CN117618783A - 静磁场在治疗骨关节炎中的用途 - Google Patents

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CN117618783A
CN117618783A CN202211067864.6A CN202211067864A CN117618783A CN 117618783 A CN117618783 A CN 117618783A CN 202211067864 A CN202211067864 A CN 202211067864A CN 117618783 A CN117618783 A CN 117618783A
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stem cells
magnetic field
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mesenchymal stem
osteoarthritis
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张平
方彦雯
鲁红冰
卫敏
廖钟财
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Tianjin Medical University
Heye Health Technology Co Ltd
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Tianjin Medical University
Heye Health Technology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及静磁场在治疗骨关节炎中的用途，具体提供静磁场或能产生静磁场的部件在制备产品中的用途，所述产品用于促进干细胞向关节软骨细胞分化、提高干细胞向关节软骨损伤区域的迁移能力、或治疗骨关节炎。本发明的用途对骨关节炎患者无创、不会加重其已有损伤，对损伤较重行动不便的人群依从性良好。

Description

静磁场在治疗骨关节炎中的用途
技术领域
本发明涉及磁场生物学领域，具体涉及静磁场在治疗骨关节炎中的用途。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性关节疾病。骨关节炎患病率高，是致残的重要原因，列全球致残疾病第六位。
传统的OA治疗方法包括非手术治疗和手术治疗，均存在很多的局限性。非手术治疗包括体重管理、物理治疗、锻炼等，药物治疗包括非甾体抗炎药、镇痛药、神经生长因子抑制剂、生物药物、双磷酸盐等，以及关节腔内注射糖皮质激素、透明质酸、富血小板血浆、血管基质组分和自体软骨细胞移植术等。手术治疗以膝关节腔持续冲洗与清理术、全膝关节置换术、膝关节单踝置换术等，但有术后感染、假体松动、假体周围骨折等并发症。这些方法虽能缓解近期疼痛改善患者的临床症状，但是软骨修复的效果并不理想。近年来开展的外源性干细胞移植治疗骨关节炎，其目标是使注射到关节腔的间充质干细胞分化为软骨细胞，但是其缺点是移植的干细胞在损伤区域定植困难、在关节表面不能分化为足够数量的软骨细胞，因而，对软骨修复的疗效也不佳。
软骨损伤后，机体将自然招募动员内源性干细胞到损伤部位并参与修复，但是，损伤后招募内源性干细胞数量不足，局部微环境不良，导致内源性再生通常不足以实现软骨的完全修复。因此，需要研发新颖有效治疗手段来干预 OA关节破坏的早期关键阶段，阻止疾病的进展，促进关节结构修复和功能重建。
再生医学利用干细胞以及细胞因子发挥治疗效应，已逐渐成为一种新的治疗OA的手段。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨和软骨生长发育和维持内环境稳定的重要因素，具有增殖和迁移归巢能力，拥有软骨细胞分化和骨细胞分化潜能，并能够分泌有助于组织再生的趋化因子、细胞因子和生长因子。骨关节炎干细胞治疗的目标是使移植到关节腔的间充质干细胞分化为软骨细胞，但是移植干细胞在发挥短暂的旁分泌作用后迅速发生凋亡。干细胞在损伤区域定植困难、对软骨修复的疗效不佳是干细胞移植亟待解决的问题。现有的干细胞制剂在使用时也存在细胞质量较低、活力较差、疗效不佳问题，严重影响再生医学的发展。
骨关节中存在着对疾病响应的内源性间充质干细胞，包括软骨干细胞、髌下脂肪垫干细胞、滑膜干细胞、滑液干细胞等。激活组织特异性干细胞在OA 治疗中起到重要作用。近年来，内源性间充质干细胞作为一种很有前途的治疗方法，受到广泛关注。
研究发现，骨髓间充质干细胞的软骨形成不仅受生物因素影响，还受环境影响，外界刺激在干细胞迁移、软骨生长发育、成年组织软骨细胞表型维持和损伤修复中起关键作用。关节软骨细胞代谢对磁场、机械和化学刺激均有反应，然而，在生理条件下，成人软骨更新很少，因而限制了关节软骨的自我修复。
磁场包括两种形式，静磁场(static magnetrostatic field)是指磁场的方向与强度不随时间发生变化的磁场，脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields) 是采用可变电磁场诱发导体中的电压和电流。其中，静磁场的磁疗是中医药文化的宝贵遗产，一定强度的静磁场对人体具有多种疗效，诸如促进血液循环、改善微循环、延缓衰老、未病预防和身体保健等。但是，迄今为止，尚没有静磁场治疗骨关节炎的系统研究，也没有对不同强度静磁场修复关节损伤的疗效观察。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，实施静磁场驱动的力学刺激，通过磁场力穿透骨和关节，通过动员机体内源性间充质干细胞迁移富集和软骨分化治疗骨关节炎，提供了一种静磁场在治疗骨关节炎中的用途。
具体地说，本发明第一方面提供一种静磁场或能产生静磁场的部件在制备产品中的用途，所述产品用于促进间充质干细胞向关节软骨细胞分化、提高干细胞向关节软骨损伤区域的迁移能力、或治疗骨关节炎。所述部件的磁感应强度随与其表面的距离增加呈指数递减。
在一个或多个实施方案中，所述关节软骨损伤区域是关节软骨损伤的表层区域。
在一个或多个实施方案中，所述产品是试剂盒或装置，例如静磁场装置、可穿戴装置。
在一个或多个实施方案中，所述静磁场的磁感应强度为30-500mT，优选为40-400mT、更优选为50-200mT，例如50mT、70mT、90mT、100mT、120mT、 150mT、180mT、200mT。
在一个或多个实施方案中，所述部件包括磁板，所述磁板包含位于同一平面的一个或多个永磁体，每个永磁体的磁极垂直于磁板表面。相邻永磁体的磁极相反。在一些实施方案中，永磁体为长方体。在一些实施方案中，所述一个或多个永磁体为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20个。在一个或多个实施方案中，所述长方体永磁体的尺寸为(10-600mm)*(10-300mm)*(1-100mm)，优选(100-400mm)*(100-200mm)*(10-50mm)。
在一个或多个实施方案中，通过细胞或骨关节与部件之间的距离控制其所接受的磁感应强度。
在一个或多个实施方案中，垂直于磁板表面处的磁感应强度最大值为 200-500mT，垂直磁板表面0-2cm处的磁感应强度最大值为50-200mT，垂直磁板表面2-5cm处的磁感应强度最大值为0-50mT。
在一个或多个实施方案中，所述磁板的磁极方向为靠近磁板上表面为北极，远离上表面为南极。
在一个或多个实施方案中，所述部件包括圆柱形永磁体。直径为10-100mm (例如35mm)，高度为1-50mm(例如10mm)。其上表面为北极，远离上表面为南极。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞和/或组织特异性干细胞；优选骨髓间充质干细胞。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞是选自以下的一种或多种标志物阳性的骨髓间充质干细胞：CD146、CD166和CD105。
在一个或多个实施方案中，所述治疗骨关节炎的疗程至少为2周。
本发明还提供一种体外非治疗性上调软骨细胞或间充质干细胞中选自以下的一种或多种基因的表达水平的方法：SDF-1、CXCR4、SOX9、Piezo1、Collagen II，或下调软骨细胞或间充质干细胞中MMP13的表达水平的方法，所述方法包括用静磁场处理软骨细胞或间充质干细胞。
在一个或多个实施方案中，所述静磁场的磁感应强度为30-500mT，优选为40-400mT、更优选为50-200mT，例如50mT、70mT、90mT、100mT、120mT、 150mT、180mT、200mT。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞和/或组织特异性干细胞；优选骨髓间充质干细胞。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞是选自以下的一种或多种标志物阳性的骨髓间充质干细胞：CD146、CD166和CD105。
本发明还提供一种体外非治疗性促进间充质干细胞向软骨细胞分化或提高干细胞的迁移能力的方法，所述方法包括用静磁场处理干细胞。
在一个或多个实施方案中，所述静磁场的强度为30-500mT，优选为 40-400mT、更优选为50-200mT，例如50mT、70mT、90mT、100mT、120mT、 150mT、180mT、200mT。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞和/或组织特异性干细胞；优选骨髓间充质干细胞。
在一个或多个实施方案中，所述干细胞是选自以下的一种或多种标志物阳性的干细胞：CD146、CD166和CD105。
本发明还提供SDF-1和/或CXCR4作为靶标在筛选用于治疗骨关节炎的药物中的用途。
本发明还提供上调SDF-1和CXCR4的表达或活性的试剂在制备用于治疗骨关节炎的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述试剂是包含SDF-1和/或CXCR4的编码序列的核酸分子或表达载体或含有所述核酸分子或表达载体的宿主细胞。
本发明具有以下有益效果：
使用静磁场治疗对骨关节炎患者无创、不会加重其已有损伤，对损伤较重行动不便的人群依从性良好。
附图说明
图1为骨关节炎小鼠手术造模示意图。A图为切断内侧副韧带(箭头所示)， B图为切除内侧半月板(箭头所示位于股骨下端和胫骨上端之间的内侧半月板已经切除)诱导创伤性骨关节炎。
图2为骨关节炎小鼠静磁场治疗示意图。A图为实验小鼠在静磁场治疗，静磁场的磁板放置在小鼠笼内的底部，B图为磁板放置在笼子底部的外面，C 图为磁板放置在小鼠笼子下面间隔2厘米。
图3为实验动物的内源性间充质干细胞静磁场治疗示意图。
图4为200mT静磁场修复早期骨关节炎小鼠关节软骨的损伤示意图。A 图为番红O染色的骨关节组织图片，B图为三组实验小鼠软骨的OARSI评分， C图为三组实验小鼠关节软骨细胞数，D图为小鼠关节软骨中的空泡细胞数， E图为钙化软骨/总软骨(CC/TAC)的比值。
图5为200mT静磁场治疗2周对骨关节炎小鼠Piezo1的影响。A&B图为免疫组化检测关节软骨组织中Piezo1的表达，C&D图为免疫荧光检测关节软骨组织中Piezo1的表达，E&F图为Western blot检测骨髓间充质干细胞中 Piezo1的表达水平。
图6为200mT静磁场促进软骨表面干细胞标志物CD146和CD166表达的示意图。A&B图为CD146关节软骨组织免疫组化染色和结果的定量分析， C&D图为CD166关节软骨组织免疫组化染色和结果的定量分析。箭头所指为 CD146和CD166阳性细胞。
图7为200mT静磁场促进软骨表面干细胞标志物CD146、CD166和 CD105表达的示意图。A&B图为CD146关节软骨组织免疫荧光染色和结果的定量分析，C&D图为CD166关节软骨组织免疫荧光染色和结果的定量分析，E&F图为CD105关节软骨组织免疫荧光染色和结果的定量分析。箭头所指为 CD146、CD166和CD105阳性细胞。
图8为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠促进内源性干细胞迁移示意图。 A图为内源性干细胞划痕实验代表性图像，B图为划痕恢复程度定量分析。
图9为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠促进内源性间充质干细胞迁移示意图。A图为内源性间充质干细胞transwell实验代表性图像，B图为干细胞迁移的定量分析。
图10为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠促进归巢因子SDF-1的表达水平示意图。A图为关节软骨组织中SDF-1免疫荧光，B图为免疫荧光结果的定量分析。箭头所指为SDF-1阳性细胞。
图11为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠促进骨关节炎的关节软骨中趋化因子CXCR4的表达水平示意图。A图为关节软骨组织中CXCR4免疫组化染色，B图为免疫组化结果的定量分析。箭头所指为CXCR4阳性细胞。
图12为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠促进骨关节炎的关节软骨细胞中趋化因子CXCR4的表达水平示意图。A图为Western blot检测关节软骨细胞中CXCR4的条带，B图为Western blot结果的定量分析。
图13为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠，静磁场通过SDF-1/CRCR4信号通路对骨髓间充质干细胞MSCs迁移的影响。通过transwell检测静磁场对MSCs迁移的影响及加入AMD3100(SDF-1/CXCR4信号通路的抑制剂)后的变化情况。A图为间充质干细胞transwell实验代表性图像，B图为MSCs迁移的定量分析。
图14为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠，静磁场对骨关节炎实验动物骨髓间充质干细胞软骨分化示意图。A图为实验动物经过200mT静磁场治疗2 周后，提取骨髓间充质干细胞软骨分化诱导后阿尔辛蓝Alcian Blue染色，B图为骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞数统计分析图。
图15为静磁场对骨关节炎小鼠的骨髓间充质干细胞软骨分化示意图。A 图为原代骨髓间充质干细胞软骨分化培养过程中实施200mT静磁场治疗4周，间充质干细胞软骨分化诱导后阿尔辛蓝Alcian Blue染色。B图为骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞数统计分析图。
图16为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠，静磁场对实验小鼠关节软骨中SOX9表达示意图。A图为关节软骨组织SOX9免疫组化染色，B图为免疫组化结果的定量分析。箭头所指为SOX9阳性细胞。
图17为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠，静磁场对实验小鼠关节软骨细胞中SOX9表达示意图。A图为Western blot检测关节软骨细胞中SOX9的条带，B图为Western blot结果的定量分析。
图18为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠，静磁场对实验小鼠关节软骨组织中MMP13表达示意图。A图为关节软骨MMP13免疫组化染色，B图为免疫组化结果的定量分析。箭头所指为MMP13阳性细胞。
图19为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠，静磁场对实验小鼠关节软骨组织中Collagen II表达示意图。A图为关节软骨Collagen II免疫组化染色，B 图为免疫组化结果的定量分析。箭头所指为Collagen II阳性细胞。
图20为200mT静磁场治疗骨关节炎小鼠，静磁场对实验小鼠关节软骨细胞中MMP13和Collagen II蛋白水平的影响。A图为Western blot检测MMP13 和Collagen II的条带，B图为MMP13的Western blot结果定量分析，C图为 Collagen II的Western blot结果定量分析。
具体实施方式
本发明发现，骨关节中存在着对疾病响应的关节组织特异性干细胞，激活机体内源性干细胞在骨关节炎治疗中起到重要作用。软骨损伤后，体内会自然招募内源性干细胞到损伤部位并参与修复，但损伤后内源性干细胞自然招募不足，局部关节微环境恶劣。此外，间充质干细胞的分化潜能受生物学因素和环境影响。
本发明证实，静磁场作为一种干细胞命运的调节器和骨骼关节再生的工具，对干细胞迁移富集和软骨分化起到重要的作用，可以有效用于骨关节炎治疗。磁的作用机制之一就是磁场力的作用，而磁场可以不变形地穿透非磁性物质，完全到达关节。本发明通过物理康复方法，激活组织特异性干细胞，充分利用人体自身的再生潜力来修复和再生受伤组织，同时避免外源性干细胞移植相关的限制。
本发明的目的是使用静磁场驱动的力学刺激，动员内源性干细胞治疗骨关节炎。本发明使用不同强度的静磁场，验证其通过动员机体的内源性干细胞治疗骨关节炎的疗效。
具体地说，本发明首先提供了一种静磁场在制备产品中的用途，所述产品用于促进干细胞向关节软骨细胞分化、提高干细胞向关节软骨损伤的表层区域的迁移或富集能力、或治疗骨关节炎。所述装置的磁感应强度随与其表面的距离增加呈指数递减。所述治疗骨关节炎包括但不限于：机械敏感离子通道 Piezo1表达水平增加、干细胞标志物CD146、CD166和CD105富集、归巢因子SDF-1表达水平增高、趋化因子CXCR4表达水平增强、SDF-1/CXCR4信号通路上调、软骨转录因子SOX9表达水平增加、软骨基质降解酶MMP13的表达水平降低、II型胶原特异性蛋白COL2(Collagen II)的表达水平增加。
本文中，干细胞包括间充质干细胞和组织特异性干细胞，例如骨髓间充质干细胞。
本文中，迁移指干细胞(特别是间充质干细胞或组织特异性干细胞)向关节软骨区域的移动。特别地，当软骨受损时，静磁场促进更多的干细胞向关节软骨损伤区域(例如，关节软骨损伤的表层区域)的迁移。本文中，关节软骨损伤的表层区域是指关节软骨损伤区域的软骨表面。
在一些实施方案中，所述静磁场由部件产生，所述部件包括磁板，所述磁板为位于同一平面的永磁体，由一个或多个交替插入的磁铁组成，磁极垂直于磁板表面。
所述一个或多个磁铁可以为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 个，所述磁铁的排布可以如图2的A-C所示。在一些实施方案中，所述磁板的磁感应强度可以通过磁铁和表面的距离进行控制。
在一些实施方案中，所述磁感应强度随磁铁与表面的距离增加呈指数递减，垂直于磁板表面处所述磁感应强度最大值为200-500mT，垂直磁板表面0-2cm 处所述磁感应强度最大值为50-200mT，垂直磁板表面2-5cm处所述磁感应强度最大值为0-50mT。
在优选的实施方案中，所述磁感应强度可以为30-500mT，优选为 40-400mT、更优选为50-200mT，例如50mT、70mT、90mT、100mT、120mT、150mT、180mT、200mT。
在一些实施方案中，磁铁的横截面可以是任何形状，例如长方形、圆形、椭圆形、矩形、三角形。如图2所示，在示例性实施方案的磁铁横截面可以为长方体，长度为250-350mm，宽度为100-200mm，高度为20-50mm；优选地，长度约310mm，宽度约130mm，高度约35mm。如图3所示，在示例性实施方案的圆形的圆柱形磁体中，磁铁的横截面也可以为圆柱体，直径为20-50mm，高度为2-20mm；优选地，直径约35mm，高度约10mm。
本文中，如图2所示，磁板的磁极方向不受限制。如图3所示，优选地，磁板的磁极方向为靠近磁板上表面为北极，远离上表面为南极。
间充质干细胞移植的疗效受到多种细胞因子和信号通路调控。SDF-1(基质细胞衍生因子-1)是重要的MSCs归巢因子，示例性序列如SEQ ID NO:1所示。SDF-1通过与软骨细胞的趋化因子CXCR4(示例性序列如SEQ ID NO:2 所示)结合，影响软骨细胞的迁移、富集、增殖、分化和成熟。在生理和病理条件下，SDF-1和CXCR4是两种重要的调节干细胞迁移、粘附和分化的细胞因子，通过激活SDF-1/CXCR4可以促进MSCs迁移。多项研究表明，SDF-1 促进MSCs的激活、迁移、归巢，CXCR4也是一种干细胞表面的趋化因子受体。SDF-1和CXCR4是促进干细胞迁移归巢重要生物轴，机械刺激通过 SDF-1/CXCR4促进了骨髓MSCs招募和迁移；超声联合SDF-1α增加了CXCR4 的表达、促进骨髓MSCs向OA大鼠软骨损伤部位的归巢。低强度脉冲超声通过增加OA大鼠SDF-1和CXCR4的表达，促进MSCs迁移和软骨的修复作用。本发明实施例证实了静磁场通过调控SDF-1/CXCR4促进内源性干细胞迁移富集。
因此，本发明还提供体外非治疗性上调软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞中SDF-1和/或CXCR4的表达水平的方法，所述方法包括用静磁场处理软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞。在一些实施方案中，静磁场处理后，SDF-1、 CXCR4在软骨细胞、软骨组织(其中的软骨细胞)和间充质干细胞中表达水平增高。
软骨转录因子SOX9在软骨形成中起着决定性的开关作用，能够通过诱导骨髓来源的MSCs软骨分化促进透明样软骨再生。骨关节炎的关节中包含有软骨细胞祖细胞和MSCs，在几个壁龛中有分化成软骨细胞的潜力，但却无法实现软骨再生。其失败的潜在机制之一是OA关节中的软骨细胞祖细胞和MSCs 缺乏软骨源性转录因子SOX9的活性。因此，补充外源性SOX9将重新激活这些干细胞分化成软骨细胞的潜力。并且，本发明实施例的动物实验也证实了 SOX9调控间充质干细胞向软骨细胞分化治疗OA。此外，SOX9在软骨细胞分化和调节细胞外基质沉积，尤其是II型胶原COL2(Collagen II)发挥重要作用。COL2是软骨分化的主要特异性蛋白，是SOX9的靶蛋白之一，SOX9为 COL2的激活剂。体外冲击波上调SOX9和COL2的表达治疗实验动物OA，跑步运动通过增加关节软骨COL2表达和抑制MMP13表达修复OA动物软骨；但是过度机械加载促进了软骨细胞去分化，减少了软骨分化基因SOX9、 aggrecan和COL2的表达。此外，MMP13是靶向软骨降解的主要酶。在示例性实施方案中，静磁场治疗后，所述转录因子SOX9表达水平、Collagen II的表达水平增加，MMP13的表达水平降低。
因此，本发明还提供体外非治疗性上调软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞中SOX9和/或Collagen II的表达水平的方法，或下调MMP13的表达水平的方法，所述方法包括用静磁场处理软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞。在一些实施方案中，静磁场处理后，SOX9、Collagen II在软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞中表达水平增高，MMP13在软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞中的表达水平下调。
此外，发明人发现，静磁场能提高软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞的机械敏感离子通道Piezo1的表达水平。因此，本发明还提供非治疗性上调软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞中Piezo1的表达水平的方法，所述方法包括用静磁场处理软骨组织、软骨细胞或间充质干细胞。
本发明还提供SDF-1和/或CXCR4作为靶标在筛选用于治疗骨关节炎的药物中的用途，以及，上调SDF-1和CXCR4的表达或活性的试剂在制备用于治疗骨关节炎的药物中的用途。所述试剂是包含SDF-1和/或CXCR4的编码序列的核酸分子或表达载体或含有所述核酸分子或表达载体的宿主细胞。
在知晓了SDF-1和/或CXCR4的氨基酸序列后，本领域技术人员容易获得其编码序列和含有该编码序列的核酸分子，例如通过PCR扩增法。本文中，编码序列指核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码多肽或蛋白的核酸分子的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核酸分子。
本发明所述的核酸分子可以多种方式被操作以保证蛋白表达。编码序列在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作，例如密码子优化。利用重组DNA方法来改变核酸分子序列的技术是本领域已知的。
构建表达载体而由细胞表达的方法涉及核酸构建物。本文的核酸构建物含有本文所述的核酸分子，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列、转录终止子序列、前导序列、在至少一种有机体中起作用的复制起点、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记，这些在本领域技术人员的知识范围内。
将基因引入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理(例如磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔)、化学(例如：胶体分散系统，包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)或生物学 (例如使用DNA载体、RNA载体或mRNA)手段转移入宿主细胞。
本文中，宿主细胞含有、表达和/或分泌本文所述的蛋白(例如SDF-1和 CXCR4)。宿主细胞既包括最终用于蛋白表达的细胞，也包括生产该细胞过程中使用到的各种工程细胞，如大肠杆菌细胞，以用于如提供本发明蛋白的编码序列或提供本文所述的载体。
以下将以具体实施例的方式对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和试剂。
实验与试剂
磁片：310mm长x130mm宽x35mm厚，35mm直径x10mm厚，中国上海磁铁。
数显特斯拉计，西安北成电子公司。
C57BL/6雌性小鼠，从中国人民解放军军事医学科学院动物中心购入。
VMR型小动物麻醉机，美国，Matrx。
石蜡切片机、烘片机，德国，Leica。
手术显微镜、普通光学显微镜、正置荧光显微镜、图像处理软件，日本， Olympus。
台式高速冷冻离心机、移液器、25mm2细胞培养瓶、离心管和吸头，德国，Eppendorf。
制冰机，美国，Grant。
二氧化碳细胞培养箱、细胞计数器、低温高速离心机、超低温冰箱，美国， Thermo。
细胞培养板、transwell小室，美国，Corning。
0.22μm一次性真空过滤器，美国，Millex。
电子天平、pH计，美国，Mettler Toledo。
垂直电泳仪、转膜仪，美国，Bio-Rad。
-80℃冰箱，日本，Sanyo。
液氮储存罐，美国，MVE47。
超净工作台，中国，苏州净化设备公司
化学发光成像系统，中国，上海勤翔科学仪器公司。
电控恒温水浴箱，中国，宁波新芝生物科技公司。
高压灭菌器，中国，上海申安公司。
摇床，中国，上海隆拓公司。
台式低速离心机，中国，湖南湘仪公司。
医用冷藏箱，中国，海尔公司。
电热恒温培养箱，中国，上海智城公司。
ST2细胞(小鼠骨髓基质细胞)，中国，通派(上海)生物科技有限公司。
抗体CD146、抗体CD166、抗体CD105、抗体SDF-1、抗体CXCR4、抗体SOX9、抗体Collagen II、抗体MMP13、抗体Piezo1，美国，Abcam。
MEM-α培养基、DMEM培养基、胎牛血清、II型胶原酶、0.25％胰蛋白酶、青链霉素，美国，Gibco。
II型胶原酶、Ficoll细胞分离液、二甲基亚砜(DMSO)、β-actin一抗、二甲基亚砜(DMSO)、阿利辛蓝、地塞米松、结晶紫，美国，Sigma。
蛋白Marker，美国，Thermo。
苏木素、伊红、番红O、快绿、水溶性树胶、抗荧光淬灭封片剂，中国，北京索莱宝公司。
免疫组化试剂盒、通用二步法试剂盒(小鼠/兔增强聚合物法检测系统)、荧光标记二抗、DAB显色试剂盒，中国，北京中杉金桥公司。
氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、正丁醇、氨水、福尔马林、二甲苯、硝酸银、铁氰化钾，中国，天津致远化学试剂公司。
异氟烷，中国，深圳瑞沃德公司。
实验方法
1、组织学实验：小鼠处死，膝关节组织取材，10％中性福尔马林固定48 小时，然后14％EDTA脱钙2周，石蜡包埋。石蜡切片，其厚度为5μm。分别采用苏木素-伊红(H&E)染色、番红O/快绿(Safranin O)染色、免疫组化、免疫荧光等染色。
组织学分析节软骨的病理变化：采用膝关节冠状位的石蜡切片进行番红 O/快绿染色，对关节软骨进行OARSI评分，测量软骨细胞数量、空泡的软骨细胞数量、透明软骨层、钙化软骨层、潮线等。
免疫组化：取膝关节的石蜡切片进行免疫组化，脱蜡和水化，内源性过氧化物酶阻断剂(通用二步法试剂盒(小鼠/兔增强聚合物法检测系统)；中杉金桥)孵育10min，加入一抗孵育(抗体Piezo1、抗体CD146、抗体CD166、抗体CXCR4、抗体SOX9、抗体MMP13、抗体Collagen II)过夜后，滴加反应增强液孵育20min，然后滴加强酶标山羊抗兔IgG聚合物孵育20min，滴加DAB 液孵育2-10min，复染。显微镜拍照，并测量分析。
免疫荧光：取膝关节的石蜡切片进行免疫荧光，脱蜡和水化，10％羊血清封闭30min，加入一抗(抗体Piezo1、抗体CD146、抗体CD166、抗体CD105、抗体SDF-1)4℃条件下孵育过夜后，滴加荧光二抗，室温避光孵育1.5h。PBS 漂洗后，加入DAPI染色液进行核染色，使用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。显微镜拍照，计数分析。
2、细胞学实验：
2.1原代骨髓细胞提取与培养：实验小鼠处死后快速分离股骨、胫骨和髂骨，股骨两端、胫骨两端以及髂骨髂窝处剪开，暴露骨髓腔，冲取骨髓，获得骨髓来源细胞，计数。用10％FBS的DMEM完全培养基重悬种板，细胞培养备用。
2.2内源性干细胞鉴定：接种细胞，使用干细胞标记物CD146、CD166、 CD105孵育，DAPI染核，在荧光显微镜下观察并拍照，分别使用不同通道拍摄绿色荧光(CD146、CD166、CD105)和蓝色荧光(细胞核)，并Merge图像。
2.3间充质干细胞划痕实验
1)使用第三代的骨髓间充质干细胞或者ST2细胞，2×106/孔细胞种板至6 孔板，每孔用移液枪加入2ml完全培养基。显微镜下观察细胞状态并转移至细胞培养箱。间充质干细胞在6孔板中生长接近至100％，用200μl移液器枪头在板子底部等距直线划痕，每孔划3条。
2)使用1×PBS溶液清洗两次细胞，以去除漂浮细胞。
3)将孔板放在显微镜下，在镜下100×视野下观察划痕部位，并拍照记录。
4)将细胞放入细胞培养箱中继续培养24h，在相同划痕部位第二次拍照。
5)在显微镜下观察划痕恢复情况、拍照及测量，在软件中对划痕前后的面积进行测量，并进行面积差值计算，最后做统计学分析。
2.4间充质干细胞transwell迁移实验
1)在24孔板transwell小室(小孔直径8μm)中，将transwell小室的上室夹出来，在下室加入500μl含10％FBS的完全培养基。
2)将培养至第三代的骨髓间充质干细胞，按照2×104/孔的数量种板至24 孔板transwell小室的上室中，每孔用移液枪加入100μl无FBS的培养基， AMD3100处理组将AMD3100以10μg/ml的浓度加入到transwell上室和间充质干细胞共同孵育，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h。
3)在24孔板中加入500μL 10％福尔马林溶液，并将transwell小室提起放置于此进行固定，室温静置30min。
4)在24孔板中加入500μl 0.5％结晶紫染液，并将transwell小室提起放置于此进行固定，室温静置30min。
5)将小室上室提起，用镊子夹着在水杯中清洗直至水不再变蓝色，然后用医用棉签沿着小室底部内膜顺时针方向擦去没有迁移过去的细胞。
6)用手术刀沿着小室边缘将底膜切下，细胞朝下置于载玻片上，蒸馏水封片。
7)在显微镜下观察染色情况、拍照及计数细胞数目，计算在视野内阳性染色的细胞个数，并进行统计学分析。
2.5软骨细胞分化实验
1)分别将培养至第三代的骨髓间充质干细胞种于六孔板中，每孔2ml含 10％FBS的MEM-α完全培养基，其中细胞为2×106/孔。
2)软骨形成培养基包含：10％FBS+1％青链霉素+5μg/ml抗坏血酸+ 10mMβ-甘油磷酸盐+10nM地塞米松+10ng/ml TGF-β3以及MEM-α培养基。
3)显微镜下观察瓶中细胞状态并转移至细胞培养箱中，隔天换液，共诱导培养4周。
4)4周后将细胞进行阿尔辛蓝Alcian Blue染色(配制1％Alcian Blue染液： 0.1gAlcian Blue加HCl 100μl加蒸馏水10ml，摇匀后备用)。
5)在显微镜下观察，400×下随机选择视野拍照，观察骨髓间充质干细胞向软骨分化情况。
3、分子生物学实验：Western blot蛋白印迹实验
分别提取实验小鼠膝关节组织、软骨细胞和骨髓间充质干细胞的蛋白，实施蛋白定量，采用一抗Piezo1、CXCR4、SOX9、MMP13、Collagen II，β-actin 作为对照，使用免疫印迹法检测蛋白条带，通过Image J软件对各组蛋白条带灰度值进行分析。
实施例1：建立骨关节炎动物模型
1.1实验设计：本实施例使用C57BL/6雌性小鼠(体重20g左右，14周龄) 用来验证静磁场对骨关节炎小鼠的疗效和分析作用机制。将150只小鼠随机进行分组，其中分别为假手术的正常对照组(Sham，n＝30)，骨关节炎造模组 (OA，n＝30)和静磁场治疗组(OAS，n＝90)，其中静磁场分为3种不同强度的磁场强度(磁感应强度)，每组30只动物。
1.2骨关节炎小鼠模型：C57BL/6雌性小鼠适应喂养1周后，进行内侧半月板-胫骨韧带切除术(DMM)手术造模，膝关节内侧副韧带横断，切除内侧半月板造成关节不稳，进而诱导骨关节炎形成。实施手术日，使用75％酒精对手术台以及手术显微镜进行消毒。在小鼠膝关节及其周围进行备皮，之后使用 1.5％异氟烷对小鼠实施吸入性麻醉，氧气流速为1.0L/min，将小鼠置于仰卧位，使用75％酒精棉签对其膝关节部位擦拭消毒后，在膝关节内侧切开1.5厘米切口，钝性分离肌肉层和筋膜层，暴露并剪横断内侧副韧带。打开关节腔后，在手术显微镜下找到内侧半月板并切除(图1)。用生理盐水冲洗创面，最后对齐表皮后进行缝皮。小鼠在术后切口处使用丁丙诺啡盐酸盐镇痛抗感染，连用 3天。对Sham组的小鼠在不切除内侧副韧带和半月板的情况下，实施同样的操作。
实施例2：通过体内、体外实验筛选静磁场治疗方案
2.1通过多种强度的静磁场动物治疗，筛选最佳治疗条件：本实施例的实验骨关节炎小鼠暴露在永磁体提供的三种磁场强度的静磁场中。永磁体是由交替插入的16个磁铁组成，磁极(北方或南方；N或S)朝上，被分别放置在实验动物笼子内的底部、笼子底部的下方、笼子下方间隔2厘米处。通过控制磁板和骨关节炎小鼠之间的距离来确定所需的磁场强度，使用数显特斯拉计确认实验动物所接受的静磁场强度，分别对应磁场强度200mT、100mT、50mT，持续2周(图2)。
2.2干细胞培养过程中实施多种强度的静磁场治疗，进一步验证最佳治疗条件和作用机制：为了在体外细胞培养过程中实施静磁场驱动的力学刺激治疗，使用6孔细胞培养板组装了静磁场治疗装置，使细胞在培养的过程中，暴露于北方磁场。本实施例实施三种强度的静磁场，通过控制磁铁和培养板之间的距离来确定所需的磁场强度，分别对应磁场强度200mT、100mT、50mT三个亚组。简而言之，内源性骨髓间充质干细胞(MSCs)放置在上面的6孔细胞培养板培养，静磁场的圆柱形磁体放置在细胞培养板下面的另外一个6孔细胞培养板内。通过控制磁铁和培养皿之间的距离来确定所需的磁场强度，使用数显特斯拉计确认培养细胞所接受的静磁场强度，分别对应磁场强度200mT、 100mT、50mT三个亚组。根据实验结果，筛选最佳的磁场条件。本实施例的体外实验是在原代骨髓间充质干细胞和ST2细胞(小鼠骨髓基质细胞)培养中实施静磁场治疗干预(图3)。
如下述实施例所述，通过划痕实验、transwell迁移实验、软骨细胞分化实验结果，磁场强度200mT的效果好于100mT和50mT。
实施例3：验证静磁场对骨关节炎的治疗效果
使用2周骨关节炎小鼠，通过膝关节番红O/快绿染色，发现假手术的正常对照组(Sham)的软骨表面光滑完整，软骨细胞外基质内未出现蛋白聚糖丢失现象。但是，骨关节炎组(OA)在手术诱导后2周时软骨表面粗糙，表现出大量蛋白聚糖丢失和软骨细胞明显减少(图4，A)。OARSI评分显示：与 Sham组相比，OA组的OARSI评分显著增加(p<0.001)；但是，通过2周的静磁场治疗后，治疗组(OAS)OARSI评分显著降低(p<0.01；图4，B)，蛋白聚糖丢失现象也明显减轻。
本实施例检查了实验小鼠的软骨细胞数量和空泡细胞数量。与正常对照组相比，骨关节炎组的软骨细胞数量明显减少(p<0.001)；然而，在静磁场治疗之后，软骨细胞的数量显著增加(p<0.001；图4，C)。同时，与正常对照组相比，骨关节炎组的空泡细胞数量明显增加(p<0.001)；在静磁场治疗之后，这些细胞的数量显著减少(p<0.001；图4，D)。因此，持续的200mT 中等强度静磁场暴露显著改善了骨关节炎软骨的微细结构，改善骨关节炎小鼠软骨退化。
本实施例还检测了2周骨关节炎小鼠的软骨病变和200mT中等强度静磁场治疗的修复情况。结果表明，骨关节炎组(OA)钙化软骨(CC)的厚度增加，而透明软骨(HC)的厚度则随着潮线上移减少。但是，钙化的软骨厚度通过静磁场治疗得以降低。统计分析结果表明，OA组的CC/TAC值明显高于Sham组(p<0.001)；经过2周的静磁场治疗后，CC/TAC的比值显著降低(p <0.001；图4，E)。
实施例4：静磁场对机械敏感离子通道Piezo1的影响
采用2周骨关节炎小鼠，OA造模手术后实施200mT中等强度静磁场驱动的力学刺激治疗。关节软骨的免疫组化和免疫荧光结果表明，静磁场治疗显著增加了软骨细胞中Piezo1表达(图5，A-D)。实验动物提取并培养的骨髓间充质干细胞的Western blot结果显示，静磁场治疗也显著增加了骨髓间充质干细胞中Piezo1表达(图5，E&F)。本实施例结果证实，在OA治疗中静磁场的疗效与Piezo1密切相关。
实施例5：静磁场增加软骨表面干细胞标志物CD146、CD166和CD105 的表达
5.1本实施例通过免疫组化检测关节软骨表面的干细胞标志物CD146和 CD166。结果显示，与正常对照组相比，OA组软骨表面的干细胞标志物CD146 和CD166明显升高(p<0.001)，而200mT中等强度静磁场进一步增加了干细胞标志物的表达水平，并且促进了CD146和CD166阳性细胞向关节软骨损伤区域的软骨表面富集(p<0.001；图6)。
5.2免疫荧光实验进一步验证了静磁场促进了干细胞标志物CD146、 CD166和CD105阳性细胞向关节软骨损伤区域的软骨表面富集(p<0.001；图7)。本实验的组织学干细胞特异性标记证实，在骨关节炎小鼠实验中，200mT 中等强度静磁场治疗能够有效的动员机体的内源性干细胞并促进其向软骨破坏的表层区域迁移。
实施例6：静磁场促进内源性干细胞的迁移富集
6.1划痕实验检测静磁场促进内源性干细胞的迁移
本实施例检测了静磁场对骨髓间充质干细胞的迁移能力的影响，我们使用三组小鼠提取并培养的骨髓间充质干细胞进行了细胞划痕实验。与正常对照组相比，骨关节炎组增强了骨髓间充质干细胞的划痕恢复能力，而200mT中等强度静磁场进一步促进了划痕恢复程度(图8)。
6.2Transwell迁移实验检测静磁场促进内源性干细胞的迁移
本实施例进一步验证了静磁场对骨髓间充质干细胞的迁移能力的影响，使用三组小鼠提取并培养的骨髓间充质干细胞进行了transwell迁移实验。与正常对照组相比，骨关节炎组增加了骨髓间充质干细胞的迁移数目，而200mT中等强度静磁场进一步增加了细胞迁移数目(图9)。
实施例7：静磁场增强归巢因子SDF-1和趋化因子CXCR4的表达水平
7.1静磁场增加归巢因子SDF-1的表达水平
本实施例通过免疫荧光实验检测了小鼠关节软骨表面SDF-1的表达水平，解析了静磁场影响内源性干细胞迁移的作用机制。结果显示，与正常对照组相比，OA造模组SDF-1的表达水平增高，而200mT中等强度静磁场治疗后OA 小鼠关节软骨中SDF-1表达水平进一步增加(图10)。
7.2静磁场增加趋化因子CXCR4的表达水平
本实施例进一步检测了200mT中等强度静磁场促进趋化因子CXCR4的表达水平，免疫组化染色结果表明，静磁场显著增强了CXCR4在关节软骨中的表达(图11)。通过Westernblot，进一步验证了静磁场显著增强CXCR4在关节软骨中的表达水平(图12)。
本实施例结果提示，200mT中等强度静磁场刺激膝关节软骨组织中 SDF-1/CXCR4的表达，其作用机制与静磁场驱动力学刺激促进了机体内源性间充质干细胞迁移相关。
实施例8：静磁场对SDF-1/CXCR4信号通路的影响
使用2周OA小鼠，实施200mT中等强度静磁场治疗。取静磁场治疗后的骨髓间充质干细胞(MSCs)，使用transwell实验分析MSCs的迁移能力。结果表明，特异性CXCR4的拮抗剂AMD3100(SDF-1/CXCR4信号通路的抑制剂)显著抑制了MSCs迁移(图13)。
本实施例结果提示，SDF-1/CXCR4的表达与静磁场促进机体内源性间充质干细胞迁移密切相关。
实施例9：静磁场增加骨关节炎软骨细胞分化的体内、体外实验
9.1静磁场促进骨关节炎小鼠软骨分化
本实施例为了探究中等强度静磁场治疗对骨关节炎小鼠软骨分化的影响，使用2周OA实验小鼠，实施200mT中等强度静磁场治疗。收集骨髓间充质干细胞进行了4周的软骨细胞分化实验。阿尔辛蓝Alcian Blue染色结果表明，与正常对照组相比，骨关节炎组分化软骨细胞数量明显减少。然而，2周的静磁场治疗后，治疗组小鼠分化的软骨细胞数目得到显著增加(图14)。
9.2体外实验检测静磁场对骨关节炎小鼠软骨分化的影响
本实施例为了进一步验证中等强度静磁场暴露对软骨分化的影响，对骨关节炎小鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中进行了持续体外静磁场暴露4周治疗。AlcianBlue染色结果表明，200mT中等强度静磁场显著增加了骨髓间充质干细胞的软骨分化(图15)。
实施例10：静磁场增加软骨转录因子SOX9的表达水平
10.1本实施例使用免疫组化染色测定了骨关节炎小鼠膝关节软骨区域 SOX9的表达情况。结果显示，与正常对照组相比，骨关节炎组关节软骨组织中软骨细胞SOX9的阳性表达明显降低，而200mT静磁场治疗组SOX9的含量显著升高(图16)。
10.2本实施例使用蛋白印迹分析进一步检测了骨关节炎小鼠膝关节软骨组织SOX9的表达情况。Western blot结果显示，与正常对照组相比，骨关节炎组关节软骨组织中软骨细胞SOX9的阳性表达明显降低，而静磁场治疗组 SOX9的含量显著升高(图17)。
实施例11：静磁场降低靶向软骨降解的主要酶MMP13的表达水平
本实施例采用2周OA小鼠，实施200mT静磁场治疗，使用免疫组化检测。结果表明，与正常对照组相比，OA模型组的关节软骨中MMP13水平明显增加；然而，静磁场显著抑制了MMP13的异常升高(图18)。
实施例12：静磁场增加软骨分化的主要特异性蛋白Collagen II的表达水平
12.1本实施例为了研究中等强度静磁场暴露对骨关节炎小鼠软骨细胞外基质的影响，采用2周OA小鼠，实施200mT静磁场治疗。使用免疫组化检测关节软骨中II型胶原Collagen II的情况。结果表明，与正常对照组相比， OA模型组的关节软骨中Collagen II明显降低；但是，静磁场显著抑制了 Collagen II的异常降低(图19)。
12.2本实施例通过蛋白印迹分析技术进一步检测了关节软骨组织中 MMP13和Collagen II的表达水平。Western blot结果表明，骨关节炎组的MMP13较假手术的正常对照组明显增加，而Collagen II较假手术的正常对照组明显降低；静磁场治疗组显著抑制了MMP13的异常升高，并且增加了 Collagen II的表达水平(图20)。
本发明证实：适宜的静磁场(200mT)有效动员内源性干细胞修复关节软骨损伤治疗骨关节炎，在骨关节炎治疗中静磁场的疗效与Piezo1密切相关；静磁场通过SDF-1/CXCR4信号轴促进内源性干细胞迁移富集到关节软骨损伤的表层区域；静磁场通过SOX9和COL2增强内源性干细胞软骨分化，通过降低 MMP13抑制关节软骨退化。
本文序列
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Claims (10)

1.一种静磁场或能产生静磁场的部件在制备产品中的用途，所述产品用于促进间充质干细胞向关节软骨细胞分化、提高干细胞向关节软骨损伤区域的迁移能力、或治疗骨关节炎，
优选地，所述静磁场的磁感应强度为30-500mT，更优选为40-400mT。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述关节软骨损伤区域是关节软骨损伤的表层区域，
优选地，所述产品是试剂盒或装置，例如静磁场装置、可穿戴装置。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述部件包括磁板，所述磁板包含位于同一平面的一个或多个永磁体，每个永磁体的磁极垂直于磁板表面，所述永磁体优选为长方体；或者，所述部件包括圆柱形永磁体，
优选地，通过细胞或骨关节与部件之间的距离控制其所接受的磁感应强度。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述干细胞是间充质干细胞和/或组织特异性干细胞，例如骨髓间充质干细胞，
优选地，所述干细胞是选自以下的一种或多种标志物阳性的骨髓间充质干细胞：CD146、CD166和CD105。
5.一种体外非治疗性上调软骨细胞或干细胞中选自以下的一种或多种基因的表达水平的方法：SDF-1、CXCR4、SOX9、Piezo1、Collagen II，或下调软骨细胞或干细胞中MMP13的表达水平的方法，所述方法包括用静磁场处理软骨细胞或间充质干细胞，
优选地，所述静磁场的磁感应强度为30-500mT，更优选为40-400mT。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述干细胞是间充质干细胞和/或组织特异性干细胞，例如骨髓间充质干细胞，
优选地，所述干细胞是选自以下的一种或多种标志物阳性的骨髓间充质干细胞：CD146、CD166和CD105。
7.一种体外非治疗性促进干细胞向软骨细胞分化或提高干细胞的迁移能力的方法，所述方法包括用静磁场处理干细胞，
优选地，所述静磁场的磁感应强度为30-500mT，更优选为40-400mT。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述干细胞是间充质干细胞和/或组织特异性干细胞，例如骨髓间充质干细胞，
优选地，所述干细胞是选自以下的一种或多种标志物阳性的骨髓间充质干细胞：CD146、CD166和CD105。
9.SDF-1和/或CXCR4作为靶标在筛选用于治疗骨关节炎的药物中的用途。
10.上调SDF-1和CXCR4的表达或活性的试剂在制备用于治疗骨关节炎的药物中的用途，
优选地，所述试剂是包含SDF-1和/或CXCR4的编码序列的核酸分子或表达载体或含有所述核酸分子或表达载体的宿主细胞。
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