ES2356389T3

ES2356389T3 - Constructos de vectores.

Info

Publication number: ES2356389T3
Application number: ES07000056T
Authority: ES
Inventors: Geert Plaetinck; Jean-Pierre Renard; Thierry Bogaert
Original assignee: Devgen NV
Current assignee: Devgen NV
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-18
Publication date: 2011-04-07
Anticipated expiration: 2021-05-18
Also published as: GB0112213D0; EP1775345B1; EP1285062A1; JP5153983B2; ES2281420T3; US20040166580A1; EP1775345A3; DE60143718D1; JP5645886B2; GB2365867B; EP1285062B1; JP2004524804A; US20080241894A1; GB0012233D0; GB2365867A; ATE354652T1; JP2012228256A; AU2001264166A1; EP1775345A2; US7932062B2

Abstract

Un constructo de ADN que comprende: a) un primer promotor y b) un segundo promotor, donde el primer y segundo promotores están en orientación opuesta entre si y definen: c) una región inter-promotores situada aguas abajo del extremo 3' del primer promotor y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor, donde dicha región inter-promotores comprende una secuencia de nucleótidos que forma un molde para la producción de ARN de doble hebra; y cuyo constructo de ADN comprende adicionalmente: d) un primer terminador de la transcripción, situado en la región inter-promotores aguas abajo, como se observa desde el extremo 3' del primer promotor, del primer promotor, donde el primer terminador de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor; caracterizado porque el primer y segundo promotores son promotores de bacteriófago, promotores procarióticos o promotores eucarióticos.

Description

Campo de la Invención

La invención se refiere a constructos de vectores mejorados para su uso en la expresión de ARN de doble hebra, concretamente para su uso en la expresión de ARN de doble hebra in vitro e in vivo.

Antecedentes de la invención 5

Desde la llegada de la inhibición del ARN de doble hebra (ARNi) como herramienta para controlar la expresión génica, como se describe en los documentos WO 99/32619 y WO 00/01846, se ha reconocido una necesidad de vectores especializados diseñados para la producción de ARN de doble hebra (ARNdh).

Los vectores de clonación diseñados para producir elevados niveles de ARNdh han sido previamente descritos por Plaetinck et al. (documento WO 00/01846) and Timmons et al. Nature, 395:854 (1998). Estos vectores contienen 10 generalmente un sitio de clonación múltiple (SCM) en el cual se pueden clonar fragmentos de ADN diana flanqueados por dos promotores transcripcionales oponibles. Esencialmente, estos tres componentes (Promotor 1, SCM y Promotor 2) constituyen el sistema completo. En el sistema de expresión apropiado, el ADN clonado en el SCM puede ser transcrito en ambas direcciones, conduciendo a la producción de dos hebras de ARN complementarias.

Una desventaja de los sistemas conocidos es que no solamente se transcribe el fragmento clonado. La lectura 15 de la ARN polimerasa dará como resultado la transcripción del vector completo, y esto también en ambas direcciones. Como solamente la transcripción del fragmento de ADN clonado dará como resultado un ARNdh activo para los fines del ARNi, la transcripción de la parte del vector da como resultado ARN inútil, ineficaz. Más específicamente, el 80% de estos transcritos pueden ser considerados no específicos y por lo tanto no eficaces.

Las grandes cantidades de ARN no específico generado por medio de los plásmidos y los sistemas de 20 expresión de la técnica anterior producen algunos efectos secundarios no deseables. Primero, en los protocolos de ARNi basados en la introducción de ADNdh en C. elegans por medio de un organismo alimenticio tal como E. coli que expresa el ADNdh (véase el documento WO 00/01846), se considera que grandes hebras de ARN son tóxicas para el organismo alimenticio. Como resultado, las grandes cantidades de ARN que se acumulan en E. coli hacen que una porción significativa de la población muera. Segundo, y probablemente más importante, es la reducción del potencial de 25 inhibición. La presencia de grandes cantidades de ADNdh no específico ocasiona un entorno competitivo para las secuencias especificadas. El potencial de las secuencias de ARNdh especificadas por el molde para inhibir la expresión de la proteína elegida como diana, por ejemplo, en células de C. elegans es reducido por la presencia de estas grandes regiones no específicas. Semejante inhibición por el ADNdh no específico ha sido desarrollada en Drosophila por Tushl et al., Genes & Development 13:3191-3197 (1999). No solamente resulta afectado el potencial para inhibir la expresión 30 génica, si no que también se limita la cantidad de ARNdh específico producido. Tercero, la transcripción de la porción del esqueleto del vector, más concretamente la transcripción del origen de replicación y las estructuras relacionadas, da como resultado la inestabilidad del plásmido y la reorganización del plásmido, conduciendo a una reducción de la producción de ARNdh. Esta concentración relativamente baja de ARNdh eficaz conduce a su vez a un ARNi ineficaz.

Para concluir, los vectores previamente descritos tienen los siguientes defectos: son tóxicos para el organismo 35 alimenticio, una mayor parte de los transcritos producidos son no específicos, el potencial inhibidor del ADNdh es reducido por la presencia de regiones no específicas, elevada incidencia de las reorganizaciones de plásmidos y pérdida del plásmido desde el organismo alimentador. Por lo tanto un objeto de la presente invención es proporcionar vectores mejorados para la producción de ADNdh que eviten las desventajas de los vectores de la técnica anterior.

Los vectores para su uso en la síntesis in vitro de transcritos de ARN, por ejemplo la producción de sondas de 40 ARN, son conocidos y han sido utilizados comúnmente en la técnica durante algún tiempo (véase por ejemplo F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); Jendrisak et al, Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence, documento US 4766072). En los protocolos de transcripción in vitro el problema de la transcripción de la lectura de las secuencias vectoras se evita generalmente linealizando el vector de transcripción en el sitio de restricción situado en el extremo 3' del transcrito 45 deseado. No obstante, esta solución no es apropiada para la transcripción in vivo o para la producción de ARNdh donde es importante que el molde sea transcrito en ambas direcciones.

Los autores de la presente invención proponen ahora una solución novedosa a los problemas encontrados con los vectores de la técnica anterior para la producción de ARNdh, basada en el uso de terminadores de la transcripción. Generalmente la solución consiste en el uso de al menos un terminador de la transcripción conectado operablemente al 50 menos a un promotor, donde el terminador detiene la transcripción iniciada por el promotor. Cualquier fragmento de ADN insertado entre el extremo 3' del promotor y el extremo 5' del terminador será transcrito después, sin la transcripción no deseada del esqueleto del vector. Preferentemente el vector consiste en dos promotores y dos terminadores, como se describe adicionalmente más abajo.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un constructo de ADN que 55 comprende dos promotores oponibles flanqueando una región inter-promotores, comprendiendo adicionalmente el constructo al menos un terminador de la transcripción situado transcripcionalmente aguas abajo de uno de dichos

promotores. En particular, la invención proporciona:

un constructo de ADN que comprende:

a) un primer promotor y

b) un segundo promotor, en el cual el primero y segundo promotor están en orientación opuesta entre sí y definen: 5

c) una región inter-promotores situada aguas abajo del extremo 3' del primer promotor y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor, donde dicha región inter-promotores comprende una secuencia de nucleótidos que forma un molde para la producción de ARN de doble hebra.

e) un primer terminador de la transcripción, situado (como se observa desde el extremo 3' del primer promotor) aguas abajo del primer promotor y aguas abajo del al menos un sitio de clonación, donde el primer terminador 10 de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor; caracterizado porque el primer y segundo promotores son promotores de bacteriófago, promotores procarióticos o promotores eucarióticos.

La región inter-promotores también puede ser definida adicionalmente como: la región de ADN entre el extremo 3' del primer promotor y el extremo 3' del segundo promotor, y que está aguas abajo del primer promotor, y que está aguas abajo del segundo promotor, y que preferiblemente no contiene el extremo 5' del primer promotor y del segundo 15 promotor. El primer promotor y el segundo promotor oponibles dirigen la expresión direccional desde sus extremos 5' a sus extremos 3' comenzando la transcripción aguas abajo de sus extremos 3', proporcionando de ese modo la transcripción de ambas hebras de cualquiera de las secuencias de nucleótidos presentes en la región inter-promotores.

En un segundo aspecto la invención proporciona el uso de un constructo de ADN para la producción de ARN de doble hebra para la inhibición de ARN, en el que dicho constructo de ADN comprende: 20

a) un primer promotor y

b) un segundo promotor,

en el que el primer y segundo promotores están en orientación opuesta entre sí y definen:

c) una región inter-promotores situada aguas abajo del extremo 3' del primer promotor y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor; 25

y cuyo constructo de ADN comprende adicionalmente:

d) al menos un sitio de clonación situado en la región inter-promotores; y

e) un primer terminador de la transcripción, situado (como se observa a partir del extremo 3' del primer promotor) aguas abajo del primer promotor y aguas abajo del al menos un sitio de clonación, donde el primer terminador de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor, y donde el primer terminador 30 de la transcripción está situado en la región inter-promotores;

caracterizado porque el primer y segundo promotores son promotores eucarióticos o promotores eucarióticos, pero no promotores de bacteriófago.

Los dos promotores presentes en el constructo de ADN de la invención pueden ser idénticos o pueden ser diferentes y pueden ser esencialmente de cualquier tipo. La naturaleza exacta de los promotores utilizados en el 35 constructo puede depender de la naturaleza del sistema de expresión en el cual se espera que funcione el constructo (p. ej., célula anfitriona procariótica vs. eucariótica). Se prefieren los promotores de bacteriófago, por ejemplo los promotores de T7, T3 y SP6, para su uso en los constructos de la invención, puesto que proporcionan las ventajas de un elevado nivel de transcripción que depende solamente de la unión de la ARN polimerasa apropiada. Cada uno de estos promotores puede ser seleccionado independientemente. Los promotores de fago también pueden funcionar en 40 una amplia variedad de sistemas anfitriones, esto es, anfitriones tanto procarióticos como eucarióticos, siempre que la polimerasa cognada esté presente en la célula anfitriona.

La disposición de los dos promotores "oponibles" que flanquean una región inter-promotores de manera que el inicio de la transcripción dirigido por uno de los promotores de como resultado la transcripción de la hebra efectora de la región inter-promotores y el inicio de la transcripción dirigido por el otro promotor de como resultado la transcripción de la hebra 45 antisentido de la región inter-promotores es una disposición bien conocida en la técnica, por ejemplo, en la serie de vectores pGEM7 de Promega Corp., Madison WI, USA.

Los constructos de ADN de la invención difieren de los de la técnica anterior debido a la presencia de al menos un terminador de la transcripción situado transcripcionalmente aguas abajo de uno de los promotores. El terminador de la transcripción puede ser uni- o bi-direccional, influyendo en la selección de terminadores uni- vs bi-direccionales el 50 posicionamiento del terminador o los terminadores dentro o fuera de la región inter-promotores, como se explica más

abajo. El terminador puede ser de origen procariótico, eucariótico o de fago. Son particularmente preferidos los terminadores de fago, por ejemplo T7, T3 y SP6. El único requerimiento es que el terminador debe ser capaz de causar la terminación del inicio de la transcripción en el promotor con respecto al cual está transcripcionalmente aguas abajo. En la práctica, esto significa que el promotor y el terminador deben formar una "combinación funcional", esto es, el terminador debe ser funcional para el tipo de ARN polimerasa que se inicia en el promotor. A modo de ejemplo, un 5 promotor de ARN pol II eucariótico y un terminador de ARN pol II eucariótico formarían generalmente una combinación funcional. La selección de una combinación funcional es particularmente importante cuando se van a utilizar promotores y terminadores de bacteriófago en los constructos de la invención, puesto que los promotores y terminadores de fago son ambos específicos de la polimerasa. Para formar una combinación funcional tanto el promotor como el terminador deben ser específicos para la misma polimerasa, p. ej. el promotor de T7 y el terminador de T7, el promotor de T3 y el 10 terminador de T3 etc.

En una realización, el constructo de ADN de la invención puede comprender un único terminador de la transcripción, situado (como se observa desde el extremo 3' del primer promotor) aguas abajo del primer promotor y aguas abajo del al menos un sitio de clonación, donde el primer terminador de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor, donde el único terminador de la transcripción está situado en la región inter-15 promotores.

En una disposición alternativa, el constructo de ADN comprende un único terminador de la transcripción situado fuera de la región inter-promotores. En una realización adicional, el constructo de ADN puede comprender dos terminadores de la transcripción, cada uno de los cuales está situado transcripcionalmente aguas abajo de uno de los dos promotores. En esta disposición, uno o ambos terminadores puede estar situado dentro de la región inter-20 promotores. Estas diferentes realizaciones de los constructos de ADN de la invención se describirán más completamente más abajo, con referencia a los dibujos adjuntos. La posición de un primer terminador de la transcripción fuera de la región inter-promotores también puede ser definida adicionalmente, esto es de manera que un primer terminador de la transcripción esté situado (como se observa desde el extremo 3' del primer promotor) aguas abajo del primer promotor, aguas abajo del al menos un sitio de clonación, y aguas abajo del extremo 5' del segundo promotor. 25

La posición de un segundo terminador de la transcripción fuera de la región inter-promotores también puede ser adicionalmente definida, esto es, de manera que un segundo terminador de la transcripción esté situado (como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor) aguas abajo del segundo promotor, aguas abajo del al menos un sitio de clonación, y aguas abajo del extremo 5' del primer promotor.

Por otra parte, cuando el terminador no está localizado en la región inter-promotores, la distancia entre el 30 extremo 5' del primer promotor y el extremo 3' del segundo terminador, o la distancia entre el extremo 5' del segundo promotor y el extremo 3' del primer terminador es preferiblemente pequeña, esto es, de manera que el extremo 3' del primer terminador de la transcripción esté separado del extremo 5' del segundo promotor por no más de 2000 nucleótidos, preferiblemente no más de 1000 nucleótidos, más preferiblemente no más de 500 nucleótidos, incluso más preferiblemente no más de 200 nucleótidos, especialmente preferiblemente no más de 100 nucleótidos, más 35 especialmente preferible no más de 50 nucleótidos, incluso más especialmente preferiblemente no más de 20 nucleótidos, concretamente preferiblemente no más de 10 nucleótidos, más concretamente preferiblemente no más de 6 nucleótidos.

Además, cuando el segundo terminador de la transcripción está localizado fuera de la región inter-promotores, preferiblemente el extremo 3' del segundo terminador de la transcripción se separa del extremo 5' del primer promotor 40 no más de 2000 nucleótidos, preferiblemente no más de 1000 nucleótidos, más preferiblemente no más de 500 nucleótidos, incluso más preferiblemente no más de 200 nucleótidos, especialmente preferiblemente no más de 100 nucleótidos, más especialmente preferiblemente no más de 50 nucleótidos, incluso más especialmente preferiblemente no más de 20 nucleótidos, concretamente preferiblemente no más de 10 nucleótidos, más concretamente preferiblemente no más de 6 nucleótidos. 45

Como se ha definido antes el término "región inter-promotores" hace referencia a toda la secuencia de ADN entre los dos promotores. Como se ha explicado antes, en ciertas realizaciones de la invención los terminadores de la transcripción pueden estar situados dentro de la región inter-promotores. La región inter-promotores puede comprender, ventajosamente, una secuencia de nucleótidos que forma un molde para la producción de ARNdh. La longitud y la naturaleza exacta de esta secuencia no es sustancial para la invención. Se describen en la presente memoria 50 constructos de ADN en los que la región inter-promotores comprende un sitio de clonación. La función del sitio de clonación es la de facilitar la inserción de un fragmento de ADN que forma un molde para la producción de ARNdh entre los dos promotores. De este modo, los autores de la presente invención describen en la presente memoria una serie de vectores de clonación que son de uso general en la construcción de vectores molde para la producción de ARNdh. Están incluidos en el alcance de la invención los vectores derivados de vectores de clonación que tienen un fragmento 55 de ADN insertado en el sitio de clonación.

El sitio de clonación puede comprender adicionalmente uno o más de los siguientes:

- al menos un sitio de restricción, (como es sabido en

la técnica), o uno o más sitios de restricción adicionales, p. ej. para proporcionar un sitio de clonación múltiple (como es sabido en la técnica),

- un ADN de relleno, p. ej., flanqueado por al menos

dos sitios de restricción, tales como dos sitios BstXI, o dos sitios de restricción XcmI,

- sitios de recombinación attR1 y attR2, 5

- una secuencia de nucleótidos ccdB,

- un nucleótido ccdB que comprende adicionalmente al

menos un único sitio de restricción con extremos romos, tal como un sitio de restricción SrfI, y/o

- un fragmento de ADN insertado en el al menos un

sitio de clonación. Todos los constructos de ADN proporcionados por la invención pueden, ventajosamente, 10 formar parte de un vector de clonación replicable, tal como, por ejemplo, un vector plasmídico. Además de los promotores oponibles, la región inter-promotores y uno o varios terminadores de la transcripción, el "esqueleto" del vector puede contener adicionalmente uno o más de los rasgos generales encontrados comúnmente en los vectores replicables, por ejemplo un origen de replicación para permitir la replicación autónoma en una célula anfitriona y un marcador selectivo, tal como un gen de resistencia a antibióticos. El gen marcador selectivo (p. 15 ej. el gen de resistencia a antibióticos) puede contener a su vez un promotor y un terminador de la transcripción y se debe entender que estos son completamente independientes de los elementos promotores y terminadores requeridos por la invención y no deben ser tenidos en cuenta en la determinación de si un vector concreto entra dentro del alcance de la invención.

Los constructos de ADN de acuerdo con la invención pueden ser construidos fácilmente a partir de los 20 elementos de la secuencia componente utilizando mecanismos recombinantes convencionales bien conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, por F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), como apreciará un experto en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada de la invención y los Ejemplos adjuntos.

Sigue una descripción detallada de los constructos de ADN de acuerdo con la invención, con referencia a los 25 siguientes dibujos esquemáticos en los que:

Las Figuras 1(a) a 1(e) son representaciones esquemáticas de varias realizaciones diferentes del constructo de ADN para su uso de acuerdo con la invención ilustrando la posición relativa de los elementos promotores y terminadores de la transcripción.

La Figura 2(a) es una representación esquemática de un vector de la técnica anterior incluida con fines 30 comparativos.

Las Figuras 2(b) a 2(e) son representaciones esquemáticas de varias realizaciones adicionales del constructo de ADN para su uso de acuerdo con la invención que ilustra el uso de diferentes sitios de clonación en la región inter-promotores.

Referente a los Dibujos, la Figura 1(a) ilustra esquemáticamente un primer constructo de ADN que es un vector 35 plasmídico que comprende dos promotores oponibles; un primer promotor a) y un segundo promotor b) 2 que flanquean una región inter-promotores c), cuya región inter-promotores está aguas abajo del 3' del primer promotor, y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor. El primer promotor y el segundo promotor pueden ser idénticos o diferentes. Esta realización comprende un primer terminador de la transcripción e) y un segundo terminador de la transcripción f) ambos los cuales están situados dentro de la región inter-promotores. En esta realización, el primer terminador y el segundo 40 terminador son preferentemente terminadores unidireccionales.

Se puede insertar un fragmento de ADN en el al menos un sitio de clonación d). Semejante fragmento está sujeto a transcripción dirigida por el primer promotor a) y el segundo promotor b) (esto es, transcripción de ambas hebras), dando como resultado la generación de dos fragmentos de ARN que se pueden combinar con un ARN de doble hebra del fragmento de ADN insertado (tanto in vitro como in vivo). 45

Cualquier secuencia de ADN deseada, tal como una secuencia de ADN genómico, o una secuencia de ADNc o cualquier otra secuencia codificante, puede ser insertada en el al menos un sitio de clonación. Sin estar limitado a ninguna explicación concreta, se supone que cuando a) y e) forman una combinación funcional, la ARN polimerasa que inicia la transcripción en a) transcribirá la región inter-promotores incluyendo el al menos un sitio de clonación y el fragmento de ADN insertado en el al menos un sitio de clonación y terminará cuando alcance e). De un modo similar, la 50 ARN polimerasa que inicia la transcripción en b) transcribirá la región inter-promotores incluyendo el al menos un sitio de clonación y el fragmento de ADN insertado en el al menos un sitio de clonación y terminará cuando alcance f). Los terminadores hacen que la ARN polimerasa se detenga, pare la transcripción y se separe del molde. Esto evita la

transcripción ilimitada del esqueleto vector, y reduce la transcripción no específica de ADN no esencial.

La región inter-promotores comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos correspondiente a una diana para la inhibición del ARN de doble hebra. Esta secuencia se denomina "TF" por fragmento diana (en sus siglas en inglés). Es esta secuencia la que, cuando se transcribe a ARNdh, será responsable de la inhibición específica del ARN de doble hebra de un gen diana. El fragmento diana se puede formar a partir de un fragmento de ADN genómico o 5 ADNc del gen diana. Su longitud y su secuencia de nucleótidos exactas no son sustanciales para la invención.

En la disposición mostrada en la Figura 1(a) los dos terminadores se sitúan a cualquier lado del TF dentro de la región inter-promotores. Cada uno de los terminadores está situado transcripcionalmente aguas abajo de uno de los promotores, el primer terminador e) está transcripcionalmente aguas abajo del primer promotor a) y el segundo terminador f) está transcripcionalmente aguas abajo del segundo promotor b). Suponiendo que a) y e) forman una 10 combinación funcional, como se ha descrito antes, la ARN polimerasa que inicia la transcripción en a) transcribirá la región inter-promotores hasta e incluyendo TF y terminará cuando alcance e). De un modo similar, la ARN polimerasa que inicia la transcripción en b) transcribirá la región inter-promotores hasta e incluyendo la TF de la hebra opuesta y terminará cuando alcance f). Los terminadores hacen que la ARN polimerasa se detenga, pare la transcripción y se separe del molde. Esto evita la transcripción ilimitada del esqueleto del vector, y reduce la transcripción no específica de 15 ADN no esencial.

Los transcritos generados a partir de este vector pueden ser, dependiendo de la situación precisa de los terminadores en el vector, ARNdh casi completamente específicos correspondientes a la región TF. Por medio de la colocación directa de las secuencias terminadoras en el extremo aguas abajo de la región TF a ambos lados del fragmento de ADN insertado, la cantidad de material transcrito es completamente reducida a las secuencias 20 especificadas por el molde. Por lo tanto, se obtiene una cantidad superior de ARNdh específico. Además los constructos son ahora más estables, debido a la no transcripción del esqueleto del vector. La última característica (estabilidad), combinada con la tasa de transcripción específica relativamente superior ahora, proporcionan un sistema adaptado a sintetizar cantidades superiores de hebras de ARNdh cortas específicas. Esta cantidad proporcionalmente superior de transcrito, que da como resultado concentraciones elevadas de ARNdh específico, aumenta el efecto inhibidor en los 25 protocolos con ARNi. En los protocolos con ARNi basados en la expresión de ARNdh en un organismo alimenticio, la toxicidad para los organismos alimenticios debida a la levada expresión de ARN se lleva a un nivel mínimo mediante el uso de este vector.

Un ejemplo específico de un vector del tipo ilustrado en la Figura 1(a), considerado por los autores de la presente invención como la disposición óptima para aplicaciones de ARNi, es el plásmido pGN9 descrito en los 30 Ejemplos adjuntos. Los terminadores transcripcionales utilizados en pGN9 son los terminadores específicos de la ARN polimerasa de T7, puesto que el vector contiene dos promotores de T7 oponibles. No obstante, se podrían utilizar otros sistemas tales como un sistema de expresión basado en el promotor, el terminador y la polimerasa de T3 o SP6, u otros promotores y terminadores procarióticos o eucarióticos.

La Figura 1(b) ilustra esquemáticamente un constructo de ADN adicional que es un vector plasmídico que 35 comprende dos promotores oponibles a) y b) que flanquean una región inter-promotores c). Este vector también comprende dos terminadores de la transcripción e) y f) pero en esta disposición los dos terminadores están situados fuera de la región inter-promotores, de hecho los elementos terminadores flanquean ahora los dos promotores. La disposición es tal que e) está aguas abajo transcripcionalmente de a) mientras f) está aguas abajo transcripcionalmente de b). Aquí de nuevo e) termina la transcripción iniciada por a), mientras f) termina la transcripción iniciada por el 40 promotor b). La colocación de los terminadores fuera de d) permite el uso de terminadores bidireccionales así como de terminadores unidireccionales, en contraste con la disposición de la Figura 1(a) donde se prefieren los terminadores unidireccionales debido a la colocación de los terminadores entre los promotores. Los numerosos terminadores bi-direccionales de acuerdo con la invención que se podrían utilizar son conocidos en la técnica. Generalmente se observa que estos son no específicos de la polimerasa. 45

La realización mostrada en la Figura 1(b) proporciona esencialmente las mismas ventajas que las mostradas en la Figura 1(a) sobre los vectores de la técnica anterior para la producción de ARNdh. El vector mostrado en la Figura 1(b) conducirá a la producción de transcritos que son ligeramente más largos, incluyendo las regiones promotoras. Esta diferencia relativamente pequeña en la longitud del transcrito y por tanto del ARNdh formado no afectará gravemente a la eficacia en el sistema de ARNi. 50

La posición de los terminadores y el promotor en el ejemplo mostrado en la figura 1(b) se encuentra preferiblemente en íntima proximidad, de manera que el extremo 5' de los promotores está separado del extremo 3' de los terminadores de la transcripción por no más de 2000 nucleótidos, preferiblemente no más de 1000 nucleótidos, más preferiblemente no más de 500 nucleótidos, incluso más preferiblemente no más de 200 nucleótidos, especialmente preferiblemente no más de 100 nucleótidos, más especialmente preferiblemente no más de 50 nucleótidos, incluso más 55 especialmente preferiblemente no más de 20 nucleótidos, concretamente preferiblemente no más de 10 nucleótidos, más concretamente preferiblemente no más de 6 nucleótidos.

La Figura 1(c) ilustra esquemáticamente un constructo de ADN adicional que es un vector plasmídico que comprende dos promotores oponibles a) y b) flanqueando una región inter-promotores c). En esta realización, un

terminador (en este caso e)) está situado dentro de c) y el otro (f)) está situado fuera de c). De nuevo, e) termina la transcripción iniciada por a) y f) termina la transcripción iniciada por b). Esta disposición puede proporcionar una solución útil al problema de que uno de los terminadores interfiera en la actividad polimerasa en la transcripción iniciada en la otra dirección (p. ej. f) interfiere con b)). Este vector proporciona esencialmente las mismas ventajas que las variaciones de vector mostradas en la Figura 1(a) y la Figura 1(b) sobre la técnica anterior. La diferencia relativamente 5 pequeña en la longitud del transcrito debido a la transcripción de uno de los promotores no afectará significativamente a la eficacia de los sistemas de ARNi. Este es más concretamente el caso cuando el terminador que está localizado fuera de la región inter-promotores c) está en íntima proximidad al promotor, como se ha definido antes.

Las Figuras 1(d) y 1(e) ilustran esquemáticamente dos constructos de ADN adicionales que son sendos vectores plasmídicos que comprenden dos promotores oponibles a) y b) flanqueando una región inter-promotores c). 10 Estas realizaciones comprenden solamente un único terminador. En la disposición mostrada en la Figura 1(d) un único terminador e) que termina la transcripción desde a) se coloca fuera de c). La situación del terminador fuera de la IPR permite el uso de un terminador bi-direccional o un terminador uni-direccional en este sistema. En la realización mostrada en la Figura 1(d) e) se coloca dentro de c). Por lo tanto a) debe ser preferiblemente un terminador uni-direccional. 15

Las realizaciones adicionales del constructo de ADN se ilustran esquemáticamente en las Figuras 2(b) a 2(e).

Estas realizaciones son todas vectores de clonación de plásmidos, basados en la disposición óptima de los promotores y los terminadores mostrados en la Figura 1(a), y descritos antes, que contienen sitios de clonación para facilitar la inserción de un fragmento de ADN en el al menos un sitio de clonación.

Estas realizaciones son todas vectores de clonación de plásmidos, basados en la disposición óptima de los 20 promotores y terminadores mostrados en la Figura 1(a), que contienen sitios de clonación para facilitar la inserción de un fragmento de ADN diana en la región inter-promotores.

La Figura 2(a), que es una representación esquemática de un vector de clonación de la técnica anterior, se incluye con fines comparativos. Este vector comprende dos promotores oponibles a) y b), que pueden ser idénticos o diferentes, flanqueando un sitio de clonación múltiple (SCM). 25

La Figura 2(b) ilustra un primer tipo de vector de clonación plasmídico. El vector contiene un primer promotor oponible a) y un segundo promotor oponible b) flanqueando la región inter-promotores. La región inter-promotores se puede definir adicionalmente como: la región de ADN entre el extremo 3' del primer promotor y el extremo 3' del segundo promotor, y que está aguas abajo del primer promotor, y que está aguas abajo del segundo promotor, y que preferiblemente no contiene el extremo 5' del primer promotor ni del segundo promotor. La región promotora inter-30 promotores comprende adicionalmente los terminadores e) y f) flanqueando un sitio de clonación múltiple SCM. El SCM comprende al menos un sitio de restricción individual, preferiblemente más de un sitio de restricción como es sabido en la técnica, cualquiera de los cuales puede ser utilizado para la inserción de un fragmento de ADN.

La Figura 2(c) ilustra un tipo adicional de vector de clonación plasmídico. Este vector contiene de nuevo promotores oponibles a) y b) flanqueando una región inter-promotores que comprende los terminadores e) y f). En esta 35 realización, a) y b) flanquean un sitio de clonación que está adaptado para facilitar la clonación de fragmentos de PCR, que comprende un ADN de relleno flanqueado por dos sitios de restricción idénticos, en este caso sitios BstXI. La secuencia específica del ADN de relleno no es esencial, siempre que dicho ADN de relleno no interfiera en el efecto deseado y/o la actividad deseada de los constructos de ADN de la invención. Un ejemplo específico de un vector de este tipo descrito en la presente memoria es el plásmido pGN29. 40

La clonación de productos de PCR utilizando sitios de reconocimiento de BstXI y adaptadores de BstXI es generalmente conocida en la técnica. Los adaptadores de BstX1 se obtienen comercialmente, por ejemplo de Invitrogen (Groningen, Países Bajos). Estos adaptadores son adaptadores no palindrómicos diseñados para una clonación más fácil y eficaz de los productos de PCR en vectores. Este uso de estos adaptadores reduce la concatamerización de adaptadores o insertos de ADN por no tener salientes (CACA) complementarios. El ADN de relleno se incluye 45 simplemente para permitir una fácil diferenciación entre el vector cortado con BstXI y el no cortado basándose en el tamaño. Su longitud y secuencia exactas no tienen importancia.

La Figura 2(d) ilustra un tipo de vector de clonación plasmídico adicional. Este vector contiene de nuevo los promotores oponibles a) y b) flanqueando una región inter-promotores que comprende los terminadores e) y f). En esta realización, a) y b) flanquean un sitio de clonación que facilita la clonación de "Alto Rendimiento" basándose en la 50 recombinación homóloga en lugar de en la digestión y ligación con enzimas de restricción. Como se muestra esquemáticamente en la Figura 2(d), el sitio de clonación comprende los sitios de recombinación attR1 y attR2 del bacteriófago lambda flanqueando un gen que es letal para E. coli, en este caso el gen ccdB.

Un método de clonación alternativo de fragmentos de ADN en este vector, (no mostrado en la Figura 2 (d)), consiste en una variante de este vector, donde la secuencia de ADN de ccdB comprende adicionalmente al menos un 55 sitio de restricción único, preferiblemente el al menos un sitio de restricción único es un sitio de restricción con extremos romos, tal como un sitio de restricción SrfI. La inserción de un fragmento de ADN en el al menos un sitio de restricción único da como resultado la inactivación del gen ccdB, y por consiguiente la inactivación del gen ccdB letal.

Una variante adicional de un vector se muestra en la Figura 2(d) en la que attR1 y attE2 no están presentes. Semejante vector comprende al menos un sitio de clonación, consistiendo dicho al menos un sitio de clonación en una secuencia ccdB, comprendiendo dicha secuencia ccdB además al menos un sitio de restricción único, preferiblemente el al menos un sitio de restricción único es un sitio de restricción con extremos romos, tal como un sitio de restricción SrfI. La inserción de un fragmento de ADN en el al menos un sitio de restricción único da como resultado la inactivación del 5 gen ccdB, y por consiguiente la inactivación del gen ccdB letal.

Estos sitios de clonación que comprenden la secuencia de nucleótidos ccdB y/o los sitios attR (R1 y/o R2) se obtienen a partir del sistema de clonación Gateway® asequible comercialmente de Life Technologies, Inc. El sistema de clonación Gateway® ha sido descrito extensamente por Hartley et al. en el documento WO 96/40724 (PCT/US96/10082). Un ejemplo específico de un vector de este tipo descrito en la presente memoria es 10 pGN39.

Las Figuras 2(e) y 2(f) ilustran otro tipo más de vector de clonación plasmídico. Este vector contiene de nuevo los promotores oponibles a) y b) flanqueando una región inter-promotores c) que comprende los terminadores e) y f). En la realización mostrada en las Figura 2(e), e) y f) flanquean un sitio de clonación que facilita la clonación de "alto rendimiento" de los productos de la PCR mediante clonación TA®. Este sitio de clonación comprende un ADN de relleno 15 flanqueado por dos sitios de restricción idénticos para una enzima que genera nucleótidos T sobresalientes. En este caso los sitios de restricción son sitios XcmI, pero se podrían utilizar otros sitios que son escindidos para generar nucleótidos T sobresalientes con un efecto equivalente. Los nucleótidos T sobresalientes facilitan la clonación de los productos de la PCR que tienen un nucleótido A sobresaliente. Este principio es conocido como clonación TA®. El vector cortado con los nucleótidos T sobresalientes puede ser "topomerizado" para generar un vector de clonación del tipo 20 mostrado esquemáticamente en la Figura 2(f), conectando la enzima topoisomerasa con los nucleótidos T sobresalientes. El vector resultante también facilita la clonación de productos de la PCR por el principio conocido como clonación TOPO®.

Los sistemas de clonación TOPO® y TA®, aunque no para los vectores descritos en esta invención, son asequibles comercialmente de Invitrogen. El sistema de clonación TOPO® ha sido descrito extensamente por Shuman 25 en el documento WO 96/19497 (PCT/US95/16099). El sistema de clonación TA® ha sido descrito extensamente por Hernstadt et al. en el documento WO 92/06189 (PCT/US91/07147).

Un lector experto apreciará fácilmente que mientras las Figuras 2(b)-2(f) ilustran la inclusión de diferentes sitios de clonación en un vector del tipo ilustrado en la Figura 1(a), estos sitios de clonación podían ser incluidos en cualquiera de los constructos de ADN de la invención, incluyendo los ilustrados esquemáticamente en las Figuras 1(b) a 1(e). 30

Aplicación de los constructos de ADN de la invención en la tecnología de ARNi.

Como se ha mencionado antes, una aplicación principal de los constructos/vectores de ADN descritos en la presente memoria está en la producción de ARN de doble hebra para su uso en la tecnología de ARNi. En particular, los constructos son útiles en protocolos de ARNi in vivo en el gusano nematodo C. elegans.

En C. elegans, el ARNi se ha realizado tradicionalmente mediante inyección de ARNdh en el gusano. Fire et al. 35 describen estos métodos extensamente en la Solicitud Internacional Núm. WO 99/32619. En resumen, ambas hebras de ARN son producidas in vitro utilizando kits de transcripción in vitro asequibles comercialmente. Se permite que ambas hebras de ARN formen ARNdh, después de lo cual el ADNdh se inyecta en C. elegans.

El nuevo sistema vector desarrollado por los autores de la presente invención supone una mejora drástica de este método tradicional. Primero, el ARN puede ser producido en una etapa, por ejemplo utilizando dos promotores 40 idénticos tales como en el vector pGN9. Segundo, y más importante, debido a la presencia de terminadores los transcritos, y por consiguiente el ARNdh formado, serán más específicos ya que sólo será transcrito el fragmento diana clonado. Esto dará como resultado un ARNi más eficaz.

Un método adicional para realizar experimentos de ARNi en C. elegans ha sido descrito por Plaetinck et al. en el documento WO 00/01846. En este método se alimentan gusanos de C. elegans con bacterias que producen ARNdh. 45 El ARNdh atraviesa la barrera del intestino del gusano e induce el mismo ARNi que si se hubiera inyectado el ARNdh. Para estos experimentos, la cepa de E. coli preferida es HT115 (DE3), y la cepa de C. elegans preferida es nuc-1;gun-1. Los vectores mejorados proporcionados por la invención también mejoran la eficacia del ARNi en este método, como se muestra en el ejemplo de más abajo, ya que sólo se produce ARNdh eficaz.

Otro método para realizar el ARNi también ha sido descrito por Plaetinck et al. en el documento WO 00/01846. 50 En resumen, este método se basa en la producción de ARNdh en el propio gusano. Esto se puede realizar utilizando promotores de gusano en los vectores descritos, o utilizando un gusano transgénico que exprese una polimerasa específica de promotores que no son de C. elegans presentes en el vector, de manera que esta polimerasa dirija la transcripción del ARNdh.

El ADN del vector plasmídico puede ser introducido en el gusano mediante varios métodos. Primero, se puede 55 introducir el ADN mediante un método de inyección tradicional (Methods in Cell Biology, Vol. 48, C. elegans Modern Biological Analysis of an organism, ed. por Epstein y Shakes). Segundo, se puede introducir el ADN mediante

alimentación de ADN. Como han demostrado Plaetinck et al. en el documento WO 00/01846, se puede introducir ADN plasmídico en el gusano alimentando al gusano con una cepa de E. coli que alberga el plásmido. Preferentemente la cepa de E. coli es OP50, o MC1061 o HT115 (DE3) pero cualquier otra cepa se podría adaptar para este fin. La cepa de C. elegans es preferentemente una cepa mutante nuc-1 o una cepa nuc-1; gun-1. El ADN plasmídico de E. coli atraviesa la barrera del intestino y se introduce en el nematodo, dando como resultado la expresión del ARNdh. 5 Como con los otros métodos de ARNi descritos antes, el uso del nuevo sistema vector aumentará el ARNi mediante la producción de ARNdh específico solamente.

La invención se comprenderá adicionalmente mediante la referencia a los siguientes Ejemplos experimentales, junto con las siguientes Figuras adicionales en las que:

La Figura 3 es una representación (mapa plasmídico) de pGN1. 10

La Figura 4 es una representación (mapa plasmídico) de pGN9.

La Figura 5 ilustra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de un plásmido pGN1, comentada para mostrar las posiciones de los promotores de T6 oponibles.

La Figura 6 representa la secuencia de nucleótidos del terminador de la transcripción de T7.

La Figura 7 ilustra las secuencias de oligonucleótidos oGN27, oGN28, oGN29 y oGN30 utulizadas para insertar los 15 terminadores de la transcripción de T7 en pGN1. Se marcan las posiciones de las secuencias terminadoras de pol de T7 y de los diferentes sitios de restricción.

La Figura 8 ilustra la secuencia de nucleótidos de un fragmento del plásmido pGN9, comentado para mostrar las posiciones de los promotores de T7 oponibles y los terminadores de la transcripción de T7.

La Figura 9 (a) es una representación (mapa plasmídico) de pGN29; (b) es una representación (mapa plasmídico) de 20 pGN39; (c) es una representación (mapa plasmídico) del plásmido TopoRNAi.

La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos completa del plásmido pGN9.

La Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos completa del plásmido pGN29.

La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos completa del plásmido pGN39.

La Figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos completa del plásmido TopoRNAi. 25

La Figura 14 muestra la secuencia completa del plásmido pGN49A.

La Figura 15 muestra la secuencia completa del plásmido pGN59A.

La Figura 16 es una representación (mapa plasmídico) de pGN49A.

La Figura 17 es una representación (mapa plasmídico) de pGN59A.

Ejemplo 1- Construcción del vector. 30

El punto de partida para la construcción de los vectores ilustrados en la presente memoria fue el plásmido pGN1. Este plásmido, descrito en la Solicitud Internacional co-pendiente del solicitante Núm. WO 00/01846, contiene dos promotores de T7 oponibles flanqueando un sitio de clonación múltiple.

La construcción del vector se llevó a cabo de acuerdo con los mecanismos de la biología molecular convencional conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, por F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in 35 Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

1) Construcción de pGN9

Primero se digirió pGN1 con las enzimas de restricción EcoRI y KpnI. Se recocieron los oligonucleótidos oGN27 y oGN28 (Figura 7) para generar un fragmento de doble hebra que después se ligó en el vector cortado con EcoRI/KpnI. El plásmido resultante se volvió a digerir con XbaI y HindIII. Los oligonucleótidos oGN29 y oGN30 se 40 recocieron para generar un fragmento de doble hebra que después se recoció en el vector cortado con XbaI/HindIII. El vector resultante se designó pGN9 (Figuras 4 y 10).

2) Construcción de vectores de clonación adicionales

El pGN29 (Figura 9(a); Figura 11) fue generado remplazando el SCM de pGN9 por un ADN de relleno flanqueado por los sitios BstXI. Los adaptadores de BstXI son asequibles comercialmente de Invitrogen (Groningen, 45 Países Bajos).

El pGN39 (Figura 9 (b); Figura 12) generado por medio de las siguientes etapas; se digirió pGN29 con BstXI. Los adaptadores de BstXI (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) fueron ligados a la Casete A proporcionada por el sistema GATEWAYTM (Life Technologies, Inc.). La casete A contiene attR1, CmR, CcdA, CcdB, attR2. La casete A con los adaptadores fue ligada después en el pGN29 digerido, dando como resultado pGN39A. pGN39A contiene un sitio SrfI único en el gen ccdB. 5

El vector TopoRNAi (figura 9 (c); figura 13) fue generado de la siguiente manera; se digirió pGN29 con BstXI. Utilizando la PCR con los cebadores oGN103 y oGN104 y el molde pCDM8 (Invitrogen, Groningen, Países Bajos), se generó un relleno que incluía sitios XcmI. Sobre el producto de la PCR, se ligaron los adaptadores de BstXI, y el producto de ligación resultante se ligó en el vector pGN29 digerido con BstXI dando como resultado el vector TopoRNAi.

oGN103:5'TACCAAGGCTAGCATGGTTTATCACTGATAAGTTGG 3' 10

oGN104:5'TACCAAGGCTAGCATGGGCCTGCCTGAAGGCTGC 3'

Se construyó PGN49A para insertar un sitio de restricción no romo único adicional y para suprimir el gen CmR pGN39. Se utilizó una PCR de solapamiento. Se llevó a cabo una primera PCR con los cebadores oGN126 y oGN127 y PGN39A como molde. Utilizando los cebadores oGN128 y oGN129 y el mismo molde se generó un segundo fragmento. La PCR de solapamiento utilizando los fragmentos resultantes y los cebadores oGN126P y oGN129P dio como 15 resultado un producto de PCR final. A este producto de PCR final, se ligaron los adaptadores de BstXI, y el producto de ligación se ligó en pGN29 digerido con BstXI. El vector resultante se denominó pGN49A.

Se generó un vector de control para someter a ensayo la eficacia del vector de clonación pGN49A, semejante vector debe contener los promotores de T7, pero no los terminadores de T7. Para esto, se aisló el inserto XbaI de pGN49A y se clonó en pGN1 digerido con la misma enzima de restricción. El vector resultante se denominó pGN59A. 20

oGN126 pGATCTGGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGATAACAGTATGC

oGN127 GGAGACTTTATCGCTTAAGAGACGTGCACTGGCCAGGGGGATCACC

oGN128: CCAGTGCACGTCTCTTAAGCGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCC-

GGTGG

oGN129 pGCTGTGTATAAGGGAGCCTGACATTTATATTCCCCAG 25

Ejemplo 2- Para ilustrar la utilidad de los vectores mejorados en ARN.

Este experimento se diseñó para ilustrar la eficacia mejorada de los vectores mejorados de esta invención en la inhibición de ARN de doble hebra, en comparación con los vectores conocidos en la técnica anterior. Cabría esperar un aumento significativo de la eficacia del sistema, ya que se producía ARNdh más eficaz y por consiguiente el ARNi funcionaba mejor. El sistema experimental para esta prueba del experimento concepto fue medir el rescate de C. 30 elegans a 25°C en mutantes de C. elegans nuc-1/pha-1(e2123)ts por medio de ARNi de sup35 utilizando la alimentación con ARNdh de pGN-2 (-terminador) y pGN-12 (+ terminador), con PGN-1 (vector vacío) como control y diluidor. La mutación pha-1 ts/sup-35 ha sido descrita extensamente por Schnabel en el documento WO 99/49066.

La mutación nuc-1 en C. elegans proporciona una cepa de C. elegans que muestra mejores capacidades de absorción, tales como la absorción de complejos de ARNdh que C. elegans de tipo salvaje. Este mutante está suprimido 35 en la mayoría de las enzimas ADNasa, y los autores de la invención han demostrado en solicitudes co-pendientes anteriores que esta cepa de C. elegans produce un ARNi mejorado mediante la alimentación del nematodo con ARNdh.

La mutación pha-1(e2123)ts proporciona una cepa de C. elegans mutante con un fenotipo de supervivencia a 15°C y letalidad a 25°C. Esta letalidad es suprimible mediante la inhibición de la expresión de sup-35. El ARNi de sup-35 debe facilitar de este modo el rescate de pha-1(e2123)ts a 25°C. Los vectores de la presente invención, cuando el 40 ARNdh de sup-35, deben incrementar la eficacia del ARNi de sup-35 en el rescate de los mutantes pha-1(e2123)ts a 25°C, en comparación con los vectores que no contienen los terminadores.

Se utilizó el vector pGN1 como vector vacío. El vector pGN2 (-terminador) es un vector que alberga ADN de sup-35 y que expresa ARNdh de sup-35 cuando se introduce en el anfitrión apropiado, el vector no tiene insertado ningún terminador transcripcional. El vector pGN12 (+ terminator) es un vector como se ha descrito antes, que contiene 45 los terminadores transcripcionales, y por consiguiente da como resultado una producción de ARNdh mejorada cuando se introduce en un anfitrión apropiado. De este modo, este vector tiene dos terminadores transcripcionales unidireccionales, ambos colocados dentro de la región inter-promotores, y flanqueando el fragmento sup-35. Se esperaba que el uso del último vector aumentara la eficacia del sistema, lo que significa aquí un mejor rescate (supervivencia) de los mutantes pha-1(e2123)ts a 25°C. 50

Condiciones experimentales

Se llenaron placas de microtitulación de 12 pocillos con aproximadamente 2 ml de agar NGM por pocillo.

(Un litro de agar NGM: 15 g de Agar, 1 g de peptona, 3 g de NaCl, 1 ml de solución de colesterol (5 mg/ml en EtOH), con adición en condiciones estériles después de someter a autoclave 9,5 ml de CaCl2 0,1 M, 9,5 ml de MgSO4 0,1 M, 25 ml de tampón KH2PO4/K2HPO4 1 M, pH 6, Ampicilina (100 µg/l), 5 ml de IPTG 0,1 M y 5 ml de solución de nistatina (disuelta a 10 mg/ml en EtOH:CH3COONH4 1:1 7,5 M).

Se aplicaron aproximadamente 50 μl de un cultivo durante la noche de bacterias HT115 (DE3) (Fire A, 5 Carnegie Institution, Baltimore, MD) transformadas con los plásmidos a las placas secas. Después se colocaron en pocillos individuales nematodos individuales en la fase de crecimiento L4, el día 1. En cada pocillo 1 nematodo (P1). El día dos, se colocaron los nematodos P1 en un nuevo pocillo y se dejaron incubando durante un día. El día 3 se repitió el mismo procedimiento. Todas las placas se incubaron adicionalmente a 25°C para permitir que se formara la progenie. La supervivencia inducida por ARN1 Sup35 (rescate) se midió mediante el recuento de los vástagos. 10

Resultados

El experimento de ARNi en mutantes nuc-1/pha-1(e2123)ts de C. elegans mediante alimentación con E. coli que expresa ARNdh de sup-35.

Escenario:

pGN1 como control 15

pGN2 (sup 35 - Term.)

pGN12 (sup 35 + Term.)

pGN2 + pGN1 diluciones 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32

pGN12 + pGN1 diluciones 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32

Condiciones: 20

Temperatura de incubación 25°C

Lectura:

Recuento de vástagos (hermafroditas adultos) pGN1 (control)

Día 1: 0 0 0 0

Día 2: 0 0 0 0

Día 3: 0 0 0 0

pGN2 (no diluido): pGN12 (no diluido)

Día 1: 12 4 48 32 Día 1 16 29 37 14

Día 2: 24 23 80 85 Día 2 27 22 57 2

Día 3: 5 0 9 16 Día 3 1 2 4 1

pGN 2+1, dilución 1/2: pGN 12+1, dilución 1/2

Día 1: 0 7 0 2 Día 1 22 28 103 61

Día 2: 9 10 0 3 Día 2 36 45 53 40

Día 3: 0 2 0 0 Día 3 3 3 25 1

pGN 2+1, dilución 1/4: pGN 12+1, dilución 1/4

pGN 2+1, dilución 1/2: pGN 12+1, dilución 1/2

Día 1: 28 23 0 0 Día 1 * 6 36 5

Día 2: 6 3 0 0 Día 2 24 55 3

Día 3: 0 0 0 0 Día 3

pGN 2+1, dilución 1/8: pGN 12+1, dilución 1/8

Día 1: 0 0 4 0 Día 1 31 12 16 38

Día 2: 0 0 11 0 Día 2 4 5 37 4

Día 3: 0 0 0 0 Día 3 0 0 2 1

pGN 2+1, dilución 1/16: pGN 12+1, dilución 1/16

Día 1: 0 0 0 0 Día 1 1 0 0 0

Día 2: 0 0 0 1 peq. Día 2 2 0 0 1

Día 3: 0 0 0 0 Día 3 0 1 1 1

pGN 2+1, dilución 1/32: pGN 12+1, dilución 1/32

Día 1: 0 0 0 0 Día 1 0 0 1 0

Día 2: 0 0 0 0 Día 2 0 L2 3 0

Día 3: 0 0 0 0 Día 3 2 0 L3-L4 0

* madre muerta

Conclusiones

Como se esperaba, los gusanos alimentados con bacterias que albergaban pGN1, no dieron como resultado 5 una progenie viable, debido al efecto letal de la mutación pha-1 a esta temperatura. La alimentación de nematodos con E. coli que alberga pGN2 o pGN12 produce en ambos casos, una progenie viable. Esto se debe a la alimentación del gusano con ARNdh de sup-35. La diferencia notable entre los dos experimentos de alimentación se puede observar en las series de dilución. Cuando se diluye la bacteria que alberga pGN2 con la bacteria que alberga pGN1, disminuye drásticamente el número de vástagos, incluso a una baja dilución de uno a dos. Esta serie de dilución indica que se 10 necesitan niveles elevados de ARNdh para tener una inducción de ARNi apropiada. En el experimento de alimentación con bacterias que albergaban pGN12, todavía se observó una progenie significativa a una dilución de uno a ocho. Esto indica que en las bacterias que albergan pGN12, se forma ARNdh mucho más eficaz. Este experimento muestra claramente que la adición de secuencias terminadoras en vectores para expresar ARNdh como se ha descrito antes proporciona una ventaja significativa en la generación del ARNi. 15

Ejemplo 3: Comparación de la eficacia del ARNi de vectores con y sin terminadores de T7 (pGN49 vs pGN59)

Se han clonado tres genes diferentes en los vectores pGN49A y pGN59A. La clonación se realizó amplificando los fragmentos génicos con ADN polimerasa de PfuI que produce extremos romos, facilitando la clonación en estos vectores. Estos fragmentos de PCR fueron clonados en los vectores digeridos con SrfI. La inserción del fragmento correcto en los clones se verificó mediante PCR. Los fragmentos se seleccionaron de manera que la expresión de dh y 20 el ARNi produce un fenotipo letal de la progenie. Este procedimiento permite comparar rápida y fácilmente la eficacia de los dos vectores pGN49 y pGN59 en el ARNi.

plásmido: Gen (acedb) Esqueleto vector

pGW5: B0511.8 pGN49A

pGW9: C01G8.7 pGN49A

pGW11: C47B2.3 pGN49A

pGW17: B0511.8 pGN59A

pGW21: C01G8.7 pGN59A

pGW23: C47B2.3 pGN59A

Todos los plásmidos (serie pGW) se transforman en bacterias E.coli AB301-105 (DE3) mediante la metodología convencional. Las bacterias se hacen crecer después en LB/amp a 37°C durante 14-18 h. Estos cultivos se centrifugaron y el sedimento bacteriano se disolvió en tampón S completo que contenía IPTG 1 mM 100 µg/µl de ampicilina. 5

En placas de 96 pocillos que contenían 100 µl de S-completo (que contenía IPTG 1 mM y 100 µg/µl de ampicilina concentración final) y 10 µl de solución de bacterias, se añadieron 3 nematodos a cada pocillo, estando los nematodos en la fase de crecimiento L1.

Las placas se incubaron a 25°C durante 5-6 días. Cada día se inspeccionaron las placas en busca del desarrollo de las larvas y la producción de vástagos F1. 10

Resultados

El ARNi se realizó ocho veces para cada plásmido construido. Los resultados demuestran que cuando los terminadores de T7 se insertan en el esqueleto del vector, el fenotipo esperado produce una incidencia del 100%. Cuando no se utilizan terminadores de T7, la reproducibilidad puede disminuir hasta un 50%. Como en el experimento previo, los resultados demuestran que la adición de los terminadores aumenta significativamente el funcionamiento del 15 ARNi.

fragmento de ADN: B0511.8 B0511.8 C01G8.7 C01G8.7 C47B2.3 C47B2.3

Vector: pGN49A pGN59A PGN49A pGN59A pGN49A pGN59A

Plásmido Resultante: PGW5 PGW17 PGW9 PGW21 PGW11 PGW23

Porcentaje letal: 100 75 100 87,5 100 50

Porcentaje progenie: 0 25 0 12,5 0 50

Fragmento de PCR generado por los cebadores oGN103 y oGN104 sobre el pCDM8 molde

Fragmento de PCR de solapamiento, que se utilizó para generar pGN49A

LISTA DE SECUENCIAS 5

<110> DEVGEN NV

<120> CONSTRUCTOS DE VECTORES

<130> SCB/55178/001

<140>

<141> 10

<160> 21

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1

<211> 160

<212> ADN 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento de pGN1 que contiene que contiene promotores de T7 oponibles

<400> 1

<210> 2 5

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de ADN que contiene un terminador de T7 10

<400> 2

actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg 49

<210> 3

<211> 70

<212> ADN 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN27

<400> 3

20

<210> 4

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 25

<223> Descripción de la Secuencia Artificial:

Oligonucleótido oGN28

<400> 4

<210> 5 30

<211> 65

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN29

<400> 5

<210> 6

<211> 65 5

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN30

<400> 6 10

<210> 7

<211> 230

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento del plásmido pGN9 que contiene promotores de T7 oponibles y terminadores de la transcripción de T7

<400> 7

20

<210> 8

<211> 3323

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 25

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido pGN9

<400> 8

<210> 9

<211> 3774

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido pGN29

<400> 9

<210> 10

<211> 5148

<212> ADN 5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido pGN39

<400> 10

<210> 11

<211> 3715

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido TopoRNAi

<400> 11

<210> 12

<211> 4107

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido pGN49A

<400> 12

<210> 13

<211> 4001

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 5

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Plásmido pGN59A

<400> 13

<210> 14

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN103

<400> 14

taccaaggct agcatggttt atcactgata agttgg 36

<210> 15 10

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN104 15

<400> 15

taccaaggct agcatgggcc tgcctgaagg ctgc 34

<210> 16

<211> 40

<212> ADN 20

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN126

<400> 16

gatctggatc cggcttacta aaagccagat aacagtatgc 40 25

<210> 17

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 5

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN127

<400> 17

ggagacttta tcgcttaaga gacgtgcact ggccaggggg

atcacc 46

<210> 18 10

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN128 15

<400> 18

ccagtgcacg tctcttaagc gataaagtct cccgtgaact ttacccggtg g 51

<210> 19

<211> 37 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido oGN129

<400> 19 25

gctgtgtata agggagcctg acatttatat tccccag 37

<210> 20

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 30

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: fragmento de PCR generado por cebadores oGN103 y 0GN104 sobre pCDM8

<400> 20

<210> 21

<211> 670

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: fragmento de PCR

<400> 21

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un constructo de ADN que comprende:

a) un primer promotor y

b) un segundo promotor,

donde el primer y segundo promotores están en orientación opuesta entre si y definen: 5

c) una región inter-promotores situada aguas abajo del extremo 3' del primer promotor y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor, donde dicha región inter-promotores comprende una secuencia de nucleótidos que forma un molde para la producción de ARN de doble hebra;

y cuyo constructo de ADN comprende adicionalmente:

d) un primer terminador de la transcripción, situado en la región inter-promotores aguas abajo, como se 10 observa desde el extremo 3' del primer promotor, del primer promotor, donde el primer terminador de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor;

caracterizado porque el primer y segundo promotores son promotores de bacteriófago, promotores procarióticos o promotores eucarióticos.
2. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente: 15

e) un segundo terminador de la transcripción situado en la región inter-promotores aguas abajo del segundo promotor, como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor,

donde el segundo terminador de la transcripción está conectado operablemente al segundo promotor.
3. Un constructo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el primer y el segundo promotores son idénticos. 20
4. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 donde el primer y el segundo promotores no son idénticos.
5. Un constructo de ADN de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, donde el primer promotor y el segundo promotor se seleccionan independientemente entre los promotores de T7, T3 o SP6.
6. El uso de un constructo de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la 25 producción de ARN de doble hebra para la inhibición del ARN, con la condición de que el primer y segundo promotores del constructo de ADN no son promotores de bacteriófago.
7. Una cepa bacteriana que alberga un constructo de ADN, donde dicho constructo de ADN comprende:

a) un primer promotor y

b) un segundo promotor, 30

donde el primer y el segundo promotores están en orientación opuesta entre si y definen:

c) una región inter-promotores situada aguas abajo del extremo 3' del primer promotor y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor, donde la región inter-promotores comprende una secuencia de nucleótidos que forma un molde para la producción de ARN de doble hebra;

y cuyo constructo de ADN comprende adicionalmente: 35

d) un primer terminador de la transcripción situado en la región inter-promotores y aguas abajo del primer promotor, como se observa desde el extremo 3' del primer promotor, donde el primer terminador de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor.
8. Una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 7, donde dicho constructo de ADN comprende adicionalmente: 40

e) un segundo terminador de la transcripción situado en la región inter-promotores y aguas abajo del segundo promotor, como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor,

donde el segundo terminador de la transcripción está conectado operablemente al segundo promotor.
9. Una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, donde el primer y el segundo promotores del constructo de ADN son idénticos. 45
10. Una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, donde el primer y el segundo promotores del constructo de ADN no son idénticos.
11. Una cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde el primer y el segundo promotores son promotores de bacteriófago, promotores eucarióticos o promotores eucarióticos.
12. Una cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicación 9 o reivindicación 10, donde el primer promotor y el 5 segundo promotor se seleccionan independientemente entre los promotores de T7, T3 o SP6.
13. Una cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, donde dicha cepa bacteriana es una cepa de E. coli.
14. El uso de la cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 o 13 para la producción de ARN de doble hebra para la inhibición del ARN, con la condición de que el primer y segundo promotores 10 del constructo de ADN no son promotores de bacteriófago.
15. El uso de un constructo de ADN para la producción de ARN de doble hebra para la inhibición de ARN, donde dicho constructo de ADN comprende:

a) un primer promotor y

b) un segundo promotor, 15

donde el primer y segundo promotores están en orientación opuesta entre si y definen:

c) una región inter-promotores situada aguas abajo del extremo 3' del primer promotor y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor;

y cuyo constructo de ADN comprende adicionalmente:

d) al menos un sitio de clonación situado en la región inter-promotores; y 20

e) un primer terminador de la transcripción, situado (como se observa desde el extremo 3' del primer promotor) aguas abajo del primer promotor y aguas abajo del al menos un sitio de clonación, donde el primer terminador de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor, y donde el primer terminador de la transcripción está situado en la región inter-promotores;

caracterizado porque el primer y segundo promotores son promotores procarióticos o promotores 25 eucarióticos, pero no promotores de bacteriófago.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho constructo de ADN comprende adicionalmente:

f) un segundo terminador de la transcripción situado, como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor, aguas abajo del segundo promotor y aguas abajo del al menos un sitio de clonación,

donde el segundo terminador de la transcripción se conecta operablemente al segundo promotor. 30
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde el segundo terminador de la transcripción está situado en la región inter-promotores.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 donde el segundo terminador de la transcripción está situado, como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor, aguas abajo del segundo promotor, aguas abajo del al menos un sitio de clonación, y aguas abajo del extremo 5' del primer promotor. 35
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, donde el extremo 3' del segundo terminador de la transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor por no más de 2000 nucleótidos.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, donde el extremo 3' del segundo terminador de la transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor por no más de 100 nucleótidos.
21. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, donde el primer y el segundo 40 promotores son idénticos.
22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, donde el primer y el segundo promotores no son idénticos.
23. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, donde el sitio de clonación comprende al menos un sitio de restricción. 45
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, donde el sitio de clonación comprende al menos dos sitios de restricción flanqueando una secuencia de ADN de relleno.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, donde los al menos dos sitios de restricción son idénticos.
26. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, donde el sitio de clonación comprende adicionalmente las secuencias de recombinación attR1 y attR2. 5
27. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, donde el sitio de clonación comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos ccdB.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, donde la secuencia de nucleótidos ccdB comprende adicionalmente al menos un sitio de restricción único.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, donde el al menos un sitio de restricción único es un sitio de 10 restricción con extremos romos.
30. El uso de acuerdo con la reivindicación 29, donde los sitios de restricción con extremos romos son sitios SrfI.
31. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 30, donde el constructo de ADN comprende adicionalmente: 15

g) un fragmento de ADN insertado en el al menos un sitio de clonación.
32. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 31, donde el constructo de ADN es un plásmido o un vector.
33. El uso de una cepa bacteriana que alberga un constructo de ADN para la producción de ARN de doble hebra para la inhibición de ARN, donde dicho constructo de ADN comprende: 20

a) un primer promotor y

b) un segundo promotor,

donde el primer y el segundo promotores están en orientación opuesta entre sí y definen:

c) una región inter-promotores situada aguas abajo del extremo 3' del primer promotor y aguas abajo del extremo 3' del segundo promotor; 25

y cuyo constructo de ADN comprende adicionalmente:

d) al menos un sitio de clonación situado en la región inter-promotores; y

e) un primer terminador de la transcripción, situado (como se observa desde el extremo 3' del primer promotor) aguas abajo del primer promotor y aguas abajo del al menos un sitio de clonación, donde el primer terminador de la transcripción está conectado operablemente al primer promotor, y donde el primer terminador de la 30 transcripción está situado en la región inter-promotores, con la condición de que el primer y el segundo promotores del constructo de ADN no sean promotores de bacteriófago.
34. El uso de acuerdo con la reivindicación 33, donde dicho constructo de ADN comprende adicionalmente:

f) un segundo terminador de la transcripción situado (como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor) aguas abajo del segundo promotor y aguas abajo del al menos un sitio de clonación, 35

donde el segundo terminador de la transcripción está conectado operablemente al segundo promotor.
35. El uso de acuerdo con la reivindicación 34, donde el segundo terminador de la transcripción está situado en la región inter-promotores.
36. El uso de acuerdo con la reivindicación 34, donde el segundo terminador de la transcripción está situado, como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor, aguas abajo del segundo promotor, aguas abajo del al 40 menos un sitio de clonación, y aguas abajo del extremo 5' del primer promotor.
37. El uso de acuerdo con la reivindicación 36, donde el extremo 3' del segundo terminador de la transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor por no más de 2000 nucleótidos.
38. El uso de acuerdo con la reivindicación 36, donde el extremo 30 del segundo terminador de la transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor por no más de 100 nucleótidos. 45
39. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38, donde el primer y el segundo promotores del constructo de ADN son idénticos.
40. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38, donde el primer y el segundo promotores del constructo de ADN no son idénticos.
41. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 40, donde el primer y el segundo 5 promotores del constructo de ADN son promotores procarióticos o promotores eucarióticos.
42. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 41, donde el constructo de ADN comprende adicionalmente un fragmento de ADN insertado en el al menos un sitio de clonación.
43. Una cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 42, donde el constructo de ADN es un plásmido o vector. 10