ES2343101T3

ES2343101T3 - Extractos de granada, productos nutricionales que los contienen y sus usos

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Publication number: ES2343101T3
Application number: ES08807007T
Authority: ES
Inventors: José A. López Más; Sergio A. Streitenberger; Marcos Peñalver Mellado; Yolanda Pedreño López; Pedro Martinez Ortiz
Original assignee: Probelte Pharma SA
Current assignee: Probelte Pharma SA
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2008-09-05
Publication date: 2013-07-15
Anticipated expiration: 2028-09-05
Also published as: EP2033526A1; WO2009031023A3; JP2010539077A; ES2343101T1; WO2009031023A2; EP2203070A2; EP2203070B1; US20100210586A1

Abstract

Uso de un extracto de granada que comprende punicalaginas, ácido elágico y azúcares, en el que la razón (% p/p) de punicalagina/ácido elágico está en el intervalo de 10/1 a 35/1, la razón (% p/p) de punicalagina/azúcares está dentro del intervalo de 10/1 a 50/1, el contenido de azúcares totales es del 2% (p/p) o menos y en el que dicho extracto tiene un contenido de punicalaginas de al menos el 30% (p/p), un contenido de ácido elágico del 2% (p/p) o menos, un contenido de fenoles totales de al menos el 30% (p/p), (expresado como equivalente de ácido gálico), una solubilidad en agua de al menos el 7% p/v (70 g por litro) y un contenido de disolventes orgánicos residuales inferior a 1 ppb para preparar un producto nutricional.

Description

Extractos de granada, productos nutricionales que los contienen y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención versa acerca del uso de extractos de granada que contienen elagitaninos para preparar

5 productos nutricionales que contienen estos extractos añadidos de granada y para el uso tanto de los extractos de granada como de los productos nutricionales funcionalizados con extractos de granada para la prevención o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (ECV), la acumulación de placa en las arterias, la hipertensión arterial y el sindrome metabólico. Según eso, se añade el extracto de granada derivado del fruto entero de la granada a bebidas y a productos alimentarios de uso humano y veterinario, lo que resulta en un aumento del nivel de antioxidantes, particulamnente de los elagitaninos y, más en particular, de las punicalaginas. Más en particular, la invención versa acerca de la funcional iza ció n o el refuerzo de productos nutricionales que han de ser usados como fuente de punicalaginas para la prevención o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (ECV), de la acumulación de placa en las arterias, de la hipertensión arterial y del sindrome metabólico, gracias al suministro nutricional de una composición rica en punicalaginas.

Según el suplemento publicado por la British Heart Foundation, European cardiovascular disease statistics, edición de 2005, las ECV son la principal causa de muerte en Europa, dando cuenta de 4,35 millones de fallecimientos cada año. La enfermedad coronaria (EC) por sí sola es la causa más común de muerte en Europa, dando cuenta de 1,95 millones de fallecímientos en Europa cada año.

Los costes totales de las ECV ascienden a 169.000 millones de euros, de los cuales 105.000 millones de euros son para tratar las ECV en la Unión Europea y 64.000 millones de euros se deben a la pérdida de productividad y al coste de la atención no profesional.

La acumulación de placa en las arterias, también denominada aterosclerosis, es la principal causa de ECV y la causa más frecuente de EC. La acumulación de placa aterosclerótica en las arterias es una afección común de las arterias. Ocurre cuando la grasa, el colesterol y otras sustancias se acumulan en las paredes de las arterias y

25 forman sustancias duras denominadas placa.

Al final, los depósitos de placa pueden estrechar la arteria y hacerla menos flexible. Esto dificulta el flujo de sangre. Si las arterias coronarias se estrechan, el flujo de sangre al corazón puede ralentizarse o detenerse, provocando dolor torácico (angina estable), respiración entrecortada, infarto y otros síntomas.

Pueden desprenderse trozos de placa y moverse por el torrente sanguíneo. Esta es una causa común de infarto y apoplejía. También pueden formarse coágulos sanguíneos en torno a los depósitos de placa. Los coágulos obstruyen el flujo sanguíneo. Si el coágulo entra en el corazón, los pulmones o el cerebro, puede causar una apoplejía, infarto o embolia pulmonar.

Se ha demostrado que la hipertensión arterial, los altos niveles de triglicéridos y el colesterol total en sangre y el consumo de tabaco son factores que contribuyen al desarrollo de esta afección. En años recientes los

35 investigadores han descubierto que algunos de estos factores de riesgo se acumulan en ciertas personas. Esta acumulación de factores de riesgo se denomina síndrome metabólico.

Las personas con síndrome metabólico tienen una acumulación de los siguientes factores de riesgo:

-: Obesidad central, lo que significa peso extra en la zona abdominal (estómago).

-

Problemas en la digestión de la glucosa (intolerancia a la glucosa). Los pacientes con síndrome metabólico suelen tener hiperinsulinemia o diabetes de tipo 2.

-: Altos niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) y triglicéridos en el torrente sanguíneo.

-

45 Bajos niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL) en el torrente sanguineo.

-: Alta presión sanguínea (hipertensión).

Aún hay mucho por aprender sobre el síndrome metabólico, pero los médicos saben que las personas con sindrome metabólico tienen un mayor riesgo de ECV.

Antecedentes de la invención

Numerosos estudios han demostrado que la oxidación in vivo de la LDL desempena un papel central en el desarrollo de la aterosclerosis (Knight, 1995; Witzum, 1994).

En estudios tanto de laboratorio como clínicos, la granada muestra resultados promisorios en la prevención de enfermedades cardiovasculares. Los científicos proporcionan evidencias de que los compuestos fitoquímicos de la granada actúan mediante varios mecanismos: inhibiendo la oxidación de la LDL y soportando la síntesis y la actividad del óxido nítrico (De Nigris y otros, Nitric Oxide. 2006), reduciendo el estrés oxidativo y la lesión 5 inflamatoria en los vasos sanguíneos (De Nigris y otros. Cardiovasc. Res. 2007; Rozenberg y otros. Atherosclerosis. 2006), disminuyendo la actividad de la enzima conversora de la angiotensina (Aviram y otros, Atherosclerosis. 2001). La evidencia cada vez mayor sugiere que los compuestos de la granada denominados punicalaginas son cardioprotectores gracias a sus potentes efectos antioxidantes y antiinflamatorios. M. Shiner y otros. Atherosclerosis 195, 2007, documentan los efectos de la estimulación de la paraoxonasa-2 por la punicalagina y el ácido gálico; se

10 demostró que la paraoxonasa-2 protege a los macrófagos del estrés oxidativo mediante un papel fisiológico aún desconocido.

Estudios adicionales han demostrado que el zumo de granada tiene más propiedades antioxidantes que cualquier otra bebida, como el zumo de arándano, el zumo de arándano rojo, té verde o vino tinto. Los anómeros a y de las punicalaginas son elagitaninos predominantes en el zumo de granada, y los principales responsables de las

15 propiedades antioxidantes del zumo. No obstante, la investigación señaló que la combinación de punicalaginas a y con otros compuestos fitoquímicos tales como el ácido elágico y sus derivados glicosilados y otros elagitaninos de granada minoritarios produce un importante efecto sinérgico que potencia los beneficios salutíferos del zumo.

Rapid large scale purification of ellagitannins from pomegranate husk, a by-product of the commercial juice industry

(Seeram y otros. Separation and Purification Technology 41 (2005) 49-55, enero de 2005) da a conocer un

20 procedimiento para aislar grandes cantidades de taninos de la granada integral (TGI) de la cáscara del fruto, que contiene altos niveles de punicalagina. El procedimiento usa agua y alcoholes de pocos átomos de carbono como eluyentes. Usando el procedimiento dado a conocer, la evaluación de TGI demostró que contiene el elagitanino (ET) fundamental de la cáscara del fruto, la punicalagina (80-85% p/p) , Y ácido elágico (AE; 1,3% p/p) Y diversas cantidades de compuestos adicionales, como la punicalina y glucósidos de AE (hexósido, ramnósido y pentósido).

25 El documento US 2006/21 1635, de los autores de la anterior publicación, da a conocer una enseñanza correspondiente.

Se halla una reseña de los estudios más recientes en Lansky y otros. Journal of Ethnophanmacology 109, 2007, 177

206. La reseña recalca el potencial de los materiales obtenidos de la granada, especialmente la fase oleosa de la semilla, para el tratamiento o la prevención del cáncer. Sin embargo, la reseña concluye afirmando que, aunque no son concluyentes, los estudios documentados sugerían más estudio, incluyendo ensayos clínicos de productos farmacéuticos debidamente diseñados.

Los anómeros a y de las punicalaginas están presentes fundamentalmente en la cáscara de la granada, y pasan al zumo primario durante el prensado para la extracción del zumo. Las punicalaginas a y tienen la fórmula siguiente:

Los estudios generaron varias solicitudes de patente.

El documento W002/056899 versa acerca de composiciones y procedimientos para reducir los oxiesteroles en la sangre y normalizar el colesterol y la presión sanguínea. Esta patente da a conocer composiciones que, preferentemente, comprenden: extracto de noni (Morinda e1trifolia), extracto de vino tinto, extracto de ciruela pasa, extracto de arándano, extracto de granada, extracto de manzana y una mezcla de enzimas. La patente reivindica un procedimiento para mantener o reducir los oxiesteroles en la sangre que comprende la etapa de administrar la

40 composición mencionada, comprendiendo dícho extracto de granada aproximadamente un 40% de ácido elágico y aproximadamente un 60% de polifenoles. Además, cuando el ácido elágico se administra oralmente, es absorbido deficientemente.

El documento US 2006/021 1635 da a conocer la purificación de elagitaninos de granada a partir de la cáscara del fruto, subproducto de la industria de zumos comerciales. Este proceso tiene los inconvenientes de requerir el uso, para la elución de elagitaninos adsorbidos en una superficie resinosa, de disolventes orgánicos, posiblemente tóxicos, como el metanol, y de generar un extracto que no contiene varios compuestos fitoquímicos presentes

5 exclusivamente en la fracción de zumo de la granada, cuando, de hecho, el zumo es el producto consumido por la gente, al que los estudios recientes atribuyen los beneficios salutiferos obtenibles de la granada.

El documento W02006/1 2783 da a conocer un procedimiento para producir un extracto de granada a partir de subproductos de la industria de los zumos. El proceso descrito incluye varios tratamientos térmicos en los que el extracto es sometido a calentamiento (2 h a 43-71°C y pasteurización). La pasteurización del zumo de granada produce ácido elágico libre a través de la degradación de elagitaninos más grandes, como las punicalaginas, lo que disminuye los beneficios para la salud de beber el zumo. Estas etapas generan varios subproductos que son dificiles de eliminar y, además, el uso de sólidos de granada procedentes de la industria de los zumos genera un extracto que no contiene algunos compuestos fitoquímicos presentes principalmente en la fracción de zumo de la granada. Por este motivo, el documento W02006/1 27832 da a conocer la combinación de extracto y zumo de granada, lo que

15 de hecho proporciona un amplio espectro de los compuestos fitoquimicos presentes en la granada integral, pero tiene la desventaja de su alto valor calórico debido a los azúcares presentes tanto en el zumo como en el extracto. Además, un alto contenido en azúcar dificulta el procesamiento industrial de tales extractos, porque la purificación de las punicalaginas es difícil y los extractos sólidos se pegan a las paredes de los equipos de secado. Las reivindicaciones de patente relacionadas con bebidas y productos alimenticios que comprenden extracto de granada están referidas a extractos preparados a partir de sólidos de granada seleccionados del grupo constituido por el pericarpio, la membrana interna y las semillas, pero no se referían a extractos preparados a partir de frutos de granada enteros.

La solicitud estadounidense 200701 78180 versa acerca de extractos de granada y procedimientos de uso de los mismos y, especialmente, acerca de procedimientos de uso de extractos de granada para provocar la regresión en lesiones debidas a la arteriosclerosis en seres humanos. Este documento presenta un estudio en seres humanos con 19 paCientes con estenosis de la arteria carótida (EAC). Diez de estos pacientes consumieron un vaso de zumo de granada todos los días durante 12 meses. Los autores del documento llegan a la conclusión de que los resultados del estudio en seres humanos demuestran efectos antiaterogénicos estadísticamente significativos del consumo de zumo de granada en pacientes con EAC. Tanto el zumo de granada usado como los extractos de granada preparados según la solicitud mencionada en lo que antecede se preparan sin ninguna etapa específica de purificación.

La solicitud estadounidense 20020012710 versa acerca de productos de granada útiles en la mejora de la salud. La patente reivindica un procedimiento para el uso del aceite de la semilla de la granada que comprende la administración del aceite de semilla de granada a un sujeto para ejercer un efecto en un proceso fisiológico. En tal

35 efecto se incluye un efecto antioxidante. Además, esta patente reivindica un procedimiento de retardo del proceso de aterosclerosis, que comprende la administración de zumo fermentado de granada a un paciente.

También se usó extracto de granada para proteger de la oxidación a bebidas que contenían leche ácida, según se expone en el documento EP 1 293 130; aquí, el extracto de granada se puede obtener por reflujo en agua, filtrado, tratamiento con carbón vegetal o a partir de agua/etanol. La concentración del extracto de granada en la bebida está en el intervalo de 10 ppm a 50 ppm. No hay indicación alguna de la composición del extracto.

Resumiendo, las técnicas mencionadas en lo que antecede proporcionan productos de granada que, a pesar de proporcionar beneficios a la salud, siguen siendo demasiado rudimentarios para ciertas aplicaciones tecnológicas de la industria de los alimentos y las bebidas funcionales, lo que supone algunas desventajas, como:

-: El consumo regular del zumo o de los extractos rudimentarios supone la ingesta de un gran valor calórico debido

45 a los azúcares presentes en ambos. Composition of pomegranatejuice (Seeram y otros. J. Nutr. 136:2481-2485, octubre de 2006). Una ración de zumo de granada (ZG) disponible para el consumo humano en la concentración natural (240 mL) contiene 34 g de azúcares, 35 g de hidratos de carbono totales, 30 mg de sodio, 430 mg de potasio, 0% de la CDR de vitamina C y vitamina A, 4% de calcio y 2% de hierro (Pom Wonderful). El ZG contiene los siguientes polifenoles: antocianinas, 387 mg/L; punicalaginas, 1561 mg/L; ácidos elágicos, 121 mg/L; y otros taninos hidrolizables, 417 mg/L.

-: El uso de disolventes orgánicos para obtener algunos de los extractos de granada mencionados en lo que antecede.

55 -La estandarización de algunos de los extractos de granada mencionados en lo que antecede está muy lejos del perfil natural de los compuestos fitoquímicos (por ejemplo, los elagitaninos) que existen en el zumo natural de granada obtenido procesando el fruto integral de la granada. Por ejemplo, algunos extractos se han estandarizado en un 40% de ácido elágico en vez de a las punicalaginas, en comparación con el zumo de granada más destacado disponible comercialmente, que contiene normalmente menos del 0,1% de ácido elágico y aproximadamente un 0,2% de punicalaginas.

-: Tales productos no son completamente hidrosolubles, especialmente los extractos enriquecidos en ácido elágico, lo que significa que su incorporación en bebidas producirá turbidez, haciendo el producto menos atractivo para los consumidores.

-: El ácido elágico es absorbido deficientemente cuando se administra oralmente.

Además, el contenido de punicalaginas no está estandarizado en la mayoria de los productos de granada mencionados en lo que antecede.

Resumen de la invención

Es un objetivo de la presente invención resolver los problemas mencionados en lo que antecede y proporcionar extractos de granada y productos nutricionales que contengan dichos extractos, conteniendo los extractos elagitaninos y teniendo una composición tal que imparta al alimento en el que se incorporen los efectos benéficos requeridos para la salud con el consumo del alimento.

Tal objetivo se logra mediante la presente invención, que versa acerca del uso de extractos de granada según la reivindicación 1 y acerca de alimentos y bebidas funcionales con extractos de granada según la reivindicación 4.

Los extractos adecuados para preparar productos nutricionales son extractos de granada que comprenden punicalaginas, ácido elágico y azúcares, en los que la razón (% p/p) de punicalagina/ácido elágico está en el intervalo de 10/1 a 35/1 , la razón (% p/p) de punicalagina/azúcares está dentro del intervalo de 10/1 a 50/1, el contenido de azúcares totales es del 2% (p/p) o menos y también tienen un contenido de fenoles totales de al menos el 30% p/p (expresado en equivalentes de ácido gálico) y una hidrosolubilidad de al menos un 7% p/v (30 g por litro).

Preferentemente, un extracto de granada adecuado tendrá un contenido de punicalaginas de al menos el 30% p/p, un contenido de ácido elágico del 2% (p/p) o menos, un contenido de fenoles totales de al menos el 30% p/p (expresado en equivalentes de ácido gálico), una hidrosolubilidad de al menos un 7% p/v (70 g por litro), un contenido de azúcar total del 2% (p/p) o menos y un contenido residual de disolventes orgánicos inferior a 1 ppb.

Más preferentemente, el extracto tendrá una hidrosolubilidad de al menos el 10% p/v (100 g por litro) y un contenido de azúcar total de no más del 1 % (p/p).

Dicho extracto de granada puede comprender una fibra soluble que tenga un contenido de beta-glucano (base seca) de al menos el 30%. Dicha fibra se selecciona, preferentemente, entre fibra soluble de avena rica en beta-glucano, fibra soluble de cebada rica en beta-glucano o sus mezclas.

Se encontró que los extractos dados a conocer en lo que antecede son excepcionalmente adecuados para ser usados para mantener niveles normales o reducir hasta niveles normales tanto la concentración de los constituyentes del colesterol en la sangre como la presión sanguínea arterial y, más en general, para proporcionar las propiedades y los efectos benéficos mencionados en los estudios y las solicitudes de patente expuestos en lo que antecede, evitando alteraciones desagradables de las propiedades de los alimentos reforzados, como la turbidez de las bebidas reforzadas y el aumento del contenido calórico. Además, la ausencia incluso de trazas de disolventes orgánicos en los extractos de la invención es ventajosa tanto desde el punto de vista económico como en el de la salud cuando se la compara con otros extractos de granada que contienen disolventes residuales.

Los extractos mencionados en lo que antecede son obtenibles por medio del procedimiento dado a conocer en las solicitudes de patente EP07004765.9 y EP08004242.7, en tramitación como la presente. El procedimiento dado a conocer y reivindicado en las mismas comprende las etapas de llevar a cabo una extracción de los frutos enteros licuados en agua a una temperatura en el intervalo de 4°C a 30°C, preferentemente de 8°C a 25°C, y con un pH en el intervalo de 3,5 a 5,0. La extracción se lleva a cabo en un molino y la duración de dicha etapa de extracción está en el intervalo de 15 a 150 minutos. La mezcla de extracción es tratada a continuación para eliminar los sólidos y obtener una solución acuosa aclarada que se carga en una columna cromatográfica de una resina no iónica adsorbente; los productos retenidos en la columna cromatográfica son eluidos cambiando el pH con una solución básica y desplazando los productos con agua des mineralizada. Preferentemente, dicho cambio del pH se lleva a cabo con una solución tampón de elución de bicarbonato de sodio.

El producto liquido eluido de la resina se concentra, preferentemente, mediante nanofiltración y se elimina el agua hasta que el producto tenga una forma sólida. Por medio de este procedimiento es posible obtener un producto con muy bajo contenido de azúcar. Tal producto no es conocido en la técnica, según la exposición previa de la técnica anterior. Aún según la patente EP08004242.7, en tramitación como la presente, en una realización, los extractos de granada de la invención se concentran y se secan en presencia de fibras solubles, especialmente fibras solubles de avena y cebada ricas en beta-glucano. Estas fibras solubles actúan como vehículo y se proporcionan en una cantidad preferente de al menos un 30%. Preferentemente, las fibras solubles tienen un contenido de beta-glucano (base seca) de al menos un 30% y en un intervalo del 30% al 60%. La presente solicitud reivindica prioridad con respecto al documento EP08004242.7 para esta caracteristica y las caracteristicas no enumeradas en la solicitud anterior EP07004765.9.

El procedimiento de producción de tales extractos naturales de granada libres de disolventes, expuesto en las solicitudes de patente EP070047565.9 y EP08004242.7, en tramitación como la presente, es simple, efectivo y no resulta caro, proporcionando tanto punicalaginas hidrosolubles, en vez de ácido elágico soluble en disolventes, y un amplio espectro de diferentes productos químicos orgánicos naturales que están presentes en el fruto completo de la granada y útiles para mejorar la actividad de los compuestos principales del extracto.

Un aspecto de la invención está relacionado con los productos nutricionales obtenidos de alimentos (incluyendo bebidas) mediante la adición de dicho extracto de granada, posiblemente combinado con fibras solubles de calidad alimenticia. Estos productos se obtienen incorporando y mezclando el extracto de granada con el producto alimentario que ha de ser funcional izado. Un aspecto adicional de la invención está relacionado con los usos del extracto según las reivindicaciones 11 y 12.

Otro aspecto de la invención está relacionado con el uso de los productos nutricionales, los alimentos y las bebidas funcionales para la prevención o el tratamiento de uno o más estados seleccionados entre enfermedades cardiovasculares (ECV), acumulación de placa en las arterias, hipertensión arterial y síndrome metabólico.

Las composiciones de extractos naturales de granada adecuadas para los usos de la invención se resumen en el párrafo siguiente para una mejor comprensión de la presente invención.

Las composiciones obtenibles a partir de las solicitudes mencionadas en lo que antecede son productos en forma líquida o sólida que contienen elagitaninos y caracterizados por tener las siguientes características:

-: un contenido de punicalaginas (en % p/p) no inferior al 30%,

un contenido de ácido elágico (ácido libre) (en % p/p) no superior al 2%,

-: un contenido de fenoles totales (como % plp, equivalentes de ácido gálico) no inferior al 30%,

-: una hidrosolubilidad (en % p/v) no inferior a17% y, más preferentemente, no inferior al 10%,

-: un contenido residual de disolventes orgánicos que no es detectable o, en cualquier caso, es inferior a 1 ppb (es decir, el extracto está libre de disolventes orgánicos),

un contenido de azúcar total no superior al 2% (p/p) y, preferentemente, no superior al 1 % (p/p),

-: un contenido de otros taninos hidrolizables no inferior al 8% (p/p),

-: un contenido de antocianinas del 0,3% (p/p) o inferior, preferentemente del 0,2% o inferior.

En estas composiciones, la razón (% p/p) de punicalaginalácido elágico está en el intervalo de 1011 a 35/1, preferentemente de 20/1 a 35/1 , Y la razón (% p/p) de punicalaginalazúcares de la fruta está dentro del intervalo de 10/1 a 50/1, preferentemente de 30/1 a 50/1. De hecho, los extractos casi no contienen azúcares (en el extracto solo hay presente un 0,06% de los azúcares originales) ni antocianinas (solo un 0,96% de las antocianinas presentes originalmente) en comparación con el zumo de granada. Por contenido de azúcar total se quiere decir los azúcares derivados del zumo de granada; principalmente "azúcares de fruta", es decir, glucosa, fructosa. Las cantidades se determinan, por ejemplo, mediante HPLC.

La composición típica del extracto de granada y de la composición relevante de zumo requeridos para administrar la misma cantidad de punicalaginas que 1 vaso (es decir, una ración o 240 mL de zumo de granada, es decir ZG) se resume en la tabla siguiente. La columna 2 da la composición de la cantidad de extracto de granada que se requiere para proporcionar 374,6 ppm de punicalaginas, correspondiente a la cantidad de punicalaginas presentes en una ración (240 mi) de zumo de granada (ZG).

La columna 3 muestra, para cada compuesto, el porcentaje de la cantidad aún presente en el extracto con respecto al ZG original; en otras palabras, muestra que se recupera el 100% de las punicalaginas y que en el extracto hay presente un 0,06% de los azúcares originalmente presentes en el zumo. Según se ha mencionado, en el extracto hay presente menos del 0,3%, habitualmente menos del 0,2%, de las antocianinas originalmente presentes. Los datos de la composición media del zumo de granada se dan a conocer anteriormente en la página 6 de la presente solicitud.

TABLA A T abla d e Las anteriores cantidades fueron obtenidas por análisis de muestras del extracto de granada para determinar antocianinas (procedimiento espectrofotométrico), punicalaginas, ácido elágico y otros taninos hidrolizables (procedimiento de HPLC), azúcares (procedimiento de HPLC) y disolventes orgánicos (procedimiento de GC).

Extracto de granada: Composición de una cantidad de extracto de granada equivalente a 240mL deZG Composición relativa del compuesto en el extracto/zumo

Cantidad, %: Cantidad,
Cantidad, %

antocianinas: 0,05 a 0,20 0,9 0,96

30,0 a 60,0: 374,6 100

Extracto de granada Cantidad, %: Composición de una cantidad de extracto de granada equivalente a 240mLde ZG Cantidad, Composición relativa del compuesto en el extracto/zumo Cantidad, %

ácido: 0,5 a 5,0 21,4 73,72

otros taninos hidrolizables: 8,0 a 15,0 107,0 106,95

azúcares: < 3,0 20,0 0,06

disolventes: no detectables no detectables -

Según se ha mencionado previamente, se encontró con sorpresa que, usando extractos de granada que siguen las

5 razones mencionadas en lo que antecede, es posible reforzar productos alimentarios (incluyendo bebidas) sin poner en peligro las propiedades organolépticas de los productos alimentarios y es posible, a la vez, impartir al alimento reforzado (es decir, al producto nutricional) los requeridos efectos benéficos para la salud.

Este resultado también es sorprendente porque, según se ha mencionado en lo que antecede, en el extracto hay muy pocas antocianinas debido a su pérdida en la extracción.

10 Por lo tanto, en los productos nutricionales objeto de la invención la razón (% p/p) de punicalaginaiácido elágico está en el intervalo de 10/1 a 35/1 , preferentemente de 20/1 a 35/1, Y la razón (% p/p) de punicalagina/azúcares de granada añadidos está en el intervalo de 10/1 a 50/1 , preferentemente de 30/1 a 50/1 . En particular, debería hacerse notar que la razón de punicalagina en relación con la fructosa en el extracto Y, en consecuencia, en los productos alimentarios según la invención (por ejemplo, los que están inicialmente libres de fructosa) está en el intervalo de

15 20/1 a 100/1, preferentemente de 60/1 a 100/1.

Un aspecto ventajoso adicional es que los extractos de granada de la invención se combinan con fibras solubles de calidad alimentaria, especialmente con fibras solubles de avena y cebada ricos en beta-glucano. Estas fibras solubles pOdrían actuar como vehículo usado para el proceso de secado o simplemente ser mezcladas con el extracto de granada obtenido secando sin ningún vehículo añadido, y se proporcionan en una cantidad preferente de

20 al menos el 30%. Preferentemente, las fibras solubles tienen un contenido de beta-glucano (base seca) de al menos el 30% y en el intervalo del 30% al 60%.

Usando extractos naturales según las solicitudes de patente EP07004765.9 y EP08004242.7 se evita cualquier traza de disolventes orgánicos en el producto final, así como el alto valor calórico debido a los azúcares presentes en otros productos de granada, especialmente teniendo en cuenta su uso para la prevención o el tratamiento de

25 enfermedades cardiovasculares (ECV), de la acumulación de placa en las arterias, de la hipertensión arterial y del síndrome metabólico.

El procedimiento de la invención de preparación de un alimento nutricional (o reforzado) (aquí la palabra alimento incluye bebidas) con extracto de granada, opcionalmente con fibra soluble, comprende las etapas de incorporar y mezclar el extracto de granada, combinado o no con fibras solubles, con el producto alimentario para obtener lo que

30 se denominado producto nutricional funcional o funcional izado. La adición del extracto de granada al producto nutricional es obtiene por mezcla y homogeneización según el procedimiento tecnológico de fabricación de cada producto nutricional que será funcional izado.

La funcionalización (es decir, el refuerzo) de productos alimentarios sólidos para el consumo humano o animal comprende la etapa de añadir extracto de granada, combinado o no con fibras solubles, habitualmente lo antes

35 posible, en el procedimiento de fabricación para facilitar su incorporación y su distribución homogénea, con independencia de si los ingredientes están mezclados de antemano con otros ingredientes secos o dispersos en agua, según la técnica conocida.

La funcionalización (refuerzo) de bebidas comprende la etapa de incorporar y disolver el extracto de granada, combinado o no con fibra soluble, durante las etapas técnicas de preparación de la bebida. De forma general, se añaden a la bebida polvo de extracto de granada y, opcionalmente, fibra soluble y componentes hidrófilos adicionales, en la razón deseada en peso, y se disuelve completamente, con parámetros de temperatura y agitación muy controlados. Esta etapa se lleva a cabo, preferentemente, antes de la pasteurización de la bebida o de que se añadan ácidos alimentarios y/o conservantes alimentarios, para evitar su deterioro.

En el contexto de la presente invención, con la expresión "producto nutricional" se entiende cualquier producto 45 alimentario (incluyendo bebidas, sal, azúcar y condimentos) para el consumo humano o animal que incorpore una cantidad de un extracto de granada.

Según la presente invención, en el producto nutricional, es decir, el producto alimentario que incluye el extracto de granada, la razón (% P/P) de punicalagina/ácido elágico está en el intervalo de 10/1 a 35/1 , preferentemente de 20/1 a 35/1 , Y la razón (% p/p) de punicalagina/azúcares de fruta añadidos está en el intervalo de 10/1 a 50/1 , preferentemente de 30/1 a 50/1 . Preferentemente, los productos nutricionales de la invención comprenden una concentración del extracto de granada de la invención equivalente a un contenido de punicalaginas que oscila entre 0,005% y 5% (p/p). Más generalmente, el producto nutricional de la invención comprende una cantidad de extracto

5 de granada según se ha definido en lo que antecede que resulte en una ingesta por parte del consumidor de al menos 10 mg de punicalaginas por día; en otras palabras, el producto nutricional proporcionará al menos 5 mg de punicalaginas por ración.

En el contexto de la presente invención, se entiende que la expresión "ración" significa:

-: una dosis; es decir, una cantidad individual de comida o bebida tomada como parte de una comida, o 10 -para un alimento, la cantidad que sería probable que una persona o un animal comiera durante una comida.

El que antecede es el significado estándar usado cuando se evalúa, por ejemplo, el contenido calórico de un alimento y también se denomina "medida común". Puede encontrarse una lista de raciones o de medidas comunes, por ejemplo, en "USDA National Nutrient Database Ior Standard Reference, Release 20, Nutrient List", disponible en

15 el sitio web del Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola, Datos de nutrientes.

Un intervalo preferente comprende una cantidad de extracto equivalente a un contenido de punicalaginas en el producto nutricional que oscina entre el 0,01 y el 0,1% (p/p).

Los productos nutricionales que contienen esta cantidad de extracto de granada añadido pueden ser: bebidas con

20 sabor a fruta, bebidas con sabor a naranja, bebidas con sabor a limón-lima, zarzaparrilla, cola, zumos de fruta, bebidas con sabor a fruta o con contenido de fruta, jugo de legumbres y hortalizas o bebidas que contienen hortalizas, bebidas para deportistas, bebidas energéticas, agua aromatizada, bebidas que comprenden un componente lácteo, leche, batidos de leche, leche fermentada, leche aromatizada, horchata, cerveza, refresco espumoso de tipo cerveza, vino, refresco de tipo vino, café, bebidas a base de café, té, bebidas a base de té,

infusiones, por mencionar algunos, derivados tecnológicamente modificados de las bebidas recién mencionadas o mezclas de dos o más de las mismas.

Otra intervalo preferente comprende una cantidad de extracto equivalente a un contenido de punicalaginas que oscila entre el 0,02% y el 0,20% (p/p). Productos nutricionales que contienen esta cantidad de extracto de granada añadido pueden ser:

30 -productos lácteos como yogures, helados, quesos;

-: aceites vegetales, marinos o de pescado obtenidos de diversas fuentes, como la aceituna (aceite de oliva virgen

extra, aceite de oliva virgen, aceite de oliva lampante, aceite de oliva refinado, aceite de orujo de oliva crudo, aceite

de orujo de oliva refinado), el girasol, el maíz, la soja, la linaza, la almendra, la canola, el cártamo, la palma, el

35 cacahuete, la colza, algas, kril, el sábalo, la anchoa, el atún;

-: un producto cárnico o avícola, tal como pollo, pavo, pato, cerdo, ternera, preparado como salchichas, ahumado o en fiambre, como jamón curado, jamón cocido, jamón ahumado, mortadela, salchichón, paté, carnes precocinadas en conserva;

40 -un producto de panadería o un producto a base de pasta, como panes, roscas de pan, bizcochos, galletas, pasteles, pastas, tartas, macarrones, espagueti;

-: una conserva de verduras o fruta, como tomates en conserva, alcachofas en conserva, piña en conserva,

melocotón en conserva, confituras, mermeladas, jaleas, encurtidos;

-un marisco en conserva o pescado en conserva, como gambas, langosta, calamar, cangrejo, mejillón, berberecho, atún, sardina; -un tentempié o un dulce, como almendras, cacahuetes, pistachos, nueces, palomitas, bombones, chicles,

por nombrar algunos, derivados tecnológicamente modificados de los productos alimentarios recién mencionados o mezclas de dos o más de los mismos.

Otro intervalo preferente comprende una cantidad de extracto equivalentes a un contenido de punicalaginas que

55 oscina entre 0,025% y 0,25% (p/p). Los productos nutricionales que contienen esta cantidad de extracto de granada añadida pueden ser: comida para mascotas, como alimentos húmedos en lata, alimentos secos para mascotas, alimentos semihúmedos, tentempiés, por nombrar algunos, derivados tecnológicamente modificados de los alimentos recién mencionados para mascotas o mezclas de dos o más de los mismos.

El gusto, el aroma y, en general, las propiedades organolépticas del alimento no se ven modificados por la adición del extracto según la presente invención.

Según la invención, el extracto también se añade a la sal en una cantidad del 0,5% al 5% (en peso) y al azúcar (preferentemente con fibras solubles) en una cantidad deO 0,2% al 2% (en peso). El bajo contenido en azúcares del

5 extracto según la invención vuelve particularmente atrayente añadir el extracto a condimentos (por ejemplo, vinagre balsámico), sal, azúcar y edulcorantes (por ejemplo, aspartamo), no siendo modificado su sabor sustancialmente por el extracto.

Por último, un tercer aspecto de la invención está relacionado con el uso de los productos nutricionales de la invención, funcionalizados con extracto de granada combinado o no con fibra soluble, para la prevención o el

10 tratamiento de enfermedades cardiovasculares (ECV), acumulación de placa en las arterias, hipertensión y síndrome metabólico. La ingesta de alimentos y bebidas funcionalizados con extracto de granada combinado o no con fibra soluble es preferible según un régimen predeterminado, que preferentemente sería de 2-3 raciones diarias, y puede durar un periodo de tiempo prolongado como tratamiento crónico, y podría durar un año o más, incluyendo toda la vida del consumidor.

15 Según la invención, la dosis diaria recomendada de un producto nutricional funcional que contenga la cantidad del extracto de granada de la presente invención, combinado o no con fibra soluble, debe aportarse en cantidad suficiente para lograr el propósito deseado, cuando el consumidor tome 2-3 raciones por día según un régimen predeterminado. En una realización, las punicalaginas están presentes en la composición del producto nutricional funcional en una cantidad en el intervalo de 5 mg a 5000 mg por ración, preferentemente 15 a 500 mg y más,

20 preferentemente de 40 mg a 200 mg por ración.

Según otra realización preferente de la presente invención, el producto nutricional reforzado, es decir, funcionalizado contiene los extractos mencionados en lo que antecede e hidroxitirosol. Preferentemente, el hidroxitirosol se obtiene por extracción según las solicitudes de patente, en tramitación como la presente, EP-A-07001791, presentada el

26.01.2007, y PCT/IB2008/000173, presentada el 28.01.2008 en nombre del presente solicitante.

25 Breve descripción de los dibujos

La invención será dada a conocer ahora con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes adjuntos y a los dibujos, en los que:

-: Las Figuras 1-3 son gráficos que muestran la correlación lineal entre la capacidad antioxidante de diferentes productos nutricionales obtenidos según la presente invención (véanse los Ejemplos 1 a 5) y su contenido en 30 punicalaginas medido por HPLC como consecuencia de su refuerzo con cantidades crecientes de extractos de granada obtenidos según la presente invención.

-: La Figura 4 es un gráfico que muestra el efecto del extracto de granada en el índice aterogénico de la rata (colesterol total/colesterol HDL).

-: La Figura 5 es un gráfico que muestra el efecto del extracto de granada en la presión sanguínea sistólica de la rata.

-: La Figura 6 es un gráfico que muestra los efectos de la administración del extracto de granada en combinación 40 con fibra soluble según la presente invención en el indice aterogénico de la rata (colesterol total/colesterol HDL).

-: La Figura 7 es un gráfico que muestra el efecto del extracto de granada en combinación con fibra soluble en el peso corporal (PC) de la rata. Las Figuras 6 y 7 están relacionadas con los Ejemplos 8a y 8b, respectivamente, en los que los grupos de animales 45 se organizaron según la Tabla 4 mostrada en el Ejemplo 8a. Descripción de las realizaciones preferentes Ejemplo 1

Preparación de un zumo de naranja funcional con extracto de granada

Se preparó el producto, a partir de un zumo de naranja concentrado, mediante la adición de agua e ingredientes

hidros olu bies. Luego se añadió y se mezcló extracto de granada y se pasteurizó y se homogenizó el producto resultante. Por último, se enfrió y se envasó el producto. También se sigue el mismo procedimiento cuando se usan otros ingredientes como ácido ascórbico, ácido cítrico y similares.

El contenido del extracto de granada oscila entre 200 y 1000 mg/kg (teniendo tal extracto de granada un contenido de punicalaginas del 50% p/p). La medición de la capacidad antioxidante se llevó a cabo como sigue.

Se prepararon seis botellas de zumo de naranja según lo anterior que comprendían una cantidad de O, 200, 400, 600, 800 Y 1000 ppm de extracto de granada, respectivamente (tal como extracto de granada que tenía un contenido de punicalaginas del 50% p/p). Se usaron 40 gramos de muestras de zumo de naranja para medir la capacidad antioxidante (capacidad de absorción del radical ABTS medida a 734 nm usando Trolox como estándar) y el

5 contenido en punicalaginas por HPLC. Cuando se trazaron los resultados (véase la Figura 1, trazo a) como la capacidad antioxidante en función de la concentración de punicalaginas, se obtuvo una correlación lineal. La capacidad antioxidante del zumo no funcionalizado fue de 1,39 mM equivalentes de Trolox por gramo, y la capacidad antioxidante del zumo funcional izado con el mayor peso proporcional usado en este ejemplo fue de 3,13 mM equivalentes de Trolox por gramo, lo que significa que se obtuvo un aumento de 2,3 veces en la capacidad antioxidante del zumo.

Ejemplo 2

Preparación de un producto lácteo funcional con extracto de granada

Se añadió extracto de granada a leche liquida de vaca y se homogeneizó en ausencia de oxígeno. El producto lácteo resultante fue sometido entonces a tratamiento UHT (150°C de 4 a 6 segundos) y, por último, fue envasado 15 en ausencia de oxígeno.

El contenido del extracto de granada oscila entre 200 y 1000 mg/kg (teniendo tal extracto de granada un contenido de punicalaginas del 50% p/p).

La medición de la capacidad antioxidante se llevó a cabo como sigue.

Se prepararon seis botellas de leche según lo anterior que comprendian una cantidad de O, 200, 400, 600, 800 Y 1000 ppm de extracto de granada, respectivamente (tal como extracto de granada que tenía un contenido de punicalaginas del 50% p/p). Se usaron 40 gramos de muestras de leche para medir la capaCidad antioxidante (capacidad de absorción del radical ABTS medida a 734 nm usando Trolox como estándar) y el contenido en punicalaginas por HPLC. Cuando se trazaron los resultados (véase la Figura 1, trazo b) como la capacidad antioxidante en función de la concentración de punicalaginas, se obtuvo una correlación lineal. La capacidad

25 antioxidante de la leche no funcionalizada fue de O mM equivalentes de Trolox por gramo, y la capacidad antioxidante del producto lácteo funcionalizado con el mayor peso proporcional usado en este ejemplo fue de 2,97 mM equivalentes de Trolox por gramo.

Ejemplo 3

Preparación de un jamón cocido funcional con extracto de granada

Se mezcla previamente extracto de granada con la mezcla de ingredientes industriales (sal, jarabe de glucosa, azúcar, varios aditivos alimentarios) y la mezcla se incorpora en la solución del escabeche. Inmediatamente después, se hace pasar la solución del escabeche por agujeros al interior de la pieza de jamón. Se realizan varios masajes, al vacío y a una temperatura inferior a 10°C, a la pieza de jamón. A continuación, se macera la pieza de jamón a 4-6°C durante al menos 48 h. Después de eso, la pieza vuelve a ser masajeada y es envasada al vacío en

35 una bolsa de cocción que se coloca en un molde. La pieza de jamón se cuece entonces en un horno de vapor hasta que la temperatura en el centro de la pieza alcanza 65°C. Inmediatamente después, la pieza de jamón cocido es enfriada y almacenada a 5°C. Por último, después de 24 h, se retira el molde.

El contenido del extracto de granada oscila entre 400 y 4000 mg/kg (teniendo tal extracto de granada un contenido de punicalaginas del 50% p/p).

La medición de la capacidad antioxidante se llevó a cabo como sigue.

Se prepararon seis jamones cocidos según lo anterior que comprendían una cantidad de 0, 400, 1000, 2000, 3000 Y 4000 ppm de extracto de granada, respectivamente (tal como extracto de granada que tenía un contenido de punicalaginas del 50% p/p). Se usaron 3 gramos de muestras de cada jamón cocido para medir la capacidad antioxidante (capacidad de absorción del radical ABTS medida a 734 nm usando Trolox como estándar) y el contenido en punicalaginas por HPLC. Cuando se trazaron los resultados (véase la Figura 2, trazo a) como la capacidad antioxidante en función de la concentración de punicalaginas, se obtuvo una correlación lineal. Concretamente, la capaCidad antioxidante del jamón cocino no funcionalizado fue de 0,1 1 mM equivalentes de Trolox por gramo, y la capacidad antioxidante del jamón cocido con el mayor peso proporcional usado en este ejemplo fue de 9,93 mM equivalentes de Trolox por gramo, lo que significa que se obtuvo un aumento de 90,3 veces en la capacidad antioxidante del jamón cocido.

Ejemplo 4

Preparación de una con selVa funcional de atún con extracto de granada Se añade el extracto de granada tan pronto como resulte posible en el proceso de producción para facilitar su incorporación y su distribución homogénea, con independencia de si los ingredientes están mezclados de antemano con otros ingredientes seCOs o dispersos en agua, según la técnica conocida.

La medición de la capacidad antioxidante se llevó a cabo como sigue.

Se prepararon seis latas de atún según lo anterior que comprendian una cantidad de O, 400, 1000, 2000, 3000 Y 4000 ppm de extracto de granada, respectivamente (tal como extracto de granada que tenia un contenido de punicalaginas del 50% p/p). Se usaron 3 gramos de muestras de cada atún para medir la capacidad antioxidante (capacidad de absorción del radical ABTS medida a 734 nm usando Trolox como estándar) y el contenido en punicalaginas por HPLC. Cuando se trazaron los resultados (véase la Figura 2, trazo b) como la capacidad antioxidante en función de la concentración de punicalaginas, se obtuvo una correlación lineal. Concretamente, la capacidad antioxidante del atún en conserva no funcionalizada fue de O mM equivalentes de Trolox por gramo, y la capacidad antioxidante del atún en conserva con el mayor peso proporcional usado en este ejemplo fue de 5,54 mM equivalentes de Trolox por gramo.

Ejemplo 5

Preparación de un alimento canino semihúrnedo con extracto de granada

Se añade el extracto de granada tan pronto como resulte posible en el proceso de producción para facilitar su incorporación y su distribución homogénea. con independencia de si los ingredientes están mezclados de antemano con otros ingredientes secos o dispersos en agua, según la técnica conocida.

El contenido del extracto de granada oscila entre 400 y 5000 mg/kg (teniendo tal extracto de granada un contenido de punicalaginas del 50% p/p).

La medición de la capacidad antioxidante se llevó a cabo como sigue.

Se prepararon seis latas de comida semi húmeda para perros según lo anterior que comprendían una cantidad de 0, 433, 1000, 1600, 4000 Y 5000 ppm de extracto de granada, respectivamente (tal como extracto de granada que tenia un contenido de punicalaginas del 50% p/p). Se usaron 3 gramos de muestras de cada alimento semihúmedo para perros para medir la capacidad antioxidante (capacidad de absorción del radical ABTS medida a 734 nm usando Trolox como estándar) y el contenido en punicalaginas por HPLC. Cuando se trazaron los resultados (véase la Figura 3) como la capacidad antioxidante en función de la concentración de punicalaginas, se obtuvo una correlación lineal. Concretamente, la capacidad antioxidante del alimento canino no funcional izado fue de 0,02 mM equivalentes de Trolox por gramo, y la capacidad antioxidante del alimento canino con el mayor peso proporcional usado en este ejemplo fue de 6,95 mM equivalentes de Trolox por gramo, lo que significa que se obtuvo un aumento de 347,5 veces en la capacidad antioxidante del alimento canino.

Ejemplo 6 (Fig. 4)

Uso del extracto de granada en la prevención o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares

6.1. Anima/es

Se obtuvieron cuarenta ratas Sprague Dawley macho (peso aproximado de 150-180 g) en Harlan Interfauna Ibérica, SA (Barcelona, España) y se mantuvieron durante todo el experimento en las instalaciones del servicio del animalario de la Universidad de Murcia. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 5 grupos experimentales de 8 ratas cada uno, y cada subgrupo de 4 ratas fue alojado con condiciones estándar de iluminación (ciclos diurnos/nocturnos de 12 h), temperatura (22±2°C) y humedad (60%).

6.2. Dietas

Las dietas usadas en el estudio fueron las siguientes:

•: DIETA DE CONTROL (C): dieta sólida estándar para ratas (Panlab).

•: DIETA ATEROGÉNICA (A): 95,5% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab), 1,5% de colesterol (Aldrich) y 3% de manteca para inducir aterosclerosis.

•: DIETA ATEROGÉNICA + EXTRACTO DE GRANADA (P): 95% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab), 1,5% de colesterol (Aldrich), 3% de manteca Y 0,5% de extracto de granada (contenido de punicalaginas: 50% p/p).

•: ESTANDAR + ALIMENTACiÓN POR SONDA ORAL (160 mg de punicalaginas/kg) (G160): dieta estándar para ratas (Panlab). Además, se administraron diariamente, por sonda oral, 160 miligramos de punicalaginas/kg de peso corporal en agua.

Habia disponible ad libitum agua potable y alimento. No obstante, en todo el estudio, se estandarizó un suministro

5 diario por animal de 15 g/dia (la ingesta real por animal era desconocida). Además, se administraron diariamente, por sonda oral, 160 miligramos de punicalaginaslkg de peso corporal en agua al grupo animal que recibia la dieta G160. Para evitar la oxidación de las grasas, la dieta aterogénica (A) y la dieta aterogénica + el extracto de granada

(P) se mantuvieron a 4°C en la oscuridad hasta su uso, y se eliminaba la dieta no consumida del dia anterior. Se midió por HPLC la concentración de punicalaginas en las dietas P y G160 usadas en el estudio.

10 6.3. Diseño del experimento

La Tabla 1, a continuación, muestra el diseño del experimento:

Tabla 1

GRUPO: Del dia 1 al 30 Del dia 31 al 60 Observaciones

1: C C

2: A A

3: A C

4: P P

5: A Dieta estándar + G160 Se administraron diariamente, por sonda oral, 160 mg de de PC en

Los grupos de animales CC, AA, AC, PP, AG160 fueron alimentados durante 2 meses con las dietas C, A o P (grupos CC, AA o PP, respectivamente) o durante 1 mes con la dieta A seguido por un mes más con la dieta C

15 (grupo AC), o con dieta estándar para rata con alimentación oral por sonda de 160 mg de punicalaginas/kg de peso corporal (grupo AG160). Al final del experimento, los animales, en ayunas, fueron anestesiados e, inmediatamente después de la eutanasia, se realizó una punción intracardiaca para recoger sangre en tubos y se añadió un 3,8% de citrato de sodio a cada tubo. Se separó el plasma por centrifugación para su análisis.

6.4. Determinación de lípidas, en el plasma

20 Se determinaron las concentraciones en plasma de colesterol total (CT), colesterol HDL (C-HDL) y triglicéridos (TG) mediante colorimetria usando equipos comerciales de reactivos de Biosystems (Barcelona, España) según las instrucciones del fabricante.

6.5. Análisis estadístico

Los datos se expresan (en la Figura 4) como media ± desviación tipica de la media (DTM) y fueron analizados por

25 ANOVA unidireccional. Las diferencias entre los grupos fueron evaluadas por la prueba de Tukey. Se consideraban significativas las diferencias cuando los valores P eran < 0,05. Los datos se analizaron usando el soporte lógico Sigma Stat (versión 2.03).

6.6. Exposición

La Figura 4 muestra la correlación entre el indice aterogénico y los animales, divididos según los diferentes modelos

30 de dieta. El grupo animal 1, tratado con la dieta CC (dieta de control durante dos meses), presenta el menor valor del indice aterogénico, mientras que el grupo animal 2, tratado con la dieta AA (dieta aterogénica -control negativo durante dos meses), presenta el mayor, siendo estadisticamente significativa la diferencia del valor del indice aterogénico entre los grupos 1 y 2 con un valor P < 0,001. Se muestra un resultado interesante según el grupo 5: los animales fueron tratados con las dietas A y G160 durante los meses l' y 2', respectivamente. No se observó

35 ninguna diferencia estadisticamente significativa del valor del indice aterogénico entre los grupos 5 y 1. En otras palabras, después del mes de tratamiento con la dieta G 160, se observó para el grupo animal 5 una reducción significativa del valor del indice aterogénico hasta un valor que es comparable al nivel obtenido con la dieta CC (dieta de control durante dos meses). Por el contrario, no se observó el mismo efecto cuando solo se dio la dieta estándar en el mes que siguió al mes de tratamiento con la dieta aterogénica (grupo animal 3). En este caso, el valor

40 del indice aterogénico (aunque fuera estadisticamente significativa la diferencia con el del grupo 2 de control negativo) dio como resultado una diferencia estadísticamente significativa con respecto al valor del índice aterogénico detectado para los animales alimentados durante dos meses con la dieta de control (grupo 1), con un valor P < 0,05.

Los altos niveles de colesterol/triglicéridos, los bajos niveles de colesterol HDL y, especialmente, las LDL oxidadas se encuentran entre los factores de riesgo asociados con la aterosclerosis y la enfermedad coronaria. Los inventores han estudiado el efecto que tiene un producto nutricional funcional izado que contiene extracto de granada en los biomarcadores de eventos cardiovasculares, y lo han comparado con prOductos nutricionales similares no funcionalizados con extracto de granada. Teniendo en cuenta todos los parámetros medidos (véase la Figura 4), llegan a la conclusión de que la administración regular del producto nutricional que contiene un extracto de granada protege el sistema cardiovascular, lo que, en mayor o menor medida, evita la incidencia de eventos cardiovasculares y, por lo tanto, bien puede ser considerado como un producto nutricional que promueve la salud.

Especialmente notable es el hecho de que la adición de extractos de granada a una dieta grasa y rica en colesterol 5 (PP, grupo 4) permite mantener el valor del índice aterogénico sin una diferencia estadísticamente significativa cuando se compara con una dieta estándar (CC, grupo 1).

Ejemplo 7 (Fig. 5)

Uso del extracto de granada en el tratamiento de la hipertensión

7.1. Animales

10 Se obtuvieron veinticuatro ratas Sprague Dawley macho (peso aproximado de 200 g al inicio del experimento) en Harlan Interfauna Ibérica, SA (Barcelona, España) y se mantuvieron durante todo el experimento en las instalaciones del servicio del animalario de la Universidad de Murcia. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos experimentales de 6 ratas cada uno, alojados con condiciones estándar de iluminación (ciclos diurnos/nocturnos de 12 h), temperatura (22±2°C) y humedad (60%).

15 7.2. Dieta

Durante los periodos de aclimatación y experimental, las ratas fueron alimentadas con una dieta sólida estándar para ratas (panlab). Había disponible ad libitum agua potable y alimento. Después de un periodo de aclimatación de 7 dias comenzaron los tratamientos según el diseño del experimento.

7.3. Diseño del experimento

20 Para determinar el efecto del extracto de granada, se usó un modo de hipertensión inducida con N-nitro-L-argininametiléster (L-NAME). Después del periodo de aclimatación, pero antes de que empezara el tratamiento de hipertensión inducida con L-NAME, se tomaron registros basales de la presión sanguínea arterial (DO) con un equipo Letica 5002.

Los animales fueron tratados según un diseño experimental mostrado en la siguiente tabla:

Tabla 2

GRUPO: con L-NAME" Alimentación sonda oral Observaciones

1 2: No 40 No No

3: 40 160 en

4: 40 mg L-NAME/kg 100 mg captoprillkg Control positivo: 100 mg de captopril en

": Se administró a todos los grupos un tratamiento de L-NAME a través del agua potable, disponible ad libitum, teniendo en cuenta un peso corporal de 200 g por animal y una estandarización del suministro medio de agua animal de 40 mUdía real de animal era

7.4. Planificación de las actividades

Para lograr que las ratas se habituaran, se realizaron durante el periodo de aclimatación mediciones de la presión sanguínea arterial usando el registro de las pulsaciones de la arteria caudal con un equipo Letica 5002.

La realización de las mediciones o los tratamientos experimentales se resumen en la siguiente tabla:

30

Día: Mediciones de la presión sanguínea arterial

1: Sí No

Tabla 3 Agua potable complementada con LNAME

Si Si

Alimentación por sonda oral No Sí Se medió la presión sanguinea arterial con una periodicidad según la tabla anterior, mediante el procedimiento del manguito del tensiómetro en la cola. Antes de la medición, las ratas fueron mantenidas a 37°C durante 10 minutos para hacer detectables las pulsaciones de la arteria caudal. El equipo usado en el presente estudio, LE 5002 (Letica, Hospitalet, Barcelona, España), tiene un transductor de impulsos de gran sensibilidad unido a un programa de

2: Sí Si Sí

3: No Sí Si

4: Sí Sí Sí

5 No Sí: Sí

6 No Sí: Sí

7 Si Sí: Sí

7.5. Detenninación de la presión sanguínea arterial

13

5 microprocesador preciso, y permite mediciones precisas de la presión sanguínea arterial. Las mediciones de la presión sanguínea arterial se realizaron a la misma hora del dia para evitar cualquier influencia del ciclo circadiano.

7.6. Análisis estadístico

Los datos se expresan (véase la Figura 5) como media ± desviación típica de la media (OTM) y fueron analizados usando el soporte lógico Sigma Stat (versión 2.03).

10 7.7. Exposición

La hipertensión arterial se encuentra entre los factores de riesgo asociados con las enfermedades cardiovasculares. Los inventores han estudiado el efecto que tiene el extracto de granada en la presión sanguinea arterial, y lo han comparado con grupos de control sin tratamiento con extracto de granada. Llegan a la conclusión de que el extracto de granada presentó una actividad antihipertensiva que, en mayor o menor medida, evita la incidencia de eventos

15 cardiovasculares y, por lo tanto, bien puede ser considerado como un suplemento dietético que promueve la salud y que puede ser una estrategia fructífera para produCir alimentos y bebidas funcionales con actividad antihipertensiva.

Ejemplo 8a (Fig. 6)

Uso del extracto de granada y de fibra soluble en la prevención o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares

8.1. Animales

20 Se obtuvieron setenta y dos ratas Sprague Oawley macho (peso aproximado de 150-180 g) en Harian Interfauna Ibérica, SA (Barcelona, España) y se mantuvieron durante todo el experimento en las instalaciones del servicio del animalario de la Universidad de Murcia. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 9 grupos experimentales de 8 ratas cada uno, y cada subgrupo de 4 ratas fue alojado con condiciones estándar de iluminación (ciclos diurnos/nocturnos de 12 h), temperatura (22±2°C) y humedad (60%).

8.2. Dietas Las dietas usadas en el estudio fueron las siguientes:

•: OIETA OE CONTROL (C): dieta sólida estándar para ratas (Panlab).

•: OIETA ATEROGÉNICA (A): 95,5% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab), 1,5% de colesterol (Aldrich) y

30 3% de manteca para inducir aterosclerosis.

• ESTANOAR + ALIMENTACiÓN POR SONOA ORAL (40 mg de punicalaginas/kg) (G40): dieta estándar para ratas (Panlab). Además, se administraron diariamente, por sonda oral, 40 miligramos de punicalaginaslkg de peso corporal en agua.

•: OIETA OE FIBRA SOLUBLE (F): 95% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab) y 5% de fibra soluble.

•: FIBRA SOLUBLE + ALIMENTACiÓN POR SONOA (40 mg de punicalaginas/kg) (FG): 95% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab) y 5% de fibra soluble. Además, se administraron diariamente, por sonda oral, 40

miligramos de punicalaginas/kg de peso corporal en agua.

•: OIETA ATEROGÉNICA + ALIMENTACiÓN POR SONOA ORAL (40 mg de punicalaginas/kg) (FG): 95,5% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab), 1,5% de colesterol (Aldrich) y 3% de manteca. Además, se administraron diariamente, por sonda oral, 40 miligramos de punicalaginas/kg de peso corporal en agua.

•: OIETA ATEROGÉNICA + FIBRA SOLUBLE (AF): 90,5% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab), 1,5% de colesterol (Aldrich) y 3% de manteca para inducir aterosclerosis y 5% de fibra soluble.

•: OIETA ATEROGÉNICA + FIBRA SOLUBLE + ALIMENTACiÓN POR SONOA (40 mg de punicalaginas/kg)

50 (AFG): 90,5% de dieta sólida estándar para ratas (Panlab) , 1,5% de colesterol (Aldrich) y 3% de manteca para inducir aterosclerosis y 5% de fibra soluble. Además, se administraron diariamente, por sonda oral, 40 miligramos de punicalaginas/kg de peso corporal en agua.

Había disponible ad libitum agua potable y alimento. No obstante, en todo el estudio, se estandarizó un suministro diario por animal de 15 g/día (la ¡ngesta real por animal era desconocida). Además, se administraron diariamente,

and AFG, respectivamente, Para evitar la oxidación de las grasas, la dieta aterogénica se mantuvo a 4°e en la oscuridad hasta su uso, y se eliminaba la dieta no consumida del día anterior.

Las concentraciones de punicalaginas en las dietas G40, FG, AG Y AFG se midieron mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLe),

8.3. Diseño del experimento

La Tabla 4, a continuación, muestra el diseño del experimento: Tabla 4

GRUPO: Del día 1 al 30 Del día 31 al 60 Observacíones

1: e e

2: A A

3: A e

4: A F

5: A G40 Se administraron diariamente, por sonda oral, 40 mg de

de pe en

6: A FG Se administraron diariamente, por sonda oral, 40 mg de

de pe en

7: AF AF

8: AG AG Se administraron diariamente, por sonda oral, 40 mg de

de pe en

9: AFG AFG Se administraron diariamente, por sonda oral, 40 mg de

de pe en

Los grupos de animales fueron alimentados durante 2 meses con las dietas e, A, AF, AG o AFG (grupos 1, 2, 7, 8 Y 9, respectivamente) o durante 1 mes con la dieta A seguido por un mes más con la dieta e, F, G40 o FG (grupos 3, 4, 5 Y 6, respectivamente). Al final del experimento, los animales, en ayunas, fueron anestesiados e, inmediatamente después de la eutanasia, se realizó una punción intracardiaca para recoger sangre en tubos. Se separó el suero por centrifugación para su análisis.

8.4. Análisis estadístico

Los datos relacionados con el indice aterogénico se expresan como media ± desviación típica de la media (DTM) y fueron analizados por ANOVA unidireccional. Las diferencias entre los grupos fueron evaluadas por la prueba de Tukey. Se consideraban significativas las diferencias cuando los valores P eran < 0,05. Los datos se analizaron usando el soporte lógico Sigma Stat (versión 2.03).

Los datos relacionados con el pe de las ratas se expresan como media ± desviación tipica de la media (DTM) y fueron analizados usando el soporte lógico Sigma Stat (versión 2.03).

8.5. Exposición

Los resultados obtenidos son mostrados en la Figura 6 adjunta, en la que el índice aterogénico ha sido correlacionado con diferentes grupos de animales que, como ya se ha dicho, están indicados en la Tabla 4.

La Figura 6 muestra la correlación entre el índice aterogénico y los animales, divididos según los diferentes modelos de dieta. El grupo animal 1, tratado con la dieta ee (dieta de control durante dos meses), presenta el menor valor del índice aterogénico, mientras que el grupo animal 2, tratado con la dieta AA (dieta aterogénica -control negativo durante dos meses), presenta el mayor, siendo estadísticamente significativa la diferencia del valor del indice aterogénico entre los grupos 1 y 2 con un valor P < 0,001. Se muestra un resultado interesante según el grupo 6: los animales fueron tratados con las dietas A y FG durante los meses l' y 2', respectivamente. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa del valor del indice aterogénico entre los grupos 6 y 1. En otras palabras, después del mes de tratamiento con la dieta FG, se observó para el grupo animal 6 una reducción significativa del valor del indice aterogénico (una reducción del 30,2% con respecto al valor medio obtenido para el grupo 3, tratado con dieta A-e) hasta un valor que es comparable al nivel obtenido con la dieta ee (dieta de control durante dos meses). Por el contrario, no se observó el mismo efecto cuando solo se dio a los animales fibra soluble (dieta F) o una alimentación por sonda de 40 mg de extracto de granadalkg de pe (dieta G40) además de una dieta estándar en el mes que siguió al mes de tratamiento con la dieta aterogénica (grupos animales 4 y 5, respectivamente). En este caso, el valor del indice aterogénico (aunque fuera estadísticamente significativa la diferencia con el del grupo 2 de control negativo) dio como resultado una diferencia estadísticamente significativa con respecto al valor del índice aterogénico detectado para los animales alimentados durante dos meses con la dieta de control (grupo 1), con un valor P < 0,05. Sorprendentemente, la reducción del valor del índice aterogénico con respecto al valor medio obtenido para el grupo 3, tratado con la dieta A-e, fue del 6,9% y el 17,2%, respectivamente, para los grupos 4 y 5, respectivamente, lo que sugiere, cuando se compara con el 30,2% de reducción obtenido para el grupo 6, un efecto sorprendente, y posiblemente sinérgico, debido a la combinación de la fibra soluble y el extracto de fruta de granada según la presente invención.

Se muestra otro resultado interesante según el grupo animal 9, que, en este experimento, fue tratado con la dieta AFG. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa del valor del índice aterogénico entre los grupos 9 y 1. En otras palabras, después de dos meses de tratamiento con la dieta aterogénica complementada con fibra soluble más una alimentación por sonda de extracto de fruta de granada rico en punicalaginas, se observó para el grupo animal AFG-AFG un valor inalterado del índice aterogénico que es comparable al nivel obtenido con la dieta de control. Por el contrario, no se observó el mismo efecto cuando solo se dieron las dietas AF o AG a los animales de los grupos 7 y S, respectivamente, durante los dos meses del experimento (grupos animales AF-AF y AG-AG). En este caso, el valor del índice aterogénico (aunque fuera estadísticamente significativa la diferencia con el del grupo 2 de control negativo) dio como resultado una diferencia estadísticamente significativa con respecto al valor del índice aterogénico detectado para los animales alimentados con la dieta de control (grupo 1), con un valor P < 0,05. El nivel del índice aterogénico derivado del grupo animal 9 sugiere un efecto preventivo debido al extracto de fruta de granada rico en punicalaginas obtenido según la presente invención y sugiere una mejora del efecto debida a la combinación de la fibra soluble y el extracto de fruta de granada según la presente invención.

Ejemplo Sb (Fig. 7)

La obesidad se encuentra entre los factores de riesgo asociados con el síndrome metabólico, y las personas con síndrome metabólico tienen un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares. Los inventores han estudiado el efecto que tiene el extracto de granada en combinación con fibra soluble en el peso corporal (PC) de la rata y lo han comparado con grupos de control sin tratamiento con la combinación de fibra soluble y extracto de fruta de granada según la presente invención.

La Figura 7 muestra la correlación entre el PC de los animales, los mismos usados en el ejemplo Sa, divididos según la diferencia de modelos de dieta y siguiendo el diseño de experimento mostrado en la Tabla 4 del anterior Ejemplo Sa.

Según dicha Figura 7, después de dos meses de tratamiento, el grupo animal 1, tratado con la dieta CC (dieta de control), presenta el menor PC, mientras que el grupo animal 2, tratado con la dieta AA (dieta aterogénica -control negativo), presenta el mayor pe. Se seleccionaron la dieta aterogénica y el tiempo total del experimento para evitar una obesidad en los animales que pudiera afectar a la correcta interpretación de los datos obtenidos para concentraciones de plasma de colesterol total (CT), colesterol HDL (C-HDL) y triglicéridos.

Se muestra un resultado interesante según los animales del grupo 9, que, en este experimento, fueron tratados con la dieta AFG. Se observaron tendencias similares entre los grupos 9 y 1 para el valor de PC de las ratas durante el experimento de dos meses. En otras palabras, después de dos meses de tratamiento con la dieta aterogénica complementada con fibra soluble más una alimentación por sonda de extracto de fruta de granada rico en punicalaginas, se observó para el grupo animal AFG-AFG un PC de las ratas comparable al valor obtenido con la dieta de control. Por el contrario, no se observó el mismo efecto cuando solo se dieron las dietas AF o AG a los animales de los grupos 7 y S, respectivamente, durante los dos meses del experimento (grupo animal AF-AF). En este caso, las tendencias del PC de las ratas de los grupos 7 y S parecen estar en una situación intermedia entre la tendencia del mayor PC de las ratas, el grupo 2, y la tendencia del menor PC de las ratas, el grupo 1. La tendencia del PC mostrada por el grupo animal 9 sugiere un efecto preventivo sobre el sobrepeso o la obesidad debido a la combinación del extracto de fruta de granada y la fibra soluble según la presente invención.

Teniendo en cuenta todos los parámetros medidos, puede llegarse a la conclusión de que la administración regular del extracto de granada en combinación con fibra soluble según la presente invención protege el sistema cardiovascular, lo que, en mayor o menor medida, previene la incidencia de algunos de los factores de riesgo que se considera que están asociados con acumulaciones de la placa aterosclerótica en las arterias y con el síndrome metabólico y que, por lo tanto, bien puede ser considerado un extracto natural que promueve la salud, para ser usado en la preparación de alimentos funcionales y suplementos dietéticos.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de un extracto de granada que comprende punicalaginas, ácido elágico y azúcares, en el que la razón (% p/p) de punicalagina/ácido elágico está en el intervalo de 10/1 a 35/1 , la razón (% p/p) de punicalagina/azúcares está dentro del intervalo de 10/1 a 50/1 , el contenido de azúcares totales es del 2% (p/p) o menos y en el que dicho extracto tiene un contenido de punicalaginas de al menos el 30% (p/p), un contenido de ácido elágico del 2% (p/p) o menos, un contenido de fenoles totales de al menos el 30% (p/p), (expresado como equivalente de ácido gálico), una solubilidad en agua de al menos el 7% p/v (70 g por litro) y un contenido de disolventes orgánicos residuales inferior a 1 ppb para preparar un producto nutricional.
2.

Uso según la reivindicación 1, en el que dicho extracto de granada tiene una solubilidad en agua de al menos el 10% p/v (100 g por litro) y un contenido de azúcares totales no superior al 1 % (p/p).
3.

Uso según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho extracto de granada comprende una fibra soluble que tiene un contenido de beta-glucano (base seca) de al menos el 30%.
4.

Producto nutricional que es un alimento funcional o una bebida funcional que comprende un extracto de granada según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en dicho producto la razón (% p/p) de punicalagina/ácido elágico está en el intervalo de 10/1 a 35/1 y la razón (% p/p) de punicalagina/azúcares de granada añadidos está dentro del intervalo de 10/1 a 50/1.
5.

Producto nutricional según la reivindicación 4, que comprende fructosa, en el que la razón (% p/p) de punicalaginalfructosa en dicho producto nutricional está en el intervalo de 60/1 a 100/1 .
6.

Producto nutricional según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, que comprende fibras solubles.
7.

Producto nutricional según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque comprende un contenido de punicalaginas dentro del intervalo del 0,005% al 5% (p/p).
8.

Producto nutricional según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende además hidroxitirosol.
9.

Producto nutricional según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que dicho producto está seleccionado de un refresco, una bebida, un producto lácteo; un aceite comestible de pescado, marino o vegetal; un producto cárnico o avícola; un producto de panadería o un producto a base de pasta; una conserva de frutas o verduras; un marisco en lata o pescado en lata; un aperitivo, un dulce, sal, azúcar, un condimento o combinaciones de dos o más de los mismos.
10.

Producto nutricional según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, que es un alimento funcional para animales o mascotas.
11.

Uso del extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como aditivo alimentario para prevenir o inhibir la oxidación lipídica de alimentos y bebidas.
12.

Uso del extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como aditivo alimentario para prevenir o inhibir que se estropeen alimentos y bebidas debido a hongos, bacterias y otros microorganismos.
13.

Extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en la prevención o el tratamiento de uno o más estados seleccionados de enfermedades cardiovasculares, hipertensión arterial, acumulación de placa en las arterias y síndrome metabólico.
14.

Producto nutricional según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, para su uso en la prevención o el tratamiento de uno o más estados seleccionados de enfermedades cardiovasculares, hipertensión arterial, acumulación de placa en las arterias y síndrome metabólico.
15.

Uso de un extracto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la fabricación de un medicamento y/o una composición para la prevención o el tratamiento de uno o más estados seleccionados de enfermedades cardiovasculares, hipertensión arterial, acumulación de placa en las arterias y síndrome metabólico.

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