ES2357235T3 - Compuestos macrocíclicos defindos especialmente útiles para el descubrimiento de fármacos. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene la estructura de la fórmula II: **Fórmula** en la que W, A 1, A 2, A 3 y T se definen como sigue con los NH de A 1 unidos a T, los C=O de A 1 unidos a los NH de A 2, los C=O de A 2 unidos a los NH de A 3, los C=O de A 3 unidos a W, y (W) y (A 1) indican el sitio de la unión de T a W y A 1 respectivamente: **Fórmula**
Description
Esta invención se refiere a compuestos macrocíclicos definidos espacialmente con elementos específicos de control conformacional. También se refiere a la generación de bibliotecas de estos macrociclos. Estas bibliotecas se usan luego para seleccionar una o más especies de macrociclos que exhiben interacción específica con una diana biológica particular.
Entre la diversidad de compuestos que se ha encontrado que poseen coherentemente actividad biológica potente y selectiva hay productos naturales y péptidos. Efectivamente, miembros de estas clases han llegado a ser agentes farmacéuticos útiles. Desafortunadamente, cada tipo tiene limitaciones que han restringido la utilidad más amplia de estas estructuras.
De hecho, los productos naturales a menudo tienen estructuras extremadamente complejas que son difíciles de sintetizar, particularmente en la modalidad combinatoria que proporcionaría acceso a un número mayor de análogos con los que definir elementos farmacofóricos y explorar del mejor modo la modulación de las propiedades biológicas del compuesto progenitor. Sin embargo, algunos esfuerzos han tenido éxito en la construcción de bibliotecas que contienen un modesto número de análogos.
Por otra parte, los péptidos han estado en la vanguardia del desarrollo de la química combinatoria debido a su facilidad de síntesis sobre soporte sólido, las reacciones reproducibles y de alto rendimiento implicadas, y la disponibilidad fácil de los materiales de partida. Siendo los péptidos los ligantes endógenos para un cierto número de enzimas y receptores, se puede realizar su modificación para desarrollar agonistas e inhibidores de los mismos receptores y enzimas, incluso más potentes. Además, se han usado bibliotecas combinatorias de péptidos para encontrar cierto número de secuencias activas desconocidas previamente para una amplia matriz de sistemas de enzimas y receptores.
Sin embargo, los compuestos peptídicos están plagados de las limitaciones habituales asociadas con el uso directo de péptidos como productos farmacéuticos, que incluyen la rápida degradación metabólica por proteasas, corto período de semidescomposición farmacocinética, dificultad en el transporte al sitio de acción en tejidos y órganos, escasas biodisponibilidad y solubilidad orales, potencial antigenicidad, así como elevados costes de fabricación.
No obstante, la naturaleza de los péptidos, densamente funcionalizados y estructuralmente diversificados, es ventajosa cuando se investigan nuevas moléculas de fármacos. Por lo tanto, se usan principalmente péptidos como punto de partida o plantilla para el desarrollo de nuevas iniciativas farmacéuticas que a menudo dan como resultado estructuras que solamente recuerdan parcialmente, si lo hacen, al péptido activo inicial. En particular, el potencial de reconocimiento de las cadenas laterales de aminoácidos ha dado como resultado intentos de incorporar estas cadenas laterales en armazones rígidos no peptídicos que intentan duplicar la disposición conformacional requerida para interacción óptima entre la molécula y la diana, así como proteína estándar mimética y elementos estructurales secundarios del péptido. Por ejemplo, se han explotado azúcares y anillos aromáticos como armazones rígidos que contienen aminoácidos o análogos como restos colgantes en una o más posiciones. En los documentos U.S. 5.646.285 (publicado el 8 de Julio de 1997) y U.S. 5.891.737 (publicado el 6 de Abril de 1999) se han descrito compuestos y bibliotecas combinatorias que utilizan pirrolidinas sustituidas en posiciones 3 y 4 como plantilla central para disposición de funcionalidad interactiva.
En otra aproximación, las estructuras cíclicas pueden mejorar mucho los perfiles farmacológicos y farmacocinéticos de péptidos (Molecular Diversity 2000 (pub. 2002), 5.289.304). Análogos de péptidos cíclicos ofrecen varios beneficios en comparación con los análogos lineales correspondientes, que incluyen movilidad conformacional restringida, topología definida, estabilidad mejorada a enzimas proteolíticas y polaridad modificada. Además, los péptidos cíclicos pueden mejorar la potencia, selectividad, estabilidad, biodisponibilidad y permeabilidad de membrana. La estabilidad de la estructura cíclica a la degradación enzimática surge como consecuencia de la dificultad de las moléculas de este tipo para alcanzar la configuración extendida que se requiere para que sean reconocidas como sustrato para peptidasas. En el documento WO 98/54577 (publicado el 3 de Diciembre de 1998) se han descrito bibliotecas de compuestos muy grandes (108 miembros o más).
Sin embargo, a menudo los anillos más grandes son demasiado flexibles y pueden ocupar demasiadas conformaciones para que sean útiles. Además, su tamaño molecular y sus características fisicoquímicas resultantes no se ajustan a los requisitos típicos para ser "de tipo fármaco". Péptidos cíclicos pequeños que contengan los residuos interactivos esenciales pueden proporcionar la restricción conformacional necesaria, pero puede que tengan otros inconvenientes, que incluyen dificultad de síntesis, facilidad de dimerización, cadena de anillo desfavorable causada por la presencia de los enlaces amida trans preferidos, falta de estabilidad al metabolismo y la hidrólisis para liberar esa cadena y limitada diversidad topológica.
La mayor parte de la atención en química combinatoria se ha dedicado a producir diversidad en términos de composición química. Sin embargo, esencialmente no se han dirigido esfuerzos a integrar esto con diversidad en términos de la estructura tridimensional crucial.
El uso de ciertos elementos de amarre para controlar la conformación se reseñó en el documento WO 01/25257. Sin embargo, aun cuando estos amarres tuvieron éxito en restringir la disposición conformacional de la molécula, solamente fueron capaces de duplicar una porción de la región espacial accesible a la molécula lineal, que puede contener cientos, si no miles, de conformaciones posibles. Para cubrir mejor el espacio conformacional disponible, se requieren elementos de amarre adicionales que definan nuevas conformaciones. Además, los amarres en el informe previo generalmente eran de naturaleza hidrófoba. Esto tiene efecto en propiedades esenciales de las moléculas macrocíclicas tales como solubilidad y log P que se sabe que tienen impacto sobre las propiedades farmacológicas del compuesto, en particular biodisponibilidad oral. Además, a menudo se requiere la variación de estas propiedades fisicoquímicas a fin de optimizar una característica deseada de una molécula como agente terapéutico. Asimismo, los primeros amarres estaban bastante limitados en cuanto a su funcionalidad química. Como esta parte de la molécula también podría tener interacciones con una diana biológica además de su función de control conformacional, una diversidad mayor en los grupos químicos funcionales se podría demostrar ventajosa. Los amarres químicamente más diversos de la presente invención han sido diseñados por lo tanto para resolver estas limitaciones de la técnica existente y proporcionar los siguientes beneficios:
- *
- Acceso a conformaciones previamente inaccesibles
- *
- Modificación de parámetros fisicoquímicos
- *
- Mejora del perfil farmacocinético
- *
- Funcionalidades interactivas adicionales para modulación de actividad biológica
La evidencia creciente sugiere que la rigidez molecular confiere propiedades farmacocinéticas favorables a las moléculas y conduce a un mejor éxito clínico (J. Med. Chem. 2003, 46, 1250¬1256;
J. Med. Chem. 2002, 45, 2615-2623). Por lo tanto los amarres de la presente invención serán extremadamente útiles para utilizar estas moléculas macrocíclicas en la investigación de nuevos productos farmacéuticos. Se proporcionan ejemplos de la actividad que ha sido exhibida por moléculas representativas de la invención.
Por lo tanto, sigue habiendo necesidad de entidades químicas específicamente diseñadas, construidas sobre un marco macrocíclico, que exploten los cambios de conformación tridimensional desencadenados por modificaciones peptídicas y/o por inserción de porciones específicas de tipo amarre, en su esqueleto macrocíclico.
La presente invención se dirige hacia compuestos macrocíclicos definidos espacialmente que incorporan elementos de control conformacional a fin de limitar su estructura tridimensional a un pequeño número de orientaciones espaciales.
Estos compuestos se definen mediante la fórmula (II):
en la que W, A1, A2, A3 y T se definen como sigue con los NH de A1 unidos a T, los C=O de A1 unidos a los NH de A2, los C=O de A2 unidos a los NH de A3, los C=O de A3 unidos a W, y (W) y (A1) indican el sitio de la unión de T a W y A1 respectivamente:
Las bibliotecas de estos compuestos se usan luego para seleccionar una o más especies de macrociclos que exhiben interacción específica con una diana biológica particular. Dianas de este tipo incluyen enzimas y receptores. Más particularmente, las bibliotecas macrocíclicas de la invención sirven como fuente fácilmente accesible de diversos compuestos macrocíclicos para uso en la identificación de nuevos compuestos macrocíclicos biológicamente activos a través de análisis de escrutinio de candidato farmacéutico, para uso en estudios que definen correlaciones de estructura/ actividad, y/o para uso en investigación clínica.
En particular, se describen compuestos de fórmula (II) como agonistas o antagonistas de un receptor de motilina de mamífero y un receptor de grelina de mamífero.
La Figura (I) es un esquema general que muestra una aproximación a la síntesis en fase sólida de compuestos de la invención.
La Figura (II) es un esquema general que muestra una segunda aproximación a la síntesis en fase sólida de compuestos de la invención.
Las Figuras 3-17 son esquemas de síntesis que muestran rutas para amarres (T) específicos que se usan para la síntesis de compuestos de la invención.
Los compuestos macrocíclicos de la presente invención incorporan una diversidad de amarres, que permiten con ello la cobertura de una sección específica de espacio conformacional. Además, estos amarres se seleccionan sobre la base de su capacidad para producir sintéticamente macrociclos con rendimiento razonable en un amplio intervalo de secuencias. Por consiguiente, los compuestos de la invención, que incorporan estos amarres, representan una amplia diversidad de conformaciones diferentes, con algunas más rígidas y otras más flexibles. Además, algunos de estos amarres son mucho más rígidos en su conformación, presentando algunas veces esencialmente sólo una forma de baja energía. En estos casos, los resultados biológicos mejorados proporcionarían excelente información sobre la conformación bioactiva específica óptima. Adicionalmente, en contraste con muchas aproximaciones tradicionales, en este proceso de optimización se emplean las mismas rutas y métodos de síntesis. La capacidad para acceder rápidamente a este tipo de información transforma lo que es habitualmente una tarea extremadamente difícil y larga en una empresa mucho más directa.
Como tal, esta invención permite la investigación simultánea de diversidad química y conformacional dentro de un marco estructural único y por lo tanto posee gran potencial para uso en el aumento de la velocidad y la eficacia de la investigación orientada hacia nuevos productos farmacéuticos.
Estos compuestos se definen mediante la fórmula (II):
en la que W, A1, A2, A3 y T se definen como sigue con los NH de A1 unidos a T, los C=O de A1 unidos a los NH de A2, los C=O de A2 unidos a los NH de A3, los C=O de A3 unidos a W, y (W) y (A1) indican el sitio de la unión de T a W y A1 respectivamente:
La presente invención tiene aplicabilidad a un amplio intervalo de dianas biológicas que representan asimismo diversas indicaciones terapéuticas. Los compuestos activos inicialmente generados se podrían optimizar y refinar para proporcionar eventualmente candidatos clínicos importantes. Una ventaja adicional de la invención es que estas etapas posteriores en el proceso de optimización se pueden llevar a cabo utilizando la misma senda de síntesis química básica, simplificando mucho y acelerando por lo tanto la que típicamente es una fase extremamente consumidora de tiempo en el proceso general de descubrimiento de fármacos.
En particular, la invención proporciona compuestos de fórmula (II) que son agonistas o antagonistas de un receptor de motilina de mamífero y/o un receptor de grelina de mamífero.
La motilina, un péptido lineal de 22 aminoácidos, desempeña un papel regulador crítico en el sistema fisiológico gastrointestinal (GI) por medio del gobierno de la actividad motora gastrointestinal en el ayuno. Como tal, el péptido se libera periódicamente de la mucosa duodenal durante el ayuno en los mamíferos, incluyendo los seres humanos. Más precisamente, la motilina ejerce un poderoso efecto sobre la motilidad gástrica por medio de la contracción del músculo liso gastrointestinal para estimular el vaciado gástrico, disminuir el tiempo de tránsito intestinal e iniciar la fase III del complejo motor de migración en el intestino delgado. Debido a la implicación crítica y directa de motilina en el control de la motilidad gástrica, los agentes que disminuyen (hipomotilidad) o mejoran (hipermotilidad) la actividad en el receptor de motilina, son un área particularmente atractiva para la investigación adicional en la búsqueda de nuevos productos farmacéuticos eficaces hacia estas indicaciones. Se describen antagonistas macrocíclicos del receptor de motilina en el documento de U.S. Prov. Pat. Appl. Ser. Nº 60/479.223, (WO 2004/111077, publicado el 23 de Diciembre de 2004).
Asimismo, la grelina es una hormona peptídica esencial implicada en cierto número de funciones fisiológicas importantes que incluyen secreción de hormona del crecimiento, mantenimiento del equilibrio de energía, apetito y motilidad intestinal. Se han investigado, como tales, los antagonistas de este receptor para tratamiento de obesidad, mientras que los agonistas de grelina tienen interés en el tratamiento de diversas enfermedades, que incluyen dolencias causadas por deficiencia de hormona del crecimiento, síndrome de desgaste, y trastornos GI implicando dismotilidad.
Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Glu-Arg-Met-Gln-Glu-Lys-Gln-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln
motilina (humana, porcina)
Gly-Ser-Ser(oct)-Phe-Leu-Ser-Pro-Gln-His-Gln-Arg-Val-Gly-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg
grelina (humana)
Procedimiento de síntesis
Se puede usar una gama de estrategias de síntesis, que implica técnicas tanto en disolución como en fase sólida, para obtener los compuestos macrocíclicos de la invención, varios de los cuales se han descrito ya en el documento WO 01/25257.
En la Figura (I) se proporciona un resumen de una primera aproximación a la síntesis en fase sólida de los compuestos de la invención, usando una estrategia de conector de tioéster. Una segunda aproximación, denominada metátesis de cierre de anillo (RCM), se resume también en general en la Figura (II).
En ambas, la construcción implica cuatro fases: la primera es la síntesis de los bloques de construcción, que comprenden principalmente elementos de reconocimiento para interacción en las dianas biológicas, más el resto de amarre esencial, principalmente para control y definición de conformación. Estos bloques de construcción se ensamblan unos con otros, típicamente de manera secuencial, en una segunda fase que emplea transformaciones químicas estándar y aquellas que se describen en los Procedimientos Estándar en este documento. Los precursores del ensamblaje se hacen cíclicos a continuación en la tercera fase, que podría implicar varios pasos, para proporcionar las estructuras macrocíclicas. Finalmente, una etapa de proceso posterior a la ciclación que implica la retirada de los grupos protectores y opcional purificación proporciona a continuación los compuestos finales deseados.
Información general
Los reactivos y disolventes fueron de calidad reactivo o mejor y se usaron tal como de recibían de los diversos proveedores comerciales salvo que se indique otra cosa. DMF, DCM, DME y THF que se usaron eran de DriSolv® (EM Science, E. Merck) o nivel de calidad de síntesis excepto para (i) desprotección, (ii) reacciones de terminación de molécula de resina y (iii) lavado. NMP usado para las reacciones de acoplamiento de aminoácidos (AA) es de calidad analítica. Se desgasificó adecuadamente DMF colocándola al vacío durante un mínimo de 30 minutos antes de usarla. Se obtuvieron aminoácidos protegidos por Boc y Fmoc y derivados protegidos por la cadena lateral, que incluyen los de aminoácidos de N-metilo y no naturales, a partir de proveedores comerciales o se sintetizaron por tecnologías estándar conocidas por los expertos en la técnica. Los aminoácidos ddz o bien fueron sintetizados por procedimientos estándar o bien se obtuvieron comercialmente de Orpegen (Heidelberg, Alemania) o Advanced Chem. Tech (Louisville, KY. EE.UU.). Aminoácidos bts fueron sintetizados mediante procedimientos establecidos. Se obtuvieron hidroxiácidos de proveedores comerciales o se sintetizaron a partir de los aminoácidos correspondientes según se describe en la bibliografía (Tetrahedron 1989, 45, 1639-1646; Tetrahedron 1990, 46, 6623-6632; J. Org. Chem. 1992, 57, 6239-6256; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6197-6205). Se realzó TLC analítica sobre placas previamente revestidas de gel de sílice 60F254 (0,25 mm de grosor) que contenía indicador fluorescente.
Se registraron espectros de RMN 1H y 13C en un espectrómetro Varian Mercury a 300 MHz y se referenciaron internamente con respecto a las intensidades de protón residuales del disolvente. Información acerca de la conformación de las moléculas en disolución se puede determinar utilizando técnicas apropiadas de RMN bidimensional conocidas por los expertos en la técnica.
Se realizan análisis de HPLC sobre un sistema 2695 de Waters Alliance que trabaja a 1 ml/min usando una columna Xterra MS C18 (o comparable) 4,6 x 50 mm (3,5 µm). Una PDA 996 de Waters proporcionó datos de UV para la evaluación de pureza. Un distribuidor LCPacking (50:40:10) permitió dividir el flujo en tres partes. La primera parte (50%) iba a un espectrómetro de masas (Micromass Platform II MS provisto de una sonda APCI) para confirmación de identidad. La segunda parte (40%) iba a un detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD, Polymer Laboratories, PL-ELS-1000) para evaluación de pureza y la última porción (10%) a un detector de nitrógeno quimiluminiscente (CLND, Antek Modelo 8060) para cuantificación y evaluación de pureza. Los datos fueron capturados y procesados utilizando la versión más reciente del programa informático de Waters Millenium.
Se realizaron purificaciones por HPLC preparativa sobre macrociclos finales desprotegidos usando un sistema FractionLynx de Waters, sobre una columna Xterra MS C18 (o comparable) 19 x 100 mm (5 µm). Las inyecciones se hicieron usando una configuración de dilución en la columna con un inyector/colector 2767 de Waters y una bomba 515 de Waters que trabaja a 2 ml/min. Espectrómetro de masas, HPLC, y recogida de fracciones dirigida por masa se controlan por medio del programa informático MassLynx versión
3.5 con FractionLynx. Las fracciones (tubos de 13 x 125 mm) que mostraron en el análisis de MS que contenían el producto se evaporaron a presión reducida, lo más típicamente en un sistema de evaporador centrífugo (Genevac HT-4, ThermoSavant Discovery, SpeedVac o comparable) o, como alternativa, se liofilizaron. A continuación se analizaron a fondo los compuestos mediante análisis LC-MS-UV-ELSD-CLND para confirmación de identidad, pureza y evaluación cuantitativa.
Se realizaron purificaciones cromatográficas a media presión automatizadas en un sistema Isco CombiFlash 16x con cartuchos desechables de sílice o C18 que permitían que se manejaran simultáneamente un máximo de dieciséis (16) muestras. Los espectros de MS se registraron en un sistema Micromass Platform II o ZQ de Waters. Los espectros HRMS se registraron con un espectrómetro VG Micromass ZAB-ZF. La información química y biológica se almacenó y se analizó utilizando el programa informático de base de datos ActivityBase (IDBS, Guilford, Surrey, Reino Unido).
La expresión "concentrado/evaporado/eliminado a presión reducida" indica evaporación utilizando un evaporador rotatorio bien bajo presión de aspirador de agua o del vacío más fuerte proporcionado por una bomba de vacío mecánica de aceite según lo que sea apropiado para eliminar el disolvente. "Empaquetamiento en seco" indica cromatografía sobre gel de sílice que ha sido previamente tratado con disolvente, que generalmente se aplica a escalas mayores para purificaciones en las que existe una gran diferencia en Rf entre el producto deseado y cualquier impureza. "Cromatografía rápida" se refiere al procedimiento que se describe con este título en la bibliografía y se aplica a cromatografía sobre gel de sílice (malla 230-400, EM Science) que se usa para eliminar impurezas, algunas de las cuales pueden estar cerca en Rf del material deseado. Se detallan separadamente procedimientos específicos para química en fase sólida.
Procedimientos generales para la química en fase sólida
Estos procedimientos se pueden aplicar igualmente bien para la síntesis de compuestos únicos o para un pequeño número de compuestos, que para la síntesis de bibliotecas de compuestos de la presente invención.
Para la química en fase sólida, es importante la elección de disolvente no sólo para solubilizar reactivos como en la química en disolución, sino también para hinchar la resina. Ciertos disolventes interaccionan de modo diferente con la matriz del polímero dependiendo de su naturaleza y pueden afectar a esta propiedad de hinchamiento. Como ejemplo, el poliestireno (con reticulaciones DVB) se hincha mejor en disolventes no polares tales como DCM y tolueno, mientras que se contrae cuando se expone a disolventes polares como los alcoholes. En contraposición, otras resinas tales como las de PEG injertado como TentaGel, mantienen su hinchamiento incluso en disolventes polares. Para las reacciones de la presente invención se pueden realizar elecciones apropiadas por un experto en la técnica. En general, se emplean resinas de poliestireno-DVB con disolventes comunes de DMF y DCM. El volumen de disolvente de reacción requerido es generalmente 1-1,5 ml por 100 mg de resina. Cuando se usa en los procedimientos de síntesis la expresión "cantidad apropiada de disolvente", se refiere a esta cantidad. La cantidad recomendada de disolvente asciende aproximadamente a una disolución 0,2 M de bloques de construcción (conectores, aminoácidos, hidroxiácidos, y amarres, que se usan a 5 eq con relación a la carga inicial de la resina). La estequiometría de la reacción se determinó sobre la base de la "carga" (que representa el número de sitios funcionales activos, dado en mmol/g) de la resina de partida.
La reacción se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo, matraz de fondo redondeado, recipiente de reacción en fase sólida provisto de filtro de fritada y llave de paso o frasco con tapa de teflón. El tamaño del recipiente debería ser tal que hubiera espacio adecuado para el disolvente y que hubiera sitio suficiente para que la resina se agitara eficazmente teniendo en cuenta que ciertas resinas se pueden hinchar significativamente cuando se tratan con disolventes orgánicos. La mezcla disolvente/resina debería llenar aproximadamente el 60% del recipiente. Tómese nota de que todas las agitaciones para la química en fase sólida se llevan a cabo mejor con un agitador orbital (por ejemplo Forma Scientific, modelo 430, 160-180 rpm), excepto para aquellos en que la escala hace uso de agitación mecánica suave más adecuada, para garantizar la mezcladura adecuada que generalmente se acepta que es importante para una reacción de éxito.
El volumen de disolvente que se usa para el lavado de resina es como mínimo el mismo volumen que se usa para la reacción, aunque generalmente se usa más para garantizar la eliminación completa del exceso de reactivos y otros subproductos residuales solubles. Cada uno de los lavados de resina que se especifican en los Ejemplos se debería realizar con una duración de al menos 5 min., con agitación (salvo que se especifique otra cosa) en el orden enumerado. El número de lavados se designa por "nx" junto al disolvente o disolución, donde n es un número entero. En el caso de sistemas de lavado de disolvente mixto, se enumeran ambos conjuntamente y se designan disolvente 1/disolvente 2. La relación de las mezclas de disolventes DCM/MeOH y THF/MeOH que se usan en las etapas de lavado es (3:1) en todos los casos. Otros disolventes mixtos son los que se enumeran. Después del lavado, secado de "manera estándar" quiere dar a entender que la resina se seca en primer lugar al aire (1h), y posteriormente al vacío (habitualmente con bomba de aceite) hasta que se alcanza sequedad total (mínimo 30 min, hasta toda la noche).
Para ejemplos representativos de los nuevos restos de amarre que se describen en este documento, se emplean las rutas de síntesis que se presentan en las Figuras 3-17 con información adicional sobre los ejemplos seleccionados que se presentan asimismo a continuación. Aunque las rutas que se describen representan una estrategia de protección específica, también se pueden emplear otros grupos protectores adecuados conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplo T12: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T12
En la figura 3 se presenta un resumen de esta ruta. En un matraz de tres bocas secado a la llama de 3l, se preparó una disolución de alcohol (aminometil) feniltiobencílico (12-0, 96g, 0,39mmol) en DMF desgasificado (1l, 0,4M). A esto se añadió Ddz-N3 (0,95eq), seguido de TMG (0,39mmol, 49ml). La reacción se agitó durante 10min, después se añadió DIPEA (68ml, 0,39mml). La mezcla se calentó a 50ºC bajo N2 hasta que la TLC indicó que no quedaba Ddz-N3 (48h típicamente). (Eluyente TLC: EtOAc: Hex 50:50; detección: ninhidrina). Tras completarse, se añadió a la mezcla de reacción 3l de tampón citrato y la capa acuosa separada se extrajo con Et2O (3 x 1500ml). La fase orgánica combinada se lavó secuencialmente con tampón citrato (2x200ml), agua (2x200ml) y salmuera (2x200ml). La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida. Se obtuvo un aceite naranja oscuro, que se purificó mediante relleno en seco. Para este procedimiento, primero se disolvió el aceite en EtOAc:Hex:DCM:TEA (20:80:1:0,5, v/v/v/v). En este punto, se requirió en algunas ocasiones más DCM para asegurar la disolución completa. La disolución se cargó en la columna, después la columna se eluyó con EtOAc:Hex:DCM:Et3N (20:80:1:0,5) hasta que se separaron todas las impurezas como indicó la TLC, poniendo atención particular a la más próxima al producto deseado. La elución se continuó después con EtOAc:hexanos:Et3N 30:70:0,5 (v/v/v) y finalmente con EtOAc:hexanos:Et3N (50:50:0,5) para eluir el producto deseado. Tras eliminar el disolvente de las fracciones que contienen el producto a presión reducida, se disolvió el residuo en la mínima cantidad de DCM, se añadió un volumen tres veces mayor de hexanos, después se evaporaron de nuevo los disolventes a presión reducida. Este tratamiento se repitió hasta obtenerse una espuma color hueso. Esta solidificó mientras se secaba a vacío (bomba de aceite). Alternativamente, el material dio un sólido tras la concentración secuencial con DCM (1x) y hexanos (2x). Se obtuvo amarre T12 como un sólido color hueso (85-90% de rendimiento).
Ejemplo T13: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T13
Se consiguen versiones protegidas de amarre T13 mediante una ruta (véase figura 4) análogas a la descrita a continuación en mayor detalle para T14, excepto que se parte de H-Ser-Oet·HCl, en un rendimiento total de 14-30% para la secuencia de 6 etapas.
1H NMR (CDCl3): δ 7,53 (1H, s, RR'C=CH-O), 6,42-6,58 (2H, m, Ph), 6,30-6,38 (1H, m, Ph), 5,40-5,50 (1H, m, NH), 4,57 (2H, s, CH2OH), 4,40 (2H, d, CH2NHDdz), 3,78 (6H, s, 2X(CH3OPh)), 2,23-2,00 (1H, ancho, OH), 1,76 (6H, s, RR'C(CH3)2).
13C NMR (CDCl3): δ 162, 161, 155, 149, 141, 136, 103, 99, 82, 57, 56, 39, 29.
Ejemplo T14: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T14
Véase la figura 5 para un resumen del esquema sintético.
Etapa T14-1: Se diluyó una disolución de metóxido de sodio 4,4M en MeOH (1,0ml, 4,6mmol, 0,01 eq) en DCM (300ml) a 0°C con MeOH (35 ml). Se añadió dicloroacetonitrilo (50 g, 455 mmol, 1,0eq) durante 4min y la mezcla resultante se agitó a 0°C durante 1 h. Se añadió hidrocloruro de L-cisteína étil éster (84,5g, 455mmol, 1,0eq) y se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con DCM y agua. La fase acuosa separada se extrajo con DCM (2x). La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto obtenido era aceptable para su uso en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa T14-2: A una disolución del producto bruto de la etapa T14-1 (455mmol referido al rendimiento teórico) en DCM (500ml) se añadió DIPEA (119ml, 652,5mmol, 1,5eq). La mezcla resultante se agitó a 50°C durante 5h, después a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se monitorizó mediante TLC (30% EtOAc: 70% Hex; detección: UV y CMA, Rf = 0,29). Tras completarse, la mezcla de reacción se diluyó con DCM y agua. La fase acuosa separada se extrajo con DCM (2x). La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. Se usó 1H NMR para verificar la pureza y la identidad del compuesto intermedio. El producto bruto obtenido era aceptable para su uso en la siguiente etapa sin purificación adicional (rendimiento: 100%).
Etapa T14-3: A una disolución del producto bruto de la etapa T14-2 (77g, 375mmol, 1,0eq) en DMF (500ml) se añadió azida sódica (122g, 1874mmol, 5,0eq). La mezcla resultante se agitó mecánicamente a 85°C durante la noche. La reacción se monitorizó mediante 1H NMR ya que el material de partida y el producto se co-eluyeron en TLC. Tras completarse y enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con Et2O y una disolución acuosa de NH4Cl saturada. La fase acuosa separada se extrajo con Et2O (2x). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. Se usó 1H NMR para verificar la pureza e identidad del compuesto intermedio, El producto bruto obtenido era aceptable para su uso en la siguiente etapa sin purificación adicional (rendimiento: 93%).
Etapa T14-4: A una disolución de la azida bruta de la etapa T14-3 (73,1g, 345mmol, 1,0eq) en EtOH al 95% (700ml) se añadió Pd/C al 10% (18,3g, 17,3mmol, 0,05eq). Se burbujeó hidrógeno gaseoso en la suspensión durante 1h, después la mezcla resultante se agitó durante la noche con un balón de hidrógeno. La reacción se monitorizó mediante TLC (30% EtOAc: 70% Hex; detección: UV y ninhidrina.). El producto final se mantuvo en la línea base y fue positivo a la ninhidrina. Si la reacción no se había completado, según la indicación de TLC, se añadía otra porción de Pd/C al 10% (25% del usado originalmente), se burbujeaba hidrógeno a través de la disolución y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente de nuevo durante la noche. La disolución de reacción se filtró a través de una almohadilla de Celite y la almohadilla se lavó concienzudamente con EtOAc (hasta que no se recuperó más producto, como indicaba la TLC). Se usó 1H NMR para verificar la pureza e identidad del compuesto intermedio. El producto bruto obtenido era aceptable para su uso en la siguiente etapa sin purificación adicional (rendimiento: 93%). Etapa T14-5: A una disolución de la amina bruta de la etapa T14-4 (59,5g, 320mmol, 1,0eq) en DMF desgasificada (mantenido en bomba de vacío durante 1 h)(200ml) se añadió secuencialmente Ddz-N3 (93,3g, 352mmol, 1,1eq), TMG (40,1ml, 320mmol, 1,0eq) y DIPEA (55,8ml, 320mmol, 1,0eq). La disolución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La reacción se monitorizó mediante TLC (100% EtOAc; detección: UV y ninhidrina, Rf = 0,52). Tras completarse, la mezcla de reacción se diluyó con Et2O y una disolución acuosa de tampón citrato (1M). La fase acuosa separada se extrajo con Et2O (2x). La fase orgánica combinada se lavó con tampón citrato (1M, 2x), agua (2x), y salmuera (2x), después se secó sobre MgSO4, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante relleno en seco (20% EtOAc: 80% Hex a 50% EtOAc: 50% Hex) para dar el éster amino protegido como un sólido amarillo. Se usó 1H NMR para verificar la identidad del compuesto intermedio (rendimiento: 65%).
Etapa T14-6: A una disolución del amino éster protegido de la etapa T14-5 (10,5g, 25,7mmol, 1,0 eq) en THF (150 ml) a 0°C se añadieron borohidruro de litio (1,68g, 77,1mmol, 3,0eq) y MeOH (3,1ml, 77,1mmol, 3,0 eq). La mezcla resultante se agitó durante 1 h, después se añadieron porciones idénticas de borohidruro de litio y MeOH. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se monitorizó mediante TLC (5% MeOH, 95% EtOAc; detección: UV y ninhidrina, Rf= 0,27. Nótese que el boronato se co-eluyó con el material de partida, pero tras finalizar, este punto desapareció). La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se añadió agua muy lentamente (100-150 ml) para parar la reacción. A mayores escalas, las sales generadas en la reacción no fueron completamente solubles en la fase acuosa en esta etapa, lo cual complicó la extracción y condujo a menores rendimientos. La mezcla resultante se agitó después durante la noche. La fase acuosa se extrajo con EtOAc (4x). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida. El compuesto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (3% MeOH, 97% EtOAc) para dar amarre Ddz-T14 como un sólido amarillo claro (rendimiento: 67%).
1H NMR (CDCl3, ppm): 7,53 (1H, s, RR'C=CH-S), 6,42-6,58 (2H, m, Ph), 6,35 (1H, t, Ph), 5,60-5,50 (1H, m, NH), 4,75
(2H, s, CH2OH), 4,60 (2H, d, CH2NHDdz), 3,78 (6H, s, 2x(CH3OPh)), 2,70-2,50 (1H, ancho, OH), 1,76 (6H, s,
RR'C(CH3)2).
13C NMR (CDCl3, ppm): 170, 161, 157, 156, 149, 118, 103, 99, 82, 61, 56, 42, 29.
Ejemplo T21: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T21
Véase la figura 6 para un resumen del esquema sintético que proporciona el protocolo de múltiples etapas para este amarre que contiene protección de éter metílico para sus grupos hidroxilo secundarios. También es posible mediante esta ruta una protección alternativa que es más fácil de eliminar, tal como la acetonida.
Ejemplo T22: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T22
En la figura 7 se muestra un resumen del esquema sintético que proporciona rutas eficaces para las formas diaestereoméricas de este amarre.
Ejemplo T24: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T24
El enfoque sintético para este amarre se muestra en la figura 8.
Ejemplo T24: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T26
El esquema sintético que proporciona este amarre se muestra en la figura 9.
MW Calc. para C18H25NO6, 351,39; MS encontrado (M+H)+ 352
Ejemplo T33: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T33
En la Figura 10 se muestra un resumen del esquema de síntesis hacia este amarre de quiral. Se obtienen los enantiómeros dependiendo de la configuración del derivado de ácido láctico de partida, viniendo el isómero-(R) del lactato de metilo-(S) y resultando el isómero-(S) de T33 del lactato de metilo-(R).
RMN 1H (CDCl3): 7,18-7,11, (m, 2H), 6,90 (m, 2H), 6,52 (m, 2H), 6,33 (m, 1H), 5,09 (bt, 1H), 4,52 (m, 1H), 3,77 (s, 6H), 3,08 (bq, 2H), 2,64 (bt, 2H), 1,75 (m, 8H); 1,27 (bd, 3H).
RMN 13C (CDCl3): 160,8, 155,5, 149,5, 131,2, 130,6, 127,4, 121,2, 113,3, 103,2, 98,4, 80,7, 74,8, 66,5, 55,4, 40,2, 30,6, 29,3, 29,2, 27,4, 16,1.
Ejemplo T38: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T38
En la Figura 11 se muestra un resumen del esquema de síntesis para material racémico. Se obtienen los enantiómeros a través del uso de enantiómeros de óxido de propileno ópticamente puros. Como el centro del epóxido se invierte durante el protocolo, el epóxido-(R) proporciona T38(S), mientras que el epóxido-(S) proporciona T38(R).
RMN 1H (CDCl3): 7,20-7,10, (m, 2H), 6,95-9,80 (m, 2H), 6,55 (bs, 2H), 6,35 (s, 1H), 5,18 (bt, 1H), 4,12 (m, 1H), 3,98 (m, 2H), 3,80 (s, 6H), 3,15 (bq, 2H), 2,65 (t, 2H), 1,98 (bs, 2H), 1,65 (bs, 6H), 1,25 (m, 3H).
Ejemplo T39: Procedimiento estándar para la síntesis de amarre T39
Para un resumen del esquema de síntesis para producto racémico, véase la Figura 12. Se pueden obtener versiones enantioméricas por la vía de metodologías de resolución o por el uso de adición de Michael asimétrica en la tercera etapa.
RMN 1H (CDCl3): 7,11-7,08, (2H, m), 6,86 (1H, t), 6,76 (1H, d), 5,05 (1H, ancho), 4,26-3,85 (4H, m), 3,22-3,07 (2H, m), 2,71 (1H, ancho), 1,66-1,60 (2H, m), 1,33 (9H, s), 1,17 (3H, d).
RMN 13C (CDCl3): 156,1, 135,0, 127,1, 127,0, 121,4, 111,7, 69,9, 61,5, 39,8, 38,4, 28,7, 20,7.
Ejemplo T40: Procedimiento estándar para la síntesis de Amarre T40
En la Figura 13 se muestra un resumen del esquema de síntesis para material racémico, mientras la Figura 14 resume la ruta para ambos enantiómeros que implica una resolución enzimática como etapa esencial.
RMN 1H (CDCl3): 7,11-7,08, (2H, m), 6,86 (1H, t), 6,76 (1H, d), 5,05 (1H, ancho), 4,26-3,85 (4H, m), 3,22-3,07 (2H, m), 2,71 (1H, ancho), 1,66-1,60 (2H, m), 1,33 (9H, s), 1,17 (3H, d).
RMN 13C (CDCl3): 156,1, 135,0, 127,1, 127,0, 121,4, 111,7, 69,9, 61,5, 39,8, 38,4, 28,7, 20,7.
Véase la figura 15 para un resumen del esquema sintético que proporciona un derivado apropiadamente protegido para usar en la construcción de macrociclo mediante la figura 1.
1H NMR (CDCl3): δ 1,23 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 1,69 (s, 3H), 1,74 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 2,35 (m, 1H), 3,35 (m, 2H), 3,76 (s, 6H), 3,92 (m, 2H), 4,40 (m, 2H), 5,10 (m, 1H), 6,15 (s, 1H), 6,25 (s, 2H).
13C NMR (CDCl3): δ 25,52 (CH3), 27,53 (CH3), 28,88 (CH3), 29,61 (CH3), 35,92 (CH2), 42,62 (CH2), 55,43 (CH3), 60,60 (CH2), 82,38 (CH), 83,33 (CH), 83,68 (CH), 84,96 (CH), 98,26 (CH), 103,23 (CH), 118,3 (Cq), 149,50 (Cq), 156,20 (Cq). 160,02 (Cq)
MW Calcd. para C22H33NO8: 439,50; MS encontrado: (M+H)+ 440
Ejemplo T56: Procedimiento estándar para la síntesis de precursor (56-1) para amarres T56 y T57
Para algunas de las estructuras de amarre, específicamente aquellas que proceden de la metodología de metátesis por apertura de anillo (RCM, Figura 2), el amarre no se añade como una unidad ya preparada, sino que se construye durante la reacción de macrociclación desde las partes precursoras adecuadas. Un ejemplo de estos se muestra en la figura 17 en la que 56-1, que contiene un resto alqueno colgante, se someterá a RCM mediante lo cual el alqueno se unirá con un alqueno en otra parte del substrato para formar el anillo macrocíclico y, por lo tanto, construir el amarre T56 (o homólogos). La reducción del doble enlace en macrociclos que contienen T56 conduce a macrociclos que contiene T57. Otros amarres que se construyeron de esta manera incluyen T46, T47, T49, y T51.
La tabla 1 enumera los rasgos estructurales para los compuestos de fórmula (II).
La Tabla 2 suministra los datos analíticos de los espectros de masas para estos compuestos.
Tabla 1: Compuestos representativos de fórmula (II)
Estos compuestos se definen mediante la fórmula (II):
en la que W, A1, A2, A3 y T se definen como sigue con los NH de A1 unidos a T, los C=O de A1 unidos a los NH de A2, los C=O de A2 unidos a los NH de A3, los C=O de A3 unidos a W, y (W) y (A1) indican el sitio de la unión de T a W y A1 respectivamente:
Tabla 2: Análisis de espectros de masas para compuestos representativos de fórmula II
Notas
- 1.
- Las fórmulas moleculares y los pesos moleculares (PM) se calculan automáticamente a partir de la estructura por la vía del programa informático ActivityBase (IDBS, Guilford, Surrey, Reino Unido) o, solamente para PM, a partir del programa informático gratuito Molecular Weight Calculator v. 6.32
- 2.
- M+H obtenidos a partir del análisis de LC-MS
- 3.
- Todos los análisis se llevaron a cabo sobre material después de purificación preparativa
Evaluación biológica de compuestos de la invención
Se evaluaron los compuestos de la presente invención en cuanto a su capacidad para interaccionar con el receptor de motilina humana y con el receptor de grelina humana utilizando análisis de unión competitiva de radioligando según se describen en los Métodos B1 y B2, respectivamente. Se puede realizar caracterización adicional de la interacción utilizando los análisis funcionales que se describen en los Métodos B3 y
B4 para receptores de motilina y grelina, respectivamente. Todos estos procedimientos se pueden llevar a cabo, si se desea, de un modo con alto rendimiento que permita la evaluación simultánea de muchos compuestos. En la Tabla 3 se presentan los resultados del examen de compuestos representativos de la presente invención usando los Métodos B1 y B2. Ejemplo Método B1: Análisis de unión competitiva de radioligando (receptor de motilina). Materiales:
Se prepararon membranas de células CHO transfectadas establemente con el receptor de motilina humana y se utilizaron en una cantidad de 1,5 µg/punto de análisis. [Perkin Elmer® SignalScreen Product #6110544]
[125I]-Motilina (Perkin Elmer, #NEX-378); concentración final: 0,04-0,06 nM
Motilina (Bachem®, #H-4385); concentración final: 1 µM
Placas de recogida multitamiz-GF/B (Millipore®, #MAHFB1H60)
Placa de titulación de polipropileno de pocillos hondos (Beckman Coulter®, #267006)
Cierre superior-A (Perkin Elmer #6005185)
Cierre inferior (Millipore, #MATAH0P00)
MicroScint-0 (Perkin Elmer; #6013611)
Tampón de unión: Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,1%
Volúmenes de análisis
150 µl de membranas diluidos en tampón de unión
10 µl de compuesto diluidos en tampón de unión
10 µl de radioligando ([125I]-Motilina) diluidos en tampón de unión
Concentraciones finales de prueba (N=11) para compuestos:
10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005 µM.
Manejo del compuesto: Se proporcionaron los compuestos congelados sobre hielo seco a una concentración de partida de 10 mM diluidos en DMSO del 100% y se almacenaron a -20ºC hasta el día de la prueba. El día de la prueba, se dejaron descongelar los compuestos a temperatura ambiente y se diluyeron a continuación en tampón de
análisis conforme a las concentraciones de prueba deseadas. En estas condiciones, la máxima concentración final de DMSO en el análisis fue 0,5%. Protocolo de análisis
En placas de pocillos hondos, se combinan membranas celulares diluidas (1,5 µg/ml) con 10 µl de tampón de unión (unión total, N=5), 1 µM de motilina (unión no específica N=3) o la concentración apropiada de compuesto de prueba. La reacción se inicia mediante adición de 10 µl de [125I]-motilina (conc. final: 0,04-0,06 nM) a cada pocillo. Se cierran las placas con cierre superior-A, se agitan suavemente con remolino y se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se detiene filtrando muestras a través de placas de recogida multitamiz previamente remojadas (polietilenimina al 0,3%, 2h) usando una recolector Tomtec, se lavan 9 veces con 500 µl de Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), y a continuación las placas se secan al aire en una cabina de extracción de gases durante 30 minutos. Se aplica a las placas un cierre inferior antes de la adición de 25 µl de MicroScint-0 a cada pocillo. Las placas se cierran a continuación con cierre superior-A y se efectúa su conteo durante 30 segundos por pocillo en un contador de centelleo y luminiscencia de microplaca de conteo superior (Perkin Elmer) en el que se expresan los resultados como número total de centelleos por minuto (cpm).
El análisis de datos se realiza mediante GraphPad® Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) usando análisis de regresión no-lineal de pendiente variable. Se calcularon los valores Ki usando un valor Kd de 0,16 nM para [125I]-motilina (previamente determinado durante la caracterización de la membrana).
concentración de prueba con desplazamiento máximo-unión no específica Dmax=1 ---------------------------------------------x100 unión total - unión no específica
donde unión total y no específica representan los cpm obtenidos en ausencia o presencia de motilina 0,1 µM,
respectivamente.
Ejemplo Método B2: Análisis de unión competitiva de radioligando (receptor de grelina).
El análisis de unión competitiva en el receptor de secretagogo de hormona de crecimiento humano (hGHS-R1a) se llevó a cabo análogamente a los análisis que se describen en la bibliografía (Bednarek MA y col., (2000), Structure-function studies on the new growth hormone-releasing peptide ghrelin: minimal sequence of ghrelin necessary for activation of growth hormone secretagogue receptor 1a; J Med Chem 43:4370-4376. Palucki BL y col., (2001), Spiro(indoline-3,4'-piperidine) growth hormone secretagogues as ghrelin mimetics; Bioorg Med Chem Lett 11:1955¬1957.)
Materiales: Se prepararon membranas (GHS-R/HEK 293) de células HEK-293 transfectadas establemente con el receptor de grelina humana (hGHS-R1a). Estas membranas fueron suministradas por Perkin Elmer
BioSignal (#RBHGHSM, lote #1887) y se utilizaron en una cantidad de 0,71 µg/punto de análisis. [125I]-Grelina (Perkin Elmer, #NEX-388); concentración final: 0,0070-0,0085 nM Grelina (Bachem, #H-4864); concentración final: 1 µM Placas de recogida multitamiz-GF/C (Millipore, #MAHFC1H60) Placa de titulación de polipropileno de pocillos hondos (Beckman Coulter, #267006) Cierre superior-A (Perkin Elmer #6005185) Cierre inferior (Millipore, #MATAH0P00) MicroScint-0 (Perkin Elmer; #6013611) Tampón de unión: Hepes 25 mM (pH 7,4), CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 2,5 mM, BSA 0,4% Volúmenes de análisis
Los experimentos de competencia se realizaron en un formato de análisis de filtración de 300 µl. 220 µl de membranas diluidos en tampón de unión 40 µl de compuesto diluidos en tampón de unión 40 µl de radioligando ([125I]-Grelina) diluidos en tampón de unión Concentraciones finales de prueba (N=1) para compuestos de la presente invención: 10, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002, 0,001 µM. Manejo del compuesto:
Se proporcionaron los compuestos congelados sobre hielo seco a una concentración de partida de 10 mM diluidos en DMSO del 100% y se almacenaron a -80ºC hasta el día de la prueba. El día de la prueba, se dejaron descongelar los compuestos a temperatura ambiente durante la noche y se diluyeron a continuación en tampón de análisis conforme a las concentraciones de prueba deseadas. En estas condiciones la máxima concentración final de DMSO en el análisis fue 0,1%.
Protocolo de análisis En placas de pocillos hondos, se combinaron 220 µl de membranas celulares diluidas (concentración final: 0,71 µg/pocillo) con 40 µl de tampón de unión (unión total, N=5), 1 µM de grelina (unión no específica, N=3) o la concentración apropiada de compuesto de prueba (N=2 para cada concentración de prueba). La reacción se inició mediante adición de 40 µl de [125I]-grelina (conc. final de 0,0070-0,0085 nM) a cada pocillo. Se cerraron las placas con cierre superior-A, se agitaron suavemente con remolino y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción se detuvo filtrando muestras a través de placas de recogida multitamiz
(previamente remojadas en polietilenimina al 0,5%) usando un recolector Tomtec, se lavaron 9 veces con 500 µl de Tris-HCl 50 mM (pH 7,4, 4ºC), y a continuación las placas se secaron al aire en una cabina de extracción de gases durante 30 minutos. Se aplicó a las placas un cierre inferior antes de la adición de 25 µl de MicroScint®0 a cada pocillo. Las placas se cerraron a continuación con cierre superior-A y se efectuó su conteo durante 30 segundos por pocillo en un contador de centelleo y luminiscencia de microplaca de conteo superior (Perkin Elmer) usando un retraso de conteo de 60 seg. Los resultados se expresaron como número total de centelleos por minuto (cpm).
El análisis de datos se realizó mediante GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) usando análisis de regresión no-lineal de pendiente variable. Se calcularon los valores Ki usando un valor Kd de 0,01 nM para [125I]-grelina (previamente determinado durante la caracterización de la membrana).
Los valores Dmax se calcularon usando la siguiente fórmula:
concentración de prueba con desplazamiento máximo-unión no específica
Dmax=1---------------------------------------------x100
unión total - unión no específica
donde unión total y no específica representan los cpm obtenidos en ausencia o presencia de grelina 1 µM, respectivamente.
Ejemplo Método B3: Análisis funcional de aequorina (receptor de motilina).
Materiales:
Se prepararon membranas usando líneas celulares AequoScreen® (EUROSCREEN, Bélgica) que expresan el receptor de motilina humana (línea celular ES-380-A; acceso de receptor #AF034632). Esta línea celular se construye mediante transfección del receptor de motilina humana en células CHO-K1 que coexpresan Gα16 y la Aequorina de diana mitocondrial (Ref #ES-WT-A5).
Motilina (Bachem, #H-4385)
Tampón de análisis: DMEM-F12 (Medio Eagles modificado de Dulbecco) con HEPES 15 mM y BSA 0,1% (pH 7,0)
Coelenterazina (Molecular Probes®, Leiden, Países Bajos)
Concentraciones finales de prueba (N=5) para compuestos:
10, 3,16, 1, 0,316, 0,1 µM.
Manejo del compuesto:
Se proporcionaron los compuestos como películas secas en una cantidad de aproximadamente 1,2 µmol en placas preformadas de 96 pocillos. Los compuestos se disolvieron en DMSO del 100% a una concentración de 10 mM y se almacenaron a -20ºC hasta uso posterior. Se prepararon placas hijas a una concentración de 500 µM en DMSO del 30% con 0,1% de BSA y se almacenaron a -20ºC hasta la prueba. El día de la prueba, se dejaron descongelar los compuestos a temperatura ambiente y se diluyeron a continuación en tampón de análisis conforme a las concentraciones de prueba deseadas. En estas condiciones la máxima concentración final de DMSO en el análisis fue 0,6%.
Preparación celular
Se recogieron células de placas de cultivo con disolución salina tamponada de fosfato exenta de Ca2+ y Mg2+ (PBS) suplementada con EDTA 5 mM, se aglomeraron durante 2 minutos a 1000 x g, se resuspendieron en tampón de análisis (véase arriba) a una densidad de 5 x 106 células/ml y se incubaron durante la noche en presencia de coelenterazina. Después de la carga, las células se diluyeron con tampón de análisis a una concentración de 5 x 105 células/ml.
Protocolo de análisis
Para la prueba de agonista, se mezclaron 50 µl de suspensión celular con 50 µl de compuesto de prueba o motilina (agonista de referencia) de la concentración apropiada en placas de 96 pocillos (muestras duplicadas). Se registró la emisión de luz resultante de la activación del receptor usando el sistema 6000 de escrutinio de fármacos funcionales "FDSS 6000" (Hamamatsu Photonics K.K. Japón).
Para la prueba de antagonista, se inyectó una concentración aproximada de EC80 de motilina (es decir 0,5 nM; 100 µl) en la suspensión celular que contenía los compuestos de prueba (muestras duplicadas) 15-30 minutos después del final de la prueba de agonista y se midió la emisión consiguiente de luz resultante de la activación del receptor como se describe en el párrafo anterior.
Los resultados se expresan como Unidades de Luz Relativas (RLU). Las curvas de respuesta a la concentración se analizaron usando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego,CA) mediante análisis de regresión no-lineal (respuesta a la dosis sigmoidea) basado en la ecuación E=Emax/(1+EC50/C)n donde E es el valor de RLU medido a una concentración dada de agonista (C), Emax es la respuesta máxima, EC50 es la concentración que produce 50% de estimulación y n es el índice de pendiente. Para la prueba de agonista, los resultados para cada concentración del compuesto de prueba se expresaron como porcentaje de activación con relación a la señal inducida por motilina a una concentración igual a la EC80 (es decir 0,5 nM). Para la prueba de antagonista, los resultados para cada concentración del compuesto de prueba se expresaron como porcentaje de inhibición con relación a la señal inducida por motilina a una concentración igual a la EC80 (es decir 0,5 nM).
Ejemplo Método B4: Análisis funcional de aequorina (receptor de grelina).
Materiales:
Se prepararon membranas usando líneas celulares AequoScreen® (EUROSCREEN, Bélgica) que expresan el receptor de grelina humana (línea celular ES-410-A; acceso de receptor #60179). Esta línea celular se construye mediante transfección del receptor de grelina humana en células CHO-K1 que co-expresan GD16 y la Aequorina de diana mitocondrial (Ref #ES-WT-A5).
Grelina (agonista de referencia; Bachem, #H®4864)
Tampón de análisis: DMEM (Medio Eagles modificado de Dulbecco) que contiene 0,1% de BSA (albúmina de suero bovino); pH 7,0.
Coelenterazina (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos)
Concentraciones finales de prueba (N=8) para compuestos de la invención:
10, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003, 0,001 µM.
Manejo del compuesto:
Se proporcionaron disoluciones de partida de compuestos (10 mM en DMSO al 100%) congeladas sobre hielo seco y se almacenaron a -20ºC antes de usar. De la disolución de partida se hicieron disoluciones madre a concentración de 500 µM mediante dilución a 20 veces en DMSO del 26%. A continuación se prepararon placas de análisis mediante dilución apropiada en medio DMEM que contenía BSA al 1%. En estas condiciones la máxima concentración final de DMSO en el análisis fue <0,6%.
Preparación celular
Se recogieron células AequoScreen® de placas de cultivo con disolución salina tamponada de fosfato exenta de Ca2+ y Mg2+ (PBS) suplementada con EDTA 5 mM, se aglomeraron durante 2 minutos a 1000 x g, se resuspendieron en DMEM-F12 de Ham que contenía BSA al 0,1% a una densidad de 5 x 106 células/ml, y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en presencia de coelenterazina 5 µM. Después de la carga, las células se diluyeron con tampón de análisis a una concentración de 5 x 105 células/ml.
Protocolo de análisis
Para la prueba de agonista, se mezclaron 50 µl de la suspensión celular con 50 µl de compuesto de prueba o grelina (agonista de referencia) de la concentración apropiada en placas de 96 pocillos (muestras duplicadas). Se probó grelina (agonista de referencia) a varias concentraciones de modo concurrente con los compuestos de prueba para validar el experimento. Se registró la emisión de luz resultante de la activación del receptor en respuesta a grelina o compuestos de prueba usando el lector FDSS 6000 de Hamamatsu (Hamamatsu Photonics K.K. Japón).
Análisis y expresión de resultados
Los resultados se expresaron como Unidades Relativas de Luz (RLU). Se analizaron las curvas de respuesta a la concentración usando el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) mediante análisis de regresión no-lineal (respuesta sigmoidea a la dosis) basado en la ecuación E=Emax/(1+EC50/C)n donde E era el valor de RLU medido a una concentración (C) dada de agonista, Emax era la respuesta máxima, EC50 era la concentración que producía estimulación del 50% y n era el índice de pendiente. Para la prueba de agonista, los resultados para cada concentración de compuesto de prueba se expresan como porcentaje de activación con relación a la señal inducida por grelina a una concentración igual a la EC80 (es decir 3,7 nM). Se reseñan los valores de EC50, pendiente y %Emax.
Tabla 3: Actividad biológica de compuestos representativos de fórmula II
- Compuesto
- Afinidad de unión [Ki(M)]1 Receptor2
- 201
- A motilina (humana)
- 202
- A motilina (humana)
- 203
- A motilina (humana)
- 204
- A motilina (humana)
- 205
- B motilina (humana)
- 206
- B motilina (humana)
- 207
- A motilina (humana)
- 208
- A motilina (humana)
- 209
- A motilina (humana)
- 211
- A motilina (humana)
- 212
- A motilina (humana)
- 213
- A motilina (humana)
- 214
- A motilina (humana)
- 215
- A motilina (humana)
- 216
- A motilina (humana)
- 217
- B motilina (humana)
- 218
- B motilina (humana)
- 219
- B motilina (humana)
- 220
- B motilina (humana)
- 235
- C motilina (humana)
- 236
- B motilina (humana)
- 237
- B motilina (humana)
- 241
- A grelina (humana)
- 242
- A grelina (humana)
- 243
- A grelina (humana)
- 244
- A grelina (humana)
- 245
- A grelina (humana)
- 246
- B grelina (humana)
- 247
- B grelina (humana)
- 248
- B grelina (humana)
- 254
- A grelina (humana)
- 255
- A grelina (humana)
- 256
- B grelina (humana)
- 257
- A grelina (humana)
- 258
- B grelina (humana)
- 259
- C grelina (humana)
- 260
- C grelina (humana)
- 261
- C grelina (humana)
- 262
- B grelina (humana)
- 264
- B grelina (humana)
- 1.
- La actividad que se presenta se indica en los siguientes intervalos: A=0,001-0,10 M, B=0,1-1,0 M, C=1,0-10,0 M
- 2.
- Unión que se lleva a cabo usando los Métodos Estándar que se describen en los Ejemplos
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Un compuesto que tiene la estructura de la fórmula II:
imagen1 en la que W, A1, A2, A3 y T se definen como sigue con los NH de A1 unidos a T, los C=O de A1 unidos a los NH de A2, los C=O de A2 unidos a los NH de A3, los C=O de A3 unidos a W, y (W) y (A1) indican el sitio de la unión de T a W y A1 respectivamente:imagen1 (continuación)imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 imagen1 - 2. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene una de las siguientes estructuras:
imagen1 -
- 3.
- El compuesto de la reivindicación 1 que tiene una de las siguientes estructuras:
-
- 4.
- El compuesto de la reivindicación 1 que tiene una de las siguientes estructuras:
imagen1 imagen1 - 5. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la siguiente estructura:
imagen1 -
- 6.
- Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
-
- 7.
- Un compuesto según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como producto farmacéutico.
-
- 8.
- Uso de un compuesto según se define en la reivindicación 2 en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de trastornos GI implicando hipermotilidad.
-
- 9.
- Un compuesto según se define en la reivindicación 2 para uso en el tratamiento de trastornos GI implicando hipermotilidad.
-
- 10.
- Uso de un compuesto según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de dolencias causadas por deficiencia de la hormona del crecimiento, síndrome de desgaste y trastornos GI implicando dismotilidad.
-
- 11.
- Un compuesto según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para uso en el tratamiento de dolencias causadas por deficiencia de la hormona del crecimiento, síndrome de desgaste y trastornos GI implicando dismotilidad.
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