JP3203268B2 - カンジダ感染の検出方法 - Google Patents
カンジダ感染の検出方法Info
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Description
【０００１】発明の背景 1. 発明の分野 現在、侵襲性カンジダ症の診断のために臨床医が利用で
きる臨床検査手段は、限られている。末梢部位の検疫的
な培養は、好中球減少症患者におけるＣａｎｄｉｄａ
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ感染症の場合を除いて、予測的価
値はほとんどない。かびの増殖が至適になるように設計
された場合でも、血液の培養は、時間がかかり、感度が
低く、特異性がない。カンジダに対する構成物質の調査
も、侵襲性感染にきわめて敏感な集団である免疫抑制患
者には役に立たない。循環かび産生物、とくにマンナン
の検出は所望のレベルの特異性を与えるが、現在のアッ
セイの臨床的な感度は期待するほどではなく、その実行
のための技術も臨床検査室に手軽に持ち込めるものでは
ない。市販されているラテックス凝集キットは、性質不
明の抗原を検出し、感度も特異性も低い。
きる臨床検査手段は、限られている。末梢部位の検疫的
な培養は、好中球減少症患者におけるＣａｎｄｉｄａ
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ感染症の場合を除いて、予測的価
値はほとんどない。かびの増殖が至適になるように設計
された場合でも、血液の培養は、時間がかかり、感度が
低く、特異性がない。カンジダに対する構成物質の調査
も、侵襲性感染にきわめて敏感な集団である免疫抑制患
者には役に立たない。循環かび産生物、とくにマンナン
の検出は所望のレベルの特異性を与えるが、現在のアッ
セイの臨床的な感度は期待するほどではなく、その実行
のための技術も臨床検査室に手軽に持ち込めるものでは
ない。市販されているラテックス凝集キットは、性質不
明の抗原を検出し、感度も特異性も低い。
【０００２】臨床的に最も重要なカンジダの種は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでマイクロモル量のペンチトール、Ｄ−ア
ラビニトールを産生し、侵襲性カンジダ症に罹患した患
者は、非罹患患者に比べ、高い血清Ｄ−アラビニトール
レベルおよびＤ−アラビニトール／クレアチニン比を示
すことは、かなりはっきりしている。したがって、Ｄ−
アラビニトールは、旧来の方法では死亡前の診断は困難
なことが多かった侵襲性カンジダ症の診断マーカーとし
て、使用できる可能性がある。
ｖｉｔｒｏでマイクロモル量のペンチトール、Ｄ−ア
ラビニトールを産生し、侵襲性カンジダ症に罹患した患
者は、非罹患患者に比べ、高い血清Ｄ−アラビニトール
レベルおよびＤ−アラビニトール／クレアチニン比を示
すことは、かなりはっきりしている。したがって、Ｄ−
アラビニトールは、旧来の方法では死亡前の診断は困難
なことが多かった侵襲性カンジダ症の診断マーカーとし
て、使用できる可能性がある。
【０００３】ヒト血清中のＤ−アラビニトールのエナン
チオ選択的測定は、最初、微生物学的−ガスクロマトグ
ラフィー（ＧＣ）法と酵素的−ＧＣ法の組み合わせによ
って行われた。しかしながら、これらのアプローチは、
時間がかかり、繁雑である。最近、アラビニトールのエ
ナンチオーマーを分離できるキラルな固定相のカラムを
用いる２つのＧＣ法が開発された。これらの方法は、Ｄ
−アラビニトールにきわめて特異的で、酵素的または微
生物学的方法での前処理を要しないが、臨床検査室で定
常的に使用するには繁雑すぎる。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＤ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼを用いる、もっと実用的な酵素蛍光法も開発さ
れている。しかし、残念ながら、正常なヒト血清中に存
在するヘキシトールであるＤ−アラビニトールとデヒド
ロゲナーゼの交差反応性のために、このアッセイの特異
性は低い。
チオ選択的測定は、最初、微生物学的−ガスクロマトグ
ラフィー（ＧＣ）法と酵素的−ＧＣ法の組み合わせによ
って行われた。しかしながら、これらのアプローチは、
時間がかかり、繁雑である。最近、アラビニトールのエ
ナンチオーマーを分離できるキラルな固定相のカラムを
用いる２つのＧＣ法が開発された。これらの方法は、Ｄ
−アラビニトールにきわめて特異的で、酵素的または微
生物学的方法での前処理を要しないが、臨床検査室で定
常的に使用するには繁雑すぎる。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＤ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼを用いる、もっと実用的な酵素蛍光法も開発さ
れている。しかし、残念ながら、正常なヒト血清中に存
在するヘキシトールであるＤ−アラビニトールとデヒド
ロゲナーゼの交差反応性のために、このアッセイの特異
性は低い。
【０００４】2. 関連技術の説明 Ｓｏｙａｍａ ＆ Ｏｎｏ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ、１４９、１４９−１５４、１９８５）は、初期比
分析による、血清中Ｄ−アラビニトールの測定の酵素蛍
光法を報告している。また、Ｓｏｙａｍａ ＆ Ｏｎｏ
（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１６８、２５９−２
６０、１９８７）は、レザズリンをカップリングさせた
酵素法による血清Ｄ−アラビニトールの改良測定方法を
報告している。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅのＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼの精製お
よび性質については、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．、１８３、３１−４２、１９７９）によっ
て述べられている。Ｋｉｅｈｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
０６、５７７−５８０、１９７９）は、ヒト血清中のＤ
−アラビニトールの測定のための気液クロマトグラフィ
ー法を報告し、カンジダ症の検出のためのこの方法の臨
床的有用性を評価している。
ｔａ、１４９、１４９−１５４、１９８５）は、初期比
分析による、血清中Ｄ−アラビニトールの測定の酵素蛍
光法を報告している。また、Ｓｏｙａｍａ ＆ Ｏｎｏ
（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１６８、２５９−２
６０、１９８７）は、レザズリンをカップリングさせた
酵素法による血清Ｄ−アラビニトールの改良測定方法を
報告している。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅのＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼの精製お
よび性質については、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．、１８３、３１−４２、１９７９）によっ
て述べられている。Ｋｉｅｈｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
０６、５７７−５８０、１９７９）は、ヒト血清中のＤ
−アラビニトールの測定のための気液クロマトグラフィ
ー法を報告し、カンジダ症の検出のためのこの方法の臨
床的有用性を評価している。
【０００５】Ｂｅｒｎａｒｄら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄ
ｉｓ．、１５１（４）、７１１−７１５、１９８５）
は、侵襲性カンジダ症における血清、尿、および組織中
のアラビニトールの立体異性コンフィギュレーションを
測定するための複合微生物学的−ＧＣ法を報告してい
る。この方法では、好ましい物質が使い果たされればＤ
−アラビニトールを消費するＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
株とサンプルをインキュベートし、その前後の血清アラ
ビニトールレベルをＧＣ法で測定し、その差としてＤ−
アラビニトール濃度を計算する。この方法は、２４時間
のインキュベーション工程を要し、抗かび剤による妨害
を受けやすく、感度も不十分である。
ｉｓ．、１５１（４）、７１１−７１５、１９８５）
は、侵襲性カンジダ症における血清、尿、および組織中
のアラビニトールの立体異性コンフィギュレーションを
測定するための複合微生物学的−ＧＣ法を報告してい
る。この方法では、好ましい物質が使い果たされればＤ
−アラビニトールを消費するＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
株とサンプルをインキュベートし、その前後の血清アラ
ビニトールレベルをＧＣ法で測定し、その差としてＤ−
アラビニトール濃度を計算する。この方法は、２４時間
のインキュベーション工程を要し、抗かび剤による妨害
を受けやすく、感度も不十分である。
【０００６】Ｗｏｎｇ ＆ Ｂｒａｕｅｒ（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６、１６７０−１６７４、
１９８８）は、ヒト血清中Ｄ−アラビニトールのエナン
チオ選択的測定のための複合酵素−ＧＣ法を報告してい
る。この方法では、血清からのＤ−アラビニトールの除
去のために、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの代わりにＫ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼを使用し、ＧＣで測定された非処理および酵
素処理血清中のＤ−アラビニトールレベルの差として、
Ｄ−アラビニトールレベルを計算する。この複合酸素−
ＧＣ法は抗かび剤によって影響を受けず、大部分の血清
サンプル中のＤ−アラビニトールを定量するのに十分な
感度を示し、数時間内に完了できるが、この方法では、
Ｄ−アラビニトールの濃度を決定に、各サンプルをＧＣ
で２回分析しなければならない。
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６、１６７０−１６７４、
１９８８）は、ヒト血清中Ｄ−アラビニトールのエナン
チオ選択的測定のための複合酵素−ＧＣ法を報告してい
る。この方法では、血清からのＤ−アラビニトールの除
去のために、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの代わりにＫ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼを使用し、ＧＣで測定された非処理および酵
素処理血清中のＤ−アラビニトールレベルの差として、
Ｄ−アラビニトールレベルを計算する。この複合酸素−
ＧＣ法は抗かび剤によって影響を受けず、大部分の血清
サンプル中のＤ−アラビニトールを定量するのに十分な
感度を示し、数時間内に完了できるが、この方法では、
Ｄ−アラビニトールの濃度を決定に、各サンプルをＧＣ
で２回分析しなければならない。
【０００７】多次元ガスクロマトグラフィーと新しいキ
ラルな固定相を使用する、ヒト血清中のカンジダの代謝
物、Ｄ−アラビニトールのエナンチオ選択的測定が、Ｗ
ｏｎｇ ＆ Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ．、４９５、２１−３０、１９８９）によっ
て開示されている。この方法は、高感度で、Ｄ−アラビ
ニトールにきわめて高い特異性を有するが、各サンプル
について、慣用の固定相およびキラルな固定相を含むＧ
Ｃカラム上での連続的な分画化を必要とする。
ラルな固定相を使用する、ヒト血清中のカンジダの代謝
物、Ｄ−アラビニトールのエナンチオ選択的測定が、Ｗ
ｏｎｇ ＆ Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ．、４９５、２１−３０、１９８９）によっ
て開示されている。この方法は、高感度で、Ｄ−アラビ
ニトールにきわめて高い特異性を有するが、各サンプル
について、慣用の固定相およびキラルな固定相を含むＧ
Ｃカラム上での連続的な分画化を必要とする。
【０００８】播種性カンジダ症の鑑別診断の補助のため
の、Ｄ−アラビニトールのエナンチオーマーのガスクロ
マトグラフィーとマススペクトルによる定量および分離
が、Ｒｏｂｏｚら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、５０
０、４１３−４２６、１９９０）によって開示されてい
る。このアプローチで使用されるカラムは有効な寿命が
限られていて、操作も労力を要し、時間がかかる。
の、Ｄ−アラビニトールのエナンチオーマーのガスクロ
マトグラフィーとマススペクトルによる定量および分離
が、Ｒｏｂｏｚら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、５０
０、４１３−４２６、１９９０）によって開示されてい
る。このアプローチで使用されるカラムは有効な寿命が
限られていて、操作も労力を要し、時間がかかる。
【０００９】侵襲性カンジダ症の診断技術に関してはＪ
ｏｎｅｓの総説（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．、３、３２−４５、１９９０がある。Ｎｅｓｓら
（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．ＤｉＳ．、１５９、４９５−５０
２、１９８９）は、免疫障害患者の侵襲性カンジダ症の
検出用のカンジダ抗原ラテックス試験を報告している。
Ｃａｂｅｚｕｄｏら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、８、７７０−７
７７、１９８９）は、危険の高い患者での全身性カンジ
ダ症の診断および治療におけるＣａｎｄ−Ｔｅｃカンジ
ダ抗原アッセイの価値について論じている。Ｗａｌｓｈ
ら（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２４（１５）、１０
２６−１０３１、１９９１）は、癌患者におけるカンジ
ダエノラーゼ抗原試験の臨床的有用性を評価している。
ｏｎｅｓの総説（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．、３、３２−４５、１９９０がある。Ｎｅｓｓら
（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．ＤｉＳ．、１５９、４９５−５０
２、１９８９）は、免疫障害患者の侵襲性カンジダ症の
検出用のカンジダ抗原ラテックス試験を報告している。
Ｃａｂｅｚｕｄｏら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、８、７７０−７
７７、１９８９）は、危険の高い患者での全身性カンジ
ダ症の診断および治療におけるＣａｎｄ−Ｔｅｃカンジ
ダ抗原アッセイの価値について論じている。Ｗａｌｓｈ
ら（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２４（１５）、１０
２６−１０３１、１９９１）は、癌患者におけるカンジ
ダエノラーゼ抗原試験の臨床的有用性を評価している。
【００１０】発明の要約 本発明の一態様は、Ｄ−アラビニトールに特異的な精製
型の酵素に関する。
型の酵素に関する。
【００１１】本発明の他の態様は、Ｄ−アラビニトール
の酸化を触媒することは可能であるが、Ｄ−アラビニト
ールの酸化を触媒することは実質的に不可能で、Ｄ−マ
ンニトールを酸化できる他の酵素を実質的に含まないＤ
−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素に関する。
の酸化を触媒することは可能であるが、Ｄ−アラビニト
ールの酸化を触媒することは実質的に不可能で、Ｄ−マ
ンニトールを酸化できる他の酵素を実質的に含まないＤ
−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素に関する。
【００１２】本発明の他の態様はＤ−アラビニトールの
測定方法である。この方法は、(1)Ｄ−アラビニトール
の含有が疑われるメジウム、および(2) Ｄ−アラビニト
ールデヒドロゲナーゼ酵素を混合し、Ｄ−アラビニトー
ルの酸化の結果として生成する生成物をメジウムについ
て試験する各工程からなる方法である。使用される酵素
は、Ｄ−アラビニトールの酸化を触媒することはできる
が、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒することは実質的に
できない。
測定方法である。この方法は、(1)Ｄ−アラビニトール
の含有が疑われるメジウム、および(2) Ｄ−アラビニト
ールデヒドロゲナーゼ酵素を混合し、Ｄ−アラビニトー
ルの酸化の結果として生成する生成物をメジウムについ
て試験する各工程からなる方法である。使用される酵素
は、Ｄ−アラビニトールの酸化を触媒することはできる
が、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒することは実質的に
できない。
【００１３】本発明の他の態様は、宿主内のカンジダ属
微生物の存在を検出する方法である。この方法は、Ｄ−
アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を用い、宿主から
のサンプルについて、Ｄ−アラビニトールの存在を調べ
る工程からなる。この酵素は、基質としてＤ−アラビニ
トールを利用できるが基質としてＤ−マンニトールは実
質的に利用できない。
微生物の存在を検出する方法である。この方法は、Ｄ−
アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を用い、宿主から
のサンプルについて、Ｄ−アラビニトールの存在を調べ
る工程からなる。この酵素は、基質としてＤ−アラビニ
トールを利用できるが基質としてＤ−マンニトールは実
質的に利用できない。
【００１４】本発明の他の態様は、患者のカンジダ感染
を検出する方法に関する。この方法は、患者からのサン
プルと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ+）によるＤ−アラビニトールの酸化は触媒できる
が、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒することは実質的に
不可能なＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を混
合し、その混合物について、与えられた時間内に精製す
るＮＡＤＨの量を調べる各工程からなる。「ＮＡＤ+ 」
の語は天然の補酵素、支持体に付着したＮＡＤ+を含む
ＮＡＤ+ 類似体、およびＮＡＤ+ の酸素原子の１個もし
くは２個以上が硫黄原子で置換されたチオ同族体を意味
する。ＮＡＤ+ の還元型（ＮＡＤＨ）の量が、カンジダ
感染症の臨床的診断の補助に使用される。
を検出する方法に関する。この方法は、患者からのサン
プルと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ+）によるＤ−アラビニトールの酸化は触媒できる
が、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒することは実質的に
不可能なＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を混
合し、その混合物について、与えられた時間内に精製す
るＮＡＤＨの量を調べる各工程からなる。「ＮＡＤ+ 」
の語は天然の補酵素、支持体に付着したＮＡＤ+を含む
ＮＡＤ+ 類似体、およびＮＡＤ+ の酸素原子の１個もし
くは２個以上が硫黄原子で置換されたチオ同族体を意味
する。ＮＡＤ+ の還元型（ＮＡＤＨ）の量が、カンジダ
感染症の臨床的診断の補助に使用される。
【００１５】本発明の他の態様は、(1) 基質としてＤ−
アラビニトールを利用できるが基質としてＤ−マンニト
ールは実質的に利用できないＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼ酵素、および(2) ＮＡＤ+ からなる組成物を
包含する。
アラビニトールを利用できるが基質としてＤ−マンニト
ールは実質的に利用できないＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼ酵素、および(2) ＮＡＤ+ からなる組成物を
包含する。
【００１６】本発明の他の態様は、３Ｄ６および５Ｅ１
１からなる群より選ばれる少なくとも１種のモノクロー
ナル抗体に結合可能で、Ｄ−マンニトールを酸化できる
他の酵素を実質的に含まないＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼ酵素に関する。
１からなる群より選ばれる少なくとも１種のモノクロー
ナル抗体に結合可能で、Ｄ−マンニトールを酸化できる
他の酵素を実質的に含まないＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼ酵素に関する。
【００１７】本発明の他の態様は、酵素からなる組成物
において、Ｄ−アラビニトールの酸化を、他の天然に存
在するポリオールの酸化に比べ、少なくとも１０倍、好
ましくは少なくとも２０倍速い速度で触媒できる組成物
に関する。
において、Ｄ−アラビニトールの酸化を、他の天然に存
在するポリオールの酸化に比べ、少なくとも１０倍、好
ましくは少なくとも２０倍速い速度で触媒できる組成物
に関する。
【００１８】本発明の他の態様は、(1) Ｄ−マンニトー
ルの酸化を触媒することは実質的に不可能なＤ−アラビ
ニトールデヒドロゲナーゼ酵素プレパーションおよび
(2) ＮＡＤ+ の、パッケージした組み合わせからなるキ
ットである。
ルの酸化を触媒することは実質的に不可能なＤ−アラビ
ニトールデヒドロゲナーゼ酵素プレパーションおよび
(2) ＮＡＤ+ の、パッケージした組み合わせからなるキ
ットである。
【００１９】特定の態様の説明 本発明は、特定のＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ
酵素を使用するＤ−アラビニトールの酵素的アッセイに
関する。このアッセイは、既知のアッセイに比べて短時
間で実施することができ、カンジダ感染症の抗菌剤処置
後の経過の追跡が可能である。すなわち、本発明は、通
常は血清または尿中のＤ−アラビニトールの定量に基づ
くカンジダ感染の検出法を提供する。使用される特定の
Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素により、Ｄ−
アラビニトールと他の代謝物、たとえばＤ−マンニトー
ルとの識別が可能になる。
酵素を使用するＤ−アラビニトールの酵素的アッセイに
関する。このアッセイは、既知のアッセイに比べて短時
間で実施することができ、カンジダ感染症の抗菌剤処置
後の経過の追跡が可能である。すなわち、本発明は、通
常は血清または尿中のＤ−アラビニトールの定量に基づ
くカンジダ感染の検出法を提供する。使用される特定の
Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素により、Ｄ−
アラビニトールと他の代謝物、たとえばＤ−マンニトー
ルとの識別が可能になる。
【００２０】使用されるＤ−アラビニトールデヒドロゲ
ナーゼ（ＤＡＤＨ）酵素は、Ｄ−アラビニトールの酸化
は触媒できるが、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒するこ
とは実質的に不可能で、Ｄ−マンニトールを酸化できる
他の酵素を実質的に含まない。ＤＡＤＨは、Ｉ．Ｕ．
Ｂ．分類で、ドナーのＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシヂ
レダクターゼに属し、基質としてＤ−アラビニトールが
ある。
ナーゼ（ＤＡＤＨ）酵素は、Ｄ−アラビニトールの酸化
は触媒できるが、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒するこ
とは実質的に不可能で、Ｄ−マンニトールを酸化できる
他の酵素を実質的に含まない。ＤＡＤＨは、Ｉ．Ｕ．
Ｂ．分類で、ドナーのＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシヂ
レダクターゼに属し、基質としてＤ−アラビニトールが
ある。
【００２１】「Ｄ−アラビニトールの酸化を触媒でき
る」の語は、純粋なＤＡＤＨが、Ｄ−アラビニトール酸
化の触媒比活性、少なくとも５０国際単位（ＩＵ）／m
g、好ましくは少なくとも１００ＩＵ／mg、さらに好ま
しくは少なくとも１５０ＩＵ／mgを有することを意味す
る。
る」の語は、純粋なＤＡＤＨが、Ｄ−アラビニトール酸
化の触媒比活性、少なくとも５０国際単位（ＩＵ）／m
g、好ましくは少なくとも１００ＩＵ／mg、さらに好ま
しくは少なくとも１５０ＩＵ／mgを有することを意味す
る。
【００２２】「Ｄ−マンニトールの酸化を触媒すること
は実質的に不可能」の語は、アッセイに使用されるＤＡ
ＤＨのＤ−マンニトール酸化の触媒比活性が、Ｄ−アラ
ビニトール酸化の触媒比活性の１％未満、好ましくは
０．２％未満、さらに好ましくは０．１％未満であるこ
とを意味する。
は実質的に不可能」の語は、アッセイに使用されるＤＡ
ＤＨのＤ−マンニトール酸化の触媒比活性が、Ｄ−アラ
ビニトール酸化の触媒比活性の１％未満、好ましくは
０．２％未満、さらに好ましくは０．１％未満であるこ
とを意味する。
【００２３】「Ｄ−マンニトールを酸化できる他の酵素
を実質的に含まない」の語は、ＤＡＤＨの不純物として
存在する他のいずれの酵素も、Ｄ−マンニトールの酸化
を触媒することは実質的にできないことを意味する。
を実質的に含まない」の語は、ＤＡＤＨの不純物として
存在する他のいずれの酵素も、Ｄ−マンニトールの酸化
を触媒することは実質的にできないことを意味する。
【００２４】「特異的ＤＡＤＨ」の語は、Ｄ−マンニト
ールの酸化を触媒することは実質的に不可能で、Ｄ−マ
ンニトールを酸化できる他の酵素を実質的に含まないこ
とを意味する。
ールの酸化を触媒することは実質的に不可能で、Ｄ−マ
ンニトールを酸化できる他の酵素を実質的に含まないこ
とを意味する。
【００２５】「精製型ＤＡＤＨ」の語は、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）で測定して、純度８０％以上、好ましくは
９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であることを
意味する。ＤＡＤＨを精製すると、精製型ＤＡＤＨは、
ヒト血清中に通常見いだされる他のポリオールの酸化の
触媒速度は、Ｄ−アラビニトールの酸化の触媒の場合の
少なくとも１０倍未満、好ましくは少なくとも２０倍未
満になる。
ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）で測定して、純度８０％以上、好ましくは
９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であることを
意味する。ＤＡＤＨを精製すると、精製型ＤＡＤＨは、
ヒト血清中に通常見いだされる他のポリオールの酸化の
触媒速度は、Ｄ−アラビニトールの酸化の触媒の場合の
少なくとも１０倍未満、好ましくは少なくとも２０倍未
満になる。
【００２６】本発明のＤＡＤＨは多くの方法で得ること
ができる。たとえば、本発明のＤＡＤＨは、カンジダ属
の一部のメンバーから単離できる。この酵素は、Ｃａｎ
ｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ
ｓｈｅｈａｔａｅから得るのが好ましい。他の種から
のＤＡＤＨ酵素は、そのＤＡＤＨ酵素が、３Ｄ６および
５Ｅ１１からなる群より選ばれるＣａｎｄｉｄａ ｔｒ
ｏｐｉｃａｌｉｓからのＤＡＤＨに対するすくなくとも
１種のモノクローナル抗体に結合できるかどうかを測定
することによって確認することができる。これらのモノ
クローナル抗体は、標準的ハイブリッド細胞法によっ
て、以下に述べるように、調製される。
ができる。たとえば、本発明のＤＡＤＨは、カンジダ属
の一部のメンバーから単離できる。この酵素は、Ｃａｎ
ｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ
ｓｈｅｈａｔａｅから得るのが好ましい。他の種から
のＤＡＤＨ酵素は、そのＤＡＤＨ酵素が、３Ｄ６および
５Ｅ１１からなる群より選ばれるＣａｎｄｉｄａ ｔｒ
ｏｐｉｃａｌｉｓからのＤＡＤＨに対するすくなくとも
１種のモノクローナル抗体に結合できるかどうかを測定
することによって確認することができる。これらのモノ
クローナル抗体は、標準的ハイブリッド細胞法によっ
て、以下に述べるように、調製される。
【００２７】これに限定されるものではないが、Ｃａｎ
ｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＤＡＤＨの精製
プロトコールの例を例示すれば、次の通りである。すな
わち、本発明の酵素を得るために用いられる細胞は、好
ましくは、炭素源および窒素源としてＤ−アラビニトー
ル、ビタミンならびに微量金属を含有する液体栄養メジ
ウム中で培養する。細胞は、旋回式シェーカー上、室温
で、後期対数期まで増殖させる。ついで、細胞を収穫
し、洗浄し、ペレット化し、適当なプロテアーゼインヒ
ビターを含む適当な緩衝液に再懸濁する。次に、細胞を
破壊する。酵母細胞は通常、高速振動ビーズ粉砕のよう
な機械的切断、またはたとえばフレンチ加圧セルによっ
て達成される高圧剪断に付される。最近細胞は通常、酵
素的に（たとえばリゾチームによる）、超音波で、また
はその両者によって破壊される。得られた細胞懸濁液
を、ついで遠心分離して、非破壊細胞、細胞壁物質、お
よび場合によっては膜、リポソームをペレット化する。
上清を次に、核酸およびその関連蛋白質を選択的に沈殿
させる高陽電荷ポリマー、たとえば硫酸プロタミンで処
理する。ついで酵素を溶液から、塩（たとえば硫酸アン
モニウム）、有機溶媒（たとえばアセトン）、または有
機ポリマー（たとえばポリエチレングリコール）で沈殿
させる。酵素の最終的精製は、標準技術、たとえばイオ
ン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点分
画電気泳動、免疫アフィニティークロマトグラフィー、
染料リガンドクロマトグラフィー（たとえば、Ｓｃｏｐ
ｅｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、３７６、１３１−
１４０、１９８６、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ
ｅｎｚｙｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｙｅ
ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａｂｓｏｒ
ｂｅｎｔｓ”）等を用いて行われる。
ｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＤＡＤＨの精製
プロトコールの例を例示すれば、次の通りである。すな
わち、本発明の酵素を得るために用いられる細胞は、好
ましくは、炭素源および窒素源としてＤ−アラビニトー
ル、ビタミンならびに微量金属を含有する液体栄養メジ
ウム中で培養する。細胞は、旋回式シェーカー上、室温
で、後期対数期まで増殖させる。ついで、細胞を収穫
し、洗浄し、ペレット化し、適当なプロテアーゼインヒ
ビターを含む適当な緩衝液に再懸濁する。次に、細胞を
破壊する。酵母細胞は通常、高速振動ビーズ粉砕のよう
な機械的切断、またはたとえばフレンチ加圧セルによっ
て達成される高圧剪断に付される。最近細胞は通常、酵
素的に（たとえばリゾチームによる）、超音波で、また
はその両者によって破壊される。得られた細胞懸濁液
を、ついで遠心分離して、非破壊細胞、細胞壁物質、お
よび場合によっては膜、リポソームをペレット化する。
上清を次に、核酸およびその関連蛋白質を選択的に沈殿
させる高陽電荷ポリマー、たとえば硫酸プロタミンで処
理する。ついで酵素を溶液から、塩（たとえば硫酸アン
モニウム）、有機溶媒（たとえばアセトン）、または有
機ポリマー（たとえばポリエチレングリコール）で沈殿
させる。酵素の最終的精製は、標準技術、たとえばイオ
ン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点分
画電気泳動、免疫アフィニティークロマトグラフィー、
染料リガンドクロマトグラフィー（たとえば、Ｓｃｏｐ
ｅｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、３７６、１３１−
１４０、１９８６、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ
ｅｎｚｙｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｙｅ
ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａｂｓｏｒ
ｂｅｎｔｓ”）等を用いて行われる。
【００２８】本発明の酵素は、組換えＤＮＡ技術によっ
て製造することもできる。略述すれば、本発明のＤＡＤ
Ｈ酵素をコードする遺伝子を、通常、その酵素が単離さ
れた生物の遺伝子材料から単離することによって得る。
一般的には、遺伝子はそのＤＮＡの部分消化後にスクロ
ースのような勾配材料を介して遠心分離することにより
得られる。遺伝子フラグメントを適当なクローニングベ
クターたとえばプラスミドにクローン化し、これを、宿
主、たとえば大腸菌のような細菌中にトランスフェクト
する。
て製造することもできる。略述すれば、本発明のＤＡＤ
Ｈ酵素をコードする遺伝子を、通常、その酵素が単離さ
れた生物の遺伝子材料から単離することによって得る。
一般的には、遺伝子はそのＤＮＡの部分消化後にスクロ
ースのような勾配材料を介して遠心分離することにより
得られる。遺伝子フラグメントを適当なクローニングベ
クターたとえばプラスミドにクローン化し、これを、宿
主、たとえば大腸菌のような細菌中にトランスフェクト
する。
【００２９】別法として、ベクターはプラスミド以外
の、たとえばバクテリオファージまたはコスミドとする
こともできる。選ばれた特定のベクターは、意図された
宿主、たとえば大腸菌のような細菌、酵母、または他の
細胞に適合性でなければならない。プラスミドは、使用
される特定の宿主細胞に適した複製の起源をもたねばな
らない。また、プラスミドは、形質転換された宿主細胞
の、形質転換を受けなかった細胞からの容易な同定を可
能にする表現型性質を付与するものでなければならな
い。このような表現型特性には、成長阻害物質たとえば
抗生物質に対する抵抗性を与える遺伝子が包含される。
テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ペニシリンお
よびアンピシリンを含む抗生物質に対する抵抗性を付与
する蛋白質をコードするプラスミドが市販されている。
プラスミドベクターにはまた、異種遺伝子のリゲーショ
ンを可能にする適当な制限部位が要求される。同様の性
質は、プラスミド以外のベクターを選択する場合にも考
慮されなければならない。
の、たとえばバクテリオファージまたはコスミドとする
こともできる。選ばれた特定のベクターは、意図された
宿主、たとえば大腸菌のような細菌、酵母、または他の
細胞に適合性でなければならない。プラスミドは、使用
される特定の宿主細胞に適した複製の起源をもたねばな
らない。また、プラスミドは、形質転換された宿主細胞
の、形質転換を受けなかった細胞からの容易な同定を可
能にする表現型性質を付与するものでなければならな
い。このような表現型特性には、成長阻害物質たとえば
抗生物質に対する抵抗性を与える遺伝子が包含される。
テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ペニシリンお
よびアンピシリンを含む抗生物質に対する抵抗性を付与
する蛋白質をコードするプラスミドが市販されている。
プラスミドベクターにはまた、異種遺伝子のリゲーショ
ンを可能にする適当な制限部位が要求される。同様の性
質は、プラスミド以外のベクターを選択する場合にも考
慮されなければならない。
【００３０】その遺伝子を有する宿主細胞を選択し、遺
伝子の発現をモニタリングする。発現が低い場合には、
その遺伝子の５′末端に誘導性プロモーターを付加する
ことによって、細菌におけるＤＡＤＨの合成を改良する
ことができる。このようなプロモーターは、市販の発現
プラスミドには存在する。遺伝子が適当なレベルで発現
したならば、細菌から蛋白質を抽出する。ＤＡＤＨ酵素
は、上述の操作で、他の蛋白質から分離される。上述の
ように、本発明のＤＡＤＨが得られたか否かを判定する
ためのスクリーニング培養の一方法には、このようなＤ
ＡＤＨを特異的に認識するモノクローナル抗体の利用が
ある。このようなモノクローナル抗体は、本発明の一態
様である。この目的でのモノクローナル抗体は、Ｋｏｈ
ｌｅｒ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６．
４９５−４９７、１９７５）の報告に基づく標準的なハ
イブリッド細胞法によって合成できる。略述すれば、宿
主を、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから上述
のようにして単離した特異的ＤＡＤＨ酵素で免疫処置す
る。宿主、通常はマウス、または他の適当な動物に酵素
を注射し、適当な期間ののち、そのマウスから脾臓細胞
を採取する。別法として、宿主からの非感作細胞を単離
し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＤＡＤＨ酵素単離体により直
接感作することもできる。ハイブリッド細胞は、上記細
胞を適当な骨髄腫細胞系と融合して生成させ、培養す
る。培養ハイブリッド細胞によって産生される抗体を、
ＤＡＤＨ酵素に対する結合親和性についてスクリーニン
グする。多くのスクリーニング方法、たとえば正および
逆ＥＬＩＳＡアッセイのようなＥＬＩＳＡスクリーニン
グが使用できる。スクリーニングアッセイは、ＤＡＤＨ
酵素単独を用いても、また第二の酵素、たとえばジアホ
ラーゼと接合させて用いて、バックグラウンドの低減お
よび陽性シグナルを増大させることもできる。
伝子の発現をモニタリングする。発現が低い場合には、
その遺伝子の５′末端に誘導性プロモーターを付加する
ことによって、細菌におけるＤＡＤＨの合成を改良する
ことができる。このようなプロモーターは、市販の発現
プラスミドには存在する。遺伝子が適当なレベルで発現
したならば、細菌から蛋白質を抽出する。ＤＡＤＨ酵素
は、上述の操作で、他の蛋白質から分離される。上述の
ように、本発明のＤＡＤＨが得られたか否かを判定する
ためのスクリーニング培養の一方法には、このようなＤ
ＡＤＨを特異的に認識するモノクローナル抗体の利用が
ある。このようなモノクローナル抗体は、本発明の一態
様である。この目的でのモノクローナル抗体は、Ｋｏｈ
ｌｅｒ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６．
４９５−４９７、１９７５）の報告に基づく標準的なハ
イブリッド細胞法によって合成できる。略述すれば、宿
主を、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから上述
のようにして単離した特異的ＤＡＤＨ酵素で免疫処置す
る。宿主、通常はマウス、または他の適当な動物に酵素
を注射し、適当な期間ののち、そのマウスから脾臓細胞
を採取する。別法として、宿主からの非感作細胞を単離
し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＤＡＤＨ酵素単離体により直
接感作することもできる。ハイブリッド細胞は、上記細
胞を適当な骨髄腫細胞系と融合して生成させ、培養す
る。培養ハイブリッド細胞によって産生される抗体を、
ＤＡＤＨ酵素に対する結合親和性についてスクリーニン
グする。多くのスクリーニング方法、たとえば正および
逆ＥＬＩＳＡアッセイのようなＥＬＩＳＡスクリーニン
グが使用できる。スクリーニングアッセイは、ＤＡＤＨ
酵素単独を用いても、また第二の酵素、たとえばジアホ
ラーゼと接合させて用いて、バックグラウンドの低減お
よび陽性シグナルを増大させることもできる。
【００３１】正相アッセイの場合には、特異的ＤＡＤＨ
酵素を、適当な表面たとえばマイクロタイタープレート
上に固定する。各ハイブリッドコロニーからの上清をそ
れぞれ別個のマイクロタイタープレートウエルに適用す
る。インキュベーション後、ウエルを洗浄し、アルカリ
ホスファターゼに共有結合で連結したヤギ抗マウス抗体
を各ウエルに添加する。ウエルを再びインキュベート
し、洗浄し、ついでホスファターゼの基質、たとえば、
ｐ−ニトロフェニルリン酸エステルを充填する。次に、
ＤＡＤＨに特異的な抗体の存在を指示するシグナルを観
察する。このようにして同定されたハイブリッド細胞を
再クローニングに付す。
酵素を、適当な表面たとえばマイクロタイタープレート
上に固定する。各ハイブリッドコロニーからの上清をそ
れぞれ別個のマイクロタイタープレートウエルに適用す
る。インキュベーション後、ウエルを洗浄し、アルカリ
ホスファターゼに共有結合で連結したヤギ抗マウス抗体
を各ウエルに添加する。ウエルを再びインキュベート
し、洗浄し、ついでホスファターゼの基質、たとえば、
ｐ−ニトロフェニルリン酸エステルを充填する。次に、
ＤＡＤＨに特異的な抗体の存在を指示するシグナルを観
察する。このようにして同定されたハイブリッド細胞を
再クローニングに付す。
【００３２】逆相アッセイの場合には、マイクロタイタ
ープレートウエルをウサギ抗マウス抗体でコートする。
各ハイブリッド細胞コロニーからの上清を別個のウエル
に適用する。ウエルをインキュベートし、洗浄し、つい
でＤＡＤＨ酵素プレパレーションを加える。ＮＡＤ+ と
Ｄ−アラビニトールをウエルに加える。ウエルを、ＮＡ
Ｄ+ のＮＡＤＨへの還元についてスクリーニングし、陽
性ウエルのハイブリッド細胞を選択し、ＤＡＤＨに対し
て特異的な抗体の均一な集団を分泌するハイブリッド細
胞を選ぶ。
ープレートウエルをウサギ抗マウス抗体でコートする。
各ハイブリッド細胞コロニーからの上清を別個のウエル
に適用する。ウエルをインキュベートし、洗浄し、つい
でＤＡＤＨ酵素プレパレーションを加える。ＮＡＤ+ と
Ｄ−アラビニトールをウエルに加える。ウエルを、ＮＡ
Ｄ+ のＮＡＤＨへの還元についてスクリーニングし、陽
性ウエルのハイブリッド細胞を選択し、ＤＡＤＨに対し
て特異的な抗体の均一な集団を分泌するハイブリッド細
胞を選ぶ。
【００３３】モノクローナル抗体は、少なくとも天然の
抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチドまたはその変異体をクローニングし、発現さ
せることによっても製造できる。
抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチドまたはその変異体をクローニングし、発現さ
せることによっても製造できる。
【００３４】モノクローナル抗体には、完全な免疫グロ
ブリン、またはそのフラグメントを包含し、免疫グロブ
リンには、各クラスおよびアイソタイプ、たとえばＩｇ
Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２
ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭが包含される。そのフラグメ
ントにはＦａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′
等が包含される。
ブリン、またはそのフラグメントを包含し、免疫グロブ
リンには、各クラスおよびアイソタイプ、たとえばＩｇ
Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２
ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭが包含される。そのフラグメ
ントにはＦａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′
等が包含される。
【００３５】上述のように、上述のようにして製造され
るＤＡＤＨモノクローナル抗体は、異なる成物から単離
される酵素プレパレーションをスクリーニングし、本発
明のＤＡＤＨ酵素を取得し、同定するためのアッセイに
も使用できる。本発明の特定のモノクローナル抗体は、
以下の表２に掲げる抗体からなる群から選ばれる抗体で
ある。したがって、本発明の他の態様は、モノクローナ
ル抗体の上記群の一つに結合できるＤＡＤＨ酵素であ
り、この酵素はＤ−マンニトールを酸化できる他の酵素
を実質的に含まない。
るＤＡＤＨモノクローナル抗体は、異なる成物から単離
される酵素プレパレーションをスクリーニングし、本発
明のＤＡＤＨ酵素を取得し、同定するためのアッセイに
も使用できる。本発明の特定のモノクローナル抗体は、
以下の表２に掲げる抗体からなる群から選ばれる抗体で
ある。したがって、本発明の他の態様は、モノクローナ
ル抗体の上記群の一つに結合できるＤＡＤＨ酵素であ
り、この酵素はＤ−マンニトールを酸化できる他の酵素
を実質的に含まない。
【００３６】本発明の他の態様は、Ｄ−アラビニトール
の測定方法に関する。この方法は、(1) Ｄ−アラビニト
ールの含有が疑われるメジウム、および(2) 特異的Ｄ−
アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を混合する工程か
らなる。この酵素は、Ｄ−アラビニトールの酸化を触媒
することはできるが、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒す
ることは実質的に不可能である。この方法に使用できる
ＤＡＤＨ酵素は、上述のように、ＤＡＤＨモノクローナ
ル抗体に結合することができる。一般的に、ＤＡＤＨ酵
素のモノクローナル抗体への結合は、結合親和性が、１
０6 Ｍ-1以上、好ましくは１０7 Ｍ-1以上、さらに好ま
しくは１０8 Ｍ-1以上である。
の測定方法に関する。この方法は、(1) Ｄ−アラビニト
ールの含有が疑われるメジウム、および(2) 特異的Ｄ−
アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を混合する工程か
らなる。この酵素は、Ｄ−アラビニトールの酸化を触媒
することはできるが、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒す
ることは実質的に不可能である。この方法に使用できる
ＤＡＤＨ酵素は、上述のように、ＤＡＤＨモノクローナ
ル抗体に結合することができる。一般的に、ＤＡＤＨ酵
素のモノクローナル抗体への結合は、結合親和性が、１
０6 Ｍ-1以上、好ましくは１０7 Ｍ-1以上、さらに好ま
しくは１０8 Ｍ-1以上である。
【００３７】Ｄ−アラビニトールの含有が疑われるメジ
ウムは、一般的に、宿主からのサンプルを含有する水性
メジウムである。サンプルは通常、体液である。また、
尿も使用できる。適当なインキュベーション時間のの
ち、メジウムをＤ−アラビニトールの酸化生成物につい
て試験する。存在するＤ−アラビニトールの量は通常、
標準曲線を参考にして測定される。この方法は、宿主内
におけるカンジダ生物の存在の検出へ応用できる。カン
ジダの存在はＤ−アラビニトールの量に相関し、サンプ
ル中のＤ−アラビニトールとクレアチニンの比に密接に
相関する。クレアチニンは、任意の慣用の、市販品を使
用する方法で測定される。
ウムは、一般的に、宿主からのサンプルを含有する水性
メジウムである。サンプルは通常、体液である。また、
尿も使用できる。適当なインキュベーション時間のの
ち、メジウムをＤ−アラビニトールの酸化生成物につい
て試験する。存在するＤ−アラビニトールの量は通常、
標準曲線を参考にして測定される。この方法は、宿主内
におけるカンジダ生物の存在の検出へ応用できる。カン
ジダの存在はＤ−アラビニトールの量に相関し、サンプ
ル中のＤ−アラビニトールとクレアチニンの比に密接に
相関する。クレアチニンは、任意の慣用の、市販品を使
用する方法で測定される。
【００３８】水性メジウム中には補因子を含有させなけ
ればならない。期待されるＤ−アラビニトールの濃度以
上の濃度で存在させると、補因子はオキシダントとして
働く。また、それは触媒濃度であってもよいが、この場
合には、補助的なオキシダント、たとえばピルビン酸お
よび乳酸デヒドロゲナーゼを存在させなければならな
い。通常、補因子は、ＮＡＤ+ またはその誘導体、たと
えばＮＡＤＰ+ である。補因子を期待されるＤ−アラビ
ニトールの濃度以上の濃度で存在させる場合は、メジウ
ムは、混合物のインキュベーション後、補因子の還元型
について試験できる。ＮＡＤ+ では、還元型はＮＡＤＨ
である。予め測定された量を越えて、与えられた時間内
に生成した還元型補因子の量は、サンプル中のＤ−アラ
ビニトールの量を指示する。還元型補因子の量は、直接
たとえば蛍光量の測定により、または間接的にたとえば
付加的試薬の添加により、検出される。
ればならない。期待されるＤ−アラビニトールの濃度以
上の濃度で存在させると、補因子はオキシダントとして
働く。また、それは触媒濃度であってもよいが、この場
合には、補助的なオキシダント、たとえばピルビン酸お
よび乳酸デヒドロゲナーゼを存在させなければならな
い。通常、補因子は、ＮＡＤ+ またはその誘導体、たと
えばＮＡＤＰ+ である。補因子を期待されるＤ−アラビ
ニトールの濃度以上の濃度で存在させる場合は、メジウ
ムは、混合物のインキュベーション後、補因子の還元型
について試験できる。ＮＡＤ+ では、還元型はＮＡＤＨ
である。予め測定された量を越えて、与えられた時間内
に生成した還元型補因子の量は、サンプル中のＤ−アラ
ビニトールの量を指示する。還元型補因子の量は、直接
たとえば蛍光量の測定により、または間接的にたとえば
付加的試薬の添加により、検出される。
【００３９】本発明の方法の一態様においては、補因子
の還元型によって還元される色原体試薬をメジウムに添
加して、メジウム中の還元型補因子の量を調べる。色原
体試薬は補助的なオキシダントとして働き、メジウム中
にインキュベーション時の始めから存在させてもよい
し、インキュベーション後に添加してもよい。インキュ
ベーション後に添加した場合は、それは補助的なオキシ
ダントとして働く。還元型補因子によって還元された場
合には、色原体試薬は検知可能なシグナルを提供する。
このような色原体試薬には、たとえば、レザズリン、テ
トラゾリウム塩たとえば、ｐ−ヨードフェニルニトロフ
ェニルテトラゾリウム、ＦｅIII −フェナンスロリン錯
体等が包含されるが、これらに限定されるものではな
い。
の還元型によって還元される色原体試薬をメジウムに添
加して、メジウム中の還元型補因子の量を調べる。色原
体試薬は補助的なオキシダントとして働き、メジウム中
にインキュベーション時の始めから存在させてもよい
し、インキュベーション後に添加してもよい。インキュ
ベーション後に添加した場合は、それは補助的なオキシ
ダントとして働く。還元型補因子によって還元された場
合には、色原体試薬は検知可能なシグナルを提供する。
このような色原体試薬には、たとえば、レザズリン、テ
トラゾリウム塩たとえば、ｐ−ヨードフェニルニトロフ
ェニルテトラゾリウム、ＦｅIII −フェナンスロリン錯
体等が包含されるが、これらに限定されるものではな
い。
【００４０】色原体試薬を使用する本発明の態様におい
ては、色原体試薬の還元型補因子による還元を補助する
触媒をアッセイメジウムに添加する。触媒は通常、還元
型補因子によって還元され、その触媒の還元型が通常、
色原体試薬を還元できる。使用される典型的な触媒に
は、ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、メル
ドパブルー、１−ヒドロキシ−５−アルキルフェナジニ
ウム塩、メチレンブルー等が包含される。ＮＡＤＨとレ
ザズリンまたはテトラゾリウム塩のいずれかを用いる場
合は、酵素ジアホラーゼが触媒として使用される。
ては、色原体試薬の還元型補因子による還元を補助する
触媒をアッセイメジウムに添加する。触媒は通常、還元
型補因子によって還元され、その触媒の還元型が通常、
色原体試薬を還元できる。使用される典型的な触媒に
は、ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、メル
ドパブルー、１−ヒドロキシ−５−アルキルフェナジニ
ウム塩、メチレンブルー等が包含される。ＮＡＤＨとレ
ザズリンまたはテトラゾリウム塩のいずれかを用いる場
合は、酵素ジアホラーゼが触媒として使用される。
【００４１】本発明の方法において色原体試薬が使用さ
れる場合には、生成物は通常、スペクトル分析によって
検出される。たとえば、測定は、蛍光、光の吸収、化学
ルミネッセンス、光散乱、電気ルミネッセンス等の検出
によって行われる。また、色原体試薬は、慣用の発色体
に変換される必要はなく、非スペクトル分析たとえば電
気化学的に検出できる物質に変換することができる。
れる場合には、生成物は通常、スペクトル分析によって
検出される。たとえば、測定は、蛍光、光の吸収、化学
ルミネッセンス、光散乱、電気ルミネッセンス等の検出
によって行われる。また、色原体試薬は、慣用の発色体
に変換される必要はなく、非スペクトル分析たとえば電
気化学的に検出できる物質に変換することができる。
【００４２】本発明の好ましい態様においては、アッセ
イは通常、期待されるＤ−アラビニトールの最高量より
過剰のＮＡＤ+ 量の存在下、２段階インキュベーション
によって行われる。Ｄ−アラビニトールの酸化は、最初
のインキュベーションではＤＡＤＨ酵素によって触媒さ
れ、ついで色原体試薬の存在下にＮＡＤＨのＮＡＤ+へ
の接触酸化が行われる。最初のインキュベーション後
に、触媒および／または色原体試薬を添加する場合は、
これらの試薬は、ＮＡＤＨとの反応が迅速かつ完全に起
こるのに十分の量添加できる。これらの試薬を最初のイ
ンキュベーション時に包含させても有用な結果を与える
が、Ｄ−アラビニトール以外のサンプル中の物質による
色原体試薬の発色体への変換がバックグランドシグナル
を高くし、アッセイの感度が低下する。
イは通常、期待されるＤ−アラビニトールの最高量より
過剰のＮＡＤ+ 量の存在下、２段階インキュベーション
によって行われる。Ｄ−アラビニトールの酸化は、最初
のインキュベーションではＤＡＤＨ酵素によって触媒さ
れ、ついで色原体試薬の存在下にＮＡＤＨのＮＡＤ+へ
の接触酸化が行われる。最初のインキュベーション後
に、触媒および／または色原体試薬を添加する場合は、
これらの試薬は、ＮＡＤＨとの反応が迅速かつ完全に起
こるのに十分の量添加できる。これらの試薬を最初のイ
ンキュベーション時に包含させても有用な結果を与える
が、Ｄ−アラビニトール以外のサンプル中の物質による
色原体試薬の発色体への変換がバックグランドシグナル
を高くし、アッセイの感度が低下する。
【００４３】本発明の方法および組成物は、大部分のア
ッセイフォーマットに適用できる。アッセイは均一系で
も不均一系でもよい。均一アッセイのアプローチでは、
サンプルは、必要に応じて、望ましくない物質を除去す
るため、前処理することができる。反応には通常、ＤＡ
ＤＨ酵素と、カンジダ感染の疑われる患者からのサンプ
ルを含有させる。上述のように、補因子、色原体試薬お
よび触媒を包含させることもできる。
ッセイフォーマットに適用できる。アッセイは均一系で
も不均一系でもよい。均一アッセイのアプローチでは、
サンプルは、必要に応じて、望ましくない物質を除去す
るため、前処理することができる。反応には通常、ＤＡ
ＤＨ酵素と、カンジダ感染の疑われる患者からのサンプ
ルを含有させる。上述のように、補因子、色原体試薬お
よび触媒を包含させることもできる。
【００４４】上述の物質を水性アッセイメジウム中に混
合し、メジウムを還元型補因子について調べる。反応お
よびその程度の検出は、均一溶液中で行われる。反応
は、１段階または２段階インキュベーションによって行
うことができる。２段階インキュベーションの使用が好
ましい。この酸化反応を検出するための他のアプローチ
には、サンプル、ＮＡＤおよび〔４−（Ｓ）− 3Ｈ〕Ｎ
ＡＤＨをインキュベートしてＤ−アラビニトールへのト
リチウムの導入率の測定、またはＤ−アラビニトールの
酸化によるＤ−リブロースの分離および色原体検出を行
う方法がある。
合し、メジウムを還元型補因子について調べる。反応お
よびその程度の検出は、均一溶液中で行われる。反応
は、１段階または２段階インキュベーションによって行
うことができる。２段階インキュベーションの使用が好
ましい。この酸化反応を検出するための他のアプローチ
には、サンプル、ＮＡＤおよび〔４−（Ｓ）− 3Ｈ〕Ｎ
ＡＤＨをインキュベートしてＤ−アラビニトールへのト
リチウムの導入率の測定、またはＤ−アラビニトールの
酸化によるＤ−リブロースの分離および色原体検出を行
う方法がある。
【００４５】不均一アッセイのアプローチでも、試薬は
均一系アプローチの場合と同様である。一般的には、Ｄ
−アラビニトールは、バルクサンプルから、通常はクロ
マトグラフィー法で分離される。分離されたＤ−アラビ
ニトールを、ついで、特異的ＤＡＤＨおよびＮＡＤ誘導
体の使用により酸化し、生成物を既述のようにして検出
する。
均一系アプローチの場合と同様である。一般的には、Ｄ
−アラビニトールは、バルクサンプルから、通常はクロ
マトグラフィー法で分離される。分離されたＤ−アラビ
ニトールを、ついで、特異的ＤＡＤＨおよびＮＡＤ誘導
体の使用により酸化し、生成物を既述のようにして検出
する。
【００４６】アッセイは通常、水性緩衝メジウム中、一
般的には至適なアッセイ感度を与える中等度のpHで行わ
れる。アッセイは、アッセイ成分または生成物を分離す
ることなく（均一）、または予め分離して（不均一）行
うことができる。
般的には至適なアッセイ感度を与える中等度のpHで行わ
れる。アッセイは、アッセイ成分または生成物を分離す
ることなく（均一）、または予め分離して（不均一）行
うことができる。
【００４７】検定すべきサンプルは、アッセイの実施前
に、妨害物を除去するため前処置することが望ましい。
サンプルは、たとえば、限外濾過、またはこの前処置を
達成するための高温に付すことができる。サンプルに
は、血清、全血、尿等が包含される。
に、妨害物を除去するため前処置することが望ましい。
サンプルは、たとえば、限外濾過、またはこの前処置を
達成するための高温に付すことができる。サンプルに
は、血清、全血、尿等が包含される。
【００４８】水性メジウムは、単に水であってもまた
０．０１〜１０容量％の共溶媒を含有していてもよい。
メジウムのpHは通常、約５〜１１の範囲、さらに通常に
は約６〜１０．５の範囲、好ましくは約７〜１０の範囲
である。pH値は通常、ＤＡＤＨの過剰な分解を生じるこ
となく、Ｄ−アラビニトールの酸化の程度および速度を
最大にするように選択される。一般的に、反応は、pHが
高いほど、また補因子の濃度が上昇するほど、さらに完
結に向けて進行する。
０．０１〜１０容量％の共溶媒を含有していてもよい。
メジウムのpHは通常、約５〜１１の範囲、さらに通常に
は約６〜１０．５の範囲、好ましくは約７〜１０の範囲
である。pH値は通常、ＤＡＤＨの過剰な分解を生じるこ
となく、Ｄ−アラビニトールの酸化の程度および速度を
最大にするように選択される。一般的に、反応は、pHが
高いほど、また補因子の濃度が上昇するほど、さらに完
結に向けて進行する。
【００４９】所望のpHを達成し、測定時そのpHを維持す
るためには、様々な緩衝液が使用できる。緩衝液の例に
は、グリシン、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビター
ル等が包含される。特定の緩衝液の使用が本発明に重要
なわけではないが、個々のアッセイにおいてはある緩衝
液が好ましいということはある。このアッセイにはホウ
酸塩は適当でない。
るためには、様々な緩衝液が使用できる。緩衝液の例に
は、グリシン、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビター
ル等が包含される。特定の緩衝液の使用が本発明に重要
なわけではないが、個々のアッセイにおいてはある緩衝
液が好ましいということはある。このアッセイにはホウ
酸塩は適当でない。
【００５０】アッセイの実施には通常、緩和な温度が採
用され、測定時には通常、一定の温度に保持される。イ
ンキュベーション温度は通常、約５〜４５℃、さらに通
常には、約１５〜４０℃の範囲とする。測定時の温度は
一般的に、約１０〜５０℃、さらに通常には、約１５〜
４０℃の範囲とする。
用され、測定時には通常、一定の温度に保持される。イ
ンキュベーション温度は通常、約５〜４５℃、さらに通
常には、約１５〜４０℃の範囲とする。測定時の温度は
一般的に、約１０〜５０℃、さらに通常には、約１５〜
４０℃の範囲とする。
【００５１】カンジダ感染症の検知のために検定される
Ｄ−アラビニトールの濃度は、一般に、１×１０-7以下
から１×１０-3Ｍ、さらに通常には、約１×１０-6から
５×１０-4Ｍの範囲で変動する。血清中で臨床的に認め
られる濃度は通常、約１×１０-6から１×１０-4Ｍの範
囲である。特定の検出法の感度、アッセイの完結に望ま
しい時間、試薬の価格、およびＤ−アラビニトールの濃
度を考慮して、通常、各種試薬の濃度が決定される。
Ｄ−アラビニトールの濃度は、一般に、１×１０-7以下
から１×１０-3Ｍ、さらに通常には、約１×１０-6から
５×１０-4Ｍの範囲で変動する。血清中で臨床的に認め
られる濃度は通常、約１×１０-6から１×１０-4Ｍの範
囲である。特定の検出法の感度、アッセイの完結に望ま
しい時間、試薬の価格、およびＤ−アラビニトールの濃
度を考慮して、通常、各種試薬の濃度が決定される。
【００５２】ＮＡＤ+ またはその誘導体の濃度は、反応
の評価および平衡に影響する。通常、アッセイ時間を最
小にするためには、ＮＡＤ+ 濃度は、ＮＡＤ+ に関して
のその酵素のＫm に少なくとも等しくなければならな
い。さらに、ＮＡＤ+ の濃度を、たとえば１０〜１００
Ｋm に上げることは、Ｄ−アラビニトールの濃度が低い
場合、ＮＡＤＨへの最大変換を確実にするために有用で
ある。酵素に関しては、酵素の濃度が高いほど、反応の
完結は速くなる。通常は少なくとも０．１ＩＵ、好まし
くは少なくとも１ＩＵ、さらに好ましくは少なくとも１
０ＩＵが使用される。しかしながら、この試薬は高いの
で、最も好ましい濃度以下の使用が指示されることもあ
る。生成するＮＡＤＨを検出するために使用される試薬
の濃度は、使用される特定の検出方法、その方法に要求
される感度、および過剰の試薬によって生成する非特異
的バックグランドの強さに依存する。
の評価および平衡に影響する。通常、アッセイ時間を最
小にするためには、ＮＡＤ+ 濃度は、ＮＡＤ+ に関して
のその酵素のＫm に少なくとも等しくなければならな
い。さらに、ＮＡＤ+ の濃度を、たとえば１０〜１００
Ｋm に上げることは、Ｄ−アラビニトールの濃度が低い
場合、ＮＡＤＨへの最大変換を確実にするために有用で
ある。酵素に関しては、酵素の濃度が高いほど、反応の
完結は速くなる。通常は少なくとも０．１ＩＵ、好まし
くは少なくとも１ＩＵ、さらに好ましくは少なくとも１
０ＩＵが使用される。しかしながら、この試薬は高いの
で、最も好ましい濃度以下の使用が指示されることもあ
る。生成するＮＡＤＨを検出するために使用される試薬
の濃度は、使用される特定の検出方法、その方法に要求
される感度、および過剰の試薬によって生成する非特異
的バックグランドの強さに依存する。
【００５３】添加の順序は広範に変動させることができ
るが、好ましい順序がある場合もある。最も単純な添加
順序は、すべての材料を同時に添加し、生成したシグナ
ルを測定するものである。また、試薬は順次、混合する
こともできる。上述のように、各添加ののちに、１回ま
たは２回のインキュベーション工程を行い、それぞれ一
般的に、約１０秒から６時間、さらに通常には約３０秒
から１時間をかける。
るが、好ましい順序がある場合もある。最も単純な添加
順序は、すべての材料を同時に添加し、生成したシグナ
ルを測定するものである。また、試薬は順次、混合する
こともできる。上述のように、各添加ののちに、１回ま
たは２回のインキュベーション工程を行い、それぞれ一
般的に、約１０秒から６時間、さらに通常には約３０秒
から１時間をかける。
【００５４】均一アッセイでは、すべての試薬を同時に
または順次混合したのち、Ｄ−アラビニトールの酸化の
結果として生成した生成物の存在を測定する。この生成
物の存在および量は、試験サンプル中のＤ−アラビニト
ールの量に関連する。本発明のＤＡＤＨ酵素は最初にサ
ンプルおよび酵素補因子と混合するのが好ましい。イン
キュベーション後、まだアッセイメジウム中に包含され
ていなければ、ＮＡＤＨと色原体試薬の反応に必要な色
原体試薬および触媒の一方または両者を添加する。使用
する色原体試薬の量は通常、アッセイメジウム中に期待
されるＤ−アラビニトールの最大量と少なくとも等モ
ル、好ましくはＤ−アラビニトールの量の少なくとも１
０倍、さらに好ましくはＤ−アラビニトールの量の少な
くとも１００倍である。
または順次混合したのち、Ｄ−アラビニトールの酸化の
結果として生成した生成物の存在を測定する。この生成
物の存在および量は、試験サンプル中のＤ−アラビニト
ールの量に関連する。本発明のＤＡＤＨ酵素は最初にサ
ンプルおよび酵素補因子と混合するのが好ましい。イン
キュベーション後、まだアッセイメジウム中に包含され
ていなければ、ＮＡＤＨと色原体試薬の反応に必要な色
原体試薬および触媒の一方または両者を添加する。使用
する色原体試薬の量は通常、アッセイメジウム中に期待
されるＤ−アラビニトールの最大量と少なくとも等モ
ル、好ましくはＤ−アラビニトールの量の少なくとも１
０倍、さらに好ましくはＤ−アラビニトールの量の少な
くとも１００倍である。
【００５５】本発明の他の態様は、Ｄ−アラビニトール
の含有が疑われるサンプル中のＤ−アラビニトールの存
在または量を決定するための本発明のアッセイ方法を、
簡便に実施するのに有用なキットに関する。本発明の活
用性を高めるために、試薬を、実質的に至適な方法およ
びアッセイを提供するようその比を選択し、同一または
別個の容器にパッケージされた組み合わせとして提供す
ることができる。試薬は、それぞれ別個の容器に入れる
か、または試薬の交差反応性および安定性に応じて、１
個もしくは２個以上の容器に混合する。キットは、一つ
の試薬として、本発明における特異的ＤＡＤＨ酵素を含
有する。キットにはさらに、補因子たとえばＮＡＤ+ 、
およびＮＡＤＨと反応して検出可能な生成物を与える試
剤を包含させることができる。
の含有が疑われるサンプル中のＤ−アラビニトールの存
在または量を決定するための本発明のアッセイ方法を、
簡便に実施するのに有用なキットに関する。本発明の活
用性を高めるために、試薬を、実質的に至適な方法およ
びアッセイを提供するようその比を選択し、同一または
別個の容器にパッケージされた組み合わせとして提供す
ることができる。試薬は、それぞれ別個の容器に入れる
か、または試薬の交差反応性および安定性に応じて、１
個もしくは２個以上の容器に混合する。キットは、一つ
の試薬として、本発明における特異的ＤＡＤＨ酵素を含
有する。キットにはさらに、補因子たとえばＮＡＤ+ 、
およびＮＡＤＨと反応して検出可能な生成物を与える試
剤を包含させることができる。
【００５６】キットにはさらに、本発明によるアッセイ
を実施するための試剤、たとえば支持体、補助試薬、サ
ンプル前処理試薬等を別にパッケージして包含させるこ
とができる。支持体は、多孔性または非多孔性の水不溶
性材料とすることができる。支持体は親水性であるかま
たは親水性にすることができるもので、無機粉末、天然
ポリマー材料、合成または改良天然ポリマー材料、たと
えばプラスチック、がらす、セラミック、金属等が包含
される。
を実施するための試剤、たとえば支持体、補助試薬、サ
ンプル前処理試薬等を別にパッケージして包含させるこ
とができる。支持体は、多孔性または非多孔性の水不溶
性材料とすることができる。支持体は親水性であるかま
たは親水性にすることができるもので、無機粉末、天然
ポリマー材料、合成または改良天然ポリマー材料、たと
えばプラスチック、がらす、セラミック、金属等が包含
される。
【００５７】本発明の他の態様は、ＮＡＤ+ と、基質と
してＤ−アラビニトールを利用できて、基質としてＤ−
マンニトールを実質的に利用できない特異的ＤＡＤＨ酵
素からなる組成物を意図するものである。
してＤ−アラビニトールを利用できて、基質としてＤ−
マンニトールを実質的に利用できない特異的ＤＡＤＨ酵
素からなる組成物を意図するものである。
【００５８】本発明の他の態様は、Ｄ−アラビニトール
の酸化を、他の天然に存在するポリオールの酸化に比
べ、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍速
い速度で触媒できるデヒドロゲナーゼである酵素からな
る組成物に関する。
の酸化を、他の天然に存在するポリオールの酸化に比
べ、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍速
い速度で触媒できるデヒドロゲナーゼである酵素からな
る組成物に関する。
【００５９】本発明の他の態様は、モノクローナル抗体
３Ｄ６または５Ｅ１１の一方または両者と、少なくとも
１×１０-6Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０-8Ｍの親
和性定数で結合するＤＡＤＨ酵素からなる組成物を提供
する。本発明の他の態様は、モノクローナル抗体３Ｄ６
または５Ｅ１１の一方または両者に結合するＣ．ｓｈｅ
ｈａｔａｅ酵素である。本発明の他の態様はまた、モノ
クローナル抗体３Ｄ６または５Ｅ１１の一方または両者
に結合するＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ酵素である。
３Ｄ６または５Ｅ１１の一方または両者と、少なくとも
１×１０-6Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０-8Ｍの親
和性定数で結合するＤＡＤＨ酵素からなる組成物を提供
する。本発明の他の態様は、モノクローナル抗体３Ｄ６
または５Ｅ１１の一方または両者に結合するＣ．ｓｈｅ
ｈａｔａｅ酵素である。本発明の他の態様はまた、モノ
クローナル抗体３Ｄ６または５Ｅ１１の一方または両者
に結合するＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ酵素である。
【００６０】例 本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。実
施例中に用いられる部および百分率は、とくに指示のな
い限り、重量によるものである。温度は、摂氏（℃）で
ある。
施例中に用いられる部および百分率は、とくに指示のな
い限り、重量によるものである。温度は、摂氏（℃）で
ある。
【００６１】例１ Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＤ−アラ
ビニトールデヒドロゲナーゼの精製 遠心分離および他の蛋白質精製工程は、とくに指示のな
い限り、４℃で行った。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ Ａ
ＴＣＣ ７５０の細胞、４Ｌを０．５％Ｄ−アラビニト
ールを補充した酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）上、旋回
シェーカーを用いて、室温で成育させた。その成育サイ
クルの後期対数期に達した（ＯＤ600 ＞５．０）のち、
遠心分離して細胞を収穫した。ついで、細胞を蒸留水で
洗浄し、再ペレット化し、細胞ペレットの湿重量を測定
した。ペレットを、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、１０-7
ＭペプスタチンＡ、１mMフェニルメチルスルホニルフル
オリドをＮａＯＨでpH７．０にした液に、細胞１ｇ湿重
量あたりこの緩衝液２mlを用いて、再懸濁した。酸洗浄
ガラスビーズ（０．４５〜０．５５mm）、細胞１ｇ湿重
量あたり２ｇ、細胞ペレットに添加した。細胞をつい
で、液体窒素で冷却しながら、Ｂｒａｕｎ ＭＳＫ細胞
ホモジナイザー中で破壊させた。破壊した細胞をガラス
ビーズから除去し、５，０００ｘｇで５分間回転させ
て、細胞壁物質をペレット化した。上清を超遠心機によ
り、４℃、１００，０００ｘｇで１時間回転した。得ら
れた上清を分離し、その容量および蛋白濃度を測定し
た。蛋白質１ｇあたり、９０mgのプロタミンサルフェー
トを、２％（ｗ／ｖ）保存溶液から、氷上で攪拌しなが
ら、５分間を要して滴加した。さらに１５分間氷上で攪
拌して、溶液を平衡化したのち、核酸−蛋白質沈殿を、
３０，０００ｘｇで１５分間遠心分離して除去した。得
られた上清に、その溶液を氷上で攪拌しながら、硫酸ア
ンモニウム結晶を２０分間を要して加え、４０％飽和と
した。さらに３０分間氷上で攪拌して、溶液を平衡化し
たのち、蛋白質沈殿を、１００，０００ｘｇで１５分間
遠心分離して回収した。得られたペレットを、操作緩衝
液（５０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５
Ｍ ＭｇＣｌ2 １０-7ＭペプスタチンＡを室温でＮａＯ
ＨによりpH７．０とする）に１００，０００ｘｇの上清
の２０分の１容用いて再懸濁した。蛋白質溶液をつい
で、反応性イエロー８６染料リガンドカラム（１cm×
３．５cm）に負荷し、カラムを５カラム容の操作緩衝液
で洗浄した（反応性イエロー８６染料およびそれを含有
するカラムは、たとえばＳｉｇｍａから市販されてい
る。この染料は、ジクロロトリアジン繊維用染料であ
る）。精製係数が劣ってもよい場合は、この操作工程に
他の染料リガンドカラムを使用することもできる。この
ような染料リガンドには、たとえば反応性ブルー４、反
応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン
５、反応性ブルー７２、および反応性イエロー３がある
が、これらに限定されるものではない（これらの染料
も、市販の繊維用染料である。Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ、
“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、１
８２巻、３４３−３５７頁、１９９０参照）。Ｄ−アラ
ビニトールデヒドロゲナーゼは、カラムを、１mMのＮＡ
ＤＨを補充した操作緩衝液３カラム容量で洗浄して溶出
した。溶出した蛋白質は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０マ
イクロコンセントレーター装置（Ａｍｉｃｏｎ、２４
Ｃｈｅｒｒｙ ＨｉｌｌＤｒｉｖｅ、Ｄｅｎｖｅｒｓ、
ＭＡ ０１９２３）を用いて、最終濃度を少なくとも１
mg／mlに濃縮した。Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナー
ゼは−８０℃で保存した。Ｄ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼの平均収率は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定して、９
０％以上であった。表１に蛋白質の精製結果をまとめ
る。
ビニトールデヒドロゲナーゼの精製 遠心分離および他の蛋白質精製工程は、とくに指示のな
い限り、４℃で行った。Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ Ａ
ＴＣＣ ７５０の細胞、４Ｌを０．５％Ｄ−アラビニト
ールを補充した酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）上、旋回
シェーカーを用いて、室温で成育させた。その成育サイ
クルの後期対数期に達した（ＯＤ600 ＞５．０）のち、
遠心分離して細胞を収穫した。ついで、細胞を蒸留水で
洗浄し、再ペレット化し、細胞ペレットの湿重量を測定
した。ペレットを、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、１０-7
ＭペプスタチンＡ、１mMフェニルメチルスルホニルフル
オリドをＮａＯＨでpH７．０にした液に、細胞１ｇ湿重
量あたりこの緩衝液２mlを用いて、再懸濁した。酸洗浄
ガラスビーズ（０．４５〜０．５５mm）、細胞１ｇ湿重
量あたり２ｇ、細胞ペレットに添加した。細胞をつい
で、液体窒素で冷却しながら、Ｂｒａｕｎ ＭＳＫ細胞
ホモジナイザー中で破壊させた。破壊した細胞をガラス
ビーズから除去し、５，０００ｘｇで５分間回転させ
て、細胞壁物質をペレット化した。上清を超遠心機によ
り、４℃、１００，０００ｘｇで１時間回転した。得ら
れた上清を分離し、その容量および蛋白濃度を測定し
た。蛋白質１ｇあたり、９０mgのプロタミンサルフェー
トを、２％（ｗ／ｖ）保存溶液から、氷上で攪拌しなが
ら、５分間を要して滴加した。さらに１５分間氷上で攪
拌して、溶液を平衡化したのち、核酸−蛋白質沈殿を、
３０，０００ｘｇで１５分間遠心分離して除去した。得
られた上清に、その溶液を氷上で攪拌しながら、硫酸ア
ンモニウム結晶を２０分間を要して加え、４０％飽和と
した。さらに３０分間氷上で攪拌して、溶液を平衡化し
たのち、蛋白質沈殿を、１００，０００ｘｇで１５分間
遠心分離して回収した。得られたペレットを、操作緩衝
液（５０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５
Ｍ ＭｇＣｌ2 １０-7ＭペプスタチンＡを室温でＮａＯ
ＨによりpH７．０とする）に１００，０００ｘｇの上清
の２０分の１容用いて再懸濁した。蛋白質溶液をつい
で、反応性イエロー８６染料リガンドカラム（１cm×
３．５cm）に負荷し、カラムを５カラム容の操作緩衝液
で洗浄した（反応性イエロー８６染料およびそれを含有
するカラムは、たとえばＳｉｇｍａから市販されてい
る。この染料は、ジクロロトリアジン繊維用染料であ
る）。精製係数が劣ってもよい場合は、この操作工程に
他の染料リガンドカラムを使用することもできる。この
ような染料リガンドには、たとえば反応性ブルー４、反
応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン
５、反応性ブルー７２、および反応性イエロー３がある
が、これらに限定されるものではない（これらの染料
も、市販の繊維用染料である。Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ、
“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、１
８２巻、３４３−３５７頁、１９９０参照）。Ｄ−アラ
ビニトールデヒドロゲナーゼは、カラムを、１mMのＮＡ
ＤＨを補充した操作緩衝液３カラム容量で洗浄して溶出
した。溶出した蛋白質は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０マ
イクロコンセントレーター装置（Ａｍｉｃｏｎ、２４
Ｃｈｅｒｒｙ ＨｉｌｌＤｒｉｖｅ、Ｄｅｎｖｅｒｓ、
ＭＡ ０１９２３）を用いて、最終濃度を少なくとも１
mg／mlに濃縮した。Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナー
ゼは−８０℃で保存した。Ｄ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼの平均収率は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で判定して、９
０％以上であった。表１に蛋白質の精製結果をまとめ
る。
【表１】Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ７５０
蛋白質の精製表 ＊活性は、１．５mM ＮＡＤ、５０mM３−（シクロヘキ
ヂルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン
酸（ＣＡＰＳＯ）、pH９．５中５０mMのＤ−アラビニト
ール、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ2 の１ml中
で、２５℃において測定した。ＮＡＤＨの産生は、３４
０nmの吸収の増加により、酵素の添加１５秒後から開始
して１分間モニタリングした。
蛋白質の精製表 ＊活性は、１．５mM ＮＡＤ、５０mM３−（シクロヘキ
ヂルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン
酸（ＣＡＰＳＯ）、pH９．５中５０mMのＤ−アラビニト
ール、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ2 の１ml中
で、２５℃において測定した。ＮＡＤＨの産生は、３４
０nmの吸収の増加により、酵素の添加１５秒後から開始
して１分間モニタリングした。
【００６２】例２ Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＤ−アラビニ
トールデヒドロゲナーゼに対するモノクローナル抗体の
製造 Ａ．一般的方法 使用した標準的ハイブリドーマ操作は、Ｋｏｈｌｅｒ、
Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．：Ｎａｔｕｒｅ、２５
６、４９５−４９７、１９７５；Ｈｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．
Ｇ．Ｒ．：“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、ＣＲＤ Ｐｒｅｓ
ｓ．１９８２、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ３３４３１
に、詳細に記載されている。
トールデヒドロゲナーゼに対するモノクローナル抗体の
製造 Ａ．一般的方法 使用した標準的ハイブリドーマ操作は、Ｋｏｈｌｅｒ、
Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．：Ｎａｔｕｒｅ、２５
６、４９５−４９７、１９７５；Ｈｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．
Ｇ．Ｒ．：“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、ＣＲＤ Ｐｒｅｓ
ｓ．１９８２、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ３３４３１
に、詳細に記載されている。
【００６３】Ｂ．免疫処置 Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、免疫源５０μｇの腹腔内
または皮下注射によって、免疫処置した。免疫源は、Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからの精製Ｄ−ア
ラビニトール（例１参照）をＨａｎｋｓ平衡食塩溶液
（ＨＢＳＳ）に５００μｇ／２．０mlの濃度に希釈して
調製した。抗原をついで２％スクアレン（ＲＩＢＩ Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ
ｃ．）中モノホスホリルリピドＡおよびトレハロースジ
マイコレートのアジュバント混合物に加え、注射に使用
した。マウスに、免疫原５０μｇを２回、ブースター投
与した。融合前に、ＨＢＳＳ中２００μｇのＣ．ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼの
最終静脈内注射を行った。
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、免疫源５０μｇの腹腔内
または皮下注射によって、免疫処置した。免疫源は、Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからの精製Ｄ−ア
ラビニトール（例１参照）をＨａｎｋｓ平衡食塩溶液
（ＨＢＳＳ）に５００μｇ／２．０mlの濃度に希釈して
調製した。抗原をついで２％スクアレン（ＲＩＢＩ Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ
ｃ．）中モノホスホリルリピドＡおよびトレハロースジ
マイコレートのアジュバント混合物に加え、注射に使用
した。マウスに、免疫原５０μｇを２回、ブースター投
与した。融合前に、ＨＢＳＳ中２００μｇのＣ．ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼの
最終静脈内注射を行った。
【００６４】Ｃ．細胞融合 免疫処置マウスから脾臓細胞を収穫し、ポリエチレング
リコールを使用して、Ｐ３ Ｘ６３−ＡＧ８．６５３骨
髄腫細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ１５８０）と融合させ
た。細胞を、ＨＡＴ（０．１mMヒポキサンチン、０．０
１６mMチミジンおよび０．４μＭアミノプテリン、Ｓｉ
ｇｍａ）補充メジウムに再懸濁し、９６−ウエルマイク
ロタイタープレートに分配した。４日後、ＨＡＴ補充メ
ジウムを半分置換して成育させた。
リコールを使用して、Ｐ３ Ｘ６３−ＡＧ８．６５３骨
髄腫細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ１５８０）と融合させ
た。細胞を、ＨＡＴ（０．１mMヒポキサンチン、０．０
１６mMチミジンおよび０．４μＭアミノプテリン、Ｓｉ
ｇｍａ）補充メジウムに再懸濁し、９６−ウエルマイク
ロタイタープレートに分配した。４日後、ＨＡＴ補充メ
ジウムを半分置換して成育させた。
【００６５】Ｄ．ハイブリドーマスクリーニング ハイブリドーマは逆相ＥＬＩＳＡによって、Ｃ．ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼに
対する特異的抗体についてスクリーニングした。マイク
ロタイターＥＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３５９
５）を、ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＮａＨＰＯ4 、０．０１
Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 ０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００
１％ＮａＮ3 、pH７．２に調整）中１：１００に希釈し
たウサギ抗−マウスＩｇＧ、Ａ、Ｍ、Ｈ鎖およびＬ鎖
（Ｚｙｍｅｄ、５２ Ｓｏｕｔｈ Ｌｉｎｄｅｎ Ａｖ
ｅｎｕｅ ＃４、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ）でコートした。上記溶液１００μｌを各ウエルに
加え、３７℃で少なくとも１時間、または４℃で一夜イ
ンキュベートした。プレートの非結合部位をＰＢＳ中１
％（ｖ／ｖ）の正常ヒツジ血清（ＮＳＳ、Ｓｉｇｍａ）
で遮断した（２００μｌ／ウエル）。ＮＳＳを吸い取っ
たのち、各ウエルに、５０μｌのハイブリドーマ培養液
の上清を加えた。プレートを２５℃で１時間インキュベ
ートした。ついでプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（Ｐ
ＢＳ中０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）で４回洗
浄した。過剰の洗浄緩衝液をプレートから吸い取り、Ｐ
ＢＴ〔ＰＢＳ中０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン
および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０〕中Ｄ−ア
ラビニトールデヒドロゲナーゼの２μｇ／ml溶液を１０
０μｌ／ウエルをプレートに加えた。ＥＩＡプレートを
２５℃で１時間インキュベートした。ついでプレートを
ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で４回洗浄し、過剰の洗浄緩衝液
をプレートから吸い取った。ついで、プレートを５０mM
ＣＡＰＳＯ中 ５０mMのＤ−アラビニトール（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ）および１．５mM ＮＡＤ、１００mMＮａＣ
ｌ、５mM ＭｇＣｌ2 を含有し、pHを９．５に調整した
基質溶液で展開した。プレートを３７℃で３０分間イン
キュベートし、ＮＡＤＨ生成物を３４０nmで測定した。
別法として、ＮＡＤＨの生成物を、酵素ジアホラーゼ
（Ｓｉｇｍａ）を介してｐ−ヨードニトロテトラゾリウ
ムバイオレット（ＩＮＴ、Ｓｉｇｍａ）の還元とカップ
リングさせた。上記反応混合物に、ジアホラーゼ（０．
５３４ＩＵ／ml、最終濃度）とＩＮＴ（０．０７４mM、
最終濃度）を加えた。反応混合物を上と同様にしてイン
キュベートし、還元ＩＮＴの産生を４９２nmでモニタリ
ングした。少なくとも３回の読みで、バックグランドよ
り高かったウエルを陽性とみなした。ＥＬＩＳＡ陽性ウ
エルからの細胞を、安定なモノクローナル抗体の分泌が
達成されるまで、サブクローニングした。サブクローニ
ング時にＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ酵素をＣ．ｓｈｅｈ
ａｔａｅに変えて、同じくＥＬＩＳＡスリーニングを実
施した。
ｐｉｃａｌｉｓＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼに
対する特異的抗体についてスクリーニングした。マイク
ロタイターＥＩＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３５９
５）を、ＰＢＳ（０．０１Ｍ ＮａＨＰＯ4 、０．０１
Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 ０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００
１％ＮａＮ3 、pH７．２に調整）中１：１００に希釈し
たウサギ抗−マウスＩｇＧ、Ａ、Ｍ、Ｈ鎖およびＬ鎖
（Ｚｙｍｅｄ、５２ Ｓｏｕｔｈ Ｌｉｎｄｅｎ Ａｖ
ｅｎｕｅ ＃４、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ）でコートした。上記溶液１００μｌを各ウエルに
加え、３７℃で少なくとも１時間、または４℃で一夜イ
ンキュベートした。プレートの非結合部位をＰＢＳ中１
％（ｖ／ｖ）の正常ヒツジ血清（ＮＳＳ、Ｓｉｇｍａ）
で遮断した（２００μｌ／ウエル）。ＮＳＳを吸い取っ
たのち、各ウエルに、５０μｌのハイブリドーマ培養液
の上清を加えた。プレートを２５℃で１時間インキュベ
ートした。ついでプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（Ｐ
ＢＳ中０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）で４回洗
浄した。過剰の洗浄緩衝液をプレートから吸い取り、Ｐ
ＢＴ〔ＰＢＳ中０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン
および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０〕中Ｄ−ア
ラビニトールデヒドロゲナーゼの２μｇ／ml溶液を１０
０μｌ／ウエルをプレートに加えた。ＥＩＡプレートを
２５℃で１時間インキュベートした。ついでプレートを
ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で４回洗浄し、過剰の洗浄緩衝液
をプレートから吸い取った。ついで、プレートを５０mM
ＣＡＰＳＯ中 ５０mMのＤ−アラビニトール（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ）および１．５mM ＮＡＤ、１００mMＮａＣ
ｌ、５mM ＭｇＣｌ2 を含有し、pHを９．５に調整した
基質溶液で展開した。プレートを３７℃で３０分間イン
キュベートし、ＮＡＤＨ生成物を３４０nmで測定した。
別法として、ＮＡＤＨの生成物を、酵素ジアホラーゼ
（Ｓｉｇｍａ）を介してｐ−ヨードニトロテトラゾリウ
ムバイオレット（ＩＮＴ、Ｓｉｇｍａ）の還元とカップ
リングさせた。上記反応混合物に、ジアホラーゼ（０．
５３４ＩＵ／ml、最終濃度）とＩＮＴ（０．０７４mM、
最終濃度）を加えた。反応混合物を上と同様にしてイン
キュベートし、還元ＩＮＴの産生を４９２nmでモニタリ
ングした。少なくとも３回の読みで、バックグランドよ
り高かったウエルを陽性とみなした。ＥＬＩＳＡ陽性ウ
エルからの細胞を、安定なモノクローナル抗体の分泌が
達成されるまで、サブクローニングした。サブクローニ
ング時にＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ酵素をＣ．ｓｈｅｈ
ａｔａｅに変えて、同じくＥＬＩＳＡスリーニングを実
施した。
【００６６】Ｅ．腹水中での抗体産生 モノクローナル抗体の精製を腹水中でスケールアップす
るために、マウスに不完全フロインドのアジュバントを
腹腔内に注射して感作して、細胞の継代２〜７日の腫瘍
の成育を容易にした。細胞をＴ−７５フラスコ中、５０
ml中最終濃度約１８×１０6 個細胞まで成育させ、遠心
分離し、ついで、１０％ＦＣＳ、１０％ＮＣＴＣ−１３
５（Ｇｉｂｃｏ）、１mMオキザロ酢酸（Ｓｉｇｍａ）、
１mMピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、４mM Ｌ−
グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／mlゲンタマイシ
ン（Ｇｉｂｃｏ）、１０μｇ／mlインスリン（Ｓｉｇｍ
ａ）、２０mM Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ）を含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）２mlに
再懸濁した。各マウスに、約４〜５×１０6 細胞を０．
５mlとして腹腔内に注射した。腹水腫瘍は通常、１〜２
週以内に発症した。高濃度の抗体を含む腹水を皮下針を
用いて腹腔から排出させた。液体は室温に放置して凝固
させ、ついでＢｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６型円ぢん分離機
により１５００rpm で遠心分離した。抗体を含有する液
体を洗いだし、４℃で保存した。
るために、マウスに不完全フロインドのアジュバントを
腹腔内に注射して感作して、細胞の継代２〜７日の腫瘍
の成育を容易にした。細胞をＴ−７５フラスコ中、５０
ml中最終濃度約１８×１０6 個細胞まで成育させ、遠心
分離し、ついで、１０％ＦＣＳ、１０％ＮＣＴＣ−１３
５（Ｇｉｂｃｏ）、１mMオキザロ酢酸（Ｓｉｇｍａ）、
１mMピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、４mM Ｌ−
グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／mlゲンタマイシ
ン（Ｇｉｂｃｏ）、１０μｇ／mlインスリン（Ｓｉｇｍ
ａ）、２０mM Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ）を含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）２mlに
再懸濁した。各マウスに、約４〜５×１０6 細胞を０．
５mlとして腹腔内に注射した。腹水腫瘍は通常、１〜２
週以内に発症した。高濃度の抗体を含む腹水を皮下針を
用いて腹腔から排出させた。液体は室温に放置して凝固
させ、ついでＢｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６型円ぢん分離機
により１５００rpm で遠心分離した。抗体を含有する液
体を洗いだし、４℃で保存した。
【００６７】例３ モノクローナル抗体の各種Ｄ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼに対するＥＬＩＳＡ結合 Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼに対して産生されたモノクローナル抗体を、
上述の逆相ＥＬＩＳＡでＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよ
びＣ．ｓｈｅｈａｔａｅから生成されたＤ−アラビニト
ール特異的のデヒドロゲナーゼへの結合についてスクリ
ーニングした。これらのモノクローナル抗体は、Ｄ−ア
ラビニトールのほかに他の糖アルコール基質を利用でき
るポリオールデヒドロゲナーゼへの結合についてもスク
リーニングした。Ｄ−アラビニトール、Ｄ−ソルビトー
ル、キシリトールおよびＤ−マンニトールを利用できる
Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅポリオールデヒドロゲナーゼを試
験した。また、基質としてＤ−アラビニトールもしくは
Ｄ−マンニトールを利用するＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓからの酵素、Ｄ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼも試験した。
ゲナーゼに対するＥＬＩＳＡ結合 Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＤ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼに対して産生されたモノクローナル抗体を、
上述の逆相ＥＬＩＳＡでＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよ
びＣ．ｓｈｅｈａｔａｅから生成されたＤ−アラビニト
ール特異的のデヒドロゲナーゼへの結合についてスクリ
ーニングした。これらのモノクローナル抗体は、Ｄ−ア
ラビニトールのほかに他の糖アルコール基質を利用でき
るポリオールデヒドロゲナーゼへの結合についてもスク
リーニングした。Ｄ−アラビニトール、Ｄ−ソルビトー
ル、キシリトールおよびＤ−マンニトールを利用できる
Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅポリオールデヒドロゲナーゼを試
験した。また、基質としてＤ−アラビニトールもしくは
Ｄ−マンニトールを利用するＡｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓからの酵素、Ｄ−アラビニトールデヒド
ロゲナーゼも試験した。
【００６８】Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＤ−アラ
ビニトールデヒドロゲナーゼを例１の記載に従い精製し
た。Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅからのＤ−アラビニトールデ
ヒドロゲナーゼの精製は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓか
らのＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼの精製と、い
くつかの例外を除いて同様である。Ｂｒａｕｎ ＭＳＫ
細胞ホモジナイザー中で破壊した細胞をガラスビーズか
ら分離して、３０，０００ｘｇで１５分間回転させて細
胞壁材料本をペレット化した。また、蛋白質を沈殿させ
るのに、４０％ではなく、６０％飽和硫酸アンモニウム
を使用した。これにより、Ｄ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼおよびポリオールデヒドロゲナーゼの両者の沈
殿が可能となった。Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナー
ゼは例１に記載のように反応性イエロー８６染料リガン
ドカラム上で精製した。この同じ株からのポリオールデ
ヒドロゲナーゼは、反応性イエロー８６染料リガンドカ
ラムの素通り分画を、反応性ブルー２染料リガンドカラ
ム（１．０cm×６．０cm）に通して精製した。ポリオー
ルデヒドロゲナーゼは、ついで、カラムを１０mMＮＡＤ
を補充した操作緩衝液３カラム容量で洗浄して溶出させ
た。Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓからＤ
−アラビニトールデヒドロゲナーゼ（凍結乾燥細胞、１
型、Ｓｉｇｍａ）は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．、１８３、３１−４２、１９７９）の記載
に従って精製した。
ビニトールデヒドロゲナーゼを例１の記載に従い精製し
た。Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅからのＤ−アラビニトールデ
ヒドロゲナーゼの精製は、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓか
らのＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼの精製と、い
くつかの例外を除いて同様である。Ｂｒａｕｎ ＭＳＫ
細胞ホモジナイザー中で破壊した細胞をガラスビーズか
ら分離して、３０，０００ｘｇで１５分間回転させて細
胞壁材料本をペレット化した。また、蛋白質を沈殿させ
るのに、４０％ではなく、６０％飽和硫酸アンモニウム
を使用した。これにより、Ｄ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼおよびポリオールデヒドロゲナーゼの両者の沈
殿が可能となった。Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナー
ゼは例１に記載のように反応性イエロー８６染料リガン
ドカラム上で精製した。この同じ株からのポリオールデ
ヒドロゲナーゼは、反応性イエロー８６染料リガンドカ
ラムの素通り分画を、反応性ブルー２染料リガンドカラ
ム（１．０cm×６．０cm）に通して精製した。ポリオー
ルデヒドロゲナーゼは、ついで、カラムを１０mMＮＡＤ
を補充した操作緩衝液３カラム容量で洗浄して溶出させ
た。Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓからＤ
−アラビニトールデヒドロゲナーゼ（凍結乾燥細胞、１
型、Ｓｉｇｍａ）は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．、１８３、３１−４２、１９７９）の記載
に従って精製した。
【００６９】逆相ＥＬＩＳＡスクリーニングは、培養上
清の代わりに腹水をＰＢＴ中に１：１００に希釈したほ
かは（１００μｌ／ウエル）、上述と同様に実施した。
さらに、各株からの精製Ｄ−アラビニトールデヒドロゲ
ナーゼは、０．２ＩＵ／mlに希釈した（国際単位は１分
間に産生するＮＡＤＨの量である）。対照として、各活
性検定について、Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ
活性を、次のようにして確認した。すなわち、非結合Ｄ
−アラビニトール１０μｌをＥＬＩＳＡウエルから取
り、酵素活性を上述のように発色試薬でチェックした。
陰性抗体対照には、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏ
ｍａｔｉｓ免疫マウスの血清をＰＢＴで１：１００に希
釈して使用した。
清の代わりに腹水をＰＢＴ中に１：１００に希釈したほ
かは（１００μｌ／ウエル）、上述と同様に実施した。
さらに、各株からの精製Ｄ−アラビニトールデヒドロゲ
ナーゼは、０．２ＩＵ／mlに希釈した（国際単位は１分
間に産生するＮＡＤＨの量である）。対照として、各活
性検定について、Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ
活性を、次のようにして確認した。すなわち、非結合Ｄ
−アラビニトール１０μｌをＥＬＩＳＡウエルから取
り、酵素活性を上述のように発色試薬でチェックした。
陰性抗体対照には、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏ
ｍａｔｉｓ免疫マウスの血清をＰＢＴで１：１００に希
釈して使用した。
【００７０】結果は表２にまとめる。各モノクローナル
抗体は、４種の酵素のそれぞれについて、二重に（ＤＵ
Ｐ）分析を行った。ブランクは上記実験をモノクローナ
ル抗体を加えないで反復して求め、ブランクの読みをＤ
ＵＰ値から差し引いた。ＤＵＰ値の平均を表２に示す。
結果は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ抗体の場合の読みに比べて
ＥＬＩＳＡの読みが高いことから明らかなように、Ｃ．
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＤ−アラビニトールデヒドロゲ
ナーゼに対して産生されたモノクローナル抗体がＣ．ｔ
ｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｓｈｅｈａｔａｅ両者か
らのＤ−アラビニトール特異的デヒドロゲナーゼに結合
することを示している。これに対し、Ｃ．ｓｈｅｈａｔ
ａｅおよびＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ
から精製されたポリオールデヒドロゲナーゼでは、これ
らの読みがＣｈｌａｍｙｄｉａ抗体の場合の読みに比べ
て有意には高くないことから明らかなように、あっても
比較的弱い結合しか見られない。これらの結果は、この
モノクローナル抗体が、Ｄ−アラビニトール特異的デヒ
ドロゲナーゼにのみ結合し、基質としてＤ−アラビニト
ールまたは他の糖アルコールを利用する特異性の劣るデ
ヒドロゲナーゼには結合しないことを示している。
抗体は、４種の酵素のそれぞれについて、二重に（ＤＵ
Ｐ）分析を行った。ブランクは上記実験をモノクローナ
ル抗体を加えないで反復して求め、ブランクの読みをＤ
ＵＰ値から差し引いた。ＤＵＰ値の平均を表２に示す。
結果は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ抗体の場合の読みに比べて
ＥＬＩＳＡの読みが高いことから明らかなように、Ｃ．
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＤ−アラビニトールデヒドロゲ
ナーゼに対して産生されたモノクローナル抗体がＣ．ｔ
ｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｓｈｅｈａｔａｅ両者か
らのＤ−アラビニトール特異的デヒドロゲナーゼに結合
することを示している。これに対し、Ｃ．ｓｈｅｈａｔ
ａｅおよびＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ
から精製されたポリオールデヒドロゲナーゼでは、これ
らの読みがＣｈｌａｍｙｄｉａ抗体の場合の読みに比べ
て有意には高くないことから明らかなように、あっても
比較的弱い結合しか見られない。これらの結果は、この
モノクローナル抗体が、Ｄ−アラビニトール特異的デヒ
ドロゲナーゼにのみ結合し、基質としてＤ−アラビニト
ールまたは他の糖アルコールを利用する特異性の劣るデ
ヒドロゲナーゼには結合しないことを示している。
【表２】Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ Ｄ−アラビニトー
ルデヒドロゲナーゼに特異的なモノクローナル抗体に対
するポリオールデヒドロゲナーゼのＥＬＩＳＡ結合 1) ＣＴＤＡＤＨ＝Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓＤ−アラ
ビニトールデヒドロゲナーゼ 2) ＣＳＰＡＤＨ＝Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅＤ−アラビニ
トールデヒドロゲナーゼ 3) ＣＳＰＤＨ＝Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅポリオールデヒ
ドロゲナーゼ 4) ＡＡＤＡＤＨ＝Ａ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓポリオール
デヒドロゲナーゼ
ルデヒドロゲナーゼに特異的なモノクローナル抗体に対
するポリオールデヒドロゲナーゼのＥＬＩＳＡ結合 1) ＣＴＤＡＤＨ＝Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓＤ−アラ
ビニトールデヒドロゲナーゼ 2) ＣＳＰＡＤＨ＝Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅＤ−アラビニ
トールデヒドロゲナーゼ 3) ＣＳＰＤＨ＝Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅポリオールデヒ
ドロゲナーゼ 4) ＡＡＤＡＤＨ＝Ａ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓポリオール
デヒドロゲナーゼ
【００７１】例４ ヒト血清蛍光原アッセイプロトコールでのＤ−アラビニ
トールの蛍光原アッセイ ヒト血清を１０mmol／l のクエン酸塩（pH４．０）で
１：３（v/v ）に希釈し、沸騰水浴中に１０分間置き、
ついで１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、沈殿し
た物質を除去した。上清をサンプルとして使用した。反
応混合物は、サンプル０．３ml、１mmol／ｌのＮＡ
Ｄ+ 、４mmol／ｌのＭｇ２＋、例１の記載に従い製造し
たＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ Ｄ−アラビニトールデヒ
ドロゲナーゼ０．３５ＩＵ、および０．１mol ／ｌのＴ
ｒｉｓ（pH９．５）を含有する。インキュベーション
は、室温で１５分間行い、Ｄ−アラビニトールのＤ−ア
ラビニトールデヒドロゲナーゼ触媒酸化と、ＮＡＤ+ の
ＮＡＤＨへの同時還元を促進させた。この初期インキュ
ベーション段階は、反応混合物のpHを１．０mol ／ｌの
クエン酸塩（pH３．６）で５．８に低下させて終結させ
た。ついで、レザズリン（１２．５μmol ／ｌ）および
ジアホラーゼ（０．１５ＩＵ）を加え、サンプルを室温
で再インキュベートしてＮＡＤＨ（初期のインキュベー
ション段階に蓄積された）のジアホラーゼ触媒利用によ
るレザズリンのレゾフリンへの還元を促進した。レゾフ
リンの形成は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ蛍光スペクト
ルフォトメーター＃６５０−４０型を用いて蛍光により
モニタリングし、これは３０秒以内に完了した。
トールの蛍光原アッセイ ヒト血清を１０mmol／l のクエン酸塩（pH４．０）で
１：３（v/v ）に希釈し、沸騰水浴中に１０分間置き、
ついで１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、沈殿し
た物質を除去した。上清をサンプルとして使用した。反
応混合物は、サンプル０．３ml、１mmol／ｌのＮＡ
Ｄ+ 、４mmol／ｌのＭｇ２＋、例１の記載に従い製造し
たＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ Ｄ−アラビニトールデヒ
ドロゲナーゼ０．３５ＩＵ、および０．１mol ／ｌのＴ
ｒｉｓ（pH９．５）を含有する。インキュベーション
は、室温で１５分間行い、Ｄ−アラビニトールのＤ−ア
ラビニトールデヒドロゲナーゼ触媒酸化と、ＮＡＤ+ の
ＮＡＤＨへの同時還元を促進させた。この初期インキュ
ベーション段階は、反応混合物のpHを１．０mol ／ｌの
クエン酸塩（pH３．６）で５．８に低下させて終結させ
た。ついで、レザズリン（１２．５μmol ／ｌ）および
ジアホラーゼ（０．１５ＩＵ）を加え、サンプルを室温
で再インキュベートしてＮＡＤＨ（初期のインキュベー
ション段階に蓄積された）のジアホラーゼ触媒利用によ
るレザズリンのレゾフリンへの還元を促進した。レゾフ
リンの形成は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ蛍光スペクト
ルフォトメーター＃６５０−４０型を用いて蛍光により
モニタリングし、これは３０秒以内に完了した。
【００７２】蛍光アッセイによる検量曲線 正常ヒト血清のプールに様々な量のＤ−アラビニトール
を添加して、一連のアッセイを実施し、その結果を表３
にまとめる。５８０nmにおける蛍光発光（Ｙ−軸）を、
添加Ｄ−アラビニトール量（Ｘ−軸）に対してプロット
して、アッセイの検量曲線が得られた。このプロットの
Ｘ−切片の絶対値は、血清のプール中に存在する内因性
レベルを示す。２２回の反復実験において、検量曲線は
直線で（平均ｒ2 ＝０．９９８）、補足サンプル中のＤ
−アラビニトールの測定値と期待値（ｙ−切片＋添加
量）の差は０．６μmol ／ｌまたは１３．２％未満であ
った。
を添加して、一連のアッセイを実施し、その結果を表３
にまとめる。５８０nmにおける蛍光発光（Ｙ−軸）を、
添加Ｄ−アラビニトール量（Ｘ−軸）に対してプロット
して、アッセイの検量曲線が得られた。このプロットの
Ｘ−切片の絶対値は、血清のプール中に存在する内因性
レベルを示す。２２回の反復実験において、検量曲線は
直線で（平均ｒ2 ＝０．９９８）、補足サンプル中のＤ
−アラビニトールの測定値と期待値（ｙ−切片＋添加
量）の差は０．６μmol ／ｌまたは１３．２％未満であ
った。
【００７３】０、２、７および１４μmol ／ｌのＤ−ア
ラビニトールを添加した正常ヒト血清のプールについて
の４回反復実験の結果を例４に例示する。Ｄ−アラビニ
トール濃度の平均測定値は期待値（添加量＋非処理プー
ルのＤ−アラビニトール濃度測定値）の０．５８μmol
／ｌまたは６．９％以内にあり、標準偏差は０．６０μ
mol ／ｌまたは５．９％未満であった。
ラビニトールを添加した正常ヒト血清のプールについて
の４回反復実験の結果を例４に例示する。Ｄ−アラビニ
トール濃度の平均測定値は期待値（添加量＋非処理プー
ルのＤ−アラビニトール濃度測定値）の０．５８μmol
／ｌまたは６．９％以内にあり、標準偏差は０．６０μ
mol ／ｌまたは５．９％未満であった。
【００７４】蛍光Ｄ−アラビニトールアッセイの正確度 様々な量のＤ−アラビニトールを添加した各ヒト血清、
数種の分析結果を表５に例示する。各サンプルについ
て、補充サンプル中のＤ−アラビニトール濃度測定値
を、非補充サンプル中の濃度測定値と補充液中の含量の
和で除して、アッセイの正確度とした。いずれの場合
も、Ｄ−アラビニトールの測定値は、期待値の１６％以
内にあった。１１例の正常成人血清における平均内因性
Ｄ−アラビニトール濃度±ＳＤは１．８６±０．３６μ
mol ／ｌであった。
数種の分析結果を表５に例示する。各サンプルについ
て、補充サンプル中のＤ−アラビニトール濃度測定値
を、非補充サンプル中の濃度測定値と補充液中の含量の
和で除して、アッセイの正確度とした。いずれの場合
も、Ｄ−アラビニトールの測定値は、期待値の１６％以
内にあった。１１例の正常成人血清における平均内因性
Ｄ−アラビニトール濃度±ＳＤは１．８６±０．３６μ
mol ／ｌであった。
【００７５】蛍光アッセイの特異性 ヒト血清中に通常存在する一連の糖および糖アルコール
について蛍光アッセイにおける反応性を調べた。試験し
た化合物中、等モル量のＤ−アラビニトールで認められ
る反応性に比して有意な反応性はキシリトールにのみみ
られた（３．３％）。最高５．０mmol／ｌまでの濃度の
グルコースは基質として利用されなかった。
について蛍光アッセイにおける反応性を調べた。試験し
た化合物中、等モル量のＤ−アラビニトールで認められ
る反応性に比して有意な反応性はキシリトールにのみみ
られた（３．３％）。最高５．０mmol／ｌまでの濃度の
グルコースは基質として利用されなかった。
【表３】 蛍光Ｄ−アラビニトールアッセイの検量曲線 ──────────────────────────────── 添加Ｄ−アラビニトール 蛍光発光、５８０nm （μmol ／Ｌ） （単 位） ──────────────────────────────── ０ １９．６ ４ ５０．５ ８ ７８．７ １２ １１１ １６ １４１ ──────────────────────────────── Ｙ＝１９．５００＋７．５８２５ｘ ｒ2 ＝１．０００
【表４】 蛍光アッセイで検知される血清Ｄ−アラビニトールの正確度および精度 ──────────────────────────────────── 添加 測定 測定値／ Ｄ−アラビニトール 〔Ｄ−アラビニトール〕a ＣＶ（％） 期待値b （μmol ／Ｌ） （μmol ／Ｌ） ──────────────────────────────────── ０ １．４５±０．０８６ ５．９ −− ２ ３．４３±０．０９６ ２．８ ０．９９ ７ ７．８３±０．３７ ４．７ ０．９３ １４ １５．４ ±０．６０ ３．９ １．００ ────────────────────────────────────a ４回反復分析の平均±標準偏差b 測定平均〔Ｄ−アラビニトール〕／（添加Ｄ−アラビ
ニトール＋１．４５μmol ／ｌ）
ニトール＋１．４５μmol ／ｌ）
【表５】 数例の正常ヒト血清における蛍光Ｄ−アラビニトールアッセイの正確度 ──────────────────────────────────── 測 定 〔Ｄ−アラビニトール〕 （μmol ／Ｌ） ヒト 添加Ｄ−アラビニトール 非補充 補充 測定値／ 血清番号 （μmol ／Ｌ） サンプル サンプル 期待値b) ──────────────────────────────────── １ ２ １．７６ ３．９４ １．０５ ２ １．５ １．９４ ３．２４ ０．９４ ３ ３ １．９６ ４．５６ ０．９２ ４ １０ １．９６ １０．７ ０．８９ ５ ７５ １．７５ ８５．７ １．１２ ６ ７ ２．０４ ８．３ ０．９２ ７ ８ １．８５ １０．０ １．０２ ８ ４０ １．７５ ４８．０ １．１５ ９ １ ２．５５ ３．５７ １．０１ １０ ８ １．５７ ９．９１ １．０４ １１ ２ １．３３ ２．８０ ０．８４ １１ ５ １．３３ ５．４８ ０．８７ １１ １０ １．３３ ９．９９ ０．８８ １１ ４５ １．３３ ４４．７ ０．９６ ──────────────────────────────────── a 補充サンプル中の測定〔Ｄ−アラビニトール〕／（添
加Ｄ−アラビニトール＋非補充サンプル中の測定〔Ｄ−
アラビニトール〕
加Ｄ−アラビニトール＋非補充サンプル中の測定〔Ｄ−
アラビニトール〕
【表６】 蛍光Ｄ−アラビニトールアッセイの特異性 ──────────────────────────────────── 添加化合物 濃 度 相対反応性 （μmol ／Ｌ） （％） ──────────────────────────────────── Ｄ−アラビニトール ５ １００ Ｌ−アラビニトール ５ ０ リビトール ５ ０ キシリトール ５ ３．３ Ｄ−ソルビトール ５ ０．１ Ｄ−マンニトール ５ ０ エリスリートール ５ ０ スレイトール ５ ０．１ ガラクチトール ５ ０．６ Ｄ−フルクトース ５００ ０ Ｄ−ガラクトース ５００ ０．９ Ｄ−マンノース ５００ ０．３ Ｄ−グルコース ５０００ ０ ──────────────────────────────────── アッセイは、煮沸血清上清に代えて、サンプルが、１０
mmol／ｌクエン酸塩、pH４．０中に指示化合物のＰＢＳ
溶液（１：３，ｖ／ｖ）を含むほかは、例４と同様に実
施した。
mmol／ｌクエン酸塩、pH４．０中に指示化合物のＰＢＳ
溶液（１：３，ｖ／ｖ）を含むほかは、例４と同様に実
施した。
【００７６】例５ ヒト血清中のＤ−アラビニトールの放射性同位元素交換
アッセイ トリチウム交換アッセイプロトコール アッセイインキュベーション溶液（容量＝０．１ml）
は、０．０５mlの限外濾過ヒト血清、０．２mmol／ｌの
非標識ＮＡＤ+ 、０．０１５mmol／ｌ（０．６２Ci／mm
ol）〔４（ｓ）− 3Ｈ〕ＮＡＤＨ、２mg／ml ＢＳＡ、
０．２mmol／ｌＤＴＴ、４mmol／ｌ Ｍｇ2+、４０mmol
／ｌ Ｔｒｉｓ（pH９．２）および０．３５ＩＵ Ｃ．
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ Ｄ−アラビニトールデヒドロゲ
ナーゼを含有させた。インキュベーションは室温で２時
間行い、トリチウムの〔４（ｓ）− 3Ｈ〕ＮＡＤＨから
Ｄ−アラビニトールへの、Ｄ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼ触媒変換を促進した。インキュベーション後、
サンプルを０．９mlの蒸留水に希釈し、予めＯＨ型に平
衡化したＡＧ ２−Ｘ８（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．７３１−６２４７）のカラムに適用した。カラムを
６mlの蒸留水で溶出し、溶出液を集め、２５０mmol／ｌ
のＮＨ4 ＯＡｃ（pH８．８）で１：１（ｖ／ｖ）に希釈
し、予めＮＨ4 ＯＡｃ緩衝液で平衡化したフェニルボロ
ネート（Ｐｉｅｒｃｅ，３７４７ Ｎｏｒｔｈ Ｍｅｒ
ｉｄａｎＲｏａｄ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１１７，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ III ．６１１０５，Ｃａｔ．Ｎｏ．２０３６
８）のカラム１mlに適用した。カラムを１０mlの２５０
mmol／ｌのＮＨ4 ＯＡｃ（pH８．８）で洗浄し、ついで
４mlのギ酸で溶出した。ギ酸溶出液について、シンチレ
ーションスペクトロメトリーによりトリチウムを分析し
た。
アッセイ トリチウム交換アッセイプロトコール アッセイインキュベーション溶液（容量＝０．１ml）
は、０．０５mlの限外濾過ヒト血清、０．２mmol／ｌの
非標識ＮＡＤ+ 、０．０１５mmol／ｌ（０．６２Ci／mm
ol）〔４（ｓ）− 3Ｈ〕ＮＡＤＨ、２mg／ml ＢＳＡ、
０．２mmol／ｌＤＴＴ、４mmol／ｌ Ｍｇ2+、４０mmol
／ｌ Ｔｒｉｓ（pH９．２）および０．３５ＩＵ Ｃ．
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ Ｄ−アラビニトールデヒドロゲ
ナーゼを含有させた。インキュベーションは室温で２時
間行い、トリチウムの〔４（ｓ）− 3Ｈ〕ＮＡＤＨから
Ｄ−アラビニトールへの、Ｄ−アラビニトールデヒドロ
ゲナーゼ触媒変換を促進した。インキュベーション後、
サンプルを０．９mlの蒸留水に希釈し、予めＯＨ型に平
衡化したＡＧ ２−Ｘ８（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．７３１−６２４７）のカラムに適用した。カラムを
６mlの蒸留水で溶出し、溶出液を集め、２５０mmol／ｌ
のＮＨ4 ＯＡｃ（pH８．８）で１：１（ｖ／ｖ）に希釈
し、予めＮＨ4 ＯＡｃ緩衝液で平衡化したフェニルボロ
ネート（Ｐｉｅｒｃｅ，３７４７ Ｎｏｒｔｈ Ｍｅｒ
ｉｄａｎＲｏａｄ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１１７，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ III ．６１１０５，Ｃａｔ．Ｎｏ．２０３６
８）のカラム１mlに適用した。カラムを１０mlの２５０
mmol／ｌのＮＨ4 ＯＡｃ（pH８．８）で洗浄し、ついで
４mlのギ酸で溶出した。ギ酸溶出液について、シンチレ
ーションスペクトロメトリーによりトリチウムを分析し
た。
【００７７】トリチウム交換アッセイの検量曲線 正常ヒト血清のプールに様々な量のＤ−アラビニトール
を添加して、、一連のアッセイを実施し、その結果を表
７にまとめる。回収されたトリチウム（Ｙ−軸）を添加
Ｄ−アラビニトール量（ｘ−軸）に対してプロットし
て、アッセイの検量曲線が得られた。この曲線のＸ−切
片の絶対値は、血清のプール中に存在する内因性のＤ−
アラビニトールとＤ−リブロースの合計を示す。Ｄ−リ
ブロースの内因性血清濃度は、アッセイを類似の条件
下、ただしＮＡＤ+ の不存在下に行い、Ｄ−アラビニト
ールへのトリチウムの取り込みを測定して得られる。検
量曲線は直線（平均ｒ2 ＝０．９９０）で、補足サンプ
ル中のＤ−アラビニトールの測定値との期待値の差は
０．４２μmol ／ｌまたは７．９％未満であった。
を添加して、、一連のアッセイを実施し、その結果を表
７にまとめる。回収されたトリチウム（Ｙ−軸）を添加
Ｄ−アラビニトール量（ｘ−軸）に対してプロットし
て、アッセイの検量曲線が得られた。この曲線のＸ−切
片の絶対値は、血清のプール中に存在する内因性のＤ−
アラビニトールとＤ−リブロースの合計を示す。Ｄ−リ
ブロースの内因性血清濃度は、アッセイを類似の条件
下、ただしＮＡＤ+ の不存在下に行い、Ｄ−アラビニト
ールへのトリチウムの取り込みを測定して得られる。検
量曲線は直線（平均ｒ2 ＝０．９９０）で、補足サンプ
ル中のＤ−アラビニトールの測定値との期待値の差は
０．４２μmol ／ｌまたは７．９％未満であった。
【表７】 トリチウム交換アッセイの検量曲線 ────────────────────────────────── アッセイ番号 添加Ｄ−アラビニトール 回収トリチウム （μmol ／Ｌ） （ｃｐｍ×０．００１） ────────────────────────────────── １ ０ ２５．５ ２ ２ ４５．３ ３ ４ ６２．８ ４ ６ ７２．９ ５ ８ ９０．８ ────────────────────────────────── ｙ＝２７．８２＋７．９１ｘ ｒ2 ＝０．９９０
【００７８】例６ ヒト血清中Ｄ−アラビニトールの自動発色アッセイ 自動発色アッセイプロトコール アッセイはＣＯＢＡＳ−ＭＩＲＡ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ
ＬａＲｏｃｈｅ）によって実施した。サンプルは、蛍光
アッセイプロトコールに指示したように、煮沸して前処
理したヒト血清とした。希釈剤（１mol ／ｌ グリシ
ン、pH１０．５）のほかに、以下の３種の試薬を加え
た。 1. 酵素試験〔１０mmol／ｌ Ｔｒｉｓ／酢酸塩（pH
６．０）、１００mmol／ｌ ＮａＣｌ，１０mmol／１
Ｍｇ２＋、２．３３mmol／ｌ ＮＡＤ＋、２０μｇ／ml
ＢＳＡ、および３．５ＩＵ／ml Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａ
ｌｉｓ Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ〕 2. カップリング試薬〔３．１８mmol／ｌ ヨードニト
ロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、６６．７mmol／l ＥＤ
ＴＡ（pH９．０）および０．０３％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
２５Ｒ２〕 3. ジアホラーゼ試薬〔ＰＢＳ中６０Ｕ／ml Ｃ．ｋｌ
ｕｙｖｅｒｉジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ. No.
０２３８１）〕 サイクル時間２５秒、インキュベーション温度３０℃で
ＭＩＲＡにより以下のアッセイ工程を実施した。 サイクル１：サンプル（容量＝８５＋１０μｌ 希釈
剤）と酵素試薬（容量＝１００μｌ）を混合、 サイクル３７：カップリング試薬（容量＝１５＋５μｌ
蒸留水を添加、 サイクル３８：Ａｂｓ500nm を読む、 サイクル３９：ジアホラーゼ試薬（容量＝３＋５μｌ蒸
留水）を添加、 サイクル４０：Ａｂｓ500nm を読む。 アッセイ結果、ΔＡ＝Ａｂｓ500nm ・サイクル４０−Ａ
ｂｓ500nm ・サイクル３８
ＬａＲｏｃｈｅ）によって実施した。サンプルは、蛍光
アッセイプロトコールに指示したように、煮沸して前処
理したヒト血清とした。希釈剤（１mol ／ｌ グリシ
ン、pH１０．５）のほかに、以下の３種の試薬を加え
た。 1. 酵素試験〔１０mmol／ｌ Ｔｒｉｓ／酢酸塩（pH
６．０）、１００mmol／ｌ ＮａＣｌ，１０mmol／１
Ｍｇ２＋、２．３３mmol／ｌ ＮＡＤ＋、２０μｇ／ml
ＢＳＡ、および３．５ＩＵ／ml Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａ
ｌｉｓ Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ〕 2. カップリング試薬〔３．１８mmol／ｌ ヨードニト
ロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、６６．７mmol／l ＥＤ
ＴＡ（pH９．０）および０．０３％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
２５Ｒ２〕 3. ジアホラーゼ試薬〔ＰＢＳ中６０Ｕ／ml Ｃ．ｋｌ
ｕｙｖｅｒｉジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ. No.
０２３８１）〕 サイクル時間２５秒、インキュベーション温度３０℃で
ＭＩＲＡにより以下のアッセイ工程を実施した。 サイクル１：サンプル（容量＝８５＋１０μｌ 希釈
剤）と酵素試薬（容量＝１００μｌ）を混合、 サイクル３７：カップリング試薬（容量＝１５＋５μｌ
蒸留水を添加、 サイクル３８：Ａｂｓ500nm を読む、 サイクル３９：ジアホラーゼ試薬（容量＝３＋５μｌ蒸
留水）を添加、 サイクル４０：Ａｂｓ500nm を読む。 アッセイ結果、ΔＡ＝Ａｂｓ500nm ・サイクル４０−Ａ
ｂｓ500nm ・サイクル３８
【００７９】自動発色アッセイの検量曲線 正常ヒト血清のプールに様々な量のＤ−アラビニトール
を添加して、一連のアッセイを実施し、その結果を表８
にまとめる。この血清のプール中の内因性Ｄ−アラビニ
トールのレベルは、Ｗｏｎｇ ＆ Ｂｒａｕｅｒ（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２６、１６７０、１９８
８）の酵素法により予め１．０μmol ／ｌと定量されて
いた。平均Ａｂｓ500nm （Ｙ−軸）を総血清Ｄ−アラビ
ニトール量（内因性＋添加量）（ｘ−軸）に対してプロ
ットして、アッセイの検量曲線が得られた。検量曲線は
直線（ｒ2 ＝１．００）で、補足サンプル中のＤ−アラ
ビニトールの測定値との期待値の差は０．１７μmol ／
ｌまたは１．０％未満であった。
を添加して、一連のアッセイを実施し、その結果を表８
にまとめる。この血清のプール中の内因性Ｄ−アラビニ
トールのレベルは、Ｗｏｎｇ ＆ Ｂｒａｕｅｒ（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２６、１６７０、１９８
８）の酵素法により予め１．０μmol ／ｌと定量されて
いた。平均Ａｂｓ500nm （Ｙ−軸）を総血清Ｄ−アラビ
ニトール量（内因性＋添加量）（ｘ−軸）に対してプロ
ットして、アッセイの検量曲線が得られた。検量曲線は
直線（ｒ2 ＝１．００）で、補足サンプル中のＤ−アラ
ビニトールの測定値との期待値の差は０．１７μmol ／
ｌまたは１．０％未満であった。
【表８】 自動発色アッセイの検量曲線 ──────────────────────────────────── アッセイ番号 血清Ｄ−アラビニトール 平均ΔＡｂｓ500nm （μmol ／Ｌ） （×１０3 ） ──────────────────────────────────── １ １．０ ９．４ ２ ６ １６．５ ３ １１ ２３．６５ ４ １６ ３１．３５ ５ ２１ ３８．４５ ６ ２６ ４５．４５ ─────────────────────────────────── ｙ＝７．８９＋１．４５ｘ ｒ2 ＝１．００
【００８０】それぞれモノクローナル抗体５Ｅ１１およ
び３Ｄ６を産生するＤＡＤＨ １Ｅ１１およびＤＡＤＨ
１−３Ｄ６とめいめいされた細胞系は、ブタペスト協
定に基づき、１９９１年６月１８日に、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖ
ｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２８８５
２，ＵＳＡ）に寄託された。受付番号はそれぞれ、ＨＢ
１０７７６およびＨＢ１０７７７である。寄託はＳａｖ
ａ Ｃｏｍｐａｎｙによって行われたが、この会社は、
出願人、Ｓｙｎｔｅｘ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）Ｉｎｃ．の全額
出資の子会社であり、Ｓｙｎｔｅｘに代わって行われた
ものである。これらのマウスハイブリドーマＰ３Ｘ６３
−ＡＧ８．６５３×Ｂａｌｂ／Ｃ脾臓細胞系についての
詳細は上記例２を参照されたい。
び３Ｄ６を産生するＤＡＤＨ １Ｅ１１およびＤＡＤＨ
１−３Ｄ６とめいめいされた細胞系は、ブタペスト協
定に基づき、１９９１年６月１８日に、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖ
ｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２８８５
２，ＵＳＡ）に寄託された。受付番号はそれぞれ、ＨＢ
１０７７６およびＨＢ１０７７７である。寄託はＳａｖ
ａ Ｃｏｍｐａｎｙによって行われたが、この会社は、
出願人、Ｓｙｎｔｅｘ（Ｕ．Ｓ．Ａ．）Ｉｎｃ．の全額
出資の子会社であり、Ｓｙｎｔｅｘに代わって行われた
ものである。これらのマウスハイブリドーマＰ３Ｘ６３
−ＡＧ８．６５３×Ｂａｌｂ／Ｃ脾臓細胞系についての
詳細は上記例２を参照されたい。
【００８１】以上、本発明を、その明確化と理解のため
の例示および実施例によって詳細に説明したが、本発明
は、その請求の範囲内において、改変および修飾の実行
が可能なことは自明であろう。
の例示および実施例によって詳細に説明したが、本発明
は、その請求の範囲内において、改変および修飾の実行
が可能なことは自明であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 33/569 33/573 Ａ 33/573 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 アーサー シー．スウィチェンコ アメリカ合衆国カリフォルニア州サニー ベイル，ダブリュ．ニッカーボッカー ドライブ 1018 (72)発明者 メラニー ダブリュ．クォング アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ ジ ョラ，レジェンツ ロード 9118，アパ ートメント エィチ. (72)発明者 マン − イング ロウリー ウオング アメリカ合衆国カリフォルニア州フレモ ント，チャマ ウエイ 152 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/02 C12N 15/02 - 15/08 C12P 21/08 C12Q 1/04 C12Q 1/32 G01N 33/53 - 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (20)
- 【請求項１】 カンジダ属由来のＤ−アラビニトールデ
ヒドロゲナーゼ酵素であって、Ｄ−アラビニトールの酸
化を、他の天然に存在するポリオールの酸化に比べ、少
なくとも１０倍速い速度で触媒することは可能である
が、Ｄ−マンニトールの酸化を触媒することは実質的に
不可能であることを特徴とし、Ｄ−マンニトールを酸化
することができる他の酵素は実質的に含まない上記酵
素。 - 【請求項２】 Ｄ−アラビニトールの酸化を、他の天然
に存在するポリオールの酸化に比べ、少なくとも２０倍
速い速度で触媒することが可能である請求項１記載のＤ
−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素。 - 【請求項３】 (1) Ｄ−アラビニトールの含有が疑われ
るメジウム、および(2) Ｄ−アラビニトールの酸化を触
媒することは可能であるが、Ｄ−マンニトールの酸化を
触媒することは実質的に不可能な請求項１または２記載
のＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を混合し、
上記Ｄ−アラビニトールの酸化の結果として生成する生
成物を上記メジウムについて試験する各工程からなるＤ
−アラビニトールの測定方法。 - 【請求項４】 メジウムはＮＡＤ+ を含有し、酸化によ
って生成するＮＡＤＨの量を直接または間接的に検出す
ることによって試験される請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 宿主内のカンジダ属微生物の存在を検出
する方法において、宿主からのサンプルにつき、基質と
してＤ−アラビニトールを利用できるが基質としてＤ−
マンニトールは実質的に利用できない請求項１または２
記載のＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を用い
てＤ−アラビニトールの存在を調べる各工程からなる方
法。 - 【請求項６】 患者のカンジダ感染を検出する方法にお
いて、患者からのサンプルと、ＮＡＤ+ によるＤ−アラ
ビニトールの酸化は触媒できるが、Ｄ−マンニトールの
酸化を触媒することは実質的に不可能な請求項１または
２記載のＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素を混
合し、その混合物について、カンジダ感染の臨床的診断
の補助として使用できるＮＡＤＨの生成量を試験する各
工程からなる方法。 - 【請求項７】 (1) 基質としてＤ−アラビニトールを利
用できるが基質としてＤ−マンニトールは実質的に利用
できない請求項１または２記載のＤ−アラビニトールデ
ヒドロゲナーゼ酵素、および(2) ＮＡＤ+ からなるカン
ジダ属微生物を検出するための組成物。 - 【請求項８】 (1) Ｄ−マンニトールの酸化を触媒する
ことは実質的に不可能な請求項１または２記載のＤ−ア
ラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素プレパレーション、
および(2) ＮＡＤ+ の、パッケージした組み合わせから
なる、カンジダ属微生物を検出するためのキット。 - 【請求項９】 ジアホラーゼおよびそのジアホラーゼの
基質からなる請求項８記載のキット。 - 【請求項１０】 基質はレザズリンまたはｐ−ヨードニ
トロテトラゾリウムである請求項８または９記載のキッ
ト。 - 【請求項１１】 Ｄ−アラビニトールの酸化に特異的な
精製型の請求項１または２記載の酵素。 - 【請求項１２】 請求項１、２および１１のいずれか一
項に記載の酵素を特異的に認識するモノクローナル抗
体。 - 【請求項１３】 細胞系ＤＡＤＨ１−３Ｄ６（寄託番号
ＡＴＣＣ ＨＢ１０７７７）によって産生されるモノク
ローナル抗体３Ｄ６または細胞系ＤＡＤＨ１−５Ｅ１１
（寄託番号ＡＴＣＣ ＨＢ１０７７６）によって産生さ
れるモノクローナル抗体５Ｅ１１である請求項１２記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項１４】 少なくとも１種の請求項１３記載のモ
ノクローナル抗体に結合可能で、Ｄ−マンニトールを酸
化できる他の酵素を実質的に含まない請求項１または２
記載のＤ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ酵素。 - 【請求項１５】 (1) Ｄ−アラビニトールの含有が疑わ
れるメジウム、および(2) 少なくとも１種の請求項１３
記載のモノクローナル抗体に結合可能で、Ｄ−マンニト
ールの酸化を触媒できる他の酵素を実質的に含まない請
求項１または２記載のＤ−アラビニトールデヒドロゲナ
ーゼ酵素を混合し、Ｄ−アラビニトールの酸化生成物を
上記メジウムについて試験する各工程からなるＤ−アラ
ビニトールの測定方法。 - 【請求項１６】 微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃ
ａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅに由
来する請求項１、２、１１および１４のいずれか一項に
記載の酵素。 - 【請求項１７】 酵素は微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａ
ｅに由来する請求項３〜６および１５のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項１８】 酵素は微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａ
ｅに由来する請求項７記載の組成物。 - 【請求項１９】 酵素は微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａ
ｅに由来する請求項８〜１０のいずれか一項に記載のキ
ット。 - 【請求項２０】 酵素は微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａ
ｅに由来する請求項１２または１３記載のモノクローナ
ル抗体。
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