RU2126202C1 - Способ получения эндосимбиоза растение/бактерия, способного к азотфиксации в частях растений - Google Patents
Способ получения эндосимбиоза растение/бактерия, способного к азотфиксации в частях растений Download PDFInfo
- Publication number
- RU2126202C1 RU2126202C1 RU94045882A RU94045882A RU2126202C1 RU 2126202 C1 RU2126202 C1 RU 2126202C1 RU 94045882 A RU94045882 A RU 94045882A RU 94045882 A RU94045882 A RU 94045882A RU 2126202 C1 RU2126202 C1 RU 2126202C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plant
- bacteria
- nitrogen
- plants
- bacterium
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 26
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 14
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 claims abstract description 10
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 10
- 241000973034 Azomonas Species 0.000 claims abstract description 9
- 241001180360 Derxia Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000588882 Beijerinckia Species 0.000 claims abstract description 6
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 241000589154 Azotobacter group Species 0.000 claims description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 53
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 8
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 5
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589149 Azotobacter vinelandii Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000217480 Azomonas agilis Species 0.000 description 2
- 241000408718 Azomonas insignis Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 239000000618 nitrogen fertilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000973036 Azorhizophilus paspali Species 0.000 description 1
- 241000599985 Beijerinckia mobilis Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108010020943 Nitrogenase Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000004178 biological nitrogen fixation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H17/00—Symbiotic or parasitic combinations including one or more new plants, e.g. mycorrhiza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S47/00—Plant husbandry
- Y10S47/01—Methods of plant-breeding and including chromosome multiplication
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение касается способа получения нового типа растений, способных фиксировать азот в листьях. Способ включает инокуляцию органа растения бактериями рода Azotobacter или Azomonas или Beijerinckia или Derxiz в условиях in vitro. Обработанное таким образом растение культивируют на или в культуральной среде, содержащей источник азота и источник углерода, утилизируемый только клетками растения и не утилизируемый бактериями в количестве не менее 10 г/л, предпочтительно 20 - 40 г/л. Целесообразно бактерии использовать в виде вегетативных клеток или цист, или форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок. При использовании форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок, в среду основной источник углерода вводят в концентрации 0,35 -- 0,75 М. При обработке растений бактериями рода Azotobacter или Azomonas в среду дополнительно вносят не более 0,5 г/л карбоната кальция и/или не более 0,2 г/л хлорида кальция. 3 з.п.ф-лы, 2 ил.
Description
Данное изобретение касается способа получения нового типа растений, способных фиксировать азот также в их листьях.
Известно, что азот является основным лимитирующим фактором культивирования сельскохозяйственных растений, поскольку использование азота с помощи удобрения является хотя и эффективным, но очень дорогим и сопровождается сильным загрязнением окружающей среды. Всемирно распространяющаяся концепция, концепция "поддерживаемого развития" отдает предпочтение продукции, основанной на внутренних ресурсах, вместо использования внешних ресурсов. В соответствии с этим предпочтительно обеспечение предоставления азота растениям путем использования возможностей, заключенных в биологической азотфиксации, вместо применения удобрений [Plant and Soil 141, 1-12 /1992/]. Однако только некоторые прокариоты /диазотрофы/ способны фиксировать атмосферный газообразный азот.
Так называемые аэробные азотфиксирующие бактерии, члены родов Azomonas, Asotobacter, Beijerinckia и Derxia, принадлежащих к семейству Azotobacteraceae [Bergey's Manual of Determinative Bacterology, 8th ed., Williams and Wilkius, Baltimore, page 253 /1974/], которые способны к эффективной азотфиксации даже при атмосферных уровнях кислорода, в природе не способны включаться во внутренние пространства тканей растений [Azotobacteraceae: the Taxonomy and Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria, Academic Press, New York /1979/] и распространяться в межклеточных пространствах, хотя можно показать, что при оседании на корнях или на наружных поверхностях листьев эти виды способны обеспечивать потребность в азоте некоторых растений до значительной степени или полностью [J. Gen. Microbiol. 71, 103-116 /1972/; J. Gen. Appl. Microbiol. 25, 261-271 /1979/; Car. J. Bot 69, 2296-2298 /1991/. Только так называемые микроаэрофильные диазотрофы, фиксирующие азот при низких уровнях кислорода, способны образовать внутриклеточные эндосимбиозы [Nitrogen-fixing Bacteria in Nonleguminous Crop Plants, Sci. Tech. Publishers/Springer-Verlag, Madison, WI, pp. 84-88 /1987/], которые однако могут фиксировать газообразный азот только в корнях, т.е. далеко от места фотосинтеза.
До настоящего времени только два исследования были проведены для совместного культивирования видов Azotobacter с клетками растений в условиях in vitro.
В первом эксперименте [Nature 252, 393-395 /1974/] аденин-ауксотрофный мутантный штамм Azotobacter vinelandii культивировали совместно с клетками моркови на содержащей сахарозу среде, которая не содержала азота или содержала азот в количестве, недостаточном для роста растений. Полученные таким образом смешанные каллусные культуры, выращиваемые в течение 18 месяцев, обнаружили азотфиксирующую активность и среди живых клеток растений можно было наблюдать бактерии. Однако этот способ имеет несколько недостатков: в нем применяли ауксотрофный мутантный штамм вида Azotobacter, который трудно выделить вследствие высокого числа "хромосом" [J. Bacteriol., 138, 871-877 /1979/] ; культуры растут медленно; система нестабильна в присутствии азота; растения не могли быть регенерированы; способ применим только для небольшого числа интенсивно исследуемых видов вследствие малого числа ауксотрофных штаммов.
В другом эксперименте [Z. Pflanzenphysiol 95, 141-147 /1979/] бактерии подавляли ткань растений и разрушали ее. Поэтому было невозможно культивирование в течение длительного периода и развитие азотфиксирующего растения.
Целью данного изобретения является преодоление недостатков известных в этой области способов и разработка способа, при помощи которого можно легко получить в условиях in vitro растение, листья которого способны также к азотфиксации и которое содержит бактерии, принадлежащие к семейству Azotobacteraceae, в его внутренних пространствах.
Данное изобретение основано на обнаружении факта, что в условиях in vitro можно включать прототрофные быстро растущие бактерии семейства Azotobacteraceae, способные к азотфиксации даже при атмосферных уровнях кислорода, во внутренние пространства растения и заселять ими внутренние пространства при добавлении источников питания, обеспечивающих менее благоприятное снабжение питательными элементами, вместо оптимального снабжения, применяемого в практике для клеток растений. В частности, было обнаружено, что при использовании такого снабжения питательными веществами растительные и бактериальные клетки могут расти равномерно и сбалансированно, тогда как на обычных средах, применяемых для культивирования растительных материалов in vitro, бактерии опережают в росте ткани высшего растения и разрушают их вследствие того, что скорость их роста на порядок выше скорости роста клеток растений.
Кроме того, данное изобретение основано на обнаружении того, что хорошо сбалансированный рост обоих партнеров может поддерживаться во время культивирования in vitro путем применения основного источника /источников/ углерода, который /которые/ может (могут метаболизироваться только растением, т.е. который метаболизируется клетками растения, и только продукты метаболизма растения могут использоваться для бактериального роста до степени, требуемой для одновременного развития. Обнаружение этого факта является неожиданным, т. к. при совместном культивировании рост культур обеспечивается источниками углерода, которые используются клетками растения только в низкой степени и обычно применяются только для исследований метаболизма и лишь в редких случаях для культур растений in vitro.
Данное изобретение основано также на обнаружении факта, что обеспечение оптимального источника азота в питательной среде также необходимо для растительных материалов, культивируемых совместно с азотфиксирующими бактериями, для развития из культур целого растения с высокой вероятностью и высоким выходом. Это означает, что симбиотические отношение in vitro не являются необходимыми для образования симбиотических отношений in vivo и, следовательно, вышеупомянутая цель может быть достигнута также при помощи несимбиотического совместного культивирования. Обнаружение этого факта является удивительным, поскольку до настоящего времени преобладало мнение, что в случае такого совместного культивирования растительные культуры должны культивироваться на не содержащей азота среде или на средах с низким содержанием азота для того, чтобы сделать рост тканей растения зависимым от фиксации азота бактериями.
Наконец, данное изобретение основано на обнаружении того, что для получения нового типа азотфиксирующих растений предпочтительно могут быть использованы члены родов Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia и Derxia. Этот факт является неожиданным, поскольку согласно нашим знаниям до настоящего времени, эти так называемые свободно живущие бактерии не заселяют внутренние пространства растений в условиях in vivo и не обнаруживают тенденции к образованию таких тесных ассоциаций в природных условиях [Azotobacteraceae: The Taxonomy and Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria; Academic Press, New York /1979/. Таким образом, распространение азотфиксирующих симбиозов на новые виды растений может быть достигнуто не только дальнейшим развитием известных природных симбиозов и тесных эндофитных ассоциаций [Plant and Soil 141, 13-39 /1992/].
На основе рассмотренного выше, данное изобретение касается способа получения растений нового типа, способных к азотфиксации также в их листьях. Согласно данному изобретению протопласты, клетки, ткани, зародыши или органы растений, выросшие и/или/ обработанные в условиях in vitro инокулируют бактериями, принадлежащими к семейству Azotobacteraceae, затем полученную таким образом культуру Co-культивируют при температуре 15-35oC и, если желательно, размножают и/или/ регенерируют целое растение при той же температуре в условиях in vitro на или в культуральной среде, содержащей азот и основной источник /источники/ углерода, утилизируемые только клетками растений, а также иногда другие добавки.
В качестве гетеротрофных бактерий, способных к азотфиксации при атмосферных уровнях кислорода, предпочтительно применяют виды родов Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia и Derxia, принадлежащие к семейству Azotobacteraceae.
Для инокуляции предпочтительно применяют вегетативные клетки, цисты и формы бактерий, частично или полностью лишенные клеточной стенки.
В качестве основного источника /источников/ углерода, утилизируемых только клетками растений, предпочтительно применяют лактозу, мальтозу, галактозу, целлобиозу, крахмал, раффинозу и/или сорбит. Основной источник /источники/ углерода добавляют в концентрации не менее 10 г/л, предпочтительно 20-40 г/л, к культуральной среде. В случае применения бактерий, частично или полностью лишенных их клеточной стенки, основной источник углерода применяют в концентрации 0,35-0,75 М.
В способе данного изобретения pH культуральных сред предпочтительно доводят до величины, являющейся оптимальной для роста данной бактерии, причем эта величина равна 5,5-9,5 для родов Azotobacter, Azomonas и Derxia и 3-9,5 для рода Beijerinckia.
В способе данного изобретения дополнительная потребность в Ca2+, необходимая для роста некоторых видов родов Azotobacter и Azomonas, предпочтительно обеспечивается добавлением карбоната кальция и/или/ хлорида кальция к культуральной среде, предпочтительно в количестве 0,1-0,5 г/л и 0,05-0,2 г/л соответственно.
Для развития и размножения нового типа азотфиксирующих растений предпочтительно используют известные в этой области способы in vitro, обычно применяемые для обработки, культивирования или микроразмножения соответственно протопластов, клеток, каллусных тканей, эмбрионов или побегов.
В качестве добавок, утилизируемых также и бактериями, могут быть также использованы "дополнительные" источники углерода, предпочтительно сахароза или глюкоза, а также витамины, аминокислоты и усиливающие рост агенты.
Фиг. 1 представляет собой фотографию, полученную при помощи электронного микроскопа, с увеличением 16000, показывающую клетки Azomonas agilis, включенные в межклеточные пространства черешка листа растения моркови.
Фиг. 2 представляет собой фотографию, полученную при помощи электронного микроскопа, с увеличением 18000, показывающую клетки Azomonas insignis, включенные в межклеточные пространства черешка листа растения моркови.
Основные преимущества способа данного изобретения можно суммировать следующим образом:
a) азотфиксирующее растение, полученное по способу согласно данному изобретению, способно к азотфиксации также в его листьях и поэтому требует мало азотных удобрений или не требует удобрения азотом;
b) можно применять как ауксотрофные, так и прототрофные бактерии;
c) можно применять традиционные способы in vitro;
d) поддерживается хорошо сбалансированный рост как растения, так и бактерий;
e) эндосимбиозы растение/бактерии могут развиваться относительно быстро;
f) в способе можно применять любые виды растений и любые части растений;
g) полученные симбиозы можно быстро размножать с применением способов in vitro, предпочтительно микроразмножения;
h) эффективность нового азотфиксирующего растения может быть увеличена путем применения бактериального мутанта, характеризующегося сверхсинтезом фермента нитрогеназы и/или/ высвобождающего большое количество фиксированного азота.
a) азотфиксирующее растение, полученное по способу согласно данному изобретению, способно к азотфиксации также в его листьях и поэтому требует мало азотных удобрений или не требует удобрения азотом;
b) можно применять как ауксотрофные, так и прототрофные бактерии;
c) можно применять традиционные способы in vitro;
d) поддерживается хорошо сбалансированный рост как растения, так и бактерий;
e) эндосимбиозы растение/бактерии могут развиваться относительно быстро;
f) в способе можно применять любые виды растений и любые части растений;
g) полученные симбиозы можно быстро размножать с применением способов in vitro, предпочтительно микроразмножения;
h) эффективность нового азотфиксирующего растения может быть увеличена путем применения бактериального мутанта, характеризующегося сверхсинтезом фермента нитрогеназы и/или/ высвобождающего большое количество фиксированного азота.
Способ данного изобретения иллюстрирован далее следующими нелимитирующими примерами.
Пример 1. После промывания от остатков сахарозы суспензию клеток моркови инокулируют клеточной суспензией /106-108 клеток/мл; вегетативные клетки и цисты /Azotobacter vinelandii /DSM 87/, затем собранные клетки культивировали при 17-22oC на отвержденной агаром образующей каллус MS культуральной среде [pH 6,2; Physiol. Plant 15, 473-494 /1962/], содержащей 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты /2,4-Д/ в качестве гормона растений и 30 г/л лактозы в качестве единственного источника углерода. Выращенную таким образом каллусную массу переносили на подобную MS-среду, не содержащую гормона 2,4-Д, и культивирование продолжали при идентичных условиях. Регенерированные таким образом растения высаживали в почву и через 2 месяца после стерилизации поверхности /0,2%-ным раствором HgCl2 в течение 1,5 мин/ и гомогенизации определяли содержание бактерий в листьях. Листья содержали 104-105 бактерий на 1 г сырого веса листьев.
Тот же самый эксперимент повторяли на той же MS-среде с тем различием, что культуральная среда не содержала гормона 2,4-Д. Суспензию клеток растений инокулировали клеточной суспензией Azotobacter vinelandii /DSM 87/ и культивировали при 17-22oC на отвержденной агаром культуральной MS-среде, не содержащей 2,4-Д. Регенерированные таким образом растения испытывали тем же путем, что и в случае растений, регенерированных из каллусной массы, росшей на содержащей гормон культуральной среде. Содержание бактерий в листьях было практически тем же самым, т.е. 104-105 бактерий на 1 г сырого веса листьев.
Азотфиксация листьев была доказана определением восстановления ацетилена в атмосфере, содержащей 10% /по объему/ ацетилена, без стерилизации поверхности (755 наномолей C2H2/г сырого веса листа/24 часа) или после стерилизации поверхности (530 наномолей C2H4/г сырого весла листа/24 часа) путем инкубирования тестируемых листьев в течение 14 часов света /1200 люксов/ и 10 часов темноты при 25oC. Культуральная среда содержала 0,1 г/л карбоната кальция в качестве дополнительного источника Ca2+.
Пример 2. Каллусы моркови инокулировали, как описано в примере 1, клетками Azomonas agilis /DSM 375/, затем растения Co-культивировали и регенерировали при 27-32oC на культуральной среде /pH 7,3/, содержащей 30 г/л лактозы в качестве основного источника углерода и 0,1 г/л сахарозы в качестве дополнительного источника углерода.
Регенерированные и включенные в растение бактерии считали после стерилизации поверхности /105-106 бактерий на 1 г сырого веса корней и 106-107 бактерий на 1 г сырого веса листьев и наблюдали при помощи электронного микроскопа. В электронно-микроскопической фотографии фиг. 1 можно видеть микроорганизмы 2, включенные в межклеточное пространство 1, окруженное живыми клетками растений, содержащими хлоропласты 3. После стерилизации поверхности 1 г листа восстанавливали 278 наномолей ацетилена до этилена в день, тогда как 1 г корней восстанавливали 266 наномолей ацетилена в день.
Пример 3. Суспензию моркови инокулировали клетками Azomonas insignis /ATCC-12523/, как описано в примере 1. Культуральная среда содержала 30 г/л галактозы в качестве основного источника углерода и 2,5 г/л глюкозы в качестве дополнительного источника углерода /pH 8,3, 27-33oC, 0,1 г/л хлорида кальция/. Содержание бактерий в регенерированном растении детектировали при помощи электронного микроскопа /105 бактерий/г сырого веса листа/день/. Электронно-микроскопическая фотография показана на фиг. 2, где микроорганизмы 2 включены в межклеточное пространство 1, окруженное клетками растения с хлоропластом 3.
Пример 4. Культуру ростков табака инокулировали через поверхность разреза не содержащей клеточных стенок /L-форма/ культурой Azotobacter paspali /ATCC 23833/ /индуцированной на культуральной среде, содержащей 100 млн-1 пенициллина G, стабилизированной 0,5 М глюкозой/. Полученные таким образом культуры культивировали на культуральной среде, содержащей 0,5 М мальтозы, 100 млн-1 пенициллина G и 0,25 г карбоната кальция /pH 7,3/ в течение 2 месяцев. В последствии культуры культивировали без пенициллина G и с последующим снижением содержания мальтозы культуральной среды идо 10 г/л. После высаживания в почву было обнаружено, что азотфиксирующая активность листьев после стерилизации поверхности была равна 800 наномолям C2H4 на г сырого веса листа/24 часа.
Пример 5. Суспензию клеток моркови инокулировали суспензией Beijerinckia mobilis /DSM 2326/, как описано в примере 1, и культуры Со-культивировали на культуральной среде, содержащей 40 г/л лактозы /pH 5,4, без добавления Ca2+/. Было обнаружено, что азотфиксирующая активность листьев регенерированного растения определенная при помощи теста восстановления ацетилена, была равна 180 наномолям C2H2/г сырого веса листа/24 часа.
Пример 6. После инокуляции клеток моркови суспензией Derxia gumrosa /ATCC 15994/, как описано в примере 3 /pH 7,2/, азотфиксирующая активность листьев регенерированного растения могла быть обнаружена в тесте восстановления ацетилена.
Claims (4)
1. Способ получения эндосимбиоза растение/бактерия, способного к азотфиксации в частях растений, включающий инокуляцию органа растения бактериями семейства Azotobacteraceae в условиях in vitro и сокультивирование обработанного таким образом органа растения на или в культуральной среде, содержащей источники углерода и азота, отличающийся тем, что источником углерода является источник, утилизируемый только клетками растения и не утилизируемый бактериями, добавляемый в количестве не менее 10 г/л, предпочтительно - 20 - 40 г/л, а бактерии семейства Azotobacteraceae представляют виды Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia и Derxia.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактерии используют в виде вегетативных клеток или цист, или форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при использовании форм бактерий, частично или полностью лишенных клеточных стенок, в культуральную среду добавляют основной источник (источники) углерода в концентрации 0,35 - 0,75 М.
4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что при обработке растений бактериями рода Azotobacter или Azomonas в среду дополнительно вносят не более 0,5 г/л карбоната кальция, и/или не более 0,2 г/л хлорида кальция.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP01218/92 | 1992-04-10 | ||
| HU9201218A HU9201218D0 (en) | 1992-04-10 | 1992-04-10 | Process for the entering of non-auxotrophic bacteries -belonging to the azotobacteraceae family - into the intercellular spaces of plant tissues, for their cultivation in vitro, with the aim to create new nitrogenfixing plant-bacterium symbiosis |
| PCT/HU1993/000020 WO1993020685A1 (en) | 1992-04-10 | 1993-04-09 | Process for the development of novel type of plants with nitrogen-fixing capacity also in their leaves |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94045882A RU94045882A (ru) | 1996-09-10 |
| RU2126202C1 true RU2126202C1 (ru) | 1999-02-20 |
Family
ID=10981718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94045882A RU2126202C1 (ru) | 1992-04-10 | 1993-04-09 | Способ получения эндосимбиоза растение/бактерия, способного к азотфиксации в частях растений |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5664368A (ru) |
| EP (1) | EP0634893B1 (ru) |
| JP (1) | JPH07508642A (ru) |
| KR (1) | KR950700683A (ru) |
| AT (1) | ATE181479T1 (ru) |
| AU (1) | AU666008B2 (ru) |
| CA (1) | CA2132967A1 (ru) |
| DE (1) | DE69325449T2 (ru) |
| DK (1) | DK0634893T3 (ru) |
| ES (1) | ES2135473T3 (ru) |
| HU (2) | HU9201218D0 (ru) |
| NZ (1) | NZ251765A (ru) |
| PL (1) | PL171864B1 (ru) |
| RU (1) | RU2126202C1 (ru) |
| WO (1) | WO1993020685A1 (ru) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0121126D0 (en) * | 2001-08-31 | 2001-10-24 | Univ Nottingham | Systemic non-nodular endosymbiotic nitrogen fixation in plants |
| NZ599631A (en) * | 2006-01-30 | 2013-08-30 | Univ Georgia State Res Found | Induction and stabilization of enzymatic activity in microorganisms |
| US7943549B2 (en) * | 2007-04-02 | 2011-05-17 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Biological-based catalyst to delay plant development processes |
| US9993005B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-06-12 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Preventing or delaying chill injury response in plants |
| US10004237B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-06-26 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Inhibiting or reducing fungal growth |
| GB201413333D0 (en) | 2014-07-28 | 2014-09-10 | Azotic Technologies Ltd | Plant inoculation |
| KR101633457B1 (ko) | 2014-11-27 | 2016-07-08 | 갈민규 | 식물생장 촉진방법 |
| CA2991776A1 (en) | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Pivot Bio, Inc. | Methods and compositions for improving plant traits |
| CN111587287A (zh) | 2017-10-25 | 2020-08-25 | 皮沃特生物股份有限公司 | 用于改良固氮的工程微生物的方法和组合物 |
| CN112544444B (zh) * | 2020-12-03 | 2022-03-22 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种用于红花木莲的组培培养基、红花木莲胚性愈伤组织培养的方法及红花木莲快繁的方法 |
| CN114431056B (zh) * | 2021-12-14 | 2022-12-13 | 四川大学 | 一种石质坡面的修复方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3704546A (en) * | 1971-06-04 | 1972-12-05 | Du Pont | Symbiotic fixation of atmospheric nitrogen |
| FR2386504A1 (fr) * | 1977-04-05 | 1978-11-03 | Anvar | Procede microbiologique destine a maitriser la productivite des plantes cultivees |
| GB8611818D0 (en) * | 1986-05-15 | 1986-06-25 | Shell Int Research | Plant generation method |
| DD287185A5 (de) * | 1989-08-21 | 1991-02-21 | Adl Der Ddr Fz Fuer Bodenfruchtbarkeit Muencheberg,De | Verfahren zur verbesserung der pflanzenentwicklung durch kombinierte inokulation von selektierten rhizosphaeren-mikroorganismen |
-
1992
- 1992-04-10 HU HU9201218A patent/HU9201218D0/hu unknown
-
1993
- 1993-04-09 AT AT93909077T patent/ATE181479T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-04-09 JP JP5518160A patent/JPH07508642A/ja active Pending
- 1993-04-09 PL PL93309470A patent/PL171864B1/pl unknown
- 1993-04-09 EP EP93909077A patent/EP0634893B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-09 WO PCT/HU1993/000020 patent/WO1993020685A1/en active IP Right Grant
- 1993-04-09 AU AU39618/93A patent/AU666008B2/en not_active Ceased
- 1993-04-09 DK DK93909077T patent/DK0634893T3/da active
- 1993-04-09 CA CA002132967A patent/CA2132967A1/en not_active Abandoned
- 1993-04-09 RU RU94045882A patent/RU2126202C1/ru active
- 1993-04-09 NZ NZ251765A patent/NZ251765A/xx unknown
- 1993-04-09 ES ES93909077T patent/ES2135473T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-09 DE DE69325449T patent/DE69325449T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-04-09 HU HU9402918A patent/HU219136B/hu unknown
- 1993-04-09 US US08/313,161 patent/US5664368A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-10-10 KR KR1019940703589A patent/KR950700683A/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Natur Col. 252, N 29, 393-394, 1974. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3961893A (en) | 1993-11-18 |
| PL171864B1 (pl) | 1997-06-30 |
| NZ251765A (en) | 1995-09-26 |
| CA2132967A1 (en) | 1993-10-28 |
| AU666008B2 (en) | 1996-01-25 |
| HU9402918D0 (en) | 1995-01-30 |
| DE69325449T2 (de) | 1999-11-18 |
| DE69325449D1 (de) | 1999-07-29 |
| RU94045882A (ru) | 1996-09-10 |
| HU219136B (hu) | 2001-02-28 |
| KR950700683A (ko) | 1995-02-20 |
| HU9201218D0 (en) | 1992-06-29 |
| US5664368A (en) | 1997-09-09 |
| EP0634893A1 (en) | 1995-01-25 |
| ATE181479T1 (de) | 1999-07-15 |
| ES2135473T3 (es) | 1999-11-01 |
| HUT69983A (en) | 1995-09-28 |
| DK0634893T3 (da) | 2000-01-17 |
| WO1993020685A1 (en) | 1993-10-28 |
| JPH07508642A (ja) | 1995-09-28 |
| EP0634893B1 (en) | 1999-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6468779B1 (en) | Aqueous extract of legumes for growing agronomically beneficial microbes | |
| CN109679860A (zh) | 一种用于园林绿色废弃物处理的复合菌剂及其制备方法与应用 | |
| RU2126202C1 (ru) | Способ получения эндосимбиоза растение/бактерия, способного к азотфиксации в частях растений | |
| JPH03232497A (ja) | 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法 | |
| JP2829325B2 (ja) | 抗菌・抗線虫剤、植物細胞活性剤及びそのための微生物 | |
| US20020050096A1 (en) | Aqueous base inoculant composition for seeds, coated seeds and method for storing the composition | |
| CA2984620A1 (en) | Biofertilizer to increase agricultural yield | |
| CA1127102A (en) | Fermentation process | |
| WO1996034840A1 (es) | Fertilizante bacteriano y procedimiento de obtencion | |
| Srivastava et al. | Biofertilizers for sustainable agriculture | |
| Odee et al. | Evaluation of inoculation procedures for Calliandra calothyrsus Meisn. grown in tree nurseries | |
| JP3485401B2 (ja) | 動物性有機肥料の良質腐熟化法 | |
| RU2074158C1 (ru) | Штамм бактерий azotobacter chroococcum, используемый для получения бактериального удобрения под амарант | |
| KR100460633B1 (ko) | 토양의 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주 레클레르시아 아데카르복실라타 케이에스제이8 | |
| JPH07232984A (ja) | 有機質肥料およびその製造方法 | |
| JPH06253827A (ja) | 植物真菌感染防除剤及び防除方法並びにこれに用いる微生物 | |
| WO2020183347A1 (en) | Bioinoculant composition | |
| JPH0578663A (ja) | 土壌改良剤の製造方法 | |
| Eklund et al. | Establishment and disappearance of introduced pseudomonads in the rhizoplane of peat grown cucumber plants | |
| Ali et al. | Isolation, characterization and symbiotic performance evaluation of soybean (Glycine max) nodulating rhizobia from different districts of Bangladesh | |
| JP3542945B2 (ja) | ハタケシメジの人工栽培方法 | |
| TWI306448B (ru) | ||
| SU1076443A1 (ru) | Способ приготовлени посевного материала дл выращивани бактерий | |
| KR970007200B1 (ko) | 에리스리톨의 제조방법 | |
| BR102020009375B1 (pt) | Processo para produção de bio-inoculante e ácido indol-3-acético e composição promotora de crescimento vegetal |