JP7394367B2 - 気体の細胞毒性評価方法 - Google Patents
気体の細胞毒性評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7394367B2 JP7394367B2 JP2018122876A JP2018122876A JP7394367B2 JP 7394367 B2 JP7394367 B2 JP 7394367B2 JP 2018122876 A JP2018122876 A JP 2018122876A JP 2018122876 A JP2018122876 A JP 2018122876A JP 7394367 B2 JP7394367 B2 JP 7394367B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- gas
- cell culture
- cell
- toxicity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title claims description 20
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 title description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 22
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 20
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 16
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000003915 cell function Effects 0.000 claims description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 59
- RWRIWBAIICGTTQ-UHFFFAOYSA-N difluoromethane Chemical compound FCF RWRIWBAIICGTTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N Chlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)Cl VOPWNXZWBYDODV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N Ethylbenzene Chemical compound CCC1=CC=CC=C1 YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N nitrogen oxide Inorganic materials O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- OCJBOOLMMGQPQU-UHFFFAOYSA-N 1,4-dichlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=C(Cl)C=C1 OCJBOOLMMGQPQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000002737 fuel gas Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 2
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 2
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 2
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 2
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000809 air pollutant Substances 0.000 description 1
- 231100001243 air pollutant Toxicity 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- XTQHKBHJIVJGKJ-UHFFFAOYSA-N sulfur monoxide Chemical class S=O XTQHKBHJIVJGKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052815 sulfur oxide Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/48742—Determining urea by measuring the volume of a gas
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/497—Physical analysis of biological material of gaseous biological material, e.g. breath
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本開示は、気体の細胞毒性評価方法に関する。
特許文献１では、被験物質を細胞培養液中に含んだ状態で細胞培養を行い、細胞の状態を測定することにより、被験物質の毒性を評価することが提案されている。
特許文献１に記載された評価方法は、医薬品の研究開発における候補化合物（固体又は液体）の選定に活用するものである。
非特許文献１では、in vitroレベルでのガスの毒性評価方法が、提案されている。気体と細胞培養液との気液界面に半透膜を設け、当該半透膜上で細胞を培養する。そして、半透膜上で培養された細胞に、直接的に被験物質としてのガスを曝露し、当該ガスの細胞毒性を評価するというものである。かかる方法により、A549細胞又はCalu-3細胞へのガス毒性を評価できるとされている。
生産研究, 59巻, 2号, 2007, p89-92
本開示の目的とするところは、細胞培養液中に存在する細胞に対しても適用可能な、つまり、気管支や肺由来の細胞以外の細胞に対しても適用可能な、気体の細胞毒性評価方法を提供することにある。
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、被験物質としての気体を細胞培養液に溶解させることにより、前記気体による細胞への毒性を評価することができることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づきさらに研究を重ね、本開示を完成するに至った。
即ち、本開示は、以下の毒性評価方法を提供する。
項１．
気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程、
及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有することを特徴とする、気体による細胞への毒性評価方法。
項２．
前記気体溶解工程は、
前記細胞培養液をｐＨ７．１～７．７、及び温度３５～３９℃に維持して実施される、項１に記載の方法。
項３．
前記気体溶解工程は、
前記気体を前記細胞培養液の表面に接触させ、培養液中に溶解させることにより実施される、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記細胞は、哺乳類由来細胞である、項１～３の何れかに記載の方法。
項１．
気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程、
及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有することを特徴とする、気体による細胞への毒性評価方法。
項２．
前記気体溶解工程は、
前記細胞培養液をｐＨ７．１～７．７、及び温度３５～３９℃に維持して実施される、項１に記載の方法。
項３．
前記気体溶解工程は、
前記気体を前記細胞培養液の表面に接触させ、培養液中に溶解させることにより実施される、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記細胞は、哺乳類由来細胞である、項１～３の何れかに記載の方法。
本開示の毒性評価方法によれば、細胞培養液中に存在する細胞に対する気体の毒性評価を行うことができるため、これまでには評価できなかった気管支や肺由来の細胞以外の細胞に応用することが可能となる。
本開示の、気体による細胞への毒性評価方法は、気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程、及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有することを特徴とする。
被験物としての気体は、気体であれば特に限定はない。但し、毒性評価という目的を考慮すれば、毒性評価に供される気体であることが好ましい。また、被験物としての気体は、単独種類の気体であってもよいし、複数種の気体の混合物であってもよい。
かかる気体として、具体的には、窒素酸化物や硫黄酸化物など大気汚染物質、一酸化炭素、二酸化炭素や炭化水素など排出ガス類、メタン、プロパン、ブタン、およびアセチレンなど燃料ガス類、ホルムアルデヒド、トルエン、キシレン、パラジクロロベンゼン、エチルベンゼン、およびスチレンなど製品中から放出されるガス、ハイドロフルオロカーボン（HFC）類、ハイドロクロロフルオロカーボン（HCFC）類、ハイドロフルオロオレフィン（HFO）類、ヒドロクロロフルオロオレフィン（HCFO）類、並びに、モノマーガスなど生産の過程で出るガスを例示することができる。
中でも、産業上の利用価値が大きいという観点から、メタン、プロパン、ブタン、およびアセチレンなど燃料ガス類、ホルムアルデヒド、トルエン、キシレン、パラジクロロベンゼン、エチルベンゼン、およびスチレンなど製品中から放出されるガス、HFC類、HCFC類、HFO類、及びHCFO類等の冷媒用ガス、並びに、モノマーガスなど生産の過程で出るガスを好適に使用可能である。
毒性評価に供する細胞としては、任意の培養細胞を使用することが可能である。初代培養された細胞であってもよいし。継代培養された細胞であってもよい。また、培養細胞は、細胞培養容器の底面に接着した状態であってもよいし、細胞培養液中に浮遊した状態であってもよい。もちろん、半浮遊細胞であってもよい。
毒性評価に供する細胞としては、単一種類の細胞を使用してもよいし、複数種の細胞種を使用してもよい。
毒性評価に供する細胞は、上述の通り任意の培養細胞を使用することが可能であるが、毒性評価という目的に鑑みれば、哺乳類由来細胞であることが好ましい。
また、毒性評価の目的に応じて、生体中の、適宜の部位由来の細胞を使用することが可能である。具体的には、心筋細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、肺細胞、消化管細胞、膵臓細胞、脾臓細胞、子宮内膜細胞、繊維芽細胞、皮膚細胞、筋細胞、血液細胞、および骨髄細胞から選択される１種以上を例示することができる。
細胞培養液として使用する培地の種類は、使用する細胞に応じて、適宜設定すればよい。具体的には、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ－１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などを使用することができる。
播種する細胞の個数及び密度、並びに細胞培養容器のサイズに関しては、毒性評価の目的や細胞の種類に応じ、適宜設定すればよい。
本開示の毒性評価方法は、気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程を有する。
気体を細胞培養液に溶解させる際には、気体以外の要因により細胞の状態が影響を受けることを排除すべく、細胞培養液のｐＨを二酸化炭素や緩衝液等により７．１～７．７に維持することが好ましく、７．３～７．５に維持することがより好ましい。同様の理由により、細胞培養液の温度を３５～３９℃に維持することが好ましく、３６～３８℃に維持することがより好ましい。
細胞培養液に気体を溶解させる方法としては、適宜の方法を採用することが可能であり、特に限定はない。具体的には、気体を細胞培養液中でバブリングさせる方法、気体を細胞培養液の表面にフローさせる（換言すれば、気体を細胞培養液の表面に接触させ、培養液中に溶解させる。）方法を例示することができる。この際、細胞培養液表面に導入する気体の濃度は、０vol％より大きく１００vol％未満の任意の濃度に設定することが可能である。細胞培養に資するための二酸化炭素濃度に関しても、特に限定はなく、０vol％より大きく１０vol％以下の任意の濃度を設定することが可能である。
上記した中でも、細胞培養液のｐＨ及び温度を上記した数値範囲内に安定して維持することが可能であるという理由から、気体を細胞培養液の表面にフローさせる方法が、好ましい。
気体を細胞培養液の表面にフローさせる具体的な態様としては、気体の流入口及び流出口をそれぞれ少なくとも１つ有する容器（インキュベーター）に開放した細胞培養容器を設置し、気体をフローさせる態様を例示することができる。
尚、容器（インキュベーター）内に気体をフローさせる際の、容器（インキュベーター）内の気圧は、９０～１２０ｋＰａに維持されていることが好ましい。
気体の流入口及び流出口をそれぞれ少なくとも一つ有する容器のサイズとしては、細胞培養容器のサイズに応じて、適宜設定すればよい。また、気体をフローする際の流量としても、気体の流入口及び流出口をそれぞれ少なくとも一つ有する容器のサイズ、細胞培養容器のサイズに応じて適宜設定すればよい。
さらに、本開示の細胞毒性評価方法においては、気体の細胞毒性を詳細、明確、且つ正確に把握するために、気体溶解工程の後に、細胞機能を評価する細胞評価工程を設ける。
評価する細胞機能としては、細胞生存率、ミトコンドリア機能、細胞複製能、細胞内エネルギーバランス、細胞膜完全性等を例示することができる。また、細胞の種類に応じて、当該細胞特有の機能を評価することも好ましい。例えば、心筋細胞を評価する際には、その拍動の指標を評価することも好適である。
本明細書において細胞生存率とは、生細胞および死細胞の総数に対する生細胞数の割合と定義する。生細胞および死細胞の数は、例えば、生体染色剤を用いた色素排除試験により得ることができる。
本明細書においてミトコンドリア機能とは、ミトコンドリアにおける酸素消費速度、カルシウムイオン流動量、および膜電位の変化から示される機能と定義する。
ミトコンドリアにおける酸素消費速度の変化は、例えば、酸素感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることが出来る。カルシウムイオン流動量の変化は、例えばカルシウムイオン感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることができる。膜電位の変化は、例えば、膜電位感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることができる。
ミトコンドリアにおける酸素消費速度の変化は、例えば、酸素感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることが出来る。カルシウムイオン流動量の変化は、例えばカルシウムイオン感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることができる。膜電位の変化は、例えば、膜電位感受性プローブの発光強度を測定することにより得ることができる。
本明細書において細胞内エネルギーバランスとは、ＡＤＰ／ＡＴＰ量比と定義する。ＡＤＰ／ＡＴＰ量比とは、例えば、ルシフェラーゼ反応による化学発光強度を測定することにより得ることができる。
本明細書において細胞膜完全性とは、細胞膜損傷の程度と定義する。かかる細胞損傷の程度は、例えば、LDHなど逸脱酵素測定することにより得ることができる。
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示はこうした例に何ら限定されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲において種々なる形態で実施し得ることは勿論である。
以下、実施例に基づき、本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示がこれらに限定されるものではない。
細胞毒性評価試験
ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（iCell cardiomyocytes2, CDI社製）を９６well half area プレートに、40,000cells/wellの密度で播種し、７～１０日間、インキュベーター内で培養した。その後、上記心筋細胞にCa指示薬（EarlyTox Cardiotoxicity Kit, Molecular Devices社製）を３０μL/wellずつ添加した。その後、密閉容器内に、クロロジフルオロメタン（実施例）、ジフルオロメタン（参考例）を、細胞培養液表面にそれぞれ流速５０ｍＬ/ｍｉｎという条件でフローした。その際、細胞培養液は、ｐＨ７．４、温度３７℃、インキュベーター内の気圧１０１．３ｋＰａに維持されていた。フロー開始時点、及びフロー開始から１０分後の時点における心筋細胞の拍動数を、共焦点定量イメージサイトメーター（ＣＱ１、横河電機社製）により蛍光測定を行い、計測した。
ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（iCell cardiomyocytes2, CDI社製）を９６well half area プレートに、40,000cells/wellの密度で播種し、７～１０日間、インキュベーター内で培養した。その後、上記心筋細胞にCa指示薬（EarlyTox Cardiotoxicity Kit, Molecular Devices社製）を３０μL/wellずつ添加した。その後、密閉容器内に、クロロジフルオロメタン（実施例）、ジフルオロメタン（参考例）を、細胞培養液表面にそれぞれ流速５０ｍＬ/ｍｉｎという条件でフローした。その際、細胞培養液は、ｐＨ７．４、温度３７℃、インキュベーター内の気圧１０１．３ｋＰａに維持されていた。フロー開始時点、及びフロー開始から１０分後の時点における心筋細胞の拍動数を、共焦点定量イメージサイトメーター（ＣＱ１、横河電機社製）により蛍光測定を行い、計測した。
尚、クロロジフルオロメタンは動物実験により、心臓に影響のある気体であることが報告されている。これに対してジフルオロメタンは心臓に有意な影響を与えないことが知られていることから、陰性対照として使用した（参考例）。
表１に示すように、ジフルオロメタンを使用した参考例（陰性対照）においてはジフルオロメタンを細胞培養溶液に溶解しても、心筋細胞の拍動数に変動は殆ど確認されなかった。心筋細胞に無害な気体を細胞培養液表面にフローするのみでは、心筋細胞に影響はなく、心筋細胞の健全な状態が保持されていることが確認された。
一方で、心臓に影響を及ぼすとされるクロロジフルオロメタンを使用した実施例においては、フロー開始より１０分後において、拍動数の顕著な増加が確認された（７４％増）。以上から、本開示における毒性評価方法により、気体（クロロジフルオロメタン）が心筋細胞に与える毒性を評価可能であることが確認された。
Claims (4)
- 気体を細胞培養液に溶解させる気体溶解工程、
及び、細胞機能を測定する細胞評価工程をこの順に有し、
前記気体溶解工程では、前記気体の流入口及び流出口をそれぞれ少なくとも１つ有する容器に開放した細胞培養容器を設置し、直接的に前記気体を細胞に曝露することなくフローさせることを特徴とする、気体による心筋細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、膵臓細胞、脾臓細胞、血液細胞及び骨髄細胞からなる群より選択される少なくとも一種の細胞への毒性評価方法。 - 前記気体溶解工程は、
前記細胞培養液をｐＨ７．１～７．７、及び温度３５～３９℃に維持して実施される、請求項１に記載の方法。 - 前記細胞は、哺乳類由来細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記細胞は、心筋細胞である、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018122876A JP7394367B2 (ja) | 2018-06-28 | 2018-06-28 | 気体の細胞毒性評価方法 |
| EP19826191.9A EP3816298A4 (en) | 2018-06-28 | 2019-06-26 | PROCEDURE FOR DETERMINING THE CYTOTOXICITY OF GAS |
| US17/255,798 US20210148887A1 (en) | 2018-06-28 | 2019-06-26 | Method for evaluating cytotoxicity of gas |
| PCT/JP2019/025400 WO2020004470A1 (ja) | 2018-06-28 | 2019-06-26 | 気体の細胞毒性評価方法 |
| JP2022154699A JP2022173420A (ja) | 2018-06-28 | 2022-09-28 | 気体の細胞毒性評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018122876A JP7394367B2 (ja) | 2018-06-28 | 2018-06-28 | 気体の細胞毒性評価方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022154699A Division JP2022173420A (ja) | 2018-06-28 | 2022-09-28 | 気体の細胞毒性評価方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020000101A JP2020000101A (ja) | 2020-01-09 |
| JP7394367B2 true JP7394367B2 (ja) | 2023-12-08 |
Family
ID=68984885
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018122876A Active JP7394367B2 (ja) | 2018-06-28 | 2018-06-28 | 気体の細胞毒性評価方法 |
| JP2022154699A Pending JP2022173420A (ja) | 2018-06-28 | 2022-09-28 | 気体の細胞毒性評価方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022154699A Pending JP2022173420A (ja) | 2018-06-28 | 2022-09-28 | 気体の細胞毒性評価方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210148887A1 (ja) |
| EP (1) | EP3816298A4 (ja) |
| JP (2) | JP7394367B2 (ja) |
| WO (1) | WO2020004470A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6944167B2 (ja) | 2018-07-25 | 2021-10-06 | ダイキン工業株式会社 | ガス濃度予測方法 |
| JP7103738B2 (ja) * | 2020-01-06 | 2022-07-20 | 株式会社大一商会 | 遊技機 |
| JP2021162598A (ja) * | 2020-03-31 | 2021-10-11 | ダイキン工業株式会社 | 検知ユニット、収容容器、検知装置 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6998249B1 (en) | 1999-09-27 | 2006-02-14 | Pharmacia & Upjohn Company | Toxicity screening method |
| US6982152B2 (en) * | 2002-04-17 | 2006-01-03 | Promega Corporation | Cytotoxicity assay |
| CN101580869B (zh) * | 2009-07-01 | 2011-09-21 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 卷烟主流烟气基因毒性测定方法 |
| JP2013039099A (ja) * | 2011-08-19 | 2013-02-28 | Koichi Imai | 細胞毒性測定用チャンバー、該チャンバー保存用コンテナ、及び細胞毒性測定用キット |
| CN107121553B (zh) * | 2017-03-16 | 2019-08-27 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种气-液界面暴露系统联合高内涵技术定量检测1,3-丁二烯致细胞dna损伤的方法 |
-
2018
- 2018-06-28 JP JP2018122876A patent/JP7394367B2/ja active Active
-
2019
- 2019-06-26 EP EP19826191.9A patent/EP3816298A4/en active Pending
- 2019-06-26 US US17/255,798 patent/US20210148887A1/en active Pending
- 2019-06-26 WO PCT/JP2019/025400 patent/WO2020004470A1/ja active Application Filing
-
2022
- 2022-09-28 JP JP2022154699A patent/JP2022173420A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 国立研究開発法人国立環境研究所［ｏｎｌｉｎｅ］、大気汚染物質を細胞に直接曝露する気液界面細胞曝露装置、公開日：２０１３年１０月３１日、［検索日：２０２１年１２月１８日］、＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｓ．ｇｏ．ｊｐ／ｋａｎｋｏ／ｎｅｗｓ／３２／３２－４／３２－４－０３．ｈｔｍｌ＞ |
| 環境化学、１９９６、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．２、ｐ．２１７－２２４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2022173420A (ja) | 2022-11-18 |
| JP2020000101A (ja) | 2020-01-09 |
| US20210148887A1 (en) | 2021-05-20 |
| WO2020004470A1 (ja) | 2020-01-02 |
| EP3816298A4 (en) | 2022-03-16 |
| EP3816298A1 (en) | 2021-05-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2022173420A (ja) | 気体の細胞毒性評価方法 | |
| Musah et al. | Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip | |
| ES2525411T3 (es) | Células anucleadas diferenciadas y método para preparar las mismas | |
| US8614095B2 (en) | Methods for identifying, purifying and enriching immature or stem cancer-initiating cells from tumors and use thereof | |
| Wang et al. | Concomitant targeting of multiple key transcription factors effectively disrupts cancer stem cells enriched in side population of human pancreatic cancer cells | |
| Reid et al. | CXCL12/CXCR4 signaling enhances human PSC-derived hematopoietic progenitor function and overcomes early in vivo transplantation failure | |
| Lutter et al. | Applying XTT, WST-1, and WST-8 to human chondrocytes: A comparison of membrane-impermeable tetrazolium salts in 2D and 3D cultures | |
| WO2015179393A1 (en) | Formation of multicellular tumoroids and uses thereof | |
| Olejniczak-Kęder et al. | Effects of 5-FU and anti-EGFR antibody in combination with ASA on the spherical culture system of HCT116 and HT29 colorectal cancer cell lines | |
| Branco et al. | Tailored cytokine optimization for ex vivo culture platforms targeting the expansion of human hematopoietic stem/progenitor cells | |
| WO2016104717A1 (ja) | 肝細胞誘導方法 | |
| RU2013146849A (ru) | Способ скрининга соединений, которые селективно снижают количество раковых стволовых клеток | |
| Apáti et al. | The importance of drug transporters in human pluripotent stem cells and in early tissue differentiation | |
| Filipe et al. | Tumor Biomechanics Alters Metastatic Dissemination of Triple Negative Breast Cancer via Rewiring Fatty Acid Metabolism | |
| Zhang et al. | A gastric cancer patient-derived three-dimensional cell spheroid culture model | |
| CN114209834A (zh) | Mcur1作为高原红细胞增多症的生物标志物的用途以及筛选药物的方法 | |
| Rivera et al. | Hypoxia Primes Human ISCs for Interleukin-Dependent Rescue of Stem Cell Activity | |
| Adile et al. | In Vitro Assays for Screening Small Molecules | |
| KR102227188B1 (ko) | 세포 배양용 밀폐용기 및 이를 이용한 세포 스페로이드 배양 방법 | |
| Boudreau et al. | Model systems to investigate nox-dependent cell migration and invasiveness | |
| JP7030343B2 (ja) | 疾患ｉＰＳ細胞を用いた神経毒性評価モデル系及びその使用 | |
| CN104977237B (zh) | 一种原位检测单个活细胞内细胞器中co2生成速率的方法 | |
| Bai | Long range chromosomal interactions and first passage process in budding yeast | |
| Batisse et al. | Structures and functions of the HIV-1 pre-integration complexes | |
| Doersch et al. | MP14-07 DEVELOPMENT OF A LIQUID BIOPSY USING EXTRACELLULAR VESICLES TO ASSESS THE SYSTEMIC T CELL IMMUNE LANDSCAPE IN BLADDER CANCER |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200702 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210706 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210903 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220104 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220301 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220628 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220928 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220928 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220929 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20221019 |
|
| C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20221025 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20221111 |
|
| C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20221115 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231117 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7394367 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |