JPH07508642A - 葉にも窒素固定容量を有する新規なタイプの植物の開発方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 葉にも窒素固定容量を有する新規なタイプの植物の開発方法１吸０抜担至団 本発明は，葉にも窒素固定できる新規なタイプの植物を開発、作出する方法に関 する。

尺皿Ω！章至π 窒素の肥料による供給は、効率的であるが、非常に高価であり、非常に環境汚染 を伴うので、窒素は、農業の植物培養の主な制限要因であることは知られて１鳥 る。栽培の概念、″維持できる開発”の概念は、世界的に、外部源を使用する代 わりに、内部源に基づいた製造に向かう傾向にある。従って、肥料を用いる代わ りに、生物学的な窒素固定で行なう可能性を利用することにより、植物に窒素供 給を行なうことが適切である［Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｓｏｉｌ　１４１，　１− １２（１９９２）ｌ．然し、大気窒素ガスを固定することができるのは、幾つか の原核生物（ジアゾトロプ；ｄｉａｚｏＬｒｏｐｈｓンのみである。

所謂、好気性窒素固定バクテリア、アゾトバクテラセア［Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅ ｒａｃｅａｅｌ科に属する多くの属；アゾモナス［Ａｚｏｍｏｎａｓｌ、アゾト バクタ［Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｌ、ベイジエリンスキア［Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃ ｋｉａｌ及びデルキシア［Ｄｅｒｘｉａｌ　［Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ 　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｏｌｏｇｙ．８ｔｈ　ｅｄ ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ．　ＢａｌｔｉｍｏｒｅC第２ ５３頁 （１９７４）］は、大気酸素レベルにおいてら、効果的な窒素固定が可能である が、植物の内部組織空間に入った天然では、不可能である［＾ｚｏｔｏｂａｃｔ ｅｒａｃｅａｅ：ｔｈｅ　Ｔａｘ。

ｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｅｒｏｂｉｃ　Ｎｉｔｒ ｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ　Ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ａｃａｄｅ高奄メ@Ｐｒｅｓ ｓ．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）］、そして、その根の上或いは葉の外側表 面上に載置した場合，それらの種は、顕著な程度に、或いは全部に、植物の窒素 必要量を供給することができることが、証明されることが可能であった（Ｊ．　 Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　７１。

１０３−１１６（１９７２）；Ｊ．　Ｇｅｎ．　、入ｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ．　２５．　２６１−２７０１９７９）；Ｃａｎ．　ＪD　Ｂａｔ。

レベル酸素で窒素を固定する微好気性シアシトロブ［ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓｌ は、細胞内のエンドシンビオセ［ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｓｅｓｌ　［非根粒菌嚢 植物中の窒素固定バクテリア、Ｓｃｊ．　Ｔｅｃｈ．　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ／ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，　ｐｐ．８４− ８８（１９８７j］を形成 することのみが可能であるが、それは、根にのみある窒素ガスを固定でき、即ち 、光合成サイトからは遠いものである。

現在まで、２つの研究が行なわれ、試験管内条件で、植物細胞とともに共存培養 アゾトバクタ種を培養した。

第一の研究［Ｎａｔｕｒｅ訂淫，３９３〜３９５（１９７４）ｌにおいて、アデ ニン独立栄養性のアゾトバクタ　ビネランヂイ［Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉ ｎｅｌａｎｄｉｉｌ変異株を、砂糖含有媒体上で、人参細胞と共存培養する。そ の砂糖含有媒体は、窒素なし、或いは、植物生長に不足量の窒素を含有している 。このようにして得られた混合細胞培養物は、１８ケ月間生長を保持し、窒素固 定活性を示した。そして、バクテリアは、生きている植物細胞の間に観察された 。然し乍ら、この方法は、いくつかの短所を有する。即ち、アゾトバクタ種の独 立栄養変異株が、使用されるが、その高い数の”染色体［ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｌ　”により単離することが困難である［Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、　！ ３８、　８７１−８７７（１９７９）］　；培養物の生長が遅い；システムが、 窒素存在下で不安定である；植物が再生できない；この方法の適用範囲は、独立 栄養性の株の数が低いために、よく研究された、少しの種に限定されている。

もう一つの実験［Ｚ．　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．　９５．　１４１− １４７（１９７９）］においては、バクテリアは、植物組織を、エンガルフして 、それを破壊した。従って、長期間にわたり培養し、窒素固定植物を開発、作出 することは不可能になった。

■呪し鼻！ 本発明の目的は、このような公知の方法の短所を除去し，その方法を開発し。

それにより、試験管内条件下で、その葉にも窒素固定でき、その内部空間におい てアゾトパクタラセアエ属に属するバクテリアを含有する植物を開発することを 可能にする。

尺五二耗坦ｌ腹皿 本発明は、試験管内条件で、アゾトバクテラセア（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃ ｅａ）科に属する、原栄養性で、急速生長性で、大気酸素レベルでも窒素固定能 力を有するバクテリアを、植物内部空間に包含せしめ、植物細胞に実際的に使用 するに最適に栄養供給する代わりに、都合がよくない栄養供給を与えるように栄 養源を添加する場合に、内部空間中に転移増殖せしめることが可能であるという 認識に基づいたものである。即ち、そのような栄養供給を使用することにより、 植物及びバクテリア細胞は、平均して生長でき、バランスよく生長できるが、一 方、試験管内で植物を培養するために使用される伝統的な媒体上では、その生長 速度が高いオーダーであるために、バクテリアは、ホスト植物組織を過生長せし め、それらを破壊してしまうということは、従来認識されている。

本発明は、更に、両方のパートナ−がよくバランスして生長することが、試験管 内培養中に、植物のみにより代謝できる、即ち、植物代謝の生成物のみが、バク テリア生長のために、同時開発に必要な程度に、利用できる主な炭素源を使用す ることにより維持できるという認識に基づいたものである。この認識は、共存培 養において、培養物の生長が、植物細胞により利用される炭素源により、少しし か供給されなく、それは、実際上、代謝審査のためのみに或いは試験管内植物培 養のため偶々のみ使用されるのだから、驚くべきものである。

本発明は、更に、最適な窒素源を栄養媒体中に供給することが、窒素固定バクテ リアと共存培養される植物が、高い確率と個数での培養から全植物を増殖させる ために、必要であるという認識に基づいているものである。これは、生体内共生 関係の影成のために、試験管内共生関係が必要でないことを意味しており、従っ て、上記の目的は、共生でない共存培養によっても達成される。今まで、そてい る植物組織を生長せしめるために、優位的であったというので、この認識は、驚 くべきことである。

最後に、本発明は、アゾトバクタ、アゾモナス、ベイジエリンスキア及びデルキ シア属の構成員は、新規なタイプの窒素固定植物を開発、作出するために、好適 に利用できるという認識に基づいている。この認識は、従来の知識によると、所 謂、遊離で生きているバクテリアは、生体内条件下で、植物の内部空間内に、コ ロニーを作らない、天然条件下では、そのような緊密な共同体を作らない傾向が ある［Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ：Ｔｈｅ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ａｎｄ 　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｅｒｏｂｉｃ　Ｎｉ狽窒盾■■■ −ｆｉｘｉｎｇ　Ｂａｃｔｅｒｉａ；　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）］ので、驚くべきことである。従って、窒素固定共生 を、新規な植物種まで拡大することは、既知の天然の共生物と、緊密な体内栄養 性共同体によりのみでは、達成できない。

上記の考察に基づいて、本発明は、葉にも窒素固定能力を有する新規なタイプの 植物を開発する方法に関する。本発明によると、試験管内条件下で生長され、そ して／或いは処理された植物原形質、細胞、組織、胚或いは器官は、アゾトバク テラセア（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａ）科に属するバクテリアと共に、接 種され、次に、このようにして得られた培養物は、１５〜３５℃の温度で共存培 養され、所望により、増殖され、そして／或いは、全植物が、同じ温度で、試験 管内条件下で、主な炭素が、植物細胞のみにより、そして、任意に他の添加剤に より、再生される。

アゾトバクテラセア（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａ）科に属する属；アゾト バクタ、アゾモナス、ベイジエリンスキア及びデルキシアの種は、大気酸素レベ ルで窒素固定能力を有する有機栄養性のバクテリアとして、好適に用いられる。

バクテリアの細胞壁から部分的に或いは全体的に採取された植物細胞、嚢胞（Ｃ ｙｓｔｓ）及び形態は、培養のために、好適に使用される。

ラクトース、マルトース、ガラクトース、セルロビオース、澱粉、ラフィノース 分解酵素及び／或いはソルビトールは、植物細胞のみにより利用される、主な炭 素源として、好適に用いられる。これらの主な炭素源は、少なくとも１０ｇ／ｌ 、好適には２０〜４ｏｇ／Ｉの濃度で、培養媒体に、都合よく添加される。これ らの細胞壁より部分的或いは全体的に採取されたバクテリアの場合、主な炭素源 は、０．３５〜０．７５Ｍの濃度で適切に使用される。

本発明の方法において、培養媒体のｐＨ値は、バクテリア生長の最適な値に、好 適には、調整され、この値は、属アゾトバクタ、アゾモナス及びデルキシアに対 しては、５．５〜９．５であり、属ベイジエリンスキアに対しては、３〜９゜５ である。

本発明の方法において、アゾトバクタ及びアゾモナス属のいくつかの種が生長す るに必要な追加のＣａ”は、好適には、炭酸カルシウム及び／或いは塩化カルシ ウムを、培養媒体に、各々、０．１〜０．５ｇ／ｌ及び０．０５〜０．５ｇ／ｌ の量で添加することにより、供給される。

各々、プロトプラスト、細胞、細胞質組織、エンブリオ或いはスプロウトを、処 理し、培養し或いは微生物増殖するために通常用いられる、既知の試験管内技術 は、窒素固定植物の新しいタイプの開発及び増殖のために好適に用いられる。

”補足的２な炭素源、好適には、砂糖或いはグルコース及びアミノ酸及び生長促 進剤も、バクテリアにより利用できる添加剤として１本発明の方法に用いること ができる。

図面の簡単な説明 図１は、１６．０００倍率の電子顕微鏡写真であり、人参植物の葉茎の細胞内空 間に包含せしめたアゾモナス　アギリス［Ａｚｏｍｏｎａｓ　ａｇｉｌｉｓｌ細 胞を示す。

図２は、１８，０００倍率の電子顕微鏡写真であり、人参植物の葉茎の細胞内空 間に包含せしめたアゾモナス　インジグニス［＾ｚｏｔｎｏｎａｓ　ｉｎｓｉｇ ｎｉｓｌ細胞を示す。

本発明による方法の主な長所は、次のように概略できる。

ａ）本発明の方法により作出される窒素固定植物は、その葉にも窒素固定能力が あり、窒素肥料の必要性がないか、少ないものである。

ｂ）独立栄養性及び原栄養性の両方のバクテリアが使用できる。

Ｃ）伝統的な試験管内技術が使用できる。

ｄ）植物及びバクテリアの両方の良くバランスされた生長が保持される。

ｅ）植物／バクテリアのエンドシンビオースが比較的急速に増殖する。

ｆ）いかなる植物もいかなるバクテリアも、本発明の方法に使用できる。

ｇ）開発されたシンビオースは、試験管内方法を使用して、好適には、微生物増 殖法により、急速に増殖できる。

ｈ）新規な窒素−固定植物の効率は、ニトロゲナーゼ酵素を過製造し、大量の固 定化窒素を放出するバクテリア変異を使用することにより、上げることができる 。

本発明の方法を９次の実施例により例示するが、限定する実施例ではない。

寒鼻但工 砂糖残部を洗浄した後、人参細胞懸濁物を、アゾトバクタ　ビネランヂイ（Ａｚ 。

ｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）（ＤＳＭ８７）の細胞懸濁物（１０ ’−１０’細胞／ｍｌ；栄養性細胞と嚢胞）で接種し、次に、回収した細胞を、 １７〜２２℃で、植物ホルモンとして、２，４−ジグｏｏフェノキシ酢酸（２， ４−Ｄ）０．５ｍｇ／Ｉ、及び単一の炭素源として、ラクトース３ｏｇ／Ｉを含 有する、アガー固化されたカルス（ｃａｌＩｕｓｅ）形成ＭＳ培養媒体［ｐ　Ｈ ＝　６　、　２　；Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　１５．４７３−４９４（１ ９６２）］上で、培養した。このようにして生長されたカルスマスを、２．４− Ｄを含有しない同様のＭＳ−媒体に移し、そして、培養を、同じ条件下で続けた 。このように再生した植物を、土壌に植えて、２ケ月後、その葉のバクテリア添 加量を、表面滅菌（Ｈｇ　ＣＩ　ｌの０．２％溶液で、１．５分）し、均質化し た後、測定した。葉は、新鮮な葉重量１ｇに対して、１０″〜１０’個のバクテ リアを含有していた。

同じ実験を、培養媒体は、２．４−Ｄを含有していないで、同じＭＳ−媒体上で 繰り返した。即ち、植物細胞懸濁物に、アゾトバクタ　ビネランヂイ（Ａｚｏｔ ｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉＸＤｓＭ８７）の細胞懸濁物で接種し、 １７−２２℃で、２．４−Ｄ含有をしない、アガー同化されたＭＳ培養媒体上で 培養した。このようにして再生された植物は、ホルモン含有培養媒体上で生長さ れたカルスマスから再生された場合と同じ方法で検査された。その葉のバクテリ ア含有量は、実際上同じであり、即ち、新鮮な葉重量１ｇに対して、１０４〜１ ０’個のバクテリアを含有していた。

葉による窒業固定は、アセチレン還元を検査することにより証明され、葉を、１ ４時間の光（１２００ルツクス）と１０時間暗所で、２５℃でテストされた葉を 、培養することにより、表面殺菌なしで、１０容量％のアセチレンを含有する雰 囲気中で、（新鮮な葉１ｇにって、２４時間で、Ｃ＊Ｈｍ７５５ナノモル）、そ して、表面殺菌後で、（新鮮な葉１ｇにって、２４時間で、Ｃ，Ｈ，５３０ナノ モル）であった。この培養媒体は、補足的Ｃａ１４源として、炭酸カルシウム０ ．１ｇ／ｌ含有していた。

寒履厖ヱ 人参カルスに、アゾモナス　アギリス［Ａｚｏｍｏｎａｓ　ａｇｉｌｉｓ（ＤＳ Ｍ　３７５月細胞を、実施例１の方法により接種した。そして、植物が、２７〜 ３２℃で、主な炭素源として、ラクトース３０ｇ／Ｉ、補足的炭素源として砂糖 ０．１ｇ／ｌを含有する培養媒体（ｐＨ＝７．３）上に共存培養された。

植物に再生され、包含されたバクテリアを１表面滅菌の後に、数えた（新鮮な根 １ｇ当ワ１０’〜１０′個バクテリア／ｇ及び新鮮な葉１ｇ当り１０’〜１０’ 個のバクテリア）６そして、電子顕微鏡により示された。図１の電子顕微鏡写真 では、葉緑素３を含有する生きている植物鎖により囲まれた細胞内空間１内に包 含された微生物２が見える。表面滅菌後、１ｇめ葉は、１日で、アセチレン２７ ８ナノモルをエチレンに還元したが、１ｇの根では、１日で、２６６ナノモルの アセチレンを還元した。

寒＾豊１ 人参細胞懸濁物に、アゾモナス　インジグニス［Ａｚｏｍｏｎａｓ　ｉｎｓｉｇ ｎｉｓ細胞（ＡＴＣＣ−１２５２３月を、実施例１の方法により接種した。そし て、培養媒体は、主な炭素源として、３０ｇ／ｌのガラクトースを、補足的炭素 源として、２．５ｇ／ｌのグルコースを含有する（ｐＨ＝８．３．２７〜３３℃ 、０，１ｇの塩化カルシウム）。再生された植物のバクテリア含有率は、電子顕 微鏡により観察された（新鮮な葉１ｇ／日で１０’個のバクテリア）。電子顕微 鏡写真は、図２に示され、微生物２は、細胞内空間１内に包含され、植物細胞の 葉緑素３と共にある。

寒＾五エ タバコの画壇１１＃Ｊに、アゾトバクタ　バスバリ【Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　 ｐａｓｐａｌｉ（ＡＴＣＣ２３９３３）］の］細胞−壁−遊離Ｌ−形）培養物を 接種する（１ｏｏｐｐｍのペニシリンＧを含有し、０．５Ｍのグルコースで安定 化された培養媒体上に採取された）。このようにして得られた培養物は、０．５ Ｍのマルトース、１１００ｐｐのペニシリンＧ及び０．２５ｇの炭酸カルシウム を含有する（ｐＩ（−７，３）培養媒体上に、２ケ月、培養した。次に、培養物 を、ペニシリンＧなしで培養し、そのため、培養媒体のマルトース含有率を、１ ０ｇ／Ｉに低減していく、植物にしていった後、植物の葉の窒素固定活性は、表 面滅菌した後、測定され、新鮮な葉／２４時間で８００ナノモルのＣ＊　Ｈａ　 ／　ｇであった。

寒鼻皿立 人参細胞懸濁物に、ペイジェリンスキア　モビリス［Ｂｅ１ｊｅｒｉｎｃｋｉａ 　ｍｏｂｉｌｉｓ（ＤＳＭ　２３２６）］！！濁物を、実施例１の方法により接 種した。そして、培養物は、ラクトース４０ｇ／ｌ含有する培養媒体（ｐＨ＝５ ．４、Ｃａ”補足なし）上に共存培養した。再生されたＷ物の葉、の窒素固定活 性は、アセチレン還元テストにより測定され、新鮮な葉／２４時間で１８０ナノ モルのＣｘＨｔ／ｇであった。

寒＾盟亙 人参細胞に、デルキシア　グムノサ［Ｄｅｒｘｉａ　ｇｕｍｎｏｓａ（ＡＴＣＣ １５９９４）］懸濁物を、実施例３の方法により接種した（ｐＨ−７，２）後、 再生された植、物の葉の窒素固定活性が、アセチレン還元テストにより、提示で きた。

Ｆｉｇ、　１ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＮｉＬ 、　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、 　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、 ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ。

ＳＫ、　ＵＡ、　ＴＪＳ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．試験管内条件下で生長され、そして／或いは処理された植物の原形質、細胞 、組織、胚或いは器官に、アゾトバクテラセア（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅ ａ）科に属するバクテリアを接種し、 次に、このようにして得られた培養物を、１５〜３５℃の温度で、共存培養し、 そして、 所望により、全植物を、試験管内条件下で、窒素及び主な炭素源を含有し、植物 細胞によりのみ利用でき、そして、任意に他の添加剤を含有する培養媒体上或い は中で、増殖せしめ、そして／或いは、再生せしめることを特徴とする葉にも窒 素固定能力を有する新規なタイプの植物を開発、作出する方法。
2. ２．アゾトバクテラセア（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａ）科に属する属；ア ゾトバクタ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾモナス（Ａｚｏｍｏｎａｓ）、ベ イジェリンスキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）及びデルクシア（Ｄｅｒｘｉａ ）の種を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．接種のために、バクテリアの細胞壁から部分的或いは全体的に採取した増殖 性の細胞、嚢胞或いは形態を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ４．植物細胞にのみ利用される主な炭素源として、ラクトース、マルトース、ガ ラクトース、セルロビオース、澱粉、ラフィノース分解酵素及び／或いはソルビ トールを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. ５．少なくとも１０ｇ／ｌ、好適には、２０〜４０ｇ／ｌの濃度で、該主な炭素 源を、培養媒体に添加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. ６．その細胞壁から全体的に或いは部分的に採取したバクテリアのための培養媒 体に、０．３５〜０．７５Ｍの濃度で、該主な炭素源を添加することを特徴とす る請求項１に記載の方法。
7. ７．培養媒体のｐＨ値を、属；アゾトバクタ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾ モナス（Ａｚｃｍｏｎａｓ）或いはテルクシア（Ｄｅｒｘｉａ）に属するバクテ リアのためには、５．５〜９．５に、属；ベイジエリンスキア（Ｂｅｉｊｅｒｉ ｎｃｋｉａ）に属するバクテリアのためには、３〜９．５に維持することを特徴 とする請求項１に記載の方法。
8. ８．アゾトバクタ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）及びアゾモナス（Ａｚｏｍｏｎａ ｓ）属を用いる場合、他の添加剤として、０．５ｇ／ｌの炭酸カルシウム及び／ 或いは０．２ｇ／ｌの塩化カルシウムを用いることを特徴とする請求項１に記載 の方法。
9. ９．“補足的”炭素源、好適には、砂糖或いはグルコース、更に、ビタミン、ア ミノ酸及び生長促進剤を他の添加剤として、用いることを特徴とする請求項１に 記載の方法。