ES2265494T3 - Procedimiento para producir compuestos de trunkamida-a. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para preparar un cicloheptapéptido que contiene un anillo heterocíclico de 5 miembros como parte del esqueleto del péptido cíclico, siendo el cicloheptapéptido de fórmula: en la que Aaa2, Aaa3, Aaa4, Aaa5, y Aaa6 son independientemente residuos de -aminoácido, R1 es H o un grupo orgánico; X es independientemente O, S, o NH; cada Y es independientemente C o CH; Z es independientemente CH o CH2; Ra es H o grupo alquilo; Rg es H o un grupo orgánico o está ausente; y cada línea punteada indica un segundo enlace permitido; procedimiento que comprende una síntesis en fase sólida de un precursor de péptido lineal ajustado para ciclación, o bien estando el precursor ajustado para la formación de un anillo heterocíclico o bien conteniendo el anillo heterocíclico, ciclación del heptapéptido lineal y si fuera necesario formación del anillo heterocíclico.

Description

Procedimiento para producir compuestos de trunkamida-A.

La presente invención se refiere a un procedimiento sintético para la formación de trunkamida A y estructuras relacionadas.

Antecedentes de la invención

La trunkamida A es un heptapéptido cíclico ciclo [D-Pht-Tzn-Thr(rPr)-Ser(rPr)-Ile-Ala-Pro] aislado del ascidio formador de colonias Lissoclinum sp. La trunkamida A se aisló por primera vez por parte de Bowden y colaboradores (Carroll, A.R.; Coll, J.C.; Bourne, D.J.; McLeod, J.K.; Zabriskie, T.M.; Ireland, C.M.; Bowden, B.F. Aust. J. Chem. 1996, 49, 659-667) pero la configuración absoluta del estereocentro exocíclico al anillo heterocíclico se asignó a la configuración L. Más recientemente, Wipf y colaboradores han demostrado por primera vez que la asignación inicial era errónea (Wipf, P.; Uto, Y. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 5165-5169) y más tarde demostraron que el estereocentro en el C(45) tiene una configuración D (Wipf, P. ; Uto, Y. J. Org. Chem. 2000, 65, 1037-1049).

Por tanto, la estructura de la trunkamida A es:

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El D-Phe-Tzn se forma a partir de dos aminoácidos, a los que se hace referencia como aminoácidos uno y siete del cicloheptapéptido, en el que D-Phe es el aminoácido siete.

La trunkamida A tiene una actividad antitumoral prometedora y es el tema del documento WO 9739025.

En el artículo J.Org. Chem. 2000, 65, 1037-1049, Wipf y colaboradores proporcionan una síntesis de trunkamida A que implica un cierre de anillo en una disolución entre alanina e isoleucina para formar un cicloheptapéptido que tiene una oxazolina en el lugar del anillo de tiazolina. Entonces la trunkamida A se obtiene mediante un tratamiento adicional. Los autores mencionan que exploraron otras posibilidades para el cierre del anillo, tal como la prolina/fenilalanina amida, pero fueron incapaces de proporcionar una alternativa viable.

Para su investigación, Wipf y colaboradores sintetizaron trunkamida A, mostrada como la siguiente fórmula 31, e isómeros con las siguientes estructuras:

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Ahora también puede observarse una síntesis adicional en disolución de trunkamida A por McKeever y Pattenden en Tetrahedron Letters 42 (2001) 2573-2577.

La síntesis de heptapéptidos no relacionados con la trunkamida A se describe en J. Org. Chem. 64, 3095-3101 (1999), y J. Am. Chem. Soc. 116, 1746-1752 (1994).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una nueva síntesis de trunkamida A y compuestos relacionados, junto con nuevos derivados de trunkamida A.

En particular la invención implica la preparación de un cicloheptapéptido mediante una síntesis en fase sólida de un precursor de heptapéptido lineal.

La invención se refiere a la preparación de un cicloheptapéptido que contiene un anillo heterocíclico de 5 miembros como parte del esqueleto de un aminoácido, tal como tiazolina. Para este fin, la invención implica la preparación de un cicloheptapéptido mediante una síntesis en fase sólida de un precursor de heptapéptido lineal, en el que el precursor lineal incluye el anillo o incluye grupos funcionales adecuados para formar el anillo. En este aspecto de la invención, el procedimiento comprende una síntesis en fase sólida de un precursor de péptido lineal ajustado para ciclación, o bien estando el precursor ajustado para la formación de un anillo heterocíclico o bien conteniendo el anillo heterocíclico, ciclación del heptapéptido lineal y si fuera necesario formación del anillo heterocíclico.

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El anillo heterocíclico de 5 miembros es de fórmula:

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en la que X es independientemente O, S, o NH; cada Y es independientemente C o CH; Z es independientemente CH o CH_{2}; R_{g} es H o un grupo orgánico o está ausente; y cada línea punteada indica un segundo enlace permitido.

Por tanto, los productos preparados mediante el procedimiento de esta invención toman la forma:

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en la que Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5}, y Aaa_{6} son independientemente residuos de \alpha-aminoácido, R_{1} es H o un grupo orgánico; R_{a} es H o grupo alquilo; y R_{g}, X, Y, Z y las líneas punteados son tal como se definieron. El anillo heterocíclico se forma mediante la fusión de parte de un aminoácido Aaa_{1} con aminoácido Aaa_{7}.

El procedimiento sintético de la presente invención permite la formación de compuestos novedosos tales como los de la siguiente fórmula (III):

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en la que Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5}, y Aaa_{6} son independientemente \alpha-aminoácidos de configuración L o D, si procede; en la que Aaa_{1} con Aaa_{7} da un anillo heterocíclico de cinco miembros aminoazol; en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno; en la que X es independientemente O, S, o NH; en la que R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e}, R_{f}, y R_{g} son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo y R_{g} puede estar ausente; en la que los pares R_{a}-R_{1}, R_{b}-R_{3}, R_{c}-R_{5}, R_{d}-R_{6}, R_{e}-R_{7} y R_{f}-R_{8} pueden formar parte del mismo grupo alquilo y por tanto, los aminoácidos correspondientes son cíclicos; en la que Y es independientemente C o CH; en la que cada Z es independientemente CH o CH_{2}; y la línea punteada indica un segundo enlace permitido; con la excepción de trunkamida A y tres estereoisómeros conocidos a partir de J. Org. Chem. 2000, 65, 1037-1049.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas de los compuestos, junto con el uso de los compuestos para preparar tales composiciones y el uso de los compuestos en métodos de tratamiento.

Realizaciones preferidas de la invención

La fase sólida preferida es una resina de cloruro de clorotritilo lábil en medio super-ácido. La síntesis en fase sólida comienza preferiblemente con el aminoácido seis, añadiendo después los aminoácidos cinco, cuatro, tres, dos, uno y siete, en ese orden. La numeración de los aminoácidos se basa en la de la trunkamida A. Preferiblemente, la cadena peptídica se alarga utilizando una estrategia de base de fluorenilmetiloxicarbonilo.

El procedimiento de la invención implica ciclación de un heptapéptido lineal y formación del anillo heterocíclico. La etapa de ciclación puede ser antes o después de la etapa de formación de anillo. Normalmente, el anillo se forma entre los grupos funcionales de dos aminoácidos del heptapéptido cíclico, designados como aminoácidos uno y siete. En la presente invención, la ciclación normalmente se produce entre el COOH del aminoácido seis y el NH_{2} del aminoácido siete, tomando el anillo heterocíclico como que se forma mediante la fusión entre los aminoácidos uno y siete.

En una versión, el procedimiento comprende ciclación de un heptapéptido lineal ajustado para la formación de anillo heterocíclico para dar un cicloheptapéptido ajustado para la formación de anillo heterocíclico, y a continuación formación del anillo heterocíclico. Un procedimiento de este tipo puede incluir la etapa de:

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en la que Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5} y Aaa_{6} representan aminoácidos, X es O o S, y A es O o NH, y R_{a} es tal como se definió, normalmente H. R_{1} es H o un grupo orgánico. Entonces el producto intermedio puede cerrarse en anillo hasta una azolina. Cuando C=X es C=S, el anillo es tiazolina. El C=S puede reemplazarse por C=O para dar una oxazolina. Para una imidazolina, el C=S se sustituye por C=O y OH se sustituye por NH_{2}. Preferiblemente, X es O o S y el anillo cerrado es una oxazolina o tiazolina, y más preferiblemente X es S y el anillo cerrado es una tiazolina.

En una versión alternativa del presente procedimiento, el procedimiento comprende formación mediante síntesis en fase sólida de un precursor de heptapéptido lineal que incluye el anillo heterocíclico y después ciclación del heptapéptido lineal. Generalmente, el anillo se forma cuando se añade el aminoácido siete. Un procedimiento de este tipo puede incluir la etapa de:

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en la que Fmoc es un grupo protector tal como fluorenilmetiloxicarbonilo, péptido es Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5} y Aaa_{6} que representan aminoácidos, la esfera rellena es una fase sólida, R_{a} y R_{1} son tal como se definieron, y D es S, O o NH.

En una modificación de esta versión alternativa, el anillo heterocíclico saturado formado se hace reaccionar adicionalmente para formar un anillo heterocíclico aromático dando un tiazol, oxazol o imidazol, reflejando la identidad de D.

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En particular el procedimiento de esta invención puede avanzar según las siguientes etapas:

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El procedimiento de la presente invención es especialmente adecuado para cicloheptapéptidos que tienen sustituyentes de prenilo inversos.

La presente invención es adecuada para la preparación de nuevos análogos de trunkamida A, siendo de fórmula (III). Un grupo preferido de compuestos es de fórmula (II):

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en la que Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5}, y Aaa_{6} son independientemente \alpha-aminoácidos de configuración L o D, si procede; en la que Aaa_{1} es independientemente un compuesto heterocíclico de cinco miembros de aminoazol; en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno; en la que X es independientemente O, S, o NH; en la que R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e}, y R_{f}, son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo; en la que los pares R_{a}-R_{1}, R_{b}-R_{3}, R_{c}-R_{5}, R_{d}-R_{6}, R_{e}-R_{7}, y R_{f}-R_{8} pueden formar parte del mismo grupo alquilo y por tanto, los aminoácidos correspondientes son cíclicos; en la que Y es independientemente C o CH; en la que Z es independientemente CH o CH_{2}.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "grupo orgánico" significa un grupo hidrocarburo que se clasifica como grupo alifático, grupo cíclico, o combinación de grupos alifáticos y cíclicos (por ejemplo, grupos aralquilo). En el contexto de la presente invención, el término "grupo alifático" significa un hidrocarburo lineal o ramificado saturado o insaturado. El término se utiliza para englobar grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, por ejemplo. El término "grupo alquilo" significa un grupo hidrocarburo lineal o ramificado saturado que incluye, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, isobutilo, t-butilo, heptilo, decilo, octadecilo, amilo, 2-etilhexilo, 2-metilbutilo, 5-metilhexilo, y similares. El término "grupo alquenilo" significa un grupo hidrocarburo lineal o ramificado insaturado con un o más enlaces dobles carbono-carbono, tal como un grupo vinilo. El término "grupo alquinilo" significa un grupo hidrocarburo lineal o ramificado, insaturado con uno o más enlaces triples carbono-carbono. El término "grupo cíclico" significa un grupo hidrocarburo de anillo cerrado que se clasifica como un grupo alicíclico, grupo aromático o grupo heterocíclico. El término "grupo alicíclico" significa un grupo hidrocarburo cíclico que tiene propiedades que se parecen a las de los grupos alifáticos. El término "grupo aromático" o "grupo arilo" significa un grupo hidrocarburo aromático mono- o policíclico. El término "grupo heterocíclico" significa un hidrocarburo de anillo cerrado en el que uno o más de los átomos en el anillo es un elemento distinto del carbono (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.).

Como bien se entiende en esta área técnica, no sólo se tolera un alto grado de sustitución, sino que a menudo es aconsejable. La sustitución se anticipa en los compuestos de la presente invención. Como un medio de simplificar el tratado y recitación de cierta terminología utilizada a lo largo de esta solicitud, los términos "grupo" y "resto" se utilizan para diferenciar entre especies químicas que permiten la sustitución o que pueden sustituirse y los que no la permiten o no pueden sustituirse. Por tanto, cuando se utiliza el término "grupo" para describir un sustituyente químico, el material químico descrito incluye el grupo sin sustituir y este grupo con átomos de O, N o S, por ejemplo, en la cadena así como el grupo carbonilo u otra sustitución convencional. Cuando se utiliza el término "resto" para describir un compuesto o sustituyente químico, sólo se pretende incluir un material químico sin sustituir. Por ejemplo, la frase "grupo alquilo" pretende incluir no sólo sustituyentes de alquilo hidrocarbonado saturado de cadena abierta puros, tales como metilo, etilo, propilo, isobutilo y similares, sino también sustituyentes alquilo que llevan sustituyentes adicionales conocidos en la técnica, tales como hidroxilo, alcoxilo, amino, carboxilo, carboxamido, átomos de halógeno, ciano, nitro, alquilsulfonilo, etc. Por tanto, "grupo alquilo" incluye grupos éter, haloalquilos, alcoholes, tioles, carboxilos, aminas, hidroxialquilos, sulfoalquilos, etc. Por otro lado, la frase "resto alquilo" se limita a la inclusión de sólo sustituyentes de alquilo hidrocarbonado saturado de cadena abierta puros, tales como metilo, etilo, propilo, isobutilo, y similares.

Cuando uno o más pares de los R_{a}-R_{1}, R_{b}-R_{3}, R_{c}-R_{5}, R_{d}-R_{6}, R_{e}-R_{7}, y R_{f}-R_{8} forman parte del mismo grupo alquilo y por tanto, los aminoácidos correspondientes son cíclicos, se prefiere que el aminoácido sea prolina o un aminoácido relacionado. Tales consideraciones proceden particularmente para R_{f}-R_{8}.

Una realización preferida de los compuestos representados mediante la fórmula II es trunkamida A (I), en la que Aaa-1 es D-Phe-L-Tzn (R_{a}= H, X= S, R_{1}= bencilo, Y= CH, Z= CH_{2}), Aaa-2 L-Thr(rPre) (R_{b}= H, R_{2}= 1,1-dimetilalilo, R_{3}= metilo), Aaa-3 es L-Ser(rPre) (R_{c}, R_{5} = H, R_{4}= 1,1-dimetilalilo), Aaa-4 es L-Ile (R_{d}= H, R_{6}= 1-metilpropilo), Aaa-5 es L-Ala (R_{e}= H, R_{7}= metilo), y Aaa-6 es L-Pro (R_{f}= CH_{2}, R_{6}= CH_{2}-CH_{2}).

Derivados de trunkamida A incluyen compuestos en los que R_{2} y/o R_{4} es un grupo alquilo tal como metilo, t-butilo, un grupo alilo, o un grupo aralquilo tal como bencilo. Derivados adicionales incluyen los compuestos en los que R_{1} es un grupo aralquilo sustituido, especialmente un grupo bencilo para-sustituido, por ejemplo, p-fluoro o p-triofluorometil-bencilo. Otros ejemplos incluyen compuestos en los que R_{1} es heteroarilo opcionalmente sustituido tal como indol, imidazol, tiazol, o arilo opcionalmente sustituido tal como fenilo.

Otro compuesto que puede prepararse mediante el presente procedimiento es molamida, véase Aust. J. Chem. 1994 47 61.

Los compuestos de la presente invención tienen actividad antitumoral, y son de uso en un método para tratamiento de cualquier mamífero, particularmente un ser humano, afectado por un cáncer que comprende la administración al individuo afectado de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención, o una composición farmacéutica del mismo.

Ejemplos de composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen cualquier sólido (comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc) o líquido (disoluciones, suspensiones o emulsiones) con una composición adecuada para una administración por vía oral, tópica o parenteral, y pueden contener el compuesto puro o en combinación con cualquier vehículo u otros principios farmacológicamente activos. Estas composiciones puede que necesiten ser estériles cuando se administren por vía parenteral.

La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención puede ser mediante cualquier método adecuado, tal como infusión intravenosa, preparaciones orales, administración por vía intraperitoneal e intravenosa. La dosis correcta de los compuestos variará según la formulación particular, el modo de aplicación, y el sitio particular, el huésped y el tumor que se esté tratando. Deberán tenerse en cuenta otros factores como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la velocidad de excreción, el estado del huésped, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades a la reacción y la gravedad de la enfermedad. La administración puede llevarse a cabo de manera continua o periódica dentro de la dosis tolerada máxima.

Los compuestos y composiciones de esta invención pueden utilizarse con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o proporcionarse como una composición separada para administrar al mismo tiempo o en un momento distinto. La identidad del otro fármaco no se limita particularmente, y candidatos adecuados incluyen:

a) fármacos con efectos antimitóticos, especialmente los que seleccionan como diana elementos citoesqueléticos, incluyendo moduladores de microtúbulos tales como fármacos de taxano (tales como taxol, paclitaxel, taxotere, docetaxel), podofilotoxinas o alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina);

b) fármacos antimetabolito tales como 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina, análogos de purinas tales como pentostatina, metotrexato);

c) agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno (tales como ciclofosfamida o ifosfamida);

d) fármacos que seleccionan como diana el ADN tales como los fármacos de antraciclina adriamicina, doxorubicina, farmorubicina o epirubicina;

e) fármacos que seleccionan como diana topoisomerasas tales como etopósido;

f) hormonas y agonistas o antagonistas de hormonas tales como estrógenos, antiestrógenos (tamoxifeno y compuestos relacionados) y andrógenos, flutamida, leuprorelina, goserelina, ciproterona u octreotida;

g) fármacos que seleccionan como diana la transducción de señales en células tumorales incluyendo derivados de anticuerpos tales como herceptína;

h) agentes alquilantes tales como fármacos de platino (cis-platino, carboplatino, oxaliplatino, paraplatino) o nitrosoureas;

i) fármacos que afectan de manera potencial la metástasis de los tumores tales como inhibidores de la metaloproteinasa de matriz;

j) terapia génica y agentes antisentido;

k) compuestos terapéuticos de anticuerpos; y

l) otros principios bioactivos de origen marino, particularmente las didemninas tales como aplidina y las ecteinascidinas tales como ecteinascidina 743;

El procedimiento sintético preferido de la presente invención cuando se aplica a modo de ilustración a la preparación de trunkamida A se representa mejor en el esquema 1:

Esquema 1

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Tal como se muestra anteriormente en el esquema 1, el procedimiento preferido para la formación sintética de trunkamida A (I) y derivados y análogos se basa en un enfoque en fase sólida y comprende las etapas secuenciales
de:

(a) incorporar un Fmoc-aminoácido (Aaa_{6}) sobre un soporte sólido (por ejemplo, poliestireno, polietileno injertado sobre poliestireno, y similares) que contiene un grupo de unión (linker) o de sujeción (handle) lábil en medio superácido (por ejemplo, clorotritilo, polialcoxibencilo, y similares) que forma un enlace éster;

(b) alargar la cadena peptídica con cuatro aminoácidos (Aaa_{5}, Aaa_{4}, Aaa_{3}, Aaa_{2}) usando una estrategia de Fmoc/tBu;

(c) incorporar Fmoc-Ser-OH con la función de cadena lateral hidroxilo sin proteger;

(d) incorporar el Fmoc-Phe(S)-OH a través de su derivado 6-nitrobenzotriazol;

(e) separar el péptido protegido en cadena lateral del soporte sólido;

(f) ciclar a través del enlace de péptido;

(g) llevar a cabo la formación de tiazolina;

(h) eliminar, si procede, los diferentes grupos protectores de cadena lateral del isoprenilo.

Este procedimiento está controlado desde un punto de vista enantiomérico y estereomérico y es rápido, aprovechándose de la metodología sintética en fase sólida, en la que la molécula en construcción se une a un soporte insoluble durante operaciones sintéticas, véase Lloyd-Williams, P.; Albericio, F.; Giralt, E. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Raton (FL), 1997. Por tanto, puede eliminarse un exceso de reactivos y subproductos solubles simplemente mediante lavado de la molécula - resina con disolventes adecuados. Por lo tanto, pueden utilizarse grandes excesos de los reactivos solubles con el fin de dirigir las reacciones hasta su finalización en un periodo de tiempo corto, evitando la racemización (si procede) y otras reacciones secundarias. El método también puede automatizarse.

El procedimiento de esta invención para trunkamida A implica un cierre de anillo entre Aaa-1 y Aaa-6, en preferencia frente al cierre de anillo entre otros Aaa.

Una etapa final de este procedimiento para la trunkamida A tras el cierre de anillo de péptido implica la formación del anillo que es parte del Aaa-1. El procedimiento se modifica fácilmente para dar otros derivados heterocíclicos. La fórmula (II) cubre tiazolina, oxazolina e imidazolina y derivados aromáticos: tiazol, oxazol, e imidazol, mientras que la fórmula (III) también incluye tiazolidina, oxazolidina e imidazolidina.

Para la trunkamida A, la reacción relevante es entre el Ser-péptido unido a la resina y Fmoc-D-Phe(S)-Bt, dando el compuesto tia. Para un derivado de oxa, es entre el Ser-péptido unido a la resina y Fmoc-D-Phe-OH en presencia de un reactivo de acoplamiento (por ejemplo, DIPCDI). Para el azo (un N en vez de S u O), la reacción será entre un ácido diaminopropiónico (Dapa) - péptido unido a la resina y el cloroimidato de Fmoc-D-Phe-OH.

Para la preparación de los otros anillos, la reacción clave será entre el Fmoc-D-Phe-H (es el derivado aldehído de Fmoc-D-Phe-OH) y el cis-péptido unido a la resina para S; ser-péptido unido a la resina para O; y dapa - péptido unido a la resina para N. Esta etapa da el anillo heterocíclico insaturado y puede seguirse por aromatización con MnO_{2}.

El procedimiento de la invención es especialmente adecuado para compuestos con sustituyentes susceptibles, tales como en los que uno o ambos de R_{2} y R_{4} son 1,1-dimetilalilo.

El procedimiento preferido se aprovecha del enfoque en fase sólida, que es eficaz, rápido y fiable. En segundo lugar, la preparación de los elementos estructurales Fmoc-Ser(rPre)-OH y Fmoc-Thr(rPre)-OH es novedosa y fácil de ampliar en escala. En tercer lugar, la introducción de Fmoc-D-Phe(S)-OH evita la necesidad de una sulfuración en la cadena peptídica.

En comparación con la estrategia propuesta por Wipf [J. Org. Chem. 2000, 65, 1037-1049], las principales diferencias con los procedimientos de la presente invención son: (i) el presente procedimiento emplea el enfoque en fase sólida para el alargamiento de la cadena peptídica; Wipf usa un enfoque en disolución. (ii) la preparación de los elementos estructurales Fmoc-Ser(rPre)-OH y Fmoc-Thr(rPre)-OH para el presente procedimiento es más directo, implica menos etapas sintéticas, y es más fácil de ampliar en escala; Wipf usa una apertura regioselectiva de un anillo de aziridina; (iiii) Wipf introduce el residuo Phe como un aminoácido; el presente procedimiento lo introduce como un aminotioácido. Wipf tiene que llevar a cabo una deshidratación del péptido para obtener una oxazolina, a continuación la apertura del anillo de oxazolina con H_{2}S (una reacción bastante mala para la formación del péptido de tioamida, el mismo producto intermedio que para la presente invención), y la deshidratación final con DAST. Esta última etapa es común en ambos enfoques.

En resumen, la presente invención ofrece ventajas sobre el procedimiento descrito por Wipf.

El procedimiento preferido de la presente invención se ilustra en el esquema 1. Tal como se muestra en el mismo, y tal como se trata en más de detalles en los ejemplos que siguen a continuación, este procedimiento se llevó a cabo tal como sigue:

la preparación tanto de Fmoc-Aaa2-OH como de Fmoc-Aaa3-OH con la función hidroxilo en forma de isoprenilo, cuando puede aplicarse, se llevó a cabo a partir de los N\alpha-Fmoc-O-t-butil-aminoácidos correspondientes mediante la siguiente cascada de reacciones: (a) protección del grupo carboxilo en forma de éster tricloroetílico mediante reacción con el alcohol, DIPCDI y DMAP; (ii) eliminación de los grupos t-butilo con TFA-H_{2}O (19:1); (iii) formación del éter mediante reacción con el tricloroacetimidato correspondiente, véase Armstrong, A.; Brackenridge, I.; Jackson, R.F. W.; Kirk, J.M. Tetrahedron Letters 1988, 29, 20, 2483-2486; (iv) reducción parcial del triple enlace al doble mediante hidrogenación catalítica en presencia de Pd/C y quinolina; y (v) eliminación del éster tricloroetílico con Zn y NH_{4}OAc.

Fmoc-Aaa6-OH se incorporó preferiblemente a una resina de clorotritilo-poliestireno, véase Barlos, K.; Gatos, D.; Schäfer, W. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 590-593, en presencia de DIEA manteniendo el nivel de sustitución por debajo de 0,5 mmol/g (el uso de cargas superiores conlleva la presencia de péptidos acabados en el producto final, véase Chiva, C.; Vilaseca, M.; Giralt, E.; Albericio, F.J. Pept. Sci. 1999, 5, 131-140).

Se llevaron a cabo acoplamientos de Fmoc-Aaa-OH con DIPCDI (cantidad equimolar con respecto a Fmoc-Aaa-OH) en DMF durante 90 minutos. Para Fmoc-Aaa_{5}-OH y Fmoc-Aaa_{4}-OH, se usaron 5 equivalentes de exceso, mientras que se usaron 1,7 equivalentes para Fmoc-Aaa_{3}-OH y Fmoc-Aaa_{2}-OH, y 4 equivalentes para Fmoc-Ser-OH.

El Fmoc-aminotioácido se incorporó en forma del derivado de 6-nitrobenzotriazol, (Shalaby, M.A.; Grote, C.W.; Rapoport, H.J. Org. Chem. 1996, 61, 9045-9048) con un exceso de 3 equivalentes durante 90 minutos.

La eliminación del grupo Fmoc se llevó a cabo con piperidina-DMF (2:8, v/v) (1 x 1 minutos, 3 x 5 minutos, 1 x 10 minutos). Tras el acoplamiento se llevó a cabo una prueba de ninhidrina y si era positiva se repetía el acoplamiento en las mismas condiciones, si no el procedimiento continuaba. Se llevaron a cabo lavados entre las etapas de desprotección, acoplamiento, y, de nuevo desprotección con DMF (5 x 0,5 minutos) y CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 minutos) usando cada vez 10 ml de disolvente/ g de resina.

La separación del péptido protegido se consiguió mediante HFIP-CH_{2}Cl_{2} (1:4, 4 x 3 minutos), véase Bollhagen, R.; Schmiedberger, M.; Barlos, K.; Grell, E. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994, 2559-2560.

La etapa de ciclación se llevó a cabo con PyAOP-DIEA (2:4 equivalentes) en DMF durante 1 hora, véase Albericio, F.; Cases, M.; Alsina, J.; Triolo, S.A.; Carpino, L.A.; Kates, S.A. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4853-4856.

La formación del anillo de tiazolina se llevó a cabo a través de la activación del grupo \beta-hidroxilo de la Ser, preferiblemente mediante reactivo DAST, véase Halasz, S.P., Glemser, O. Chem. Ber. 1970, 103, 594-602; (b) Lafargue, P.; Guenot, P., Lellouche, J.P. Heterocycles 1995, 41, 947-958. y el desplazamiento posterior mediante el átomo de azufre, véase Wipf, P.; Millar, C.P.; Venkatraman, S.; Fritch, P.C. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 6395-6398. El uso de otros reactivos de activación, tales como el reactivo Burgess, véase Atkins, G.M.; Burgess, E.M. J. Am. Chem. Soc. 1968, 90, 4744-4745; (b) Burgess, E.M.; Penton, H.R.; Taylor, E.A. J. Org. Chem. 1973, 38, 26-31, o Mitsunobu, véase Galéotti, N.; Montagne, C.; Poncet, J.; Jouin, P. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 2807-2810 condujo también al producto diana, pero con rendimientos claramente inferiores.

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Ejemplos de la invención

Procedimientos generales. La Cl-TrtCl-resina, los derivados de Fmoc-aminoácidos, HOBt, PyAOP eran de PerSeptive Biosystems (Framingham, MA), Bachem (Bubendorf, Suiza), Albatross (Montreal, Canadá), y NovaBiochem (Läufelfingen, Suiza). La síntesis de 1-[N-Fmoc-D-tionofenilalanilil]-6-nitrobenzotriazol se llevó a cabo usando el método descrito por Rapoport y colaboradores. DIEA, DIPCDI, piperidina, Fmoc-Cl, NMM, cloroformato de isobutilo, 4-nitro-1,2-fenilendiamina, P_{4}S_{10}, 2-metil-3-butino-2-ol, tricloroacetonitrilo, TFA, DMAP, DCC, HFIP, DAST, Pd-C al 10%, CF_{3}SO_{3}H, 2,2,2-tricloroetanol y quinolina eran de Aldrich (Milwaukee, WI). DMF, CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3} y EtOAc eran de SDS (Peypin, Francia). Acetonitrilo (calidad para HPLC) y THF eran de Scharlau (Barcelona, España). Hexano, Et_{2}O, y metanol eran de Panreac (Moncada i Reixac, Barcelona). Todos los reactivos y disolventes comerciales se usaron tal como se recibieron con excepción del DMF y el CH_{2}Cl_{2} que se burbujearon con nitrógeno para eliminar contaminantes volátiles (DMF) y se almacenaron sobre tamices moleculares de 4 \ring{A} (Merck, Darmstadt, Alemania) (DMF) o CaCl_{2} (CH_{2}Cl_{2}), y Et_{2}O se almacenó sobre Na.

Se llevaron a cabo reacciones en disolución en matraces de fondo redondo. Se secaron extractos de disolvente orgánico sobre MgSO_{4} anhidro, seguido de la eliminación del disolvente a presiones reducidas y < 40ºC. Se llevaron a cabo síntesis en fase sólida en jeringuillas de polipropileno (10/20 ml) equipadas con un disco poroso de polietileno. Se eliminaron los disolventes y reactivos solubles mediante succión. La eliminación del grupo Fmoc se llevó a cabo con piperidina-DMF (2:8, v/v) (2 x 1 minuto, 2 x 20 minutos). Se llevaron a cabo lavados entres las etapas de desprotección, acoplamiento, y de nuevo, desprotección con DMF (5 x 1 minuto) y CH_{2}Cl_{2} (5 x 1 minuto) usando cada vez 10 ml de disolvente/g de resina. Se llevaron a cabo transformaciones de la síntesis de péptido y lavados se llevaron a cabo a 25ºC. Las columnas de HPLC (columna de fase invertida Nucleosil C_{18}, 4,6 X 250 mm,. 10 \mum) eran de Scharlau (Barcelona, España).

Se llevó a cabo HPLC analítico en un instrumento de Shimadzu que comprende dos bombas de administración de disolvente (modelo LC-6A), un inyector automático (modelo SIL-6B), un detector de longitud de onda variable (modelo SPD-6A), un controlador de sistema (modelo SCL-6B) y un trazador (modelo C-R6A). La detección de UV fue a 220 nm, y se llevaron a cabo gradientes lineales de CH_{3}CN (+ el 0,036% de TFA) en H_{2}O (+ el 0,045% de TFA) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min desde: (condición A) 0:1 a 1:0 a lo largo de 30 minutos; (condición B) 1:1 a 10:0 a lo largo de 30 minutos. Se llevó a cabo una cromatografía ultrarrápida usando gel de sílice 60 A C C 50-70 \mum SDS (Peypin, Francia). Se midieron las rotaciones ópticas en un polarímetro Perkin-Elmer 241 MC. Se midieron espectros de IR en un espectrómetro Nicolet 510 FT-IR. Se llevaron a cabo análisis de MALDITOF y de ES-MS de las muestras de péptidos en un Voyager DE RP de PerSeptive Biosystems, usando matrices de ACH o DHB, y en un espectrómetro Micromass VG-quattro. Se llevaron a cabo análisis de CI-MS de derivados de aminoácidos en un espectrómetro Hewlett Packard HP-5988A. Se llevó a cabo espectroscopia de ^{1}H-RMN (500 MHz, 200 MHz) y ^{13}C-RMN (50 MHz) en un Bruker DMX-500 (11,7 T) y Varian Gemini 200 (4,7 T). Los desplazamientos químicos (\delta) se expresan en partes por millón de desplazamiento a campo más bajo a partir de TMS (tetrametilsilano). Las constantes de acoplamiento se expresan en Herzios.

Las abreviaturas utilizadas para aminoácidos y las designaciones de péptidos siguen las reglas de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB en J. Biol. Chem. 1972, 247, 977-983. Se utilizan las siguientes abreviaturas adicionales: ACH, ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico; CI, ionización química (chemical ionization); Cl-TrtCl-resina, resina de cloruro de 2-clorotritilo; DAST, trifluoruro de (dietilamino)azufre; DCC, N,N’-diciclohexilcarbodiimida; DHB, ácido 2,5-dihidroxibenzoico; DIEA, N,N-diisopropiletilamina; DIPCDI, N,N’-diisopropilcarbodiimida; DMAP, 4-dimetilaminopiridina; DMF, N,N-dimetilformamida; ESMS, espectrometría de masas por electropulverización (electrospray mass spectrometry); EtOAc, acetato de etilo; Fmoc, 9-fluorenilmetoxicarbonilo; Fmoc-Phe(S)-NBt, 1-(N-Fmoc-D-tionofenilalaninil)-6-nitrobenzotriazol; HFIP, 1,1,1,3,3,3,-hexafluoro-2-propanol; HPLC, cromatografía de líquidos de alta resolución; HOBt, 1-hidroxibenzotriazol; rPr, 1,1-dimetilalilo, prenilo inverso; MALDI-TOF, ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo; MeOH, metanol; NMM, N-metilmorfolina; RMN, resonancia magnética nuclear; Oxa, oxazolina; PyAOP, hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1-il-N-oxi-tris(pirrolidino)fosfonio; SPS, síntesis en fase sólida; Tce, tricloroetanol; TFA, ácido trifluoroacético; THF, tetrahidrofurano; TMS; trimetilsililo; Tzn, tiazolina; UV ultravioleta. Los símbolos de aminoácidos denotan la configuración L a menos que se mencione lo contrario. Todas las razones de disolventes son volumen/volumen a menos que se mencione lo contrario.

Ejemplo 1 Fmoc-Ser-OTce (esquema 2)

Se disolvió Fmoc-Ser(tBu)-OH (1 g, 2,6 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (7 ml). En primer lugar se añadió DMAP (0,15 g, 1,3 mmoles, 0,5 equivalentes) y 2,2,2-tricloroetanol (Tce) (0,3 ml, 3,1 mmoles, 1,2 equivalentes), y a continuación se añadió DCC (0,63 g, 3,1 mmoles, 1,2 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml) en una atmósfera de N_{2} a 0ºC. Se dejó en agitación la mezcla de reacción durante 18 horas a temperatura ambientes. Se enfrió la reacción orgánica hasta 0ºC, se filtró y se concentró el filtrado a vacío. Se disolvió el producto bruto resultante en EtOAc (7 ml) y se lavó con ácido cítrico acuosos al 10% (2 x 10 ml), NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 10 ml) y salmuera (2 x 10 ml), se secó (MgSO_{4}), y se concentró a vacío para dar Fmoc-Ser(OtBu)-OTce (1,34 g), que se utilizó sin purificación adicional.

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Se disolvió Fmoc-Ser(tBu)-OTce en TFA-H_{2}O (19:1, 10 ml) y se dejó en agitación durante 5 horas. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (EtOAc-Hexano, 3:7) para dar Fmoc-Ser-OTce (0,83 g, 1,8 mmoles, un rendimiento global del 69% para las dos etapas).

HPLC analítica (t_{R}, 12,2 minutos, condición B). [\alpha]_{D} -5,6º (c 0,01, CHCl_{3}, 23ºC).

IR (película) 3407, 1769, 1692, 1516, 1209, 1082 cm^{-1}.

CI-MS, calculado para C_{20}H_{18}O_{5}NCl_{3} 457, hallado 475 [(M+NH_{4})^{+}, 100%].

HRMS (espectrometría de masas de alta resolución - high resolution mass spectrometry) (FAB) ES-MS, calculado 458, 0329, hallado 458,0332.

^{1}H-RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,70-7,20 (8H, m, Ar), 6,05 (1H, d, J= 8,0 Hz, NH), 4,85 (1H, d, J= 12,0 Hz, CH_{2} Tce), 4,67 (1H, d, J= 12,2 Hz, CH_{2} Tce), 4,60-4,54 (1H, m, \alpha-CH Ser), 4,45-4,30 (2H, m, CH_{2} Fmoc), 4,20-4,15 (1H, m, CH Fmoc), 4,10-3,85 (2H, m, \beta-CH_{2} Ser), 3,50 (1H, sa, OH). ^{13}C-RMN (50 MHz, CDCl_{3}) \delta: 169,0 (CO Ser), 156,2 (CO Fmoc), 143,5 (C Ar), 141,1 (C Ar), 127,6 (CH, Ar), 126,9 (CH Ar), 124,9 (CH Ar), 119,8 (CH Ar), 94,2 (CCl_{3} Tce), 74,4 (CH_{2} Tce), 67,2 (CH_{2} Fmoc), 62,6 (\beta-CH_{2} Ser), 55,9 (\alpha-CH Ser), 46,9 (CH Fmoc).

Esquema 2

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Ejemplo 2 Fmoc-Ser(rPr)-OH (Esquema 3)

Se disolvió Fmoc-Ser-OTce (0,83 g, 1,8 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} - hexano (2:1, 4 ml), y se añadieron tricloroacetimidato de 1,1-dimetilpropinilo (0,41 g, 1,8 mmoles, 1 equivalente) y CF_{3}SO_{3}H (40 \mul) en una atmósfera de N_{2}. Se dejó en agitación la mezcla de reacción durante 4 días añadiendo las mismas cantidades del tricloroacetimidato y CF_{3}SO_{3}H cada 24 horas. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró el filtrado a vacío, se disolvió en EtOAc (10 ml) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado (2 x 10 ml), H_{2}O (2 x 10 ml) y salmuera (2 x 10 ml). Se secó (MgSO_{4}) la disolución orgánica, y se concentró a vacío para obtener el 1,1-dimetilpropinil éter de Fmoc-Ser-OTce (0,95 g), que se utilizó sin purificación adicional.

Se disolvió el 1,1-dimetilpropinil éter de Fmoc-Ser-OTce en MeOH (20 ml), y se añadieron Pd-C al 10% (38 mg, un 4% del peso de producto bruto) y quinolina (0,44 ml, 0,45 ml por gramo de producto bruto) en una atmósfera de N_{2}. Se cambió la atmósfera de N_{2} a H_{2} y se dejó en agitación durante 2 horas. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (CHCl_{3}-Hexano, 8:2) para dar Fmoc-Ser(rPr)-OTce (0,38 g, 0,72 mmoles).

HPLC analítica (t_{R}, 20,7 minutos, condición B).

[\alpha]_{D} -26,4º (c 0,05, CHCl_{3}, 23ºC).

IR (película) 3442, 2979, 1782, 1506, 1451 cm^{-1}.

CI-MS, calculado para C_{25}H_{26}O_{5}NCl_{3} 525, hallado 526 [(M+H)^{+}, 34%], 543 [(M+NH_{4})^{+}, 100%].

HRMS (FAB) ES-MS, calculado 526, 0955, hallado 526, 0940.

^{1}H-RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,80-7,22 (8H, m, Ar), 5,82-5,65 (2H, m, CHiPr, NH), 5,20-5,10 (2H, m, CH_{2} iPr,), 4,87 (1H, d, J= 10,8 Hz, CH_{2} Tce), 4,74 (1H, d, J= 10,8 Hz, CH_{2} Tce), 4,70-4,60 (1H, m, \alpha-CH Ser), 4,50-4,35 (2H, m, CH_{2} Fmoc), 4,32-4,25 (1H, m, CH Fmoc), 3,90 (1H, dd, J= 8,0, 2,8 Hz, \beta-CH_{2} Ser), 3,60 (1H, dd, J= 8,0, 2,8 Hz, \beta-CH_{2} Ser), 1,6 (6H, s, 2 CH_{3} iPr).

^{13}C-RMN (50 MHz, CDCl_{3}) \delta: 168,1 (CO Ser), 155,2 (CO Fmoc), 143,2 (C Ar), 142,6 (CH iPr), 141,1 (C, Ar), 127,6 (CH Ar), 126,9 (CH Ar), 125,0 (CH Ar), 119,9 (CH Ar), 114,5 (CH_{2} iPr), 94,0 (CCl_{3} Tce), 75,6 (C iPr), 74,5 (CH_{2} Tce), 67,2 (CH_{2} Fmoc), 62,5 (\beta-CH_{2} Ser), 54,4 (\alpha-CH Ser), 47,0 (CH Fmoc), 25,6 (CH_{3} iPr), 25,3 (CH_{3} iPr).

Se disolvió Fmoc-Ser(rPr)-OTce (0,38 g, 0,72 mmoles) en THF (6 ml) y se añadieron polvo de Zn (1,56 g, 24 mmoles, 33,1 equivalentes) y NH_{4}OAc 1 M (1,35 ml, 1,3 mmoles, 1,87 equivalentes) en una atmósfera de N_{2}. Se dejó en agitación la mezcla de reacción durante 14 horas, se filtró y se concentró a vacío. Se disolvió el producto bruto en EtOAc (10 ml) se lavó con KHSO_{4} acuosos al 5% (2 x 10 ml) y salmuera (2 x 10 ml), se secó (MgSO_{4}) y se concentró a vació para dar Fmoc-Ser(rPr)-OH (0,28 g, 0,71 mmoles, un rendimiento global del 40% para las 3 etapas).

HPLC analítica (t_{R}, 11 minutos, condición B).

[\alpha]_{D} +11º (c 0,009, CHCl_{3}, 23ºC).

IR (película) 2977, 1725, 1510, 1451, 1209 cm^{-1}.

CI-MS, calculado para C_{23}H_{25}O_{5}N 395, hallado 396 [(M+H)^{+}, 18%], 413 [(M+NH_{4})^{+}, 59%].

HRMS (FAB) ES-MS, calculado 396,1811, hallado 396,1814.

^{1}H-RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,80-7,20 (8H, m, Ar), 5,80-5,60 (2H, m, NH, CHiPr), 5,11 (1H, d, J= 19,4 Hz, CH_{2} iPr,), 5,00 (1H, d, J= 11,6 Hz, CH_{2} iPr), 4,45-4,05 (4H, m, \alpha-CH Ser, CH_{2} Fmoc, CH Fmoc), 3,72 (1H, dd, J= 9,4, 2,6 Hz, \beta-CH_{2} Ser), 3,48 (1H, dd, J= 9,4, 2,6 Hz, \beta-CH_{2} Ser), 1,24 (6H, s, 2 CH_{3} iPr).

^{13}C-RMN (50 MHz, CDCl_{3}) \delta: 174,0 (CO Ser), 156,0 (CO Fmoc), 143,6 (C Ar), 142,7 (CH iPr), 141,1 (C, Ar), 127,5 (CH Ar), 126,9 (CH Ar), 125,0 (CH Ar), 119,8 (CH Ar), 114,4 (CH_{2} iPr), 75,7 (C iPr), 67,2 (CH_{2} Fmoc), 62,6 (\beta-CH_{2} Ser), 54,3 (\alpha-CH Ser), 47,0 (CH Fmoc), 25,5 (2 CH_{3} iPr).

Esquema 3

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Ejemplo 3 Fmoc-Thr-OTce

Según el procedimiento usado para la síntesis de Fmoc-Ser-OTce, Fmoc-Thr(OtBu)-OH (1 g, 2,5 mmoles) proporcionó Fmoc-Thr-OTce (0,81 g, 1,7 mmoles, un rendimiento global del 68% para dos etapas).

HPLC analítica (t_{R}, 14 minutos, condición B).

CI-MS, calculado para C_{21}H_{20}O_{5}NCl_{3} 472, hallado 473 [(M+H)^{+}, 76%]. HRMS (FAB) ES-MS, calculado 472,0485, hallado 472,0486.

^{1}H-RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,80-7,20 (8H, m, Ar), 5,80 (1H, d, J= 8,8 Hz, NH), 4,90 (1H, dd, J= 12 Hz, CH_{2} Tce), 4,70 (1H, dd, J= 12 Hz, CH_{2} Tce), 4,57-4,40 (4H, m, \alpha-CH Thr, CH_{2} Fmoc, \beta-CH Thr), 4,25-4,18 (1H, m, CH Fmoc), 2,41 (1H, sa, OH), 1,27 (3H, d, J= 7 Hz, \gamma-CH_{3} Thr).

^{13}C-RMN (50 MHz, CDCl_{3}) \delta: 169,4 (CO Thr), 156,7 (CO Fmoc), 143,4 (C Ar), 141,0 (C, Ar), 127,6 (CH Ar), 126,9 (CH Ar), 124,9 (CH Ar), 119,8 (CH Ar), 94,3 (Cl_{3} Tce), 74,3 (CH_{2} Tce), 67,5 (\beta-CH Thr), 67,2 (CH_{2} Fmoc), 59,2 (\alpha-CH Thr), 46,9 (CH Fmoc), 20,0 (\gamma-CH_{3} Thr).

Ejemplo 4 Fmoc-Thr(rPr)-OH

Según el procedimiento usado para la síntesis de Fmoc-Ser(OrPr)-OTce, Fmoc-Thr-OTce (0,81 g, 1,7 mmoles) proporcionó Fmoc-Thr(OrPr)-OTce (0,34 g, 0,63 mmoles).

HPLC analítica (t_{R}, 21,5 minutos, condición B).

[\alpha]_{D} -6,9º (c 0,0024, CHCl_{3}, 23ºC).

IR (película) 2929, 1732, 1507, 1261, 1092 cm^{-1}.

CI-MS, calculado para C_{26}H_{28}O_{5}NCl_{3} 539, hallado m/z 540 [M+H]^{+}.

HRMS (FAB) ES-MS, calculado 540,1111, hallado 540,1112.

^{1}H-RMN (250 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,80-7,30 (8H, m, Ar), 5,81-5,70 (1H, m, CH iPr), 5,66 (1H, d, J= 9,5 Hz, NH), 5,2-5,12 (2H, m, CH_{2}iPr), 4,88 (1 H, dd, J= 12 Hz, CH_{2} Tce), 4,62 (1H, dd, J= 12 Hz, CH_{2} Tce), 4,45-4,40 (3H, m, \alpha-CH Thr, CH_{2} Fmoc), 4,35-4,20 (2H, m, CH Fmoc, \beta-CH Thr), 1,30-1,27 (9H, m, \gamma-CH_{3} Thr, 2 CH_{3} iPr).

^{13}C-RMN (50 MHz, CDCl_{3}) \delta: 169,8 (CO Thr), 156,6 (CO Fmoc), 143,7 (C Ar), 143,5 (CH, iPr), 141,3 (C Ar), 127,7 (CH Ar), 127 (CH Ar), 125,2 (CH Ar), 120,0 (CH Ar), 114,2 (CH_{2}, iPr), 94,3 (CCl_{3} Tce), 76,0 (C iPr), 75,0 (CH_{2} Tce), 68,0 (\beta-CH Thr), 67,3 (CH_{2} Fmoc), 59,8 (\alpha-CH Thr), 47,2 (CH Fmoc), 26,6 (CH_{3} iPr), 26,1 (CH_{3} iPr), 20,7 (\gamma-CH_{3} Thr).

Según el procedimiento usado para la síntesis de Fmoc-Ser(rPr)-OH, Fmoc-Thr(rPr)-OTce (0,34 g, 0,63 mmoles) proporcionó Fmoc-Thr(rPr)-OH (0,24 g, 0,6 mmoles, un rendimiento global del 35% para 3 etapas).

HPLC analítica (t_{R}, 13,4 minutos, condición B).

CI-MS, calculado para C_{24}H_{27}O_{5}N 409, hallado m/z 410 [M+H]^{+}.

HRMS (FAB) ES-MS, calculado 410,1967 hallado 410,1974.

[\alpha]_{D} 18,3º (c 0,009, CHCl_{3}, 23ºC).

IR (película) 2979, 1726, 1506, 1451, 1211 cm^{-1}.

^{1}H-RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 7,80-7,20 (8H, m, Ar), 5,90-5,70 (2H, m, CH iPr, NH), 5,20 (1H, d, J= 10,2 Hz, CH_{2} iPr), 5,13 (1H, d, J= 3,2 Hz, CH_{2}iPr), 4,40-4,10 (5 H, m, \alpha-CH Thr, \beta-CH Thr, CH_{2} Fmoc, CH Fmoc), 1,31 (3H, d, J= 3,0 Hz, \gamma-CH_{3} Thr), 1,25 (6H, s, 2 CH_{3} iPr).

^{13}C-RMN (50 MHz, CDCl_{3}) \delta: 173,6 (CO Thr), 156,3 (CO Fmoc), 143,5 (C Ar), 142,4 (CH, iPr), 141,1 (C Ar), 127,6 (CH Ar), 126,1 (CH Ar), 125,0 (CH Ar), 119,0 (CH Ar), 114,9 (CH_{2}, iPr), 77,1 (C iPr), 67,7 (\beta-CH Thr), 67,2 (CH_{2} Fmoc), 58,9 (\alpha-CH Thr), 47,0 (CH Fmoc), 26,6 (CH_{3} iPr), 25,6 (CH_{3} iPr), 19,1 (\gamma-CH_{3} Thr).

Ejemplo 5 H-Pro-O-TrtCl-resina

Se colocó Cl-TrtCl-resina (1 g, 1,6 mmoles/g) en una jeringuilla de polipropileno de 20 ml equipada con un disco de filtro de polietileno. A continuación se lavó la resina con CH_{2}Cl_{2} (5 x 1 minuto), y se añadió una disolución de Fmoc-Pro-OH (0,27 g, 0,8 mmoles, 0,5 equivalentes) y DIEA (0,28 ml, 1,6 mmoles, 2 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml), y se agitó la mezcla durante 1 hora. Se finalizó la reacción mediante la adición de MeOH (0,8 ml) y tras una agitación adicional de 10 minutos. Se sometió la Fmoc-O-TrtCl-resina a los siguientes lavados/tratamientos con CH_{2}Cl_{2} (3 x 0,5 minutos), DMF (3 x 0,5 minutos), piperidina-DMF (1:4, 2 x 1,2 x 20 minutos), DMF (5 x 1 minuto), isopropanol (2 x 1 minuto), DMF (5 x 1 minuto), MeOH (2 x 1 minuto), CH_{2}Cl_{2} (3 x 1 minuto) y se secó a vacío.

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Ejemplo 6 H-D-Phe(S)-Ser-Thr(rPr)-Ser(rPr)-Ile-Ala-Pro-O-TrtCl-resina

Se añadieron secuencialmente Fmoc-Ala-OH (1,24 g, 4 mmoles, 5 equivalentes), Fmoc-Ile-OH (1,4 g, 4 mmoles, 5 equivalentes), Fmoc-Ser(rPr)-OH (0,54 g, 1,4 mmoles, 1,7 equivalentes), Fmoc-Thr(rPr)-OH (0,56 g, 1,4 mmoles, 1,7 equivalentes) y Fmoc-Ser-OH (1,05 g, 3,2 mmoles, 4 equivalentes) a la H-Pro-O-TrtCl-resina obtenida anteriormente usando DIPCDI (0,62 ml, 4 mmoles, 5 equivalentes, para Ala e Ile; 0,21 ml, 1,4 mmoles, 1,7 equivalentes, para Ser(rPr) y Thr(rPr); 0,49 ml, 3,2 mmoles, 4 equivalentes, para Ser) y HOBt (0,54 g, 4 mmoles, 5 equivalentes, para Ala e Ile; 0,18 g, 1,4 mmoles, 1,7 equivalentes, para Ser(rPr) y Thr(rPr); 0,43 g, 3,2 mmoles, 4 equivalentes, para Ser) en DMF (7 ml, para Ala, Ile y Ser) o CH_{2}Cl_{2} (4 ml, para Ser(rPr) y Thr(rPr)]. Finalmente, se añadió Fmoc-D-Phe(S)-NBt (1,32 g, 2,4 mmoles, 3 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (7 ml) al péptido-resina. En todos los casos, tras 90 minutos de acoplamiento, la prueba de la ninhidrina fue negativa. La eliminación del grupo Fmoc y los lavados se llevaron a cabo tal como se describió en procedimientos generales.

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Ejemplo 7 H-D-Phe(S)-Ser-Thr(rPr)-Ser(rPr)-Ile-Ala-Pro-OH

Se separó el péptido de la resina mediante HFIP-CH_{2}Cl_{2} (1:4, 4 x 3 minutos). Se evaporaron los filtrados combinados hasta sequedad a presión reducida, para dar 0,34 g del compuesto del título con una pureza de > 63% tal como se comprobó mediante HPLC (t_{R} 21,2 minutos, condición A).

ES-MS, calculado para C_{43}H_{67}N_{7}O_{10}S 873, hallado: m/z 874 [M+H]^{+}.

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Ejemplo 8 Ciclo[D-Phe(S)-Ser-Thr(rPr)-Ser(rPr)-Ile-Ala-Pro]

Se disolvió el péptido lineal bruto (0,34 g, 0,39 mmoles) en CH_{2}Cl_{2}-DMF (9:1, 150 ml), y se añadieron PyAOP (0,41 g, 0,78 mmoles, 2 equivalentes) y DIEA (0,27 ml, 1,55 mmoles, 4 equivalentes). Se dejó en agitación la mezcla durante 1 hora, y a continuación se eliminó el disolvente mediante evaporación a presión reducida. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía ultrarrápida (CHCl_{3}-MeOH, 9,8:0,2), para dar el producto del título (100 mg, 0,12 mmoles, un rendimiento del 15%).

HPLC analítica (t_{R}, 14,7 minutos, condición B).

ES-MS, calculado para C_{43}H_{65}N_{7}O_{9}S 855, hallado m/z 856 [M+H]^{+}.

HRMS (FAB) ES-MS, calculado 856,4642 hallado 856,4637.

^{1}H-RMN (500 MHz, CDCl_{3}) mostrado en la tabla I.

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TABLA I

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Ejemplo 9 Trunkamida A. Ciclo[D-Phe-Tzn-Thr(rPr)-Ser(rPr)-Ile-Ala-Pro]

Se disolvió el péptido cíclico en CH_{2}Cl_{2} (1 ml), y se añadió gota a gota DAST (17 \mul, 0,13 mmoles, 1,1 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (0,1 ml) a -20ºC en atmósfera de N_{2}. Tras 30 minutos se añadieron otros 1,1 equivalentes de DAST en las mismas condiciones y se dejó en agitación durante 30 minutos adicionales. Se eliminó el disolvente mediante evaporación a presión reducida. Se purificó el producto bruto mediante HPLC (columna de fase invertida Vydac C_{18}, 15-20 \mum, 250 x 10 mm), un gradiente lineal desde el 55% hasta el 70% de acetonitrilo en agua en 30 minutos, 3 ml/min, detección a 220 nm, para dar el producto del título (35 mg, 0,04 mmoles, un rendimiento del 33%).

HPLC analítica (t_{R}, 16,2 minutos, condición B).

ES-MS, calculado para C_{43}H_{63}N_{7}O_{8}S 837,5, hallado m/z 838,3 [M+H]^{+}, 860,3 [M+Na]^{+}.

HRMS (FAB) ES-MS, calculado 838,4537, hallado 838,4556.

^{1}H-RMN (600 MHz, CDCl_{3}:d^{6}DMSO, 7:3) mostrado en la tabla II.

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TABLA II

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Ejemplo 10 Ciclo[L-Phe-Tzn-Thr(rPr)-Ser(rPr)-Ile-Ala-Pro]

Se llevaron a cabo procedimientos experimentales como los descritos en los ejemplos 1 a 9 con la única excepción de que, en el ejemplo 6, se sustituyó Fmoc-D-Phe(S)-NBt por Fmoc-L-Phe(S)-NBt, que se preparó a partir de Boc-L-Phe-OH. Se caracterizó el producto.

HPLC (t_{R}, 18,8 minutos, condición B).

ES-MS, calculado para C_{43}H_{63}N_{7}O_{8}S 837,5, hallado m/z 838,3 [M+H]^{+}, 860,3 [M+Na]^{+}.

^{1}H-RMN (500 MHz, CDCl_{3}) mostrado en la tabla III.

TABLA III

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Ejemplo 11 Ciclo[L-Phe-Tzn-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Ala-Pro]

Se llevaron a cabo procedimientos experimentales como los descritos en los ejemplos 5 a 9, partiendo de 500 mg de resina, con las siguientes excepciones, en el ejemplo 6, se sustituyeron Fmoc-Ser(rPr)-OH, Fmoc-Thr(rPr)-OH, y Fmoc-D-Phe(S)-NBt por Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, y Fmoc-L-Phe(S)-NBt, respectivamente. Se caracterizó el producto.

HPLC (t_{R}, 18,7 minutos, condición B).

MALDI-TOF-MS, calculado para C_{41}H_{63}N_{7}O_{8}S 813,5, hallado m/z 814,6 [M+H]^{+}, 836,2 [M+Na]^{+}, 852,7

\hbox{[M+K] ^{+} ,}

^{1}H-RMN (500 MHz, CDCl_{3}) mostrado en la tabla IV.

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TABLA IV

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Ejemplo 12 Ciclo[L-Phe-Oxa-Thr(tBu)-Ile-Ala-Pro]

Se llevaron a cabo procedimientos experimentales como los descritos en los ejemplos 5 a 9, partiendo de 1 g de resina, con las siguientes excepciones, en el ejemplo 6, se sustituyeron Fmoc-Ser(rPr)-OH, Fmoc-Thr(rPr)-OH, y Fmoc-D-Phe(S)-NBt por Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, y Fmoc-L-Phe(O)-OH, respectivamente. Se caracterizó el producto.

HPLC (t_{R}, 21,1 minutos, condición A).

ES-MS, calculado para C_{41}H_{63}N_{7}O_{9}, 797,5, hallado m/z 798,1 [M+H]^{+},

^{13}C-RMN (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 172,4, 170,7, 170,2, 170,1, 169,9, 168,8, 167,4, 136,3, 129,4, 128,1, 126,5, 77,2, 75,8, 73,9, 70,7, 67,8, 65,9, 61,1, 59,6, 57,5, 56,2, 55,9, 49,1, 47,7, 47,2, 37,8, 36,4, 29,7, 28,2, 27,3, 25,4, 25,1, 23,6, 18,8, 18,3, 16,0, 12,0.

^{1}H-RMN (500 MHz, CDCl_{3}) mostrado en la tabla V.

TABLA V

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Claims (14)

1. Procedimiento para preparar un cicloheptapéptido que contiene un anillo heterocíclico de 5 miembros como parte del esqueleto del péptido cíclico, siendo el cicloheptapéptido de fórmula:

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en la que Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5}, y Aaa_{6} son independientemente residuos de \alpha-aminoácido, R_{1} es H o un grupo orgánico; X es independientemente O, S, o NH; cada Y es independientemente C o CH; Z es independientemente CH o CH_{2}; R_{a} es H o grupo alquilo; R_{g} es H o un grupo orgánico o está ausente; y cada línea punteada indica un segundo enlace permitido; procedimiento que comprende una síntesis en fase sólida de un precursor de péptido lineal ajustado para ciclación, o bien estando el precursor ajustado para la formación de un anillo heterocíclico o bien conteniendo el anillo heterocíclico, ciclación del heptapéptido lineal y si fuera necesario formación del anillo heterocíclico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una resina de cloruro de clorotritilo lábil en medio superácido.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la cadena de péptido se alarga usando una estrategia de base de fluorenilmetiloxicarbonilo.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, 2, ó 3, que comprende ciclar un heptapéptido lineal ajustado para la formación de anillo heterocíclico para dar un cicloheptapéptido ajustado para la formación de anillo heterocíclico, y a continuación formar de anillo heterocíclico.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, que incluye la etapa:

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en el que R_{a} es H o un grupo alquilo; Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5} y Aaa_{6} representan aminoácidos, X es O o S, y A es O o NH.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que X es O o S y el anillo cerrado es una oxazolina o tiazolina.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que X es S y el anillo cerrado es tiazolina.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende formar un precursor de heptapéptido lineal que incluye el anillo heterocíclico y a continuación ciclar del heptapéptido lineal.

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9. Procedimiento según la reivindicación 8, que incluye la etapa:

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en el que Fmoc es fluorenilmetiloxicarbonilo, R_{a} es H o un grupo alquilo, R_{1} es H o un grupo orgánico, péptido es Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5} y Aaa_{6} que representan aminoácidos, la esfera rellena es una fase sólida, y D es S, O o NH.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que el anillo heterocíclico formado mediante ciclación del heptapéptido lineal se hace reaccionar adicionalmente para formar un anillo heterocíclico aromático.

11. Compuesto de la siguiente fórmula (III):

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en la que Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5}, y Aaa_{6} son independientemente \alpha-aminoácidos de configuración L o D, si procede; en la que Aaa_{1} es independientemente un compuesto heterocíclico de cinco miembros aminoazol; en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno; en la que X es independientemente O, S, o NH; en la que R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e}, R_{f}, y R_{g} son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo y R_{g} puede estar ausente; en la que los pares R_{a}-R_{1}, R_{b}-R_{3}, R_{c}-R_{5}, R_{d}-R_{6}, R_{e}-R_{7}, R_{f}-R_{8} pueden formar parte del mismo grupo alquilo y por tanto, los aminoácidos correspondientes son cíclicos; en la que Y es independientemente C o CH; en la que cada Z es independientemente CH o CH_{2}; y la línea pun-
teada indica un segundo enlace permitido; con la excepción de trunkamida A y sus isómeros de las siguientes fórmulas:

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12. Compuesto de la siguiente fórmula (II):

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en la que Aaa_{2}, Aaa_{3}, Aaa_{4}, Aaa_{5}, y Aaa_{6} son independientemente \alpha-aminoácidos de configuración L o D, si procede; en la que Aaa_{1} es independientemente un compuesto heterocíclico de cinco miembros de aminoazol; en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno; en la que X es independientemente O, S, o NH; en la que R_{a}, R_{b}, R_{c}, R_{d}, R_{e}, y R_{f}, son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado del grupo que consiste en un grupo alquilo; en la que los pares R_{a}-R_{1}, R_{b}-R_{3}, R_{c}-R_{5}, R_{d}-R_{6}, R_{e}-R_{7}, y R_{f}-R_{8} pueden formar parte del mismo grupo alquilo y por tanto, los aminoácidos correspondientes son cíclicos; en la que Y es independientemente C o CH; en la que Z es independientemente CH o CH_{2}, con la excepción de trunkamida A y sus isómeros de las siguientes fórmulas:

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13. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 11 ó 12 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Uso de un compuesto según la reivindicación 11 ó 12 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.