<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft die Regulierung von Mitogen-aktivierten Protein-Kinasen (MAPK)
Die Proteinphosphorylierung ist einer der Hauptmechanismen für die Steuerung von Zellfunkti- onen als Antwort auf aussere Signale. Bei Eukaryonten spielen die Mitogen-aktivierten Protein- Kinasen (MAPKs), eine spezifische Klasse der Serin/Threonin-Protein-Kinasen, eine Rolle bei vie- len dieser Prozesse. Ein allgemeines Merkmal der MAPK-Kaskaden ist ihre Zusammensetzung aus drei funktionell verbundenen Protein-Kinasen Ein MAPK wird phosphoryliert und dadurch durch eine MAPK-Kinase (MAPKK) aktiviert, welche selbst aktiviert wird durch eine andere Serin/ Threonin-Protein-Kinase, eine MAPK-Kinase-Kinase.
Die MAPKKs sind Kinasen mit einer Doppel- Spezifitat, die MAPKs phosphorylieren und dadurch sowohl am Threonin- als auch am Tyrosin- Rest des TXY-Phosphorylierungs-Motivs aktivieren. Die MAPKs haben eine zweilappige Struktur, in welcher das ATP in der Spalte zwischen den beiden Lappen gebunden ist, und der C-terminale Lappen bindet das Substrat. Die Kristallstruktur von ERK2, einem Sauger-MAPK, liess auf die erste Erklärung schliessen, warum der unike Doppel-Phosphorylierungsvorgang fur die Aktivierung dieser Gruppe der Protein-Kinasen notwendig ist (Zhang et al., 1994) Thr183 und Tyr185 von ERK2 sind in einer Schleife enthalten, die die Kinase-Subdomänen VII und VIII verbindet.
Während Thr183 an der Oberfläche der Schleife exponiert und daher für das MAPKK-MEK1 zugänglich ist, ist Tyr185 in einer hydrophoben Tasche vergraben Da beide Reste für die Aktivierung von ERK2 phosphoryliert sein müssen, muss MEK1 zuerst Thr183 phosphorylieren, was zu einer Konformationsänderung von ERK2 führt, wodurch Tyr185 einer nachfolgenden Phosphorylierung zugänglich wird (Canaga- rajah et al., 1997).
Eine Signalisierung durch MAPK-Kaskaden kann zu einer Vielfalt verschiedener Auswirkungen führen, einschliesslich der Differenzierung und Zellteilung (Robinson und Cobb, 1997), doch sind auch MAPK-Reaktionswege an der Antwort auf verschiedene Stressbelastungen beteiligt. Nuklea- re Ziele der MAPKs konnen verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie Ste12, c-Jun-Elk-1 und c-Myc sein (Karin und Hunter, 1995), doch konnen Ziele auch andere Protein-Kinasen, wie MAPK- aktivierte Protein-Kinase-2 (Stokoe et al., 1992), Proteine einschliesslich des epidermalen Wachs- tumsfaktor-Rezeptors und des Ras-exchange-Faktors Sos, und stromaufwarts gelegene Kompo- nenten der MAPK-Kaskade, wie Raf1 und MEK1 (Whitmarsh und Davis, 1996), sein. Obwohl viele MAPK-Kaskaden in Hefe und in Tieren definiert wurden, bleibt ihre Zusammensetzung in Pflanzen unklar.
Im Gegensatz zu Tieren sind Pflanzen festsitzende Organismen. Um Veränderungen in ihrer Umwelt zu überleben, haben Pflanzen komplexe und differenzierte Wahrnehmungs- und Adapti- onssysteme entwickelt, die es ihnen ermöglichen, auf viele Stress-Situationen zu reagieren und sich an diese anzupassen. Zu solcherlei Stress zahlen abiotische Faktoren, wie Kälte, Trockenheit, Verletzung, UV-Strahlung und osmotischer Stress, und biotische Faktoren, wie Pathogene Stress- Reaktionen sind durch ein kompliziertes räumliches und zeitliches Muster von Vorgängen charak- terisiert, zu denen unmittelbare Fruhreaktionen zahlen, die innerhalb von Sekunden und Minuten auftreten, und die die Offnung von lonen-Kanalen und die Bildung reaktiver Sauerstoff-Zwischen- produkte inkludieren.
Auf diese Vorgänge folgt das Einsetzen der Transkriptionsaktivierung be- stimmter Gene und die Erzeugung bestimmter Pflanzenhormone, wie Ethylen und Jasmonsäure.
Spätreaktionen treten innerhalb von Stunden und Tagen auf und umfassen die Expression von Genen, die verschiedene Stoffwechselbahnen regulieren oder direkt an Stress-Reaktionen beteiligt sind (Somssich und Hahlbrock, 1998; Maleck und Dietrich, 1999).
MAPKs spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von Stress-Reaktionen bei Tieren und bei Hefe.
Bei Pflanzen sind mehrere MAPKs bei der Signalisierung von Hormonen, Stress und Zellzy- klus- und Entwicklungsereignissen beteiligt. Kürzlich zeigte es sich, das SIMK (durch Salzstress- induzierte MAPK) aktiviert wird, wenn Luzerne(Alfalfa)-Zellen hyperosmotischen Bedingungen ausgesetzt werden
Es zeigte sich, dass man Mitglieder des "drei-Kinase-Moduls" in Pflanzen finden kann (zur In- formation vgl Ligterink und Hirt, 2000) Im Verständnis von Pflanzen-MAPKs wurden beträchtliche Fortschritte gemacht, und eine Vielfalt von Untersuchungen zeigte, dass MAPKs bei mehreren Aspekten der Entwicklung (Wilson et al., 1997), Zellteilung (Banno et al., 1993 ; Calderini et al., 1998 ;
Bögre et al., 1999) und Hormonwirkung, einschliesslich Auxin (Mizoguchi et al., 1994, Absci- sinsäure (Knetsch et al , 1996), Gibberellinsaure (Huttly und Phillips, 1995), Ethylen (Kieber et al.,
<Desc/Clms Page number 2>
1993; Chang, 1996, Salicylsaure (Zhang und Klessig, 1997), und Jasmonsäure (Seo et al., 1995, 1999, Stratmann und Ryan, 1997) eine Rolle spielen MAPKs werden auch durch biotischen und abiotischen Stress, wie Kälte und Trockenheit (Jonak et al., 1996) und Verletzung (Seo et al., 1995,1999, Usami et al., 1995 ; Bogre et al., 1997, Zhang und Klessig, 1998) und wahrend einer Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkung (Ligterink et al., 1997 ; Zhang et al , 1998; Romeis et al., 1999) aktiviert.
Bis heute wurden mehrere MAPKKs aus verschiedenen Pflanzen isoliert, einschliesslich AtMEK1 (Morns et al , 1997), AtMKK2, AtMKK3, AtMKK4 und AtMKK5 aus Arabidopsis (Ichimura et al , 1998a, 1998b), TMEK1 aus der Tomate (Hackett et al., 1998), NPK2 aus Tabak (Shibata et al., 1995) und ZmMEK1 aus Mais (Hardin und Wolniak, 1998). Trotz der Klonierung dieser Gene ist es noch immer unklar, auf welchem Weg die Kinasen wirken und welche MAPKS durch sie aktiviert werden. Obwohl eine mögliche MAPK-Kaskade durch Zwei-Hybriden-Analyse in Hefe ("yeast two hybrid analysis") und Funktions-Komplementationstests von Hefe-Mutanten (Mizoguchi et al , 1998) definiert wurden, bleibt noch nachzuweisen, ob diese Kinasen eine Kaskade in Pflanzen bilden.
Kürzlich wurde eine neue MAPKK durch einen Zwei-Hybriden-Screen mit einer Tabak- MAPK isoliert, doch konnte die rekombinante MAPKK die jeweilige MAPK nicht phosphorylieren oder aktivieren (Liu et al., 2000).
Die MAPKs werden auch durch verschiedenen Stress in Pflanzen aktiviert (Jonak et al., 1999).
Die MAPK-Aktivierung gehört zu den ersten, detektierbaren Signalgebungsereignissen. Kürzlich wurde festgestellt, dass der SIMK-MAPK-Weg durch erhöhte Salzkonzentrationen aktiviert wird (Munnik et al., 1999).
Andere Strategien zur Herstellung Salz-tolerierbarer Pflanzen sind beispielsweise in US 5,639,950, US 5,859,337, WO 99/54489 A1, US 5,965,705 und US 4,594,323 beschrieben
Die US 5,639,950 betrifft eine DNA-Sequenz einschliesslich eines bifunktionellen Enzyms (P5CS genannt) mit sowohl gamma-Glutamylkinase- als auch Glutaminsäure-gamma-Semialde- hyd-Dehydrogenase-Aktivitäten, die die ersten beiden Schritte in der Prolinproduktion bei Pflanzen katalysieren. Es wurde beschrieben, dass die Aufnahme dieses Gens in Pflanzen die Salz- Toleranz und die Widerstandsfähigkeit der Pflanzen gegen Trockenheit erhohen
Die US 5,859,337 beschreibt Nukleinsäuren, die für Polypeptide codieren, welche Pflanzen und andere Organismen tolerant gegen Salz machen Diese Polynucleotidsequenzen werden "STZ" oder "STO" genannt.
In der WO 99/54489 A1 ist ein Verfahren zum Erhalt von Pflanzen, die gegenüber abiotischem Stress, insbesondere osmotischem Stress, tolerant sind, beschrieben, wobei einer Pflanze die Fähigkeit verliehen wird, der durch Stress induzierten Phosphorylierung Cyclin-abhangiger Kinase (cyclin dependent kinase, CDK)-Proteine entgegenzuwirken.
Die US 5,965,705 betrifft ein Gen, das als CBF1 bezeichnet ist, welches für ein Protein (CBF1) codiert, das an eine Region bindet, die die Expression von Genen reguliert, welche die Toleranz gegenüber Kalte und Dehydrierung bei Pflanzen fordern. Dieses Gen wird zur Transformation von Mikroorganismen verwendet und kann zur Transformation von Pflanzen verwendet werden.
Die US 4,594,323 betrifft mutierte proBA-Regionen, die vorgesehen werden, um osmotisch empfindlichen Wirten eine osmotische Toleranz zu verleihen. Die mutierte DNA-Sequenz kann mindestens ein Enzym im Biosynthese-Weg für eine Aminosäure, die die gewünschte osmotische Toleranz verleiht, überproduzieren
MAP-Kinasen, ihre Aktivierung in Saugern und Hefe ist z. B. in der US 5,804,427 oder 5,736,381 beschrieben
Es erweist sich jedoch, dass die MAP-Kinase selbst kein geeignetes Mittel zur Erhöhung der Salz-Stress-Toleranz in Pflanzen ist, daher werden andere Ziele gesucht, um solche gewünschte Wirkungen hervorzurufen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren zur Verbesserung der Stress-Toleranz, insbesondere der Salz-Toleranz, bei eukaryontischen Zellen, insbesondere bei Pflanzenzellen, vorzusehen.
Diese Aufgabe wird mittels eines Proteins mit einer Mitogen-aktivierten Protein-Kinase-Kinase- Aktivität (MAPKK-Aktivitat) gelöst, welches Protein umfasst . a) die Aminosauresequenz, wie in Fig. 1 angegeben, oder . b) ein Fragment der Aminosäuresequenz, wie in Fig 1 angegeben, welches mindestens die 11
<Desc/Clms Page number 3>
Kinase-Domänen, wie in Fig 2A angegeben, aufweist, oder .C) eine Aminosauresequenz mit mindestens 90% Identität mit mindestens 50 aufeinander fol- genden Aminosaureresten der Aminosauresequenz, wie in Fig 1 angegeben, bei Bestimmung mit dem FAST/A-Algorithmus, und wobei das Protein mit der Aminosauresequenz a), b) oder c) weiters eine aktivierende Aktivität auf die Salz-Stress-mduzierte MAP-Kmase (SIMK) aufweist
Die Identität bei der Aminosäuresequenz ist vorzugsweise hoher als 95%;
insbesondere hoher als 98%
Die SIMKK-Aktivität der vorliegenden Proteine ist für SIMK-Proteine spezifisch
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine SIK-MAPK-Kinase (SIMK-Kinase; SIMKK) isoliert, sequenziert und charakterisiert. Die Aminosauresequenz der Alfalfa-SIMKK ist in Fig 1 veranschaulicht Die Nukleinsauresequenz codiert fur eine aktive Protein-Kinase, die mit SIMK spezifisch in Wechselwirkung tritt, jedoch nicht mit drei anderen MAPKs, im Zwei-Hybriden-System in Hefe. Die rekombinante SIMKK aktiviert SIMK spezifisch mittels Phosphorylierung sowohl der Threonin- als auch der Tyrosin-Reste in der Aktivierungsschleife von SIMK Die SIMKK enthalt eine putative MAPK-Andockstelle am N-Terminus, der bei Sauger-MAPK-Kinasen, Transkriptionsfakto- ren und Phosphatasen konserviert ist.
Das Entfernen der MAPK-Andockstelle von SIMKK schränkt die Wechselwirkung mit SIMK teilweise ein, eliminiert sie jedoch nicht vollstandig, was zeigt, dass auch andere Domänen von SIMKK bei der MAPK-Bindung eine Rolle spielen Bei vorübergehen- den Expressionstests aktiviert SIMKK spezifisch die SIMK, zwei andere MAP-Kinasen jedoch nicht Ausserdem verbessert die SIMKK die Salz-induzierte Aktivierung von SIMK. Es zeigte sich, dass beim SIMKK-Protein gemäss der vorliegenden Erfindung die SIMK-Proteine auf effiziente Weise gesteuert werden können, und einem Organismus, insbesondere festsitzenden Organismen, wie Pflanzen, eine verbesserte SIMKK-Aktivitat verliehen werden kann. Mit dieser verbesserten SIMKK-Aktivität wird die Stress-Toleranz, insbesondere die Salz-Toleranz, bei solchen Organis- men deutlich erhoht.
Die Bestimmung der Aktivierungsaktivität des Proteins gemäss der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise gemäss den in den Beispielen beschriebenen Aktivitätstests durchgeführt werden.
Die SIMKK-Aktivität der vorliegenden Erfindung ist von anderen MAPKK-Aktivitaten, wie beispiels- weise in den Beispielen beschrieben, leicht unterscheidbar
Die Isolierung von SIMKK verschiedener Organismen kann durch Screenen von cDNA-Biblio- theken, insbesondere Zwei-Hybnden-cDNA-Bibliotheken spezifischer Organismen, vorzugsweise Pflanzen, mit SIMK als Sonde, durchgeführt werden Das Protein gemäss der vorliegenden Erfin- dung weist eine spezifische Wechselwirkung mit SIMK auf, es wird keine Wechselwirkung mit anderen MAPKs beobachtet.
Bei Tieren kann man die MAPK-Andockstellen in MAPKKs, Phosphatasen und MAPK-Substra- ten, einschliesslich MAPK-aktivierter Protein-Kinase 2 und Transknptionsfaktoren finden Das MAPK-Andock-Motiv ist durch eine Anhaufung positiv geladener Aminosauren ausserhalb der kata- lytischen Domane charakterisiert (Jacobs et al., 1999). Kurzlich wurden bei Sauger-MAPKs Sub- strat-Andockstellen, die zwei negativ geladene Aminosäuren bilden, identifiziert (Tanoue et al , 2000).
Es zeigte sich, dass wenn Substrate, Aktivatoren und Regulatoren von ERK2 an ihrer MAPK-Andockstelle mutiert wurden, diese Proteine ihre Fähigkeit zu einer Co-Immunpräzipitation mit ERK2 verloren Der N-terminale nicht-katalytische Teil von SIMKK enthält auch eine putative MAPK-Andockstelle Eine Wechselwirkung zwischen SIMK und SIMKK in Abwesenheit der An- dockstelle war jedoch noch immer möglich, wenn auch in geringerem Masse
Kürzlich wurde SIPKK, ein Tabak-MAPKK, isoliert und man stellte fest, dass es mit SIPK, einem Tabak-Homolog von SIMK, in Wechselwirkung steht (Liu et al., 2000) SIPK und SIPKK waren im Zwei-Hybriden-System in Hefe in Wechselwirkung, und SIPK war zu einer Co-Immun- prazipitation mit SIPKK aus Baktenenextrakten fähig Ein GST-Fusionsprotein von SIPKK konnte MBP in vitro phosphorylieren, womit gezeigt wurde,
dass SIPKK eine funktionelle Protein-Kinase ist SIPKK konnte jedoch SIPK weder phosphorylieren noch aktivieren, was darauf hindeutet, dass SIPKK nicht der Aktivator von SIPK ist
Die MAPKs in allen Eukaryonten werden durch einen posttranslationalen Vorgang aktiviert, an dem die Phosphorylierung eines Threonin- und eines Tyrosin-Restes des sogenannten TXY-Motivs zwischen den Subdomanen VII und VIII beteiligt ist. Die Phosphorylierung des TXY-Motivs erfolgt
<Desc/Clms Page number 4>
durch MAPKKs, welche Kinasen mit einer zweifachen Spezifität sind Unter Verwendung bakteriell exprimierter GST-Fusionsproteine von Alfalfa SIMKK und SIMK kann gezeigt werden, dass SIMKK SIMK sowohl am Threonin- als auch am Tyrosin-Rest des TXY-Motivs phosphoryliert.
Weiters zeigte sich, weil zwei andere MAPKs von Alfalfa nicht durch SIMKK phosphoryliert wurden, dass SIMKK eine Protein-Kinase von SIMK mit einer zweifachen Spezifität ist.
SIMK ist eine durch Salz induzierbare MAPK, die auf moderate hyperosmotische Bedingungen reagiert (Munnik et al , 1999) Obwohl SIMK durch Salz-Stress nur wenig aktiviert wurde, führte eine Co-Expression von SIMKK und SIMK zu wesentlich stärkerer SIMK-Aktivierung als jene, die durch SIMKK alleine erreicht worden war.
Da die Salinitat zu einem der Hauptfaktoren wird, die die landwirtschaftliche Produktivitat einschranken, dient die vorliegende Identifizierung der molekularen Mechanismen der Salz-Stress-Signalisierung nicht nur als wichtiger Beitrag zur grundlegenden Wissenschaft, sondern bietet auch neue Wege, die Stress-Toleranz im Allgemeinen und die Salz- Toleranz insbesondere von empfindlichen Nutzpflanzen zu verbessern
Ein Weg, festsitzenden Organismen eine verbesserte SIMKK-Aktivität gemass der vorliegenden Erfindung zu verleihen, ist, Organismen genetisch zu manipulieren, wobei die SIMKK-Aktivität mit- tels transgener Methoden verstarkt wird
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein DNA-Molekül, das eine Region auf- weist, die für ein SIMKK-Protein gemäss der vorliegenden Erfindung codiert Es ist bevorzugt,
dass das DNA-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung die Nukleinsäuresequenz, wie in Fig 1 ange- geben, aufweist. Es zeigte sich, dass das DNA-Molekul, das die Nukleinsäuresequenz von Position 145 bis Position 1251 aufweist, wie in Fig. 1 angegeben, bestimmten (Pflanzen-)Zellen die Fahig- keit verleiht, mit Stress, insbesondere mit höheren Salzkonzentrationen, besser fertig zu werden.
Die DNA-Moleküle gemass der vorliegenden Erfindung können eine Sequenz-Identität von min- destens 95% mit den oben beschriebenen DNA-Molekülen aufweisen oder alternativ unter strin- genten Bedingungen mit solchen DNA-Molekülen hybridisieren. Ein Beispiel für hoch stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Anwendung von 6 x SSC und 65 C.
Auch RNA-Moleküle, welche eine Nukleotidsequenz aufweisen, die der Sequenz der DNA- Moleküle gemäss der vorliegenden Erfindung entspricht, stellen einen Aspekt der vorliegenden Er- findung dar In diesen RNA-Molekülen ist T selbstverständlich immer durch U ersetzt.
Selbstverständlich bilden auch DNA-Moleküle, die die zu den oben beschriebenen DNA- Molekülen komplementare Sequenz aufweisen, einen Teil der vorliegenden Erfindung Bei diesen DNA-Molekulen werden SIMKKs verwandter Organismen identifiziert und mittels allgemeiner Me- thoden der Molekularbiologie isoliert. Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Identifizierung und Isolierung von SIMKK-DNAs und -Proteinen, unter Verwendung bekannter SIMKK-Sequenzen, beispielsweise wie in Fig. 1 angegeben. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfah- ren zur Identifizierung und Isolierung eines DNA- oder RNA-Molekuls gemäss der vorliegenden Erfindung, umfassend die Schritte des . Bereitstellen einer markierten Nukleinsaure-Sonde, die fur ein Protein gemäss Anspruch 1 oder ein konserviertes Fragment davon codiert, .
Bereitstellen einer Bibliothek von Nukleinsäure-Molekülen, die potentiell ein Nukleinsaure-
Molekul enthalten, das für ein SIMKK oder Teile davon codiert, . Identifizieren der SIMKK codierenden Nukleinsäure-Moleküle mit der markierten Nukleinsaure-
Sonde, und gegebenenfalls .
Isolieren des SIMKK codierenden Nukleinsaure-Moleküls
Mit solchen identifizierten und isolierten Nukleinsaure-Molekulen, die mindestens für einen Teil eines SIMKK-Protems codieren, kann ein Verfahren zur Expression eines SIMKK-Proteins oder von Teilen davon vorgesehen werden, welches umfasst :
. das Bereitstellen eines Nukleinsäure-Moleküls, das durch das erfindungsgemässe Verfahren isoliert worden ist, in einem Expression-Vektor, . das Transformieren eines geeigneten Wirts mit dem das Nukleinsaure-Molekül enthaltenden
Expressions-Vektor, und . die Expression des SIMKK-Proteins oder von Teilen davon, das (die) von diesem Nukleinsaure-
Molekül codiert worden ist (sind), in einem geeigneten Wirt
Wenn die DNA-Molekule gemäss der vorliegenden Erfindung auch fur ein funktionelles SIMKK- Protein codieren, das eine geeignete Wirkung auf SIMK aufweist, ist es auch möglich, solche DNA-
<Desc/Clms Page number 5>
Moleküle zur Transformation von Pflanzen oder anderer festsitzender Organismen zu verwenden, um bei solchen Organismen eine höhere Stress-Toleranz zu induzieren
Zu diesem Zweck sieht die vorliegende Erfindung einen Vektor vor,
der ein DNA-Molekül ge- mass der vorliegenden Erfindung und geeignete Regulierungselemente aufweist, die eine Trans- kription eines RNA-Molekuls vom DNA-Molekul gemäss der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen Ein "geeignetes Regulierungselement" in der Bedeutung der vorliegenden Erfindung kann vom Fachmann je nach dem zu transformierenden Organismus leicht ausgewählt werden. Wenn bei- spielsweise die SIMKK-RNA in einer Pflanzenzelle erzeugt werden sollte, sollte der Vektor ein Re- gulierungselement enthalten, der diese Transkription in dieser ausgewählten Pflanze oder Pflan- zenzelle ermöglicht.
Vorzugsweise umfasst der Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung weiters einen Selekti- onsmarker
Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Vektors gemäss der vorliegenden Erfindung um- fasst einen induzierbaren Promotor als Regulierungselement, insbesondere einen Promotor, der durch Salzkonzentration reguliert wird
Um eine hohe konstitutive Expression eines Transgens in allen Geweben zu erhalten, wurde bisher der 35S-Blumenkohl-Mosaikvirus-Promotor in grossem Umfang verwendet (Holmberg N und Bülow L., 1998, Trends P1. Sc1 3'61-66). Dieser Promotor hat mehrere Vorteile.
Er hat ein breites Wirtsspektrum und kann sowohl in zweikeimblättngen als auch in einkeimblättrigen Pflanzen ver- wendet werden und variiert nur wenig zwischen verschiedenen Organen und Entwicklungsstadien (Benfey P und ChuaN., 1990, Science 250 :959-966).
Promotoren für die Expression in besonderen Geweben wurden verwendet und inkludieren den Arabidopsis-Promotor aus dem Rubisco-small subunit-Gen AtS1A, welcher nur die Expression in grunen Geweben steuert (Krebbers et al , 1988, Plant Mol. Biol. 11745-759), oder der Patatin-Typ I-Promotor, welcher ausschliesslich die Expression in Kartoffelknollen vermittelt (Rocha-Sosa M et al , 1989, EMBOJ 8:23-29)
In verschiedenen Untersuchungen wurden auch unterschiedliche Pflanzen-Promotoren ver- wendet, die durch Trockenheit, Kälte, Salinität oder Sauerstoffmangel induziert werden (Homberg N und Bulow L., 1998, Trends Pl Sci. 3 :61-66). Zum Beispiel reagiert der Osmotin-Promotor auf Salinitat, Trockenheit und das Hormon Abscisinsaure (Raghothama et al , 1993, Plant Mol Biol.
23 1117-1128), und der Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-4-Promotor reagiert auf Sauer- stoffmangel (Kohler et al , 1996, Plant J 10.175-183).
Gemäss einem weiteren Aspekt betnfft die vorliegende Erfindung auch eine Pflanzenzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung aufweist Infolge der verstärkten SIMKK-Aktivität weist eine solche Pflanze in vivo und in vitro eine höhere Toleranz fur Salz-Stress oder andere Stress-Faktoren auf.
Vorzugsweise sind der Vektor oder zumindest die SIMKK-Codier- und -Betriebsteile desselben stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Gemäss der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich die Regulierungselemente der SIMKK in einer bestimmten transformierten Pflanze von den Regulierungselementen der "natürlichen" SIMKK in dieser Pflanze, soferne vorhanden. Dies be- deutet, dass die Integration in das Pflanzengenom an einer nicht natürlicherweise vorkommenden Stelle oder mit einem nicht natürlicherweise vorkommenden Regulierungselement durchgeführt wird ("nicht natürlicherweise" bedeutet, nicht natürlicherweise im Wildtyp dieses spezifischen zu transformierenden Organismus vorhanden).
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die Pflanzen- zellen eine Salz-Toleranz von mindestens 150% der Wildtyp-Zellen auf Salz-Toleranzen von mehr als 200%, vorzugsweise mehr als 300%, insbesondere mehr als 400%, der Wildtyp-Zelle sind mit der vorliegenden Erfindung leicht erreichbar
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Pflanze, die mindestens eine Sub-Population von Pflanzenzellen gemäss der vorliegenden Erfindung aufweist. Eine solche Pflanze hat eine höhere Stress-Toleranz als der Wildtyp, wenn sie die Merkmale gemäss der vorliegenden Erfindung in mindestens einer Sub-Population ihrer Zellen enthalt.
Diese Sub-Population sollte natürlich gross genug sein, um die Stress-Toleranz (Salz-Toleranz) der Pflanze im Ganzen zu verleihen
Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Identi- fizierung und Isolierung von DNA-Molekülen, die fur Proteine mit einer SIMKK-Aktivitat codieren,
<Desc/Clms Page number 6>
wobei die DNA-Moleküle gemäss der vorliegenden Erfindung als Sonde verwendet werden. Für ein solches Verfahren ist es bevorzugt, ein Fragment beispielsweise der in Fig. 1 gezeigten DNA- Sequenz zum Screenen auf SIMKK-Homologe in anderen Organismen zu verwenden. Eine geeig- nete Sonde hat eine Länge von etwa 20 bis 100 Nukleinsäure-Positionen und wird aus konservier- ten Regionen ausgewählt, z. B. der in Fig 1 fett gedruckten Region.
Eine solche Sonde kann zum Screenen einer Genbibliothek eines ausgewählten Organismus, z. B. einer DNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek, und zur Identifizierung von DNA- Molekulen mit offenen Leserahmen, die potentiell fur ein SIMKK-Protein codieren, verwendet wer- den. Um die SIMKK-Aktivität eines solchen Monierten Proteins zu verifizieren, sollte das Protein exprimiert und auf SIMKK-Aktivität getestet werden, beispielsweise mittels des in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahrens.
Gemäss einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung betnfft sie ein Verfahren zur Erhö- hung der Salz-Toleranz in Pflanzen durch Transformation einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle mit einem Vektor gemass der vorliegenden Erfindung
MAPKKs werden gewöhnlich durch spezifische Protein-Kinasen, genannt MAPKK-Kinasen (MAPKKKs), aktiviert. Obwohl MAPKKKs üblicherweise inaktiv sind und eine Aktivierung durch stromaufwärts befindliche Faktoren benötigen, macht eine Deletion einer Regulierungsregion diese Kinasen oft konstitutiv aktiv. Es zeigte sich, dass dies bei ANPK1, der N-terminal trunkierten Versi- on der Tabak-MAPKKK-NPK1 der Fall ist, und eine Co-Expression von ANPK1 mit spezifischen MAPKs führte zur Aktivierung der MAP-Kinasen in vivo (Kovtun et al., 2000, Proc Natl. Acad. Sci.
USA 97 : Es sei bemerkt, dass SIMKK eine in dieser Hinsicht unübliche MAPKK ist, insoferne als sie keine Aktivierung durch eine stromaufwärts befindliche MAPKKK braucht, um ihr Substrat, die SIMK-MAPK aktivieren zu konnen (Fig. 8).
Es ist daher auch moglich, die SIMKK-Aktivität bei bestimmten Pflanzen zu verstärken, indem spezifische aktivierende Moleküle, d. h. MAPKKKs, wie ANPK1, angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist in den folgenden Beispielen und in den Figuren genauer be- schrieben. Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele und Figuren eingeschränkt.
Fig. 1. zeigt die Nukleotid-Sequenz und die induzierte Aminosäure-Sequenz von SIMKK-cDNA
Fig. 2. Alfalfa-SIMKK gehort zu einer Unterfamilie von Pflanzen-MAPKKs und hat ein konser- viertes MAPK-Andock-Motiv (A) Multiple Ausrichtung der abgeleiteten katalytischen Protein-Kern-Sequenzen von Alfalfa- SIMKK mit AtMEK1 (Morris et al., 1997), AtMKK2, AtMKK3, AtMKK4 und AtMKK5 (Ichimura et al., 1998) aus Arabidopsis, TMEK1 (Hackett, 1998) aus Tomate, NPK2 (Shibata et al., 1995) aus Ta- bak, und ZmMEK1 (Hardin und Wolniak, 1998) aus Mais. Identische Aminosäuren sind durch Punkte angegeben, Lucken sind durch Bindestriche angegeben, und die putativen Phosphorylie- rungsstellen sind durch Sternchen angegeben Die 11katalytischen Sub-Domanen sind durch rö- mische Ziffern über den jeweiligen Regionen angegeben.
(B) Multiple Ausrichtung putativer MAPK-Andockstellen in verschiedenen MAPKKs Die MAPK- Andockstellen-Konsensus-Sequenz ist K/R-K/R-K/R-X(1-5)-L/I-X-L/I (Jacobs et al., 1999) Zahlen geben den ersten und letzten Rest in jedem Protein und jeder Domäne an Die putative MAPK- Andockstelle von SIMKK wurde mit den Motiven von Arabidopsis AtMKK2, AtMKK4 und AtMKK5 (Ichimura et al , 1998), Mais ZmMEK1 (Hardin und Wolmak, 1998), Drosophila melanogaster MEK (Tsuda et al., 1993), Human-MEK1 (Zheng und Guan, 1993) und JNKK1 (Lin et al. 1995), und Saccharomycs cerevisiae Ste7 (Teague et al., 1986) verglichen.
Fig. 3. Zwei-Hybriden-Wechselwirkungstest zwischen Alfalfa-MAPKs und SIMKK.
GAL4-Aktivierungsdomanen-Fusionen wurden mit GAL4-Bindungsdomänen-Fusionen in PJ69- 4A co-transformiert und auf eine Wechselwirkung entweder in einem #-Galactosidase (#-gal)-Filter- Abhebtest oder durch Zuchtung auf Ade getestet. Die erste Spalte zeigt die GAL4-Bindungsdomä- nen(BD)-Fusionen, die auf eine Wechselwirkung mit den GAL4-Aktivierungsdomänen(AD)-Fusio- nen der zweiten Spalte getestet wurden
Fig. 4. Die N-terminale MAPK-Andockstelle von SIMKK ist fur die Wechselwirkung mit SIMK nicht essentiell.
(A) SIMKK und drei trunkierte Versionen von SIMKK wurden fur die Analyse der Zwei-Hybn- den-Wechselwirkung in Hefe mit SIMK verwendet. Die drei SIMKK-Konstrukte enthielten entweder
<Desc/Clms Page number 7>
die nicht-katalytische, N-terminale (SIMKK-N) oder die katalytische C-terminale (SIMKK-C) Doma- ne oder eine trunkierte Version von SIMKK, der die N-terminale Domane fehlte (SIMKK-K)
EMI7.1
SIMKK. Die SIMKK-Konstrukte wurden mit der GAL4-Bindungsdomane von pGBT9 fusioniert, in PJ69-4A zusammen mit SIMK-pGAD424 transformiert und durch Zuchtung von Transformanten auf SD/Ade und SD/His-+3-AT auf Wechselwirkung mit SIMK getestet Die erste Spalte zeigt die GAL4-Bindungsdomänen(BD)-Fusionen, die auf eine Wechselwirkung mit den GAL4-Aktivierungs- domanen (AD)-Fusionen in der zweiten Spalte untersucht wurden
Fig. 5.
SIMKK codiert fur eine aktive Kinase.
SIMKK wurde in pGEX-3x kloniert und als GST-Fusionsprotein exprimiert GST wurde als Kon- trolle expnmiert Affinitatsgereinigte GST oder GST-SIMKK wurde in Anwesenheit von y-32P-ATP mit basischem Myelinprotem (myelin basic protein, MBP) oder Histon-H1 (H1) inkubiert Nach SDS-PAGE wurden die Reaktionsprodukte mittels Coomassie-Blue-Färbung (A) oder Autoradio- graphie (B) analysiert
Fig. 6. SIMKK phosphoryliert SIMK.
In vitro-Kinase-Tests von GST-SIMKK alleine und Kinase-negativen MAPKs als Substraten.
GST-SIMKK wurde in Anwesenheit von y-32P-ATP alleine oder mit SIMK(K84R), MMK2 (K66R) oder MMK3(K69R) inkubiert. Nach SDS-PAGE wurden die Reaktionsprodukte mittels Coomassie- Blue-Farbung (A) oder Autoradiographie (B) analysiert
Fig. 7. SIMKK phosphoryliert SIMK am Threonin- und Tyrosin-Rest der Aktivierungsschleife
Zur Phosphorylierungsanalyse wurden Kinase-inaktive MAPKs, SIMK(K84R), MMK2(K66R) und MMK(K69R) in Anwesenheit von ATP ohne (-) oder mit (+) SIMKK inkubiert (A) Die Phospho- rylierung des TEY-Motivs der MAPKs wurde nachfolgend durch Immunoblotten mit einem pTEpY- Phospho-spezifischen Antikörper analysiert.
Die Phosphorylierung des TEY-Motivs von SIMK(K84R) wurde durch (B) Immunoblotten mit einem Phosphotyrosin-spezifischen Antikörper, (C) Immunoblotten mit einem Phosphothreonm-spezifischen Antikörper und (D) Dünnschichtchro- matographie der phosphorylierten Aminosäuren analysiert
Fig. 8. SIMKK führt zu einer spezifischen Aktivierung von SIMK in vivo
Petersilie-Protoplasten wurden mit dem leeren Vektor pSH9 (Bahnen 1 und 4), pSH9-SIMK-HA (Bahn 2), pSH9-SIMK-HA und pRT101-SIMKK (Bahn 3), pSH9-MMK2 (Bahn 5), pSH9-MMK2 und pRT101-SIMKK (Bahn 6), pSH9-MMK3-HA (Bahn 7), pSH9-MMK3-HA und pRT101-SIMKK (Bahn 8) vorübergehend transformiert SIMK-HA, MMK2, MMK3-HA und SIMKK wurden unter der Kon- trolle des 35S-Promotors exprimiert.
(A) die SIMK-, MMK3- und MMK2-Aktivltat wurde aus Proteinextrakten mittels Immunoprezipi- tation mit einem HA- oder MMK2-Antikorper, gefolgt von einem in vitro-Kinase-Test mit basischem Myelin-Protein (MBP) als Substrat bestimmt. (B) Immunoblots der selben Extrakte, wie in (A) beschrieben, wurden entweder mit HA- oder MMK2-Antikorper durchgeführt
Fig. 9. SIMKK verstarkt die Salz-induzierte Aktivierung von SIMK in vivo.
Petersilie-Protoplasten wurden mit dem leeren Vektor pSH9 (Bahn 1), pSH9-SIMK-HA (Bahnen 2 und 3), pSH9-SIMK-HA und pRT101-SIMKK (Bahnen 4 und 5) vorübergehend transformiert SIMK-HA und SIMKK wurden unter der Kontrolle des 35S-Promotors expnmiert Die Zellen wurden 10 min lang mit 250 mM NaCI (Bahnen 3 und 5) behandelt. (A) Die SIMK-Aktivitat wurde aus Pro- teinextrakten durch Immunoprazipitation mit einem HA-Antikorper, gefolgt von einem in vitro- Kinase-Test mit MBP als Substrat bestimmt. (B) Immunoblots der selben Extrakte wie in (A) be- schneben wurden mit HA-Antikorper durchgeführt.
Beispiele:
Isolierung und Sequenzanalyse von SIMKK
SIMK in dessen gesamter Lange wurde als Sonde zum Screenen einer Hefe-Zwei-Hybnden- cDNA-Expressionsbibliothek, hergestellt aus in Suspension gezuchteten Zellen von Luzerne (Medi- cago saliva) (Hybn-ZAP; Stratagene), verwendet Hefe-Stamm PJ69-4A (James et al., 1996) wurde mit einer Effizienz von 15 000 Kolonie-bildenden Einheiten pro Mikrogramm der Bibliothek-DNA transformiert, und etwa 150 000 Transformanten wurden direkt auf Wachstum auf SD/Ade-/Leu-/
<Desc/Clms Page number 8>
Trp- gescreent. Plasmide putativ positiver Klone wurden gerettet und in Hefe re-transformiert Die Transformanten wurden auf Medium, dem Histidin fehlte, das aber 10 mM 3-Aminotriazol (Sd/His- +3-At) enthielt und in Medium, dem Adenin fehlte (SD/Ade-) ausplattiert.
Positive Klone wurden vollstandig sequenziert (T7-Sequencing-Set; Pharmacia)
Klonierung von SIMKK, SIMK, MMK2, MMK3, SAMK, SIK-N, SIK-K und SIK-C in pGAD424 und pGBT9
Mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde der offene Leserahmen von SIMKK als Smal/Xhol-Fragment in pGAD424 (Clontech, Palo Alto, CA) und pGBT9 (Clontech) kloniert, wobei folgende Primer verwendet wurden.
5'-Pnmer (MEK4x4) : TATACCCGGGAATGAGGCCGATTCAGCTTC,
3'-Primer (MEK4x3). TTTCCCGGGCTCGAGGACGAACTAAGAAGAAAGTGATCTTG
SIMK und MMK2 wurden als BamHI-Fragment, wie fruher beschrieben, kloniert (Jonak et al , 1995). MMK3 wurde als BamHI-Fragment kloniert, wobei die folgenden Primer verwendet wurden-
MMK3 5'-Pnmer (M14x1) AAAAGGATCCGTAACAGAATAATCATG,
3'-Pnmer (M14x2)- ATATGGATCCGACCATTGTGCCAAGTC,
SAMK 5'-Primer (MMK4x1) TTTTGGATCCCAATGGCCAGAGTTAACC,
3'-Pnmer (M17x2). TATGGATCCTTAAGCATACTCAGGATTG,
SIK-N 5'-Primer (MEK4x4),
3'-Primer (MEK4n3) : TTTTGGATCCCTTCCGCTTCCGATCCGGTT,
SIK-K 5'-Primer (MEK4k5)' TTTTCCCGGGGAGTCAACAGCTAGTGATTC;
3'-Primer (MEK4x3) ;
SIK-C 5'-Primer (MEK4c5)- ATATCCCGGGGACTGCTTCTCCGGAGTTTAGG,
3'-Pnmer (MEK4x3).
Nach PCR wurden die offenen Leserahmen der Protein-Kinase-Konstrukte vollständig sequen- ziert.
Klonierung von SIMKK, SIMK, MMK2 und MMK3 in pGEX-3x und Expression als Gluta- thion-S-Transferase-Fusionsproteine
SIK wurde als SmaVSmal-PCR-Fragment in pGEX-3x (Pharmacia) kloniert, wobei die folgen- den Primer verwendet wurden 5'-Pnmer (MEK4x1)' TATACCCGGGGAGATGAGGCCGATTCAGCTTC,
3'-Pnmer (MEK4x2)- TTTTCCCGGGTACATTGACGAACTAAGAAG
SIMK, MMK2 und MMK3 wurden als BamHVBamHI-Fragment in pGEX-3x kloniert, wobei die oben beschriebenen offenen Leserahmen verwendet wurden Die Expression von Glutathion-S- Tranferase(UIST)-Fusionsproteinen in Eschenchia co/1 und die Affinitatsreinigung wurden, wie be- schrieben, durchgeführt (Ausubel et al , 1999) Die Proteinkonzentrationen wurden mittels eines Bio-Rad-Detektionssystems bestimmt
Bei einem Versuch,
die aktivierende Kinase von SIMK zu isolieren, wurde der offene Leserah- men von SIMK mit der GAL4-Bindungsdomane von pGBT9, einem Sonden-Plasmid, fusioniert Der Hefestamm PJ69-4A wurde mit diesem Plasmid und einer Alfalfa-pGAD424-cDNA-Bibliothek trans- formiert, wobei die Pflanzenproteine als Fusion mit der GAL4-Aktivierungsdomane exprimiert wur- den. Etwa 150 000 Transformanten wurden durch Plattieren auf selektivem Medium, dem Adenin, Leucin und Tryptophan fehlte, gescreent Potentiell positive Klone wurden auf falsch-positive Klone durch Plasmid-Rettung (plasmid rescue) (Robzyk und Kassir, 1992) und Retransformation in PJ69- 4A getestet.
Die Transformanten wurden auf SD/His-+3-AT (Medium, dem Histidin fehlt, das aber 10 mM 3-Aminotriazol enthalt) und SD/Ade- (Medium, dem Adenin fehlt) ausplattiert Drei Klone wurden erhalten, die auf Medium wachsen konnten, dem entweder Adenin oder Histidin fehlte. Die Sequenzierung der Inserts der isolierten Plasmide zeigte, dass eine der cDNAs potentiell fur ein Protein der MAPKK-Familie codierte und daher SIMKK (oder SIK, als Kurzform) benannt wurde.
Wie in Fig 2A gezeigt, enthalt die 1,5-kb cDNA den gesamten offenen Leserahmen von SIMKK (SIK), der für ein Protein von etwa 42 kD codiert Das Protein enthält die typischen Merkmale der MAPKKs: 11 katalytische Sub-Domanen und 2 putative Phosphorylierungsstellen (durch Sternchen
<Desc/Clms Page number 9>
in Fig. 2A angegeben), die durch die stromaufwärts befindliche Aktivierungs-Kinase aktiviert wer- den.
Eine Ausrichtung des katalytischen Kerns von SIMKK mit anderen MAPKKs aus Pflanzen zeigt die grosse Homologie innerhalb dieser Gen-Familie Die grösste Sequenz-Homologie wurde bei AtMKK4 und AtMKK5 aus Arabidopsis beobachtet (Ichimura et al , 1998)
Wie in Fig. 2B gezeigt, enthalt der N-Terminus von SIK auch ein DEJL-Motiv - K/RK/R-K/R-X(1- 5)-L/I-X-L/I - von welchem bekannt ist, dass es als eine MAPK-Andockstelle bei Säugern wirkt (Jacobs et al., 1999) und das in Tier- und Hefe-MAPKKs konserviert ist Die MAPK-Andockstelle scheint in mehreren verschiedenen Pflanzen-MAPKKs konserviert zu sein, weil nicht nur SIK, son- dern auch Arabidopsis-AtMKK2,-ATMKK4 und -AtMKK5 und Mais- ZmMEK1 ein putatives MAPK- Andockmotiv enthalten
Hefe-Stämme, Wachstumsbedingungen,
Transformation und #-Galaktosidase-Filter-Test
SD-Medium wurde, wie beschrieben (Sherman et al., 1979), hergestellt Der Hefe-Stamm PJ69-4A (James et al., 1996) wurde zur Selektion auf Ade- oder His-+3-AT verwendet. Der Stamm HF7C (Feilotter et al., 1994) wurde für den #
-Galaktosidase-Filter-Test verwendet Die Transforma- tion von Hefezellen erfolgte, wie beschrieben (Schiestl und Gietz, 1989) Die Filter-Tests wurden, wie beschrieben (Breeder und Nasmyth, 1985), durchgeführt
In vitro-Mutagenese
Zur Herstellung von Kinase-negativen Versionen Mitogen-aktivierter Protein-Kinasen (MAPKs) wurden die konservierten Lysin-Reste K84, K66 und K69 von SIMK, MMK2 bzw MMK3 durch in vitro-Mutagenese unter Verwendung des Altered Sites-Sets, wie vom Hersteller (Promega) beschrieben, zu Arginin umgeandert Die folgenden Oligonukleotide wurden fur die in vitro-Muta- genese-Reaktion synthetisiert.
SIMKLOF 5' GCATTTGCAATCTTCATAACCGCGACATGTTC 3', MMK2LOF 5' GCCAATCTTCCTAATGGCGAC 3'; und
MMK3LOF 5' CGCCAATCTTCCTTATCGCAACG 3'
In vitro-Phosphorylierungs-Tests
GST-Fusions-Proteine wurden in verschiedenen Kombinationen 30 min lang bei Raumtempe- ratur in 20 mM Hepes, pH 7,4,15 mM MgCI2, 5 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 M ATP und 2 Ci von y-32P-ATP inkubiert Das Verhältnis von Enzym zu Substrat war 1 5 Das Reaktionsvolumen betrug 20 l Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 5x SDS-Puffer und 5minutiges Erhitzen auf 95 C gestoppt Die Proben wurden entweder bei -20 C gefroren oder direkt durch SDS-PAGE auf 10% Gelen analysiert
Protein-Blotten und Immunodetektion der phosphorylierten GST-MAPKs
Nach der Trennung durch SDS-PAGE wurden die Proteine auf Polyvinylden-Difuorid-Membra- nen (Millipore,
Bedford, MA) durch Tank-Blotten (uber Nacht bei 30 mA; Bio-Rad) transferiert. Der Transfer-Puffer enthielt 50 mM Borsäure und 50 mM Tns-Base Zur Identifizierung phosphorylierter MAPKs wurden die Membranen 5 min lang in TBS-Tween (0,01 M Tris, pH 8, 0,15 M NaCI und 0,05% Tween 20) gewaschen und 20 min lang in TBS-Tween/0,3% fettfreiem Milchpulver blockiert Nach dreimaligem, je 20minütigem Waschen wurden die Blots 1,5 h lang mit Biotin-konjugiertem Ziegen-anti-Maus- oder Ziegen-anti-Kaninchen-Antikorper (1 1000;
Sigma), der in TBS-Tween verdünnt war, inkubiert Das Waschen erfolgte dreimal, wie oben beschrieben Danach wurden die Blots in Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (1 500) inkubiert und wiederum gewaschen Die Farbe-Reaktion erfolgte in einer frisch zubereiteten Lösung von 3,3'-Diaminobenzidin (Sigma, verdünnt in TBS plus 0,03% Wasserstoffperoxid) Die verwendeten Antikörper waren ein monoklo- naler Phospho-MAPK-Antikorper (1 1000; New England Biolabs, Beverly, MA), ein monoklonaler Phosphotyrosin-Antikörper (1. 2000, Sigma), und ein polyklonaler Phosphothreonin-Antikorper
<Desc/Clms Page number 10>
(1.1000;
Zymed, San Francisco, CA)
Phosphoaminosäure-Analyse
Nach einer in vitro-Phosphorylierung von Affinitäts-gereinigtem GST-SIMK-Protein mittels GST- SIMK(K84R) in Anwesenheit von 32P-y-ATP wurde die Umsetzung durch Proteinfällung mit 20% TCA in Anwesenheit von 50 g BSA gestoppt Nach erschöpfendem Waschen mit 10% TCA wur- den die Proteine unter Argon mit 6 N HCI bei 110 C 1 h lang hydrolysiert Das HCI wurde durch Abdampfen unter Vakuum und aufeinander folgende Waschungen mit Wasser eliminiert Die Ami- nosäuren wurden in Chromatographie-Lösungsmittel (Isobuttersäure-0,5 M NH40H 5 :3 (v/v)) re- suspendiert, und die Phosphoaminosaurezusammensetzung wurde durch Autoradiographie nach eindimensionaler Chromatographie auf Celluloseplatten wieder gelöst.
Vorübergehende Expressions-Tests
Die offenen Leserahmen von SIMK und MMK3 wurden an das C-terminale Dreifach- Haemagglutinin(HA)-Epltop fusioniert und als Ncol/BamHI-Fragment in PSH9 (Holtorf et al., 1995) kloniert. Die offenen Leserahmen von SIK und MMK2 wurden als Xhol/Xbal- und EcoRVKpnl- Fragmente in pRT101 kloniert (Töpfer et al , 1987).
Versuche betreffend eine vorubergehende Expression und Co-Transformation wurden mit Pro- toplasten aus in Suspension gezüchteten Petersilie-Zellen durchgeführt. Die Protoplasten wurden wie beschrieben (Dangl, 1987) hergestellt. Fünfzehn bis 30 fg von Plasmid-DNA wurden für die Co- Transformationen verwendet; ein 35S-#-Glucuronidase-Reporter-Konstrukt (Holtorf et al., 1995) wurde verwendet, um die Transformationseffizienz zu evaluieren. Die Versuche wurden minde- stens dreimal mit Proben von verschiedenen Protoplasten-Präparationen durchgeführt.
Immunokinase-Tests
Extrakte wurden aus transformierten Protoplasten 12 bis 16 Stunden nach der Transformation hergestellt. Die Proteinextrakte wurden, wie beschrieben (Jonak et al , 1996), hergestellt. Proto- plasten-Extrakte, die 150 g Gesamtprotein enthielten, wurden entweder mit 5 l HA-Antikorper (BABCO, Richmond, CA) oder mit 2 AL von MMK2-Antikörper (5 fg von Protein A-gereinigtem An- tikorper) (Jonak et al., 1996) und 20 l Protein G- oder Protein A-Sepharose-Kügelchen (suspen- diert in 50 mM Tris, pH 7,4,250 mM NaCI, 5 mM EGTA, 5 mM EDTA, 0,1% Tween 20,5 mM NaF, 10 g/ml Leupeptin und 10 g/ml Aprotinin) 2 h lang bei 4 C immunpräzipitiert.
Die Kügelchen wurden dreimal mit Puffer I (20 mM Tns-HCI, 5 mM EDTA, 100 mM NaCI und 1 % Tnton X-100), einmal mit dem selben Puffer, der jedoch 1 m NaCI enthielt, und einmal mit Kinase-Puffer (20 mM Hepes, pH 7,5,15 mM MgCI2, 5 mM EGTA und 1 mM DTT) gewaschen Die Kinase-Umsetzungen der immunpräzipitierten Proteine wurden in 10 l Kinase-Puffer, enthaltend 1 mg/ml basisches Myelin-Protein, 0,1 mM ATP und 2 C1 y-32P-ATP durchgeführt. Die Protein-Kinase-Umsetzungen wurden 30 min lang bei Raumtemperatur durchgeführt Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Proben-Puffer gestoppt Die Phosphorylierung von basischem Myelin-Protein wurde durch Autoradiographie nach SDS-PAGE analysiert.
Das Immunoblotten von Protoplasten-Extrakten, enthaltend SIMK-HA, MMK2 und MMK3-HA, erfolgte entweder mit HA-Antikorper, wie vom Hersteller (BABCO) empfohlen, oder mit MMK2- Antikorper, wie beschrieben (Jonak et al , 1996)
SIMKK geht eine spezifische Wechselwirkung mit SIMK ein
Um festzustellen, ob die Wechselwirkung zwischen SIMKK und SIMK spezifisch ist, wurde getestet, ob SIMKK mit drei anderen Alfalfa-MAPKs, MMK2 (Jonak et al , 1995), MMK3 (Bögre et al., 1999) und SAMK (Jonak et al , 1996) in Wechselwirkung treten kann.
Zu diesem Zweck wurden die offenen Leserahmen von MMK2, MMK3 und SAMK mit der GAL4-Bindungsdomäne von pGBT9 fusioniert und in den Hefe-Stamm PJ69-4A, der bereits SIMKK-pGAD424 enthielt, transfor- miert Die Kolonien wurden auf Wachstum auf Ade und auf eine Wechselwirkung in einem
<Desc/Clms Page number 11>
#-Galactosidase-Filter-Abhebungs-Test getestet.
SIMK-pGBT9 wurde als positive Kontrolle ver- wendet, und der leere Vektor pGAD424 wurde als negative Kontrolle verwendet Wie in Fig. 3 ge- zeigt, konnten nur mit SIMK-pGBT9 und SIMKK-pGAD424 co-transformierte Zellen auf Ade- wach- sen und zeigten eine Wechselwirkung im #-Galactosidase-Filter-Abhebungs-Test
Die N-terminale MAPK-Andock-Stelle von SIMKK ist hilfreich, ist jedoch nicht essentiell für eine Wechselwirkung mit SIMK
Es zeigte sich, dass der nicht-katalytische N-Terminus des Xenopus MAPKK XMEK fur die Wechselwirkung mit dem jeweiligen Frosch-MAPK wichtig ist (Fukuda et al., 1997). Die Andock- Stellen für ERK/MEK und JNK/JNKK-Wechselwirkung wurden definiert (Xia et al., 1998, Jacobs et al , 1999).
Eines dieser Wechselwirkungs-Motive ist das sogenannte DEJL-Motiv, welches man auch im N-Terminus von SIMKK (Fig. 2B) findet Um zu untersuchen, ob das DEJL-Motiv von SIMKK für die Wechselwirkung mit SIMK wichtig ist, wurden drei trunkierte Formen von SIMKK durch Polymerase-Kettenreaktion erzeugt (Fig. 4A). Die drei verschiedenen SIMKK-Konstrukte enthielten entweder die nicht-katalytische N-terminale (SIMKK-N) oder die C-termmale (SIMKK-C) Domäne, oder eine trunkierte Version von SIMKK, der die N-terminale nicht-katalytische Domane (SIMKK-K) fehlte.
Die SIMKK-Konstrukte wurden mit der GAL4-Bindungsdomane von pGBT9 fusi- oniert und danach in PJ69-4A zusammen mit SIMK-pGAD424 transformiert Die SIMKK-Konstrukte wurden auf eine Wechselwirkung mit SIMK getestet, indem Transformanten auf Ade-- und His + 3 - AT-Platten gezüchtet wurden SIMKK in dessen gesamter Lange wurde als positive Kontrolle ver- wendet, und der leere Vektor pGAD424 wurde als negative Kontrolle verwendet.
Zusätzlich wurden auch SIMKK-N, SIMKK-K und SIMKK-C mit der GAL4-Bindungsdomäne fusioniert und in Kombina- tion mit dem leeren Vektor pGAD424 auf Autoaktivierung getestet PJ69-4A-Zellen, die mit SIMKK- pGBT9- und SIMK-pGAD424 co-transformiert worden waren, konnten auf Ade- oder His-+3-AT wachsen Dagegen konnten PJ69-4A-Zellen, die mit SIMK-pGAD424 und entweder SIMKK-N- pGBT9 oder SIMKK-C-pGBT9 transformiert worden waren, unter diesen Bedingungen nicht wach- sen Anderseits konnten PJ69-4A-Zellen, die mit SIMK-pGAD424 transformiert worden waren, und die N-terminal trunkierte SIMKK (SIMKK-K) noch immer auf His+3-AT wachsen, sie verloren jedoch ihre Fähigkeit, auf Ade- zu wachsen (Fig 4B) Diese Ergebnisse zeigen an, dass die N-terminale Verlangerung von SIMKK alleine nicht fur eine Wechselwirkung mit SIMK ausreicht.
Da jedoch die Deletion des N-Terminus von SIMKK die Wechselwirkung mit SIMK verringert, tragt der N-Terminus noch immer zur Wechselwirkung von SIMKK mit SIMK bei
SIMKK codiert für eine funktionelle Protein-Kinase
Um zu beweisen, dass SIMKK fur eine funktionelle Protein-Kinase codiert, wurde der offene Leserahmen von SIMKK in pGEX-3x cloniert, und ein bakteriell expnmiertes Glutathion-S-Trans- ferase(GST)-SIMKK-Fusionsprotein wurde erzeugt Das Affinitats-gereinigte GST-SIMKK-Protein (Fig 5B) wurde für einen in vitro-Kinase-Test zusammen mit dem basischen Myelin-Protein (MBP) und Histon-H1 als Substrate (Fig 5A) verwendet SIMKK konnte autophosphorylieren (Fig 5B) und phosphorylierte sowohl MBP als auch Histon-H1, obwohl es MBP bevorzugte (Fig 5B).
Um die Möglichkeit auszuschliessen, dass kontaminierende Protein-Kinasen in der Affinitats-gereinigten GST-SIMKK-Fraktion vorhanden waren, wurde auch Affinitäts-gereinigtes GST hergestellt, wies jedoch weder eine Autophosphorylierung (Fig 5B) noch eine Protein-Kinase-Aktivitat gegenüber MBP oder Histon-H1 (Fig 5B) auf. Diese Daten zeigen, dass SIMKK für eine aktive Protein-Kinase codiert, die MBP phosphorylieren kann.
SIMKK phosphoryliert SIMK in vitro
Um zu bestimmen, ob SIMKK SIMK als Substrat in vitro erkennt, wurde der offene Leserahmen von SIMK in pGEX-3x Moniert und als GST-Fusions-Protein in Escherichia co/l expnmiert
Wenn Affinitäts-gereinigtes GST-SIMK-Protein mit GST-SIMKK in Anwesenheit von y-32P-ATP inkubiert wurde, wurde ein Anstieg des mit 32P markierten SIMK beobachtet (Daten nicht angege- ben), was anzeigt, dass SIMKK SIMK in vitro phosphorylieren kann Um zwischen einer SIMK-
<Desc/Clms Page number 12>
Autophosphorylierung und einer Markierung durch SIMKK zu unterscheiden, wurde eine Kinase- negative Form von SIMK durch in vitro-Mutagenese erzeugt, wobei der Lysin-Rest K84 durch Argi- nin ersetzt wurde. MMK2 und MMK3, zwei andere MAPKs aus Alfalfa, wurden ebenso an den Positionen K66 bzw. K69 mutiert.
Die offenen Leserahmen von SIMK(K84R), MMK2(K66R) und MMK3(K69R) wurden in pGEX-3x cloniert und als GST-Fusionsproteine exprimiert (Fig 6A). Das Affinitäts-gereinigte GST-SIMK(K84R), GST-MMK2 (K66R) und GST-MMK3 (K69R) zuerst auf ihre Kinase-Aktivitaten mit MBP als Substrat getestet. Im Gegensatz zu den Wildtyp-GST- Fusions-Proteinen von SIMK, MMK2 und MMK3 (Jonak et al., 1995), zeigten die mutierten Versio- nen dieser Kinasen keine Autophosphorylierung und keine Phosphorylierung von MBP (Daten nicht angegeben). Bei Verwendung als Substrat für in vitro-Kinase-Tests mit SIMKK stellte sich heraus, dass SIMKK GST-SIMK(K84R) stark phosphoryliert und in geringerem Ausmass auch GST- MMK2(K66R) (Fig 6B).
SIMKK phosphoryliert SIMK sowohl am Threonin- als auch am Tyrosin-Rest der Aktivie- rungsschleife
MAPKKs sind Protein-Kinasen mit einer zweifachen Spezifitat, die MAPKs durch Phosphorylie- rung sowohl des Threonin- als auch des Tyrosin-Restes des TXY-Motivs in der Aktivierungsschlei- fe zwischen den Subdomänen VII und VIII aktiviert. Um festzustellen, ob SIMKK als Kinase mit einer zweifachen Spezifität wirkt und ob diese Phosphorylierung für SIMK spezifisch ist, wurde eine Reihe von Immunoblot-Versuchen mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt.
Zur Phosphorylierungsanalyse der MAPKs wurden die Kinase-negativen GST-Fusions- Proteine von SIMK, MMK2 und MMK3 mit oder ohne GST-SIMKK inkubiert Die Phosphorylierung des TXY-Motivs wurde danach durch Immunoblotten der MAPKs mit einem Satz von drei Antikör- pern analysiert Der monoklonale pTEpY-spezifische Antikörper erkennt selektiv nur jene MAPKs, die phosphorylierte Threonin- und Tyrosin-Reste am TEY-Motiv der Aktivierungsschleife tragen.
Nach der Inkubation von SIMK(K84R), MMK2 (K66R) und MMK3(K69R) in Abwesenheit von SIMKK detektierte der pTEpY-Antikörper kein Signal (Fig. 7A), was die Unfähigkeit der mutierten Kinasen zu einer Autophosphorylierung am TEY-Motiv demonstriert. Nach Inkubation der MAPKs mit SIMKK wurde der pTEpY-Antikörper ausschliesslich an SIMK(K84R) gefunden (Fig 7B) Diese Daten zeigen, dass SIMKK eine Kinase mit einer zweifachen Spezifität ist, die spezifisch das TEY- Motiv von SIMK phosphoryliert
Um nachzuweisen, dass die Phosphorylierung von SIMK durch SIMKK sowohl an Tyrosin- als auch an Threonin-Resten stattfindet, wurde phosphoryliertes GST-SIMK(K84R) durch Immunoblot- Analyse entweder mit einem Phosphotyrosm- oder einem Phosphothreonin-Antikörper analysiert.
Anstiege sowohl der Tyrosin- (Fig 7B) als auch der Threonin- (Fig 7C) -Phosphorylierung von GST-SIMK(K84R) wurden nach Inkubation mit SIMKK beobachtet Eindimensionale Phosphopep- tid-Analyse zeigte auch, dass SIMKK SIMK(K84R) sowohl am Threonin als auch am Tyrosin phos- phoryliert (Fig. 7D), was bestätigt, dass SIMKK als Protein-Kinase von SIMK mit Doppel-Spezifität wirkt.
In vivo-Aktivierung von SIMK, jedoch nicht von MMK2- oder MMK3, durch SIMKK
Um zu bestimmen, ob SIMKK SIMK in vivo aktivieren kann, wurden SIMK und SIMKK in Proto- plasten der Petersilie co-exprimiert Proteinextrakte aus transformierten Protoplasten wurden hergestellt, und SIMK-Haemagglutinin (HA) wurde mit einem anti-HA-Antikorper immunprazipitiert Die SIMK-Aktivitat wurde durch in vitro-Kinase-Tests mit MBP als Substrat bestimmt Bei Zellen, die nur mit dem Vektor transformiert wurden, konnte der HA-Antikörper keine MBP-Kinase-Aktivität ausfällen (Fig. 8A, Bahn 1). Ektopisch expnmiertes SIMK alleine zeigte eine relativ geringe Kinase- Aktivität (Fig 8A, Bahn 2) Dagegen wurde eine mehrfach höhere SIMK-Aktivitat erhalten, wenn Zellen sowohl mit SIMK als auch mit SIMKK co-transformiert wurden (Fig. 8A, Bahn 3).
Um zu bestimmen, ob SIMKK ein spezifischer Aktivator fur SIMK ist, wurden die Versuche mit MMK2 (Fig 8A, Bahnen 5 und 6) und MMK3 (Fig 8A, Bahnen 7 und 8) wiederholt Im Gegensatz zu den SIMK-Ergebnissen wurden keine Anstiege der MMK2- oder MMK3-Aktivitat nach Co-Transfor- mation mit SIMKK beobachtet (Fig. 8A, Bahnen 6 bzw. 8). Die Unterschiede in den SIMK-, MMK2-
<Desc/Clms Page number 13>
und MMK3-Kinase-Aktivitaten waren nicht auf verschiedene Protein-Mengen zuruckzuführen, wie durch Immunoblotten der Protein-Extrakte mit entweder HA- oder MMK2-Antikorper gezeigt (Fig 8B), was darauf hinweist, dass SIMKK ein spezifischer Aktivator von SIMK, aber nicht für andere MAPKKs, ist.
SIMKK verstärkt die Salz-induzierte Aktivierung von SIMK
SIMK ist eine Salz-induzierbare MAPK, die durch moderate hyperosmotische Stress-Bedingun- gen aktiviert wird Die Behandlung von Zellen mit NaCI mit einer Konzentration von 250 mM führt zur SIMK-Aktivierung, mit einem Maximum bei etwa 10 min (Munnik et al , 1999) Um zu bestim- men, ob möglicherweise SIMKK bei der Vermittlung der SIMK-Aktivierung durch Salz eine Rolle spielt, wurden Petersilie-Zellen vorübergehend mit leerem Vektor (Fig. 9, Bahn 1), SIMK-HA- Expressionsvektor alleine (Fig 9, Bahnen 2 und 3) oder Expressionsvektoren von SIMK-HA und SIMKK (Fig 9, Bahnen 4 und 5) transferiert. Nach Immunprazipitation von SIMK mit HA-Antikorper wurde die SIMK-Kinase-Aktivitat durch in vitro-Kinase-Tests unter Verwendung von MBP als Sub- strat bestimmt.
Wenn es alleine expnmiert wurde, zeigte SIMK nur eine sehr geringe Kinase- Aktivität (Fig. 9A, Bahn 2) und wurde durch Salz-Stress-Behandlung nur geringfügig induziert (Fig. 9A, Bahn 3). Obwohl SIMK durch Co-Expression mit SIMKK aktiviert werden konnte (Fig 9A, Bahn 4), verstarkte der Salz-Stress diese Aktivierung betrachtlich (Fig 9A, Bahn 5) Wie durch Immunoblotten der Protein-Extrakte mit HA-Antikörper gezeigt (Fig 9B), lagen ähnliche SIMK- Protein-Mengen in den Zellenextrakten vor und können die Unterschiede in SIMK-Aktivitaten, die bei den lrnmunokinase-Tests beobachtet wurden, nicht erklaren Insgesamt zeigen diese Daten, dass SIMKK bei der Vermittlung der Salz-induzierten Aktivierung von SIMK eine Rolle spielt.
LITERATURSTELLEN
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D.D., Seidmann, J. G., Smith, J. A., und Struhl, K. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (New York. John Wiley & Sons)
Banno, H., Hirano, K., Nakamura, T., Irie, K., Nomoto, S., Matsumoto, K., und Machida, Y.
(1993) NPK1, a tobacco gene that encodes a protein with a domain homologous to yeast BCK1, STE11and BYR2 protein kineses. Mol Cell. Biol 13,4745-4752
Benfey, P., und Chua, N. (1990) The cauliflower mosaic virus 35S promoter combinatorial regulation of transcnption in plants Science 250,959-966
Bögre, L., Ligterink, W., Meskiene, 1., Barker, P.J., HeberleBors, E., Huskisson, N. S., und Hirt, H. (1997) Wounding induces the rapid and transient activation of a specific MAP kinase path- way. Plant Cell 9,75-83.
Bögre, L., Calderini, 0., Binarova, P., Mattauch, M., Till, S., Kiegerl, S., Jonak, C., Pol- laschek, C., Barker, P., Huskisson, N. S., Hirt, H., und Heberle-Bors, E. (1999) A MAP kinase is activated late in plant mitosis and becomes localized to the plane of cell division. Plant Cell 11, 101-114.
Breeden, L., und Nasmyth, K. (1985) Regulation of the yeast HO gene Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 50,643-650
Calderini, 0., Bogre, L., Vicente, 0., Binarova, P., Heberle-Bors, E., und Wilson, C. (1998).
A cell cycle regulated MAP kinase with a possible role in cytokinesis in tobacco cells J Cell Scl 111, 3091-3100
Canagarajah, B.J., Khokhlatchev, A., Cobb, M. H., und Goldsmith, E. J. (1997). Activation mechanism of the MAP kinase ERK2 by dual phosphorylation Cell 90, 859-869
Chang, C. (1996) The ethylene signal transduction pathway in Arabidopsis: an emerging para- digm? Trends Biochem Scl 21, 129-133.
Dangl, J. L., Hauffe, K. D., Lipphardt, S., Hahlbrock, K., und Scheel, D. (1987). Parsley pro- toplasts retain differential responsiveness to UV light and fungal elicitor EMBO J 6,2551-2556
Feilotter, H. E., Hannon, G. J., Ruddell, C. J., und Beach, D. (1994). Construction of an im- proved host strain for two hybrid screening Nucleic Acids Res 22,1502-1503
Fukuda, M., Gotoh, 1., Adachi, M., Gotoh, Y., und Nishida, E. (1997) A novel regulatory mechanism in the mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade Role of nuclear export signal
<Desc/Clms Page number 14>
of MAP kinase kinase. J. Biol. Chem. 272, 32642-32648.
Hackett, R.M., Oh, S. A., Morris, P. C., und Grierson, D. (1998). A tomato MAP kinase kinase gene differentially regulated during fruit development, leaf senescence, and wounding. Plant Physiol. 117,1526-1531.
Hardin, S. C., und Wolniak, S. M. (1998). Molecular cloning and charactenzation of maize ZmMEK1, a protein kinase with a catalytic domain homologous to mitogen- and stress-activated protein kinase kinases. Planta 206,577-584
Holmber, N., und Bülow, L. (1998). Improving stress tolerance in plants by gene transfer Trends PL Scl. 3, 61-66.
Holtorf, S., Apel, K., und Bohlmann, H. (1995). Comparison of different constitutive and in- ducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 29, 637-646.
Huttly, A., und Phillips, A. L. (1995). Gibberellin-regulated expression in oat aleurone cells of two kineses that show homology to MAP kinase and a ribosomal protein kinase. Plant Mol. Biol. 27, 1043-1052.
Ichimura, K., Mizoguchi, T., Hayashida, N., Seki, M., und Shinozaki, K. (1998a) Molecular cloning and characterization of three cDNAs encoding putative mitogen-activated protein kinase kinases (MAPKKs) in Arabidopsis thaliana DNA Res 5, 341-348.
Ichimura, K., Mizoguchi, T., Irie, K., Morris, P., Giraudat, J., Matsumoto, K., und Shino- zaki, K. (1998b). Isolation of ATMEKK1 (a MAP kinase kinase kinase)-interacting proteins and analysis of a MAP kinase cascade in Arabidopsis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 253,532- 543.
Jacobs, D., Glossip, D., Xing, H., Muslin, A. J., und Kornfeld, K. (1999). Multiple docking sites on substrate proteins form a modular system that mediates recognition by ERK MAP kinase.
Genes Dev. 13, 163-175.
James, P., Halladay, J., und Craig, E. A. (1996). Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybnd selection in yeast. Genetics 144,1425-1436
Jonak, C., Kiegerl, S., Lloyd, C., Chan, J., und Hirt, H. (1995). MMK2, a novel alfalfa MAP kinase, specifically complements the yeast MPK1 function Mol. Gen. Genet. 248,686-694.
Jonak, C., Kiegerl, S., Ligterink, W., Barker, P.J., Huskisson, N. S., und Hirt, H. (1996).
Stress signaling in plants' A mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought. Proc. Natl. Acad. Scl USA 93, 11274-11279.
Jonak, C., Ligterink, W., und Hirt, H. (1999). MAP kinases in plant signal transduction. Cell.
Mol. Life Sci. 55, 204-213.
Karin, M., und Hunter, T. (1995). Transcriptional control by protein phosphorylation: Signal transmission from the cell surface to the nucleus. Curr. Biol. 5,747-757.
Kieber, J. J., Rothenberg, M., Roman, G., Feldmann, K. A., und Ecker, J.R. (1993). CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the raf family of protein kinases Cell 72,427-441
Knetsch, M. L.W., Wang, M., Snaar-Jagalska, B. E., und Heimovaara-Dijkstra, S. (1996).
Abscisic acid induces mitogen-activated protein kinase activation in barley aleurone protoplasts Plant Cell 8, 1061-1067.
Köhler et al. (1996). A promoter for strong and ubiquitous anaerobic gene expression in tobacco Plant J. 10,175-183.
Kovtun, Y., Chiu, W. -L., Tena, G., und Sheen, J. (2000). Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants Proc. Natl. Acad Sci. USA 97, 2940-2945
Krebbers, E. et al. (1988). Four genes in two diverged subfamilies encode the ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase small subunit polypeptides of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol 11, 745-759.
Ligterink, W., und Hirt, H. (2000). MAP kinase pathways in plants' versatile signaling tools.
Int Rev Cytol., in Druck
Ligterink, W., Kroj, T., zur Nieden, U., Hirt, H., und Scheel, D. (1997) Receptor-mediated activation ofa MAP kinase in pathogen defense of plants Science 276,2054-2057
Lin, A., Minden, A., Martinetto, H., Claret, F.X., Lange-Carter, C., Mercurio, F., Johnson,
<Desc/Clms Page number 15>
G. L., und Karin, M. (1995) Identification of a dual specificity kinase that activates the Jun kineses and p38-Mpk2 Science 268,286-290.
Liu, Y., Zhang, S., und Klessig, D. F. (2000) Molecular cloning and charactenzation of a tobacco MAP kinase kinase that interacts with SIPK Mol Plant-Microbe Interact 13, 118-124.
Maleck, K., und Dietrich, R.A. (1999). Defense on multiple fronts : How do plants cope with diverse enemies? Trends Plant Scl. 4,215-219.
Mizoguchi, T., Gotoh, Y., Nishida, E., Yamaguchi-Shinozaki, K., Hayashida, N., Iwasaki, T., Kamada, H., und Shinozaki, K. (1994). Characterization of two cDNAs that encode MAP kinase homologues in Arabidopsis thaliana and analysis of the possible role of auxin in activating such kinase activities in cultured cells Plant J. 5, 111-122.
Mizoguchi, T., Ichimura, K, Irie, K., Morris, P., Giraudat, J., Matsumoto, K., und Shinozaki, K. (1998) Identification of a possible MAP kinase cascade in Arabidopsis thaliana based on pair- wise yeast two-hybrid analysis and functional complementation tests of yeast mutants. FEBS Lett.
437, 56-60
Morris, P. C., Guerrier, D., Leung, J., und Giraudat, J. (1997) Cloning and charactensation of MEK1, an Arabidopsis gene encoding a homologue of MAP kinase kinase Plant Mol Biol 35, 1057-1064.
Munnik, T., Ligterink, W., Meskiene, 1., Calderini, 0., Beyerly, J., Musgrave, A., und Hirt, H. (1999). Distinct osmo-sensing protein kinase pathways are involved in signalling moderate and severe hyper-osmotic stress Plant J. 20,381-388.
Raghothama et al., (1993) Analysis of an osmotically regulated pathogenesis-related osmotin gene promoter Plant Mol Biol. 23 1117-1128
Robinson, M. J., und Cobb, M. H. (1997) Mitogen-activated protein kinase pathways Curr Opin Cell Biol. 9,180-186
Robzyk, K., und Kassir, Y. (1992) A simple and highly efficient procedure for resuing autonomous plasmids from yeast Nucleic Acids Res. 20,3790
Rocha-Sosa, M. et al. (1989). Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class l patatin gene. EMBO J. 8, 23-29
Romeis, T., Piedras, P., Zhang, S., Klessig, D. F., Hirt, H., und Jones, J. D. (1999) Rapid Avr9- and Cf-9-dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves. Conver- gence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses Plant Cell 11,273-287
Schiestl, R.H., und Gietz, R.D.
(1989) High efficiency transformation of mtact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier Curr Genet. 16,339-346.
Seo, S., Okamoto, M., Seto, H., Ishizuka, K., Sano, H., und Ohashi, Y. (1995) Tobacco MAP kinase : Apossible mediator in wound signal transduction pathways. Science 270,1988-1992.
Seo, S., Sano, H., und Ohashi, Y. (1999) Jasmonate-based wound signal transduction re- quires activation of WIPK, a tobacco mitogen-activated protein kinase. Plant Cell 11, 289-298
Sherman, F., Fink, G.R., und Hicks, J. B. (1979) Methods in Yeast Genetics. (Cold Spring Harbor, NY Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Shibata, W., Banno, H., Ito, Y., Hirano, K., Irie, K., Usami, S., Machida, C., und Machida, Y.
(1995) A tobacco protein kinase, NPK2, has a domain homologous to a domain found in activators of mitogen-activated protein kineses (MAPKKs) Mol. Gen. Genet 246,401-410
Somssich, LE., und Hahlbrock, K. (1998) Pathogen defence in plants A paradigm of biologi- cal complexity Trends Plant Scl. 3, 86-90.
Stokoe, D., Campbell, D. G., Nakielny, S., Hidaka, H., Leevers, S.J., Marshall, C., und Cohen, P. (1992) MAPKAP kinase-2: A novel protein kinase activated by mitogen-activated pro- tein kinase EMBO J 11, 3985-3994.
Stratmann, J. W., und Ryan, C.A. (1997) Myelin basic protein kinase activity in tomato leaves is induced systemically by wounding and increases in response to Systeme and oligosacchande elicitors Proc Natl. Acad. Sci. USA 94,11085-11089
Tanoue, T., Adachi, M., Moriguchi, T., und Nishida, E. (2000) A conserved docking motif in MAP kinases common to substrates, activators and regulators. Nat Cell Biol 2,110-116
Teague, M.A., Chaleff, D. T., und Errede, B. (1986) Nucleotide sequence of the yeast regula- tory gene STE7 predicts a protein homologous to protein kinases. Proc Natl. Acad Sci USA 83, 7371-7375
<Desc/Clms Page number 16>
Töpfer, R., Matzeit, V., Gronenborn, B., Schell, J., und Steinbiss, H.-H. (1987). A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions. Nucleic Acids Res. 15,5890.
Tsuda, L., Inoue, Y. H., Yoo, M. A., Mizuno, M., Hata, M., Lim, Y. M., Adachi-Yamada, T., Ryo, H., Masamune, Y., und Nishida, Y. (1993). A protein kinase similar to MAP kinase activator acts downstream of the raf kinase in Drosophila. Cell 72,407-414.
Usami, S., Banno, H., Ito, Y., Nishihama, R., und Machida, Y. (1995). Cutting activates a 46-kilodalton protein kinase in plants. Proc. Natl. Acad SCl. USA 92,8660-8664.
Whitmarsh, A. J., und Davis, R. J. (1996) Transcription factor AP-1 regulation by mitogen- activated protein kinase signal transduction pathways J Mol. Med. 74,589-607.
Wilson, C., Voronin, V., Touraev, A., Vicente, 0., und Heberle-Bors, E. (1997) A develop- mentally regulated MAP kinase activated by hydration in tobacco pollen. Plant Cell 9,2093-2100.
Xia, Y., Wu, Z., Su, B., Murray, B., und Karin, M. (1998) JNKK1 organizes a MAP kinase module through specific and sequential interactions with upstream and downstream components mediated by its amino-terminal extension. Genes Dev 12, 3369-3381
Zhang, F., Strand, A., Robbins, D., Cobb, M. H., und Goldsmith, E. J. (1994) Atomic struc- ture of the MAP kinase ERK2 at 2. 3 A resolution Nature 367, 704-711
Zhang, S., und Klessig, D. F. (1997) Salicylic acid activates a 48-kD MAP kinase in tobacco.
Plant Cell 9,809-824 US 5,977,422
Zhang, S., und Klessig, D. F. (1998). The tobacco wounding-activated mitogen-activated pro- tein kinase is encoded by SIPK. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95,7225-7230.
Zhang, S., Du, H., und Klessig, D. F. (1998). Activation of the tobacco SIP kinase by both a cell wall-denved carbohydrate elicitor and punfied proteinaceous elicitins from Phytophthora spp Plant Cell 10, 435-450.
Zheng, C. F., und Guan, K. L. (1993). Cloning and characterization of two distinct human ex- tracellular signal-regulated kinase activator kinases, MEK1 and MEK2. J. Biol. Chem. 268,11435- 11439.
PATENTANSPRÜCHE:
1 Protein mit einer Mitogen-aktivierten Protein-Kinase-Kinase-Aktivitat (MAPKK-Aktivität), gekennzeichnet durch . a) die Aminosäuresequenz, wie in Fig. 1 angegeben, oder . b) ein Fragment der Aminosäuresequenz, wie in Fig. 1 angegeben, welches mindestens die 11 Kinase-Domänen, wie in Fig 2A angegeben, aufweist, oder . c) eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Identität mit der Aminosauresequenz, wie in Fig. 1 angegeben, bei Bestimmung mit dem FAST/A-Algonthmus, und wobei das Protein mit der Aminosauresequenz a), b) oder c) weiters eine aktivierende
Aktivitat auf die Salz-Stress-induzierte MAP-Kinase (SIMK) aufweist.