ES2281420T3 - Construcciones de vector. - Google Patents
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Abstract
Uso de una construcción de ADN para producir ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana, en el que dicha construcción de ADN comprende: a) un primer promotor y b) un segundo promotor, en la que el primer y segundo promotores están en orientación opuesta entre sí y definen una región entre promotores colocada cadena abajo del extremo 3'' del primer promotor y cadena abajo del extremo 3'' del segundo promotor; c) al menos un sitio de clonación colocado en la región entre promotores; d) una secuencia de nucleótidos que corresponde a dicha secuencia diana insertada en dicho al menos un sitio de clonación; e) un primer terminador de la transcripción colocado, como se observa desde el extremo 3'' del primer promotor, cadena abajo del primer promotor y cadena abajo de la secuencia de nucleótidos correspondiente a dicha secuencia diana, en la que el primer terminador de la transcripción está unido de forma operativa al primer promotor; caracterizada porque el primer promotor y el segundo promotor son promotores de bacteriófagos.
Description
Construcciones de vector.
La invención se refiere a construcciones de
vector mejoradas para su uso en la expresión de ARN bicatenario,
particularmente para su uso en la expresión de ARN bicatenario in
vitro e in vivo.
Desde la llegada de la inhibición por ARN
bicatenario (ARNi) como herramienta para controlar la expresión
génica, como se describe en el documento WO 99/32619 y WO 00/01846,
se ha reconocido una necesidad de vectores especializados diseñados
para la producción de ARN bicatenario (ARNds).
Los vectores de clonación diseñados para
producir elevados niveles de ARNds se han descrito previamente por
Plaetinck et al. (Documento WO 00/01846) y Timmons et
al. Nature, 395: 854 (1998). Estos vectores generalmente
contienen un sitio de clonación múltiple (MCS) en el que los
fragmentos de ADN diana pueden clonarse flanqueados por dos
promotores transcripcionales oponibles. Esencialmente, estos tres
componentes (Promotor 1, MCS y Promotor 2) componen el sistema
completo. En el sistema de expresión apropiado, el ADN clonado en el
MCS puede transcribirse en ambas direcciones, conduciendo a la
producción de dos cadenas de ARN complementarias.
Una desventaja de los sistemas conocidos es que
no se transcribe solamente el fragmento clonado. La lectura de la
ARN polimerasa provocará la transcripción del vector completo, y
esto también en ambas direcciones. Como solamente la transcripción
del fragmento de ADN clonado producirá ARNds activo para los
propósitos de ARNi, la transcripción de parte del vector produce un
ARN ineficaz, inútil. Más específicamente, el 80% de estos
transcritos puede considerarse como no específico y por tanto no
eficaz.
Las grandes cantidades de ARN no específico
generado por los sistemas de plásmido y expresión de la técnica
anterior produce algunos efectos secundarios no deseables. Primero,
en protocolos de ARNi basados en la introducción de ARNds en C.
elegans mediante un organismo de alimento tal como E.
coli que expresa el ARNds (véase documento WO 00/01846), se
considera que las cadenas de ARN grandes son tóxicas para el
organismo de alimento. Como resultado, grandes cantidades de ARN
acumulándose en E. coli provocan que una parte significativa
de la población muera. Segundo, y probablemente más importante, es
la reducción del potencial de inhibición. La presencia de grandes
cantidades de ARNds no específico produce un entorno competitivo por
las secuencias especificadas. El potencial de las secuencias de
ARNds especificadas por el molde de inhibir la expresión de la
proteína dirigida en, por ejemplo, células de C. elegans se
reduce por la presencia de estas grandes regiones no específicas.
Dicha inhibición por ARNds no específico también se ha demostrado en
Drosophila por Tushl et al., Genes & Development
13: 3191-3197 (1999). No solamente el potencial de
inhibir la expresión génica está afectado, sino que también está
limitada la cantidad de ARNds específico producido. Tercero, la
transcripción de la parte estructural del vector, más
particularmente la transcripción del origen de replicación y
estructuras relacionadas, provoca la inestabilidad del plásmido y
la reorganización del plásmido, conduciendo a una producción
reducida de ARNds. Esta concentración relativamente baja de ARNds
eficaz a su vez conduce a un ARNi ineficaz.
Para concluir, los vectores descritos
previamente tienen los siguientes inconvenientes: son tóxicos para
el organismo de alimentación, una proporción mayor de los
transcritos producidos son no específicos, el potencial inhibidor
del ARNds se reduce por la presencia de regiones no específicas, una
elevada incidencia de reorganizaciones del plásmido y una pérdida
del plásmido del organismo de alimentación. Por lo tanto, un objeto
de la presente invención es proporcionar vectores mejorados para la
producción de ARNds que evite las desventajas de los vectores de la
técnica anterior.
Los vectores para su uso en la síntesis in
vitro de transcritos de ARN, por ejemplo la producción de sondas
de ARN, han sido conocidos y habitualmente usados en la técnica
durante algún tiempo (véase, por ejemplo, F. M. Ausubel et
al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, Inc. (1994); Jendrisak et al, Vectors for
in vitro production of RNA copies of either strand of a
cloned DNA sequence, documento US 4.766.072). En protocolos de
transcripción in vitro convencionales el problema de la
transcripción por lectura de las secuencias del vector generalmente
se evita linealizando el vector de transcripción en el sitio de
restricción situado en el extremo 3' del transcrito deseado. Sin
embargo, esta solución no es apropiada para la transcripción in
vivo o para la traducción de ARNds donde es importante que el
molde se transcriba en ambas direcciones.
Ahora se propone una nueva solución a los
problemas encontrados con los vectores de la técnica anterior para
la producción de ARNds, en base al uso de terminadores de la
transcripción. Generalmente la solución consiste en el uso de al
menos un terminador de la transcripción unido de forma operativa a
al menos un promotor, donde el terminador detiene la transcripción
iniciada por el promotor. Cualquier fragmento de ADN insertado entre
el extremo 3' del promotor y el extremo 5' del terminador se
transcribirá después, sin la transcripción no deseada de la
estructura del vector. Preferentemente, el vector está compuesto por
dos promotores y dos terminadores, como se describe adicionalmente
a continuación.
Por lo tanto, de acuerdo con la invención se
proporciona el uso de una construcción de ADN para producir ARN
bicatenario correspondiente a una secuencia diana, comprendiendo la
construcción de ADN:
(a) un primer promotor y
(b) un segundo promotor,
en la que el primer y segundo promotores están
en orientación opuesta entre sí y definen una región entre
promotores colocada cadena abajo del extremo 3' del primer promotor
y cadena abajo del extremo 3' del segundo promotor; y dicha
construcción de ADN comprende adicionalmente:
(c) al menos un sitio de clonación
colocado en la región entre promotores; y
(d) un primer terminador de la
transcripción, colocado (como se observa desde el extremo 3' del
primer promotor) cadena abajo del primer promotor y cadena abajo de
la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia diana,
en la que el primer terminador de la transcripción está unido de
forma operativa al primer promotor,
caracterizada porque el primer promotor y el
segundo promotor son promotores de bacteriófago.
La región entre promotores también puede
definirse adicionalmente como: la región de ADN entre el extremo 3'
del primer promotor y el extremo 3' del segundo promotor, y que está
cadena abajo del primer promotor, y que está cadena abajo del
segundo promotor, y que preferiblemente no contiene el extremo 5'
del primer promotor y del segundo promotor. El primer promotor y el
segundo promotor oponibles dirigen la expresión direccional desde
sus extremos 5' hasta sus extremos 3' comenzando la transcripción
cadena abajo de sus extremos 3', proporcionando de este modo la
transcripción de ambas cadenas de cualquier secuencia o secuencias
de nucleótidos presentes en la región entre promotores.
Los dos promotores presentes en la construcción
de ADN de la invención son promotores de bacteriófagos y pueden ser
idénticos o pueden ser diferentes. La naturaleza precisa de los
promotores usados en la construcción puede depender de la
naturaleza del sistema de expresión en el que se espera que funcione
la construcción (por ejemplo, célula hospedadora procariota frente
a eucariota). Los promotores de bacteriófagos, por ejemplo los
promotores T7, T3 y SP6, se usan en las construcciones de la
invención, ya que proporcionan ventajas de elevado nivel de
transcripción que depende solamente de la unión de la ARN polimerasa
apropiada. Cada uno de estos promotores puede elegirse
independientemente. Los promotores de fagos también pueden funcionar
en una amplia diversidad de sistemas hospedadores, es decir,
hospedadores tanto procariotas como eucariotas, con la condición de
que la polimerasa afín esté presente en la célula hospedadora.
La disposición de dos promotores
"oponibles" que flanquean una región entre promotores de modo
que el inicio de la transcripción dirigido por unos de los
promotores provoque la transcripción de la cadena con sentido de la
región entre promotores y el inicio de la transcripción dirigido por
el otro promotor provoque la transcripción de la cadena antisentido
de la región entre promotores es una disposición bien conocida en la
técnica, por ejemplo, en la serie de vectores pGEM7 de Promega
Corp., Madison WI, USA.
Las construcciones de ADN de la invención
difieren de las de la técnica anterior en la presencia de al menos
un terminador de la transcripción colocado transcripcionalmente
cadena abajo de uno de los promotores. El terminador de la
transcripción puede ser uni o bidireccional, estando influenciada la
elección de terminadores unidireccionales frente a bidireccionales
por la colocación del terminador o terminadores en o fuera de la
región entre promotores, como se explica a continuación. El
terminador puede ser de origen procariota, eucariota o fágico. Los
terminadores de bacteriófagos, por ejemplo terminadores T7, T3 y
SP6, son particularmente preferidos. El único requisito es que el
terminador debe ser capaz de provocar la terminación de la
transcripción que se inicia en el promotor con relación al que está
transcripcionalmente cadena abajo. En la práctica, esto significa
que el promotor y el terminador deben formar una "combinación
funcional", es decir, el terminador debe ser funcional para el
tipo de ARN polimerasa que inicia en el promotor. A modo de ejemplo,
un promotor para la ARN pol II eucariota y un terminador para la
ARN pol II eucariota generalmente formarían una combinación
funcional. La selección de una combinación funcional es
particularmente importante cuando tienen que usarse promotores y
terminadores de bacteriófagos en las construcciones de la invención,
ya que los promotores y terminadores fágicos son ambos específicos
de polimerasa. Para formar una combinación funcional tanto el
promotor como el terminador deben ser específicos para la misma
polimerasa, por ejemplo, promotor T7 y terminador T7, promotor T3 y
terminador T3 etc.
En una realización, la construcción de ADN de la
invención puede comprender un único terminador de la transcripción,
colocado (como se observa a partir del extremo 3' del primer
promotor) cadena abajo del primer promotor y cadena abajo de al
menos un sitio de clonación, en la que el primer terminador de la
transcripción está unido de forma operativa al primer promotor,
donde el único terminador de la transcripción está colocado en la
región entre promotores.
En una disposición alternativa, la construcción
de ADN comprende un único terminador de la transcripción colocado
fuera de la región entre promotores. En una realización adicional
más, la construcción de ADN puede comprender dos terminadores de la
transcripción, cada uno de los cuales está colocado
transcripcionalmente cadena abajo de uno de los dos promotores. En
esta disposición, uno o ambos terminadores pueden colocarse en la
región entre promotores. Estas diversas realizaciones de las
construcciones de ADN de la invención se describirán más
completamente a continuación, con referencia a los dibujos adjuntos.
La colocación de un primer terminador de la transcripción fuera de
la región entre promotores también puede definirse adicionalmente
como, es decir, de modo que un primer terminador de la
transcripción esté colocado (como se observa a partir del extremo 3'
del primer promotor) cadena abajo del primer promotor, cadena abajo
de al menos un sitio de clonación, y cadena abajo del extremo 5' de
segundo promotor.
La colocación de un segundo terminador de la
transcripción fuera de la región entre promotores también puede
definirse adicionalmente como, es decir, de modo que un segundo
terminador de la transcripción colocado (como se observa a partir
del extremo 3' del segundo promotor) cadena abajo del segundo
promotor, cadena abajo de al menos un sitio de clonación, y cadena
abajo del extremo 5' del primer promotor.
Además, cuando el terminador no está localizado
en la región entre promotores, la distancia entre el extremo 5' del
primer promotor y el extremo 3' del segundo terminador, o la
distancia entre el extremo 5' del segundo promotor y el extremo 3'
del primer terminador es preferiblemente pequeña, es decir, tal que
el extremo 3' del primer terminador de la transcripción esté
separado del extremo 5' del segundo promotor en no más de 2000
nucleótidos, preferiblemente no más de 1000 nucleótidos, más
preferiblemente no más de 500 nucleótidos, incluso más
preferiblemente no más de 200 nucleótidos, de forma especialmente
preferible no más de 100 nucleótidos, de forma más especialmente
preferible no más de 50 nucleótidos, de forma incluso más
especialmente preferible no más de 20 nucleótidos, de forma
particularmente preferible no más de 10 nucleótidos, de forma más
particularmente preferible no más de 6
nucleótidos.
nucleótidos.
Además, cuando el segundo terminador de la
transcripción está localizado fuera de la región entre promotores,
preferiblemente el extremo 3' del segundo terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor en
no más de 2000 nucleótidos, preferiblemente no más de 1000
nucleótidos, más preferiblemente no más de 500 nucleótidos, incluso
más preferiblemente no más de 200 nucleótidos, de forma
especialmente preferible no más de 100 nucleótidos, de forma más
especialmente preferible no más de 50 nucleótidos, de forma incluso
más especialmente preferible no más de 20 nucleótidos, de forma
particularmente preferible no más de 10 nucleótidos, de forma más
particularmente preferible no más de 6 nucleótidos.
Como se ha definido anteriormente la expresión
"región entre promotores" se refiere a toda la secuencia de
ADN entre los dos promotores. Como se ha explicado anteriormente, en
ciertas realizaciones de la invención el terminador o terminadores
de la transcripción pueden estar situados en la región entre
promotores. La región entre promotores puede, ventajosamente,
comprender una secuencia de nucleótidos que forma un molde para la
producción de ARNds. La longitud y naturaleza precisas de esta
secuencia no es objeto de la invención. La invención proporciona
adicionalmente construcciones de ADN en las que la región entre
promotores comprende un sitio de clonación. La función del sitio de
clonación es facilitar la inserción de un fragmento de ADN que
forma un molde para la producción de ARNds entre los dos promotores.
Por tanto, la invención proporciona una serie de vectores de
clonación que son de uso general en la construcción de vectores
molde para la producción de ARNds. También se incluyen en el
alcance de la invención vectores derivados de los vectores de
clonación que tienen un fragmento de ADN insertado en el sitio de
clonación.
El sitio de clonación puede comprender
adicionalmente uno o más de los siguientes:
- al menos un sitio de restricción,
(como se sabe en la técnica), o uno o más sitios de restricción
adicionales, por ejemplo, para proporcionar un sitio de clonación
múltiple (como se sabe en la técnica),
- un ADN de relleno, por ejemplo,
flanqueado por al menos dos sitios de restricción, tales como dos
sitios de restricción BstXI o dos sitios de restricción
XcmI,
- sitios de recombinación attR1
y attR2,
- una secuencia de nucleótidos
ccdB,
- un nucleótido ccdB que comprende
adicionalmente al menos un único sitio de restricción de extremo
romo, tal como un sitio de restricción SrfI, y/o
- un fragmento de ADN insertado en al
menos un sitio de clonación. Todas las construcciones de ADN
proporcionadas por la invención pueden, ventajosamente, formar parte
de un vector de clonación replicable, tal como, por ejemplo, un
vector plasmídico. Además de los promotores oponibles, la región
entre promotores y el terminador o terminadores de la
transcripción, la "estructura" del vector puede contener
adicionalmente uno o más de los elementos generales encontrados
habitualmente en vectores replicables, por ejemplo un origen de
replicación para permitir la replicación autónoma en una célula
hospedadora y un marcador de selección, tal como un gen de
resistencia a antibióticos. El gen marcador de selección (por
ejemplo, el gen de resistencia a antibióticos) puede contener en sí
mismo un promotor y un terminador de la transcripción y debe
entenderse que estos con completamente independientes de los
elementos promotores y terminadores necesarios por la invención y
no deben tomarse en consideración para determinar si un vector
particular entra dentro del alcance de la invención.
Las construcciones de ADN de acuerdo con la
invención pueden construirse fácilmente a partir de los elementos
componentes de la secuencia usando técnicas recombinantes
convencionales bien conocidas en la técnica y descritas, por
ejemplo, en F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons; Inc. (1994), como
apreciará un especialista en la técnica a partir de la siguiente
descripción detallada de la invención y los Ejemplos adjuntos.
A continuación se proporciona una descripción
detallada de las construcciones de ADN de acuerdo con la invención,
con referencia a los siguientes dibujos esquemáticos en los que:
Las Figuras 1 (a) a 1(e) son
representaciones esquemáticas de varias realizaciones diferentes de
la construcción de ADN de acuerdo con la invención que ilustra la
colocación relativa de los elementos promotores y terminadores de
la transcripción.
La Figura 2 (a) es una representación
esquemática de un vector de la técnica anterior incluido para
propósitos de comparación.
Las Figuras 2 (b) a 2 (e) son representaciones
esquemáticas de varias realizaciones adicionales de la construcción
de ADN de acuerdo con la invención que ilustra el uso de diferentes
sitios de clonación en la región entre promotores.
Con referencia a los Dibujos, la Figura 1 (a)
ilustra esquemáticamente una primera construcción de ADN de acuerdo
con la invención que es un vector plasmídico que comprende dos
promotores oponibles; un primer promotor a) y un segundo promotor
b) 2 flanqueando una región entre promotores c), estando dicha
región entre promotores cadena abajo del extremo 3' del primer
promotor, y cadena abajo del extremo 3' del segundo promotor. El
primer promotor y el segundo promotor pueden ser idénticos o
diferentes. Esta realización comprende un primer terminador de la
transcripción e) y un segundo terminador de la transcripción f) que
están los dos colocados en la región entre promotores. En esta
realización, el primer terminador y el segundo terminador son
preferentemente terminadores unidireccionales.
Puede insertarse un fragmento de ADN en al menos
un sitio de clonación d). Dicho fragmento se somete a transcripción
dirigida por el primer promotor a) y el segundo promotor b) (es
decir, transcripción de ambas cadenas), provocando la generación de
dos fragmentos de ARN que pueden combinarse en ARN bicatenario del
fragmento de ADN insertado (tanto in vitro como in
vivo).
Cualquier secuencia de ADN deseada, tal como una
secuencia de ADN genómico, o una secuencia de ADNc o cualquier otra
secuencia codificante, puede insertarse en el al menos un sitio de
clonación. Sin limitarse a ninguna explicación específica, se asume
que cuando a) y e) forman una combinación funcional, la ARN
polimerasa que inicia la transcripción en a) transcribirá la región
entre promotores incluyendo el al menos un sitio de clonación y el
fragmento de ADN insertado en el al menos un sitio de clonación y se
terminará cuando alcance e). De forma similar, la ARN polimerasa
que inicia la transcripción en b) transcribirá la región entre
promotores incluyendo el al menos un sitio de clonación y el
fragmento de ADN insertado en el al menos un sitio de clonación y
terminará cuando alcance f). Los terminadores provocan que la ARN
polimerasa se detenga, interrumpa la transcripción y se retire del
molde. Esto evita la transcripción ilimitada de la estructura del
vector, y reduce la transcripción no específica de ADN no
esencial.
La región entre promotores comprende
adicionalmente una secuencia de nucleótidos que corresponde a una
diana para la inhibición por ARN bicatenario. Esta secuencia se
denomina "TF" para el fragmento diana. Es esta secuencia la
que, cuando se transcribe en ARNds, será responsable de la
inhibición por ARN bicatenario específica de un gen diana. El
fragmento diana puede formarse a partir de un fragmento de ADN
genómico o ADNc del gen diana. Su longitud y secuencia nucleotídica
precisas no son objeto de la invención.
En la disposición mostrada en la Figura 1 (a)
los dos terminadores están colocados en cada lado del TF en la
región entre promotores. Cada uno de los terminadores está colocado
transcripcionalmente cadena abajo de uno de los promotores, el
primer terminador e) está transcripcionalmente cadena abajo del
primer promotor a) y el segundo terminador f) está
transcripcionalmente cadena abajo del segundo promotor b).
Suponiendo que a) y e) formen una combinación funcional, como se ha
descrito anteriormente, la ARN polimerasa que inicia la
transcripción en a) transcribirá la región entre promotores hasta e
incluyendo TF y terminará cuando alcance e). De forma similar, la
ARN polimerasa que inicia la transcripción en b) transcribirá la
región entre promotores hasta e incluyendo TF en la cadena opuesta
y terminará cuando alcance f). Los terminadores provocan que la ARN
polimerasa se detenga, interrumpa la transcripción y se retire el
molde. Esto evita la transcripción ilimitada de la estructura del
vector, y reduce la transcripción no específica de ADN no
esencial.
Los transcritos generados a partir de este
vector, dependiendo de la colocación precisa de los terminadores en
el vector, ser ARNds casi completamente específicos correspondientes
a la región TF. A través de la colocación directa de las secuencias
terminadoras en el extremo cadena abajo de la región TF en ambos
lados del fragmento de ADN insertado, la cantidad de material
transcrito se reduce completamente a las secuencias especificadas
por el molde. Por lo tanto, se obtiene una cantidad mayor de ARNds
específico. Además, las construcciones ahora también son más
estables, debido a la ausencia de transcripción de la estructura del
vector. La última característica (estabilidad), combinada con el
índice de transcripción específica ahora relativamente mayor,
proporciona un sistema adaptado para sintetizar cantidades mayores
de cadenas de ARNds cortas específicas. Esta cantidad
proporcionalmente mayor de transcrito, que provoca concentraciones
mayores de ARNds específico, potencia el efecto inhibidor en
protocolos de ARNi. En protocolos de ARNi basados en la expresión de
ARNds en un organismo de alimento, la toxicidad para los organismos
de alimentación debida a la elevada expresión de ARN se lleva a un
nivel mínimo por el uso de este vector.
Un ejemplo específico de un vector del tipo
ilustrado en la Figura 1 (a), considerado como la disposición
óptima para aplicaciones de ARNi, es el plásmido pGN9 descrito en
los Ejemplos adjuntos. Los terminadores de la transcripción usados
en pGN9 son terminadores específicos de la ARN polimerasa T7, ya que
el vector contiene dos promotores T7 oponibles. Sin embargo,
podrían usarse otros sistemas tales como un sistema de expresión
basado en el promotor, terminador y polimerasa T3 o SP6, u otros
promotores y terminadores procariotas o eucariotas.
La Figura 1 (b) ilustra esquemáticamente una
construcción de ADN adicional de acuerdo con la invención que es un
vector plasmídico que comprende dos promotores oponibles a) y b) que
flanquean una región entre promotores c). Este vector también
comprende dos terminadores de la transcripción e) y f) pero en esta
disposición los dos terminadores están colocados fuera de la región
entre promotores, de hecho los elementos terminadores ahora
flanquean los dos promotores. La disposición es tal que e) está
transcripcionalmente cadena abajo de a) mientras que f) está
transcripcionalmente cadena abajo de b). De nuevo e) termina la
transcripción iniciada por a), mientras que f) termina la
transcripción iniciada por el promotor b). La colocación de los
terminadores fueran de d) permite el uso de terminadores
bidireccionales así como terminadores unidireccionales, en contraste
con la disposición de la Figura 1 (a) en la que se prefieren
terminadores unidireccionales a causa de la colocación de los
terminares entre los promotores. Son conocidos en la técnica varios
terminadores bidireccionales que podrían usarse de acuerdo con la
invención. Generalmente, se ha observado que estos son no
específicos de polimerasa.
La realización mostrada en la Figura 1 (b)
proporciona esencialmente las mismas ventajas que las mostradas en
la Figura 1 (a) sobre los vectores de la técnica anterior para la
producción de ARNds. El vector mostrado en la Figura 1 (b)
conducirá a la producción de transcritos que son ligeramente más
largos, incluyendo las regiones promotoras. Esta diferencia
relativamente pequeña en la longitud del transcrito y por tanto el
ARNds formado no afectará gravemente a la eficacia en un sistema
ARNi.
La posición de los terminadores y el promotor en
el ejemplo mostrado en la Figura 1 (b) se colocan preferiblemente
en cercana proximidad, de modo que el extremo 5' de los promotores
esté separado del extremo 3' de los terminadores de la
transcripción en no más de 2.000 nucleótidos, preferiblemente no más
de 1.000 nucleótidos, más preferiblemente no más de 500
nucleótidos, incluso más preferiblemente no más de 200 nucleótidos,
de forma especialmente preferible no más de 100 nucleótidos, de
forma más especialmente preferible no más de 50 nucleótidos, de
forma incluso más especialmente preferible no más de 50
nucleótidos, de forma incluso más especialmente preferible no más
de 20 nucleótidos, de forma particularmente preferible no más de 10
nucleótidos, de forma más particularmente preferible no más de 6
nucleótidos.
La Figura 1 (c) ilustra esquemáticamente una
construcción de ADN adicional de acuerdo con la invención que es un
vector plasmídico que comprende dos promotores oponibles a) y b) que
flanquean una región entre promotores c). En esta realización se
coloca un terminador (en este caso e)) en c) y el otro (f)) se
coloca fuera de c). De nuevo, e) termina la transcripción iniciada
por a) y f) termina la transcripción iniciada por b). Esta
disposición puede proporcionar una solución útil al problema de la
interferencia de uno de los terminadores con la actividad
polimerasa en la otra dirección (por ejemplo, f) impide la
transcripción iniciada por b)). Este vector proporciona
esencialmente las mismas ventajas que las variaciones de vector
mostradas en la Figura 1 (a) y Figura 1 (b) sobre la técnica
anterior. La diferencia relativamente pequeña en la longitud del
transcrito debida a la transcripción de uno de los promotores no
afectará significativamente a la eficacia en sistemas de ARNi. Éste
es más particularmente el caso cuando el terminador que se localiza
fuera de la región entre promotores c) está en cercana proximidad
del promotor, como se ha definido anteriormente.
Las Figuras 1 (d) y 1 (e) ilustran
esquemáticamente dos construcciones de ADN adicionales de acuerdo
con la invención que son las dos vectores plasmídicos que
comprenden dos promotores oponibles a) y b) que flanquean una
región entre promotores c). Estas realizaciones comprenden solamente
un único terminador. En la disposición mostrada en la Figura 1 (d)
se coloca fuera de c) un único terminador e) que termina la
transcripción de a). La colocación del terminador fuera del IPR
permite el uso de un terminador bidireccional o un terminador
unidireccional en este sistema. En la realización mostrada en la
Figura 1 (d) e) se coloca en c). Por lo tanto a) debe ser
preferiblemente un terminador unidireccional.
Realizaciones adicionales de la construcción de
ADN de acuerdo con la invención se ilustran esquemáticamente en las
Figuras 2 (b) a 2 (e).
Estas realizaciones son todas vectores de
clonación plasmídicos, basados en la disposición óptima de los
promotores y terminadores mostrados en la Figura 1 (a), y descritos
anteriormente, que contienen sitios de clonación para facilitar la
inserción de un fragmento de ADN en el al menos un sitio de
clonación.
Estas realizaciones son todas vectores de
clonación plasmídicos, basados en la disposición óptima de los
promotores y terminadores mostrados en la Figura 1 (a), que
contienen sitios de clonación para facilitar la inserción de un
fragmento de ADN diana en la región entre promotores.
La Figura 2 (a), que es una representación
esquemática de un vector de clonación de la técnica anterior, se
incluye para propósitos de comparación. Este vector comprende dos
promotores oponibles a) y b), que pueden ser idénticos o
diferentes, flanqueando un sitio de clonación múltiple (MCS).
La Figura 2 (b) ilustra un primer tipo de vector
de clonación plasmídico de acuerdo con la invención. El vector
contiene un primer promotor oponible a) y un segundo promotor
oponible b) que flanquea una región entre promotores. La región
entre promotores puede definirse adicionalmente como: la región de
ADN entre el extremo 3' del primer promotor y el extremo 3' del
segundo promotor, y que está cadena abajo del primer promotor, y que
está cadena abajo del segundo promotor, y que preferiblemente no
contiene el extremo 5' del primer promotor o del segundo promotor.
Esta región entre promotores comprende adicionalmente los
terminadores e) y f) que flanquean un sitio de clonación múltiple
MCS. El MCS comprende al menos un sitio de restricción individual, y
preferiblemente más de un sitio de restricción como se sabe en la
técnica, cualquiera de los cuales puede usarse para la inserción de
un fragmento de ADN.
La Figura 2 (c) ilustra un tipo adicional de
vector de clonación plasmídico de acuerdo con la invención. Este
vector contiene de nuevo promotores a) y b) oponibles que flanquean
una región entre promotores que comprende los terminadores e) y f).
En esta realización, a) y b) flanquean un sitio de clonación que
está adaptado para la clonación facilitada de fragmentos de PCR,
que comprenden un ADN de relleno flanqueado por dos sitios de
restricción idénticos, en este caso sitios BstXI. La secuencia
específica del ADN de relleno no es esencial, con la condición de
que dicho ADN de relleno no impida el efecto deseado y/o la
actividad deseada de las construcciones de ADN de la invención. Un
ejemplo específico de un vector de acuerdo con este aspecto de la
invención descrito en este documento es el plásmido pGN29.
La clonación de los productos de PCR usando los
sitios de reconocimiento BstXI y adaptadores BstXI es generalmente
conocida en la técnica. Los adaptadores BstXI se obtienen en el
mercado, tal como de Invitrogen (Groningen, Países Bajos). Estos
adaptadores son adaptadores no palindrómicos diseñados para una
clonación más fácil y eficaz de productos de PCR en vectores. El
uso de estos adaptadores reduce la concatemerización de adaptadores
o ADN de inserto teniendo solapamientos no complementarios (CACA).
El ADN de relleno se incluye simplemente para permitir una fácil
diferenciación entre un vector cortado y no cortado por BstXI en
base al tamaño. Su longitud y secuencia precisas no son de
importancia.
La Figura 2 (d) ilustra un tipo adicional de
vector de clonación plasmídico de acuerdo con la invención. Este
vector contiene de nuevo promotores oponibles a) y b) que flanquean
una región entre promotores que comprende los terminadores e) y f).
En esta realización, a) y b) flanquean un sitio de clonación que
facilita una clonación de "Alto Rendimiento" en base a la
recombinación homóloga en lugar de la digestión con enzimas de
restricción y ligamiento. Como se muestra esquemáticamente en la
Figura 2 (d), el sitio de clonación comprende los sitios de
recombinación attR1 y attR2 del bacteriófago lambda
que flanquean un gen que es letal para E. coli, en este caso
el gen ccdB.
Un método de clonación alternativo de fragmentos
de ADN en este vector (no mostrado en la Figura 2 (d)), consiste en
una variante de este vector, en la que la secuencia de ADN de
ccdB comprende adicionalmente al menos un sitio de
restricción único, siendo preferiblemente el al menos un sitio de
restricción único, un sitio de restricción de extremo romo, tal
como un sitio de restricción SrfI. La inserción de un
fragmento de ADN en el al menos un sitio de restricción único,
provoca la inactivación del gen ccdB, y por tanto la inactivación
del gen ccdB letal.
Se muestra una variante adicional de un vector
en la Figura 2 (d) en la que el attR1 y el attE2 no están presentes.
Dicho vector comprende al menos un sitio de clonación, estando
compuesto dicho al menos un sitio de clonación por una secuencia de
ccdB, comprendiendo adicionalmente dicha secuencia de ccdB al menos
un sitio de restricción único, siendo preferiblemente el al menos
un sitio de restricción único un sitio de restricción de extremo
romo, tal como un sitio de restricción SrfI. La inserción de
un fragmento de ADN en el al menos un sitio de restricción único,
provoca la inactivación del gen ccdB, y por tanto la inactivación
del gen ccdB letal.
Estos sitios de clonación que comprenden la
secuencia de nucleótidos de ccdB y/o los sitios attR (R1 y/o R2) se
obtienen del sistema de clonación Gateway^{TM} disponible en el
mercado en Life Technologies, Inc. El sistema de clonación
Gateway^{TM} se ha descrito ampliamente por Hartley et al.
en el documento WO 96/40724 (PCT/US96/10082). Un ejemplo específico
de un vector de acuerdo con este aspecto de la invención descrito
en este documento es pGN39.
La Figura 2 (e) y 2 (f) ilustran un tipo
adicional más de vector de clonación plasmídico de acuerdo con la
invención. Este vector contiene de nuevo promotores oponibles a) y
b) que flanquean una región entre promotores c) que comprenden los
terminadores e) y f). En la realización mostrada en la Figura 2 (e),
e) y f) flanquean un sitio de clonación que facilita la clonación
de "alto rendimiento" de productos de PCR por clonación
TA^{TM}. Este sitio de clonación comprende un ADN de relleno
flanqueado por dos sitios de restricción idénticos para una enzima
que genera nucleótidos T de solapamiento. En este caso los sitios de
restricción son sitios XcmI, pero podrían usarse otros sitios que
se escinden para generar nucleótidos T de solapamiento con efecto
equivalente. Los nucleótidos T de solapamiento que facilitan la
clonación de productos de PCR que tienen un nucleótido A de
solapamiento. Este principio es conocido como clonación TA^{TM}.
El vector cortado con nucleótidos T de solapamiento puede
"topomerizarse" para generar un vector de clonación del tipo
mostrado esquemáticamente en la Figura 2 (f), uniendo la enzima
topoisomerasa a los nucleótidos T de solapamiento. El vector
resultante también facilita la clonación de productos de PCR por el
principio conocido como clonación TOPO^{TM}.
Los sistemas de clonación tanto TOPO^{TM} como
TA^{TM}, aunque no para los vectores descritos en esta invención,
están disponibles en el mercado en Invitrogen. El sistema de
clonación TOPO^{TM} se ha descrito ampliamente por Shuman en el
documento WO 96/19497 (PCT/US95/16099). El sistema de clonación
TA^{TM} se ha descrito ampliamente por Hernstadt et al. en
el documento WO 92/06189 (PCT/US91/07147)
Un especialista en la técnica apreciará
fácilmente que aunque las Figuras 2 (b) - 2 (f) ilustran la
inclusión de sitios de clonación diferentes en un vector del tipo
ilustrado en la Figura 1 (a), estos sitios de clonación podrían
incluirse en cualquiera de la construcciones de ADN de la invención,
incluyendo las ilustradas esquemáticamente en las Figuras 1 (b) a 1
(e).
Como se ha mencionado anteriormente, una
aplicación principal de las construcciones/vectores de ADN de la
invención es en la producción de ARN bicatenario para el uso en
tecnología de ARNi. En particular, las construcciones son útiles en
protocolos de ARNi in vivo en el gusano nematodo C.
elegans.
En C. elegans, se ha realizado ARNi
tradicionalmente por inyección de ARNds en el gusano. Fire et
al. describe estos métodos ampliamente en la Solicitud
Internacional Nº WO 99/32619. En resumen, se producen ambas cadenas
de ARN in vitro usando kits de transcripción in vitro
disponibles en el mercado. Se deja que ambas cadenas de ARN formen
ARNds, después de lo cual se inyecta el ARNds en C. elegans.
El nuevo sistema de vector desarrollado en la presente invención es
una mejora drástica en este método tradicional. En primer lugar,
puede producirse el ARN en una etapa, por ejemplo usando dos
promotores idénticos tales como en el vector pGN9. En segundo
lugar, y más importante, debido a la presencia de terminadores, los
transcritos y por tanto el ARNds formado, serán más específicos ya
que solamente se transcribirá el fragmento diana clonado. Esto
producirá un ARNi más eficaz.
Un método adicional para realizar experimentos
de ARNi en C. elegans, se ha descrito por Plaetinck et
al., en el documento WO 00/01846. En este método se alimenta a
los gusanos C. elegans con bacterias que producen ARNds. El
ARNds pasa la barrera del intestino del gusano e induce el mismo
ARNi que si se hubiera inyectado ARNds. Para estos experimentos, la
cepa de E. coli preferida es HT115. (DE3), y la cepa de C.
elegans preferida es nuc-1;
gun-1. Los vectores mejorados proporcionados por la
invención también mejoran la eficacia de ARNi en este método, como
se muestra en el siguiente ejemplo, ya que solamente se produce
ARNds eficaz.
Otro método para realizar ARNi se ha descrito
también por Plaetinck et al. en el documento WO 00/01846. En
resumen, este método se basa en la producción de ARNds en el propio
gusano. Esto puede hacerse usando promotores del gusano en los
vectores descritos, o usando un gusano transgénico que exprese una
polimerasa específica para promotores no de C. elegans
presentes en el vector, de modo que esta polimerasa dirija la
transcripción del ARNds. Los promotores se seleccionarán
preferentemente entre los promotores de ARN bacteriófagos conocidos,
tales como los promotores de ARN T7 o T3 o SP6, que proporcionan la
ventaja de un elevado nivel de transcripción dependiente solamente
de la unión de la polimerasa afín.
El ADN del vector plasmídico puede introducirse
en el gusano por varios métodos. Primero, el ADN puede introducirse
por el método de inyección tradicional (Methods in Cell Biology, Vol
48, C. elegans Modern Biological Analysis of an organism,
ed. por Epstein y Shakes). Segundo, el ADN puede introducirse por
alimentación con ADN. Como han mostrado Plaetinck et al. en
el documento WO 00/01846, el ADN plasmídico puede introducirse en el
gusano alimentando al gusano con una cepa de E. coli que
alberga el plásmido. Preferentemente la cepa de E. coli es
OP50, o MC10161 o HT115 (DE3) pero sería adecuada cualquier otra
cepa para este propósito. La cepa de C. elegans es
preferentemente una cepa mutante nuc-1 o una cepa
nuc-1; gun-1. El ADN plasmídico de
E. coli pasa la barrera del intestino y se introduce en el
nematodo, provocando la expresión de ARNds. Como con otros métodos
de ARNi descritos anteriormente, el uso del nuevo sistema de vector
potenciará el
\hbox{ARNi por la producción de solamente ARNds
específico.}
La invención se entenderá adicionalmente con
referencia a los siguientes Ejemplos experimentales, junto con las
siguientes Figuras adicionales en las que:
La Figura 3 es una representación (mapa de
plásmido) de pGN1.
La Figura 4 es una representación (mapa de
plásmido) de pGN9.
La Figura 5 ilustra la secuencia de nucleótidos
de un fragmento del plásmido pGN1, indicado para mostrar las
posiciones de los promotores T7 oponibles.
La Figura 6 representa la secuencia de
nucleótidos del terminador de la transcripción T7.
La Figura 7 ilustra las secuencias de
oligonucleótidos oGN27, oGN28, oGN29 y oGN30 usados para insertar
los terminadores de la transcripción T7 en pGN1. Las posiciones de
las secuencias terminadoras T7 pol y de diversos sitios de
restricción están marcadas.
La Figura 8 ilustra la secuencia de nucleótidos
de un fragmento del plásmido pGN9, indicado para mostrar las
posiciones de los promotores T7 oponibles y los terminadores de la
transcripción T7.
La Figura 9 (a) es una representación (mapa de
plásmido) de pGN29; (b) es una representación (mapa de plásmido) de
pGN39; (c) es una representación (mapa de plásmido) del plásmido
TopoRNAi.
La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos
completa del plásmido pGN9.
La Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos
completa de plásmido de pGN29.
La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos
completa del plásmido pGN39.
La Figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos
completa del plásmido TopoRNAi.
La Figura 14 muestra la secuencia completa del
plásmido pGN49A.
La Figura 15 muestra la secuencia completa del
plásmido pGN59A.
La Figura 16 es una representación (mapa de
plásmido) de pGN49A.
La Figura 17 es una representación (mapa de
plásmido) de pGN59A.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El punto de partida para la construcción de los
vectores ejemplificados en este documento fue el plásmido pGN1.
Este plásmido, descrito en la Solicitud Internacional Nº WO 00/01846
del solicitante en trámite junto con la presente, contiene dos
promotores T7 oponibles que flanquean un sitio de clonación
múltiple.
La construcción del vector se realizó de acuerdo
con las técnicas de biología molecular convencionales conocidas en
la técnica y descritas, por ejemplo, en F. M. Ausubel et al.
(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Jonh Wiley
& Sons, Inc. (1994).
Primero se digirió pGN1 con las enzimas de
restricción EcoRI y KpnI. Se hibridaron los oligonucleótidos oGN27
y oGN28 (Figura 7) para generar un fragmento bicatenario que después
se ligó en el vector cortado con EcoRI/KpnI. El plásmido resultante
se volvió a digerir con XbaI y HindIII. Se hibridaron los
oligonucleótidos oGN29 y oGN30 para generar un fragmento
bicatenario que después se hibridó en el vector cortado con
XbaI/HindIII. El vector resultante se denominó pGN9 (Figuras 4 y
10).
Se generó pGN29 (Figura 9(a); Figura 11)
reemplazando el MCS en pGN9 con un ADN de relleno flanqueado por
sitios BstXI. Los adaptadores de BstXI están disponibles en el
mercado en Invitrogen (Groningen, Países Bajos).
Se generó pGN39 (Figura 9 (b); Figura 12)
siguiendo etapas; se digirió pGN29 con BstXI. Los adaptadores BstXI
(Invitrogen, Groningen, Países Bajos) se ligaron al Casete A
proporcionado por el sistema GATEWAYTM (Life Technologies, Inc.).
El Casete A contiene attR1, CmR, CcdA, CcdB, attR2. El Casete A con
los adaptadores después se ligó en pGN29 digerido, produciendo
pGN39A. pGN39A contiene un único sitio SrfI en el gen
ccdB.
El vector TopoRNAi (Figura 9 (c); Figura 13) se
generó del siguiente modo; se digirió pGN29 con BstXI. Usando PCR
con los cebadores oGN103 y oGN104 y el molde pCDM8 (Invitrogen,
Groningen, Países Bajos), se generó un relleno que incluye sitios
XcmI. En el producto de PCR, se ligaron adaptadores BstXI, y el
producto de ligamiento resultante se ligó en el vector pNG29
digerido con BstXI produciendo el vector TopoRNAi.
Se construyó PGN49A para insertar un sitio único
de restricción no romo adicional y para delecionar el gen CmR de
pGN39. Se usó PCR de solapamiento. Se realizó una primera PCR con
los cebadores oGN126 y oGN127 y PGN39A como molde. Usando los
cebadores oGN128 y oGN129 y el mismo molde se generó un segundo
fragmento. La PCR solapante usando los fragmentos resultantes y los
cebadores oGN126P y oGN129P produjo un producto de PCR final. A este
producto de PCR final, se ligaron los adaptadores BstXI, y el
producto de ligamiento se ligó en pGN29 digerido con BstXI. El
vector resultante de denominó PGN49A.
Se generó un vector de control para ensayar la
eficacia del vector de clonación pGN49A, debiendo contener dicho
vector los promotores T7, pero no los terminadores T7. Para esto, se
aisló el inserto de XbaI de pGN49A y se clonó en pGN1 digerido con
la misma enzima de restricción. El vector resultante se denominó
pGN59A.
Ejemplo
2
Este experimento se diseñó para ilustrar la
eficacia mejorada de los vectores mejorados de esta invención en la
inhibición por ARN bicatenario, en comparación con los vectores
conocidos de la técnica anterior. Podría esperarse un aumento
significativo en la eficacia del sistema, ya que se produjo ARNds
más eficaz y por tanto el ARNi funcionó mejor. El sistema
experimental para este experimento de prueba de concepto fue medir
el rescate de C. elegans a 25ºC en mutantes de C.
elegans nuc-1/pha-1 (e2123) ts
por ARNi de sup35 usando ARNds de alimentación de
PGN-2 (- terminador) y pGN-12 (+
terminador), con PGN-1 (vector vacío) como control y
diluidor. La mutación pha-1
ts/sup-35 se descrito ampliamente por Schnabel en el
documento WO 99/49066.
La mutación nuc-1 en C. elegans
proporciona una cepa de C. elegans que muestra mejores
capacidades de captación, tales como la captación de los complejos
de ARNds, que C. elegans de tipo silvestre. Este mutante está
delecionado en la mayor parte de las enzimas ADNasa, y se ha
demostrado en solicitudes anteriores en trámite junto con la
presente que esta cepa de C. elegans produce ARNi potenciado
alimentando al nematodo con ARNds.
La mutación pha-1 (e2123) ts
proporciona una cepa mutante de C. elegans con un fenotipo de
supervivencia a 15ºC y letalidad a 25ºC. Esta letalidad se puede
suprimir por la inhibición de la expresión de
sup-35. Por tanto el ARNi de sup-35
debe facilitar el rescate de pha-1 (e2123) ts a
25ºC. Los vectores de la presente invención, cuando expresan el
ARNds a partir de sup-35, deben aumentar la eficacia
de ARNi de sup-35 en el rescate de mutantes
pha-1 (e2123) ts a 25ºC, en comparación con vectores
que no contienen los terminadores.
El vector pGN1 se usó como vector vacío. El
vector pGN2 (- terminador) es un vector que lleva el ADN de
sup-35 y que expresa el ARNds de
sup-35 cuando se introduce en el hospedador
apropiado, el vector no tiene terminadores de la transcripción
insertados. El vector pGN12 (+ terminador) es un vector que se ha
descrito anteriormente, que contiene los terminadores
transcripcionales, y por tanto provoca la producción mejorada de
ARNds cuando se introduce en un hospedador apropiado. Por tanto,
este vector tiene dos terminadores transcripcionales
unidireccionales, ambos colocados en el interior de la región entre
promotores, y que flanquean el fragmentos sup-35. Se
esperaba que el uso del último vector aumentara la eficacia del
sistema, que aquí significa un mejor rescate (supervivencia) de
mutantes pha-1 (e-2123) ts a
25ºC.
Se llenaron placas de microtitulación de 12
pocillos con aproximadamente 2 ml de agar NGM por pocillo. (1 litro
de agar NGM: 15 g de agar, 1 g de peptona, 3 g de NaCl, 1 ml de
solución de colesterol (5 mg/ml en EtOH), con adición estéril
después de esterilizar en autoclave 9,5 ml de CaCl_{2} 0,1 M, 9,5
ml de MgSO_{4} 0,1 mM, 25 ml de tampón
KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 1 M pH 6, ampicilina (100
\mug/l), 5 ml de IPTG 0,1 M y 5 ml de solución de nistatina
(disuelta a 10 mg/ml en EtOH:CH_{3}COONH_{4} 1:1 7,5 M).
Las placas secadas se salpicaron con
aproximadamente 50 \mul de un cultivo de una noche de bacterias
HT115 (DE3) (Fire A, Carnigie Institution, Baltimore, MD)
transformadas con los plásmidos. Después se sembraron en placas
nematodos individuales en la fase de crecimiento L4 en pocillos
individuales en el día 1. En cada pocillo 1 nematodo (P1). En el
día dos, los nematodos P1 se colocaron en un nuevo pocillo y se
dejaron incubar durante un día. Se repitió el mismo procedimiento
en el día 3. Todas las placas se incubaron adicionalmente a 25ºC
para permitir que se formara la descendencia. La supervivencia
inducida por ARNi de sup35 (rescate) se midió contando la
descendencia.
El experimento de ARNi en mutantes de C.
elegans nuc-1/pha-1 (e2123) ts
por alimentación con E. coli que expresa ARNds de
sup-35.
pGN1 como control
pGN2 (sup 35 - Term.)
- pGN12 (sup 35 + Term.)
pGN2 + pGN1 diluciones 1/2, 1/4, 1/8, 1/16,
1/32
- pGN12 + pGN1 diluciones 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32
\vskip1.000000\baselineskip
Temperatura de incubación 25ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Recuento de descendencia (hermafroditas
adultos)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se esperaba los gusanos alimentados por
bacterias que tenían pGN1, que no produjeron descendencia viable,
debido al efecto letal de la mutación pha-1 a esta
temperatura. La alimentación de la nematodos con E. coli que
lleva pGN2 o pGN12 produjo una descendencia viable. Esto se debe a
la alimentación del gusano con ARNds de sup-35. La
diferencia remarcada entre los dos experimentos de alimentación
puede observarse en la serie de dilución. Cuando se diluyen las
bacterias que llevan pGN2, con bacterias que llevan pGN1, la
cantidad de descendencia disminuye drásticamente, incluso a una
dilución baja de uno a dos. Esta serie de dilución indica que se
necesitan elevados niveles de ARNds para obtener una inducción de
ARNi apropiada. En el experimento de alimentación con bacterias que
llevan pGN12, aún se observa una descendencia significativa a una
dilución de uno a ocho. Esto indica que en las bacterias que llevan
pGN12, se forma ARNds mucho más eficaz. Este experimento muestra
claramente que la adición de secuencias terminadoras en vectores
para expresar ARNds como se ha descrito anteriormente, proporciona
una ventaja significativa en la generación de ARNi.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se han clonado tres genes diferentes en los
vectores pGN49A y pGN59A. Se realizó la clonación amplificando los
fragmentos génicos con ADN polimerasa PfuI que produce extremos
romos, que facilitan la clonación en estos vectores. Estos
fragmentos de PCR se clonaron en los vectores digeridos con SrfI. Se
comprobó la inserción correcta del fragmento de los clones por PCR.
Los fragmentos se eligen de modo que la expresión ds y ARNi
provoquen un fenotipo letal de la descendencia. Este procedimiento
permite comparar rápida y fácilmente la eficacia de los vectores
pGN49 y pGN59 en ARNi.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los plásmidos (serie pGW) se transforman
en bacterias E. coli AB301-105 (DE3) por
metodología convencional. Después las bacterias se hacen crecer en
LB/amp a 37ºC durante 14-18 horas. Estos cultivos se
centrifugaron y se disolvió el sedimento bacteriano en tampón S
completo que contenía IPTG 1 mM y 100 \mug/\mul de
ampici-
lina.
lina.
En placas de 96 pocillos que contenían 100
\mul de tampón S completo (que contenía IPTG 1 mM y concentración
final de 100 \mug/\mul de ampicilina) y 10 \mul de solución de
bacterias, se añadieron 3 nematodos a cada pocillo, estando todos
los nematodos en la fase de crecimiento L1.
Se incubaron las placas a 25ºC durante
5-6 días. Cada día se inspeccionan las placas para
el desarrollo de las larvas y la producción de descendencia F1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó ARNi ocho veces para cada plásmido
construido. Los resultados muestran que cuando se insertan
terminadores T7 en la estructura del vector, el fenotipo esperado
da una aparición del 100%. Cuando no se usan terminadores T7 puede
disminuir la reproducibilidad hasta un 50%. Como en el experimento
previo, los resultados muestran que la adición de terminadores
potencia significativamente el rendimiento de ARNi.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> DEVGEN NV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CONSTRUCCIONES DE VECTOR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ACB/55178/001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Fragmento de pGN1 que contiene promotores T7 oponibles
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Secuencia de ADN que contiene un terminador T7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Fragmento del plásmido pGN9 que contiene promotores T7 oponibles y
terminadores de la transcripción T7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Plásmido pGN9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3774
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Plásmido pGN29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5148
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Plásmido pGN39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3715
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Plásmido TopoRNAi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Plásmido pGN49A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4001
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Plásmido pGN59A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccaaggct agcatggttt atcactgata agttgg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccaaggct agcatgggcc tgcctgaagg ctgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctggatc cggcttacta aaagccagat aacagtatgc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagacttta tcgcttaaga gacgtgcact ggccaggggg atcacc
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtgcacg tctcttaagc gataaagtct cccgtgaact ttacccggtg g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Oligonucleótido oGN129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgtgtata agggagcctg acatttatat tccccag
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Fragmento de PCR generado por los cebadores oGN103 y oGN104 en
pCDM8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 670
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Fragmento de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
Claims (47)
1. Uso de una construcción de ADN para
producir ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana, en
el que dicha construcción de ADN comprende:
a) un primer promotor y
b) un segundo promotor,
en la que el primer y segundo
promotores están en orientación opuesta entre sí y definen una
región entre promotores colocada cadena abajo del extremo 3' del
primer promotor y cadena abajo del extremo 3' del segundo
promotor;
c) al menos un sitio de clonación colocado en la
región entre promotores;
d) una secuencia de nucleótidos que corresponde
a dicha secuencia diana insertada en dicho al menos un sitio de
clonación;
e) un primer terminador de la transcripción
colocado, como se observa desde el extremo 3' del primer promotor,
cadena abajo del primer promotor y cadena abajo de la secuencia de
nucleótidos correspondiente a dicha secuencia diana, en la que el
primer terminador de la transcripción está unido de forma operativa
al primer promotor;
caracterizada porque el primer promotor y
el segundo promotor son promotores de bacteriófagos.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicha construcción de ADN comprende adicionalmente:
f) un segundo terminador de la transcripción
colocado, como se observa desde el extremo 3' del segundo promotor,
cadena abajo del segundo promotor y cadena abajo de la secuencia de
nucleótidos correspondiente a dicha secuencia diana, en la que el
segundo terminador de la transcripción está unido de forma operativa
al segundo promotor.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en el que el primer terminador de la transcripción está
colocado en la región entre promotores.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en el que el primer terminador de la transcripción está
colocado, como se observa desde el extremo 3' del primer promotor,
cadena abajo del primer promotor, cadena abajo de la secuencia de
nucleótidos correspondiente a dicha secuencia diana, y cadena abajo
del extremo 5' del segundo promotor.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 2, 3, ó 4, en el que el segundo terminador de
la transcripción está colocado en la región entre promotores.
6. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2, 3 ó 4 en el que el segundo terminador de la
transcripción está colocado, como se observa desde el extremo 3' del
segundo promotor, cadena debajo del segundo promotor, cadena abajo
de la secuencia de nucleótidos correspondiente a dicha secuencia
diana, y cadena abajo del extremo 5' del primer promotor.
7. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 4, 5 ó 6, en el que el extremo 3' del primer
terminador de la transcripción está separado del extremo 5' del
segundo promotor en no más 2000 nucleótidos.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación
7, en el que el extremo 3' del primer terminador de la transcripción
está separado del extremo 5' del segundo promotor en no más de 1000
nucleótidos.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación
9, en el que el extremo 3' del primer terminador de la transcripción
está separado del extremo 5' del segundo promotor en no más de 500
nucleótidos.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el extremo 3' del primer terminador de la transcripción
está separado del extremo 5' del segundo promotor en no más de 200
nucleótidos.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación
10, en el que el extremo 3' del primer terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del segundo promotor en
no más de 100 nucleótidos.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el extremo 3' del primer terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del segundo promotor en
no más de 50 nucleótidos.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación
12, en el que el extremo 3' del primer terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del segundo promotor en
no más de 20 nucleótidos.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación
13, en el que el extremo 3' del primer terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del segundo promotor en
no más de 10 nucleótidos.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que el extremo 3' del primer terminador de la transcripción
está separado del extremo 5' del segundo promotor en no más de 6
nucleótidos.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 6
o reivindicación 7, en el que el extremo 3' del segundo terminador
de la transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor
en no más de 2000 nucleótidos.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación
16, en el que extremo 3' del segundo terminador de la transcripción
está separado del extremo 5' del primer promotor en no más de 1000
nucleótidos.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación
17, en el que el extremo 3' del segundo terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor en
no más de 500 nucleótidos.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación
18, en el que extremo 3' del segundo terminador de la transcripción
está separado del extremo 5' del primer promotor en no más de 200
nucleótidos.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación
19, en el que el extremo 3' del segundo terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor en
no más de 100 nucleótidos.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación
20, en el que el extremo 3' del segundo terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor en
no más de 50 nucleótidos.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación
21, en el que el extremo 3' del segundo terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor en
no más de 20 nucleótidos.
23. Uso de acuerdo con la reivindicación
22, en el que el extremo 3' del segundo terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor en
no más de 10 nucleótidos.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación
23, en el que el extremo 3' del segundo terminador de la
transcripción está separado del extremo 5' del primer promotor en
no más de 6 nucleótidos.
25. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes en el que el primer y el segundo
promotores son idénticos.
26. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 en el que el primer y el segundo
promotores no son idénticos.
27. Uso de acuerdo con la reivindicación 25
o reivindicación 26 en el que el primer promotor y el segundo
promotor se eligen independientemente entre los promotores T7, T3, o
SP6.
28. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes en el que el sitio de clonación
comprende al menos un sitio de restricción.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación
28, en el que el sitio de clonación comprende al menos dos sitios
de restricción que flanquean una secuencia de ADN de relleno.
30. Uso de acuerdo con la reivindicación
29, en el que al menos dos sitios de restricción son idénticos.
31. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 28 a 30 en el que el al menos un sitio de
restricción o los al menos dos sitios de restricción son sitios
BstXI.
32. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 28 a 30 en el que el sitio o sitios de
restricción son sitios XcmI.
33. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes en el que el sitio de clonación
comprende las secuencias de recombinación attR1 y attR2.
34. Uso de acuerdo con la reivindicación 33
en el que el sitio de clonación comprende adicionalmente una
secuencia de nucleótidos ccdB.
35. Uso de acuerdo con la reivindicación 34
en el que la secuencia de nucleótidos ccdB comprende adicionalmente
al menos un sitio de restricción único.
36. Uso de acuerdo con la reivindicación 35
en el que el al menos un sitio de restricción único es un sitio de
restricción de extremo romo.
37. Uso de acuerdo con la reivindicación 36
en el que el sitio de restricción de extremo romo es un sitio
SrfI.
\newpage
38. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes en el que la construcción de ADN
está en forma de un plásmido o vector.
39. Uso de acuerdo con la reivindicación
38, en el que el plásmido o vector, sin la secuencia de nucleótidos
correspondiente a dicha secuencia diana inserta en dicho al menos un
sitio de clonación, tiene la secuencia de nucleótidos ilustrada en
la SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº
12, o SEC ID Nº 13.
40. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la construcción de ADN
usada para producir ARN bicatenario está contenida en una cepa
bacteriana.
41. Uso de acuerdo con la reivindicación
40, en el que la cepa bacteriana es una cepa de E. coli.
42. Uso de acuerdo con la reivindicación 40
ó 41, en el que la cepa bacteriana se suministra a un nematodo.
43. Uso de acuerdo con la reivindicación
42, en el que la cepa bacteriana se suministra a C.
elegans.
44. Uso de acuerdo con la reivindicación
43, en la que la cepa bacteriana se suministra a un mutante
nuc-1 de C. elegans.
45. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el ARN bicatenario
producido se usa para interferencia por ARN.
46. Uso de acuerdo con la reivindicación
45, en el que el ARN bicatenario producido se usa para la
interferencia por ARN en un nematodo.
47. Uso de acuerdo con la reivindicación
46, en el que ARN bicatenario producido se usa para interferencia
por ARN en C. elegans.
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