ES2347232T3 - Ensayo de citotoxicidad. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la citotoxicidad de un agente a ensayar, el método comprende: (a) contacto de células vivas en medio de cultivo contenidas en una vasija, con una cantidad predeterminada de agente a ensayar; y (b) incubado de células en el medio de cultivo del paso (a) durante una cantidad predeterminada de tiempo; después (c) adición a las células y al medio de cultivo del paso (b) de un reactivo mezcla que no sea tóxico para las células vivas, donde el reactivo mezcla comprende: un solvente, un colorante que tenga un estado oxidado y un estado reducido donde el estado reducido pueda ser distinguido del estado oxidado y donde el colorante esté inicialmente presente en el estado oxidado, un agente transferidor de electrones, un sustrato para la enzima citoplasmática que tenga una vida media mayor de dos horas, y un cofactor para la enzima citoplasmática; y después (d) medida del medio de cultivo del paso (c) para la producción del estado reducido del colorante, siendo causada la producción del estado reducido del colorante por la enzima citoplasmática específica para el sustrato dentro del reactivo mezcla añadido en el paso (c), donde la enzima citoplasmática ha sido liberada de las células muertas y de las células moribundas dentro de la vasija, a través de la cual se determina la citotoxicidad del agente a ensayar.
Description
Ensayo de citotoxicidad.
Esta invención está dirigida a ensayos para la
determinación del efecto citotóxico de un compuesto a ensayar dado
o de unas determinadas condiciones de ensayo. El método inventivo
mide la liberación de un componente citoplasmático proveniente de
las células teñidas y muertas, teniendo el compuesto citoplasmático
una vida media en el medio de cultivo mayor de dos horas, y
preferiblemente mayor de cuatro horas a 37ºC. El componente
citoplasmático se mide mediante la conversión de un colorante
indicador. El componente citoplasmático preferido para ser medido
es la enzima lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima que cataliza
la oxidación del lactato a piruvato. Por lo tanto, en la
realización preferida, se liga una oxidación catalizada por la LDH a
una reducción catalizada por la diaforasa de unas especies
no-fluorescentes para rendir un fluoróforo. Se
revelan también los kits para la práctica de la invención.
Los métodos para determinar la citotoxicidad y
la viabilidad celular en respuesta a la exposición de un agente a
probar dado son la llave importante a pruebas farmacéuticas y
medioambientales, pruebas de pesticidas y herbicidas,
descubrimiento de medicamentos, etc. Concretando, para determinar si
un determinado agente químico presenta un riesgo real o potencial
cuando es expuesto a un determinado tipo de célula se requiere un
método que fiel, precisa y exactamente mida la citotoxicidad y/o
viabilidad celular tras la exposición al agente a ensayar.
Un método común de determinación de la
viabilidad celular se basa en la habilidad de la membrana celular de
las células viables para excluir colorantes vitales como el azul
tripán y el yoduro de propidio. Las células vivas excluyen estos
colorantes vitales y no se tiñen. Por el contrario, las células
muertas y agonizantes han perdido la integridad de la membrana y
permiten a estos colorantes entrar en el citoplasma, donde los
colorantes tiñen compuestos y organelas dentro de la célula.
Las células no-viables que han
perdido la integridad de la membrana también dejan escapar
componentes citoplasmáticos al medio circundante. Así la muerte
celular se puede medir mediante la monitorización de la
concentración de estos compuestos celulares en el medio
circundante. Un método tal se describe en Corey et al. (1997)
J. Immunol. Meth. 207: 43-51. En este ensayo
se mide la liberación de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (G3PDH) a partir de células muertas o dañadas
mediante el acoplamiento de la actividad de la G3PDH liberada a la
producción de ATP.
Otros métodos para probar la viabilidad o la
muerte celular dependen de la conversión de un colorante desde un
estado a otro. Por ejemplo, en un formato típico, previo a la
reacción, el colorante absorbe a una primera longitud de onda de
radiación. El colorante se convierte después en un producto que
absorbe a una segunda (y diferente) longitud de onda de luz.
Mediante la monitorización de la conversión del colorante de un
estado a otro se puede determinar el grado de viabilidad celular o
de muerte celular. Para este propósito se muestran en este artículo
un número de colorantes adecuados. De estos indicadores, los que se
usan más frecuentemente son los colorantes aceptores de electrones
como las sales de tetrazolio. Las sales de tetrazolio informadas en
este artículo incluyen MMT (bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio),
XTT (ácido (sodio
3'-{(1-fenilamino-carbonil)-3,4-tetrazolio}-bis(4-metoxi-6-nitro)
bencenosulfónico hidrato) y, MTS (sal interna de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio).
Se ha descrito un ensayo típico de viabilidad
celular y de proliferación usando MTS (Buttke et al., (1993)
J. Immunol. Methods, 157: 233-240). Dunigan
et al., (1995, BioThechniques, 19:
640-649) procede a describir que uno de los sellos
del metabolismo es la generación de energía mediante complejas
reacciones redox de moléculas orgánicas. Un gran número de estas
reacciones utilizan \beta-nicotinamida adenina
dinucleótido (NADH) o \beta-nicotinamida adenina
dinucleótidofosfato (NADPH) como donantes de hidrógeno. Mientras es
teóricamente posible monitorizar directamente las concentraciones de
NADH y NADPH mediante espectrofotometría, desde un punto de vista
práctico, el análisis espectrofotométrico directo está limitado
debido a la presencia de numerosos compuestos que absorben luz
cerca del máximo de absorción del NADH y del NADPH
(\varepsilon=16.900 a \lambda_{max} de 259 nm). Por ejemplo,
NAD+, NADP+, DNA, RNA, y la mayoría de las proteínas tienen un
máximo de absorción a aproximadamente 260 nm.
Buttkle et al. describe, usando MTS para
medir indirectamente la reducción causada por las células vivas
proliferantes, el MTS teniendo una absorbancia en la región del
visible cuando está en su forma reducida. La reducida, forma
formazen del MTS, es soluble en agua y tiene un amplio máximo de
absorción centrado a 450-580 nm. Los experimentos
descritos por Dunigam et al. son enteramente libres de
células. Las soluciones de MTS y MTS/fenazina metosulfato (PMS) se
prepararon como soluciones madre y se añadieron distintas
combinaciones de enzimas y agentes reductores a alícuotas de esta
solución madre y se analizaron espectrofotométricamente a lo largo
del tiempo. Se analizaron varias combinaciones de NADH, NADPH,
ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, ácido málico, ácido
isocítrico, maleato deshidrogenasa y isocitrato deshidrogenasa. Los
autores encontraron que el MTS sólo se convierte únicamente a su
forma reducida de estructura formazen muy lentamente. La reactividad
del MTS, en cambio, se acelera enormemente mediante la adición del
reactivo transferidor de electrones PMS al 5% a la solución de
reacción. De esta forma, los autores concluyen que el MTS/PMS es un
monitor útil de la generación de NADH y NADPH en sistemas acuosos
libres de células.
Lancaster et al., Nº de Patente U.S.
5.501.959, publicada el 26 de marzo de 1996, describe un ensayo de
viabilidad y de proliferación en el que microorganismos, células
tisulares, o similares, son incubados en medio de crecimiento en
presencia del colorante resazurina y un compuesto a ser ensayado. Se
añadió también a la mezcla de reacción un agente estabilizador
redox, al que se le ha dado el nombre de agente "envenenante",
con el fin de inhibir la autorreducción
no-específica de la resazurina debido a los
componentes encontrados dentro de la mayoría de los medios de
cultivo. En este ensayo, el colorante resazurina es reducido por la
actividad de las células vivas. Así, en el ensayo de Lancaster
et al., el colorante resazurina se usa como un indicador
redox para detectar el crecimiento microbiano, no la muerte
microbiana. La forma reducida de la resazurina, conocida
trivialmente como resorufina, puede ser detectada fluorimétricamente
y colorimétricamente. La resazurina, la forma oxidada del
colorante, es azul, mientras la resorufina, la forma reducida del
colorante, es roja.
Se pueden adquirir comercialmente varios ensayos
citotóxicos. Por ejemplo, Molecular Probes de Eugene, Oregon,
comercializa un kit de ensayo de citotoxicidad bajo la marca
registrada "Vybrant". El ensayo marca "Vybrant" detecta
la liberación de la enzima citoplasmática
glucosa-6-fosfato deshidrogenada
(G6PDH) de las células muertas y moribundas. Este ensayo detecta
G6PDH mediante un proceso en dos pasos que conduce a la reducción
de la resazurina a resorufina. La literatura de los productos de
Molecular Probes establece específicamente que las incubaciones no
sean de más de 24 horas "provocaría una degradación significativa
de la G6PDH, perjudicando los resultados del ensayo". Ver
prospecto informativo del producto de Molecular Probes nº
V-23111, revisado el 22 de Octubre de 2001. De
todas formas, en manos de los inventores presentes, la vida media de
la G6PDH seguido de la lisis celular a 37ºC se estimó ser menor de
dos horas a 37ºC, por lo tanto, resultando este kit inapropiado
para el ensayo citotóxico para mayores espacios de tiempo.
Promega Corporation de Madison, Wisconsin, vende
una línea de ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y
proliferación celular bajo las marcas registradas de "CellTiter
96", "CellTiter-Glo" y "CytoTox 96".
Ver los boletines técnicos de Promega nºs 112 (publicado en 1991),
169 (publicado en Junio de 1993), 245 (publicado en Agosto de
1996), y 288 (publicado en Marzo de 2001).
La literatura de los productos "CytoTox 96,
Ensayo citotóxico no-radioactivo" (boletín
técnico 163 de Promega Corporation, publicado en Septiembre de
1992) describe un ensayo colorimétrico que puede ser usado en lugar
de los ensayos citotóxicos de liberación de Cr-51.
Este ensayo mide cuantitativamente la liberación de lactato
deshidrogenasa tras la lisis celular. La LDH en sobrenadantes de
cultivos se mide con un ensayo enzimático acoplado el cual resulta
en la conversión de la sal de tetrazolio al producto formazan rojo.
La cantidad de color formado es proporcional al número de células
lisadas.
El ensayo de Promega marca "CytoTox 96",
ensayo citotóxico no-radioactivo, por ejemplo, es un
ensayo colorimétrico para la determinación de la citotoxicidad de
un compuesto a ensayar. Este ensayo mide cuantitativamente la
liberación de la LDH a partir de las células muertas usando la
reducción del INT ligada a enzima, y el colorante tetrazolio tipo
MTS (ver Nº de Patente U.S. 5.185.450 para una amplia descripción
del colorante MTS). Este ensayo es un protocolo en dos pasos (p.
ej., es no-homogéneo) y el colorante INT se detecta
colorimétricamente. Este ensayo usa condiciones que son
incompatibles con las células eucariotas vivas ya que la reacción
tiene lugar a pH de 8,5 con un detergente presente
(Triton-X100).
Genotech de St. Louis, Missouri, vende un ensayo
citotóxico basado en la lactato deshidrogenada (LDH) bajo la marca
registrada de "CytoScan". El ensayo de marca "CytoScan" es
un método colorimétrico que mide la liberación de la LDH de las
células muertas. La liberación de la LDH por las células muertas se
mide mediante una reacción enzimática acoplada que resulta en la
reducción de la sal de tetrazolio en formazan de color rojo. La
actividad LDH se determina luego como una función de la oxidación
del NADH o de la reducción del tetrazolio durante un periodo de
tiempo definido. Ver el catálogo Genoteca nº
786-210. Se comercializan kits esencialmente
idénticos por Panvera de Madison, Wisconsin (LDH Cytotoxicity
Detection Kit, Oxford producto nº TAK MK401), Oxford Biomedical
Research de Oxford, Michigan (Colorimetric Cytotoxicity Assay Kit,
Oxford producto nº LK 100), y Roche Molecular Biochemicals de
Indianápolis, Indiana (Cytotoxicity Detectio Kit, Roche catálogo nº
1 644 793). Todos estos kits requieren un procedimiento en dos
etapas para eliminar el medio de cultivo a un contenedor separado y
estos son no-homogéneos.
Sigma de St. Luois, Missouri, vende dos kits de
ensayo in vitro distintos bajo los nombres de producto de
"Tox-7" y "Tox-8". El kit
"Tox-7" está basado en la LDH y es
esencialmente idéntico al ensayo de marca "CytoScan" de
Genotech descrito en el párrafo anterior. El ensayo
"Tox-7" es un proceso en dos pasos que requiere
la transferencia de un sobrenadante o de un lisado celular a un
vaso separado, donde el sobrenadante o el lisado es analizado
después. Los procesos en dos pasos no son los preferidos para el
barrido a gran escala debido al requerimiento de un incremento de
los materiales de manipulación. El colorante de tetrazolio concreto
usado en el kit "Tox-7" de Sigma no se
especifica, pero la literatura del producto indica que la reacción
es medida espectrofotométricamente a 490 nm, el máximo de absorción
típico de los formazanes (y la misma longitud de onda especificada
en el producto de
Genotech).
Genotech).
Todos estos kits disponibles comercialmente
requieren la transferencia del sobrenadante del cultivo a un vaso
adicional para la medida de la actividad enzimática de la LDH y por
lo tanto, no-homogéneos.
\newpage
En el ensayo de Sigma
"Tox-8", la bioreducción de la resazurina por
las células viables (células no muertas) resulta en la formación de
resorufina. El grado de colorante reducido se puede medir
fluorimétricamente o espectrofotométricamente.
Biosource, Internacional (Camarillo, California)
vende kits para medir proliferación celular y viabilidad bajo la
marca registrada "alamarBlue", (ver el catálogo nºs DAL1025 y
DAL1100). Igual que la resazurina, el colorante de marca
"alamarBlue" se puede usar para monitorizar el entorno reductor
de las células vivas. La tecnología subyacente de este producto
comercial se describe en Lancaster, Nº de Patente U.S.
5.501.959.
El uso de almohadillas absorbentes impregnadas
con resazurina y antibióticos para el test de susceptibilidad
antimicrobiana se describe en Baker et al. (1980)
Microbiol. 26: 248-253 y Nº de Patente
Canadiense 1.112.140. Los aislados bacterianos son aplicados a las
almohadillas en un caldo de infusión de cerebro y corazón. De todos
modos, los protocolos descritos no son adecuados para la
determinación de concentraciones mínimas inhibidoras (CMI).
Kanazawa et al. (1996) J. Antibiotics 19:
229-233 también describe el uso de almohadillas
absorbentes impregnadas con resazurina y agentes antimicrobianos
para su uso en el test de susceptibilidad. Brown et al.
(1961) J. Clin. Path. 5: 10-13 y Nº de
Patente U.S. 3.107.204 describe el uso de almohadillas absorbentes
impregnadas de un indicador redox de tetrazolio y agentes
microbianos, también para usarlos en el test de
susceptibilidad.
Queda, no obstante, una necesidad largamente
anhelada y no encontrada de un ensayo citotóxico que mida muerte
celular (mejor que viabilidad), en el que el ensayo sea rápido, los
componente no sean tóxicos (y por lo tanto el test se pueda llevar
a cabo en presencia de las células a ser investigadas), y en el que
los componentes citoplasmáticos medidos tengan una vida media mayor
de 2 horas.
En reconocimiento de las carencias arriba
mencionadas, una primera realización de la invención está dirigida
a un método para la determinación de la citotoxicidad de un agente a
ensayar. El método comprende, en primer lugar, la adición de una
cantidad predeterminada del agente a ensayar a un vaso que contiene
células vivas en medio de cultivo. Se incuban después las células
en el medio de cultivo durante una determinada cantidad de tiempo.
Después se les añade a las células incubadas y al medio de cultivo
un reactivo mezcla que es no-tóxico para las
células todavía vivas en el medio de cultivo. El reactivo mezcla
comprende un solvente, un colorante que tiene un estado oxidado y
un estado reducido en el que el estado reducido puede ser
distinguido del estado oxidado y en el que el colorante está
presente inicialmente en el estado oxidado, un agente transferidor
de electrones, un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene
una vida media mayor de dos horas, y un cofactor para la enzima
citoplasmática. El contenido del vaso se mide después para la
producción del estado reducido del colorante. El estado reducido
del colorante se produce por la enzima citoplasmática que convertirá
el sustrato incluido en el reactivo mezcla en el producto deseado.
La enzima citoplasmática es liberada por las células muertas y
moribundas dentro del vaso, aunque también podría estar presente
como un componente del medio celular como es el suero. Por lo
tanto, mediante la cuantificación de la cantidad de esta enzima
indirectamente (mediante la detección del estado reducido del
colorante) y restando la cantidad de fondo presente antes de que
tenga lugar el compromiso celular, se puede determinar la muerte
celular causada por un agente a ensayar.
La invención también abarca kits para realizar
el método arriba descrito. El reactivo mezcla que se usa en este
método (y proporcionado en el kit) se puede añadir directamente al
medio de cultivo (con las células presentes) sin afectar
adversamente a la viabilidad celular durante la duración del ensayo.
En la incorporación preferente, el método y el kit correspondiente
rinde unos resultados esencialmente de inmediato, generalmente en
10 minutos. Los datos pueden ser recogidos ya sea colorimétricamente
o fluorimétricamente. La medida fluorimétrica es más sensible y es
el medio preferido para la detección de resorufina. En otras
realizaciones, los datos se pueden recolectar muy rápidamente tras
la adición del reactivo mezcla, con el proceso de adquisición de
datos generalmente siendo posible en cuestión de segundos o
minutos.
Es preferido que el método en conjunto se lleve
a cabo en un único vaso. Esto es, que las células estén localizadas
dentro del vaso que contiene el medio adecuado. El agente a ensayo
se añade al recipiente. El recipiente con las células y el agente a
ensayo se incuban. El reactivo mezcla se añade después al mismo
recipiente, en presencia de las células incubadas (mejor que coger
una alícuota libre de células y añadir el reactivo mezcla a ella).
Luego se mide el medio celular (colorimétricamente o
fluorimétricamente). La realización preferente de la invención es
de este modo "homogénea", homogéneo designando que el método
entero se lleva a cabo en un recipiente único, mejor que el
requerimiento de alícuotas a ser transferidas y ensayadas en un
recipiente distinto. Esto hace al método presente altamente
adecuado para la automatización a gran escala, donde es deseable que
el material usado y los requerimientos de manipulación sean
reducidos a un mínimo absoluto.
Como se anota arriba, la producción del método
empieza a ocurrir tras la adición del reactivo mezcla a las células
incubadas. La señal generada por el método se podría medir en
cualquier sitio desde materia de segundos hasta 10 minutos, hasta
treinta minutos o más. En la realización preferente, la señal se
mide transcurrido un periodo de tiempo generalmente del orden de 10
minutos.
En la realización preferente del método, el
sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media
mayor a dos horas es el lactato, y la enzima citoplasmática que
constituye la base de la medida citotóxica es la lactato
deshidrogenasa (LDH). La LDH tiene una vida media de aproximadamente
9 horas en medio de cultivo a 37ºC tras la lisis celular. El
colorante preferido para su uso en la invención es la resazurina.
También se puede usar el MTS. El agente transferidor de electrones
preferido es la enzima diaforasa, aunque también se puede usar el
azul de
Meldola.
Meldola.
También se prefiere que la solución de parada
(preferiblemente una solución de dodecilsulfato sódico, SDS) se
añada a la reacción antes de la medida de la producción del estado
reducido del colorante.
El presente método se apoya en que los
componentes citoplasmáticos tienen una larga vida media tras su
liberación de las células muertas y moribundas. Así, como se indica
más arriba, en la realización preferente el componente
citoplasmático a medir es la LDH. Ya que el método utiliza un
componente citoplasmático con una relativa larga vida media, tendrá
lugar una mínima degradación del componente durante todo el periodo
del test que pueden incluir tiempos de incubación de 12 o 24 horas
(o mayores). La actividad del componente citoplasmático liberado
con una larga vida media se puede medir más fiablemente que un
componente liberado con una corta vida media, especialmente cuando
el periodo de incubación de las células con el agente a ensayo
resulta en una liberación de componentes citoplasmáticos varias
horas antes de que sea añadido el reactivo mezcla al recipiente.
Una segunda realización de la invención está
dirigida a los kit para llevar a cabo el método arriba descrito. El
kit comprende, en combinación, un colorante dispuesto en un primer
contenedor, el colorante que posee un estado oxidado y un estado
reducido donde el estado reducido se puede distinguir del estado
oxidado y donde el colorante está presente en el estado oxidado;
una mezcla de sustrato liofilizado dispuesto en un segundo
contenedor, la mezcla de sustrato comprende un agente transferidor
de electrones, un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene
una vida media mayor de dos horas, y un cofactor para la enzima
citoplasmática; y (opcionalmente) instrucciones para el uso del
kit.
En la realización preferente del kit, el
reactivo mezcla es una solución acuosa que comprende alrededor de
109 mM de lactato; alrededor de 3,3 mM de NAD+; sobre 2,2 U/ml de
diaforasa, sobre 3,0 mM de tampón Tris; alrededor de 30 mM de
Hepes; sobre 10 mM de NaCl; y alrededor de 350 \muM de resazurina.
Se podrían usar otras concentraciones de los componentes hasta el
grado de que el sustrato, el cofactor y el agente transferidor de
electrones estén presentes en exceso de modo que haya una adecuada
velocidad de reacción y hasta cierto punto en que la osmolaridad
del reactivo mezcla no afecte adversamente a la osmolaridad global
del medio de cultivo hasta el punto de que las células sean
dañadas.
Opcionalmente, se podría disponer de una
solución de parada en un tercer contenedor. La solución de parada
generalmente comprende un jabón, un detergente, o una base fuerte.
Las soluciones de parada preferidas incluyen el SDS o el hidróxido
sódico.
También, opcionalmente, se puede disponer de una
solución lisante (para los experimentos de control positivo) en un
(cuarto) container adicional. Las soluciones lisantes preferidas
incluyen Triton X-100 al 9% p/v en agua.
Otra invención del kit podría contener un
reactivo mezcla en un único contenedor. Dichos kits comprenden, en
combinación, un tampón, un colorante, un sustrato para el componente
citoplasmático, un cofactor apropiado para el componente
citoplasmático, y un agente transferidor de electrones, todos
dispuestos en un primer contenedor. Por ejemplo, dicho primer
contenedor contendría, en combinación, resazurina, lactato, NAD+,
diaforasa, Tris, HEPES y NaCl. El kit también contendría
instrucciones para el kit, y opcionalmente, una solución de
parada.
Una primera ventaja de la realización preferente
de la presente invención es que proporciona medios y métodos
mejorados que utilizan resazurina o MTS como un indicador de la
muerte celular. En particular, el método inventivo utiliza un
reactivo mezcla que no es deletéreo para la viabilidad de las
células que están siendo evaluadas. Así, el método inventivo es
"homogéneo" en tanto que puede ser realizado en el mismo
recipiente en el que se incuban las células, sin la necesidad de
extraer una alícuota libre de células del medio de cultivo.
Abreviando, usando la invención presente, no hay necesidad de sacar
una alícuota libre de células del medio del cultivo celular y
realizar el test en la alícuota. El método se puede llevar a cabo
directamente sobre el medio celular, en presencia de las células
incubadas; en el mismo recipiente en el que se incubaron las
células.
Otra ventaja de la invención es que, en la
realización preferente, se mide la actividad de la LDH para
determinar la muerte celular. Dado que la LDH tiene una larga vida
media (mayor de 8 horas a 37ºC), se puede usar la invención para
determinar el grado de muerte celular sobre un largo periodo de
ensayo de modo más preciso y exacto que otros métodos de trabajo
anteriores.
Otra ventaja de la invención es que debido a que
las condiciones de ensayo no son deletéreas para las células que
están siendo evaluadas, cuando se realiza el ensayo, las células
vivas presentes en el cultivo no generan más que un grado
insignificante de señal sobre el ruido de fondo. Esto es debido a
que las membranas celulares de las células viables no se dañan por
la solución de reactivo usado en el método, y por eso las células
viables retienen su LDH citoplasmática. Por lo tanto, solamente se
mide la LDH presente en el medio, proveniente de un medio aditivo
como es el suero o liberada de células con su membrana comprometida.
Esto permite que el ensayo se lleve a cabo directamente en los
recipientes que contienen las células viables.
La utilidad del ensayo es manifiesta en cuanto
que determinando la citotoxicidad de un compuesto o composición
dados es una información crítica en el proceso de descubrimiento de
medicamentos. Por ejemplo, la citotoxicidad es deseable cuando la
toxicidad está específicamente dirigida frente a una diana celular
identificada, como un tipo dado de cáncer, una infección, una
enfermedad causada por microorganismos, o un organismo parasitario.
La citotoxicidad, por supuesto, es indeseada cuando, por ejemplo, se
descubre un teórico nuevo medicamento que es citotóxico para las
células normales. La invención expuesta se puede usar en ambas
situaciones para medir la citotoxicidad de un agente dado frente a
un tipo celular dado.
La Fig. 1 es un rendimiento esquemático del
método preferente de acuerdo con la presente invención.
La Fig. 2 es un gráfico que representa el número
de células (eje de la X) frente a la fluorescencia (excitación a
560 nm y emisión a 590 nm) (eje de la Y) para un carrera ejemplo del
método presente. El test fue llevado a cabo usando las células L929
(ATCC CCL-1). Células intactas (\blacksquare),
células lisadas (\medcirc).
La Fig. 3 es un gráfico que representa el tiempo
tras el comienzo de la lisis en horas (eje de la X) frente a la
fluorescencia (excitación a 560 nm y emisión a 590 nm) (eje de la
Y) en un ensayo que mide la actividad de la G6PDH liberado de la
lisis de las células L929 (\blacksquare) y de las células Jurkat
(\boxempty).
La Fig. 4 es un gráfico que representa el tiempo
tras el comienzo de la lisis en horas (eje de la X) frente a la
fluorescencia (excitación a 560 nm y emisión a 590 nm) (eje de la
Y) en un ensayo que mide la actividad de la LDH liberada de la
lisis de las células L929 (\medbullet) y de las células Jurkat
(\medcirc).
La Fig. 5 es un gráfico que representa la
citotoxicidad del TNF\alpha como se mide usando el método de la
presente invención. La concentración del TNF\alpha en ng/ml se
representa en el eje X, la fluorescencia se representa en el eje Y
como en las figuras de la 2 a la 4. Ver ejemplo 3.
Se usan la siguientes abreviaturas a lo largo de
la especificación y de las reivindicaciones. Las palabras no
definidas expresamente aquí se les tiene que dar su significado
normal y aceptado en el artículo.
"Células L929"= línea celular adherente
fibroblastoide derivada de tejido adiposo y areolar subcutáneo de
ratón C3H/An, disponible comercialmente de la American Type Culture
Collection (Manassas, Virginia) bajo el nº de acceso ATCC
CCL-1.
"Células Jurkat"= línea celular humana
linfocítica de células T, disponible comercialmente de la ATCC bajo
el nº de acceso ATCC TIB-152.
"HEPES"= Ácido
N-2-hidroxietil
piperazina-N'-2-etanosulfónico.
"Agente farmacéutico o terapéutico conocido o
teórico"= Un compuesto químico de formulación desconocida
conocido y usado como agente farmacéutico, o un compuesto químico o
formulación bajo investigación para su uso como agente
farmacéutico.
"LDH"= Lactato deshidrogenasa.
"MTS"= Sal interna de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio,
disponible comercialmente en Promega Corp. Madison, Wisconsin.
"MTT"= Bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio,
disponible comercialmente en Aldrich.
"NADH"=
\beta-nicotinamida adeninadinucleótido (forma
protonada). NAD+ indica la forma desprotonada.
"NADPH"=
\beta-nicotinamida adenina dinucleótidofosfato
(forma protonada). NADP+ indica la forma desprotonada.
"resazurina"=
7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona
10-óxido (sal sódica), disponible comercialmente en Aldrich (nº de
catálogo 19.930-3).
"resorufina"=
7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona
(la forma reducida de la resazurina), disponible comercialmente en
Aldrich (nº de catálogo 42.445-5).
"SDS"= Dodecilsulfato sódico.
"Tris"=
tris(hidroximetil)aminoetano.
"Vasija"= indica cualquier contenedor o
mantenedor donde puede darse el método inventivo. Incluye
contenedores de pocillo único, como tubos de ensayo, y contenedores
multi-pocillo como las placas de microtitulación de
cualquier configuración. "Vasija" también abarca almohadillas,
parches, esparadrapo, gasas, y similares, o cualquier material de
construcción, que sea suficientemente absorbente para retener las
células y los reactivos necesarios para realizar el método
expuesto.
"XTT"= Ácido (sodio
3'-{(1-fenilamino-carbonil)-3,4-tetrazolio}-bis(4-metoxi-6-nitro)
bencenosulfónico hidrato.
Refiriéndonos ahora a la Fig. 1, la cual es un
diagrama esquemático de método preferido de acuerdo a la presente
invención, el método comprende células incubándose en medio de
crecimiento y un agente a ser ensayado (más adelante referido como
el agente a ensayo). Las células se incuban luego en presencia del
reactivo mezcla y del agente a ensayo durante un periodo de tiempo.
Asumiendo que el reactivo a ensayo, no mostrado en la Fig. 1, es al
menos parcialmente citotóxico, esto causará que algunas células
mueran y se conviertan en "agujereadas", liberando de ese modo
componentes citoplasmáticos, como la LDH, al medio de cultivo.
El reactivo mezcla usado en este método no es
tóxico para las células vivas. Por lo tanto se puede añadir
directamente a las células que están siendo incubadas, sin que
afecte adversamente al resultado del método. El reactivo mezcla
comprende un solvente (preferiblemente agua, y preferiblemente
tamponada), un colorante que tenga un estado oxidado y un estado
reducido donde el estado reducido pueda ser distinguido del estado
oxidado y donde el colorante está inicialmente presente en el estado
oxidado, un agente transferidor de electrones, un sustrato para el
componente citoplasmático (como el lactato, un sustrato específico
para la LDH), y un cofactor apropiado (como el NAD+ para la LDH),
indicado en la Fig. 1, el colorante es preferiblemente la
resazurina, aunque el colorante MTS de tetrazolio también se usar
con éxito. También se pueden usar otros indicadores redox. El
agente transferidor de electrones preferido es la enzima diaforasa,
aunque también se puede usar el Azul de Medola (también conocido
como el azul de naftol, índice de color I.C. 51175) (EM
Science/Harleco, una división de Merk KGaA, Darmstad,
Alemania).
En la realización preferida, las células se
incuban durante una cantidad de tiempo predeterminada en presencia
del agente a ensayar, después de dicho tiempo se añade el reactivo
mezcla a las células incubadas. Como se muestra en la Fig. 1,
cuando se usa lactato como sustrato, y la LDH es el componente
citoplasmático que se está midiendo, la LDH liberada de las células
muertas o moribundas inicia una serie de reacciones catalizadas
enzimáticamente. En la primera reacción, el lactato (uno de los
ingrediente incluidos en la solución de reactivo) es oxidado a la
forma de piruvato. La reacción requiere NADH+ y por ello en la
realización preferida se incluye en el reactivo mezcla.
La oxidación del lactato a piruvato resulta en
la producción de NADH. En una segunda reacción, el colorante (la
resazurina se muestra en la Fig. 1) es reducido en una reacción
potenciada por el NADH producido en la primera reacción y
catalizada por el agente transferidor de electrones (en la Fig. 1,
se muestra la diaforasa, el agente transferidor de electrones
preferido). De este modo, como se ilustra en la Fig. 1, el agente
transferidor de electrones preferido, la diaforasa, cataliza la
reducción de la resazurina a resorufina, una reducción potenciada
por el NADH.
El resultado final es un método en el que se
mide indirectamente la liberación de un componente citoplasmático
(se muestra la LDH en la Fig. 1) de las células muertas y moribundas
mediante la medida de la reducción de un colorante, cuya reducción
está siendo conducida mediante una reacción que está ligada a la
oxidación de un sustrato específico del componente citoplasmático
liberado (p.ej. la conversión del lactato a piruvato causada por la
liberación de LDH como se muestra en la Fig. 1). La cantidad de
forma reducida del colorante es proporcional al número de células
lisadas. (Ver más abajo los Ejemplos para una discusión
posterior).
La producción de la forma reducida del colorante
se puede medir colorimétricamente o fluorimétricamenete, u con otro
dispositivo de medida de espectros electromagnéticos, de todas
formas, el MTS sólo se puede medir colorimétricamente. Los
dispositivos de medida adecuados son ampliamente bien conocidos en
la materia y se pueden adquirir a partir de una amplia lista de
proveedores comerciales.
En particular, cuando el colorante es la
resazurina, la reducción se puede detectar ya sea por colorimetría
de absorbancia o por fluorimetría. La resazurina es de color azul
intenso y es esencialmente no fluorescente, dependiendo de su nivel
de pureza. La resorufina, la forma reducida de la resazurina, es
roja y muy fluorescente. Cuando se usa la colorimetría, la reacción
se monitoriza a longitudes de onda bien conocidas en el tema que
son un máximo de absorción para la resorufina (aproximadamente a 570
nm). Las medidas de fluorescencia de la resorufina están elaboradas
mediante excitación a longitudes de onda bien conocidas en la
materia (aproximadamente de 530 a 560 nm) y midiendo el espectro de
emisión (conocido en el tema de tener un máximo a alrededor de 590
nm). Dado que la detección fluorimétrica es más sensible que la
detección espectrofotométrica, en la intervención preferida del
método, se usa la resazurina como colorante y la producción de
resorufina se detecta fluorimétricamente.
El medio en el que se crecen o se mantienen las
células no limita la funcionalidad de la invención, aunque se
prefieren los medios no reductores en orden de minimizar cualquier
reducción no específica del colorante. Para cultivos microbianos,
los medios adecuados incluyen, sin limitación, medio de cultivo
Mueller-Hinton y medio de cultivo de soja
tripticasa. Para cultivos celulares de mamíferos, los medios
adecuados incluyen, sin limitación, RPMI 1640, RPMI 1640 con suero
de ternera fetal, medio Eagle modificado de Dubbelcco, solución
salina equilibrada de Hanks, solución tamponada de fosfato. Se ha
observado que los medios que naturalmente contienen o suplementados
con piruvato sódico ralentizan la velocidad de la reacción de la LDH
y de este modo la velocidad de generación de la resorufina.
Dependiendo de la sensibilidad deseada, se debían desear tiempos
mayores de desarrollo.
En una aplicación del método, el agente a
ensayar será una sustancia teórica inhibidora del crecimiento, como
un agente antimicrobiano o un medicamento citotóxico. La naturaleza
del agente a ensayar, no obstante, es virtualmente ilimitada. El
agente a ensayar podría ser, por ejemplo, cualquier elemento,
compuesto, mezcla, medicamento o medicamento potencial, en
cualquier forma (ya sea sólido, líquido o gas) o un grupo de
condiciones ambientales (como cualquier combinación de calor, luz,
nivel de oxígeno y similares) deseados para ser ensayados por sus
efectos citotóxicos. El método también se puede usar para ensayar
agentes antimicrobianos conocidos y medicamentos citotóxicos con el
fin de determinar qué agente quimioterápico podría ser más efectivo
frente a una determinada infección o tipo celular. El método se
puede también utilizar con agentes antimicrobianos y medicamentos
desconocidos o sospechosos con el propósito de determinar su
actividad potencial frente un microorganismo dado o tipo celular,
p.ej., barrido a gran escala de sustancias para actividad biológica
como parte de barrido de medicamentos u otras actividades.
Las células a usar en este método se podrían
recoger de cualquier fuente, y podrían ser eucariotas o procariotas.
Por ejemplo, las células humanas se podrían recoger por los
doctores en sus despachos y mandar a un laboratorio central de
pruebas para su ensayo usando el método actual, o los especimenes
celulares se podrían recoger a partir de los pacientes en un
hospital. Los especimenes de microorganismos podrían venir de
cualquier parte de cuerpo humano o animal, como del líquido espinal
cerebral, un absceso, una herida infectada, infecciones genitales,
etc. Las células podrían provenir de biopsias tumorales o de otros
especimenes. Las células a ensayar podrían también provenir de
muestras de comida, muestras de tierra, etc. En pocas palabras, la
naturaleza de las células a ser ensayadas y sus fuentes no son
críticas en la invención.
Los especimenes recolectados se cultivan en un
medio adecuado, como consta más arriba, de acuerdo con la práctica
convencional del laboratorio. A partir de las colonias bacterianas o
de los clones celulares en la placa de cultivo primario, se prepara
un inóculo de acuerdo con un procedimiento establecido el cual
produce una suspensión bacteriana o celular de una concentración
convenida. El procesamiento posterior de la suspensión depende del
aparato concreto y el método a usar en el test de
susceptibilidad.
Una consecuencia preferente del ensayo
bacteriano es la de generar la información en el probable éxito del
tratamiento de una población dada con un antibiótico seleccionado.
Otro uso de la invención es la de probar la presencia de microbios
en una mezcla, solución o superficie aunque esté libre de ellos. El
propósito del ensayo de citotoxicidad celular podría ser la de
determinar la susceptibilidad de las células tumorales a
medicamentos quimioterápicos o agentes a ensayar, o para el barrido
de medicamentos candidatos, o para determinar si un medicamento
candidato dado exhibe citotoxicidad indeseada hacia las células
normales o a cualquier tipo celular indicador.
El método descrito aquí es inherentemente
cuantitativo en cuanto a que la cantidad de forma reducida del
colorante producida es proporcional al número de células lisadas.
El método, sin embargo, se puede usar tanto para el test
cuantitativo como para el test cualitativo. El término de ensayo
cuantitativo se refiere a los aparatos y métodos de ensayo los
cuales producen resultados de las pruebas que generalmente indican
si un organismo o un especimen celular es sensible o resistente a
un antibiótico particular o a un agente citotóxico. El grado
relativo de sensibilidad o resistencia no está informado en el test
cualitativo. El término de ensayo cualitativo se refiere a los
aparatos y métodos de ensayo los cuales proveen datos de la
concentración del producto antimicrobiano o citotóxico que será
suficiente para inhibir el crecimiento del microorganismo u otro
tipo celular. Típicamente, para especimenes de microorganismos, se
utilizadan seis o más concentraciones diferentes del agente a
ensayar, cubriendo el rango terapéutico de las concentraciones del
agente a ensayo. El término concentración mínima inhibidora (CMI)
se usa con frecuencia para referirse al resultado proporcionado por
el test cuantitativo de un agente a ensayo y se define como la
concentración mínima del agente a ensayar que producirá inhibición
del crecimiento de las células usadas en el método.
El protocolo general del método procede como
sigue:
Primero, se reconstituye una mezcla de sustrato
liofilizado en un tampón y se deja equilibrar a la temperatura de
ensayo (usualmente a temperatura ambiente). Esto rinde una mezcla de
reactivo que contiene todos los componentes requeridos para llevar
a cabo el método.
La mezcla de reactivo se añade después a la
muestra(s) a medir, las muestras que han incubado previamente
durante un tiempo predeterminado en presencia de concentraciones
conocidas del agente a ensayar. Entonces las muestras se mezclan
ligeramente para asegurar uniformidad. Después las muestras se
incuban durante una cantidad de tiempo predeterminada,
preferiblemente sobre diez minutos, antes de reunir los datos de
fluorescencia o de colorimetría.
Las reacciones se paran mediante la adición de
un agente de parada adecuado, preferiblemente SDS al 3% p/v en agua
o una solución acuosa de hidróxido sódico (1 N).
Después se registra la fluorescencia de la forma
reducida del colorante indicador, preferiblemente la resorufina. La
cantidad de fluorescencia es indicativa de la cantidad de actividad
de componente citoplasmático (p.ej. LDH) presente en la muestra. La
serie preferida de filtros para el registro de la fluorescencia mide
excitación a 560 nm y emisión a 590 nm. Son posibles otras ligeras
variaciones de estas longitudes de onda.
Si se usa la resazurina como colorante y la
fluorescencia es la medida a punto final, la vasija en la que se
realiza la reacción, como es la placa de ensayo de microtitulación,
debería ser compatible con un fluorímetro de micropocillos. Si se
usa el MTS como indicador, la vasija en la que se realiza la
reacción debería ser compatible con medidas de absorbancia a 490
nm.
La presente invención es también extraída a kits
que contienen reactivos e instrucciones necesarias para llevar a
cabo los métodos de más arriba. En la forma más favorecida, el kit
incluye un tampón de ensayo que contiene el colorante (de nuevo, el
colorante teniendo un estado oxidado y un estado reducido donde el
estado reducido puede ser distinguido del estado oxidado y donde el
colorante está presente en la mezcla fundamentalmente en el estado
oxidado) dispuesto en un primer contenedor. El kit también incluye
una mezcla de sustrato liofilizado que contiene un agente
transferidor de electrones, un sustrato para el componente
citoplasmático (esto es, lactato) y un cofactor apropiado para la
enzima citoplasmática (esto es, NAD+ en el caso de la LDH) dispuesto
en un segundo contenedor. Un tercer contenedor opcional podría
tener la solución de parada. Un contenedor adicional opcional
podría contener la solución de lisis. El kit también incluiría
instrucciones de cómo se usa el kit.
Es preferible que la mezcla de sustrato esté
presente en forma de un polvo liofilizado que se reconstituye
después con un tampón para generar una mezcla de reactivo que no es
tóxica para las células y que contiene los componentes requeridos
para la práctica del método de la presente invención. Es preferida
esta incorporación porque la mezcla de sustrato liofilizado es más
fácil de almacenar y transportar. El kit, sin embargo, se puede
configurar de modo que los componentes necesarios arriba enumerados
sean empaquetados en forma de mezcla de reactivo prefabricado,
listo para usar.
En la incorporación preferida del kit, el
colorante es la resazurina o la sal interna de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio
(MTS). Es también preferible que el sustrato para la enzima
citoplasmática sea el lactato. Es preferible que el agente
transferidor de electrones sea una enzima, y más preferiblemente la
diaforasa. Si la LDH es la enzima citoplasmática medida, es también
preferible que el reactivo mezcla contenga más NAD+ como
cofactor.
Así, cuando se reconstituye la mezcla de
sustrato en solución de reactivo, es preferible que la solución de
reactivo comprenda un solvente acuoso, lactato (esto es, lactato de
litio), NAD+, diaforasa, tampón Tris, HEPES, NaCl y resazurina o
MTS. Más específicamente, cuando se reconstituye la mezcla de
sustrato, es preferible que la solución de reactivo contenga los
siguientes componentes: desde alrededor de 50 mM hasta alrededor de
250 mM de lactato de litio; desde alrededor de 0,1 U/ml hasta
alrededor de 10 U/ml de diaforasa; desde alrededor de 0,5 mM hasta
alrededor de 10 mM de NAD+; desde alrededor de 1 mM hasta alrededor
de 10 mM de tampón Tris; desde alrededor de 10 mM hasta alrededor
de 100 mM de HEPES; desde alrededor de 1 mM hasta alrededor de 100
mM de NaCl; y desde alrededor de 50 \muM hasta alrededor de 500
\muM de resazurina. Los componentes están presentes en una forma
que es consistente con la osmolaridad requerida de las células bajo
investigación (sobre 310 mOsm para la mayoría de los tipos
celulares de mamíferos). Puede ser necesaria una optimización de la
cinética, y están bien dentro de las habilidades de los típicos
artesanos.
En la intervención más preferible, cuando se
reconstituye la mezcla de sustrato, rinde una solución de reactivo
que comprende los siguientes componentes: sobre 109 mM de lactato de
litio; sobre 3,3 mM de NAD+; sobre 2,2 U/ml de diaforasa; sobre 3
mM de tampón Tris; sobre 30 mM de HEPES; sobre 10 mM de NaCl; y
sobre 350 \muM de resazurina.
Es preferible que cuando se reconstituye la
mezcla de sustrato (o si los componentes están presentes en forma
de solución lista para preparar), que la solución tenga un pH desde
alrededor de 7,0 hasta alrededor de 8,0, más preferiblemente desde
alrededor de 7,25 hasta alrededor de 7,6.
La solución de parada del kit es preferiblemente
una solución acuosa de un jabón, detergente, o una base fuerte como
el hidróxido sódico. El reactivo de parada preferido es una solución
de SDS del 1% al 5% o hidróxido sódico (preferiblemente 1 N). Se
prefiere una solución de SDS al 3%.
Se proporcionan los siguientes Ejemplos sólo por
propósitos ilustrativos. Los Ejemplos están incluidos exclusivamente
para ayudar en una comprensión más concreta de la invención
descrita y aquí reivindicada.
Se preparó una solución de reactivo combinando
una mezcla de sustrato liofilizado con el tampón de ensayo
conteniendo resazurina, y todos los ingredientes requeridos para
medir la liberación de la LDH a partir de las células muertas. Se
diseñó el tampón solvente usado para reconstituir la mezcla de
sustrato liofilizado de modo que cuando se usa para reconstituir la
mezcla, la solución resultante tenga una osmolaridad que sea
compatible con las células vivas. Esto es, la solución resultante
sea isotónica para las células. Cuando se usó para reconstituir la
mezcla de sustrato liofilizado, la solución de reactivo
contenía:
- lactato:
- 109 mM
- NAD+:
- 3,34 mM
- Diaforasa:
- 2,17 Unidades/ml
- tampón Tris:
- 3,05 mM
- HEPES:
- 30 mM
- NaCl:
- 10 mM
- Resazurina:
- 350 \muM
La células L929 se incubaron en
F-12/DME con FBS al 10% y diluyeron serialmente en
una placa de microtitulación para rendir pocillos por duplicado
conteniendo 0, 1.562, 3.125, 6.250, 12.500, 25.000, y 50.000 células
por pocillo, en un volumen total de 90 \mul. Las células se
incubaron a 37ºC durante tiempo suficiente para permitir la
fijación (alrededor de 1,5 horas). Las placas de microtitulación que
contenían células se sacaron entonces del incubador y en una serie
de pocillos se añadieron 10 \mul de Tritón X-100
(un agente lisante) y se dejó proceder la lisis hasta su
finalización (alrededor de 30 minutos), mientras las células se
equilibraban a la temperatura ambiente. La otra serie de pocillos
se dejaron sin lisar; se añadieron 10 \mul tampón fosfato salino
(PBS) a éstos como un control de volumen. Se preparó la mezcla de
reactivo del ensayo como se describió previamente, y se dejó
equilibrar a temperatura ambiente. Después que se completó la lisis,
se añadieron 100 \mul de reactivo mezcla a cada pocillo. Las dos
series de pocillos se dejaron incubar durante 10 minutos. Después
de 10 minutos, se añadieron 50 \mul de una solución de parada (SDS
al 3%) a cada pocillo. Se mide entonces la fluorescencia de cada
pocillo (excitación a 560 nm, emisión a 590 nm). Los resultados se
muestran en la Fig. 2.
Como puede observarse en la Fig. 2, en los
pocillos donde no estaba presente el agente lisante, se detectó una
cantidad mínima de fluorescencia de fondo. En los pocillos donde se
añadió el agente lisante, la fluorescencia crecía de una forma
lineal, proporcional al número de células en cada pocillo. Como se
puede ver en la Fig. 2, el método rinde resultados lineales desde 0
hasta al menos 500 células por pocillo hasta al menos 50.000
células por pocillo. Se han probado otras líneas celulares y han
mostrado resultados similares.
Este Ejemplo muestra que el método expuesto se
puede usar para calcular la citotoxicidad de un agente a ensayar
porque la cantidad de fluorescencia detectada se sabe que es
proporcional al número de células lisadas.
Las Fig. 3 y 4 representan la actividad de la
glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) (Fig. 3) y
de la lactato deshidrogenasa (LDH) (Fig. 4) en medio de cultivo
bajo idénticas condiciones de ensayo para dos tipos celulares
distintos, las células L929 y las células Jurkat. Las condiciones de
ensayo usadas eran similares a aquellas indicadas más arriba en el
Ejemplo 1. Para la medida de la G6PDH, la glucosa
6-fosfato y el NADP+ se sustituyeron por lactato y
NAD+ y la concentración de resazurina se redujo a 250 \muM para
ayudar al incremento de la velocidad de desarrollo de la
resorufina. Trabajos previos con el reactivo G6PDH indican que la
fluorescencia es proporcional al número de células lisadas. Las
muestras de células L929 y de células Jurkat a ser evaluadas se
reunieron, y se añadió un agente lisante. Para monitorizar la
estabilidad de las enzimas citoplasmáticas liberadas, las células
se mantuvieron a 37ºC seguido de la adición del detergente lisante.
La cantidad de fluorescencia se midió después a 1, 2, 4 y 6 horas a
partir del tiempo en que se añadió el agente lisante. Las Fig. 3 y
4 representan la estabilidad de la LDH en medio de cultivo comparada
con la estabilidad de la G6PDH bajo las mismas condiciones. Como
puede verse en la Fig. 4, incluso 6 horas después de añadir el
agente lisante, la LDH liberada de ambas células, L929 y Jurkat,
retiene bien sobre el 50% de su actividad inicial. En fuerte
contraste, como puede verse en la Fig. 3, la G6PDH bajo condiciones
idénticas, pierde más del 50% de su actividad inicial dentro de las
2 horas de añadir el agente lisante.
Este ejemplo muestra que en la intervención
preferida de la presente invención, el método depende de una enzima,
la LDH, cuya vida media en medio de cultivo es mayor de 8 horas.
Por lo tanto, la presente invención se puede usar para medir
citotoxicidad durante periodos de incubación más largos que en los
ensayos conocidos hasta la presente revelación.
Claims (43)
1. Un método para determinar la citotoxicidad de
un agente a ensayar, el método comprende:
- (a)
- contacto de células vivas en medio de cultivo contenidas en una vasija, con una cantidad predeterminada de agente a ensayar; y
- (b)
- incubado de células en el medio de cultivo del paso (a) durante una cantidad predeterminada de tiempo; después
- (c)
- adición a las células y al medio de cultivo del paso (b) de un reactivo mezcla que no sea tóxico para las células vivas, donde el reactivo mezcla comprende:
- un solvente, un colorante que tenga un estado oxidado y un estado reducido donde el estado reducido pueda ser distinguido del estado oxidado y donde el colorante esté inicialmente presente en el estado oxidado, un agente transferidor de electrones, un sustrato para la enzima citoplasmática que tenga una vida media mayor de dos horas, y un cofactor para la enzima citoplasmática; y después
- (d)
- medida del medio de cultivo del paso (c) para la producción del estado reducido del colorante, siendo causada la producción del estado reducido del colorante por la enzima citoplasmática específica para el sustrato dentro del reactivo mezcla añadido en el paso (c), donde la enzima citoplasmática ha sido liberada de las células muertas y de las células moribundas dentro de la vasija, a través de la cual se determina la citotoxicidad del agente a ensayar.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el estado reducido del
colorante se pueda distinguir fluorimétricamente del estado oxidado
del colorante, y en el paso (d), el medio de cultivo se mida para
la producción del estado reducido del colorante mediante
espectroscopía de fluorescencia.
3. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el estado reducido del
colorante se pueda distinguir colorimétricamente del estado oxidado
del colorante, y en el paso (d), el medio de cultivo se mida para
la producción del estado reducido del colorante mediante
espectroscopía en el visible.
4. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el colorante es la
resazurina o la sal interna de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio
(MTS).
5. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el agente transferidor de
electrones es una enzima.
6. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el agente transferidor de
electrones es la diaforasa.
7. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el sustrato es el lactato y
el cofactor es el NAD+, y en el paso (d), la producción del estado
reducido del colorante es causada por la lactato
deshidrogenasa.
8. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (a), la vasija contiene las
células vivas que son procariotas.
9. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (a), la vasija contiene las
células vivas que son eucariotas.
10. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (a), la vasija contiene las
células vivas que son células eucariotas cultivadas.
11. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (a), el agente a ensayar es un
antibiótico conocido.
12. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (a), el agente a ensayar es un
agente farmacéutico o terapéutico conocido.
13. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde: en el paso (b) las células se incuban, en
el paso (c) se añade el reactivo mezcla, y en el paso (d), se mide
el medio de cultivo para la producción del estado reducido del
colorante, todo en la vasija del paso (a).
14. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (d), se mide el medio de cultivo
para la producción del estado reducido del colorante sin separar el
medio de cultivo de las células del paso (c).
15. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el solvente es un solvente
acuoso.
16. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c), el solvente es un solvente
tamponado.
17. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde el reactivo mezcla comprende un solvente
acuoso, lactato, NAD+, diaforasa, tampón Tris, HEPES, NaCl y
resazurina.
18. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 17, donde el reactivo mezcla comprende:
desde 50 mM hasta 250 mM de lactato;
desde 0,1 U/ml hasta 10 U/ml de diaforasa;
desde 0,5 mM hasta 10 mM de NAD+;
desde 1 mM hasta 10 mM de tampón Tris;
desde 10 mM hasta 100 mM de HEPES;
desde 1 mM hasta 100 mM de NaCl;
desde 50 \muM hasta 500 \muM de
resazurina.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 17, donde el reactivo mezcla comprende:
109 mM de lactato;
3,3 mM de NAD+;
2,2 U/ml de diaforasa;
3,0 mM de tampón Tris;
30 mM de HEPES;
10 mM de NaCl; y
350 \muM de resazurina.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 17, donde el reactivo mezcla tenga un pH desde 7,0
hasta 8,0.
21. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 17, donde el reactivo mezcla tenga un pH desde 7,25
hasta 7,6.
22. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, comprendiendo más allá el paso de añadir una
solución de parada a la vasija, después del paso (c) y antes del
paso (d).
23. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 22, donde la solución de parada comprende un jabón o
un detergente.
24. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 22, donde la solución de parada comprende
dodecilsulfato sódico.
25. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 22, donde la solución de parada comprende hidróxido
sódico.
26. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende
un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media
mayor de dos horas seguido de la lisis celular o de la muerte
celular a 37ºC.
27. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende
un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media
mayor de cuatro horas seguido de la lisis celular o de la muerte
celular a 37ºC.
28. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende
un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media
mayor de seis horas seguido de la lisis celular o de la muerte
celular a 37ºC.
29. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 1, donde en el paso (c) el reactivo mezcla comprende
un sustrato para la enzima citoplasmática que tiene una vida media
mayor de ocho horas seguido de la lisis celular o de la muerte
celular a 37ºC.
30. Un método como se reivindicaba en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes donde en el paso (a) se añade
una cantidad predeterminada de agente a ensayar a la vasija
conteniendo las células vivas en el medio de cultivo; y el reactivo
mezcla comprende:
un solvente acuoso, resazurina, un agente
transferidor de electrones, NAD+, y lactato; y el paso (d) comprende
la medida del medio de cultivo del paso (c) para la producción de
resorufina sin extraer el medio de cultivo del vaso, siendo la
producción de resorufina causada por la liberación de la lactato
deshidrogenasa a partir de las células muertas y moribundas dentro
del vaso, a través del cual es determinada la citotoxicidad del
agente a ensayar.
\vskip1.000000\baselineskip
31. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 30, donde en el paso (c), el agente transferidor de
electrones es el azul de Meldola.
32. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 30, donde en el paso (a), el agente a ensayar es un
compuesto tóxico conocido o teórico.
33. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 30, donde en el paso (d), la producción de resorufina
se mide fluorimétricamente.
34. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 30, donde en el paso (d), la producción de resorufina
se mide colorimétricamente.
35. Un método como se reivindicaba en la
reivindicación 30, donde el reactivo mezcla comprende un solvente
acuoso, lactato, NAD+, diaforasa, tampón Tris, HEPES, NaCl y
resazurina.
36. Un kit para la medida de la citotoxicidad de
un agente a ensayar, el kit comprende, en combinación:
un colorante dispuesto en un primer contenedor,
el colorante teniendo un estado oxidado y un estado reducido donde
el estado reducido se puede distinguir del estado oxidado y donde el
colorante está presente en el estado oxidado, es decir estando el
colorante de resazurina desde 50 \muM hasta 500 \muM, donde la
resazurina está dispuesta en una mezcla de reactivo premezclada
lista para usar que no es tóxica para las células vivas, el
reactivo mezcla comprendiendo desde 0,1 U/ml hasta 10 U/ml de
diaforasa, desde 50 mM hasta 250 mM de lactato, desde 0,5 mM hasta
10 mM de NAD+, desde 1 mM hasta 10 mM de tampón fosfato, desde 10 mM
hasta 100 mM de HEPES, y desde 1 mM hasta 100 mM de NaCl; dicha
mezcla de sustrato teniendo un pH desde 7,0 hasta 8,0 en solución,
y
instrucciones para usar el kit.
\vskip1.000000\baselineskip
37. Un kit como se reivindicaba en la
reivindicación 36, donde el estado reducido del colorante se puede
distinguir del estado oxidado del colorante fluorimétricamente o
colorimétricamente.
38. Un kit como se reivindicaba en la
reivindicación 36, donde el reactivo mezcla comprende una solución
acuosa comprendiendo:
109 mM de lactato;
3,3 mM de NAD+;
2,2 U/ml de diaforasa;
3,0 mM de tampón Tris;
30 mM de HEPES;
10 mM de NaCl; y
350 \muM de resazurina.
\newpage
39. Un kit como se reivindicaba en la
reivindicación 36, donde el reactivo mezcla tenga un pH desde 7,25
hasta 7,60.
40. Un kit como se reivindicaba en la
reivindicación 36, comprendiendo más allá una solución de parada
dispuesta en un segundo contenedor.
41. Un kit como se reivindicaba en la
reivindicación 36, donde la solución de parada comprende un jabón o
un detergente.
42. Un kit como se reivindicaba en la
reivindicación 36, donde la solución de parada comprende
dodecilsulfato sódico.
43. Un kit como se reivindicaba en la
reivindicación 36, donde la solución de parada comprende hidróxido
sódico.
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