ES2354574T3

ES2354574T3 - Proteínas del factor de transcripción relacionadas con el estrés y métodos de uso en plantas.

Info

Publication number: ES2354574T3
Application number: ES07002748T
Authority: ES
Inventors: Ruoying Chen; Oswaldo Da Costa E Silva; Nocha Van Thielen
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: US7220896B2; EP1251731B1; AU2734001A; US7902424B2; AU2913601A; AU2734101A; DE60045115D1; WO2001045494A3; WO2001045494A9; ES2316400T3; WO2001045492A2; US20080052792A1; WO2001045495A2; DE60034069D1; WO2001045492A3; EP1280398B1; DE60034069T2; ES2315248T3; ATE324780T1; US7164057B2

Abstract

Una planta transgénica transformada por medio de un ácido nucleico que codifica una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta, en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica a la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5

Campo de la Invención

Esta invención se relaciona en general con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están asociadas con respuestas al estrés abiótico y tolerancia al estrés abiótico en plantas. En particular, esta invención se relaciona con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que confieren tolerancia a la sequía, el frío, y/o a la sal. 10

Antecedentes en el Estado del Arte

Los estreses ambientales abióticos, tales como el estrés por sequía, el estrés por salinidad, el estrés por calor, y el estrés por frío, son los principales factores limitantes del crecimiento y productividad de las plantas. Las pérdidas de cosechas y de rendimiento de los principales cultivos tales como arroz, maíz y trigo provocadas por estos tipos de estrés representan factores económicos y políticos 15 significativos y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Las plantas están típicamente expuestas durante su ciclo de vida a condiciones de un contenido reducido de agua en el medio ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra estas condiciones de sequedad. Sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son muy grandes, los efectos sobre el desarrollo de las plantas, el crecimiento y 20 rendimiento de la mayoría de las plantas de cultivo son profundos. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles a concentraciones salinas más altas en el suelo. La exposición continua a la sequía y a alta salinidad provoca alteraciones mayores en el metabolismo de las plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo conducen en última instancia a la muerte celular y por lo tanto a pérdidas de rendimiento. 25

El desarrollo de plantas tolerantes a estrés es una estrategia que tiene el potencial para solucionar o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de fitomejoramiento para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzamiento con la línea deseada. Los limitados recursos de germoplasma para tolerancia al estrés e incompatibilidad en los 30 cruces entre especies de plantas lejanamente relacionadas representan problemas significativos que se encuentran en fitomejoramiento convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia a la sequía, al frío y a la salinidad en plantas modelo tolerantes a la sequía y/o la salinidad son de naturaleza compleja e involucran múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas. Esta naturaleza de múltiples componentes de la tolerancia al estrés ha hecho no solamente 35 que el fitomejoramiento sea muy poco exitoso con respecto a la tolerancia, sino que ha limitado también la habilidad para modificar la tolerancia al estrés por medio de ingeniería genética utilizando métodos biotecnológicos.

Por lo tanto, lo que requiere es la identificación de los genes y de las proteínas involucradas en estos procesos de múltiples componentes que conducen a tolerancia al estrés. La elucidación de la función 40 de los genes expresados en plantas tolerantes al estrés no solamente mejorará nuestra comprensión de la adaptación y tolerancia de las plantas a los estreses ambientales, sino que también puede proporcionar información importante para diseñar nuevas estrategias para el mejoramiento de los cutivos.

Una planta modelo utilizada en el estudio de tolerancia al estrés es Arabidopsis thaliana. Existen al menos cuatro rutas diferentes de transducción de señal que conducen a tolerancia al estrés en la planta 45 modelo Arabidopsis thaliana. Estas rutas están bajo el control de diferentes factores de transcripción (Shinozaki y colaboradores, 2000 Curr. Op. P1. Biol. 3: 217 - 23). Los reguladores de genes, especialmente los factores de transcripción, involucrados en estas rutas de tolerancia son particularmente adecuados para modificar por ingeniería genética la tolerancia en plantas debido a que un único gen puede activar una cascada completa de genes que conducen al fenotipo tolerante. En consecuencia, los 5 factores de transcripción son objetivos importantes en la búsqueda para identificación de genes que confieren a las plantas tolerancia al estrés.

Un factor de transcripción que ha sido identificado en el estado del arte es el factor de transcripción CBF de Arabidopsis thaliana (Jaglo-Ottosen y colaboradores, 1998 Science 280: 104 - 6). La sobreexpresión de este gen en Arabidopsis le confirió tolerancia a la sequía a esta planta (Kasuga y 10 colaboradores, 1999 Nature Biotech. 17: 287 - 91). Sin embargo, CBF es el único ejemplo hasta la fecha de un factor de transcripción capaz de conferir tolerancia a la sequía a las plantas por sobreexpresión.

Aunque se han caracterizado algunos genes que están involucrados en respuestas al estrés en plantas, la caracterización y clonación de genes de plantas que confieren tolerancia al estrés permanecen muy incompletas y fragmentadas. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que el estrés por sequía y 15 salinidad en algunas plantas puede ser debido a efectos aditivos del gen, en contraste con otras investigaciones que indican que genes específicos son activados en forma transcripcional lo cual conduce a acumulación de nuevas proteínas en tejido vegetativo de las plantas bajo condiciones de estrés osmótico. Aunque generalmente se asume que las proteínas inducidas por estrés juegan un papel en la tolerancia, se carece todavía de evidencia directa, y las funciones de muchos genes responsables del estrés 20 son desconocidas.

Por lo tanto, existe la necesidad de identificar genes expresados en las plantas tolerantes al estrés que tienen la capacidad de conferir resistencia al estrés a su planta huésped y a otras especies de plantas. Las plantas tolerantes al estrés recientemente generadas tendrán muchas ventajas, tales como un incremento en el rango en el que las plantas de cultivo pueden ser cultivadas, por ejemplo, disminuyendo 25 los requerimientos de aguade una especie de planta.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención reúne en parte la necesidad de identificar factores de transcripción únicos y nuevos capaces de conferir tolerancia al estrés a las plantas por sobreexpresión. Es decir, lo que se describe aquí es el factor de transcripción: Homeo Dominio/Cierre de Leucina (HDZ-1) de 30 Physcomitrella patens.

La presente invención proporciona una planta transgénica transformada por medio de un ácido nucleico que codifica a la proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en mayor tolerancia al estrés ambiental comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta en donde la TFSRP se selecciona del Homeo 35 Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica a la TFSRP se selecciona de Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11. 40

La invención establece en algunas modalidades que la TFSRP y el ácido nucleico que la codifica se encuentren en miembros del genero Physcomitrella. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una planta de Physcomitrella patens. La invención prevé que el estrés ambiental puede ser estrés por salinidad, sequía, temperatura, por metales, químico, patógeno y oxidativo, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, el estrés ambiental puede ser salinidad, sequía, y temperatura, o combinaciones de los mismos.

La invención proporciona además una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica TFSRP, en donde la planta es una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta y en donde 5 la semilla contiene la TFSRP seleccionada del Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO:18, o el ácido nucleico que codifica TFSRP seleccionado del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11. 10 La divulgación proporciona además una semilla producida por una planta transgénica que expresa una TFSRP, en donde la planta es una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta.

La invención prevé además el uso de la planta transgénica de acuerdo con la invención o la semilla de acuerdo con la invención para la producción de un producto agrícola. La invención 15 proporciona además una TFSRP aislada, en donde la TFSRP es como se la describe más adelante. La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica TFSRP, en donde al ácido nucleico que codifica TFSRP codifica para una TFSRP como se describe más adelante.

La invención proporciona además un vector aislado de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica TFSRP como se describe más adelante, en donde la expresión del vector 20 en una célula huésped resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. La invención proporciona además una célula huésped que contiene al vector y una planta que contiene la célula huésped.

La invención proporciona además un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica TFSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en una mayor 25 tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica TFSRP, y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y 30 homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HD-Z-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11.

La invención proporciona además un método para incrementar la expresión de un gen de interes 35 dentro de una célula huésped comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped, en donde se trascribe el gen de interés en respuesta a una TFSRP, que comprende: (a) la transformación de la célula huésped con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica TFSRP, y (b) la expresión de la TFSRP dentro de la célula huésped, incrementando así la expresión del gen transcrito en respuesta a la TFSRP comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped en donde la 40 TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11. 45

La presente invención proporciona además un método para identificar una nueva TFSRP, que comprende (a) elevar una respuesta específica de un anticuerpo a una TFSRP, o un fragmento de la misma, como se describió anteriormente; (b) seleccionar material putativo de la TFSRP con el anticuerpo, en donde el enlazamiento específico del anticuerpo con el material indica la presencia de una TFSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material enlazado en comparación con la TFSRP conocida para 5 determinar su novedad. La presente invención proporciona además el uso de la proteína aislada del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP) de acuerdo con la invención, el ácido nucleico aislado que codifica TFSRP de acuerdo con la invención o el vector aislado de expresión recombinante de acuerdo con la invención para la producción de una planta transgénica que tiene una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La presente invención 10 proporciona además un método para modificar la tolerancia al estrés de una planta que comprende, modificar la expresión de una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP) en la planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1 (A - G) muestran las secuencias parciales de ADNc del ejemplo comparativo de CABF-15 1 (SEQ ID NO: 1), del ejemplo comparativo de DBF-1 (SEQ ID NO: 2), del ejemplo comparativo de CBF-1 (SEQ ID NO: 3), de HDZ-1 (SEQ ID NO: 4) de acuerdo con la invención, del ejemplo comparativo de ZF-1 (SEQ ID NO: 5), del ejemplo comparativo de LZ-1 (SEQ ID NO: 6) y del ejemplo comparativo de CABF-2 (SEQ ID NO: 7) de Physcomitrella patens.

Las Figuras 2 (A - H) muestran las secuencias de longitud completa de ADNc del ejemplo 20 comparativo de CABF-1 (SEQ ID NO: 8), del ejemplo comparativo de DBF-1 (SEQ ID NO: 9), del ejemplo comparativo de la variante de DBF-1 (SEQ ID NO: 22), del ejemplo comparativo de CBF-1 (SEQ ID NO: 10), de HDZ-1 (SEQ ID NO: 11) de acuerdo con la invención, del ejemplo comparativo de ZF-1 (SEQ ID NO: 12), del ejemplo comparativo de LZ-1 (SEQ ID NO: 13) y del ejemplo comparativo de CABF-2 (SEQ ID NO: 14) de Physcomitrella patens. 25

Las Figuras 3(A - H) muestran las secuencias deducidas de aminoácidos del ejemplo comparativo de CABF-1 (SEQ ID NO: 15), del ejemplo comparativo de DBF-1 (SEQ ID NO: 16), del ejemplo comparativo de la variante de DBF-1 (SEQ ID NO: 23), del ejemplo comparativo de CBF-1 (SEQ ID NO: 17), de HDZ-1 (SEQ ID NO: 18) de acuerdo con la invención, del ejemplo comparativo de ZF-1 2 (SEQ ID NO: 19), del ejemplo comparativo de LZ-1 (SEQ ID NO: 20) y del ejemplo comparativo 30 de CABF-2 (SEQ ID NO: 21) de Physcomitrella patens.

La Figura 4 muestra un diagrama del vector de expresión pGMSG de la planta que contiene al súper promotor que dirige la expresión 5 de las SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, y 14 ("Gen Deseado"). Los componentes son: gen de resistencia a la gentamicina aacCl (Hajdukiewicz y colaboradores, 1994 Plant Molecular Biology 25: 989 - 94), promotor NOS (Becker y colaboradores, 1992 Plant Molecular 35 Biology 20: 1195 - 7), terminador g7T (Becker y colaboradores, 1992), terminador NOSpA (Jefferson y colaboradores, 1987 EMBO J. 6: 3901 - 7).

La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con sobreexpresión de HDZ-1 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre de acuerdo con la presente invención. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas 40 líneas de transformantes. Las Figures 6 a 14 muestran ejemplos comparativos.

La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con sobreexpresión de ZF-1 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con sobreexpresión de CABF-1 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

La Figura 8 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con sobreexpresión de DBF-1 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas 5 transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

La Figura 9 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con sobreexpresión de CABF-2 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con sobreexpresión de LZ-1 de 10 Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con sobreexpresión de CBF-1 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes. 15

La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo de estrés por salinidad con sobreexpresión de ZF-1 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

La Figura 13 muestra los resultados de un ensayo de estrés por salinidad con sobreexpresión de CABF-2 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. 20 Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

La Figura 14 muestra los resultados de un ensayo de estrés por salinidad con sobreexpresión de LZ-1 de Physcomitrella patens en plantas transgénicas y líneas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las líneas transgénicas muestran un fenotipo tolerante. Se muestran distintas líneas de transformantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 25

La presente invención puede ser entendida más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos allí. Sin embargo, antes de divulgar los presentes compuestos, composiciones, y métodos y describirlos, debe entenderse que esta invención no se limita a ácidos nucleicos específicos, a polipéptidos específicos, a tipos específicos de células, a células huésped específicas, a condiciones específicas, o a métodos 30 específicos, etc., ya que ellos pueden variar, desde luego, y las numerosas modificaciones y variaciones que puedan presentarse serán evidentes para aquellos capacitados en el arte. Debe entenderse también que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de describir modalidades específicas únicamente y no pretende constituirse en una limitante. En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como las "Proteínas del factor de Transcripción relacionadas con el Estrés" (TFSRP), de ninguna manera 35 limitan la funcionalidad de esas secuencias.

La presente invención proporciona una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica TFSRP en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica TFSRP se 40 selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11, en donde la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención proporciona además una semilla producida por una planta transgénica transformada por un 45 ácido nucleico que codifica TFSRP en donde la TFSRP se seleciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico 5 como se define en la SEQ ID NO: 11, en donde la semilla contiene al ácido nucleico que codifica TFSRP, y en donde la planta es una línea genéticamente pura en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) 10 como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11 para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención proporciona además una semilla producida por una planta transgénica que expresa una TFSRP, en donde la semilla contiene la TFSRP en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la 15 SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11, y en donde la planta es una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una 20 variedad de tipo silvestre de la planta. Como se lo utiliza aquí, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparte caracteres constantes que las separa de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de esa especie. Mientras posea al menos un rasgo distintivo, una variedad se caracteriza también por alguna variación entre individuos dentro de la variedad, con base principalmente en la segregación Mendeliana de los rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas. 25 Una variedad es considerada una "línea genéticamente pura" para un rasgo particular si es genéticamente homocigota para ese rasgo hasta un grado en que, cuando la variedad de la línea genéticamente pura es autógama, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el riesgo surge de la expresión transgénica de una secuencia única de ADN introducida en una variedad de una planta. 30

La invención proporciona además una TFSRP aislada. La invención establece que la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 o en donde la TFSRP es codificada por una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 11. Un nuevo hallazgo de la presente invención es que esta clase de factores de transcripción está involucrada en la tolerancia al estrés en plantas y que la expresión de un miembro de esta clase de proteína en una planta 35 puede incrementar esa tolerancia de la planta al estrés.

La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica TFSRP. La presente invención incluye ácido nucleico que codifica las TFSRP que codifican las TFSRP como se describe aquí. En modalidades preferidas, el ácido nucleico que codifica TFSRP es un Homeo Dominio/Cierre de Leucina (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 4. En una modalidad preferida, el ácido nucleico y la 40 proteína se aíslan de la planta del genero Physcomitrella. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una planta de Physcomitrella patens (P. patens).

Como se lo utiliza aquí, el término "estrés ambiental" se refiere a cualquier condición de crecimiento por debajo del óptimo e incluye, pero no se limita a, condiciones por debajo del óptimo asociadas con estés por salinidad, sequía, temperatura, metales, químico, patógenos y oxidativo, o 45 combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, el estrés ambiental puede ser salinidad, sequía, y temperatura, o combinaciones de las mismas, y en particular, puede ser alta salinidad, bajo contenido de agua y baja temperatura. Debe entenderse también que como se los utiliza en la descripción y en las reivindicaciones, "un" o "una" puede significar una o más, dependiendo del contexto en el cual se los utiliza. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar al 5 menos una célula.

De acurdo con los propósitos de esta invención, como se consagra y describe ampliamente aquí, esta invención, en un aspecto, proporciona un ácido nucleico aislado de un musgo que codifica una Proteína Relacionada con el Estrés (SRP), o una porción de la misma. En particular, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las TFSRP incluidas las secuencias de ácido nucleico 10 mostradas en la SEQ ID NO: 11. La presente invención también proporciona secuencias de aminoácidos de las TFSRP incluida la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 18.

Aún otro descubrimiento de la presente invención es que un grupo de factores de transcripción de Homeo Dominio/Cierre de Leucina confiere mayor tolerancia al estrés a las planas. También se describe una nueva proteína predicha de P. patens denominada HDZ-1 (SEQ ID NO: 18), que es un 15 homólogo de los factores de transcripción de HD-Z encontrados en las plantas. (En la Tabla 2 se muestra la homología con otras proteínas). Los factores de transcripción del Homeo Dominio (HD) han sido bien caracterizados en animales por estar involucrados en la formación de órganos. En plantas, las proteínas del HD parece que contienen, en muchos casos, un dominio adyacente de Cierre de Leucina (proteínas HD-Z). La mayoría de estos genes se expresan específicamente en meristemos, en forma consistente con 20 su papel en la determinación de la morfología (Tornero y colaboradores, .1996 PI. J. 9: 639 - 48). Sin embargo, las proteínas HD-Z han sido también implicadas en procesos que no son de desarrollo. La expresión de HDZ-1 (SEQ ID NO: 18) en Arabidopsis thaliana activa constitutivamente genes involucrados en tolerancia a la sequía, resultando en plantas tolerantes a la sequía.

Un aspecto de la invención se relaciona con moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican 25 polipéptidos TFSRP o porciones biológicamente activas de los mismos, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para ser utilizados como sondas de hibridación o iniciadores para la identificación o amplificación de ácido nucleico que codifica TFSRP (por ejemplo, ADN para TFSRP). Como se lo utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" tiene por objeto incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN 30 generado utilizando análogos de nucleótido. Este término también abarca una secuencia no traducida localizada en ambos extremos 3’ y 5’ de la región de codificación del gen: aproximadamente al menos 1000 nucleótidos de secuencia, secuencia arriba del extremo 5’ de la región de codificación y aproximadamente al menos 200 nucleótidos de secuencia, secuencia abajo del extremo 3’ de la región de codificación del gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero 35 preferiblemente es ADN bicatenario. Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de algunas de las secuencias que naturalmente flanquean al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en 40 diferentes modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico para la TFSRP puede contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ó 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de Physcomitrella patens). Además, una molécula "aislada" ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede estar libre de algo del otro 45 material celular con el cual está naturalmente asociado, o medio de cultivo cuando es producido por medio de técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros químicos cuando se los sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 o una porción de la misma, puede 5 ser aislada utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de la secuencia suministrada aquí. Por ejemplo, se puede aislar ADNc para TFSRP de P. patens de una biblioteca de P. patens utilizando toda o una porción de la SEQID NO: 4 como una sonda de hibridación y técnicas estándar de hibridación (por ejemplo, como se describe en Sambrook y colaboradores, 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory 10 Press, Cold Spring Harbor, NY). Además, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de la SEQ ID NO: 4 puede ser aislada por medio de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleótidos diseñados con base en esta secuencia (por ejemplo, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de la SEQ ID NO: 4 por medio de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleótidos diseñados con base en esta misma 15 secuencia de la SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, se puede aislar ARNm a partir de células vegetales (por ejemplo, por medio del procedimiento de extracción de guanidinio-tiocianato de Chirgwin y colaboradores, 1979 Biochemistry 18: 5294 - 5299) y se puede preparar ADNc utilizando transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa MLV de Moloney, disponible con Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa AMV, disponible con Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Se pueden 20 diseñar iniciadores oligonucleótidos sintéticos para amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa con base en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 4. Se puede amplificar una molécula de ácido nucleico de la invención utilizando ADNc o, alternativamente, ADN genómico, como molde e iniciadores oligonucleótidos apropiados de acuerdo con las técnicas estándar de amplificación por PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada puede ser clonada en un vector 25 apropiado y caracterizada por medio de análisis de la secuencia de ADN. Adicionalmente, se pueden preparar oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos para TFSRP por medio de técnicas estándar se síntesis, por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado de ADN.

En una modalidad preferida, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención incluye las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 11. La secuencia de la SEQ ID NO: 11 30 corresponde a los ADNc para TFSRP de Physcomitrella patens de la invención. Este ADNc incluye secuencias que codifican TFSRP (es decir, la "región de codificación", indicada en la Tabla 1), así como secuencias no traducidas 5’ y secuencias no traducidas 3’. Debe entenderse que la SEQ ID NO: 11 incluye ambas regiones de codificación y las regiones no traducidas 5’ y 3’. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede incluir únicamente la región de codificación de la secuencia en la SEQ 35 ID NO: 11 o puede contener los fragmentos genómicos completos aislados a partir del ADN genómico. Una región de codificación de estas secuencias está indicada como "posición del ORF".

En otra modalidad preferida, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención incluye una molécula de ácido nucleico que es un complemento de una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una 40 secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 es una que s suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 de tal manera que puede hibridar con las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 11 formando así un dúplex estable.

La molécula de ácido nucleico empleada en los métodos y plantas y semilla de la invención incluye una secuencia de nucleótidos que es aproximadamente al menos 70 - 80%, 80 - 90%, o 90 - 95%, 45 e incluso más preferiblemente aproximadamente al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, homóloga con una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 o una porción de la misma.

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir únicamente una porción de la región de codificación de la secuencia en la SEQ ID NO: 11 por ejemplo un fragmento que pueda ser utilizado como una sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de 5 una TFSRP. Las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación de los genes para la TFSRP de P. patens permiten la generación de sondas y de iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos de TFSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de TFSRP de otros musgos o especies relacionadas. Por lo tanto, esta invención también proporciona compuestos que contienen las moléculas de ácido nucleico divulgadas aquí, o fragmentos de 10 las mismas. Estos compuestos incluyen las moléculas de ácido nucleico unidas a una unidad estructural. Estas unidades estructurales incluyen, pero no se limitan a, unidades estructurales de detección, unidades estructurales de hibridación, unidades estructurales de purificación, unidades estructurales de suministro, unidades estructurales de reacción, unidades estructurales de enlazamiento, y similares. La sonda/iniciador típicamente incluye un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido 15 típicamente incluye una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones estrictas con aproximadamente al menos 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de una de las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 11, una secuencia antisentido de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11 o mutantes de ocurrencia natural de las mismas. Se pueden utilizar iniciadores con base en una secuencia 20 de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 en reacciones por PCR para clonar homólogos de TFSRP. Se pueden utilizar sondas con base en la secuencia de nucleótidos para TFSRP para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homólogas. En modalidades preferidas, la sonda incluye además un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de la enzima. Tales 25 sondas pueden ser utilizadas como parte de un kit de prueba de marcadores genómicos para identificar células que expresen una TFSRP, por ejemplo por medio de la medición del nivel de un ácido nucleico que codifica TFSRP en una muestra de células, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm para TFSRP o determinando si un gen para TFSRP genómico ha sido mutado o suprimido.

En particular, un método útil para determinar el nivel de transcripción el gen (un indicador de la 30 cantidad de ARNm disponible para traducción hasta el producto génico) es llevar a cabo una transferencia tipo Northern (para referencia ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), en la cual se marca un iniciador diseñado para enlazarse con el gen de interés con un marcador detectable (usualmente radioactiva o quimioluminiscente), de tal menara que cuando se extrae el ARN total de un cultivo del organismo, se corre sobre gel, se lo transfiere a una 35 matriz estable y se incuba con esta sonda, el enlazamiento y la cantidad de enlazamiento de la sonda indica la presencia y también la cantidad de ARNm para este gen. Esta información demuestra al menos parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. Se puede preparar ARN celular total de las células, tejidos u órganos por medio de diferentes métodos, todos bien conocidos en el arte, por ejemplo aquel descrito en Bormann, E. R. y colaboradores, 1992 Mol. Microbiol. 6: 317 - 326. 40

Para evaluar la presencia o la cantidad relativa de proteína traducida a partir de este ARNm, se pueden emplear técnicas estándar, tales como transferencias tipo Western, (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). En este proceso, se extraen proteínas celulares totales, se las separa por medio de electroforesis en gel, se las transfiere a una matriz tal como nitrocelulosa, y se incuba con una sonda, por ejemplo un anticuerpo, que se enlaza 45 específicamente con la proteína deseada. Esta sonda está generalmente marcada con un marcador quimioluminiscente o colorimétrico que puede ser fácilmente detectado. La presencia y cantidad del marcador observado indica la presencia y la cantidad de la proteína mutante deseada presente en la célula.

En una modalidad, la molécula de ácido nucleico empleada en los métodos, la planta o la semilla de la invención codifica una proteína o una porción de la misma que incluye una secuencia de 5 aminoácidos que es suficientemente homóloga con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 de tal manera que la proteína o una porción de la misma mantiene la misma o una función similar a la secuencia de aminoácidos con la cual se la compara. Como se la utiliza aquí, la expresión "suficientemente homóloga" se refiere a proteínas o porciones de las mismas que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye un número mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por 10 ejemplo, un residió de aminoácido que tiene una cadena lateral similar que un residuo de aminoácido, en los ORF de una secuencia de la SEQ ID NO: 18) a una secuencia de aminoácidos de TFSRP de tal manera que la proteína o una porción de la misma es capaz de participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente puede participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens. También se 15 describen aquí ejemplos de tales actividades. En la Tabla 1 se exponen ejemplos de actividades de TFSRP.

En otra modalidad, la proteína empleada en los métodos, la planta o la semilla es aproximadamente al menos 70 - 80%, 80 - 90%, 90 - 95%, y más preferiblemente aproximadamente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más, homóloga con una secuencia entera de aminoácidos mostrada en la 20 SEQ ID NO: 18. En aún otra modalidad, aproximadamente al menos 70 - 80%, 80 - 90%,90 - 95%, y lo más preferible aproximadamente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más, homóloga con una secuencia entera de aminoácidos codificados por la secuencia de ácido nucleico mostrade en la SEQ ID NO: 11.

Porciones de proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico para TFSRP empleadas en los métodos, la planta o la semilla de la invención son preferiblemente porciones biológicamente 25 activas de una de las TFSRP. Como se lo utiliza aquí, el término "porción biológicamente activa de una TFSRP" tiene por objeto incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, de una TFSRP que participa en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente participa en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o tiene una actividad como la expuesta en la Tabla 1. Para determinar si una TFSRP o una porción 30 biológicamente activa de la misma pueden participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, se puede llevar a cabo un análisis de estrés de una planta que expresa la TFSRP. Tales métodos de análisis son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte, como se detalla en el Ejemplo 7.

Se pueden preparar fragmentos adicionales de ácido nucleico que codifican porciones 35 biológicamente activas de una TFSRP por medio del aislamiento de una porción de la secuencia en la SEQ ID NO: 18 que expresa la porción codificada de la TFSRP o del péptido (por ejemplo, por medio de expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la TFSRP o del péptido.

Además de las secuencias de nucleótidos para TFSRP de Physcomitrella patens mostradas en las 40 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 22, se apreciará por parte de aquellos capacitados en el arte que pueden existir polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de las TFSRP dentro de una población (por ejemplo, la población de Physcomitrella patens). Tal polimorfismo genético en el gen para TFSRP puede existir entre individuos dentro de una población debido a una 45 variación natural. Como se los utiliza aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que contienen un marco de lectura abierta que codifica una TFSRP, preferiblemente una TFSRP de Physcomitrella patens. Tales variaciones naturales pueden resultar típicamente en una diferencia de 1 - 5% en la secuencia de nucleótidos del gen para TFSRP. Cualquiera y todas de tales diferencias de nucleótidos y polimorfismos resultantes de aminoácidos en una TFSRP que 5 son el resultado de una variación natural y que no alteran la actividad funcional de las TFSRP están destinados a encontrase dentro del alcance de la invención.

Se pueden aislar las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes naturales y homólogos que no son de Physcomitrella patens del ADNc para TFSRP de Physcomitrella patens de la invención con base en su homología con el ácido nucleico de 20TFSRP de Physcomitrella patens 10 divulgada aquí utilizando el ADNc de Physcomitrella patens, o una porción del mismo, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación bajo condiciones de hibridación estrictas. Por lo tanto, en otra divulgación, una molécula aislada de ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos e hibrida bajo condiciones estrictas con la molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11. El ácido nucleico puede ser de al menos 30, 50, 100, 250 15 o más nucleótidos de longitud. Como se lo utiliza aquí, el término "hibrida bajo condiciones estrictas" tiene por objeto describir condiciones para hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos al menos 60% homólogas entre sí típicamente permanecen hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que secuencias aproximadamente al menos 65%, más preferiblemente aproximadamente al menos 70%, e incluso más preferiblemente aproximadamente al 20 menos 75% o más homólogas entre sí típicamente permanecen hibridadas entre sí. Tales condiciones estrictas son conocidas por aquellos capacitados en el arte y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1 - 6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo preferido no limitante de condiciones estrictas de hibridación son la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2 X SSC, SOS al 0,1 % a 50 - 65ºC. 25 Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la divulgación que hibrida bajo condiciones estrictas con una secuencia de la SEQ ID NO: 11 corresponde a una molécula de ácido nucleico de ocurrencia natural. Como se lo utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico de "ocurrencia natural" se refiere a una molécula de ARN o de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se presenta en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural). En una modalidad, el ácido nucleico codifica una 30 TFSRP natural de Physcomitrella patens.

Además de variantes de ocurrencia natural de la secuencia de TFSRP que pueden existir en la población, la persona capacitada se dará cuenta además que pueden introducirse cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 conduciendo por este medio a cambios en la secuencia de aminoácidos de la TFSRP codificada, sin alterar la habilidad funcional de la TFSRP. Por 35 ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de la SEQ ID NO: 11. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia de tipo silvestre de la TFSRP (SEQ ID NO: 18) sin alterar la actividad de dicha TFSRP, mientras que se requiere de un residuos de aminoácido "esencial" para la actividad de TFSRP. Otros residuos de aminoácidos, sin 40 embargo, (por ejemplo, aquellos que son no conservados o únicamente semiconservados en el dominio que tiene actividad de TFSRP) pueden no ser esenciales para la actividad y por lo tanto es probable que sean susceptibles de alteración sin alterar la actividad de TFSRP.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico que codifican las TFSRP que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son escenciales para la 45 actividad de TFSRP. Tales TFSRP difieren en la secuencia de aminoácidos de una secuencia contenida en la SEQ ID NO: 18 que retiene aún al menos una de las actividades de TFSRP descritas aquí. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico empleada en los métodos, la planta o la semilla incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína contiene una secuencia de aminoácidos aproximadamente al menos 70% homóloga con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 5 NO: 18 y es capaz de participar en la respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente participa en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o tiene una o más actividades expuestas en la Tabla 1. Preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es aproximadamente al menos 70 - 80%, 80 - 90%, 90 - 95% homóloga con una de las secuencias de la SEQ ID NO: 18 y lo más 10 preferible aproximadamente al menos 96%,97%,98%, o 99% homóloga con la secuencia de la SEQ ID NO: 18.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una de las secuencias de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23 y una forma mutante de las mismas) o de dos 15 ácidos nucleicos, se alinean las secuencias con el propósito de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para una óptima alineación con la otra proteína o ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácidos o de nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, una de las secuencias de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23) está ocupada por el mismo residuos de aminoácido o de nucleótido que la correspondiente posición en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de la secuencia seleccionada del polipéptido de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23), entonces las moléculas son homólogas en esa posición (es decir, como se lo utiliza 25 aquí, "homología" de aminoácido o de ácido nucleico es equivalente con "identidad" de aminoácido o de ácido nucleico). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100). Preferiblemente, la longitud de comparación de la secuencia es al menos de 15 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 residuos de aminoácidos, y 30 lo más preferible al menos de 35 residuos de aminoácidos.

Alternativamente, una determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 - 5877). Tal algoritmo está incorporado en los programas NBLAST 35 y XBLAST de Altschul, y colaboradores (1990 J. Mol. Biol. 215: 403 - 410). Las búsquedas de ácidos nucleicos con BLAST pueden llevarse a cabo con el programa NBLAST, puntaje = 100, longitud de palabra = 12 para obtener homólogos de secuencias de ácido nucleico con las moléculas de ácido nucleico para TFSRP de la invención. Las búsquedas de proteína con BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntaje = 50, longitud de palabra = 3 para obtener homólogos de secuencias de aminoácidos 40 con las TFSRP de la presente invención. Para obtener alineaciones con huecos para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y colaboradores (1997 Ácido nucleicos Res. 25: 3389 - 3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros determinados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la 45 comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 1989). Tal algoritmo está incorporado en el programa ALiGN (versión 2.0) que hace parte del paquete del programa de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALiGN para comparación de una secuencia de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de pesos PAM120, una penalización por longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4 para obtener homólogos de las secuencias de aminoácidos 5 con las TFSRP de la presente invención. Para obtener alineaciones con huecos para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y colaboradores (1997 Ácido nucleicos Res. 25: 3389 - 3402). Se pueden utilizar los parámetros determinados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS 10 1989). Tal algoritmo está incorporado en el programa ALiGN (versión 2.0) que hace parte del paquete del programa de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALiGN para comparación de una secuencia de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuos de pesos PAM120, una penalización por longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

Se puede crear la molécula de ácido nucleico empleada en estos métodos, planta y semilla que 15 codifica un homólogo de TFSRP con una secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 18 por medio de la introducción de una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 de tal manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en las secuencias de la SEQ ID NO: 11 por medio de técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y 20 mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos predichos de aminoácidos no esenciales. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual se reemplaza el residuo del aminoácido con un residuo del aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas 25 (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, 30 histidina). Por lo tanto, se reemplaza preferiblemente un residuo predicho de un aminoácido no esencial en una TFSRP con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones en forma aleatoria junto con todo o parte de una secuencia de codificación de TFSRP, por ejemplo por medio de mutagénesis por saturación, y se pueden seleccionar los mutantes resultantes por una actividad de TFSRP descrita aquí para identificar mutantes 35 que retengan actividad de TFSRP. Después de la mutagénesis de la secuencia de la SEQ ID NO: 11, se puede expresar la proteína codificada en forma recombinante y se puede determinar la actividad de la proteína analizando la tolerancia al estrés de una planta que expresa la proteína como se describe en el Ejemplo 7.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican las TFSRP empleadas en los métodos, 40 semilla y plantas de la invención descritas anteriormente, otro aspecto de la invención se relaciona con métodos que emplean moléculas de ácido nucleico que son antisentido a las mismas. Un ácido nucleico "antisentido" incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena de codificación de una molécula bicatenaria de ADNc o complementaria a una secuencia de ARNm. Por lo tanto, un ácido nucleico 45 antisentido puede enlazarse a través de un enlace de hidrógeno con un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena entera que codifica TFSRP, o únicamente a una porción de la misma. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región de codificación" de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica una TFSRP. El término "región de codificación" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que 5 contiene codones que son traducidos en residuos de aminoácidos (por ejemplo, la región entera de codificación de ""’ incluye los nucleótidos 1 a ....). En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región no codificadora" de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica TFSRP. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región de codificación que no son traducidas en aminoácidos (es decir, también denominadas 10 como regiones no traducidas 5’ y 3’).

Dadas las secuencias de la cadena de codificación de TFSRP divulgadas aquí (por ejemplo, las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 11), se pueden diseñar ácidos nucleicos antisentido empleados en los métodos de la invención de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región entera de codificación del 15 ARNm para TFSRP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido únicamente a una porción de la región no codificadora o de codificación del ARNm para TFSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea al sitio de inicio de la traducción del ARNm para TFSRP. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, aproximadamente de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Se puede construir un 20 ácido nucleico antisentido de la invención utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) utilizando nucleótidos de ocurrencia natural o diferentes nucleótidos modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos sentido y 25 antisentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden ser utilizados para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil uracilo, dihidrouracilo, beta-O-galactosilqueosina, inosina, N-6-30 isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N-6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-O-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetil uracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiarético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido 35 uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión dentro del cual se ha subclonado ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido con un ácido nucleico objetivo de interés, descrito adicionalmente en la 40 siguiente subsección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido empleadas en los métodos de la invención se administran típicamente a una célula o se generan in situ de tal manera que hibridan con o se enlazan con ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una TFSRP para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, por medio de la inhibición de la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser por 45 medio de complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se enlaza con dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. La molécula antisentido puede ser modificada de tal manera que se enlaza específicamente con un receptor o un antígeno expresado sobre una superficie celular seleccionada por ejemplo, por medio del enlazamiento de la molécula de ácido 5 nucleico antisentido con un péptido o un anticuerpo que se enlaza con un receptor o un antígeno de la superficie de la célula. Se puede suministrar también la molécula de ácido nucleico antisentido a las células utilizando los vectores descritos aquí. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren las construcciones de vectores en las cuales se coloca la molécula de ácido nucleico antisentido bajo el control de promotores procariotas, virales, o eucariotas fuertes (incluida 10 una planta).

En aún otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido empleada en los métodos de la invención es una molécula de ácido nucleico α-anomérica. Una molécula de ácido nucleico α-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el cual, contrario a las unidades β usuales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y colaboradores, 1987 Ácido nucleicos. Res. 15: 15 6625 - 6641). La molécula antisentido de ácido nucleico puede incluir también un 2’-o-metilribonucleótido (Inoue y colaboradores, 1987 Ácido nucleicos Res. 15: 6131 - 6148) o un análogo quimérico de ARN - ADN (Inoue y colaboradores, 1987 FBBS Lett. 215: 327 - 330).

En aún otra modalidad, un ácido nucleico antisentido empleado en los métodos de la invención es una ribozima. Las ribozimas con moléculas catalíticas de ARN con actividad de ribonucleasa que son 20 capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, con el cual ellas tienen una región complementaria. Por lo tanto, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988 Nature 334: 585 - 591)) pueden ser utilizadas para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm para TFSRP para inhibir así la traducción de ARNm para TFSRP. Se puede diseñar una ribozima que tenga especificidad por un ácido nucleico que codifique para TFSRP 25 con base en la secuencia de nucleótidos de un ADNc para TFSRP divulgada aquí (es decir, la SEQ ID NO: 11) o con base en una secuencia heteróloga que se aísla de acuerdo con los métodos enseñados en esta invención. Por ejemplo, se puede construir un derivado de un ARN de Tetrahymena L-19 IVS en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que va a ser escindida en un ARNm que codifica para TFSRP. Ver, por ejemplo, Cech y colaboradores, patente 30 estadounidense No. 4.987.071 y Cech y colaboradores, patente estadounidense No. 5.116.742. Alternativamente, se puede utilizar ARNm para TFSRP para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad específica de ribonucleasa a partir de una reserva de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartei, D. y Szostak, J. W., 1993 Science 261: 1411 - 1418.

Alternativamente, se puede inhibir la expresión del gen para TFSRP por medio de secuencias de 35 nucleótidos objetivo complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleótidos para TFSRP (por ejemplo, un promotor y/o reforzador de TFSRP) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción de un gen para TFSRP en células objetivo. Ver generalmente, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569 - 84; Helene, C. y colaboradores, 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27 - 36; y Maher, L. J., 1992 Bioassays 14(12): 807. 40

La invención proporciona además un vector aislado de expresión recombinante que contiene un ácido nucleico como se describió anteriormente, en donde la expresión del vector en la célula huésped resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. Como se lo utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que 45 se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) 5 se integran dentro del genoma de una célula huésped por introducción dentro de la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están operativamente enlazados. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y 10 "vector" pueden ser utilizados en forma intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir tales otras formas de vectores de expresión, por ejemplo vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación anormal, adenovirus y virus adeno asociados 35), que realizan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante de la invención incluyen un ácido nucleico de la 15 invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo cual significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas con base en las células huésped que son utilizadas para expresión, que están operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico que va a ser expresada. En un vector de expresión recombinante, "operativamente enlazado" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está 20 enlazada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores, reforzadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras están descritas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression 25 Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o ver: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick and Thompson, Capítulo 7, 89 - 108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluidas las referencias citadas allí. Las secuencias reguladoras incluyen a aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos 30 únicamente en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Aquellos capacitados en el arte se darán cuenta que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la escogencia de la célula huésped que va a ser transformada, del nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Se pueden introducir los vectores de expresión de la invención en células huésped para producir así proteínas o péptidos, incluidas proteínas de fusión o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe aquí 35 (por ejemplo, las TFSRP, formas mutantes de las TFSRP, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para expresión de las TFSRP en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los genes para TFSRP se pueden expresar en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras células de hongos (ver Romanos, M. A. y colaboradores, 1992 40 Foreign gene expresión in yeast: a review, Yeast 8: 423 - 488; van den Hondel, C. A. M. J. J. y colaboradores, 1991 Heterologous gene expresión in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396 - 428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J., 1991 Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. y colaboradores, eds., p. 1 - 28, Cambridge 45 University Press: Cambridge), algas (Falciatore y colaboradores, 1999 Marine Biotechnology 1 (3): 239 - 251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del genero Stylonychia lemnae con vectores siguiendo un método de transformación como se describe en WO 98/01572 y células vegetales multicelulares (ver Schmidt, R. y 5 Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583 - 586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, S. 71 - 119 (1993); F. F. White, B. Jenes y colaboradores, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128 - 43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant 10 Molec. Biol. 42: 205 - 225 y las referencias citadas allí) o células de mamífero. Células huésped adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Alternativamente, se puede transcribir y traducir el vector de expresión recombinante in vitro, utilizando por ejemplo las secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7. 15

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo más a menudo con vectores que contienen promotores inducibles o constitutivos que dirigen la expresión ya sea de proteínas de fusión o de proteínas que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden una cantidad de aminoácidos a una proteína codificada allí, usualmente al terminal amino de la proteína recombinante pero también al terminal C o fusionados dentro de regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión sirven 20 típicamente tres propósitos: 1) incrementar la expresión de proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión por fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la unidad estructural de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante de la unidad estructural de fusión 25 para purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento de cognatos, incluyen al Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Los vectores típicos de expresión por fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S., 1988 Gene 67: 31 - 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST), proteína de enlazamiento de 30 maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objetivo. En una modalidad, la secuencia de codificación de la TFSRP se clona en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que contiene, desde el terminal N hasta el terminal C, un sitio de escisión de trombina-GST - proteína X. Se puede purificar la proteína de fusión por medio de cromatografía de afinidad utilizando resina de agarosa - glutationa. La TFSRP recombinante no fusionada a GST puede ser 35 recuperada por medio de escisión de la proteína de fusión con trombina.

Los ejemplos de vectores de expresión inducibles adecuados de E. coli que no son de fusión incluyen pTrc (Amann y colaboradores, 1988 Gene 69: 301 - 315) y pET’11d (Studiery colaboradores, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60 - 89). La expresión del gen objetivo a partir del vector pTrc vector se basa en la transcripción 40 de ARN polimerasa huésped de un promotor híbrido de fusión trp-lac. La expresión del gen objetivo a partir del vector pET 11 d se basa en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediado por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gnl). Esta polimerasa viral es suministrada por cepas huésped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) de un profago residente λ que alberga un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. 45

Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante es para expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad desmejorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119 - 128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que va a ser insertado en un vector de expresión de tal manera que los codones 5 individuales para cada aminoácido son aquellos preferencialmente utilizados en la bacteria escogida para expresión, por ejemplo C. glutamicum (Wada y colaboradores, 1992 Nucleic Acids Res. 20: 2111 - 2118). Tal alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención puede ser llevada a cabo por medio de técnicas estándar de síntesis de ADN.

En otra modalidad, el vector de expresión de TFSRP es un vector de expresión de levadura. Los 10 ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, y colaboradores, 1987 Embo J. 6: 229 - 234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30: 933 - 943), pJRY88 (Schultz y colaboradores, 1987 Gene 54: 113 - 123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen a aquellos detallados en: van den Hondel, C. A. M. 15 J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, y colaboradores, eds., p. 1 - 28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativamente, las TFSRP de la invención pueden expresars en células de insectos utilizando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas 20 en células cultivadas de insectos (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y colaboradores, 1983 Mol. Cell Biol. 3: 2156 - 2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989 Virology 170: 31 - 39).

En aún otra modalidad, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman y colaboradores, 1987 EMBO 25 J. 6: 187 - 195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son a menudo suministradas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados de derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus del Simio 40. Para otros sistemas adecuados de expresión tanto para células procariotas como eucariotas ver los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., 30 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra modalidad, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferencialmente en un tipo particular de célula (por ejemplo, se utilizan elementos reguladores específicos del tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos del tejido son conocidos en el arte. Los ejemplos no limitantes de promotores adecuados 35 específicos del tejido incluyen al promotor de albúmina (específico del hígado; Pinkert y colaboradores, 1987 Genes Dev. 1: 268 - 277), promotores específicos linfoideos (Calame e Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43: 235 - 275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989 EMBO J. 8: 729 - 733) e inmunoglobulinas (Banerji y colaboradores, 1983 Cell 33: 729 - 740; Queen y Baltimore, 1983 Cell 33: 741 - 748), promotores específicos de las neuronas (por ejemplo, el promotor 40 neurofilamentoso, Byrne y Ruddle, 1989 PNAS 86: 5473 - 5477), promotores específicos del páncreas (Edlund y colaboradores, 1985 Science 230: 912 - 916), y promotores específicos de la glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de la leche, patente estadounidense No. 4.873.316 y la publicación de la solicitud europea No. 264.166). También se incluyen promotores regulados por desarrollo, por ejemplo los promotores hox de múrido (Kessel y Gruss, 1990 Science 249: 374 - 379) y el promotor fetoproteína (Campes y Tilghman, 1989 Genes Dev. 3: 537 - 546).

En otra modalidad, las TFSRP de la invención se pueden expresar en células de plantas unicelulares (tales como algas) (ver Falciatore y colaboradores, 1999 Marine Biotechnology 1 (3): 239 - 251 y las referencias citadas allí) y células vegetales de plantas superiores (por ejemplo, los 5 espermatofitos, por ejemplo plantas de cultivo). Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen a aquellos detallados en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195 - 1197; y Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711 - 8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and 10 Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38.

Un casete de expresión de una planta preferiblemente contiene secuencias reguladoras capace de dirigir la expresión génica en células vegetales y que están operativamente enlazadas de tal manera que cada secuencia puede cumplir su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por medio de señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan a partir 15 de ADN-t de Agrobacterium tumefaciens por ejemplo el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti, pTiACH5 (Gielen y colaboradores, 1984 EMBO J. 3: 835) o equivalentes funcionales del mismo pero también son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en plantas.

Como la expresión de un gen en una planta muy a menudo no está limitada a niveles transcripcionales, un casete de expresión de una planta contiene preferiblemente otras secuencias 20 operativamente enlazadas como reforzadores de traducción tal como la secuencia overdrive que contiene la secuencia líder 5’no traducida del virus del mosaico del tabaco que refuerza la proteína por relación de ARN (Gallie y colaboradores, 1987 Nucl. Acids Research 15: 8693 - 8711).

La expresión del gen de la planta tiene que estar operativamente enlazada a un promotor apropiado que confiere expresión génica en una forma oportuna, específica del tejido o de la célula. Se 25 prefieren los promotores que dirigen la expresión constitutiva (Benfey y colaboradores, 1989 EMBO J. 8: 2195 - 2202) como aquellos derivados de virus de la planta como el CAMV 35S (Franck y colaboradores, 1980 Cell 21: 285 - 294), el CaMV 19S (ver también la patente estadounidense No. 5.352.605 y WO8402913) o promotores de la planta como aquellos de la subunidad pequeña de Rubisco descritos en la patente estadounidense No. 4.962.028. 30

Otras secuencias preferidas para uso en casetes de expresión del gen de la planta son las secuencias objetivo necesarias para dirigir el producto génico en su compartimiento celular apropiado (para revisón ver Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285 - 423 y las referencias citadas allí) tal como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos como los amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplasmático, cuerpos oleosos, 35 peroxisomas y otros compartimientos de las células vegetales.

La expresión del gen de la planta se puede facilitar también a través de un promotor inducible (para revisión ver Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89 - 108). Los promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se quiere que ocurra la expresión el gen en una forma específica en el tiempo. Los ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido 40 salicílico (WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y colaboradores, 1992 Plant J. 2: 397 - 404) y un promotor inducible por etanol (WO 93/21334).

También, los promotores adecuados que responden a condiciones de estrés biótico o abiótico son aquellos tales como el promotordel gen PRPI inducible por patógenos (Ward y colaboradores, 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361 - 366), el promotor hsp80 inducible por calor del tomate (patente estadounidense No. 45 5.187.267), el promotor alfa-amilasa inducible por frío de la patata (WO 96/12814) o el promotor pinll inducible por heridas (EP 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío, y salinidad, tales como el promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozalei y colaboradores (1993 Mol. Gen. Genet. 235: 331 - 340).

Especialmente se prefieren aquellos promotores que confieren expresión génica en órganos y 5 tejidos específicos, tal como las células de defensa y las células del pelo de la raíz. Los promotores adecuados incluyen al promotor del gen de la napina de colza (patente estadounidense No. 5.608.152), al promotor USP de Vicia faba (Baeumlein y colaboradores, 1991 Mol Gen Genet. 225(3): 459 - 67), al promotor de oleosina de Arabidopsis (WO9845461), al promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente estadounidense No. 5504200), al promotor Bce4 de Brassica (WO9113980) o al promotor B4 de 10 legumina (LeB4; Baeumlein y colaboradores, 1992 Plant Journal, 2(2): 233 - 9) así como promotores que confieren expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas como el maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Promotores adecuados destacados con son el promotor del gen 1 pt2 o 1 pt1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) o aquellos descritos en WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína de la cebada, gen de la glutelina del arroz, gen de la orizina del arroz, gen de la prolamina del arroz, gen 15 de la gliadina del trigo, gen de la glutelina del trigo, gen de la zeína del maíz, gen de la glutelina de la avena, gen de la kasirina del sorgo y gen de la secalina del centeno).

También son especialmente adecuados los promotores que confieren expresión génica específica del plástido ya que los plástidos son el compartimiento donde se sintetizan precursores y algunos productos finales de la biosíntesis de lípidos. Los promotores adecuados son el promotor de la ARN 20 polimerasa viral descrito en WO 95/16783 y WO 97/06250 y el promotor clpP de Arabidopsis descrito en WO 99/46394.

La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que incluye una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está operativamente enlazada a una secuencia reguladora en una forma que 25 permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm de TFSRP. Las secuencias reguladoras operativamente enlazadas a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido pueden ser escogidas para que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células. Por ejemplo, promotores virales y/o reforzadores, o se pueden escoger secuencias reguladoras que dirijan la expresión de tipo 30 constitutivo, específica del tejido o específica de la célula de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el cual se producen ácido nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad se pude determinar por medio del tipo de célula en la cual se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido ver Weintraub, H. y 35 colaboradores, Antisense ARN as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 y Mol y colaboradores, 1990 FEBS Letters 268: 427 - 430.

Otro aspecto de la invención se relaciona con células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan en forma intercambiable aquí. Se entiende que tales términos se refieren no 40 solamente a la célula objetivo particular sino que también se aplican a la progenie o a la progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido ya sea a una mutación o a influencias ambientales, tal progenie puede no ser en realidad, idéntica a la célula original, pero aún están incluidas dentro del alcance del término como se lo utiliza aquí. 45

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una TFSRP puede ser expresada en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células de hongos o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células vegetales, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Aquellos capacitados en el arte conocen otras células huésped adecuadas. 5

Se puede introducir el ADN del vector en células procariotas o eucariotas a través de técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se utilizan aquí, los términos "transformación", "transfección", "conjugación" y "transducción" se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para la introducción de ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluida la precipitación conjunta con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-10 dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada químicamente y electroporación. Los métodos adecuados para transformación o transfección de células huésped incluidas células vegetales pueden encontrarse en Sambrook, y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium 15 protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Ya que la tolerancia al estrés biótico y abiótico es una característica general que se desea que sea heredada en una amplia variedad de plantas como el maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, colza y canola, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especie Vicia, guisantes, alfalfa, plantas de arbusto (café, cacao, té), especie de sauce, árboles (palma 20 oleaginosa, coco), pastos perennes y cultivos forrajeros, estas plantas de cultivo son también plantas objetivo preferidas para ingeniería genética como una modalidad adicional de la presente invención.

En particular, la invención proporciona un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica TFSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta que 25 comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico para TFSRP, y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. En modalidades preferidas, la TFSRP es como se describió anteriormente. En modalidades preferidas, el ácido nucleico que codifica TFSRP es como se describió anteriormente. La invención también proporciona un método para 30 incrementar la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped, en donde el gen de interés es transcrito en respuesta a una TFSRP, que comprende: (a) la transformación de la célula huésped con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica TFSRP, y (b) la expresión de la TFSRP dentro de la célula huésped, incrementando así la expresión del gen transcrito en respuesta a la TFSRP comparada con una variedad 35 de tipo silvestre de la célula huésped. En modalidades preferidas, la TFSRP es como se describió anteriormente. En modalidades preferidas, el ácido nucleico que codifica TFSRP es como se describió anteriormente.

Para tal transformación de la planta, se pueden utilizar vectores binarios tales como pBinAR (Höfgen y Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221 - 230). La construcción de los vectores binarios se 40 puede realizar por ligación del ADNc en orientación sentido o antisentido dentro del T-ADN. 5 prima en el ADNc, un promotor de una planta activa la transcripción del ADNc. Una secuencia de poliadenilación se localiza 3 prima en el ADNc. Se puede lograr la expresión específica en el tejido por medio del uso de un promotor específico para el tejido. Por ejemplo, se puede lograr la expresión específica en la semilla por medio de clonación de la napina o el promotor LeB4 o USP 5 prima en el ADNc. También, se puede 45 utilizar cualquier otro elemento promotor específico de la semilla. Para expresión constitutivo dentro de la planta completa, se puede utilizare el promotor CaMV 35S. La proteína expresada puede ser dirigida a un compartimiento celular utilizando un péptido señal, por ejemplo para plástidos, mitocondria o retículo endoplasmático (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci., 1996 4 (15): 285 - 423). El péptido señal se clona 5 prima en el marco para el ADNc para archivar la localización subcelular de la proteína de fusión. 5

Se puede lograr la transformación de la planta mediada por Agrobacterium utilizando por ejemplo la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383 - 396) o LBA4404 (Clontech). La transformación puede ser realizada por medio de técnicas estándar de transformación (Deblaere y colaboradores, 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777 - 4788). En una modalidad, se pueden utilizar promotores que responden a estreses abióticos, tales como el 10 promotor RD29A de Arabidopsis, con las secuencias de ácido nucleico divulgadas aquí. Alguien capacitado en el arte se dará cuenta que el promotor utilizado debe estar operativamente enlazado al ácido nucleico de tal manera que el promotor causa la transcripción del ácido nucleico que resulta en la síntesis de un ARNm que codifica un polipéptido. Alternativamente, el ARN puede ser un ARN antisentido para uso afectando la expresión posterior del mismo o de otro gen o genes. 15

La transformación de la planta mediada por Agrobacterium puede llevarse a cabo utilizando técnicas estándar de transformación y regeneración (Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995. - en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993. - 360 S., ISBN 0-8493-20 5164-2). Por ejemplo, se puede transformar colza a través de la transformación del cotiledón o el hipocotiledón (Moloney y colaboradores, 1989 Plant cell Report 8: 238 - 242; De Block y colaboradores, 1989 Plant Physiol. 91: 694 - 701). El uso de antibióticos para Agrobacterium y selección de plantas depende del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de colza normalmente se lleva a cabo utilizando kanamicina como marcador seleccionable de la planta. 25 La transferencia génica mediada por Agrobacterium para lino puede ser llevada a cabo utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova y colaboradores, 1994 Plant Cell Report 13: 282 - 285. Adicionalmente, la transformación de soja se puede llevar a cabo utilizando por ejemplo una técnica descrita en EP 0424 047, patente estadounidense No. 5.322.783 (Pioneer Hi-Bred International) o en EP 0397 687, patente estadounidense No. 5.376.543, patente estadounidense No. 5.169.770 (University 30 Toledo).

La transformación de la planta utilizando bombardeo de partículas, captación de ADN mediada por Polietilén Glicol o a través de la técnica de la Fibra del Carburo de Silicio es por ejemplo descrita por Freeling y Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7. Un ejemplo específico de transformación del maíz se encuentra en la patente estadounidense No. 5.990.387 35 y un ejemplo específico de transformación de trigo puede encontrarse en WO 93/07256.

Para una transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, únicamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo dentro de su genoma. Con el propósito de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifique un marcador seleccionable (por ejemplo, de 40 resistencia a los antibióticos) dentro de las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen a aquellos que confieren resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato o en plantas que confieran resistencia a un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Se pueden introducir moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable dentro de una célula huésped en el mismo vector como aquel que codifica una TFSRP o se puede 45 introducir en un vector separado. Se pueden identificar células transfectadas en forma estable con la molécula introducida de ácido nucleico, por ejemplo, por medio de selección del fármaco (por ejemplo, las células que hayan incorporado al gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Para crear un microorganismo homólogo recombinante, se prepara un vector que contenga al 5 menos una porción de un gen para TFSRP dentro del cual se ha introducido una supresión, adición o sustitución para así después, por ejemplo, perturbar funcionalmente, al gen para TFSRP. Preferiblemente, este gen para TFSRP es un gen para TFSRP de Physcomitrella patens, pero puede ser un homólogo de una planta relacionada o incluso de una fuente de mamífero, levadura o insecto. En una modalidad preferida, se diseña el vector de tal manera que, por recombinación homóloga, se perturba funcionalmente 10 el gen para la TFSRP endógena (es decir, no codifica más una proteína funcional; también denominado como un vector desactivador). Alternativamente, se puede diseñar el vector de tal manera que, por recombinación homóloga, se muta el gen para la TFSRP endógena o bien se altera pero aún codifica proteína funcional (por ejemplo, se puede alterar la región reguladora secuencia arriba para alterar así la expresión de la TFSRP endógena). Para crear una mutación puntual a través de recombinación homóloga, 15 se pueden utilizar híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeroplastia (Cole-Strauss y colaboradores, 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323 - 1330 y Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3): 240 - 247). Se conocen también en el estado del arte procedimientos de recombinación homóloga en Physcomitrella patens y están contemplados para ser utilizados aquí.

Mientras que en el vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen para TFSRP 20 está flanqueado en sus extremos 5’ y 3’ por una molécula adicional de ácido nucleico del gen para TFSRP para permitir que ocurra recombinación homóloga entre el gen exógeno para TFSRP trasportado por el vector y un gen endógeno para TFSRP en un microorganismo o planta. La molécula adicional de ácido nucleico de flanqueo para TFSRP es lo suficientemente larga para recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN de flanqueo 25 (tanto en los extremos 5’ como 3’) están incluidos en el vector (ver por ejemplo, Thomas, K. R., y Capecchi, M. R., 1987 Cell 51: 503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp y colaboradores, 1998 PNAS, 95 (8): 4368 - 4373 para recombinación con base en ADNc en Physcomitrella patens). Se introduce el vector en una célula vegetal o de un microorganismo (por ejemplo, a través de ADN mediado por polietilén glicol) y se seleccionaron células en las cuales el gen 30 introducido para TFSRP se ha recombinado en forma homóloga con el gen endógeno para TFSRP, utilizando técnicas conocidas en el arte.

En otra modalidad, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen para TFSRP en un vector dejándolo bajo el control del operón lac permite la expresión del gen para 35 TFSRP únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en el arte.

Se puede utilizar una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariota o eucariota en el cultivo, para producir (es decir, expresar) una TFSRP. Se puede aplicar un método alternativo adicional en plantas por medio de la transferencia directa de ADN en flores en desarrollo a través de electroporación o de transferencia de genes por medio de Agrobacterium. Por lo tanto, la 40 invención proporciona además métodos para producir las TFSRP utilizando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método comprende el cultivo de la célula huésped de la invención (dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una TFSRP, o dentro de cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica una TFSRP de tipo silvestre o alterada) en un medio adecuado hasta que se produce TFSRP. En otra modalidad, el método comprende además el aislamiento de las TFSRP del medio o de la Célula huésped.

Otro aspecto de la invención se relaciona con las TFSRP aisladas, y con porciones biológicamente activas de las mismas. Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está libre de algo del material celular cuando se la produce por medio 5 de técnicas de ADN recombinante, o de precursores químicos u otros químicos cuando se la sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de TFSRP en las cuales la proteína se separa de algunos de los componentes celulares de las células en las cuales es producida en forma natural o recombinante. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de TFSRP que tiene aproximadamente menos de 30% (en peso 10 seco) de proteína que no es TFSRP (también llamada aquí como "proteína contaminante"), más preferiblemente aproximadamente menos de 20% de proteína que no es TFSRP, aún más preferiblemente aproximadamente menos de 10% de proteína que no es TFSRP, y lo más preferible aproximadamente menos de 5% de proteína que no es TFSRP. Cuando se produce en forma recombinante la TFSRP o una porción biológicamente activa de la misma, también está preferiblemente sustancialmente libre de medio 15 de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa aproximadamente menos del 20%, más preferiblemente aproximadamente menos del 10%, y lo más preferible aproximadamente menos del 5% del volumen de la preparación de proteína. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros químicos" incluye preparaciones de TFSRP en las cuales la proteína se separa de precursores químicos o de otros químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. En una modalidad, la 20 expresión "sustancialmente libre de precursores químicos o de otros químicos" incluye preparaciones de TFSRP que tienen aproximadamente menos de 30% (en peso seco) de precursores químicos o de químicos que no son de TFSRP, más preferiblemente aproximadamente menos de 20% de precursores químicos o de químicos que no son de TFSRP, aún más preferiblemente aproximadamente menos de 10% de precursores químicos o de químicos que no son de TFSRP, y lo más preferible aproximadamente 25 menos de 5% de precursores químicos o de químicos que no son de TFSRP. En modalidades preferidas, proteínas aisladas o porciones biológicamente activas de las mismas carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo a partir del cual se deriva la TFSRP. Típicamente, tales proteínas son producidas por expresión recombinante, por ejemplo, de una TFSRP de Physcomitrella patens en plantas diferentes de Physcomitrella patens o microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos. 30

Una TFSRP aislada o una porción de la misma de la invención pueden participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente pueden participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o tiene una o más de las actividades expuestas en la Tabla 1. En modalidades preferidas, la proteína o una porción de la misma incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente 35 homóloga con una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 11 de tal manera que la proteína o una porción de la misma mantienen la habilidad para participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en Physcomitrella patens, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas. La porción de la proteína es preferiblemente una porción biológicamente activa como la descrita aquí. En otra modalidad preferida, 40 una TFSRP de la invención tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. En aún otra divulgación, la TFSRP tiene una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida, por ejemplo, bajo condiciones estrictas, con una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11. En aún otra modalidad preferida, la TFSRP empleada en los métodos, la semilla o las plantas de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70 - 80%, 45 80 - 90%, 90 - 95%, e incluso más preferiblemente aproximadamente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más, homóloga con una de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18. Las TFSRP de la divulgación también poseen preferiblemente al menos una de las actividades de TFSRP descritas aquí. Por ejemplo, una TFSRP preferida de la presente invención incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida, por ejemplo, bajo condiciones estrictas, con una 5 secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 y que puede participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente puede participar en la transcripción de una proteína involucrada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o que tiene una o más de las actividades expuestas en la Tabla 1.

En otras modalidades, la TFSRP empleada en los métodos, la semilla o las plantas de la 10 invención es sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 y retiene la actividad funcional de la proteína de la secuencia de la SEQ ID NO: 18, aunque difiere en la secuencia de aminoácidos debido a una variación natural o mutagénesis, como se describió en detalle más arriba. Por lo tanto, en otra modalidad, la TFSRP empleada en los métodos, la semilla o las plantas de la invención es una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 70 - 80, 80 - 15 90, 90 - 95%, y lo más preferible aproximadamente al menos 96%, 97%, 98%, 99% o más, homóloga a una secuencia entera de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18, y que tiene al menos una de las actividades de TFSRP descritas aquí. En otra modalidad, la invención se relaciona con una proteína completa de Physcomitrella patens que es sustancialmente homóloga a una secuencia entera de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 11. 20

Las porciones biológicamente activas de una TFSRP empleada en los métodos, la semilla o las plantas de la invención incluyen péptidos que contienen secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una TFSRP, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 o la secuencia de aminoácidos de una proteína homóloga a una TFSRP, que incluye menos aminoácidos que una TFSRP de longitud completa o la proteína de longitud completa que s homóloga a 25 una TFSRP, y exhibe al menos una actividad de una TFSRP. Típicamente, las porciones biológicamente activas (péptidos, por ejemplo, péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) incluyen un dominio o motivo con al menos una actividad de una TFSRP. Además, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas, en las cuales otras regiones de la proteína están suprimidas, por medio de técnicas recombinantes y evaluadas por una o más de las 30 actividades descritas aquí. Preferiblemente, las porciones biológicamente activas de una TFSRP incluyen uno o más de los dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen actividad biológica.

Las TFSRP son producidas preferiblemente por medio de técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión 35 (como se describió anteriormente), se introduce el vector de expresión en una célula huésped (como se describió anteriormente) y la TFSRP se expresa en la Célula huésped. La TFSRP puede ser aislada luego de las células por medio de un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. En forma alternativa a la expresión recombinante, se pueden sintetizar químicamente TFSRP, un polipéptido, o un péptido utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. 40 Además, se puede aislar TFSRP nativa de las células (por ejemplo, de Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-TFSRP, que puede ser producido por medio de técnicas estándar utilizando una TFSRP o un fragmento de la misma de esta invención.

La invención también proporciona proteínas TFSRP quiméricas o de fusión. Como se lo utiliza aquí, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" TFSRP comprende un polipéptido de TFSRP 45 operativamente enlazado a un polipéptido que no es de TFSRP. Un "polipéptido de TFSRP" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una TFSRP, mientras que un "polipéptido que no es de TFSRP" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la TFSRP, por ejemplo, una proteína que es diferente de la TFSRP y que se deriva del mismo o de un organismo diferente. Dentro de 5 la proteína de fusión, el término "operativamente enlazado" se refiere a que el polipéptido de TFSRP y el polipéptido que no es de TFSRP se fusionan entre sí de manera que ambas secuencias cumplan la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido que no es de TFSRP puede estar fusionado al terminal N o al terminal C del polipéptido de TFSRP. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-TFSRP en la cual las secuencias de TFSRP se fusionan al terminal 10 C de las secuencias de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de las TFSRP recombinantes. En otra modalidad, la proteína de fusión es una TFSRP que contiene una secuencia de una señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), se puede incrementar la expresión y/o la secreción de una TFSRP a través del uso de una secuencia de una señal heteróloga. 15

Preferiblemente, se produce una proteína TFSRP quimérica o de fusión de la invención por medio de técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan juntos en el marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo por medio del empleo de terminales con extremos romos o escalonados para ligación, digestión con enzima de restricción para proporcionar terminales apropiados, rellenado de 20 extremos cohesivos según convenga, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseadas y ligación enzimática. En otra modalidad, se puede sintetizar el gen de fusión por medio de técnicas convencionales incluyendo sintetizadores automatizados de ADN. Alternativamente, se puede llevar a cabo amplificación por PCR de fragmentos de gen utilizando iniciadores ancla que dan lugar a voladizos complementario entre dos fragmentos consecutivos de gen que pueden ser posteriormente apareados y 25 amplificados nuevamente para generar una secuencia quimérica del gen (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel y colaboradores John Wiley & Sons: 1992). Además, comercialmente se encuentran disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican una unidad estructural de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica TFSRP puede ser clonado en tal vector de expresión de tal manera que la unidad estructural de fusión se enlaza en el 30 marco a la TFSRP.

Los homólogos de la TFSRP pueden ser generados por mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual discreta o truncamiento de la TFSRP. Como se lo utiliza aquí, el término "homólogo" se refiere a una forma variante de la TFSRP que actúa como un agonista o antagonista de la actividad de la TFSRP. Un agonista de la TFSRP puede retener sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades 35 biológicas de la TFSRP. Un antagonista de la TFSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma de ocurrencia natural de la TFSRP, por ejemplo, por medio de enlazamiento competitivo con un miembro secuencia abajo o secuencia arriba de la cascada metabólica del componente de la membrana celular que incluye la TFSRP, o por medio del enlazamiento con una TFSRP que media el transporte de compuestos a través de tales membranas, evitando así que se lleva a cabo la translocación. 40

En una modalidad alternativa, se pueden identificar homólogos de la TFSRP por medio de selección de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de la TFSRP por la actividad agonista o antagonista de TFSRP. En una modalidad, se genera una biblioteca variada de variantes de TFSRP por medio de mutagénesis combinatorial a nivel nucleico complementario y se codifica por medio de una biblioteca variada de genes. Se puede producir una biblioteca variada de 45 variantes de TFSRP, por ejemplo, por medio de ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de tal manera que puede expresarse un conjunto degenerado de secuencias potenciales de TFSRP como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para despliegue de fagos) que contiene allí el conjunto de secuencias de TFSRP. Existen una variedad de métodos que pueden ser utilizados para producir 5 bibliotecas de homólogos potenciales de TFSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. Se puede llevar a cabo una síntesis química de una secuencia degenerada de un gen en un sintetizador automático de ADN, y luego se liga el gen sintético en un vector apropiado de expresión. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la disposición, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias potenciales de TFSRP. Los métodos para sintetizar 10 oligonucleótidos degenerados son conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura y colaboradores, 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura y colaboradores, 1984 Science 198: 1056; Ike y colaboradores, 1983 Ácido nucleico Res. 11: 477.

Además, se pueden utilizar bibliotecas de fragmentos de la codificación de TFSRP para generar una población variada de fragmentos de TFSRP para detección y posterior selección de homólogos de 15 una TFSRP. En una modalidad, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencia de codificación por medio de tratamiento de un fragmento bicatenario de PCR de una secuencia de codificación de TFSRP con una nucleasa bajo condiciones en donde ocurre mallado únicamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos 20 mellados, removiendo porciones monocatenarias de dúplex reformados por tratamiento con nucleasa S1, y ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por medio de este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifique fragmentos del terminal N, del terminal C e Internos e diferentes tamaños de la TFSRP.

Se conocen diferentes técnicas en el arte para seleccionar productos génicos de bibliotecas 25 combinatoriales elaboradas por medio de mutaciones puntuales o truncamientos, y por selección de bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas pueden adaptarse para selección rápida de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatorial de homólogos de TFSRP. Las técnicas más comúnmente utilizadas, que son sensible a análisis de alto rendimiento, por selección de grandes bibliotecas de genes típicamente incluyen clonación 30 de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformando células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresando los genes combinatoriales bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Se puede utilizar mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con el ensayo de selección para 35 identificación de homólogos de TFSRP (Arkin y Yourvan, 1992 PNAS 89:7811-7815; Delgrave y colaboradores, 1993 Protein Engineering 6(3): 327 - 331). En otra modalidad, se pueden aprovechar ensayos con base en la célula para analizar una biblioteca variada de TFSRP, utilizando métodos bien conocidos en el arte. La presente invención proporciona además un método para identificación de una nueva TFSRP, que comprende (a) aumentar una respuesta de un anticuerpo específico con una TFSRP, o 40 fragmento de la misma, como se describió anteriormente; (b) selección de material putativo de TFSRP con el anticuerpo, en donde el enlazamiento específico del anticuerpo con el material indica la presencia de una TFSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material enlazado en comparación con TFSRP conocida para determinar su novedad.

La moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína, proteínas de fusión, iniciadores, vectores, y células huésped descritos aquí pueden ser utilizados en uno o más de los siguientes métodos: identificación de Physcomitrella patens y organismos relacionados; mapeo de genomas de organismos relacionados con Physcomitrella patens; identificación y localización de secuencias de Physcomitrella patens de interés; estudios evolucionarios; determinación de las regiones de 5 TPSRP requeridas para funcionar; modulación de una actividad de TFSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones de las células; modulación del transporte transmembrana de uno o más compuestos; y modulación de resistencia al estrés.

El musgo Physcomitrella patens representa un miembro de los musgos. Está relacionado con otros musgos tales como Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia de luz. Musgos como 10 Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de homología sobre la secuencia de ADN y el nivel de polipéptidos permitiendo el uso de selección heteróloga de moléculas de ADN con sondas que evolucionan de otros musgos u organismos, permitiendo por lo tanto la derivación de una secuencia de consenso adecuada para selección heteróloga o la función de anotación y predicción de funciones de genes en terceras especies. La habilidad para identificar tales funciones puede tener por lo tanto una 15 relevancia significativa, por ejemplo, la predicción de la especificidad del sustrato de enzimas. Además, estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como puntos de referencia para el mapeo de genomas de musgo, o de genomas de organismos relacionados.

Las moléculas de ácido nucleico para TFSRP de la invención tienen una variedad de usos. Lo más importante, el ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de la presente invención pueden ser 20 utilizados para transformar plantas, induciendo por lo tanto tolerancia al estrés tal como sequía, alta salinidad y frío. La presente invención proporciona por lo tanto una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica TFSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención 25 establece además que la planta transgénica puede ser seleccionada de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especie Vicia, guisantes, alfalfa, café, cacao, té, especie de sauce, palma oleaginosa, coco, pastos perennes y cultivos forrajeros, por ejemplo. En particular, la presente invención describe utilizando la expresión de HDZ-1(SEQ ID NO: 18) para modificar por ingeniería genética 30 plantas tolerantes a la sequía. Esta estrategia ha sido demostrada aquí para Arabidopsis thaliana, Colza/Canola, soja, maíz y trigo pero esta aplicación no está restringida a estas plantas. Por lo tanto, la invención proporciona una planta transgénica que contiene el HDZ-1 de TFSRP como se definió anteriormente, incluyendo homólogos, en donde el estrés ambiental es sequía.

La presente invención también proporciona métodos para modificar la tolerancia al estrés de una 35 planta que comprenden, la modificación de la expresión de una TFSRP en la planta. La invención establece que este método puede ser llevado a cabo de tal manera que la tolerancia al estrés es o bien incrementada o disminuida.

Además, este método puede ser utilizado en donde la planta es ya sea transgénica o no transgénica. En los casos en donde la planta es transgénica, la planta puede ser transformada con un 40 vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican la TFSRP anteriormente descrita, o la planta puede ser transformada con un promotor que dirige la expresión de TFSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención establece que tal promotor puede ser específico del tejido. Además, tal promotor puede ser regulado por desarrollo. Alternativamente, plantas no transgénicas pueden tener expresión de TFSRP nativa modificada por medio de la inducción de un promotor nativo. 45 Adicionalmente, la invención establece que la expresión de TFSRP puede ser modificada por medio de la administración de una molécula antisentido que inhibe la expresión de TFSRP.

La expresión de HDZ-1(SEQ ID NO: 18) en plantas objetivo se puede lograr por medio de, pero no se limita a, uno de los siguientes ejemplos: (a) un promotor constitutivo, (b) un promotor inducible por estrés, (c) un promotor inducido químicamente, y (d) sobreexpresión de un promotor modificado por 5 ingeniería genética por ejemplo con factores de transcripción derivados de un dedo de zinc (Greisman y Pabo, 1997 Science 275: 657). El último caso involucra la identificación de homólogos de HDZ-1(SEQ ID NO: 18) en la planta objetivo así como de su promotor. Se modifican por medio de ingeniería genética factores de transcripción recombinantes que contienen un dedo de zinc para interactuar específicamente con el homólogo de HDZ-1(SEQ ID NO: 18) y se activa la transcripción del gen correspondiente. 10

Como se muestra aquí y se describe más completamente más adelante, la expresión del HDZ-1(SEQ ID NO: 18) de TFSRP en Arabidopsis thaliana confiere un alto grado de tolerancia a la sequía a la planta. Bajo condiciones de estrés por sequía, las líneas que sobreexpresan HDZ-1 mostraron una tasa de supervivencia del 50%. Los controles no transformados mostraron una tasa de supervivencia del 10%. Es digno de mención que los análisis de estas líneas transgénicas fueran llevados a cabo con plantas T1. Por 15 lo tanto, los resultados serán mejores cuando se encuentra un expresador fuerte homocigoto. Otra prueba de la implicación de estos genes en la tolerancia al estrés está dada por el incremento en el nivel de transcripción en respuesta al tratamiento a baja temperatura.

Además de la introducción de las secuencias de ácido nucleico para TFSRP en plantas transgénicas, se pueden utilizar también estas secuencias para identificar un organismo como 20 Physcomitrella patens o un pariente cercano del mismo. También, pueden ser utilizadas para identificar la presencia de Physcomitrella patens o un pariente de la misma en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona las secuencias de ácido nucleico de una cantidad de genes de Physcomitrella patens; sondeando el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mixta de microorganismos bajo condiciones estrictas con una sonda que abarca una región de un gen de 25 Physcomitrella patens que es única para este organismo, se puede determinar si este organismo está presente.

Además, las moléculas de proteína y de ácido nucleico de la invención pueden servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no solamente en el mapeo del genoma, sino también en estudios funcionales de proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para 30 identificar la región del genoma a la cual se enlaza una proteína de enlazamiento de ADN de Physcomitrella patens, el genoma de Physcomitrella patens podría ser digerido, y los fragmentos incubados con la proteína de enlazamiento de ADN. Aquellos que enlazan la proteína pueden ser adicionalmente sondeados con las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con marcadores fácilmente detectables; el enlazamiento de tal molécula de ácido nucleico al fragmento de 35 genoma permite la localización del fragmento con el mapa del genoma de Physcomitrella patens, y, cuando se lleva a cabo múltiples veces con diferentes enzimas, facilita una rápida determinación de la secuencia de ácido nucleico con la cual se enlaza la proteína. Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente homólogas a las secuencias de especies relacionadas de tal manera que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un 40 mapa genómico en musgos relacionados.

Las moléculas de ácido nucleico para TFSRP de la invención son también útiles para estudios evolucionarios y estructurales de la proteína. Los procesos metabólicos y de transporte en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una amplia variedad de células procariotas y eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención 45 con aquellas que codifican enzimas similares de otros organismos, se puede evaluar la relación evolutiva de los organismos. En forma similar, tal comparación permite una evaluación de qué regiones de la secuencia son conservadas y cuáles no, lo que puede ayudar en la determinación de aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valiosa para estudios de modificación por ingeniería genética de la proteína y puede dar una indicación de lo que 5 puede tolerar la proteína en términos de mutagénesis sin pérdida de la función.

La manipulación de las moléculas de ácido nucleico para TFSRP de la invención puede resultar en la producción de las TFSRP que tienen diferencias funcionales con las TFSRP de tipo silvestre. Estas proteínas pueden ser mejoradas en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayor número de lo usual en la célula, o pueden tener menor eficiencia o actividad. Existen una cantidad de mecanismos por 10 medio de los cuales la alteración de una TFSRP de la invención puede afectar directamente la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de plantas que expresen las TFSRP, un mayor transporte puede conducir a una mejor repartición de la sal y /o del soluto dentro del tejido y los órganos de la planta. Ya sea por medio del incremento del número o de la actividad de las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas a partir de la célula, puede ser posible afectar la tolerancia a la sal de la 15 célula.

El efecto de la modificación genética en las plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la tolerancia al estrés puede ser evaluado por medio del crecimiento del microorganismo o de la planta modificados bajo condiciones no adecuadas y analizando luego las características de crecimiento y/o de metabolismo de la planta. Tales técnicas de análisis son bien conocidas por una persona capacitada 20 en el arte, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteínas, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de evapotranspiración, rendimiento general de la planta y/o del cultivo, floración, reproducción, colocación de las semillas, crecimiento de la raiz, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehmet aL, 1993 Biotechnology, vol.3, Capítulo III: Product recovery and purification, 25 páginas 469 - 714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. y colaboradores, 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F. y Cabral, J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A. y Henry, J. D., 1988 Biochemical separations, en: Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Capítulo 11, página 1 - 27, VCH: Weinheim y Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in 30 biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, los vectores de expresión de levadura que contienen los ácidos nucleicos divulgados aquí, o fragmentos de los mismos, pueden ser construidos y transformados en Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes pueden ser luego analizadas por la falla o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, salinidad, y temperatura. En forma similar, 35 los vectores de expresión de plantas que contienen los ácidos nucleicos divulgados aquí, o fragmentos de los mismos, pueden ser construidos y transformados en una célula vegetal apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos estándar. Las células y/o las plantas transgénicas resultantes derivadas de allí pueden ser luego analizadas por la falla o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, salinidad, y temperatura. 40

La modificación por ingeniería genética de uno o más genes para TFSRP de la invención puede resultar también en las TFSRP que tiene actividades alteradas que impactan indirectamente la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas, plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos como el C. glutamicum. Por ejemplo, el proceso bioquímico normal del metabolismo resulta en la producción de una variedad de productos (por ejemplo, peróxido de hidrógeno y otras especies reactivas oxigenadas) que 45 pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos (por ejemplo, se sabe que el peroxinitrito nitra las cadenas laterales de tirosina, inactivando por lo tanto algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J. T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226 - 235). Aunque estos productos son típicamente excretados, se pueden alterar genéticamente las células para transportar más productos que lo típico para una célula de tipo silvestre. Optimizando la actividad de una o más de las 5 TFSRP de la invención que están involucradas en la exportación de moléculas específicas, tal como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia al estrés de la célula.

Adicionalmente, las secuencias divulgadas aquí, o fragmentos de las mismas, pueden ser utilizadas para generar mutaciones desactivadas en los genomas de diferentes organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levadura, y células vegetales. (Girke. T., 1998 The Plant 10 Journal 15: 39 - 48). Las células desactivadas resultantes pueden ser luego evaluadas por su habilidad o capacidad para tolerar diferentes condiciones de estrés, su respuesta a diferentes condiciones de estrés, y el efecto sobre el fenotipo y/o genotipo de la mutación. Para otros métodos de inactivación génica se incluye la patente estadounidense No. 6.004.804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraju y colaboradores, 1999 Spliceosome-mediated ARN trans-splicing as a tool for gene therapy Nature 15 Biotechnology 17: 246 - 252.

Las estrategias de mutagénesis anteriormente mencionadas para las TFSRP que resultan en una mayor Resistencia al estrés no pretenden ser limitantes; las variaciones sobre estas estrategias serán evidentes para alguien capacitado en el arte. Utilizando tales estrategias, e incorporando los mecanismos divulgados aquí, se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico y de proteína de la invención para 20 generar algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum que expresan moléculas mutadas de proteína y de ácido nucleico para TFSRP de tal manera que se mejora la tolerancia al estrés.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con un polipéptido de TFSRP, o una porción de la misma, como la codificada por un ácido nucleico divulgado 25 aquí o como se describe aquí. Se pueden elaborar los anticuerpos por medio de muchos métodos conocidos (Ver, por ejemplo Harlow y Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). En resumen, se puede inyectar antígeno purificado en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden ser purificados directamente, o se pueden obtener las células del bazo del animal. Las 30 células pueden ser fusionadas luego con una línea de células inmortales y seleccionadas por la secreción de anticuerpo. Se pueden utilizar los anticuerpos para seleccionar bibliotecas de clones de ácido nucleico para células que secretan el antígeno. Se pueden secuenciar luego esos clones positivos. (Ver, por ejemplo, Kelly y colaboradores, 1992 Bio/Technology 10: 163 - 167; Bebbington y colaboradores, 1992 Bio/Technology 10: 169 - 175). 35

Las frases "se enlaza selectivamente" y "se enlaza específicamente" con el polipéptido se refiere a una reacción de enlazamiento que es determinativa de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros biológicos. Por lo tanto, bajo las condiciones señaladas del inmunoensayo, los anticuerpos especificados enlazados a una proteína particular no se enlazan en una cantidad significativa con otras proteínas presentes en la muestra. El enlazamiento selectivo con un 40 anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir de un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Se pueden utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se enlazan selectivamente con una proteína particular. Por ejemplo, inmunoensayos ELISA en fase sólida son rutinariamente utilizados para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunoreactivos con una proteína. Ver Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory 45 Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y de las condiciones que podrían ser utilizadas para determinar el enlazamiento selectivo.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diferentes huéspedes. Una descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales puede encontrarse en Stites y colaboradores, editors, "Basic and Clinical Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 5 Fourth Edition) y las referencias citadas allí, y en Harlow y Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988).

A través de esta solicitud se referencian diferentes publicaciones. Las divulgaciones de todas estas publicaciones y aquellas referencias citadas en esas publicaciones en su totalidad son incorporadas aquí como referencia en esta solicitud con el propósito de describir más completamente el estado del arte 10 al cual pertenece esta invención.

Debe entenderse también que lo anterior se relaciona con modalidades preferidas de la presente invención y que pueden hacerse numerosos cambios allí sin apartarse del alcance de la invención. Se ilustra adicionalmente la invención por medio de los siguientes ejemplos, que no pretenden constituirse de ninguna manera como limitaciones impositivas del alcance de la misma. Por el contrario, debe 15 entenderse claramente que puede recurrirse a diferentes otras modalidades, modificaciones, y equivalentes de la misma, las cuales, después de leer la descripción aquí, pueden sugerirse por sí mismas a aquellos capacitados en el arte sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o del alcance de las reivindicaciones anexas. Adicionalmente, todas las referencias citadas aquí se incorporan expresamente aquí como referencia. 20

EJEMPLOS

A continuación, todos los ejemplos para CABF-1, DBF-1, CBF-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2 son ejemplos comparativos. En particular los clones de CABF-1, DBF-1, CBF-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2 en la tabla 1 y las construcciones que incluyen CABF-1, DBF-1, CBF-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2 en la tabla 10 25 son ejemplos comparativos.

Los ejemplos para HDZ-1 son los ejemplos de acuerdo con la invención.

Ejemplo 1

Crecimiento de cultivos de Physcvmitrella patens 30

Para este estudio, se utilizaron plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. de la colección de la sección de estudios genéticos de la University of Hamburg. Se originaron de la cepa 16/14 recolectada por H. L. K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fueron subcultivadas a partir de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 45 55: 438 - 446). La proliferación de las plantas se llevó a cabo por medio de esporas y por medio de regeneración de los gametofitos. El 35 protonema se desarrolló a partir de la espora haploide como un cloronema rico en cloroplastos y un caulonema bajo en cloroplastos, sobre los cuales se formaron brotes aproximadamente después de 12 días. Ellos crecieron para producir gametóforos que portan antéridios y arqueogonios. Después de la fertilización, resultaron el esporofito diploide con una seta corta y la cápsula de la espora, en los cuales maduraron las meioesporas. 40

Se llevó a cabo el cultivo en una cámara climática a temperatura ambiente de 25˚C y una intensidad de luz de 55 micromols-1m2 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL de 65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo fue o bien modificado en cultivo líquido utilizando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165: 354 - 358) o cultivado sobre medio sólido de Knop utilizando agar óxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas utilizados para el 45 aislamiento de ARN y ADN fueron cultivados en cultivos líquidos aireados. Los protonemas fueron triturados cada 9 días y transferidos a medio de cultivo fresco.

Ejemplo 2

Aislamiento de ADN total de plantas 5

Los detalles para el aislamiento de ADN total se relacionan con la elaboración de un gramo de peso fresco de material vegetal. Los materiales utilizados incluyen los siguientes amortiguadores: amortiguador CTAB de bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio al 2% (p/v) (CTAB); Tris HCl 100 mM pH 8.0; NaCl 1.4 M; EDTA 20 mM; amortiguador de N-Laurilsarcosina: N-laurilsarcosina al 10% (p/v); Tris HCl 100 mM pH 8.0; EDTA 20 mM. 10

Se trituró el material de la planta bajo nitrógeno líquido en un mortero para producir un polvo fino y se lo transfirió a recipientes Eppendorf de 2 ml. El material congelado de la planta fue luego convertido con una capa de 1 ml de amortiguador de descomposición (1 ml de amortiguador CTAB, 100 μl de amortiguador N-laurilsarcosina, 20 μl de β-mercaptoetanol y 10 μl de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60˚C durante una hora con agitación continua. Se distribuyó el homogenato 15 obtenido en dos recipientes Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por medio de agitación con el mismo volumen de cloroformo/isoamil alcohol (24:1). Para la fase de separación, se llevó a cabo una centrifugación a 8000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. Se precipitó luego el ADN a -70˚C durante 30 min utilizando isopropanol enfriado con hielo. Se sedimentó el ADN precipitado a 4˚C y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 μl de amortiguador TE (Sambrook y 20 colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación adicional, se trató el ADN con NaCl (concentración final 1.2 M) y se precipitó nuevamente a -70˚C durante 30 minutos utilizando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de una etapa de lavado con etanol al 70%, se secó el ADN y posteriormente se lo recogió en 50 μl de H2O + ARNasa (concentración final de 50 mg/ml). Se disolvió el ADN durante la noche a 4˚C y posteriormente se llevó a 25 cabo la digestión con ARNasa a 37˚C durante 1 hora. El almacenamiento del ADN se hizo a 4˚C.

Ejemplo 3

Aislamiento de ARN total y poli-(A)+ ARN y construcción de una biblioteca de ADNc de Physcomitrella patens 30

Para la investigación de los transcriptos, se aislaron tanto ARN total como poli-(A)+ARN. Se obtuvo ARN total de protonemas de tipo silvestre de 9 días siguiendo el método GTC (Reski y colaboradores, 1994 MoL Gen. Genet. 244: 352 - 359). Se aisló el Poli(A)+ARN utilizando Dyna Beada® (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. Después de la determinación e la concentración del ARN o del poli(A)+ ARN, se precipitó el ARN por medio de la 35 adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M pH 4.6 y 2 volúmenes de etanol y se almacenó a -70˚C.

Para la construcción de la biblioteca de ADNc, se logró la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa del Virus de Leucemia de Múrido (Roche, Mannheim, Alemania) e iniciadores de oligo-d(T), la síntesis de la segunda cadena por medio de incubación con ADN polimerasa 40 I, enzima Klenow y digestión con ARNasaH a 12˚C (2 horas), 16˚C (1 hora) y 22˚C (1 hora). Se detuvo la reacción por medio de incubación a 65˚C (10 minutos) y posteriormente se transfirió sobre hielo. Se volvieron romas las moléculas de ADN bicatenarias por medio de T4-ADN-polimerasa (Roche, Mannheim) a 37˚C (30 minutos). Se removieron los nucleótidos por medio de extracción con fenol/cloroformo y columnas Spin de Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, 45 Alemania) a los extremos del ADNc por medio de T4-ADN-ligasa (Roche, 12˚C, durante la noche) y se fosforiló por medio de incubación con polinucleótido quinasa (Roche, 37˚C, 30 minutos). Se sometió esta mezcla a separación sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión. Se eluyeron las moléculas de ADN mayores a 300 pares de bases del gel, se extrajo con fenol, se concentró sobre columnas Elutip-D (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania) y se las ligó a los brazos del vector y empacó en fagos lambda 5 ZAPII o en fagos lambda ZAPExpress utilizando el Kit Gigapack Gold (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) utilizando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4

Secuenciación y función de anotación de las EST de Physcomitrella patens 10

Se utilizaron bibliotecas de ADNc como se describe en el Ejemplo 2 para secuenciación del ADN de acuerdo con métodos estándar, y en particular, por medio del método de terminación de la cadena utilizando el Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction de ABI PRISM (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). Se llevó a cabo una Secuenciación Aleatoria después de la recuperación preparativa del plásmido a partir de bibliotecas de ADNc a través de excisión de masa in vivo, nueva 15 transformación, y posterior siembra en placa de DH10B sobre placas de agar (detalles del material y el protocolo de Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos. Se preparó ADN del plásmido a partir de cultivos de E. coli que crecieron durante la noche cultivados en medio de caldo de Luria que contiene ampicilina (ver Sambrook y colaboradores 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de ADN de Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se 20 utilizaron iniciadores de secuenciación con las siguientes secuencias de nucleótidos:

5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’ SEQ ID NO: 24

5’-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3’ SEQ ID NO: 25

5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ SEQ ID NO: 26

Se procesaron las secuencias y se anotó utilizando el paquete de software EST-MAX 25 suministrado comercialmente por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos importantes para caracterización funcional y estructural de secuencias de protein. Para referencia, visitar el sitio web en pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance; Pearson W. R., 1990 Rapid and sensitive sequence comparison with 30 FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183: 63 - 98; BLAST: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., y Lipman D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403 - 10; PREDATOR: High-accuracy secondary structure prediction from single and multiple sequences. Frishman, D. y Argos, P., 1997 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27: 329 35 - 335; CLUSTALW: Multiple sequence alignment. Thompson, J. D., Higgins, D. G. y Gibson, T. J. (1994); CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673 - 4680; TMAP: Transmembrane region prediction from multiply aligned sequences. Persson, B. y Argos, P., 1994 Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence 40 alignments. J. Mol. Biol. 237: 182 - 192; ALOM2: Transmembrane region prediction from single sequences. Klein, P., Kanehisa, M., and DeLisi, C., 1984 Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787: 221 - 226. Versión 2 por el Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Detection of PROSITE protein sequence patterns. Kolakowski L. F, Jr., Leunissen J. A. M., Smith J. E., 1992 ProSearch: fast searching of protein sequences with regular 45 expresión patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13: 919 - 921; BLIMPS: Similarity searches against a database of ungapped blocks. J. C. Wallace and Henikoff S., 1992; PATMAT: A searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8: 249 - 254. Escrito por Bill Alford.

5

Ejemplo 5

Identificación del ORF de Physcomitrella patens correspondiente a CABF-1, DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2

Se identificaron los ADNc parciales de Physcomitrella patens (las EST) mostrados en la Tabla 1 más abajo en el programa de secuenciación de EST de Physcomitrella patens utilizando el 10 programa EST-MAX a través de análisis BLAST. (Las Tablas 2 - 8 muestran algunos de estos resultados). Los Números de Identificación de Secuencia correspondientes a estas EST son los siguientes: CABF-1 (SEQ ID NO: 1), DBF-1 (SEQ ID NO: 2), CBF-1 (SEQ ID NO: 3), HDZ-1 (SEQ ID NO: 4), ZF-1 (SEQ ID NO: 5), LZ-1 (SEQ ID NO: 6) y CABF-2 (SEQ ID NO: 7). Estos clones particulares fueron escogidos para análisis adicionales ya que ellos codifican para factores de transcripción. 15

Tabla 1

Categoría Funcional: Función Putativa Código de Secuencia Posición del ORF Nombre

Factor de Transcripción: proteína de enlazamiento de ADN s_pp001031077f 1-515 DBF-1

: factor de transcripción, enlazamiento de CCAAT, cadena A c_pp004053131r 500-1 CABF-1

: factor de transcripción s_pp004052093r 2-508 CABF-2

: proteína con dedo de zinc c_pp001074039r 1154-447 ZF-1

: proteína del homeodominio/cierre de leucina c_pp001058012r 364-750 HDZ-1

: proteína de enlazamiento de ADN VBP1 s_pp013006061r 1-371 LZ-1

: activador transcripcional CBF1 c_pp004032055r 183-998 CBF-1

Tabla 2

Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpHDZ-1 y de otras proteínas homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalización por hueco: 10; penalización por extensión del hueco: 0.1; matriz de puntuación: blosum62)

Swiss-Prot#: Q9LS31 Q9LS33 Q43529 Q9XH37 Q9SP47

Nombre de la Proteína: Caja homeótica de la proteína PPHB7 Caja homeótica de la proteína PPHB5 Caja homeótica Proteína con homeodominio/cierre de leucina Proteína 57 con homeodominio/ cierre de leucina

Especie: Physcomitrella patens (Musgo) Physcomitrella patens (Musgo) Lycopersicon esculentum (Tomate) Oryza sativa (Arroz) Glycine max (Soja)

% de Identidad: 71% 38% 30% 29% 30%

20

(continuación)

Swiss-Prot#: Q9LS31 Q9LS33 Q43529 Q9XH37 Q9SP47

% de Similitud: 72% 51% 40% 39% 36%

Tabla 3

Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpZF-1 y de otras proteínas homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalización por hueco: 10; penalización por extensión del hueco: 0.1; matriz de puntuación: blosum62)

Swiss-Prot#: Q9SK53 Q9ZTK7 Q9ZTK8 Q9XE47 082431

Nombre de la Proteína: Proteína con dedo de zinc de la caja B tipo Constans Proteína 2 tipo Constans Proteína 1 tipo Constans Proteína con dedo de zinc Proteína 1 tipo Constans

Especies: Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Malusdomestica (Manzana) (Manzano silvestre) Pinus radiata (Pino de Monterrey) Raphanus sativus (Rábano)

Identidad %: 40% 43% 42% 39% 41%

Similitud %: 50% 54% 54% 49% 53%

Tabla 4

Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpCABF-1 y de otras proteínas homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalización por hueco: 10; penalización por extensión del hueco: 0.1; matriz de puntuación: blosum62)

Swiss-Prot#: Q9ZQC3 O23310 P25209 Q9LFI3 O23633

Nombre de la Proteína: Factor de transcripción putativo de enlazamiento de CCAAT Subunidad A del factor de transcripción de enlazamiento de CCAAT Subunidad A del factor de transcripción de enlazamiento de CCAAT Factor de transcripción NF-Y, proteína tipo enlazamiento de CCAAT Factor de transcripción

Especies: Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Zea mays (Maíz) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón)

% de Identidad: 47% 53% 49% 41% 46%

(continuación)

Swiss-Prot#: Q9ZQC3 O23310 P25209 Q9LFI3 O23633

% de Similitud: 58% 56% 57% 53% 52%

Tabla 5

Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpDBF-1 y de otras proteínas homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalización por hueco: 10; penalización por extensión del hueco: 0.1; matriz de puntuación: blosum62)

Swiss-Prot#: Q9ZUL5 045609 Q9NPU9

Nombre de la Proteína: Proteína putativa de enlazamiento de ADN Proteína M03C11.8 Proteína hipotética 68.6 KDA

Especie: Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Caenorhabditis elegans Homo sapiens (Humano)

% de Identidad: 47% 24% 25%

% de Similitud: 58% 35% 37%

Tabla 6

Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpCABF-2 y de otras proteínas homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalización por hueco: 10; penalización por extensión del hueco: 0.1; matriz de puntuación: blosum62)

Swiss-Prot#: O23636 Q9SNZ0 Q9SMP0 Q92869 O35088

Nombre de la Proteína: Factor de transcripción Proteína hemoactivada Factor de transcripción HAPSA Subunidad NF-YC del factor de transcripción Factor nuclear YC

Especies: Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Homo sapiens (Humano) Mus musculus (Ratón)

% de Identidad: 54% 40% 42% 26% 25%

% de Similitud: 62% 49% 49% 31% 30%

5

10

Tabla 7

Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpLZ-1 y otras proteínas homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalización por hueco: 10; penalización por extensión del hueco: 0.1; matriz de puntuación: blosum62)

Swiss-Prot#: Q9SQK1 P43273 O24160 Q06979 Q41558

Nombre de la Proteína: Factor de transcripción ZIP Factor de transcripción HBP-1B Transcripción del Cierre de Leucina Factor de enlazamiento 3.2 del elemento OCS Factor de transcripción HBP-IB (C1)

Especies: Nicotiana tabacum (Tabaco común) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Nicotiana TGA2.1 tabacum (Tabaco común) Zea mays (Maíz) Triticum aestivum (Trigo)

% de Identidad: 62% 73% 46% 46% 45%

% de Similitud: 74% 61% 55% 53% 53%

Tabla 8

Grado de identidad y similitud de aminoácidos de PpCBF-1 y otras proteínas homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalización por hueco: 10; penalización por extensión del hueco: 0.1; matriz de puntuación: blosum62)

Swiss-Prot# ó Genbank #: Q9M210 BAA33435 Q9LU18 Q9ZQP3 Q9SUKS

Nombre de la Proteína: Proteína tipo factor de transcripción DRHB1B Proteína tipo factor de transcripción TINY Proteína putativa TINY Proteína tipo TINY del dominio de Apetala2

Especies: Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón) Arabidopsis thaliana (Berro oreja de ratón)

% de Identidad: 22% 21% 21% 20% 20%

% de Similitud: 35% 32% 32% 30% 27%

Ejemplo 6

Clonación del ADNc de longitud completa de Physcomitrella patens que codifica para CABF-1, DBF-1, 5 CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1, CABF-2

Para aislar CABF-1 de longitud completa (SEQ ID NO: 8), CABF-2 (SEQ ID NO: 14), CBF-1 (SEQ ID NO: 10), se llevó a cabo una PCR como se describe más adelante bajo el título "Amplificación de Longitud Completa" utilizando los EST originales descritos en el Ejemplo 4 como molde ya que eran de longitud completa (ver Tabla 9 para los iniciadores). 10

Tabla 9

Esquema e iniciadores utilizados para la clonación de clones de longitud completa

Gen: Sitios finales en el producto Método de Aislamiento Iniciadores Race Iniciador para RT-PCR

DBF-1: XmaI/HpaI 5’RACE y RT-PCR para un clon de longitud completa

CABF-2: XmaI/SacI PCR de un clon BST original

LZ-1: Hpal/EcoRV 5’RACE y RT-PCR para un clon de longitud completa

CBF-1: XmaI/HpaI PCR del clon EST original

(continuación)

HDZ-1: XmaI/HpaI 5’RACE y RT-PCR para un clon de longitu completa

ZF-1: XmaI/SacI 5’ RACE y RT-PCR para un clon de longitud completa

CABF-1: XmaI/SacI PCR de un clon EST original

Para aislar los clones que codifican para DBF-1 (SEO ID NO: 9), HDZ-1 (SEQ ID NO: 11), ZF-1 (SEQ ID NO: 12) y LZ-1 (SEQ ID NO: 13) de Physcomitrella patens, se crearon bibliotecas de ADNc con un el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó como molde el ARN total aislado descrito en el Ejemplo 2. Se 5 trataron los cultivos antes del aislamiento de ARN de la siguiente manera: Estrés por Salinidad: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio suplementado con NaCl 1 M; Estrés por Frío: 4˚C para los mismos intervalos de tiempo que para la salinidad; Estrés por Sequía: se incubaron los cultivos sobre papel de filtro seco para los mismos intervalos de tiempo anteriores. Se extrajo luego el ARN y se lo utilizó para aislamiento.

Protocolo 5’ RACE 10

Las secuencias EST DBF-1 (SEQ ID NO: 2), HDZ-1 (SEQ ID NO: 4), ZF-1 (SEQ ID NO: 5) y LZ-1 (SEQ ID NO: 6) identificadas a partir de la búsqueda en la base de datos como se describe en el Ejemplo 4 fueron utilizadas para diseñar oligos para RACE (ver Tabla 9). Se obtuvieron secuencias extendidas para estos genes por medio de la realización de una Amplificación Rápida por reacción en cadena de la polimerasa de los Extremos del ADNc (RACE PCR) utilizando el kit de PCR Advantage 2 5 (Clontech Laboratories) y el kit de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories) utilizando un Termociclador T3 de Biometra de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las secuencias obtenidas a partir de las reacciones RACE correspondieron a las regiones de codificación de longitud completa de HDZ-1, ZF-1 y LZ-1 y fueron utilizadas para diseñar oligos para clonación de longitud completa de los genes respectivos (ver más abajo la amplificación de longitud completa). El 10 producto RACE de DBF-1 no fue de longitud completa y se requirió de una nueva reacción RACE (ver la Tabla 9 para iniciadores).

Amplificación de Longitud Completa

Se obtuvieron los clones de longitud completa correspondientes a CABF-1 (SEQ I D NO: 8), CBF-1 (SEQ ID NO: 10) y CABF-2 (SEQ ID NO: 14) llevando a cabo la reacción en cadena de la 15 polimerasa (PCR) con iniciadores específicos para el gen (ver la Tabla 9) y el EST original como molde. Las condiciones para la reacción fueron condiciones estándar con PWO ADN polimerasa (Roche). Se llevó a cabo la PCR de acuerdo con condiciones estándar y con los protocolos del fabricante (Sambrook y colaboradores, 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y., Termociclador T3 de Biometra). Los parámetros para la 20 reacción fueron: cinco minutos a 94˚C seguido por cinco ciclos de un minuto a 94˚C, un minuto a 50˚C y 1.5 minutos a 72˚C. Esto fue seguido por veinticinco ciclos de un minuto a 94˚C, un minuto a 65˚C y 1.5 minutos a 72˚C.

Se aislaron los clones de longitud completa correspondientes a los genes DBF-1 (SEO ID NO: 9), HDZ-1 (SEQ ID NO: 11), ZF-1 (SEO ID NO: 12) y LZ-1 (SEO ID NO: 13) repitiendo el método 25 RACE pero utilizando los iniciadores específicos del gen como se presenta en la Tabla 9.

Se extrajeron los fragmentos amplificados del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel OIAquick (Qiagen) y se los ligó en el vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transformaron vectores recombinantes en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar (Sambrook y colaboradores 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd 30 Sedition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Se seleccionaron la células transformadas sobre agar LB que contiene 100 μg/ml de carbenicilina, 0.8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido) y 0.8 mg de IPTG (isopropiltio-β-D-galactósido) que crecieron durante la noche a 37˚C. Se seleccionaron las colonias blancas y se las utilizó para inocular 3 ml de LB líquido que contiene 100 μg/ml de ampicilina y que crecieron durante la noche a 37˚C. Se extrajo el ADN del 35 plásmido utilizando el Kit OIAprep Spin Miniprep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Analyses of subsequent clones and restriction mapping was performed according to standard molecular biology techniques (Sambrook y colaboradores, 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.).

Ejemplo 7 40

Modificación por medio de ingeniería genética de plantas de Arabidopsis tolerantes al estrés por sobreexpresión de los genes CABF-1, DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2

Construcción del vector binario: pGMSG

Se digirió el vectorpLMNC53 (Mankin, 2000, tesis de Doctorado) con Hindlll (Roche) y se rellenó el extremo redondeado con enzima Klenow y dNTPs 0.1 mM (Roche) de acuerdo con las 45 instrucciones del fabricante. Se extrajo este fragmento del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se digirió luego el fragmento purificado con EcoRI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se extrajo este fragmento del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento resultante de 1.4 kilobases, el casete de gentamicina, incluía al promotor nos, 5 al gen aacCI y al terminador g7.

Se digirió el vector pBIueScript con EcoRI y SmaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se extrajo el fragmento resultante del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel OIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se ligaron el vector digerido pBlueScript y fragmentos del casete de gentamicina con T4 ADN Ligasa (Roche) de acuerdo con las 10 instrucciones del fabricante, uniendo los dos sitios EcoRI respectivos y uniendo el sitio HindIII de extremo redondeado con el sitio Smal.

Se transformó el vector recombinante (pGMBS) en células Top 10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar. Se seleccionaron las células transformadas sobre agar LB que contiene 100 μg/ml de carbenicilina, 0.8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido) y 0.8 mg de IPTG 15 (isopropiltio-β-D-galactósido), cultivadas durante la noche a 37˚C. Se seleccionaron las colonias blancas y se las utilizó para inocular 3 ml de LB líquido que contiene 100 μg/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37˚C. Se extrajo el ADN del plásmido utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis de los clones posteriores y el mapeo de restricción fueron llevados a cabo de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook y 20 colaboradores 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.).

Tanto el vector pGMBS como el vector p1 bxSuperGUS fueron digeridos con XbaI y KpnI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, cortando el casete de gentamicina de pGMBS y produciendo la columna vertebral del vector p1bxSuperGUS. Se extrajeron los fragmentos resultantes del 25 gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se ligaron estos dos fragmentos con T4 ADN ligasa (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se transformó el vector recombinante resultante (pGMSG) en células Top 10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar. Se seleccionaron las células transformadas sobre agar LB que contiene 30 100 μg/ml de carbenicilina, 0.8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido) y 0.8 mg de IPTG (isopropiltio-β-D-galactósido) y cultivadas durante la noche a 37˚C. Se seleccionaron las colonias blancas y se las utilizó para inocular 3 ml de LB líquido que contiene 100 μg/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37˚C. Se extrajo el ADN del plásmido utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis de los clones posteriores y el mapeo 35 de restricción fueron llevados a cabo de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook y colaboradores, 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY).

Subclonación de CABF-1. DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2 en el vector binario

Se subclonaron los fragmentos que contienen los diferentes factores de transcripción de 40 Physcomitrella patens a partir de los vectores recombinantes PCR2.1 TOPO por medio de digestión doble con enzimas de restricción (ver la Tabla 10) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cortó el siguiente fragmento del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante se lo ligó dentro del vector binario pGMSG, escindido con las enzima apropiadas (ver la Tabla 10) y se desfosforiló antes de la ligación. El vector recombinante resultante 45 pGMSG contenía el factor de transcripción correspondiente en la orientación sentido bajo el control del súper promotor constitutivo.

Tabla 10

Nombres de las diferentes construcciones de los factores de transcripción de Physcomitrella patens utilizadas para transformación de la planta

Gen: Enzimas utilizadas para generar un fragmento del gen Enzimas utilizadas para restringir pGMSG Construcción del Vector Binario

CABF-1: XmaI/SacI XmaI/SacI pBPSSH003

DBF-1: XmaI/HpaI XmaI/Ec1136 pBPSLVM009

CBF-1: XmaI/HpaI XmaI/Ec1136 pBPSSH002

HDZ-1: XmaI/HpaI XmaI/Ec1136 pBPSLVM007

ZF-1: XmaI/SacI XmaI/SacI pBPSLVM008

LZ-1: HpaI/EcoRV Ec1136 pBPSLVM012

CABF-2: XmaI/SacI XmaI/SacI pBPSM1003

Transformación de Agrobacterium

Se transformaron los vectores recombinantes en Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de 5 acuerdo con condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

Transformación de la Planta

Se cultivaron y transformaron Arabidopsis thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar (Bechtold, 1993 Acad. Sci. Paris. 316:1194-1199; Bent y colaboradores, 1994 Science 265: 1856 - 1860). 10

Selección de Plantas Transformadas

Se esterilizaron semillas T1 de acuerdo con protocolos estándar (Xiong y colaboradores 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159 - 170). Se sembraron en placa las semillas sobre agar al 0.6% en ½ MS suplementado con sacarosa al 1%, 150 μg/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich) y 2 μg/ml de benomilo (Sigma-Aldrich). Se vernalizaron las semillas sobre placas durante cuatro días a 4˚C. Se 15 germinaron las semillas en una cámara climática a temperatura ambiente de 22˚C y una intensidad de luz de 40 micmmols-1m2 (luz blanca; tubo de fluorescencia Philips TL 65W/25) y un ciclo de duración del día de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Se seleccionaron las plantas transformadas después de 14 días y se las transfirió a placas de agar al 0.6% en ½ MS suplementadas con sacarosa al 1% y se les permitió recuperarse durante cinco-siete días. 20

Selección por Tolerancia a la Sequía

Se transfirieron plántulas T1 a papel filtro estearil seco en una caja de Petri y se les permitió desecarse durante dos horas con una RH del 80% (humedad relativa) en una Cabina de Crecimiento Sanyo MLR-350H, micromols-1m2 (luz blanca; tubo de fluorescencia Philips TL 65W/25). Se disminuyó luego la RH al 60% y se desecaron las plántulas adicionalmente durante ocho horas. Se removieron luego 25 la plántulas y se las colocó sobre placas de agar al 0.6% en ½ MS suplementadas con 2 μg/ml de benomilo y se calificó después de cinco días.

Los resultados de la selección de la tolerancia a la sequía en plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan la TFSRP son mostrados en la Tabla 11. Cabe señalar que estos análisis se realizaron con plantas T1 ya que los resultados deberían ser mejores cuando se encuentra un expresador homocigoto 30 fuerte.

Tabla 11

Resumen de los ensayos de estrés por sequía

Nombre del Gen: Ensayo de Estrés por Sequía

: Número de sobrevivientes Número total de plantas Porcentaje de sobrevivientes

HDZ-1: 7 14 50%

ZF-1: 25 45 53%

CABF-1: 8 9 89%

DBF-1: 4 5 80%

CABF-2: 3 6 50%

LZ-1: 11 14 79%

CBF-1: 9 9 100%

Control: 18 84 21%

Selección por Tolerancia a la Salinidad

Se transfirieron plántulas a papel filtro remojado en ½ MS y se las colocó en agar al 0.6% en ½ MS suplementado con 2 μg/ml de benomilo la noche anterior a la selección por tolerancia a la salinidad. Para la selección por tolerancia a la salinidad, se movió el papel filtro con las plántulas a arrumes de papel 5 filtro estéril, remojadas en NaCl 50 mM, en una caja de Petri. Después de dos horas, se removió el papel filtro con las plántulas a arrumes de papel filtro estéril, se remojó con NaCl 200 mM, en una caja de Petri. Después de dos horas, se removió el papel filtro con las plántulas a arrumes de papel filtro estéril, se remojó en NaCl 600 mM, en una caja de Petri. Después de 10 horas, se movieron las plántulas a cajas de Petri que contienen agar al 0.6% en ½ MS suplementado con 2 μg/ml de benomilo. Se calificaron las 10 plántulas después de 5 días.

Los resultados de la selección por tolerancia a la sal en plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan las TFSRP se muestran en la Tabla 12. En particular, las plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan ZF-1 mostraron una tasa de supervivencia del 52% (12 sobrevivientes de 23 plantas estresadas); LZ-1, 48% (10 sobrevivientes de 21 plantas estresadas); CABF-2, 56% (5 sobrevivientes de 9 15 plantas estresadas); mientras que el control no transformado una tasa de supervivencia del 9% (2 sobrevivientes de 23 plantas analizadas). Cabe señalar que estos análisis fueron realizados con plantas T1, y por lo tanto, los resultados deben ser mejores cuando se encuentra un expresador homocigoto fuerte.

Tabla 12

Resumen de los ensayos de estrés por sequía

Nombre del Gen: Ensayo de Estrés por Sequía

ZF-1: 12 23 52%

CABF-2: 5 9 56%

LZ-1: 10 21 48%

Control: 2 23 9%

Selección por Tolerancia a la Congelación 20

Se movieron las plántulas a cajas de Petri que contienen agar al 0.6% en ½ MS suplementado con sacarosa al 2% y 2 μg/ml de benomilo. Después de cuatro días, se incubaron las plántulas a 4˚C durante 1 hora y luego se las cubrió con hielo raspado. Se colocaron luego las plántulas en una Cámara Ambiental Specialist ES2000 y se incubó durante 3.5 horas comenzando en -1.0˚C y disminuyendo -1˚C por hora. Se incubaron luego las plántulas a -5.0˚C durante 24 horas y luego se permitió que se descongelaran a 5˚C durante 12 horas. Se retiró el agua y se calificaron las plántulas después de 5 días. Se seleccionan luego las plantas transgénicas por su tolerancia mejorada al frío demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al frío.

Ejemplo 8 5

Detección de los transgenes CABF-1, DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1, y CABF-2 en las líneas transgénicas de Arabidopsis

Se homogenizó una hoja de una planta transgénica y de tipo silvestre de Arabidopsis en 250 μl de amortiguador de bromuro de Hexadeciltrimetil amonio (CTAB) (CTAB al 2%, NaCl 1.4 M, EDTA 8 mM y Tris 20 mM pH 8.0) y 1 μl de β-mercaptoetanol. Se incubaron las muestras a 60 - 65˚C durante 30 10 minutos y se añadieron luego 250 μl de Cloroformo a cada muestra. Las muestras fueron sometidas a agitación tipo vórtice durante 3 minutos y se centrifugó durante 5 minutos a 18.000 x g. Se tomó el sobrenadante de cada muestra y se añadieron 150 μl de isopropanol. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos, y se centrifugó durante 10 minutos a 18.000 x g. Se lavó cada precipitado con etanol al 70%, se secó, y resuspendió en 20 μl de TE. Se utilizaron 4 μl de la suspensión 15 en un volumen de reacción PCR de 20 μl utilizando Taq ADN polimerasa (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó un plásmido vector binario que contiene cada gen para TFSRP como control positivo, y se utilizó el ADN genómico C24 de tipo silvestre como control negativo en las reacciones PCR. Se analizaron 10 μl de la reacción PCR sobre agarosa al 0.8% - gel de bromuro de etidio. 20

Los iniciadores y los tiempos de reacción utilizados para amplificación de cada gen para TFSRP se presentan más abajo. Notablemente, se amplificaron exitosamente los transgenes a partir de las líneas transgénicas T1, pero no a partir de la C24 de tipo silvestre. Este resultado indica que las plantas transgénicas T1 contienen al menos una copia de los transgenes. No hubo indicación de la existencia ya sea de genes idénticos o muy similares en el control no transformado de Arabidopsis thaliana que podría 25 ser amplificado por este método.

CABF-1

Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5’GAATAGATACGCTGACACGC3’ SEQ ID NO: 46

5’ATGAGCTCACTCITACACTCCGCGOGGTTGGTT3’ SEQ ID NO: 47 30

El programa PCR fue: 1 ciclo de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 75˚C y 3 minutos a 72˚C seguido por 14 ciclos del mismo ciclo excepto por que la temperatura de hibridación disminuyó 1˚C cada ciclo hasta 62˚C; y luego 16 ciclos de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 62˚C y 3 minutos a 72˚C. Se generó un fragmento de 600 pares de bases a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

HDZ-1 35

Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5’GAATAGATACGCTGACACGC3’ SEQ ID NO: 46

5’GCGTTAACGCCGATGGTGCAACTTTGGTTGAC3’ SEQ ID NO: 48

El programa PCR era el siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 62˚C y 4 minutos a 72˚C, seguido por 10 minutos a 72˚C. Se produjo un fragmento de 1.3 kb a partir del control positivo y las 40 plantas transgénicas.

ZF-1

Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5’GAATAGATACGCTGACACGC3’ SEQ ID NO: 46

5’GCGAGCTCGACCTTGCTCGATGGAGACTCCAAT3’ SEQ ID NO: 49 45

El programa PCR era el siguiente: 1 ciclo de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 75˚C y 3 minutos a 72˚C, seguido por 14 ciclos del mismo ciclo excepto por que la temperatura de hibridación disminuyó 1 ˚C cada ciclo hasta 62˚C; y luego 16 ciclos de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 62˚C y 3 minutos a 72˚C. Se generó un fragmento de 1.3 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas T1.

CBF-1 5

Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5’GAATAGATACGCTGACACGC3’ SEQ ID NO: 46

5’GCGTTAACGACTCACTGAGAGTCATAATGGTG3’ SEQ ID NO: 50

El programa PCR era el siguiente: 1 ciclo de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 75˚C y 3 minutos a 72˚C, seguido por 14 ciclos del mismo ciclo excepto por que la temperatura de hibridación disminuyó 1˚C cada 10 ciclo hasta 62˚C; y luego 16 ciclos de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 62˚C y 3 minutos a 72˚C. Se generó un fragmento de 1.1 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas T1.

DBF-1

Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5’CTAGTAACATAGATGACACC3’ SEQ ID NO: 51 15

5’ATCCCGGGCGATGGTGCGTTCGAGATCGTAAGG3’ SEQ ID NO: 52

El programa PCR era el siguiente. 30 ciclos de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 62˚C y 4 minutos a 72˚C, seguido por 10 minutos a 72˚C. Se produjo un fragmento de 2.9 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

CABF-2 20

Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5’GAATAGATACGCTGACACGC3’ SEQ ID NO: 53

5’CTGAGCTCTAATGCATTCACTGTTGCTGCTGCT3’ SEQ ID NO: 54

El programa PCR era el siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 62˚C y 4 minutos a 72˚C, seguido por 10 minutos a 72˚C. Se produjo un fragmento de 800 pb a partir del control positivo y las 25 plantas transgénicas.

LZ-1

Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

5’GAATAGATACGCTGACACGC3’ SEQ ID NO: 53

5’GCGATATCGCTTCCATACCTGCGCCGAAGACTT3’ SEQ ID NO: 55 30

El programa PCR era el siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94˚C, 1 minuto a 62˚C y 4 minutos a 72˚C, seguido por 10 minutos a 72˚C. Se produjo un fragmento de 1.8 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

Ejemplo 9

Detección del ARNm de los transgenes CABF-1, DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1, y CABF-2 en líneas 35 transgénicas de Arabidopsis

Se detectó la expresión utilizando RT-PCR. Se aisló el ARN total de plantas tratadas por estrés utilizando un procedimiento adaptado de (Verwoerd y colaboradores, 1989 NAR 17: 2362). Se recolectaron muestras de hojas (50 - 100 mg) y se las molió hasta un polvo fino en nitrógeno líquido. Se resuspendió el tejido molido en 500 μl de una mezcla 1:1 a 80˚C de fenol con amortiguador de extracción 40 (LiCl 100 mM, Tris 100 mM pH8, EDTA 10 mM, SDS al 1%), seguido por una agitación breve tipo vórtice para mezclar. Después de la adición de 250 μl de cloroformo, se agitó brevemente cada muestra con agitación tipo vórtice. Se centrifugaron luego las muestras durante 5 minutos a 12.000 x g. Se removió la fase acuosa superior hasta un tubo Eppendorf fresco. Se precipitó el ARN por medio de la adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol al 95%. Se mezclaron las 45 muestras por inversión y se las colocó sobre hielo durante 30 minutos. Se precipitó el ARN por medio de centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. Se removió el sobrenadante y se secó brevemente al aire el precipitado. Se resuspendió la muestra de ARN en 10 μl de DEPC tratado con agua. Para remover el ADN contaminante de las muestras, cada una fue tratada con ADNasa libre de ARNasa (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se sintetizó ADNc a partir del ARN total utilizando el 5 kit de síntesis de ADNc de la primera Cadena (Boehringer Mannheim) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo la amplificación por PCR del fragmento específico del gen del ADNc sintetizado utilizando Taq ADN polimerasa (Roche) e iniciadores específicos del gen (ver la Tabla 13 para los iniciadores) en la siguiente reacción: amortiguador 1X PCR, MgCl2 1.5 mM, cada iniciador 0.2 μM, dNTPs 0.2 μM, 1 unidad de polimerasa, 5 μl de ADNc de la reacción de síntesis. Se llevó a cabo la 10 amplificación bajo las siguientes condiciones: Desnaturalización, 95˚C, 1 minuto; hibridación, 62˚C, 30 segundos; extensión, 72˚C, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72˚C, 5 minutos; mantener, 4˚C, hasta el final. Se corrieron los productos PCR sobre un gel de agarosa al 1%, se tiñó con bromuro de etidio, y se visualizó bajo luz UV utilizando el sistema de documentación en gel Quantity-One (Bio-Rad).

Se detectó la expresión de los transgenes en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaron 15 que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugiere fuertemente que su producto génico mejoró la tolerancia al estrés de la planta en las líneas transgénicas. De acuerdo con la declaración anterior, no se podría detectar la expresión de genes endógenos idénticos o muy similares por medio de este método. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7.

Tabla 13 20

Iniciadores utilizados para la amplificación del ARNm del transgén respectivo en PCR utilizando ARN aislado de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana como molde

Gen: iniciador 5’ iniciador 3’

DBF-1

CABF-2

LZ-1

CBF-1

(continuación)

Gen: iniciador 5’ iniciador 3’

HDZ-1

ZF-1

CABF-1

Ejemplo 10

Modificación por ingeniería genética de plantas de soja tolerantes al estrés por sobreexpresión de los genes CABF-1; DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2

Se utilizaron las construcciones pBPSLVM111, pBPSLVM149, pBPSLVM157, pBPSLVM39, 5 pBPSLVM12, pBPSLVM19, pBPSLVM69 para transformar soja como se describe más adelante.

Se esterilizó la superficie de las semillas de soja con etanol al 70% durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por Clorox al 20% (v/v) suplementado con Tween al 0.05% (v/v) durante 20 minutos con agitación continua. Luego, se enjuagaron las semillas 4 veces con agua destilada y se las colocó sobre papel filtro estéril humedecido en una caja de Petri a temperatura 10 ambiente durante 6 a 39 horas. Se pela el recubrimiento de las semillas, y se desprenden los cotiledones del eje del embrión. Se examinó el eje del embrión para asegurarse de que la región meristemática no esté dañada. Se recolectaron los ejes embrionarios cortados en una caja de Petri estéril medio abierta y se los secó al aire hasta un contenido de humedad menor al 20% (peso fresco) en una caja de Petri sellada hasta un uso posterior. 15

Se preparó un cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una sola colonia en medio LB sólido más antibióticos apropiados (por ejemplo 100 mg/l de estreptomicina, 50 mg/l de kanamicina) seguido por el crecimiento de la única colonia en medio LB líquido hasta una densidad óptica a 600 nm de 0.8. Luego, se precipitó el cultivo de bacterias a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con acetosiringona 100 μM. Se 20 incubaron los cultivos de bacterias en este medio de inducción previa durante 2 horas a temperatura ambiente antes de usarlos. Se embebieron los ejes de los embriones cigóticos de semilla de soja con un contenido aproximado de humedad del 15% durante 2 horas a temperatura ambiente con el cultivo en suspensión previamente inducido de Agrobacterium. Se removieron los embriones del cultivo de imbibición y se los transfirió a cajas de Petri que contenían medio MS sólido suplementado con sacarosa 25 al 2% y se incubó durante 2 días, en la oscuridad a temperatura ambiente. Alternativamente, se colocaron los embriones sobre el papel de filtro estéril humedecido (medio MS líquido) en una caja de Petri y se incubó bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Después de este período, se transfirieron los embriones ya sea a medio MS líquido o sólido suplementado con 500 mg/L de carbenicilina o 300 mg/L de cefotaxima para matar la Agrobacteria. Se utilizó el medio líquido para humedecer el papel filtro estéril. Se incubaron los embriones durante 4 semanas a 25˚C, bajo 150 μmol m-2sec-1 y un período de luz de 12 horas. Una vez que las plántulas produjeron raíces, fueron transferidas a suelo Metromix estéril. Se lavó el medio de las plantas in vitro antes de transferir las plantas al suelo. Se mantuvieron las plantas bajo una cubierta plástica durante 1 semana para favorecer el proceso de aclimatación. Luego se 5 trasfirieron las plantas a una habitación de crecimiento donde fueron incubadas a 25˚C, bajo 150 μmol m-2sec-1 de intensidad de luz y un período de luz de 12 horas aproximadamente durante 80 días.

Se seleccionaron luego las plantas transgénicas por su tolerancia mejorada a la sequía, a la salinidad y/o al frío de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia al estrés. 10

Ejemplo 11

Modificación por ingeniería genética de plantas de Colza/Canola tolerantes al estrés por medio de sobreexpresión de los genes CABF-1; DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2

Se utilizaron las construcciones pBPSLVM111, pBPSLVM149, pBPSLVM157, pBPSLVM39, pBPSLVM12, pBPSLVM19, pBPSLVM69 para transformar colza/canola como se describe más adelante. 15

El método de transformación de la planta descrito aquí es también aplicable a Brassica y a otros cultivos. Se esteriliza la superficie de semillas de canola con etanol al 70% durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por Clorox al 20% (v/v) suplementado con Tween al 0.05 % (v/v) durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. Luego, se enjuagan las semillas 4 veces con agua destilada y se las coloca sobre papel filtro humedecido estéril en una caja de 20 Petri a temperatura ambiente durante 18 horas. Luego se remueven los recubrimientos de las semillas y se secan las semillas al aire durante la noche en una caja de Petri estéril a medio cerrar. Durante este período, las semillas perdieron aproximadamente 85% de su contenido de agua. Se almacenan luego las semillas a temperatura ambiente en una cada de Petri sellada hasta un uso posterior. Las construcciones de ADN y la imbibición de los embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Se analizan muestras 25 de las plantas transgénicas primarias (T0) por medio de PCR para confirmar la presencia de T-ADN. Estos resultados se confirman por medio de hibridación tipo Southern en la cual se somete el ADN a electroforesis sobre gel de agarosa al 1% y se lo transfiere a una membrana de nylon positivamente cargada (Roche Diagnostics). Se utiliza el PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por medio de PCR, de acuerdo a lo recomendado por el 30 fabricante.

Se seleccionaron luego las plantas transgénicas por su tolerancia mejorada al estrés, de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 12 35

Modificación por ingeniería genética de plantas de maíz tolerantes al estrés por medio de sobreexpresión de los genes CABF-1; DBF-1, CBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2

Se utilizaron las construcciones pBPSLVM111, pBPSLVM149, pBPSLVM157, pBPSLVM39, pBPSLVM12, pBPSLVM19, pBPSLVM69 para transformar maíz como se describe más adelante.

La transformación del maíz (Zea Mays L.) se realiza con el método descrito por Ishida y 40 colaboradores, 1996 Nature Biotech 14745 - 50. Se cultivan embriones inmaduros conjuntamente con Agrobacterium tumefaciens que porta los vectores "súper binarios", y se recuperan las plantas transgénicas a través de organogénesis. Este procedimiento proporciona un eficiencia de transformación entre 2.5% y 20%. Se seleccionan luego las plantas transgénicas por su tolerancia mejorada a la sequía, salinidad y/o al frío de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 13

Modificación por medio de ingeniería genética de plantas de trigo tolerantes al estrés por sobreexpresión de los genes CABF-1; DBF-1, GBF-1, HDZ-1, ZF-1, LZ-1 y CABF-2 5

Se utilizaron las construcciones pBPSLVM111, pBPSLVM149, pBPSLVM157, pBPSLVM39, pBPSLVM12, pBPSLVM19, pBPSLVM69 para transformar trigo como se describe más adelante.

La transformación del trigo se lleva a cabo con el método descrito por Ishida y colaboradores 1996. Nature Biotech 14745 - 50. Se cultivan embriones inmaduros conjuntamente con Agrobacterium tumefaciens que portan los vectores "súper binarios", y se recuperan las plantas transgénicas a través de 10 organogénesis. Este procedimiento proporciona un eficiencia de transformación entre 2.5% y 20%. Se seleccionan luego las plantas transgénicas por su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de selección descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 14 15

Seguimiento a los cambios en la concentración de ARNm de CABF-1, CABF-2 y CBF-1 en cultivos de Physcomitrella patens tratados para el frío

Preparación en un portaobjetos de un Microarreglo de ADN

Se llevó a cabo una amplificación por PCR en placas de 96 pozos de los EST seleccionados de Physcomitrella patens clonados en el vector pBluescript. Se empleó el juego de amortiguadores para PCR 20 (Boehringer Mannheim) para la reacción PCR. Cada mezcla de reacción para PCR contiene 10 μl de Amortiguador para PCR sin MgCl2, 10 μl de MgSO4, 3 μl del iniciador SK-Fwd (MWG-Biotech, Secuencia: 5’-CGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACT-3’, SEQ ID NO: 76), 3 μl del iniciador SK-Rev (MWG-Biotech, Secuencia: 5’GCGTAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’, SEQ ID NO: 77), 2 μl de dNTP, 1 μl de Taq ADN polimerasa (Roche), 72 μl de agua y 1 μl de molde de ADN. Después de 25 desnaturalización a 95˚C durante tres minutos, se llevaron a cabo las reacciones PCR con 35 ciclos de tres etapas consecutivas incluida desnaturalización a 95˚C durante 45 segundos, hibridación a 63˚C durante 45 segundos, y alargamiento a 72˚C durante 60 segundos. El último alargamiento fue a 72˚C durante 10 minutos. Se purificaron luego los productos PCR con un kit de purificación para PCR OIAquick (Qiagen, Inc.), se eluyó con agua y se midió la concentración de ADN a 260 nm en un espectrofotómetro. 30

Se secaron 2 a 5 μg de cada producto PCR y se disolvieron en 50 μl de DMSO. Se formatearon luego los productos PCR a partir de placas de 96 pozos hasta placas de 384 pozos para impresión. Se empleó un organizador de Microarreglos GenIII (Molecular Dynamics) para imprimir los productos PCR a portaobjetos para microarreglos (Molecular Dynamics) con el formato recomendado por el fabricante. Las manchas impresas tenían un diámetro aproximado de 290 μm y estaban separadas aproximadamente 35 320 μm de centro a centro. Después de la impresión, se dejó la lámina portaobjetos en la cámara libre de polvo durante una hora hasta sequedad. Se llevó a cabo un entrecruzamiento con UV con 600 μJ/mm. Las láminas portaobjetos entrecruzadas estaban listas para hibridación y fueron almacenadas en cámaras oscuras y secas.

Síntesis de sondas para microarreglo 40

Se extrajo el ARN total de cultivos de Physcomitrella patens tratados contra el frío (12 horas a 4˚C en la oscuridad) de acuerdo con el método de extracción de ARN descrito en Ausubel y colaboradores (1987 Curr. Prot. in Mol. Biol. J. Wiley y Sons, New York). Se aplicó el kit Oligotex ARNm midi (Qiagen Inc.) para aislar el ARNm del ARN total con un enfoque que combina tanto un protocolo estándar y por lotes recomendado por el fabricante. Después del enlazamiento del ARN total 45 con Oligotex, se centrifugó la muestra a 14.000 x g para separar el Oligotex:ARNm con la fase líquida en vez de un corrimiento a través de una columna. Después de tres lavados con amortiguador OW2 como se describe en el protocolo por lotes, se resuspendió el Oligotex:ARNm en 400 μl de OW2 y luego se lo recolectó por medio de la columna de acuerdo al protocolo estándar. Se eluyó el ARNm de acuerdo al protocolo estándar. 5

Se sintetizaron sondas de ADNc marcadas con Cy3 y Cy5 a partir del ARNm con Superscript Choice System para síntesis de ADNc (Gibco BRL). Se mezclaron tanto el iniciador oligo-(dT)25 (Genosys Biotechnologies) como el inciador Nonamer (Amersham Pharmacia Biotech) con ARNm hasta alcanzar un volumen total de 20 μl. Se calentó primero la mezcla a 70˚C durante 10 minutos y luego se la dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de transferirla sobre hielo. Una vez está la muestra 10 sobre hielo, se añaden 8 μl de Amortiguador para Síntesis de la Primera Cadena, 4 μl de DTT 0.1 M, 2 μl de dNTP (Amersham Pharmacia Biotech), 2 μl de Cy3 o Cy5 dCTP (Amersham Pharmacia Biotech), 2 μl de Inhibidor de ARNasa (Gibco BRL) y 2 μl de Transcriptasa Inversa Superscript II. Se llevó a cabo la síntesis de la primera cadena a 42˚C durante 8 horas y se calentó luego la mezcla a 94˚C durante tres minutos después de la reacción. 15

Después de la síntesis de la primera cadena, se añadieron 4 μl de hidróxido de sodio 2.5 M a la reacción y se incubó la mezcla a 37˚C durante diez minutos. Se añadieron luego 20 μl de MOPS 2 M (pH 5.0) y 500 μl de amortiguador PB (Qiagen Inc.) a cada reacción. Se purificó luego la sonda por medio del Kit de Purificación para PCR QIAquick (Qiagen Inc.) de acuerdo con el protocolo suministrado por el fabricante. 20

Hibridación de Microarreglos de ADNc y lavados

Se mezclaron las sondas purificadas marcadas con Cy3 y Cy5 y se las secó al vacío hasta un volumen final de 9 μl. Se añadieron luego 9 μl de Solución de Hibridación de Microarreglos (Amersham Pharmacia Biotech) y 18 μl de Formamida (Sigma) a las sondas de ADNc hasta un volumen final de 36 μl. Se aplicó la mezcla a la lámina portaobjetos de microarreglos impresa que fue luego cubierta con una 25 lámina cubreobjetos límpia y libre de polvo sin aire atrapado. Se llevó a cabo la hibridación en una cámara de hibridación a 42˚C durante 16 a 20 horas. Después de la hibridación, se lavaron las láminas portaobjetos dos veces con 0.5XSSC, SDS al 0.2% a temperatura ambiente durante 5 minutos y 15 minutos. Se llevaron a cabo lavados rigurosos dos veces con 0.25XSSC, SDS al 0.1% a 55˚C durante 10 y 30 minutos respectivamente. Después de los lavados, se enjuagaron brevemente las láminas portaobjetos 30 con agua de Millipore y se secó bajo nitrógeno comprimido.

Análisis de los datos de los Microarreglos por Barrido

Se hizo un barrido de los microarreglos de ADNc utilizando el Escáner de microarreglos GenIII (Molecular Dynamics) equipado con dos canales láser. Se observaron primero las imágenes escaneadas y se las ajustó con el software ImageQuant (Molecular Dynamics) y luego se las analizó por medio del 35 software ArrayVision (Molecular Dynamics). Se extrajo la intensidad de la señal para cada mancha por medio del software ArrayVision (Molecular Dynamics) y se la transfirió a Excel (Microsoft). Se normalizaron los datos obtenidos dividiendo la diferencia del valor de la intensidad y de fondo y la diferencia del valor de control y de fondo. Se obtuvo la relación dividiendo los datos normalizados.

Ejemplo 15 40

Identificación de Genes Homólogos y Heterólogos

Se pueden utilizar secuencias de genes para identificar genes homólogos o heterólogos de ADNc o bibliotecas genómicas. Se pueden aislar genes homólogos (por ejemplo, clones de ADNc de longitud completa) a través de hibridación de ácido nucleico utilizando por ejemplo bibliotecas de ADNc. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, se siembran en placa de 100.000 a 1.000.000 de 45 bacteriófagos recombinantes y se transfieren a membranas de nylon. Después de la desnaturalización con álcali, se inmoviliza el ADN sobre la membrana por ejemplo por medio de entrecruzamiento por UV. Se lleva a cabo la hibridación con condiciones altamente rigurosas. En solución acuosa se lleva a cabo la hibridación y el lavado con una fuerza iónica de NaCl 1 M y una temperatura de 68˚C. Se generan sondas de hibridación por ejemplo por medio de marcación de la transcripción tipo nick en forma radioactiva 5 (32P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Se detectan las señales por medio de autorradiografía.

Se pueden identificar genes parcialmente homólogos o heterólogos que están relacionados pero no son idénticos en forma análoga al procedimiento anteriormente descrito utilizando condiciones de hibridación y de lavado de baja rigurosidad. Para hibridación acuosa, se mantiene normalmente la fuerza iónica con NaCl 1 M mientras se disminuye progresivamente la temperatura desde 68 hasta 42˚C. 10

El aislamiento de secuencias de genes con homologías (o identidad/similitud de secuencias) únicamente en un dominio distinto de (por ejemplo 10 - 20 aminoácidos) se puede llevar a cabo por medio del uso de sondas sintéticas de oligonucleótidos marcadas en forma radioactiva. Los oligonucleótidos marcados en forma radioactiva se preparan por medio de fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con T4 polinucleótido quinasa. Los oligonucleótidos 15 complementarios se aparean y ligan para formar concatémeros. Se marcan entonces en forma radioactiva los concatémeros bicatenarios, por ejemplo, por medio de transcripción tipo nick. Normalmente se lleva a cabo la hibridación en condiciones de baja rigurosidad utilizando altas concentraciones de oligonucleótidos.

Solución para hibridación de oligonucleótidos: 20

6xSSC

Fosfato de sodio 0.01 M

EDTA 1 mM (pH 8)

SDS al 0.5 %

100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado 25

Leche en polvo desengrasada al 0.1 %

Durante de la hibridación, se disminuye la temperatura por etapas hasta 5 - 10˚C por debajo de la Tm estimada del oligonucleótido o hasta temperatura ambiente seguido por etapas de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con baja rigurosidad, por ejemplo 3 etapas de lavado utilizando 4 x SSC. Otros detalles son descritos por Sambrook, J. y colaboradores, 1989, "Molecular Cloning: A 30 Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, F. M. y colaboradores, 1994 "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 16

Identificación de Genes Homólogos por medio de Selección de Bibliotecas de Expresión con Anticuerpos

Se pueden utilizar clones de ADNc para producir proteína recombinante por ejemplo en E. coli 35 (por ejemplo, el sistema OIAexpress pQE de Qiagen). Luego se purifican normalmente por afinidad las proteínas recombinantes a través de cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Se utilizan luego proteínas recombinantes para producir anticuerpos específicos por ejemplo por medio del uso d técnicas estándar para inmunización de conejos. Se purifican los anticuerpos por afinidad utilizando una columna Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como lo describen Gu y colaboradores, 1994 40 BioTechniques 17: 257 - 262. Se puede utilizar entonces el anticuerpo para seleccionar bibliotecas de expresión de ADNc para identificar genes homólogos o heterólogos a través de una selección inmunológica (Sambrook, J. y colaboradores, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, F.M. y colaboradores, 1994 "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons). 45

Ejemplo 17

Mutagénesis In vivo

La mutagénesis in vivo de microorganismos se puede realizar por medio del paso del ADN del plásmido (u otro vector) a través de E. coli o de otros microorganismos (por ejemplo Bacillus spp. o levadura tal como Saccharomyces cerevisiae) que se ven afectados en su capacidad para mantener la 5 integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación del ADN (por ejemplo, mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, ver Rupp, W. D., 1996 ADN repair mechanisms, en: Escherichia coli y Salmonella, p. 2277 - 2294, ASM: Washington.) Tales cepas son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte. El uso de tales cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M., 1994 Strategies 7: 32 - 34. La transferencia de moléculas de 10 ADN mutadas en plantas se hace preferiblemente después de selección y ensayos en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de acuerdo con diferentes ejemplos presentados en esta descripción.

Ejemplo 18

Análisis In vitro de la Función de los Genes de Physcomitrella en Organismos Transgénicos

La determinación de las actividades y parámetros cinéticos de enzimas está bien establecida en el 15 arte. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada deben ser adaptados a la actividad específica de la enzima de tipo silvestre, que está dentro de las capacidades de una persona capacitada en la materia. Descripciones generales sobre las enzimas, así como detalles específicos relacionados con la estructura, cinéticas, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades de la enzima pueden encontrarse, por ejemplo, en las siguientes 20 referencias: Dixon, M., y Webb, B. C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure y Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentals de Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P. D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., 25 Graß1, M., eds. (1983 - 1986) Methods de Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; y Ullmann’s Encyclopedia de Industrial Chemistry (1987) vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352 - 363.

La actividad de las proteínas que se enlazan con ADN puede ser medida por medio de diferentes métodos bien establecidos, tales como ensayos de cambios de posición de las bandas de ADN (también 30 llamados ensayos de retado en gel). El efecto de tales proteínas sobre la expresión de otras moléculas se puede medir utilizando ensayos de gen reportero (tal como aquellos descritos en Kolmar, H. y colaboradores, 1995 EMBO J. 14: 3895 - 3904 y las referencias citadas allí). Los sistemas de ensayo del gen reportero son bien conocidos y establecidos para aplicaciones en células tanto procariotas como eucariotas, utilizando enzimas tales como β-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varias otras. 35

La determinación de la actividad de proteínas de transporte de la membrana se puede realizar de acuerdo a técnicas tales como aquellas descritas en Gennis, R. B. Pores, Channels y Transporters, in Biomembranes, Molecular Structure y Function, páginas 85 - 137, 199 - 234 y 270 - 322, Springer: Heidelberg (1989).

Ejemplo 19 40

Purificación del Producto Deseado de Organismos Transformados

La recuperación del producto deseado del material de la planta (es decir, Physcomitrella patents o Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas aquí, o el sobrenadante de los cultivos descritos anteriormente puede llevarse a cabo por medio de diferentes métodos bien conocidos en el arte. 45 Si el producto deseado no es secretado por las células, puede ser recolectado del cultivo por medio de centrifugación a baja velocidad, se pueden lisar las células por medio de técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o sonicación. Los órganos de las plantas se pueden separar mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de homogenización de las células se remueven los residuos por medio de centrifugación, y se retiene la fracción del sobrenadante que contiene las proteínas solubles para 5 purificación adicional del compuesto deseado. Si el producto es secretado a partir de las células deseadas, entonces se remueven las células del cultivo por medio de centrifugación a baja velocidad, y se retiene la fracción del sobrenadante para purificación adicional.

La fracción del sobrenadante obtenida a través de cualquier método de purificación es sometida a cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula deseada es retenida sobre una resina 10 cromatográfica mientras que muchas de las impurezas en la muestra no lo son, o donde las impurezas son retenidas por la resina mientras que la muestra no lo es. Tales etapas de cromatografía pueden ser repetidas las veces que sea necesario, utilizando la misma resina cromatográfica o una diferente. Alguien capacitado en el arte sería capaz de seleccionar las resinas apropiadas para la cromatografía y su aplicación más eficaz para purificar una molécula particular. El producto purificado puede ser 15 concentrado por medio de filtración o ultrafiltración, y almacenado a una temperatura a la cual se maximiza la estabilidad del producto.

Existe una amplia gama de métodos de purificación conocidos en el arte y el método de purificación anterior no pretende constituirse en una limitante. Tales técnicas de purificación están descritas, por ejemplo, en Bailey, J. E. & Ollis, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-20 Hill: NewYork (1986). Adicionalmente, se puede evaluar la identidad y la pureza de los compuestos aislados por medio de técnicas estándar en el estado del arte. Estas incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de coloración, cromatografía de capa fina, NIRS, ensayos enzimáticos, o microbiológicamente. Tales métodos de análisis son revisados en: Patek y colaboradores, 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: 133 - 140; Malakhova y colaboradores, 1996 25 Biotekhnologiya 11: 27 - 32; y Schmidt y colaboradores, 1998 Bioprocess Engineer. 19: 67 - 70. Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89 - 90, p. 521 - 540, p. 540 - 547, p. 559 - 566, 575 - 581 y p. 581 - 587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas de Biochemistry y Molecular Biology, John Wiley y Sons; Fallon, A. y colaboradores (1987) Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular 30 Biology, vol. 17.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

5

Documentos de patente citados en la descripción

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• WO 9612814 A [0069] • US 5990387 A [0080]

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25

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• Gennis, R. B. Pores. Channels and Transporters, in Biomembranes, Molecular Structure and Function. Springer, 1989, 85-137199-234270-322 [0185] 35

• Bailey, J. E. ; Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill, 1986 [0188]

• Patek y colaboradores Appl. Environ. Microbiol., 1994, vol. 60, 133 - 140 [0188]

• Malakhova y colaboradores Biotekhnologiya, 1996, vol. 11, 27 - 32 [0188]

• Schmidt y colaboradores Bioprocess Engineer, 1998, vol. 19, 67 - 70 [0188]

• Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. VCH, vol. A27, 89-90521-540540-547559-566575-40 581581-587 [0188]

• Michal, G. Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1999 [0188]

• Fallon, A. y colaboradores Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 1987, vol. 17 [0188] 45

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH

<120> PROTEÍNAS DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN RELACIONADAS CON EL ESTRÉS Y MÉTODOS DE USO EN PLANTAS 35

<130> 16313-0005

<140> PCT/US00/34972

<141> 2000-12-22

<150> 60/171.745

<151> 1999-12-22 40

<160> 77

<170> PatentIn Versión 2.1

<210> 1

<211> 685

<212> ADN 45

<213> Physcomitrella patens

<400> 1

5

<210> 2

<211> 517

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<220> 10

<221> base modificada

<222> (1)..(517)

<223> "n" representa a, t, c, g, otro o desconocido

<400> 2

15

<210> 3

<211> 1000

<212> ADN 20

<213> Physcomitrella patens

<400> 3

<210> 4

<211> 1343

<212> ADN 5

<213> Physcomitrella patens

<220>

<221> base modificada

<222> (1)..(1343)

<223> “n” representa a, t, c, g, otro o desconocido 10

<400> 4

<210> 5 15

<211> 1157

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 5

20

<210> 6

<211> 374 5

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 6

10

<210> 7

<211> 461

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens 15

<400> 7

<210> 8 20

<211> 1347

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 8

<210> 9 5

<211> 2838

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 9

10

<210> 10

<211> 1424 5

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 10

<210> 11

<211> 1318

<212> ADN 5

<213> Physcomitrella patens

<400> 11

10

<210> 12

<211> 1341

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 12 15

<210> 13

<211> 1521

<212> ADN 5

<213> Physcomitrella patens

<400> 13

10

<210> 14

<211> 1176

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 14 15

<210> 15

<211> 218 5

<212> PRT

<213> Physcomitrella patens

<400> 15

10

<210> 16

<211> 801

<212> PRT 5

<213> Physcomitrella patens

<400> 16

<210> 17

<211> 268

<212> PRT 5

<213> Physcomitrella patens

<400> 17

<210> 18

<211> 339 5

<212> PRT

<213> Physcomitrella patens

<400> 18

<210> 19

<211> 358

<212> PRT

<213> Physcomitrella patens

<400> 19 5

<210> 20

<211> 343

<212> PRT 5

<213> Physcomitrella patens

<400> 20

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> Physcomitrella patens

<400> 21

5

<210> 22

<211> 2838 10

<212> ADN

<213> Physcomitrella patens

<400> 22

<210> 23

<211> 288 5

<212> PRT

<213> Physcomitrella patens

<400> 23

<210> 24

<211> 18 5

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 24 10

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 25

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 5

<400> 25

ctaaagggaa caaaagctg 19

<210> 26

<211> 18

<212> ADN 10

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 26

tgtaaaacga cggccagt 18 15

<210> 27

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 27

gcgatcctca gcctgtcgat ccatt 25

<210> 28

<211> 26 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 28 30

ccctgaggta tcgttcctgg ttccca 26

<210> 29

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 35

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 29

atcccgggcg atggtgcgtt cgagatcgta agg 33

<210> 30 40

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 45

<400> 30

gcgttaacga gctttctcgc agtgccagat aa 32

<210> 31

<211> 33

<212> ADN 5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 31

atcccgggct ctgcacccca gatgtcgcat cct 33 10

<210> 32

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 32

ctgagctcta atgcattcac tgttgctgct gct 33

<210> 33

<211> 25 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 33 25

cctgtagggc cacccggagc tcact 25

<210> 34

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 30

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 34

gagttaacgc agtggtcaca acgcagagta cgc 33

<210> 35 35

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 40

<400> 35

gcgatatcgc ttccatacct gcgccgaaga ctt 33

<210> 36

<211> 32

<212> ADN 45

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 36

gacccgggcc atgtgatatg gcttcaaagt at 32 5

<210> 37

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 37

gcgttaacga ctcactgaga gtcataatgg tg 32

<210> 38

<211> 25 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 38 20

cgtagtcgcg ctcgagctgt ttggt 25

<210> 39

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 25

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 39

atcccgggca cgagggcaag aggggataga gac 33

<210> 40 30

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 35

<400> 40

gcgttaacgc cgatggtgca actttggttg ac 32

<210> 41

<211> 25

<212> ADN 40

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 41

ccgtgtcctc ggagcattct ggcat 25 45

<210> 42

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 5

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 42

atcccgggag gagggagttg gaatctagga gac 33

<210> 43

<211> 33 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 43 15

gcgagctcga ccttgctcga tggagactcc aat 33

<210> 44

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 20

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 44

atcccgggaa taggacggat ggccgacagt tac 33

<210> 45 25

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 30

<400> 45

atgagctcac tcttacactc cgcggggttg gtt 33

<210> 46

<211> 20

<212> ADN 35

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 46

gaatagatac gctgacacgc 20 40

<210> 47

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 45

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 47

atgagctcac tcttacactc cgcggggttg gtt 33

<210> 48

<211> 32 5

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 48 10

gcgttaacgc cgatggtgca actttggttg ac 32

<210> 49

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 49

gcgagctcga ccttgctcga tggagactcc aat 33

<210> 50 20

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 25

<400> 50

gcgttaacga ctcactgaga gtcataatgg tg 32

<210> 51

<211> 20

<212> ADN 30

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 51

ctagtaacat agatgacacc 20 35

<210> 52

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 40

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 52

atcccgggcg atggtgcgtt cgagatcgta agg 33

<210> 53

<211> 20 45

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 53 5

gaatagatac gctgacacgc 20

<210> 54

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 54

ctgagctcta atgcattcac tgttgctgct gct 33

<210> 55 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 20

<400> 55

gcgatatcgc ttccatacct gcgccgaaga ctt 33

<210> 56

<211> 25

<212> ADN 25

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 56

ggagacggta tcacaccatc gaaga 25 30

<210> 57

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 35

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 57

tgcacagaca tctgcctggc tcaca 25

<210> 58

<211> 25 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 58 45

gatgatcgca gccgaagctc cagtg 25

<210> 59

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 59

gggtgtgcca tggactggtg ttccag 26

<210> 60 10

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 15

<400> 60

ggcagtctgt ggaggctgat acatca 26

<210> 61

<211> 25

<212> ADN 20

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 61

cctgatcctg tgaccccttt tgcca 25 25

<210> 62

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 30

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 62

gacatggacg gtgatgcgaa gttgg 25

<210> 63

<211> 26 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 63 40

cggcaacagc agggtctata ccttgg 26

<210> 64

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 45

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 64

gcatactcca ggtcaaatgc agcagc 26

<210> 65 5

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 10

<400> 65

gggtcggcag cctccaatcc ataca 25

<210> 66

<211> 25

<212> ADN 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 66

ggcagggaat ctacgcatcg ctttg 25 20

<210> 67

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 25

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 67

cgacgagatt ctctgcaaca tctgag 26

<210> 68

<211> 26 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 68 35

ggagcttgga ctgcgacctc gtcaag 26

<210> 69

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 40

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 69

ggtgtggctc gtgcgagggc tatcag 26

<210> 70 45

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 5

<400> 70

gtcatcgagg aatcgcacaa ctcct 25

<210> 71

<211> 26

<212> ADN 10

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 71

ggttgacgtt ggattgcaca tggtgg 26 15

<210> 72

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 72

tggatgtgcg aagtgtgcga ggttg 25

<210> 73

<211> 25 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 73 30

gcgctgcctc tgataataga gttgg 25

<210> 74

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 35

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 74

gtgcaggagt gcgtatccga gttcatc 27

<210> 75 40

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador 45

<400> 75

cgtacggctg ttgcatcatc tgcatcg 27

<210> 76

<211> 26

<212> ADN 5

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 76

cgccaagcgc gcaattaacc ctcact 26 10

<210> 77

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Iniciador

<400> 77

gcgtaatacg actcactata gggcga 26

20

25

30

35

40

45

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica transformada por medio de un ácido nucleico que codifica una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental 5 comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta, en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 y homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con la proteína como se define en la SEQ ID NO: 18, o en donde el ácido nucleico que codifica a la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina -1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11 y 10 homólogos del mismo que tienen al menos 70% de identidad con el ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO: 11.
2. La planta transgénica de cualquiera de la Reivindicación 1, en donde el ácido nucleico y la proteína son de una Physcomitrella patens.
3. La planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde la TFSRP es el Homeo Dominio/Cierre 15 de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18.
4. La planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que codifica la TFSRP es el Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 11.
5. La planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde el estrés ambiental se selecciona de salinidad, sequía, y temperatura. 20
6. Una planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en donde el estrés ambiental es sequía, y la TFSRP es HDZ-1 como se define en la SEQ ID NO: 18.
7. Una planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2 y 4, en donde el estrés ambiental es sequía, y el ácido nucleico que codifica la TFSRP es HDZ-1 como se define en la SEQ ID NO: 11. 25
8. La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en donde la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
9. La planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en donde la planta se selecciona de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, 30 especie Vicia, guisantes, alfalfa, café, cacao, té, especie de sauce, palma oleaginosa, coco, pastos perennes y cultivos forrajeros.
10. Una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la semilla contiene la TFSRP de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, y en donde la planta es 35 una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de la planta de tipo silvestre.
11. Una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica la proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la semilla contiene al ácido nucleico que codifica la TFSRP de cualquiera de las Reivindicaciones 40 1, 2 y 4 y en donde la planta es una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de la planta de tipo silvestre.
12. Una proteína aislada del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la TFSRP se selecciona del Homeo Dominio/Cierre de Leucina-1 (HDZ-1) como se define en la SEQ ID NO: 18 o en donde la TFSRP es codificada por una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 11.
13. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína del factor de transcripción de protección relacionada con el estrés (TFSRP), en donde el ácido nucleico que codifica la TFSRP codifica para una TFSRP como se define en la SEQ ID NO: 18. 5
14. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína del factor de transcripción de protección relacionada con el estrés (TFSRP), en donde el ácido nucleico que codifica la TFSRP es como se define en la SEQ ID NO: 11.
15. Un vector aislado de expresión recombinante que contiene un ácido nucleico de cualquiera de las Reivindicaciones 13 y 14, en donde la expresión del vector en una célula huésped resulta en una 10 mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped.
16. Una célula huésped que contiene al vector de la Reivindicación 15.
17. La célula huésped de la Reivindicación 16, en donde la célula está en una planta.
18. Un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica la proteína 15 del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta que comprende:

(a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica TFSRP, y 20

(b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta,

en donde la TFSRP y el ácido nucleico que codifica la TFSRP son como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4.
19. Un método para incrementar la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped 25 comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped, en donde se transcribe el gen de interés en respuesta a una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), que comprende:

(a) la transformación de la célula huésped con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica la TFSRP, y 30

(b) la expresión de la TFSRP dentro de la célula huésped, incrementando así la expresión del gen transcrito en respuesta a la TFSRP comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped,

en donde la TFSRP y el ácido nucleico que codifica la TFSRP son como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4. 35
20. Un método para identificar una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP), que comprende:

(a) elevar una respuesta específica de un anticuerpo a una TFSRP como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3;

(b) seleccionar material putativo de la TFSRP con el anticuerpo, en donde el enlazamiento 40 específico del anticuerpo con el material indica la presencia de una TFSRP potencialmente nueva; y

(c) identificar el material enlazado como una TFSRP.
21. Un método para modificar la tolerancia al estrés de una planta que comprende, modificar la expresión de una proteína del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP) en la planta, en donde la TFSRP es como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.
22. El método de la Reivindicación 21, en donde se incrementa la tolerancia al estrés.
23. El método de la Reivindicación 21, en donde disminuye la tolerancia al estrés. 5
24. El método de la Reivindicación 21, en donde la expresión de TFSRP se modifica por la administración de una molécula antisentido que inhibe la expresión de TFSRP, en donde la TFSRP es como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.
25. El método de la Reivindicación 21, en donde la planta es transgénica.
26. El método de la Reivindicación 25, en donde la planta es transformada con ácido nucleico que 10 codifica TFSRP como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2 y 4.
27. El método de la Reivindicación 25, en donde la planta es transformada con un promotor que dirige la expresión de TFSRP nativa, en donde la TFSRP es como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.
28. El método de la Reivindicación 27, en donde el promotor es específico del tejido o es regulado 15 durante el desarrollo.
29. El uso de la proteína aislada del factor de transcripción relacionada con el estrés (TFSRP) de la Reivindicación 12, el ácido nucleico aislado que codifica TFSRP de la Reivindicación 13 ó 14 o el vector aislado de expresión recombinante de la reivindicación 15 para la producción de una planta transgénica que tiene una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una 20 variedad de la planta de tipo silvestre.
30. El uso de la planta transgénica de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 o de la semilla de la Reivindicación 10 u 11 para la producción de un producto agrícola.

“Siguen 29 páginas de dibujos” 25