ES2348164T3 - Secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar como cebadores y sondas en la amplificacion y la detección de adn de vhs y método para la amplificación y deteccion de adn de vhs usando una amplificación y detección de adn de vhs usando una amplificación basada en la transcripción. - Google Patents

Secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar como cebadores y sondas en la amplificacion y la detección de adn de vhs y método para la amplificación y deteccion de adn de vhs usando una amplificación y detección de adn de vhs usando una amplificación basada en la transcripción. Download PDF

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ES2348164T3 ES05808224T ES05808224T ES2348164T3 ES 2348164 T3 ES2348164 T3 ES 2348164T3 ES 05808224 T ES05808224 T ES 05808224T ES 05808224 T ES05808224 T ES 05808224T ES 2348164 T3 ES2348164 T3 ES 2348164T3
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Abstract

Un par de cebadores de oligonucleótido para la amplificación del ácido nucleico del virus del herpes simple (VHS) que comprende: a) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'- ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3', y b) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'- CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3'.

Description

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que pueden usarse en el campo del diagnóstico de virus, más específicamente, en el diagnóstico de infecciones del virus del herpes simple (VHS). La invención también se refiere a un método de amplificación basado en la transcripción para la amplificación de dianas de ADN usando tales secuencias de ácidos nucleicos.
Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos se usan en el campo de la biología molecular y la tecnología del ADN recombinante. Estos métodos se usan para cantidades
aumentar el número de copias de una secuencia de ácido nucleico particular, presente en
en pequeñas y a menudo un ambiente en el cual también están presentes una amplia variedad de otras secuencias de ácidos nucleicos, tanto de ARN como de ADN. En particular, los métodos de amplificación de ácidos nucleicos se usan para facilitar la detección o cuantificación de ácidos nucleicos y son importantes para diagnosticar, por ejemplo, enfermedades infecciosas, enfermedades hereditarias y varios tipos de cáncer. También se han encontrado aplicaciones de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos en otros campos en los que se investigan muestras en las que el ácido nucleico puede estar presente en cantidades minutas, tales como en la ciencia forense, arqueología o para establecer la paternidad.
Se conocen varias técnicas de amplificación de ácidos nucleicos basadas en diferentes mecanismos de acción. Se conoce el método de amplificación de ácidos nucleicos con el nombre "reacción en cadena de la polimerasa" (PCR) descrito en las solicitudes de patente EP-A-0.200.362 y EP-A-0.201.148.
La presente invención también se refiere a una clase diferente de métodos de amplificación de ácidos nucleicos, a saber, "técnicas de amplificación basadas en la transcripción". Con estos métodos, se obtienen múltiples copias de ARN a partir de una plantilla de ADN que comprende un promotor funcional reconocido por la ARN polimerasa. Dichas copias de ARN se usan como diana a partir de la cual se obtienen nuevas plantillas de ADN, etc. Gingeras et al. en el documento WO-A-88/10315 y Burg et al. en el documento WO-A-89/1050 han descrito dichos métodos. Se han descrito técnicas de amplificación basadas en la transcripción isotérmica por Davey en el documento EP-A-0.323.822 (que se refiere al método NASBA), por Gingeras et al. en el documento EP-A-0.373.960 y por Kacian et al. en el documento EP-A-0.408.295. Las reacciones de amplificación basadas en la transcripción también pueden realizarse con enzimas termoestables. Las amplificaciones basadas en la transcripción se realizan por lo general a una temperatura alrededor de los 41 grados Celsius. Las enzimas termoestables permiten que la reacción sea realizada a temperaturas más elevadas. Dicho método termoestable se describe en el documento EP-A-0.682.121 presentado en nombre de Toyo Boseki KK.
Los métodos que se describen en los documentos EP-A-0.323.822, EP-A
0.373.960 y EP-A-0.408.295 son métodos isotérmicos continuos. Con estos métodos, se requieren cuatro actividades enzimáticas para conseguir la amplificación:
imagen1 una actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN, imagen1 una actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN, imagen1 una actividad de RNAsa (H) y imagen1 una actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN.
Algunas de estas actividades pueden combinarse en una enzima de modo que por lo general sólo son necesarias dos o tres enzimas. La transcriptasa inversa, tal como la transcriptasa inversa de AMV (virus de la mieloblastosis aviar) o MMLV (virus de la leucemia murina de Moloney) tienen tanto actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN como de ADN, y también actividad de inherente de RNAsa H. Además, puede añadirse una RNAsa a la mezcla de reacción de una reacción de amplificación basada en la transcripción, tal como la RNAsa H de E. coli.
Las ARN polimerasas dependientes del ADN sintetizan múltiples copias de ARN a partir de una plantilla de ADN incluyendo un promotor reconocido por la ARN polimerasa. Ejemplos de ARN polimerasas son las polimerasas de E. coli y bacteriofagos T7, T3 y SP6. Un ejemplo de una ARN polimerasa comúnmente usada con los métodos de amplificación basados en la transcripción es la polimerasa T7. Así, el promotor que se incorpora en la plantilla usada para producir múltiples copias del ARN sería entonces el promotor T7. Por lo general, la plantilla que comprende al promotor tiene que ser creada comenzando a partir del ácido nucleico que comprende la secuencia diana. Dicho ácido nucleico puede estar presente en el material de partida que se usa como entrada para la reacción de amplificación. El ácido nucleico presente en el material de partida contendrá por lo general la secuencia diana como parte de una secuencia mucho más larga. Pueden estar presentes otras secuencias de ácidos nucleicos tanto en el extremo 3' como en el 5' de la secuencia diana. La reacción de amplificación puede comenzarse juntando este ácido nucleico del material de partida, las enzimas apropiadas que proporcionan juntas las actividades anteriormente mencionadas y al menos uno, aunque por lo general dos oligonucleótido(s). Al menos, uno de estos oligonucleótidos debe comprender la secuencia del promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN.
Los métodos de amplificación basados en la transcripción son útiles, en particular, si el material de entrada es el ARN monocatenario, aunque pueda ser igualmente usado ADN monocatenario o bicatenario como material de entrada. Cuando se realiza un método de amplificación basado en la transcripción en una muestra con ARN monocatenario con otras secuencias tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de la secuencia diana el par de oligonucleótidos que se usan adecuadamente con los métodos que se describen en la técnica anterior consiste en:
-un primer oligonucleótido (denominado de forma general "promotor-cebador" "o
cebador directo") que es capaz de hibridarse al extremo 3' de la secuencia diana,
cuyo oligonucleótido tiene la secuencia de un promotor (preferiblemente el
promotor T7) unida a su extremo 5' (la parte que se hibrida de este oligonucleótido
tiene una polaridad opuesta cuando se usa el ARN diana como material de
entrada),
-un segundo oligonucleótido (denominado de forma general "cebador inverso")
que comprende el extremo 5' de la secuencia diana (este oligonucleótido tiene la
misma polaridad que el ARN diana).
Cuando se reúnen en una mezcla de reacción dicho par de oligonucleótidos, junto con todas las enzimas que tienen las actividades apropiadas y un aporte suficiente de los ribonucleótidos y desoxiribonucleotidos necesarios y se mantienen en las condiciones apropiadas (es decir, en las condiciones de tampón apropiadas y a la temperatura apropiada) durante un período suficiente de tiempo comenzará una reacción de amplificación isotérmica continua. Se han descrito muchas variantes del anterior tema en la técnica anterior. Una reacción de amplificación basada en la transcripción comprende la síntesis de transcripciones de ARN monocatenario a partir de una plantilla que comprende a un promotor (p.ej, el promotor T7) que es reconocido por una ARN polimerasa (p.ej, la ARN polimerasa de T7). Un cebador directo, que comprende la secuencia del promotor, sirve como cebador para iniciar la síntesis de una cadena de ADN complementario respecto al ARN diana.
El cebador será amplificado por la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN. La RNAsa H degradará el híbrido ARN-cADN formado. Esto permite la hibridación del cebador inverso específico al cADN. La extensión de este cebador por la ADN polimerasa dependiente de ADN hasta el extremo 5' del cADN causa la formación de una secuencia del promotor bicatenaria, por lo cual la secuencia del promotor que era parte del cebador directo se usa como plantilla. Este promotor bicatenario será usado entonces por la ARN polimerasa dependiente de ADN para producir muchas nuevas moléculas de ARN que son complementarias al ARN diana. Después de esta fase de iniciación, la amplificación entra en una fase cíclica.
En la práctica, se producirá la secuencia entera de acontecimientos, que comienza a partir del ARN monocatenario en la muestra, tan pronto como todos los ingredientes sean reunidos y la mezcla se ponga a la temperatura apropiada para que todas las enzimas sean activadas. El operador del método no tiene que intervenir para llevar a cabo ninguna de estas etapas.
Como se explica antes, los métodos de amplificación basados en la transcripción son particularmente útiles para amplificaciones que comienzan a partir del ARN monocatenario. El material de partida que contiene el ácido nucleico que se amplifica puede no contener el ácido nucleico diana como ARN de una longitud definida. Cuando se realiza un método de amplificación basado en la transcripción en el material de partida que comprende la secuencia diana sólo como ADN bicatenario, circular o lineal, el ADN tiene que ser convertido a ácido nucleico monocatenario. Esto puede conseguirse separando las cadenas de ADN bicatenario aplicando una temperatura elevada (hasta unos 100 grados Celsius). El primero de los oligonucleótidos usados como cebadores de amplificación puede entonces hibridarse a una de las cadenas sencillas. Las enzimas usadas con los actuales métodos de amplificación basados en la transcripción no pueden resistir una temperatura tan alta y por consiguiente sólo pueden añadirse después de que las cadenas de ADN hayan sido separadas. Cuando uno de los oligonucleótidos se hibrida a un ADN monocatenario y se amplifica, se crea el ADN bicatenario otra vez, y la mezcla de reacción tiene que someterse a una temperatura elevada suficientemente alta para fusionar el ADN bicatenario en sus cadenas separadas otra vez. De nuevo, las enzimas estarían inactivadas y deben añadirse nuevas enzimas después de que haya sido aplicada la etapa de calor. El segundo oligonucleótido puede añadirse ahora e hibridarse a la cadena que fue creada a partir del primer oligonucleótido amplificado en la primera etapa. Cuando uno de los oligonucleótidos incluye una secuencia del promotor 5' de una ARN polimerasa dependiente de ADN (véase más arriba), se obtiene una plantilla de ADN bicatenario incluyendo un promotor funcional bicatenario, a partir del cual puede darse una primera etapa de producción de ARN. Las transcripciones de ARN resultantes pueden entrar en la fase cíclica de amplificación y el proceso puede ser entonces isotérmico.
A partir de lo anterior, es evidente que comenzar con un método de amplificación basado en la transcripción a partir del ADN bicatenario puede ser un proceso tedioso. Requiere que sean tomadas diversas acciones específicas por el técnico; la muestra tiene que calentarse y enfriarse repetidamente y las enzimas tienen que reponerse después de cada etapa de calentamiento.
Alguna investigación se ha introducido ya en el desarrollo de métodos de amplificación basados en la transcripción que pueden comenzar a partir de ADN bicatenario, evitando el tedioso procedimiento descrito más arriba para convertir el ADN bicatenario en ARN monocatenario que puede usarse como entrada para la amplificación basada en la transcripción isotérmica cíclica.
Un método de amplificación basado en una transcripción bastante simple para dsADN se ha descrito en el documento WO-A-99/25868. Según el método descrito en este documento, puede ser amplificado el ADN bicatenario en una muestra por medio de un protocolo de amplificación basado en la transcripción directamente, sin ninguna etapa de tratamiento por calor (de más de 90°C) en absoluto, o -en una realización preferida -con sólo una etapa de calentamiento inicial. Dicho ADN bicatenario, que es relativamente corto, debe ser preferido en este método. Realmente, el método no se diferencia esencialmente de un protocolo convencional de amplificación basado en la transcripción para amplificar el ARN monocatenario.
O bien, puede transcribirse el ADN bicatenario en el material de partida dentro del ARN antes del inicio de la amplificación. Dicha etapa suplementaria puede estar basada en una enzima, por ejemplo la ARN polimerasa de E. coli, que transcribe el ADN bicatenario en ARN sin que esté presente la secuencia del promotor, también conocido como sitio de unión de la polimerasa. Se ha descrito dicho proceso de etapas suplementarias para facilitar la amplificación del ADN bicatenario por los métodos de amplificación basados en la transcripción en la solicitud de patente WO-A-96/02668. Las etapas suplementarias descritas en este procedimiento no sólo incluyen etapas extra de manipulación y de tiempo de manipulación, sino también el uso de otros ingredientes, es decir, la ARN polimerasa de E. coli.
Otro modo para preparar plantillas adecuadas para los métodos de amplificación basados en la transcripción para el ADN bicatenario se describe en el documento EPA-0.397.269. En esta patente, se describe un método mediante el cual el ADN bicatenario se trata previamente con una enzima de restricción. Después del tratamiento con la enzima de restricción, sólo es necesaria una etapa de separación por calor para crear el ADN monocatenario. Con este método, se usa un cebador directo (promotor-cebador) que tiene un parte de 3' que incluye una secuencia que es complementaria al extremo 3' exacto de una de las cadenas sencillas del ADN y un extremo 5' que incluye una secuencia promotor reconocida por una ARN polimerasa (por ejemplo, la ARN polimerasa de T7). Cuando el promotor-cebador se hibrida al extremo 3' de la cadena sencilla del ADN se forma un complejo bicatenario, del cuya secuencia del 5'-promotor del cebador directo puede servir como una plantilla para una reacción de amplificación que comienza a partir del extremo 3' de la cadena de ADN. Así, una ADN polimerasa dependiente de ADN forma un promotor bicatenario y el complejo que resulta puede servir como plantilla para la ARN polimerasa dependiente de ADN para sintetizar múltiples copias del ARN.
En el documento WO-A-91/04340 también se describen diversos métodos para comenzar una reacción de amplificación basada en la transcripción para el ADN monocatenario. De nuevo, puede usarse una enzima de restricción para crear un extremo 3' apropiado en el ADN, que se puede hibridar con una secuencia de 3' de un promotor-cebador. En otra realización del mismo método, se usa una enzima de restricción que corta el ADN bicatenario, junto con un oligonucleótido de restricción que se hibrida al ADN monocatenario diana creándose así un trozo bicatenario de ADN que puede ser cortado por la enzima de restricción para crear el extremo 3' apropiado. También se describe cómo puede ser creado el extremo 3' definido en el ADN monocatenario usando una enzima de restricción que corta el ADN monocatenario.
Con este método, quedará un pequeño trozo del oligonucleótido de restricción después de que la enzima de restricción haya cortado el complejo bicatenario. Sin embargo, según la descripción de la solicitud WO-A-91/04340, el oligonucleótido de restricción se elige, por lo visto, de tal modo que después de la digestión, el trozo restante será demasiado pequeño para quedarse hibridado al extremo 3' del ADN monocatenario, y por eso se caerá para hacer sitio para el oligonucleótido del promotor. Sin embargo, el tratamiento previo con una enzima de restricción como se usa con los métodos de la técnica anterior, aunque pueda dar lugar a un ensayo basado en la transcripción sensible, requiere muchas etapas de manipulación suplementarias y tiempo de manipulación.
El solicitante ha presentado ya una solicitud de WO-A-02/072881 sobre un método de amplificación basado en la transcripción que incluye una digestión de la enzima de restricción. Esta invención proporciona un método de amplificación basado en la transcripción que permite una amplificación sensible y específica (y la detección subsecuente) del ADN. Con el método de la invención, el ADN puede ser amplificado y detectado de un modo más eficiente que con los métodos de amplificación basados en la transcripción de la técnica anterior. En contraste con los métodos de la técnica anterior, el uso de una enzima de restricción no complica el procedimiento de amplificación. Este método para la amplificación basada en la transcripción de una secuencia de ácido nucleico diana comienza a partir del ADN opcionalmente presente en una muestra, y comprende las etapas de: imagen1 incubar la muestra en un tampón de amplificación con:
-una o varias enzimas de restricción capaces de dividir el ADN en un sitio de restricción seleccionado, creando dicha enzima de restricción un extremo 3' definido sobre una de las cadenas de ADN,
-un promotor-cebador, teniendo dicho promotor-cebador una región 5' que comprende la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente del ADN y una región de 3' complementaria al extremo 3' definido de la cadena de ADN,
-un segundo cebador, que tiene la polaridad opuesta del promotor-cebador y que comprende el extremo 5' de la secuencia diana, y -en el caso de un ADN monocatenario, un cebador de restricción,
imagen1 mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra una digestión por la enzima de restricción,
imagen1 someter la muestra a un tratamiento térmico a una temperatura y tiempo suficientes para inactivar a la enzima de restricción y/o forzar que un ADN bicatenario se vuelva monocatenario,
imagen1 enfriar para hibridar los cebadores y permitir la adición de enzimas,
imagen1 añadir los siguientes reactivos a la muestra: -una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN, -una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN -una enzima que tiene actividad de RNAsa H -una enzima que tiene actividad de ARN polimerasa, y
imagen1 mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra la amplificación.
Este método ha mostrado un modo eficiente para amplificar la cadena de ADN usando un método de amplificación basado en la transcripción. Se proporcionó la demostración para un ensayo de HBV, sin embargo podría ser detectado/amplificado otro virus de ADN usando esta tecnología, además del método de amplificación convencional, tal como la PCR.
Así, el VHS es el virus más comúnmente detectado en los laboratorios diagnósticos, representando más del 40 % de los virus que fueron detectados en cultivos celulares durante un período de 25 años. El VHS causa una variedad de síndromes clínicos, y los sitios anatómicos infectados incluyen piel, labios, cavidad bucal, ojos, tracto genital y sistema nervioso central.
Puede ocurrir una infección por VHS generalizada o diseminada en pacientes inmunológicamente comprometidos por neoplasia, trasplante de órganos, enfermedad de inmunodeficiencia hereditaria o SIDA, o por infección neonatal adquirida por la transmisión del virus a través de un canal de nacimiento infectado. Cuanto más diseminada está la enfermedad más fatal es.
Los virus del herpes comprenden una gran familia de virus de ADN bicatenario. Ocho de los virus del herpes, virus del herpes simple tipo 1 y 2 (VHS-1 y VHS-2), virus varicela zóster (VVZ), citomegalovirus humano (CMVH), virus de Epstein-Barr (VEB) y virus de herpes humano 6, 7 y 8 (VHH-6, VHH-7 y VHH-8), se ha demostrado que infectan a los seres humanos. Varios de estos virus son patógenos humanos importantes.
Los dos principales son el VHS-1 y VHS-2.
Se estima que el VHS-1 afecta a 100 millones de personas en los Estados Unidos. La infección primaria del VHS-1 por lo general ocurre entre los uno y cuatro años. Los herpes labiales, el síntoma visible, aparecen típicamente a una edad posterior, estando afectados el 20-45 % de la población sobre la edad de quince años (Whitley, Clin. Intect. Dis., 26:541-555, 1998).
El herpes genital (VHS-2) es la segunda enfermedad de transmisión sexual más común, estando aproximadamente el 22 % de la población estadounidense infectada por este virus (Fleming 1997). Tenorio et al. (1993), Journal of Virologic Methods 44, 261-269 describen un método para la detección y la clasificación del VHS por la PCR multiplexor.
La presente invención es un método para evaluar una muestra biológica para detectar la presencia o la ausencia del VHS mediante el uso de una reacción de amplificación, tal como la PCR o cualquier método de amplificación basado en la transcripción que pudiera permitir la amplificación del ADN, por ejemplo un método de amplificación basado en la transcripción que incluya una digestión de la enzima de restricción. Los cebadores se seleccionan a partir de un grupo de potenciales secuencias de interés, uno estará en una orientación 5'-3', y el otro cebador estará en la orientación complementaria inversa. Los otros cebadores serán capaces de amplificar tanto VHS tipo 1 como VHS tipo 2. La exposición es bajo condiciones en las cuales los cebadores amplificarán una(varias) secuencia(s) del virus simple humano 1 y/o virus simple humano 2 si al menos una secuencia está presente. La muestra se examina entonces para determinar si existe un producto de amplificación. La presencia de un producto de amplificación indica que la muestra contiene el VHS.
La presente invención comprende además exponer los productos de amplificación a sondas de oligonucleótidos diseñadas para discriminar o no entre los dos tipos 1 y 2 del VHS.
Por lo tanto, la invención se refiere a un par de cebadores de oligonucleótidos para la amplificación del ácido nucleico del virus del herpes simple (VHS) que comprende:
a) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
5'-ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3', o su secuencia complementaria y
b) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
5'-CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3', o su secuencia complementaria.
En una realización particular del par de cebadores de oligonucleótido, al menos uno de dichos oligonucleótidos está operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico del promotor y esto es verdadero para todos los pares de cebadores descritos en esta aplicación.
La presente aplicación se refiere además a una sonda de oligonucleótido tipo no específica para la detección de VHS tipo 1 y/o tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en:
5'-GAAAAAGTACATCGGCGTCATCT-3', o su secuencia complementaria.
Además en este documento se describe una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección del VHS tipo 1, que tiene 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente que tiene 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en:
5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3', o su secuencia complementaria.
Además, se describe una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección del VHS tipo 2, que tiene 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 1035 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en:
5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3', o su secuencia complementaria.
Se describe además un par de sondas de oligonucleótido específicas del tipo para la detección del VHS tipo 1 y tipo 2, que tienen 10-50 nucleótidos de longitud, que tienen preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en:
5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3' [tipo 1], y
5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3' [tipo 2],
o sus secuencias complementarias.
Otro objetivo de la invención es un método para amplificar un ADN de VHS diana opcionalmente presente en una muestra, que comprende las etapas de,
-incubar la muestra en un tampón de amplificación con:
imagen1 una o varias enzimas de restricción capaces de dividir el ADN del
VHS en un sitio de restricción seleccionado, creando dicha enzima de
restricción un extremo 3' definido sobre una de las cadenas de ADN, y
imagen1 un promotor-cebador, teniendo dicho promotor-cebador una región 5' que comprende la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente del ADN y una región 3' que comprende la secuencia de un primer cebador y complementaria al extremo 3' definido de la cadena de ADN, teniendo el primer cebador 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
5'-CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3', o su secuencia complementaria,
imagen1 un segundo cebador, que tiene la polaridad opuesta del promotorcebador y que comprende el extremo 5' de la secuencia diana, teniendo el segundo cebador 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
5'-ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3', o su secuencia complementaria,
-mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra una digestión por la enzima de restricción, en presencia de los trifosfatos de nucleosido apropiados, y,
-someter la muestra así obtenida a un tratamiento térmico a una temperatura y tiempo suficientes para inactivar la(s) enzima(s) de restricción y/o, opcionalmente, producir al menos parcialmente el bicatenario monocatenario,
-añadir los siguientes reactivos a la muestra:
imagen1 una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN, imagen1 una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN, imagen1 una enzima que tiene actividad de RNAsa H, imagen1 una enzima que tiene actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y
-mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra la amplificación.
En una realización particular del método, el ADN es el ADN bicatenario de VHS.
En otra realización particular del método, el ADN es monocatenario y la función del promotor-cebador y la función del cebador de restricción son combinadas en la utilización de un promotor combinado y comprendiendo el cebador de restricción una secuencia complementaria a la región que incluye el sitio de restricción del ADN monocatenario diana y la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente del ADN.
De nuevo, en otra realización particular del método, se usa una transcriptasa inversa combinando las actividades de la enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN y de la enzima que tiene actividad de ADN dependiente de ADN.
El método según la invención propone una transcriptasa inversa que se usa con actividad inherente de RNAsa H sustituyendo tres enzimas, a saber la enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN, la enzima que tiene actividad de ADN dependiente de ADN así como la enzima que tiene actividad de RNAsa H.
En otra realización particular del método, la temperatura de incubación es de 35°C a aproximadamente 45°C y preferiblemente aproximadamente 37-41°C.
En otra realización particular del método, la etapa de calentamiento se realiza a una temperatura entre 92°C y 98°C y preferiblemente a aproximadamente 95°C.
Otra vez, en otra realización particular del método, se usa una enzima de restricción que corta el ADN de VHS en un sitio que está conservado entre los diferentes genotipos de VHS.
Otro objeto de la presente invención es un método para la detección de ácido nucleico de VHS en una muestra en la que la muestra se somete a una reacción de amplificación de ácido nucleico usando un par de oligonucleótidos, según los anteriores oligonucleótidos descritos, y los reactivos de amplificación adecuados y se detecta la presencia de cualquier ácido nucleico amplificado.
En una realización particular de este método, la detección de cualquier ácido nucleico amplificado se realiza haciendo reaccionar la muestra con al menos un oligonucleótido, según los anteriores oligonucleótidos descritos, en condiciones de hibridación adecuadas y detectando la presencia del marcador en cualquier híbrido formado entre la secuencia amplificada y la(s) sonda(s).
La técnica de amplificación usada es una técnica de amplificación basada en la transcripción, preferiblemente NASBA, y se proporciona el primer oligonucleótido de una secuencia del promotor reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN.
La invención también propone un método para la detección de VHS en una muestra, comprendiendo las etapas de:
(a)
amplificar el ADN de VHS según el método expuesto anteriormente para obtener el ARN monocatenario,
(b)
hibridar al ARN amplificado una sonda de oligonucleótido no específica del tipo y/o sondas de oligonucleótido específicas del tipo, según las sondas que se describen anteriormente; y
(c)
detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.
La invención se refiere a un método específico por la detección del VHS tipo 1 en una muestra, que comprende las etapas de:
(a)
amplificar el ADN de VHS, según los métodos de amplificación que se describen anteriormente, para obtener el ARN monocatenario,
(b)
hibridar al ARN amplificado una sonda de oligonucleótido específica, según la sonda específico del tipo 1 que se describe anteriormente y
(c)
detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.
La invención se refiere también a otro método específico para la detección del VHS tipo 2 en una muestra que comprende la misma etapa de amplificación, pero usando una sonda de oligonucleótido tipo específico 2, permitiendo este método la detección de los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.
La presente invención propone incluso el uso de un par de oligonucleótidos, descritos anteriormente, en una reacción de amplificación del ácido nucleico o como una sonda para la detección del ácido nucleico de VHS en una muestra.
También es parte de esta invención un kit de ensayo para la detección del VHS en una muestra. El kit comprende:
-el grupo de oligonucleótidos identificado anteriormente,
-un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico
sustancialmente complementaria a al menos parte de la secuencia de ácido
nucleico amplificada, provista de un marcador detectable,
-los reactivos de amplificación adecuados,
-opcionalmente, al menos una enzima de restricción.
La invención se refiere incluso a un kit para detectar y, opcionalmente, identificar VHS en una muestra, en el que el kit comprende un par de cebadores, en el que el primer cebador comprende una secuencia promotora de la ARN polimerasa y una secuencia hibridante y que tiene 10-50 nucleótidos de longitud y, preferiblemente, que tiene 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en 5'-CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3', y que tiene la secuencia del segundo cebador 10-50 nucleótidos de longitud, y que tiene preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en 5'ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3'.
En una realización particular del kit, además comprende una sonda de oligonucleótido que contiene una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse a la región del ADN amplificado usando el primer cebador y el segundo cebador.
Finalmente, la invención se refiere a un kit de ensayo, que incluye los reactivos de amplificación adecuados para realizar una técnica de amplificación basada en la transcripción, preferiblemente NASBA.
La invención será descrita de aquí en adelante mediante ejemplos con referencia a los dibujos que acompañan, en los que:
imagen1 FIGURA 1: Representación esquemática del ADN NASBA que incluye la digestión de la enzima de restricción. La enzima de restricción (flecha) está sólo activa durante la fase de iniciación de NASBA. Después de la digestión, el cebador directo se hibrida a la plantilla. La AMV RT ampliará el extremo 3' de la cadena diana (negro) del ADN, usando el cebador directo, que incluye la secuencia promotora T7 (oscuro gris) como plantilla. El T7 DdRp reconocerá la secuencia promotora T7 bicatenaria y comenzará la producción del amplicón de ARN (gris claro). La secuencia del amplicón de ARN es complementaria a la cadena de ADN diana. Durante la fase cíclica, el amplicón de ARN será amplificado y detectado mediante tecnología de balizas moleculares. La RNAsa H y el cebador inverso sólo son requeridos durante la fase cíclica.
imagen1 FIGURA 2: Amplificación del ADN de VHS con diferentes grupos de cebador. El NASBA fue realizado en presencia y ausencia de ApaI y SalI. Se analizaron cuatro diferentes grupos de cebador POL de VHS: P1.1/P2.1, P1.1/P2.2, P3.1/P4.1, P3.2/P4.1 (Tabla 1). Se usó como plantilla una serie de dilución de 10 veces de un ADN lineal que incluía parte de la región POL de VHS del VHS 1 o VHS 2. Se usaron las balizas moleculares genéricas OTMB8515 y OTMB8516 para detectar la cadena menos y la cadena más tanto del VHS tipo 1 como del VHS tipo 2, respectivamente.
imagen1 FIGURA 3: Amplificación del ADN de VHS incluyendo la digestión de Apa I. Se analizó una serie de dilución de Apa I. Se usa como cebador directo el POL P1.1 de VHS, P2.2 como cebador inverso y OTMB8516 como baliza molecular (Tabla 1). Se usa como plantilla una dilución de 105 veces de un extracto de muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 (cepa SC16).
imagen1 FIGURA 4: Amplificación del ADN de VHS incluyendo la digestión SalI. Se analizó una serie de dilución de Sal I. Se usa como cebador directo POL P1.1 de VHS, P2.2 como cebador inverso y OTMB8516 como baliza molecular (Tabla 1). Se usa como plantilla una dilución de 105 veces de un extracto de muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 (cepa SC16).
imagen1 FIGURA 5: Amplificación de muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 incluyendo la digestión de Apa I y Sal I. Se analizó una serie de dilución de una muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 (cepa SC16) en ausencia y presencia de las enzimas de restricción Apa I y Sal I. Se usan el grupo de cebador P1.1/P2.2 y la baliza genérica OTMB8516 (Tabla 1).
imagen1 FIGURA 6: Detección específica de VHS tipo 1 y VHS tipo 2 incluyendo la digestión de Apa I y Sal I. Para la detección específica del ADN de VHS tipo 1 y VHS tipo 2, se diseñaron balizas moleculares específicas en el área de amplificación del POL-gen de VHS usando el grupo de cebador POL P1.1/P2.2. La baliza molecular OTMB8547 es específica para la detección de VHS tipo 1 y la baliza molecular OTMB8562 es específica para la detección de VHS tipo 2. Se analizaron las series de dilución de un ADN lineal de VHS tipo 1 y VHS tipo 2.
Pueden estar presentes con anterioridad los necesarios trifosfatos de
nucleosido (apropiados para una amplificación adecuada) durante la etapa de
incubación con la(s) enzima(s) de restricción, por ejemplo como parte del dicho
tampón de amplificación. Pueden ser añadidos más tarde, sin embargo, en el
procedimiento, por ejemplo, junto con las enzimas después del tratamiento de calor. La persona experta en la técnica conoce las enzimas usadas para el método de
amplificación basado en la transcripción, y las condiciones en las cuales se realiza el
método de amplificación basado en la transcripción y es consciente de todas las
modificaciones habituales que pueden hacerse en cuanto a la optimización de las reacciones de amplificación basadas en la transcripción. Por ejemplo, el cebador directo, el promotor-cebador, pueden comprender una región purina entre la secuencia promotora sobre el extremo 5' del cebador y la secuencia hibridante sobre el extremo 3' del cebador.
La secuencia de los cebadores está determinada en gran parte por la posición del sitio de restricción elegido.
El extremo 3' de un cebador directo debe hibridarse a la secuencia diana directamente corriente arriba del sitio de restricción. El cebador puede variar en la longitud siempre que sea suficientemente largo para hibridarse en las condiciones usadas con la reacción de amplificación. En general, la parte que se hibrida del cebador consiste en aproximadamente de 10 a aproximadamente 35 nucleótidos.
Una enzima de restricción es una enzima que puede cortar el ADN bicatenario en un sitio seleccionado (es decir, una secuencia de nucleótidos específica reconocida por la enzima). En la selección de una enzima de restricción apropiada para el método de la invención debería ponerse cuidado en que se elija un sitio de restricción que esté presente en todas las variantes del ADN diana (por ejemplo, un sitio de restricción que esté presente en todos los genotipos de un virus particular, si la amplificación se realiza para detectar el ADN viral en la muestra). El sitio de restricción no debería estar presente en la secuencia de ADN en medio de los cebadores.
La adición de la enzima de restricción causa la creación de un extremo 3' definido de la cadena diana del ADN, que está disponible entonces para unirse a la parte que se hibrida del promotor-cebador. Un aspecto adicional es que, debido a la digestión, será mejorada la desnaturalización de aquella parte del ADN y entonces será facilitada la unión del cebador.
El oligonucleótido del promotor que contiene la secuencia promotora T7 debería ser diseñado de tal modo que la parte que se hibrida interaccionará con la plantilla directamente corriente arriba del sitio de restricción. La enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN (por lo general, una transcriptasa inversa tal como MMLV-RT o AMV-RT) puede ampliar el extremo 3' de la cadena diana del ADN creado por la digestión con la enzima de restricción, usando el cebador como plantilla. Se formará una secuencia del promotor T7 bicatenario y puede comenzar la producción del amplicón de ARN.
La invención será ilustrada en adelante mediante los Ejemplos siguientes.
EJEMPLO 1: Amplificación del ADN de VHS
Dos sitios de restricción conservados (ApaI y SalII) son codificados en el POL-gen altamente conservado del ADN de VHS. Según estas enzimas de restricción, se diseñaron los cebadores y las sondas de balizas moleculares. Se aisló el ADN de VHS
5 1 y VHS 2 a partir del material del paciente, usando el Extractor NucliSens (Referencia de Producto: 200272 (220V) o 200236 (110V), BioMerieux B. V., Boxtel, Países Bajos). Siguiendo el procedimiento estándar como se describe para el aislamiento de ARN (Extractor Manual del Operador, 41001-9, Rev A, 1999), se obtiene un extracto de 50 �l. Se usan cinco �l del extracto por ensayo. Se realizó la digestión de la enzima de
10 restricción en el tampón de NASBA (Tris-HCl 40 mM, pH 8,5, MgCl2 12 mM, KCl 70 mM, DMSO al 15 % v/v, DTT 5 mM, 1 mM cada dNTP, ATP 2 mM, CTP 2 mM, UTP 2 mM, GTP 1,5 mM, ITP 0,5 mM, cebadores 0,2 �M, sonda de baliza molecular 0,1 �My 1,0 de unidades de enzima de restricción Apa I (Referencia de Producto: E1005Y, Amersham Biosciences, Friburgo, Alemania) y 1,0 unidades de enzima de restricción
15 SalI (Referencia de Producto: E1080Y, Amersham Biosciences, Friburgo, Alemania). Después de una incubación durante 15 minutos a 41°C, las enzimas de restricción se desactivaron con calor y la plantilla de ADN se desnaturalizó a 95°C durante 5 minutos. La hibridación de los cebadores ocurrió durante un enfriamiento a 41°C durante 3 minutos. Posteriormente, se añadieron las enzimas de NASBA (2,1 �g de
20 BSA, 0,08 unidades de RNAsa H, 32 unidades de ARN polimerasa de T7 y 6,4 unidades de transcriptasa inversa de AMV), la mezcla de reacción se mezcló golpeando suavemente y por centrifugación corta, y comenzaron la amplificación y la detección a tiempo real. La mezcla de reacción se incubó a 41°C en el Analizador NucliSens EasyQ (Referencia de Producto: 200276, BioMerieux B. V., Boxtel, Países
25 Bajos) durante 60 minutos con fluorescencia monitorizando cada minuto. Después de la digestión con la enzima de restricción e hibridación de los cebadores a la diana, se usan los cebadores directos, incluyendo una secuencia del promotor T7 (P1 y P3, tabla 1), como plantilla por AMV RT para ampliar el extremo 3' de la cadena diana en el sitio de restricción. Se forma un promotor T7 bicatenario que
30 se usa por T7 para la producción de amplicones que serán reutilizados hasta que los cebadores sean terminados (véase la FIGURA 1).
35
EJEMPLO 2: Amplificación del ADN de VHS con diferentes grupos de cebador:
Se realizó un ensayo de NASBA en ausencia y presencia de las enzimas de restricción Apa I y Sal I. Se analizaron cuatro grupos de cebador POL de VHS diferentes: P1.1/P2.1, P1.1/P2.2, P3.1/P4.1, P3.2/P4.1, como se representa en la Tabla 1.
Cebador/Sonda
Secuencia Marcador
HSV_pol P3.1
5'-AATTCTAATACGACTCACTATA gggcc ctggtcgacctgctgttttacgac-3'
HSV_pol P3.2
5'AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA cctgctgttttacgacgataccg-3'
HSV_pol P4.1
5'-tctgctcagttcggcggtga-3'
HSV_pol P1.1
5'AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA ccagggccctggaggtgcgg-3'
HSV_pol P2.1
5' gggcgacaagatggcgagcca-3'
HSV pol P2.2
5' acgttcaccaagctgctgct-3'
OTMB8515
5'-CGATCG ccccgaacgcctgcagtcc CGATCG-3' FAM
OTMB8516
5'-CGATCG aaaagtacatcggcgtcatcta CGATCG-3 FAM
OTMB8547
5'-CT6TCCC gtcatct6cggiggtaag 777AT67-3' FAM
OTMB8562
5'-CGATCG gtcatctgcgggggcaag CGATCG-3' Cy-5
*La secuencia del promotor T7 está escrita en mayúsculas y cursiva, la secuencia que se hibrida en minúsculas, la secuencia madre de la sonda en mayúsculas y negrita. 10 7 = Metoxi G, 6 = Metoxi A e i = inosina
Tabla 1: Secuencias del cebador y sonda*
La inosina se incluye para aumentar la especificidad y metoxi G o A es útil para aumentar la interacción de la unión del amplicón (ADN/ARN).
P1 y P3 son cebadores directos y P2 y P4 son cebadores inversos. Se usó como plantilla una serie de dilución de 10 veces de un ADN lineal incluyendo parte de la región POL de VHS de VHS tipo 1 o VHS tipo 2. Se usaron las balizas moleculares genéricas OTMB8515 y OTMB8516 para detectar la cadena menos y la cadena más tanto de VHS tipo 1 como de VHS tipo 2, respectivamente. Para todos los grupos de cebador, se mostró una mejora clara de la cinética de reacción si las enzimas de restricción eran incluidas, véase la FIGURA 2. Dependiendo del grupo de cebador, se obtuvo un aumento de 10-1000 veces de la sensibilidad y una disminución de unos 510 minutos del "tiempo a positividad" (TTP) en presencia de las enzimas de restricción. Ambos son indicaciones para una mejor reacción de amplificación. Fueron obtenidas la mejor cinética y sensibilidad con el grupo de cebador P1.1/P2.2.
EJEMPLO 3: Amplificación del ADN de VHS incluyendo la digestión de Apa I
Para optimizar la cantidad de Apa I en la reacción, se analizó una serie de dilución de Apa I. Se usó el POL P1.1 de VHS como cebador directo, P2.2 como cebador inverso y OTMB8516 como baliza molecular (véase la Tabla 1 anterior). Se usa como plantilla una dilución de 105 veces del extracto de una muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 (cepa SC16). La concentración óptima de Apa I se determinó que era 0,25 unidades o más como se deduce a partir de la FIGURA 3.
EJEMPLO 4: Amplificación del ADN de VHS incluyendo la digestión de Sal I:
Para optimizar la cantidad de Sal I en la reacción, se analizó una serie de dilución de Sal I. El POL P1.1 de VHS se usa como cebador directo, P2.2 como cebador inverso y OTMB8516 como baliza molecular (Tabla 1). Se usa como plantilla una dilución de 105 veces de un extracto de la muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 (cepa SC16). La concentración óptima de Sal se determinó que era 0,1 unidades o más, como se muestra en la FIGURA 4.
EJEMPLO 5: Amplificación de la muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 (cepa SC16) incluyendo la digestión de ApaI y SalI
Se analizó una serie de dilución de una muestra de cultivo de tejido de VHS tipo 1 (cepa SC16) en ausencia y presencia de las enzimas de restricción Apa I y Sal I. Se usaron el grupo de cebador P1.1/P2.2 y la baliza genérica OTMB8516, véase la Tabla 1. En ausencia de las enzimas de restricción fue detectable una dilución de 1000 veces del virus, véase la FIGURA 5. Sin embargo, en presencia de las enzimas de restricción una dilución de 1000.000 veces dio todavía positiva, mostrando que se obtenía un aumento de 1000 veces la sensibilidad. Además, se observó una
5 disminución de TTP de 5 minutos en presencia de las enzimas de restricción. Ambas son indicaciones de una mejor reacción de amplificación lo que indica que la adición de enzimas de restricción también mejora la amplificación del material del cultivo de tejido.
10 EJEMPLO 6: Detección específica del VHS tipo 1 y VHS tipo 2 incluyendo la digestión de Apa I y Sal I
Para la detección específica del ADN de VHS tipo 1 y VHS tipo 2, se diseñaron balizas moleculares específicas en el área de amplificación del POL-gen de VHS 15 usando el grupo de cebador POL P1.1/P2.2. Para discriminar entre el VHS tipo 1 y VHS tipo 2, las balizas específicas se dirigen contra la parte del amplicón en la cual existe una diferencia de dos nucleótidos entre el VHS tipo 1 y VHS tipo 2. La baliza molecular OTMB8547 es específica para la detección de VHS tipo 1 y la baliza molecular OTMB8562 es específica para la detección de VHS tipo 2. Se analizaron las
20 series de dilución de un ADN lineal de VHS tipo 1 y VHS tipo 2. Se demostró que la baliza específica de VHS tipo 1 OTMB8547 era específica para VHS1, como se expone en la FIGURA 6, y la baliza molecular de VHS tipo 2 específica OTMB8562 se demostró que era específica para el VHS tipo 2.

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un par de cebadores de oligonucleótido para la amplificación del ácido nucleico del virus del herpes simple (VHS) que comprende:
    a) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3', y
    b) un oligonucleótido, con 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: 5'CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3'.
  2. 2. Un par de cebadores de oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que al menos uno de dichos oligonucleótidos está operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico del promotor.
  3. 3. Un método para amplificar un ADN de VHS diana opcionalmente presente en una muestra, que comprende las etapas de:
    -incubar la muestra en un tampón de amplificación con:
    -una o varias enzimas de restricción capaces de dividir el ADN de VHS en un sitio de restricción seleccionado, creando dicha enzima de restricción un extremo 3' definido sobre una de las cadenas de ADN, y
    -un promotor-cebador, teniendo dicho promotor-cebador una región 5' que comprende la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente del ADN y una región 3' que comprende la secuencia de un primer cebador y complementaria al extremo 3' definido de la cadena de ADN, teniendo el primer cebador 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
    5'-CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3',
    -un segundo cebador, que tiene la polaridad opuesta del promotor-cebador y que comprende el extremo 5' de la secuencia diana, teniendo el segundo cebador 1050 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
    5'-ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3',
    -mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra una digestión por la enzima de restricción, en presencia de los trifosfatos de nucleosido apropiados, y
    -someter la muestra así obtenida a un tratamiento térmico a una temperatura y tiempo suficientes para inactivar la(s) enzima(s) de restricción y/u, opcionalmente, producir al menos parcialmente el bicatenario monocatenario,
    -añadir los siguientes reactivos a la muestra:
    -una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN,
    -una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN,
    -una enzima que tiene actividad de RNAsa H,
    -una enzima que tiene actividad de ARN polimerasa dependiente de ADN, y
    -mantener la mezcla de reacción así creada en las condiciones apropiadas
    durante una cantidad suficiente de tiempo para que ocurra la amplificación.
  4. 4.
    El método según la reivindicación 3, en el que el ADN es ADN bicatenario de VHS.
  5. 5.
    El método según la reivindicación 3, en el que el ADN es monocatenario y la función del promotor-cebador y la función del cebador de restricción se combinan usando un promotor combinado y el cebador de restricción que comprende una secuencia complementaria a la región incluyendo el sitio de restricción del ADN monocatenario diana y la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente del ADN.
  6. 6.
    El método según la reivindicación 3, en el que se usa una transcriptasa inversa combinando las actividades de la enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN y de la enzima que tiene actividad de ADN dependiente de ADN.
  7. 7.
    El método según la reivindicación 3, en el que se usa una transcriptasa inversa que tiene actividad inherente de RNAsa H sustituyendo tres enzimas, a saber la enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN, la enzima que
    tiene actividad de ADN dependiente de ADN así como la enzima que tiene actividad de RNAsa H.
  8. 8.
    El método según la reivindicación 3, en el que la temperatura de incubación es de 35ºC a aproximadamente 45 ºC y preferiblemente de aproximadamente 37-41ºC.
  9. 9.
    El método según la reivindicación 3, en el que la etapa de calentamiento se realiza a una temperatura entre 92ºC y 98 ºC y preferiblemente a aproximadamente 95ºC.
  10. 10.
    El método según la reivindicación 3, en el que se usa una enzima de restricción que corta el ADN de VHS en un sitio que es conservado entre los genotipos diferentes de VHS.
  11. 11.
    El método para la detección del ácido nucleico de VHS en una muestra en el que la muestra se somete a una reacción de amplificación de ácido nucleico usando un par de oligonucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y reactivos de amplificación adecuados y se detecta la presencia de cualquier ácido nucleico amplificado.
  12. 12.
    El método según la reivindicación 11, en el que la detección de cualquier ácido nucleico amplificado se realiza haciendo reaccionar la muestra con al menos un oligonucleótido seleccionado de una sonda de oligonucleótido del tipo no específica para la detección de VHS tipo 1 y/o tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GAAAAAAGTACATCGGCGTCATCT-3', una sonda de oligonucleótido del tipo específica para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTACGGGGGTAAG-3', una sonda de oligonucleótido del tipo específica para la detección de VHS tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTGCGGGGGCAAG-3', o con un par de sondas de oligonucleótido específico del tipo para la detección de VHS tipo 1 y tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de
    longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3' [tipo 1], y 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3' [tipo 2] en condiciones de hibridación adecuadas y detectando la presencia del marcador en cualquier híbrido formado entre la secuencia amplificada y la(s) sonda(s).
  13. 13.
    El método según la reivindicación 11, en el que la técnica de amplificación usada es una técnica de amplificación basada en la transcripción, preferiblemente el NASBA, y el primer oligonucleótido está provisto de una secuencia promotora reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN.
  14. 14.
    Un método para la detección de VHS en una muestra, que comprende las etapas de:
    (a)
    amplificar el ADN de VHS según cualquiera de las reivindicaciones 3-10 para obtener ARN monocatenario,
    (b)
    hibridar al ARN amplificado unas sondas de oligonucleótido específicas del tipo seleccionadas de una sonda de oligonucleótido no específica del tipo para la detección de VHS tipo 1 y/o tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GAAAAAAGTACATCGGCGTCATCT-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTACGGGGGTAAG-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3',
    (c) detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.
  15. 15. Un método para la detección de VHS tipo 1 en una muestra, que comprende las etapas de:
    (a)
    amplificar el ADN de VHS según cualquiera de las reivindicaciones 3-10 para obtener ARN monocatenario,
    (b)
    hibridar al ARN amplificado una sonda de oligonucleótido específica para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTACGGGGGTAAG-3', y
    (c) detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.
  16. 16. Un método para la detección de VHS tipo 2 en una muestra, que comprende las etapas de:
    (a)
    amplificar el ADN de VHS según cualquiera de las reivindicaciones 3-10 para obtener ARN monocatenario,
    (b)
    hibridar al ARN amplificado una sonda de oligonucleótido específica para la detección de VHS tipo 2, teniendo dicha sonda 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud, y comprendiendo al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'GTCATCTGCGGGGGCAAG-3', o su secuencia complementaria;
    (c) detectar los híbridos formados entre dicho ARN y dicha sonda.
  17. 17. El uso de un par de oligonucleótidos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en una reacción de amplificación de ácido nucleico o como una sonda para la detección de ácido nucleico de VHS en una muestra.
  18. 18. El kit de ensayo para la detección de VHS en una muestra que comprende: -un grupo de oligonucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, -un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico
    sustancialmente complementaria a al menos parte de la secuencia de ácido nucleico amplificada, provista de un marcador detectable, seleccionada de una sonda de oligonucleótido no específica del tipo para la detección de VHS tipo 1 y/o tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GAAAAAGTACATCGGCGTCATCT-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 1, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3', una sonda de oligonucleótido específica del tipo para la detección de VHS tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente 10-35 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en: 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-31, o con un par de sondas de oligonucleótido específicas del tipo para la detección de VHS tipo 1 y tipo 2, teniendo 10-50 nucleótidos de longitud, preferiblemente teniendo 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento específico del tipo de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en:
    5'-GTCATCTACGGGGGTAAG-3' [tipo 1], y 5'-GTCATCTGCGGGGGCAAG-3' [tipo 2],
    -reactivos de amplificación adecuados, -opcionalmente al menos una enzima de restricción.
  19. 19.
    Un kit para detectar y opcionalmente identificar VHS en una muestra, en el que el kit comprende un par o cebadores, en el que el primer cebador comprende una secuencia promotora de ARN polimerasa y una secuencia hibridante y que tiene 10-50 nucleótidos de longitud, y preferiblemente que tiene 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en 5'-CCAGGGCCCTGGAGGTGCGG-3', y la segunda secuencia de cebador que tiene 10-50 nucleótidos de longitud, y preferiblemente que tiene 10-35 nucleótidos de longitud, y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia que consiste en 5'-ACGTTCACCAAGCTGCTGCT-3'.
  20. 20.
    El kit según la reivindicación 19, que comprende además una sonda de oligonucleótido que contiene una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse a la región del ADN amplificado usando el primer cebador y el segundo cebador.
  21. 21.
    El kit de ensayo según la reivindicación 18, en el que los reactivos de amplificación adecuados hacen posible una técnica de amplificación basada en la transcripción, preferiblemente el NASBA.
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