身体測定データ及び骨
折についての追跡データが得られず、最終的に研究グル
ープは女性４１５人となった。
Ｄ間の関連の分析は、異なるグループの女性について行
った。女性４５９人のサンプルを無作為に総集団から選
んだ。４４人の女性については、身体測定データ及び骨
折についての追跡データが得られず、最終的に研究グル
ープは女性４１５人となった。
【００６６】測定
実験の始めに、靴及び室内着を着用せずに起立姿勢で身
長及び体重を測定した。身長（メートル）の二乗で割っ
たキログラム体重（ｋｇ／ｍ2 ）をボディーマス指数
（ＢＭＩ）としてコンピュータ処理した。以前に記載さ
れた（バーガーら、Bone Miner 1994 25: 1-13）よう
に、大腿部付け根及び腰椎（椎骨）で、二重エネルギー
Ｘ線吸光光度計（ＤＥＸＡ）（ルマール DPX-L濃度計、
ルワール社、マジソン、WI、USA ）により骨ミネラル密
度（ＢＭＤ）を測定した。前年度の食事からのカルシウ
ム摂取（ｍｇ／日）を、食事頻度の質問により評価し、
エネルギー摂取により調整した。現在の喫煙状況を質問
し評価した。
長及び体重を測定した。身長（メートル）の二乗で割っ
たキログラム体重（ｋｇ／ｍ2 ）をボディーマス指数
（ＢＭＩ）としてコンピュータ処理した。以前に記載さ
れた（バーガーら、Bone Miner 1994 25: 1-13）よう
に、大腿部付け根及び腰椎（椎骨）で、二重エネルギー
Ｘ線吸光光度計（ＤＥＸＡ）（ルマール DPX-L濃度計、
ルワール社、マジソン、WI、USA ）により骨ミネラル密
度（ＢＭＤ）を測定した。前年度の食事からのカルシウ
ム摂取（ｍｇ／日）を、食事頻度の質問により評価し、
エネルギー摂取により調整した。現在の喫煙状況を質問
し評価した。
【００６７】９５６人の女性（６２％）について、第四
胸椎から第五腰椎までの椎骨の側面Ｘ線写真を、ベース
ライン調査（１９９０年から１９９３年）及び追跡検診
（１９９７年から１９９９年）の両方について得た。追
跡Ｘ線写真を、マックロスキー／カニス法（McCloskey
ら、Osteoporosis Int 1993 3: 138-147) により椎骨骨
折の存在を数えた。椎骨骨折が存在する場合は、ベース
ラインＸ線写真をよく調べ、骨折が付随的(incident)で
あるか主体的(prevalent) なものであるかを確かめた。
胸椎から第五腰椎までの椎骨の側面Ｘ線写真を、ベース
ライン調査（１９９０年から１９９３年）及び追跡検診
（１９９７年から１９９９年）の両方について得た。追
跡Ｘ線写真を、マックロスキー／カニス法（McCloskey
ら、Osteoporosis Int 1993 3: 138-147) により椎骨骨
折の存在を数えた。椎骨骨折が存在する場合は、ベース
ラインＸ線写真をよく調べ、骨折が付随的(incident)で
あるか主体的(prevalent) なものであるかを確かめた。
【００６８】股関節部、手首及び他の骨折を含む付随的
非椎骨骨折を記録し、確認し、そして平均７年間の追跡
期間にわたって医師が分類した。追跡は、１９９１年１
月１日、又はその後の研究に含まれた時点に開始した。
本研究についての追跡は１９９９年１２月３１日か、参
加者が死亡した場合はそれより早い時点で終了した。
非椎骨骨折を記録し、確認し、そして平均７年間の追跡
期間にわたって医師が分類した。追跡は、１９９１年１
月１日、又はその後の研究に含まれた時点に開始した。
本研究についての追跡は１９９９年１２月３１日か、参
加者が死亡した場合はそれより早い時点で終了した。
【００６９】ホモシステイン測定
ベースライン調査から絶食でない血清試料を得た。試料
を直ぐに氷の上におき、エクス・ビボ形成による総ホモ
システイン濃度の増大を妨ぐのに充分であることが分か
っている（ウビンクら、Clin Chim Acta 1992 207: 119
-128）６０分以内に処理した。総ホモシステインの測定
まで、血清を−２０℃で凍結して保存した。アラキ及び
サコ（J Chromatogr 1987 422: 43-52）に従って、かつ
ウビンクら（J Chromatogr 1991 565: 441-446）により
改良された高圧液体クロマトグラフィーを用いて、総ホ
モシステインを蛍光誘導体として測定した。
を直ぐに氷の上におき、エクス・ビボ形成による総ホモ
システイン濃度の増大を妨ぐのに充分であることが分か
っている（ウビンクら、Clin Chim Acta 1992 207: 119
-128）６０分以内に処理した。総ホモシステインの測定
まで、血清を−２０℃で凍結して保存した。アラキ及び
サコ（J Chromatogr 1987 422: 43-52）に従って、かつ
ウビンクら（J Chromatogr 1991 565: 441-446）により
改良された高圧液体クロマトグラフィーを用いて、総ホ
モシステインを蛍光誘導体として測定した。
【００７０】ＣＯＬＩＡ１及びＭＴＨＦＲ遺伝子型の決
定 標準的操作に従って末梢静脈血試料からゲノムＤＮＡを
抽出し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の多形性を、以前に記載さ
れている二対立遺伝子制限部位を導入するミスマッチプ
ライマー（グラントら、前記）を用いてポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により検出した。この試験は、二つの
対立遺伝子Ｇ及びＴを、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の第１イン
トロンのＳｐ１結合部位の第１塩基における、それぞれ
グアニン及びチミジンの存在により識別する。ＭＴＨＦ
Ｒ遺伝子のＣ６７７Ｔ多形性は、多形性を含むＤＮＡ断
片のＰＣＲ増幅により検出し、その後この断片を、以前
に記載されたように（フロスら、前記）ＨｉｎｆＩで消
化した。この試験では、二つの対立遺伝子Ｃ及びＴを、
タンパク質のコドン２２２における、それぞれアラニン
又はバリンにより識別する。
定 標準的操作に従って末梢静脈血試料からゲノムＤＮＡを
抽出し、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の多形性を、以前に記載さ
れている二対立遺伝子制限部位を導入するミスマッチプ
ライマー（グラントら、前記）を用いてポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により検出した。この試験は、二つの
対立遺伝子Ｇ及びＴを、ＣＯＬＩＡ１遺伝子の第１イン
トロンのＳｐ１結合部位の第１塩基における、それぞれ
グアニン及びチミジンの存在により識別する。ＭＴＨＦ
Ｒ遺伝子のＣ６７７Ｔ多形性は、多形性を含むＤＮＡ断
片のＰＣＲ増幅により検出し、その後この断片を、以前
に記載されたように（フロスら、前記）ＨｉｎｆＩで消
化した。この試験では、二つの対立遺伝子Ｃ及びＴを、
タンパク質のコドン２２２における、それぞれアラニン
又はバリンにより識別する。
【００７１】統計分析
研究グループ間のベースラインでの年齢の差を、分散分
析（ＡＮＯＶＡ）の平均により評価した。ベースライン
の特徴での他の全ての差を共変量として、年齢又は年齢
及びＢＭＩと共に試験する共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）
により比較し、ありうる攪乱効果を調整した。主体を、
そのホモシステインレベルに従った遺伝子型又は１／３
ずつにグループ分けした。カイ二乗分析を用いて、ハー
ディ−ヴァインベルグ平衡からの逸脱を試験した。ＢＭ
Ｄと異なる遺伝子型若しくはホモシステインレベル間の
関連を調べるために、多変量線形回帰モデルを用いた。
椎骨骨折の危険を見積もるために、９５％信頼区間（９
５％ＣＩ）のオッズ比を、ロジスティック回帰モデルを
用いて計算した。非椎骨骨折危険を見積もるためＣｏｘ
比例危険モデルを用い、それにより追跡期間における潜
在的差を考慮に入れた。
析（ＡＮＯＶＡ）の平均により評価した。ベースライン
の特徴での他の全ての差を共変量として、年齢又は年齢
及びＢＭＩと共に試験する共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）
により比較し、ありうる攪乱効果を調整した。主体を、
そのホモシステインレベルに従った遺伝子型又は１／３
ずつにグループ分けした。カイ二乗分析を用いて、ハー
ディ−ヴァインベルグ平衡からの逸脱を試験した。ＢＭ
Ｄと異なる遺伝子型若しくはホモシステインレベル間の
関連を調べるために、多変量線形回帰モデルを用いた。
椎骨骨折の危険を見積もるために、９５％信頼区間（９
５％ＣＩ）のオッズ比を、ロジスティック回帰モデルを
用いて計算した。非椎骨骨折危険を見積もるためＣｏｘ
比例危険モデルを用い、それにより追跡期間における潜
在的差を考慮に入れた。
【００７２】結果
Ａ．ＭＴＨＦＲ遺伝子、ＣＯＬＩＡ１遺伝子及び骨粗鬆
症終点 研究主体の特徴 「ロッテルダム研究」の女性のベースラインの特徴及び
本研究の集団の特徴を表１に示す。本研究のグループ
は、ロッテルダム研究に比べて平均５．６歳若いが、８
０才以上の女性を排除しているためである。この研究主
体は、平均して１．９％低く調整されたボディーマス指
数（ＢＭＩ）及び１．３％低く調整された腰椎ＢＭＤを
有していた。ベースラインのカルシウム摂取、主体の喫
煙率又は大腿部付け根ＢＭＤに関しては、有意差はなか
った。
症終点 研究主体の特徴 「ロッテルダム研究」の女性のベースラインの特徴及び
本研究の集団の特徴を表１に示す。本研究のグループ
は、ロッテルダム研究に比べて平均５．６歳若いが、８
０才以上の女性を排除しているためである。この研究主
体は、平均して１．９％低く調整されたボディーマス指
数（ＢＭＩ）及び１．３％低く調整された腰椎ＢＭＤを
有していた。ベースラインのカルシウム摂取、主体の喫
煙率又は大腿部付け根ＢＭＤに関しては、有意差はなか
った。
【００７３】ＭＴＨＦＲ、ＣＯＬＩＡ１及びＢＭＤの間
の関連 表２は、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ変異型及びＣＯＬＩＡ
１のＳｐ１多形性の両者の遺伝子型頻度を示す。ＣＯＬ
ＩＡ１多形性の対立遺伝子頻度（Ｇ対立遺伝子が８２
％、そしてＴ対立遺伝子が１８％）及び遺伝子型分布
は、以前の研究の白色人種について報告されたものと同
様であり（ウィターリンデンら、前記、ビーバンら、N
Engl J Med 1998 339: 351-352、及びラングダールら、
J Bone MinerRes 1998 13: 1384-1389 、及びキーン
ら、Arthritis Rheus 1999 42m 285-290）、それらはハ
ーディ−ヴァインベルグの平衡（ＨＷＥ）から逸脱しな
かった。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、身
長、喫煙習慣又は食事からのカルシウム摂取において有
意差がなかった（データは示さず）。ＧＧ遺伝子型の平
均体重は、ＧＴ及びＴＴ遺伝子型グループに比べて有意
に高かった（ｐ＝０．０５）。先に報告されたように、
大腿骨付け根及び腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意の
遺伝子−用量効果が見い出された。年齢及びＢＭＩにつ
いて調整後、ＧＧグループに比べてＴＴ遺伝子型を有す
る個体では大腿骨付け根ＢＭＤは０．２ＳＤ低く、腰椎
ＢＭＤは０．４ＳＤ低かった。
の関連 表２は、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ変異型及びＣＯＬＩＡ
１のＳｐ１多形性の両者の遺伝子型頻度を示す。ＣＯＬ
ＩＡ１多形性の対立遺伝子頻度（Ｇ対立遺伝子が８２
％、そしてＴ対立遺伝子が１８％）及び遺伝子型分布
は、以前の研究の白色人種について報告されたものと同
様であり（ウィターリンデンら、前記、ビーバンら、N
Engl J Med 1998 339: 351-352、及びラングダールら、
J Bone MinerRes 1998 13: 1384-1389 、及びキーン
ら、Arthritis Rheus 1999 42m 285-290）、それらはハ
ーディ−ヴァインベルグの平衡（ＨＷＥ）から逸脱しな
かった。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、身
長、喫煙習慣又は食事からのカルシウム摂取において有
意差がなかった（データは示さず）。ＧＧ遺伝子型の平
均体重は、ＧＴ及びＴＴ遺伝子型グループに比べて有意
に高かった（ｐ＝０．０５）。先に報告されたように、
大腿骨付け根及び腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意の
遺伝子−用量効果が見い出された。年齢及びＢＭＩにつ
いて調整後、ＧＧグループに比べてＴＴ遺伝子型を有す
る個体では大腿骨付け根ＢＭＤは０．２ＳＤ低く、腰椎
ＢＭＤは０．４ＳＤ低かった。
【００７４】ＭＴＨＦＲ多形性の対立遺伝子頻度は、Ｃ
対立遺伝子が７７％、Ｔ対立遺伝子が３３％であり、そ
して遺伝子型分布は、以前の研究の白色人種について報
告されたものと同様であり（ボットーら、Am J Epidemi
ol 200 151: 862-877)、それらはＨＷＥから逸脱しなか
った。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、ＢＭ
Ｉ、食事からのカルシウム摂取及び喫煙習慣において有
意差がなかった（データは示さず）。大腿骨付け根及び
腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意な遺伝子−用量効果
を見い出した。年齢及びＢＭＩについて調整後、ＣＣグ
ループに比べてＴＴ遺伝子型を有するグループにおける
両部位の骨ミネラル密度は０．２ＳＤ低かった。
対立遺伝子が７７％、Ｔ対立遺伝子が３３％であり、そ
して遺伝子型分布は、以前の研究の白色人種について報
告されたものと同様であり（ボットーら、Am J Epidemi
ol 200 151: 862-877)、それらはＨＷＥから逸脱しなか
った。三つの異なる遺伝子型グループは、年齢、ＢＭ
Ｉ、食事からのカルシウム摂取及び喫煙習慣において有
意差がなかった（データは示さず）。大腿骨付け根及び
腰椎の骨ミネラル密度に及ぼす有意な遺伝子−用量効果
を見い出した。年齢及びＢＭＩについて調整後、ＣＣグ
ループに比べてＴＴ遺伝子型を有するグループにおける
両部位の骨ミネラル密度は０．２ＳＤ低かった。
【００７５】ＭＴＨＦＲ変異型及びＣＯＬＩＡ１変異型
の間の相互作用 ＢＭＤ及び／又は骨折危険を判定するに際し両遺伝的変
異型の相互作用を研究するために、主体を４グループ、
すなわちＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１についての危険対
立遺伝子を持たない参照グループ、ＭＴＨＦＲ危険対立
遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＣＯＬＩＡ１危
険対立遺伝子は存在しないグループ、ＣＯＬＩＡ１危険
対立遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＭＴＨＦＲ
は存在しないグループ、及びＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ
１の両方の危険対立遺伝子（単数又は複数）が存在する
グループに区分した。四つの遺伝子型グループについて
のベースライン身体測定及び食事に関する測定に有意な
差は見られなかった（データは示さず）。大腿骨付け根
及び腰椎の両者での骨ミネラル密度は、四つの遺伝子グ
ループ間で有意に異なった（表３）。両部位について、
ＭＴＨＦＲか又はＣＯＬＩＡ１のいずれかに危険対立遺
伝子が存在する場合と比べて、両遺伝子座に危険対立遺
伝子が存在する場合はＢＭＤの減少が見られた。
の間の相互作用 ＢＭＤ及び／又は骨折危険を判定するに際し両遺伝的変
異型の相互作用を研究するために、主体を４グループ、
すなわちＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１についての危険対
立遺伝子を持たない参照グループ、ＭＴＨＦＲ危険対立
遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＣＯＬＩＡ１危
険対立遺伝子は存在しないグループ、ＣＯＬＩＡ１危険
対立遺伝子（単数又は複数）は存在するが、ＭＴＨＦＲ
は存在しないグループ、及びＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ
１の両方の危険対立遺伝子（単数又は複数）が存在する
グループに区分した。四つの遺伝子型グループについて
のベースライン身体測定及び食事に関する測定に有意な
差は見られなかった（データは示さず）。大腿骨付け根
及び腰椎の両者での骨ミネラル密度は、四つの遺伝子グ
ループ間で有意に異なった（表３）。両部位について、
ＭＴＨＦＲか又はＣＯＬＩＡ１のいずれかに危険対立遺
伝子が存在する場合と比べて、両遺伝子座に危険対立遺
伝子が存在する場合はＢＭＤの減少が見られた。
【００７６】遺伝子型とＢＭＤ間の関連における年齢関
連の変化 骨ミネラル密度に及ぼす遺伝的効果を、損失速度の差に
よるだけでなく、最大骨量の差として観察できた。従っ
て、本発明者らは主体を８．３年カテゴリーに分割し
て、ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１相互作用とＢＭＤとの
関連に及ぼす年齢効果を調べた。図１及び図２は、組み
合わせた対立遺伝子のグループと参照グループの間の差
が、最高齢女性グループ（年齢７１．６才から８０才）
の大腿骨付け根及び腰椎の両者では、両端の遺伝子型グ
ループの間で０．５ＳＤまで年齢と共に増大することを
示す。
連の変化 骨ミネラル密度に及ぼす遺伝的効果を、損失速度の差に
よるだけでなく、最大骨量の差として観察できた。従っ
て、本発明者らは主体を８．３年カテゴリーに分割し
て、ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１相互作用とＢＭＤとの
関連に及ぼす年齢効果を調べた。図１及び図２は、組み
合わせた対立遺伝子のグループと参照グループの間の差
が、最高齢女性グループ（年齢７１．６才から８０才）
の大腿骨付け根及び腰椎の両者では、両端の遺伝子型グ
ループの間で０．５ＳＤまで年齢と共に増大することを
示す。
【００７７】遺伝子型と骨折危険の間の関連
表４は、そのＭＴＨＦＲ／ＣＯＬＩＡ１遺伝子型に従っ
てグループ分けした女性の付随的非椎骨骨折及び椎骨骨
折の分布を示す。ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１の両者に
ついて少なくとも一つの危険対立遺伝子を保持する女性
では、非椎骨骨折の過剰発現が観察された。椎骨骨折の
存在に関しては、４遺伝子グループ間に有意差はなかっ
た。ロジスティック回帰分析では、危険対立遺伝子の組
み合わせを担持する女性は非椎骨骨折について１．９倍
危険が増大することを示した。年齢及びＢＭＩ又は大腿
骨付け根のＢＭＤについて調整すると、危険の評価は本
質的に変わらなかった。
てグループ分けした女性の付随的非椎骨骨折及び椎骨骨
折の分布を示す。ＭＴＨＦＲ及びＣＯＬＩＡ１の両者に
ついて少なくとも一つの危険対立遺伝子を保持する女性
では、非椎骨骨折の過剰発現が観察された。椎骨骨折の
存在に関しては、４遺伝子グループ間に有意差はなかっ
た。ロジスティック回帰分析では、危険対立遺伝子の組
み合わせを担持する女性は非椎骨骨折について１．９倍
危険が増大することを示した。年齢及びＢＭＩ又は大腿
骨付け根のＢＭＤについて調整すると、危険の評価は本
質的に変わらなかった。
【００７８】ＭＴＨＦＲ／ＣＯＬＩＡ１遺伝子型とＢＭ
Ｄとの関連は年齢に依存するので、非椎骨骨折の危険に
及ぼす年齢効果も評価した。労力の理由で、女性を中央
値６５．７５に従って２つの年齢グループに分割した。
表５は、両危険対立遺伝子を担持する高齢女性が、とり
わけより多くの非椎骨折を有することを示す。ロジステ
ィック回帰分析では、２．５倍高い危険を示した。この
危険計算を大腿骨付け根でＢＭＤについて調整すると、
骨折危険は参照グループに比べて２．１倍の高さを維持
した。
Ｄとの関連は年齢に依存するので、非椎骨骨折の危険に
及ぼす年齢効果も評価した。労力の理由で、女性を中央
値６５．７５に従って２つの年齢グループに分割した。
表５は、両危険対立遺伝子を担持する高齢女性が、とり
わけより多くの非椎骨折を有することを示す。ロジステ
ィック回帰分析では、２．５倍高い危険を示した。この
危険計算を大腿骨付け根でＢＭＤについて調整すると、
骨折危険は参照グループに比べて２．１倍の高さを維持
した。
【００７９】Ｂ ホモシステインレベルと骨折の危険
血清中のホモシステインレベルのベースラインの三分画
に従って４１５人の女性を三つのカテゴリーに区分し
た。ベースラインの特徴の比較（表６）では、最も高い
１／３の女性では、最も低い１／３に比べて平均５才高
く（ｐ＜０．００１）、喫煙者は多く、そしてその平均
の食事からのカルシウム摂取は１４％低いことを示し
た。三つの三分画は、大腿骨付け根及び腰椎でのＢＭＩ
及びＢＭＤに関して有意な差はなかった。
に従って４１５人の女性を三つのカテゴリーに区分し
た。ベースラインの特徴の比較（表６）では、最も高い
１／３の女性では、最も低い１／３に比べて平均５才高
く（ｐ＜０．００１）、喫煙者は多く、そしてその平均
の食事からのカルシウム摂取は１４％低いことを示し
た。三つの三分画は、大腿骨付け根及び腰椎でのＢＭＩ
及びＢＭＤに関して有意な差はなかった。
【００８０】表７は、ホモシステインタータイルに従っ
た骨折分布を示す。最も高い１／３の女性は、最も低い
１／３の女性に比べて有意に多くの非椎骨骨折及び椎骨
骨折を経験していた。中間の１／３でも、最も低い１／
３に比べてより多くの椎骨骨折を経験していた。ロジス
ティック回帰分析では、最も高い１／３の女性には非椎
骨骨折では２．１倍高い骨折の危険が、そして椎骨骨折
では３．６倍高い骨折の危険があった。これらの危険の
見積は、年齢及びＢＭＩについて調整した後も本質的に
変化しなかった。ＢＭＤ、食事からのカルシウム摂取又
は喫煙のような他の可能な攪乱因子について調整した場
合も、危険の見積は変化しなかった（データは示さ
ず）。
た骨折分布を示す。最も高い１／３の女性は、最も低い
１／３の女性に比べて有意に多くの非椎骨骨折及び椎骨
骨折を経験していた。中間の１／３でも、最も低い１／
３に比べてより多くの椎骨骨折を経験していた。ロジス
ティック回帰分析では、最も高い１／３の女性には非椎
骨骨折では２．１倍高い骨折の危険が、そして椎骨骨折
では３．６倍高い骨折の危険があった。これらの危険の
見積は、年齢及びＢＭＩについて調整した後も本質的に
変化しなかった。ＢＭＤ、食事からのカルシウム摂取又
は喫煙のような他の可能な攪乱因子について調整した場
合も、危険の見積は変化しなかった（データは示さ
ず）。
【００８１】
【表１】
【００８２】
【表２】
【００８３】
【表３】
【００８４】
【表４】
【００８５】
【表５】
【００８６】
【表６】
【００８７】
【表７】
【００８８】
【発明の効果】本発明により、骨粗鬆症による骨折の危
険を持つか否かを主体の遺伝子を検査することにより、
非侵襲的に診断することが可能となり、これによって、
骨粗鬆症による骨折の危険を有する主体の予防措置を講
ずることも可能となった。
険を持つか否かを主体の遺伝子を検査することにより、
非侵襲的に診断することが可能となり、これによって、
骨粗鬆症による骨折の危険を有する主体の予防措置を講
ずることも可能となった。
【配列表】
<110> Oxagen Limited
<120> 骨損傷の受け易さを判定する方法
<130> ＫＳ−１３−０１０
<160> 4
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400>
tgaaggagaa ggtgtctgcg gga 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400>
aggacggtgc ggtgagagtg 20
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400>
taacttctgg actatttgcg gactttttgg 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400>
gtccagccct catcctggcc 20
【図１】図１は、大腿部付け根の骨密度における年齢に
関する差を示す。
関する差を示す。
【図２】図２は、腰椎の骨密度における年齢に関する差
を示す。
を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 アンドレアス ゲラルドゥス ウィターリ
ンデン
オランダ国、ディーアール ロッテルダム
3000、私書箱1738、エフジージー−イー
ユーアール、内科第ＩＩＩ部、ルームイー
イー575ビー、エラスムス ウニベルジテ
ート ロッテルダム
(72)発明者 ジョイス ベルディナ ジョセファ バン
メウルス
オランダ国、ディーアール ロッテルダム
3000、私書箱1738、エフジージー−イー
ユーアール、内科第ＩＩＩ部、ルームイー
イー575ビー、エラスムス ウニベルジテ
ート ロッテルダム
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA05 HA11
4B063 QA12 QA19 QQ03 QQ43 QR32
QR62
4C086 AA01 CB09 MA01 MA04 NA14
ZA96
Claims (24)
- 【請求項１】 主体の骨損傷の受け易さを判定する方法
であって、ＭＴＨＦＲの多形性及びコラーゲンＩα１の
多形性のどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するか
を決定する工程を含む方法。 - 【請求項２】 主体の骨損傷の受け易さを判定する請求
項１記載の方法であって、ＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ（Ａ
ｌａ２２２Ｖａｌ）多形性、及びコラーゲンＩα１のＳ
ｐ１多形性のどの対立遺伝子が存在するかを決定する工
程を含む方法。 - 【請求項３】 コラーゲンＩα１のＳｐ１多形性のｓ対
立遺伝子を持つことが特定された主体の骨損傷の受け易
さを判定する方法であって、ＭＴＨＦＲの多形性のどの
対立遺伝子が存在するかを決定する工程を含む方法。 - 【請求項４】 請求項３記載の骨損傷の受け易さを判定
する方法であって、該多形性がＭＴＨＦＲのＣ６７７Ｔ
多形性である方法。 - 【請求項５】 請求項１〜請求項４いずれか１項に記載
の方法であって、該対立遺伝子がＭＴＨＦＲ遺伝子及び
／又はコラーゲンＩα１遺伝子の関連部分の増幅により
決定されるものである方法。 - 【請求項６】 請求項１〜請求項５いずれか１項に記載
の方法であって、コラーゲンＩα１遺伝子のＳｐ１多形
性の対立遺伝子及びＭＴＨＦＲ遺伝子のＣ６７７Ｔ多形
性の対立遺伝子のコピー数を決定する工程を含む方法。 - 【請求項７】 請求項１〜請求項６いずれか１項に記載
の方法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα
１遺伝子に存在する該対立遺伝子（単数又は複数）が骨
損傷の危険と関連するか否かを判定する工程をさらに含
む方法。 - 【請求項８】 主体の試料中に存在する該対立遺伝子
（単数又は複数）と骨損傷の危険の既知の程度を有する
主体に存在するＭＴＨＦＲ遺伝子及びコラーゲンＩα１
遺伝子の対立遺伝子とを比較する工程を含む、請求項７
記載の方法。 - 【請求項９】 イン・ビトロで実施される、請求項１〜
請求項８いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 主体の血液又は組織試料について実施
される、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 主体の骨折のし易さを判定するための
請求項１〜請求項１０いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 主体が哺乳類である、請求項１〜請求
項１１いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 主体がヒトである、請求項１〜請求項
１２いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 主体が女性又は雌である、請求項１〜
請求項１３いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 非ヒト哺乳類の骨損傷の危険を予防す
る方法であって、非ヒト哺乳類に葉酸を投与する工程を
含む方法。 - 【請求項１６】 生活スタイルの改善、定期的運動又は
食事変更をさらに含む請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 主体が雌である、請求項１５又は請求
項１６いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】 請求項１〜請求項１４いずれか１項に
記載の方法により骨損傷を受け易いとされた主体の、骨
損傷を予防するための医薬の製造における葉酸の使用。 - 【請求項１９】 治療に対する主体の応答を予測する方
法であって、ＭＴＨＦＲ遺伝子及び／又はコラーゲンＩ
α１遺伝子にどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在す
るかを分析し決定する工程を含む方法。 - 【請求項２０】 該主体が骨損傷の受け易さを診断され
るものである、請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 主体の骨損傷の受け易さを判定するた
めに使用するキットであって、（ｉ）ＭＴＨＦＲ遺伝子
及び／又はコラーゲンＩα１遺伝子の一部を増幅するた
めの一つ以上の核酸プライマー分子、及び（ii）該遺伝
子にどの対立遺伝子（単数又は複数）が存在するかを決
定するための手段を含むキット。 - 【請求項２２】 請求項２１記載のキットであって、該
対立遺伝子（単数又は複数）と骨損傷の危険の間の相関
関係を示す手段をさらに含むキット。 - 【請求項２３】 請求項２１又は請求項２２記載のキッ
トであって、主体のＤＮＡ配列との比較のためにＤＮＡ
又はタンパク質の対照試料を含むキット。 - 【請求項２４】 請求項１〜請求項１４いずれか１項に
記載の方法における請求項２１〜請求項２３いずれか１
項に記載のキットの使用。
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|---|---|---|---|
| US32892901P | 2001-10-11 | 2001-10-11 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003116547A true JP2003116547A (ja) | 2003-04-22 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001341855A Expired - Fee Related JP4174203B2 (ja) | 2001-10-11 | 2001-11-07 | 骨損傷の受け易さを判定する方法 |
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| US10768398B2 (en) * | 2012-09-07 | 2020-09-08 | Cornell University | Solar-concentrating solarization apparatus, methods, and applications |
| US10327393B2 (en) * | 2013-03-07 | 2019-06-25 | Blue River Technology Inc. | Modular precision agriculture system |
| US11160204B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-11-02 | Raven Industries, Inc. | Localized product injection system for an agricultural sprayer |
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| CN107942404B (zh) * | 2017-11-09 | 2019-08-06 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种确定裂缝的方法及装置 |
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|---|---|---|---|---|
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| GB9604305D0 (en) * | 1996-02-29 | 1996-05-01 | Ralston Stuart H | Diagnostic method and apparatus |
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- 2001-11-07 JP JP2001341855A patent/JP4174203B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 2002-10-11 US US10/270,714 patent/US20030165928A1/en not_active Abandoned
-
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- 2008-06-26 US US12/147,362 patent/US20090011421A1/en not_active Abandoned
-
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2011
- 2011-06-28 US US13/170,296 patent/US20120164637A1/en not_active Abandoned
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2013
- 2013-05-09 US US13/890,897 patent/US20160215339A1/en not_active Abandoned
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2016
- 2016-01-21 US US15/002,736 patent/US20160369342A1/en not_active Abandoned
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| METZE | Darier Disease |
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