ES2347412T3 - Colonias individuales de celulas mixobacterianas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la producción de colonias individuales de la mixobacteria Sorangium que comprende cultivar la mixobacteria Sorangium sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina.
Description
Colonias individuales de células
mixobacterianas.
La presente invención se refiere a
microorganismos mixobacterianos.
Los microorganismos mixobacterianos son
bacterias del suelo ampliamente extendidas que incluyen, p. ej., la
mixobacteria Sorangium, tal como la mixobacteria Sorangium
cellulosum. De forma similar a los estreptomicetos, las
bacterias mixobacterias pueden producir metabolitos secundarios con
una alta diversidad estructural, p. ej. epotilonas, tales como
epotilona A y epotilona B. Las bacterias mixobacterias tienen una
característica excelente: son capaces de deslizarse.
Las células bacterianas pueden formar
generalmente colonias individuales, p. ej. que pueden originarse a
partir de una sola célula, si se cultivan sobre la superficie de un
medio nutriente, p. ej., semisólido, p. ej. que contiene agar agar.
Sin embargo, no pueden obtenerse colonias individuales, sino
aglomerados de células bacterianas que se originan a partir de toda
la superficie del medio nutriente, si se cultivan células
mixobacterianas, debido a que las células mixobacterianas pueden
ser capaces de moverse, p. ej. de deslizarse o de pulular sobre una
superficie de un medio nutriente, p. ej., semisólido, p. ej. que
contiene agar agar. Así, el cultivo de colonias individuales de
células mixobacterianas, p. ej. que se originan a partir de una sola
célula, puede ser difícil, p. ej. prácticamente imposible, si se
cultiva una suspensión de células mixobacterianas sobre un medio
nutriente, p. ej., semisólido.
Se ha encontrado ahora que, sorprendentemente,
pueden obtenerse colonias individuales de células mixobacterianas
sobre un medio nutriente, p. ej. semisólido, a pesar de la capacidad
de las células mixobacterianas para moverse, p. ej. deslizarse o
pulular, sobre una superficie de un medio nutriente, p. ej.
semisólido.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una colonia individual de células mixobacterianas.
Una colonia individual, según se describe en la
presente memoria, incluye, p. ej., una colonia celular que se
origina a partir de una sola unidad formadora de colonias de células
mixobacterianas, p. ej. en la forma de una colonia diferente con
límites definidos, p. ej. que puede reconocerse a la vista como una
colonia individual. El término "colonia individual", según se
define en la presente memoria, significa una colonia que se origina
a partir de un pequeño número, p. ej. menos de cuatro, de células
mixobacterianas, preferiblemente a partir de una sola célula
mixobacteriana.
Las mixobacterias incluyen preferiblemente la
mixobacteria Sorangium, más preferiblemente la mixobacteria
Sorangium cellulosum. Las células mixobacterianas incluyen
preferiblemente células de la mixobacteria Sorangium, más
preferiblemente células de la mixobacteria Sorangium
cellulosum.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para la producción de colonias
individuales de la mixobacteria Sorangium que comprende
cultivar la mixobacteria Sorangium sobre un medio nutriente
que contiene de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina, p. ej.
isoleucina; o isoleucina y leucina.
Un procedimiento de acuerdo con la presente
invención puede llevarse a cabo como sigue:
- Un medio nutriente apropiado incluye un medio nutriente sobre el que pueden crecer células mixobacterianas. Preferiblemente, el medio nutriente es semisólido, p. ej., el medio nutriente contiene agar agar. El medio nutriente para el crecimiento de mixobacterias es conocido como tal y la producción del mismo puede llevarse a cabo, p. ej., de acuerdo con un método como los convencionales. Típicamente, un medio nutriente para el crecimiento de células mixobacterianas puede contener
- -
- una fuente de carbono asimilable, p. ej. glucosa;
- -
- una fuente de nitrógeno asimilable, p. ej. NH_{4}^{+}, p. ej. en la forma de (NH_{4})_{2}SO_{4}, un digesto pancreatínico de caseína, tal como bactotriptona, p. ej. disponible comercialmente de Difco;
- -
- una fuente de fósforo, p. ej. un fosfato, tal como KH_{2}PO_{4};
- -
- elementos traza, p. ej. Mg, p. ej. en la forma de MgSO_{4}, Ca, p. ej. en la forma de CaCl_{2}, Fe, tal como Fe-EDTA (EDTA: ácido etilendiaminotetraacético);
- -
- opcionalmente una fuente de azufre, p. ej. un sulfato, tal como Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4};
opcionalmente compuestos tamponadores, p. ej.
ácido
(3-N-morfolino)propanosulfónico
(MOPS).
\vskip1.000000\baselineskip
El medio nutriente puede contener ingredientes
adicionales y otros apropiados.
De acuerdo con la presente invención, el medio
nutriente contiene isoleucina y/o leucina. Preferiblemente, el
medio nutriente contiene isoleucina, o isoleucina y leucina. La
isoleucina y la leucina incluyen L-isoleucina y
L-leucina.
Se encontró que la isoleucina y/o leucina
presente en el medio nutriente puede inhibir el deslizamiento o la
pululación de células mixobacterianas sobre la superficie del medio
nutriente.
La isoleucina y/o la leucina están presentes en
el medio nutriente en una cantidad suficiente para inhibir el
deslizamiento, p. ej. la pululación, de células mixobacterianas
sobre el medio nutriente. Una cantidad apropiada de isoleucina y/o
leucina en el medio nutriente incluye, p. ej., de 0,5 g a 10 g de
isoleucina y/o leucina por litro de medio nutriente, tal como de
0,8 g/l a 6 g/l, p. ej. de 1 g/l a 5 g/l.
El medio nutriente que contiene isoleucina y/o
leucina, p. ej. en forma semisólida, p. ej. que contiene agar agar,
puede colocarse sobre un soporte, p. ej. una placa o un plato, para
obtener un soporte con un medio nutriente, p. ej. semisólido, que
contiene isoleucina y/o leucina sobre la superficie.
Un soporte con un medio nutriente, p. ej.
semisólido, que contiene isoleucina y/o leucina sobre la superficie
puede inocularse con una suspensión de células mixobacterianas.
Las células mixobacterianas pueden obtenerse de
mixobacterias, incluyendo, p. ej., la mixobacteria Sorangium,
tales como microorganismos de la mixobacteria Sorangium
cellulosum que son bien conocidos, p. ej. están disponible
comercialmente, p. ej. de acuerdo con un método como los
convencionales.
Una suspensión de células mixobacterianas
apropiadas, p. ej. un cultivo líquido de células mixobacterianas,
puede obtenerse incubando un medio de cultivo líquido con células
mixobacterianas. Un medio de cultivo líquido para la incubación de
células mixobacterianas incluye un medio de cultivo sobre el que
pueden crecer células mixobacterianas. Un medio de cultivo líquido
apropiado es conocido o puede prepararse, p. ej., de acuerdo con un
método como los convencionales. Un medio de cultivo líquido típico
para incubar células mixobacterianas puede contener, p. ej.,
fuentes para carbono asimilable, nitrógeno asimilable etc., tales
como glucosa, almidón, soja (harina), extracto de levadura; y
elementos traza, p. ej. Mg, p. ej. en la forma de MgSO_{4}, Ca, p.
ej. en la forma de CaCl_{2}, Fe, p. ej. en la forma de
Fe-EDTA.
La incubación puede llevarse a cabo durante un
tiempo apropiado, p. ej. varios días, a una temperatura apropiada,
p. ej. de 20ºC a 40ºC, p. ej. alrededor de 30ºC, p. ej. bajo
agitación. Las células mixobacterianas obtenidas pueden separarse
por centrifugación y resuspenderse en medio de cultivo líquido
reciente. La suspensión obtenida puede diluirse usando un medio de
dilución apropiado, tal como un hidrolizado enzimático de polvo de
habas de soja, p. ej. en forma diluida, p. ej. en solución del 1%
al 10%, tal como solución al 5%, p. ej. diluido con agua, tal como
una solución de Bacto Soytone, p. ej. disponible comercialmente de
Difco. Puede ser apropiada una suspensión celular con un grado de
dilución de hasta 10^{-6}, p. ej.
Puede obtenerse una suspensión diluida de
células mixobacterianas que es apropiada para la inoculación de
medio nutriente, p. ej. sobre un soporte.
Un soporte inoculado con un medio nutriente, p.
ej. semisólido, que contiene isoleucina y/o leucina sobre la
superficie puede incubarse, p. ej., de acuerdo con un método como
los convencionales, p. ej.
- -
- a temperaturas apropiadas, tales como de 30ºC a 40ºC, p. ej. 37ºC;
- -
- durante un tiempo apropiado, p. ej. durante varios días, p. ej. de 10 a 20 días, tal como de 12 a 14 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden obtenerse colonias individuales de
células mixobacterianas sobre la superficie del medio nutriente,
que tienen, p. ej., un diámetro de varios mm, tal como de 4 a 5 mm,
después de un tiempo apropiado. Las colonias individuales pueden
ser nítidas y pueden reconocerse a la vista como colonias
individuales que tienen, p. ej., límites definidos.
La densidad celular puede determinarse como es
habitual, p. ej. en una cámara de conteo, p. ej. en una cámara de
Thoma.
Las colonias individuales de células
mixobacterianas son útiles para una mejora eficaz de la cepa.
Las células mixobacterianas son capaces de
producir metabolitos secundarios, que, p. ej., pueden ser útiles
como un producto farmacéutico. Por ejemplo, la mixobacteria
Sorangium es capaz de producir las epotilonas
farmacéuticamente activas conocidas, especialmente epotilona A y
epotilona B, pero también epotilona D, que tienen las siguientes
fórmulas,
que se sabe que inhiben la
proliferación de células tumorales y son adecuadas para el
tratamiento de enfermedades tumorales (véanse, p. ej., Bolag, D.M.
et al., "Epothilones, a new class of
microtubule-stabilizing agents with a
Taxol-like mechanism of action", Cancer Research
55, 2325-33 (1995), Kowalski, R.J. et al., J.
Biol. Chem. 272(4), 2534-2541 (1997), US
5.641.803, US 5.496.804, US 5.565.478; para la epotilona A, véase
especialmente WO93/10121, y para la epotilona D, especialmente WO
99/01124).
La mejora de cepas de mixobacterias, p. ej. la
mixobacteria Sorangium, puede mejorar, p. ej., la velocidad
de producción de metabolitos secundarios, p. ej. compuestos
farmacéuticamente activos, p. ej. epotilonas.
Si las células sufren un pretratamiento, p. ej.
mutación o transformación celular mediante el tratamiento
correspondiente, y tales células solo pueden obtenerse en la forma
de células agregadas y no en la forma de colonias individuales,
pueden agregarse células de diferentes genotipos. En tal caso, es
imposible una selección celular de células que tienen
características diferentes, especialmente deseadas, después del
tratamiento, debido a que no pueden seleccionarse células con
diferentes características después del tratamiento, si no pueden
formarse colonias individuales. En otras palabras, la formación de
colonias individuales es una condición previa necesaria o al menos
ventajosa para llevar a cabo un procedimiento de selección de
células que tienen características deseadas.
Si pueden formarse colonias individuales, lo que
está permitido de acuerdo con la presente invención para
mixobacterias, p. ej. células de la mixobacteria Sorangium,
puede llevarse a cabo una selección eficaz de células que tienen
diferentes características después de un pretratamiento
correspondiente, p. ej. de células que tienen una velocidad de
producción superior de un metabolito secundario, p. ej. un compuesto
deseado, p. ej. farmacéuticamente activo, p. ej. epotilonas, que
las células no tratadas.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona el uso de una colonia individual de células
mixobacterianas en la mejora de cepas mixobacterianas, p. ej. cepas
de la mixobacteria Sorangium; y, en otro aspecto, la
producción de una cepa de la mixobacteria Sorangium que tiene
una velocidad de producción de epotilona mejorada, que comprende
las etapas:
- i)
- producir colonias individuales de células de la mixobacteria Sorangium pretratadas que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina,
- ii)
- seleccionar células de las colonias individuales obtenidas bajo la etapa i) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas;
- iii)
- cultivar células seleccionadas en la etapa ii) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa i) puede llevarse a cabo, p. ej., de
acuerdo con la presente invención. Las etapas ii) y iii) pueden
llevarse a cabo, p. ej., de acuerdo con un método convencional.
El pretratamiento de las células que puede
mejorar la velocidad de producción de las epotilonas en comparación
con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas incluye,
p. ej., transformación de células de la mixobacteria
Sorangium, tratamiento de las células que da como resultado
mutagénesis de células de la mixobacteria Sorangium,
mutagénesis espontánea. Tal pretratamiento se describe, p. ej., en
US 5.686.295.
La presente invención se refiere en particular a
una cepa de la mixobacteria Sorangium que tiene una velocidad
de producción de epotilona mejorada obtenida mediante el
procedimiento descrito anteriormente.
Por otra parte, la presente invención se refiere
al uso de un medio nutriente que contiene isoleucina y/o leucina en
un procedimiento para la mejora de cepas de mixobacterias.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para la producción de epotilonas, p.
ej. epotilona B, que comprende las etapas
- i)
- formar colonias individuales de células de la mixobacteria Sorangium pretratadas que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina,
- ii)
- seleccionar células de las colonias individuales obtenidas bajo la etapa i) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas;
- iii)
- cultivar células seleccionadas en la etapa ii) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas;
- iv)
- fermentar las células de la mixobacteria Sorangium cultivadas obtenidas en la etapa iii); y
- v)
- aislar epotilona del caldo de fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una cepa de la mixobacteria Sorangium que tiene
una velocidad de producción de epotilona mejorada.
La etapa i) puede llevarse a cabo, p. ej., de
acuerdo con la presente invención. Las etapas ii) a v) pueden
llevarse a cabo, p. ej., de acuerdo con un método convencional.
En los siguientes ejemplos todas las
temperaturas están sin corregir y se dan en ºCelsius.
\vskip1.000000\baselineskip
Agua en una cantidad para obtener 700 ml de
Solución A.
El pH de la solución A se ajusta con NaOH hasta
7,4.
Solución F: 35 ml
Microorganismo Sorangium
cellulosum (células) disponible comercialmente en forma de
cultivo líquido, tratado en autoclave, 3 días.
Las Soluciones A, C, D y F se tratan
separadamente en un autoclave y se mezclan después de enfriar a
alrededor de 60º. Se añade a la mezcla una solución E recientemente
preparada poco antes de verter el medio nutriente sobre placas.
La mezcla obtenida se vierte sobre placas. Se
obtienen placas con el medio nutriente sobre la superficie.
Agua en una cantidad para obtener 50 ml de
solución A.
El pH de la solución A se ajusta hasta 7,4 con
NaOH. La esterilización se lleva a cabo durante alrededor de 20
minutos a 122º.
Un cultivo líquido de la mixobacteria
Sorangium cellulosum se incuba en medio nutriente
líquido durante alrededor de 3 días a alrededor de 30ºC y 180 Upm.
El cultivo obtenido se separa por centrifugación estérilmente y se
resuspende en medio nutriente líquido reciente. La suspensión de
células obtenida se diluye con solución Bacto Soytone (hidrolizado
enzimático acuoso de polvo de habas de soja) al 0,5% para obtener
series de dilución hasta una dilución de 10^{-6}.
Placas con el medio nutriente sobre la
superficie obtenidas como se describe bajo a) se inoculan con series
de dilución de la mixobacteria Sorangium cellulosum
obtenida bajo b.
Se usan para la inoculación 100 \mul por placa
de las series de dilución.
Las placas inoculadas se incuban a alrededor de
37ºC durante un período de alrededor de 12 a 14 días.
Se obtienen colonias individuales nítidas de
células de la mixobacteria Sorangium cellulosum que
tienen límites definidos y que tienen un diámetro de 4 a 5 mm. Las
colonias se reconocen a la vista como colonias individuales.
La densidad celular, determinada contando en una
cámara de Thoma, es típicamente 3,7 x 10^{8} células/ml. A una
velocidad de dilución de la suspensión de células de 10^{-5} se
obtienen 180 colonias individuales sobre una placa,
correspondientes a un conteo bacteriano vivo de 1,8 x 10^{8}
células/ml.
Velocidad de recuperación: 49%.
\vskip1.000000\baselineskip
El Ejemplo 1 se repite, con la diferencia de que
la solución A contiene 2 g de L-isoleucina y no
contiene L-leucina en lugar de 2 g de
L-leucina y 1 g de L-isoleucina.
Se obtienen resultados similares a los indicados
en el ejemplo 1.
Claims (6)
1. Un procedimiento para la producción de
colonias individuales de la mixobacteria Sorangium que
comprende cultivar la mixobacteria Sorangium sobre un medio
nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o
leucina.
2. Uso de un medio nutriente que incluye de 1
g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina en un procedimiento para la
mejora de cepas de la mixobacteria Sorangium.
3. A procedimiento para la producción de una
cepa de la mixobacteria Sorangium que tiene una velocidad de
producción de epotilona mejorada, que comprende las etapas
- i)
- formar colonias individuales de células de la mixobacteria Sorangium pretratadas que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina,
- ii)
- seleccionar células de las colonias individuales obtenidas bajo la etapa i) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas;
- iii)
- cultivar células seleccionadas en la etapa ii) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un procedimiento para la producción de
epotilona, que comprende las etapas
- i)
- formar colonias individuales de células de la mixobacteria Sorangium pretratadas que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina,
- ii)
- seleccionar células de las colonias individuales obtenidas bajo la etapa i) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas;
- iii)
- cultivar células seleccionadas en la etapa ii) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas;
- iv)
- fermentar las células cultivadas obtenidas en la etapa iii); y
- v)
- aislar epotilona del caldo de fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que se produce epotilona B.
6. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 5, el uso de acuerdo con
la reivindicación 3 y una cepa de acuerdo con la reivindicación 6,
en donde la mixobacteria es la mixobacteria Sorangium
cellulosum.
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