ES2342183T3

ES2342183T3 - Sistema de ensayo de la coagulacion.

Info

Publication number: ES2342183T3
Application number: ES05781688T
Authority: ES
Inventors: Matthias Stiene; Eurig Wyn Jones; Sladjana Nincic; Elke Horstkotte
Original assignee: EGOMEDICAL TECHNOLOGIES AG
Current assignee: EGOMEDICAL TECHNOLOGIES AG
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2005-08-31
Publication date: 2010-07-02
Anticipated expiration: 2025-08-31
Also published as: EP1920246B1; EP1920246A1; ATE460664T1; JP2009506332A; DE602005019923D1; US20090221011A1; AU2005336058A1; CA2615278A1; WO2007025559A1

Abstract

Elemento de prueba para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre total que posee una primera superficie (2a) y una segunda superficie (4a) a una distancia predeterminada una frente a otra, estando provistas dichas ambas superficies de dos modelos sustancialmente equivalentes que forman zonas de alta y baja energía superficial que están alineados de forma esencialmente congruente, con lo cual las zonas de alta energía superficial crean un sistema de distribución de muestras (6) con al menos dos zonas de detección de la coagulación (6a1, 6a2), caracterizado porque al menos una de las zonas de detección (6a, 6''a) de la primera y la segunda superficies (2a, 4a) está provista de al menos un reactivo estimulante de la coagulación.

Description

Sistema de ensayo de la coagulación.

Campo de la invención

La invención se refiere a un sistema de ensayo de la coagulación para medir la coagulación sanguínea en una muestra de fluido fisiológico.

Antecedentes de la invención

El proceso de coagulación de la sangre es complejo e implica a una gran cantidad de componentes sanguíneos, incluyendo la generación de fibras de fibrina. Las fibras se forman por la polimerización de las moléculas de una proteína denominada fibrinógeno. El fibrinógeno es catalizado a partir de una enzima llamada trombina, que es catalizada a su vez por la enzima protrombina.

El ensayo de tiempo de la protrombina (ensayo PT) se emplea comúnmente en hospitales, clínicas y laboratorios para determinar la capacidad de coagulación de una muestra de sangre. El ensayo es ampliamente utilizado para la evaluación preoperatoria, así como para la terapia anticoagulante administrada por ejemplo a pacientes cardíacos. El ensayo PT se basa en el período de tiempo necesario para que una muestra de sangre se coagule bajo la influencia de ciertos reactivos, tales como iones calcio y tromboplastina.

De forma similar, los individuos que padecen enfermedades cardíacas y vasculares y/o que tienen válvulas cardíacas mecánicas a menudo son tratados con un régimen diario de medicamentos que retardan la coagulación sanguínea, denominados comúnmente como anticoagulantes. Para que la cantidad de anticoagulante en el torrente sanguíneo sea eficaz, se debe mantener a un nivel considerado apropiado por el médico. La consecuencia de cantidades inadecuadas de anticoagulante en el torrente sanguíneo es grave, conduciendo a apoplejías o hemorragias.

Los pacientes que logran este equilibrio deben soportar visitas frecuentes, onerosas e inoportunas a la clínica, donde se puede controlar de cerca la capacidad de la sangre para coagularse. El control se realiza con mediciones periódicas PT tal como se miden por el Coeficiente Internacional Normalizado (INR). Por ejemplo, un INR superior a 3 resulta en un riesgo más alto de hemorragia seria, mientras que un INR de 6 incrementa el riesgo de desarrollar un sangrado serio en cerca de 7 veces el correspondiente a un INR por debajo de 3. Por otra parte, un INR por debajo de 2 se asocia con un mayor riesgo de apoplejía. Por tanto, se recomienda el control del tiempo de protrombina para asegurar que los niveles de dosis se encuentran dentro del rango terapéutico.

Cuando se controlan componentes tales como los niveles de fibrinógeno y de protrombina en sangre, el médico puede adquirir datos significativos sobre la capacidad de coagulación sanguínea de un paciente o sobre otras condiciones clínicas. Las proteínas que están involucradas en el proceso de coagulación se denominan habitualmente factores. Los factores se numeran del I al XIII y los especialistas se refieren a un factor por su número identificando la proteína correspondiente.

La activación de la protrombina tiene lugar como resultado de la acción del Factor Xa de coagulación sanguínea, que se forma por la activación del Factor X durante la proteólisis. Existen dos vías moleculares que llevan a la activación del Factor X para producir Xa, generalmente conocidas como vías extrínsecas e intrínsecas de la coagulación sanguínea. La vía extrínseca utiliza solamente un factor específico de tejido de una membrana lesionada, mientras que la vía intrínseca utiliza sólo factores internos de la sangre circulante. Ambas vías surgen de la interacción de las enzimas implicadas en el proceso de coagulación sanguínea con las proteínas superficiales y los fosfolípidos.

Se han empleado diversos ensayos para medir el proceso de coagulación en ambas vías, extrínseca e intrínseca, de una muestra de sangre de un paciente. Por ejemplo, la prueba del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado (APTT) mide los factores de coagulación de la vía intrínseca. Estos factores incluyen los Factores XII, XI, X, IX, VIII, V, II y I, que pueden ser anormales debido a la herencia, a una enfermedad o a los efectos de una terapia con heparina. Por tanto, la prueba APTT es útil como criba prequirúrgica y para controlar la terapia con heparina. De forma similar, las pruebas de velocidad de polimerización del fibrinógeno utilizando una prueba de Tiempo de Trombina (TT) o una prueba cuantitativa de fibrinógeno proporcionan datos útiles para el diagnóstico de pacientes en terapia con Warfarina (marca: Coumadine®) o con productos farmacéuticos relacionados.

Tal como se ha mencionado anteriormente, la prueba más comúnmente utilizada para controlar la terapia con anticoagulantes es la prueba del tiempo de protrombina en una etapa. La reacción medida por la prueba PT es:

Sangre + Tromboplastina + Ca^{++} \rightarrow Coágulo de Fibrina

La tromboplastina es una preparación fosfolípido-proteína que activa la coagulación en especímenes sanguíneos. Diferentes fabricantes disponen comercialmente de tromboplastinas y éstas se pueden obtener a partir de extractos de pulmón, cerebro o placenta y se pueden fabricar sintéticamente. En general, los valores PT entre distintos laboratorios no coinciden, siendo por ello tales valores inaceptables para definir los rangos terapéuticos para la terapia con anticoagulantes.

Por ello, se desarrolló un Coeficiente Internacional Normalizado (INR) y éste fue adoptado por la Organización Mundial de la Salud a principios de los años 80. El objeto del coeficiente normalizado era estandarizar los resultados procedentes de varios analizadores de tromboplastinas y de coagulación para que fueran equivalentes. Por consiguiente, con el coeficiente, un fabricante atribuye un Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) a cada lote de tromboplastina, indicando la sensibilidad relativa de la tromboplastina con respecto a una tromboplastina de referencia internacional. Por ejemplo, si una tromboplastina tiene la misma sensibilidad que la tromboplastina de referencia, entonces el ISI es 1,0. Un valor de ISI superior a 1,0 indica que la tromboplastina no es tan sensible como la tromboplastina de referencia. Se utiliza la ecuación que figura más abajo para calcular el valor INR utilizando un valor PT y un valor ISI:

1

El PT medio-normal se determina en cada laboratorio haciendo el promedio de los valores PT a partir de un número de individuos sanos.

La detección de la formación de coágulos de fibrina se remonta a mediados de 1850 y los primeros métodos eran manuales. En 1910 se desarrolló un aparato para determinar el cambio de viscosidad de una muestra de sangre cuando experimentaba la coagulación. El aparato proporcionaba una indicación directa del voltaje, que se podía representar frente al tiempo de coagulación. En los años 20, destacaron las técnicas fotoeléctricas para detectar variaciones en la transmisividad a la luz de una muestra de sangre durante la coagulación con variaciones en la transmisividad óptica de la muestra observadas con un galvanómetro. Otras investigaciones sobre la coagulación de plasma sanguíneo por técnicas fotoeléctricas mejoradas se realizaron a mediados de los años 30 con un aumento de la densidad óptica a medida que se observaba la sangre coagulada. Esto condujo al desarrollo de un instrumento que mostraba un aumento de la densidad a medida que se formaba un coágulo.

Así, los sistemas modernos de detección de la densidad óptica funcionan según el principio de que un incremento en la densidad óptica de una muestra de coagulación disminuye la transmisividad a la luz a través de la muestra. En un sistema típico de detección de la densidad óptica, se coloca una muestra de sangre de prueba en una cubeta transparente de muestra y se somete a reacción con un reactivo estimulante de la coagulación tal como tromboplastina. La radiación electromagnética o la luz en el espectro visible o casi infrarrojo atraviesa entonces la mezcla de reactivo y plasma a medida que la muestra coagula. Como el cambio bioquímico que lleva a la formación de fibrina tiene lugar dentro de la muestra, la densidad óptica de la muestra aumenta. Los voltajes de salida correspondientes a la densidad óptica de la muestra permiten, después del procesamiento con una unidad de procesamiento, determinar la coagulación de la muestra.

Aunque se ha reconocido durante mucho tiempo la existencia de la relación entre los niveles de fibrinógeno (fibrina) y la densidad óptica, ha habido un importante desacuerdo sobre la naturaleza y metodología adecuada para medir tal relación y se han elaborado numerosos parámetros de prueba para determinar los niveles de fibrinógeno utilizando datos sobre la densidad óptica.

Además, la creciente concienciación sobre el efecto negativo del tiempo irregular de coagulación sanguínea, la aceptación del autocontrol y del autotratamiento han conducido al desarrollo de múltiples monitores de coagulación sanguínea y métodos para uso personal y pruebas de diagnóstico inmediato. Sin embargo, estos dispositivos siguen careciendo del estado de desarrollo, economía y comodidad conocidos para los sistemas de control de la glucosa en casa para pacientes diabéticos.

Un ejemplo de método y sistema para medir el tiempo de coagulación sanguínea es el descrito en la patente de Estados Unidos Nº 4.252.536. El método implica proporcionar una mezcla de una muestra de sangre y un reactivo, irradiación de la mezcla con luz y detección de la cantidad de luz difundida desde la mezcla irradiada produciendo una señal eléctrica representativa de la misma. Posteriormente, se realiza una determinación a partir de la señal eléctrica en el tiempo en el cual tiene lugar el cambio más rápido en la señal eléctrica y después la determinación como punto final en un momento anterior a la primera vez en la que ha tenido lugar un cambio, que es 1/n el del cambio más rápido, siendo n mayor que 1. La mayoría de los métodos de medición del tiempo de coagulación se basan en plasma que se introduce en una cubeta y en el análisis de las propiedades de coagulación durante un período de
tiempo.

La solicitud de patente europea Nº 1.162.457 describe un sistema de prueba para determinar una sustancia promotora de la coagulación apropiada para su administración a un paciente como terapia para mejorar la función de coagulación utilizando tres pocillos de muestra que reciben una cantidad determinada de sangre.

La patente de Estados Unidos Nº 6.066.504 describe un conjunto de electrodos que proporciona una medida cuantitativa de los cambios de viscosidad durante intervalos de tiempo para indicar la coagulación o la lisis de una muestra sanguínea.

La patente europea Nº 974.840 describe un dispositivo de diagnóstico en fluido para medir la concentración de un analito o las características de un fluido biológico utilizando medios de detección óptica.

La PCT WO 2004/044560 describe la determinación fotométrica del tiempo de coagulación en sangre total no diluida que contiene un recipiente para recibir una muestra de sangre total no diluida, una fuente de emisión de luz para emitir luz y un detector de luz para medir la cantidad de luz procedente de dicho recipiente.

La patente de Estados Unidos Nº 6.084.660 describe un dispositivo de diagnóstico médico en fluido que posee, en un extremo, un orificio de muestra para introducir la muestra y, en el otro extremo, una cámara para extraer la muestra hacia una zona de medida, donde se mide la concentración de un analito o una propiedad física de la sangre total, en particular el tiempo de coagulación, sólo después de asegurarse en primer lugar de que se ha introducido en el dispositivo una muestra de sangre total.

La PCT WO2002/086472 describe el uso de rotores moleculares fluorescentes que varían su intensidad de fluorescencia en base a la viscosidad del entorno. El inventor se refiere además a un tipo de motores moleculares que se modifican con una cadena de hidrocarburos o un grupo hidrofílico para permitir la medición de la membrana o de la viscosidad del líquido.

Las publicaciones de las solicitudes de patente de Estados Unidos Nº 2002/0110486A1 y 2003/0031594A1 describen una tira de prueba que comprende una pluralidad de zonas de reacción utilizadas con el propósito de asegurar la calidad. La tira de prueba requiere un volumen de aproximadamente 20 \mul de sangre. Sin embargo, cuando un usuario debe someterse a la prueba frecuentemente, según lo requiera la gestión apropiada de la terapia de coagulación, estos grandes volúmenes de muestra no son prácticos ni tampoco ventajosos.

La PCT/EP 2004002284 describe un elemento de prueba reactivo seco para la detección fotométrica y la determinación cuantitativa de un analito, por ejemplo glucosa, en un fluido fisiológico, por ejemplo sangre, que posee un sistema de distribución de muestras con al menos dos zonas de detección, estando provisto de un sistema integrado de calibración y requiriendo volúmenes muy pequeños de muestra, de aproximadamente 0,5 \mul.

La publicación de solicitud de la patente de Estados Unidos Nº 2003/210287 describe un dispositivo de diagnóstico médico adaptado para la medida de los tiempos de coagulación sanguínea que posee un sustrato no absorbente sobre el que se deposita un reactivo mediante impresión no-impacto de microgotas. El dispositivo comprende una cámara para crear una fuerza de succión con el fin de introducir la muestra en el dispositivo y una junta de parada para interrumpir el flujo después de llenar la zona de reactivo. La capa superior tiene preferentemente una superficie hidrofóbica enfrentada al sustrato, al menos en las zonas del canal y del reactivo.

La publicación de solicitud de patente internacional WO 00/56808 describe un método para convertir una superficie recubierta por un material polimérico más hidrofílico mediante tratamiento en un plasma de gas de un gas no-polimerizable. Además, la WO 00/56808 describe un sistema de transporte de líquido creado por una superficie (I) que presenta un modelo hidrofílico y una superficie (II) que tiene carácter hidrofóbico o un modelo hidrofílico que coincide con el modelo hidrofílico de la superficie (I). Además, la WO 00/56808 proporciona un kit que contiene un dispositivo que comprende un sistema de transporte de líquido y una sustancia fluorescente que debe detectarse en el dispositivo.

La publicación de la solicitud de patente internacional WO 02/076878 describe un método y una estructura de guiado microfluídico bajo que emplea superficies humectables y no humectables para formar una vía de flujo que posee una baja resistencia al flujo, favorece el flujo laminar y proporciona una interfase gas-líquido superior.

La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2004/031688 proporciona sistemas de laboratorio con microchips, tal como actuadores, para manipular pequeñas cantidades de líquido (microfluídicas) basados en el fenómeno de electro-humidificación. El sistema de laboratorio con microchips comprende un dispositivo de manejo de materiales que transporta el líquido en forma de gotas individuales posicionadas entre dos superficies. La formación y el movimiento de las gotas son controlados por varios campos eléctricos en todo el espacio entre las dos superficies, realizando los campos eléctricos una conversión hidrofóbica e hidrofílica de las gotas.

Sin embargo, hasta ahora no existe ningún sistema de prueba que sea adecuado para medir la coagulación de una muestra de sangre y que se proporcione con medios integrados de control de calidad y requiera sólo pequeños volúmenes de muestra.

Por tanto, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un sistema de ensayo para determinar la coagulación de sangre total que requiere sólo etapas mínimas, tales como la aplicación de sangre sobre una tira, que proporciona un cálculo automático posterior del resultado exacto de la prueba, incluyendo un medio para el control de calidad "sobre la tira" y que requiere solamente una pequeña cantidad de muestra.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un proceso de producción para un elemento de prueba de la coagulación que no implica múltiples complicadas etapas de producción y que, por tanto, es barato y utilizable para productos que ayudan a los pacientes en el autocontrol de la coagulación sanguínea y/o en el lugar de trabajo de un médico.

Sumario de la invención

Así, la presente invención proporciona un elemento de ensayo para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre total que tiene una primera superficie y una segunda superficie opuestas entre sí a una distancia predeterminada, estando dichas dos superficies provistas de dos patrones sustancialmente equivalentes que forman zonas de alta y baja energía superficial, que están alineados de forma mayoritariamente congruente, por lo que las zonas de alta energía superficial crean un sistema de distribución de muestras con al menos dos zonas de detección, donde al menos una de las zonas de detección de la primera y/o la segunda superficie está provista de al menos un reactivo estimulante de la coagulación.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un elemento de ensayo de la coagulación.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema de prueba de la coagulación que se compone de un elemento de ensayo de la coagulación y un dispositivo medidor para realizar ensayos de coagulación sanguínea utilizando un formato simplificado con el fin de proporcionar un resultado verificado acorde con los estándares mundiales, proporcionando al mismo tiempo un control de calidad en la tira.

Se entenderán mejor las características y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones ilustrativas y preferentes junto con las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra una vista en perspectiva de una realización del elemento de ensayo de la coagulación de la presente invención proporcionado en forma de una tira de prueba.

Figura 2: muestra una vista en perspectiva de la realización según la Figura 1, mostrando la distribución de muestras ampliada.

Figura 3: muestra un despiece en perspectiva del dispositivo según la Figura 1, presentando las tres capas por separado.

Figura 4: muestra distintas formas de discontinuidad de la capa central que forma la cavidad para la muestra junto con las superficies primera y segunda.

Figura 5a: sección de una zona de detección del sistema de distribución de muestras construido por elementos de guiado hidrofóbicos.

Figura 5b: sección de otra realización de una zona de detección del sistema de distribución de muestras por medio de vías hidrofílicas.

Figura 6: muestra distintas realizaciones del sistema de distribución de muestras con distintos modelos de vías y zonas de detección adecuadas para distintos métodos de evaluación.

Figura 7a: muestra el sistema de distribución de muestras de la Figura 5b junto con un emisor de luz y un detector, en una vista en sección, adecuado para evaluar los cambios de absorbancia de la luz de la muestra.

Figura 7b: muestra el sistema de distribución de muestras de la Figura 5b junto con un medio detector configurado para evaluar cambios en la señal de fluorescencia de un rotor molecular añadido a la muestra o para evaluar la turbidez del fluido de muestra suministrado.

Figura 8: muestra distintos rotores moleculares y su estructura molecular.

Figura 9: gráfico que muestra la evaluación esquemática de los resultados de coagulación con los controles de calidad positiva y negativa instalados.

Figura 10: muestra el espectro óptico de sangre total de 500 a 700 nm.

Figura 11: gráfico que muestra el progreso de una reacción de coagulación sanguínea iniciada con Thromborel S® y controlada a 600 nm.

Figura 12: diagrama de bloques simplificado de un ejemplo de medidor para su uso en un método de la invención.

Figura 13: muestra la influencia de los fallos de registro durante el proceso de laminación sobre el volumen de la muestra del elemento de prueba y la parte superior respectivamente, en una vista en sección de una realización alternativa, que permite mayores tolerancias para el registro de base y la capa de recubrimiento sin comprometer la calidad de la tira de prueba.

Figura 14: muestra las etapas de producción de los elementos de ensayo de la coagulación en forma de tiras.

Descripción detallada de la invención

Como se muestra en la Figura 1 y en la Figura 2, la tira de prueba de coagulación 1 de la presente invención es una disposición multicapa que comprende una capa base 2, una capa central 3 que recubre la capa base 2 y una capa superior 4 que recubre la capa central 3. La capa central 3 presenta una discontinuidad 5, que crea una cavidad hueca en conjunto con la capa base 2 y la capa superior 4. Dentro de dicha cavidad se encuentra un sistema de distribución de muestras 6 que está conectado a una zona de aplicación de muestras 9 localizada a un lado de la tira de prueba de coagulación. La zona de aplicación de muestras 9 como interfaz con el usuario se forma preferentemente como una curva convexa 10 que se extiende desde un lado mayor de la tira de prueba de coagulación para facilitar la aplicación de la muestra. Frente a la zona de aplicación de muestras 9, 10 en el segundo lado mayor de la tira de prueba de coagulación se localiza un venteo de aire 11 que permite el desplazamiento del aire mientras se distribuye el fluido fisiológico o acuoso hacia las zonas predeterminadas de detección 6a, 6'a (véase la Figura 3). Se puede observar que la construcción necesita sólo de un venteo de aire independientemente de la cantidad de zonas de detección predeterminadas utilizadas dentro del elemento de prueba de coagulación. Los elementos descritos del sistema de distribución de muestras con las zonas de alta energía superficial, zona de aplicación de muestras, venteo de aire, capa central y discontinuidad en la capa central forman la totalidad del elemento de prueba de coagulación, lo que crea la acción capilar intrínseca para llevar a cabo la distribución del fluido fisiológico o acuoso aplicado a las zonas de detección predeterminadas.

Además, la tira de prueba de coagulación 1 posee características de registro 7, 8 que sirven para diferenciar entre varios tipos de tiras de prueba con el fin de determinar distintos parámetros, tales como el Tiempo de Protrombina (PT) y el Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado (APTT). Por este medio se pueden dar instrucciones a un medidor multianalito para que ponga en marcha un programa especial o procedimientos que requieren parámetros seleccionables con la inserción de la tira para la determinación de distintos parámetros. Tal como se ilustra en la Figura 3, que representa la disposición multicapa de las Figuras 1 y 2 en una vista despiezada, la capa base 2 proporciona una primera superficie 2a, y la capa superior 4 proporciona una segunda superficie 4a. La primera superficie 2a y la segunda superficie 4a están estampadas con zonas que crearán el sistema de distribución de muestras 6. El patrón del sistema de distribución de muestras 6 comprende un número predeterminado de zonas de detección 6a y de vías de muestra 6b, que están alineadas y se presentan de forma mayoritariamente congruente al ensamblaje de la disposición multicapa. La capa central 3 define la distancia entre la primera superficie 2a de la capa base 2 y la segunda superficie 4a de la capa superior 4 y tiene una discontinuidad 5 para formar una cavidad hueca en conjunto con la primera superficie 2a de la capa base 2 y la segunda superficie 4a de la capa superior 4. El sistema de distribución de muestras 6 que se formará entre la primera superficie 2a y la segunda superficie 4a se localiza dentro de la cavidad creada por la discontinuidad 5 de la capa central 3 y la primera superficie 2a de la capa base 2 y la segunda superficie 4a de la capa superior 4. Preferentemente, la cavidad hueca es a propósito sustancialmente más grande que el sistema de distribución de muestras.

Como el propósito de la discontinuidad 5 de la capa central es sólo crear una cavidad para el sistema de distribución de muestras 6, la discontinuidad 5 de la capa central 3 puede tener distintas formas; se muestran ejemplos de las mismas en la Figura 4. La Figura 4a muestra una cavidad para el elemento de prueba de coagulación en forma de paraguas 12. La Figura 4b muestra una cavidad para el elemento de prueba de coagulación de forma rectangular 14, y en la Figura 4c la cavidad de muestra 14 tiene forma circular. La discontinuidad 5 de la capa central 3 no influye en el tamaño de las zonas de detección predeterminadas 6a ni en el tamaño de las vías 6b del sistema de distribución de muestras 6 y, por tanto, no influye o cambia el volumen de muestra necesario. En comparación con el sistema de distribución de muestras 6, las formas de las cavidades mostradas en la Figura 4 son más bien sencillas, permitiendo así la aplicación de herramientas de perforación sencillas y de procesamiento rápido con menos exigencia con respecto a la exactitud de registro.

El sistema de distribución de muestras 6 localizado en la cavidad formada por la discontinuidad 5 de la capa central 3 y la primera superficie 2a de la capa base 2 así como la segunda superficie 4a de la capa superior 4 se forma mediante la creación de zonas de alta y baja energía superficial sobre dichas superficies 2a y 4a. Las zonas de alta y baja energía superficial sobre la primera superficie 2a de la capa base 2 y la segunda superficie 4a de la capa superior 4 están alineadas y se presentan principalmente congruentes entre sí. Debido a que el fluido fisiológico aplicado, o cualquier otra muestra acuosa aplicada, está humidificando solamente las zonas de alta energía superficial, se ve forzado, por tanto, dentro de las vías de flujo predeterminadas 6b y las zonas de detección 6a del sistema de distribución de muestras 6 y entre la primera superficie 2a de la capa base 2 y la segunda superficie 4a de la capa superior 4.

La Figura 5a muestra una construcción del sistema de distribución de muestras 6 utilizando "elementos de guiado" hidrofóbicos. En esta realización del elemento de prueba de coagulación de la presente invención, la capa base 2 y la capa superior 4 están recubiertas por una capa hidrofóbica 16, excepto las zonas que formarán las vías de muestras y las zonas de detección. La capa hidrofóbica 16 crea una zona de baja energía superficial, que ejercerá una fuerza repelente sobre un fluido de muestra aplicado 15 y forzará al fluido de muestra 15, por tanto, hacia las zonas de alta energía superficial que formarán el sistema de distribución de muestras 6.

Preferentemente, la capa hidrofóbica se aplica sobre una superficie hidrofílica que es humectable por el fluido fisiológico o acuoso. El procedimiento descrito anteriormente requiere una superficie hidrofílica que se puede producir mediante un polímero hidrofílico natural, tal como celofán o vidrio, así como a partir de superficies hidrofóbicas de polímeros comunes (se dan ejemplos más abajo), convirtiendo la superficie hidrofóbica en hidrofílica por medio de un proceso de recubrimiento o por una deposición física o química de un plasma de monómeros hidrofílicos que se pueden evaporar al vacío, por ejemplo dióxido de silicio, óxido de etileno, etilenglicol, pirrol o ácido acrílico. Posteriormente, el modelo de "elementos de guiado" se puede realizar imprimiendo tinta hidrofóbica sobre las superficies hidrofílicas de las capas base y superior.

Una tinta hidrofóbica adecuada tendrá ángulos de contacto con el agua típicos de más de 100º y una energía superficial típica de menos de 25 mN/m y contendrá típicamente monómeros, oligómeros y polímeros con funciones hidrofóbicas, aditivos de hidrofobización o pigmentos y cargas hidrofóbicos.

La Figura 5b muestra otra construcción del sistema de distribución de muestras por medio de vías hidrofílicas. En esta realización del elemento de prueba de coagulación, la capa base 2 y la capa superior 4 están recubiertas por una capa hidrofílica 17, creando así zonas de alta energía superficial.

La capa hidrofílica 17 impresa en la superficie hidrofóbica es altamente humectable por un fluido fisiológico o acuoso; por tanto, las zonas de alta energía superficial que crean las vías hidrofílicas del sistema de distribución de muestras ejercerán una fuerza capilar positiva sobre el fluido fisiológico o acuoso de muestra aplicado, transportando el fluido de muestra hacia las zonas de detección individuales.

La capa hidrofílica 17 se puede realizar mediante la impresión de agentes hidrofílicos o anfifílicos sobre una superficie hidrofóbica. Las tintas con funciones hidrofílicas se pueden elaborar a partir de una amplia selección de polímeros solubles en agua y en alcohol de alto peso molecular y mezclas de los mismos. Son particularmente útiles los derivados preparados a partir de alginatos, celulosa, hidroxietilcelulosa, gomas, polialcoholes, polietilenglicoles, óxidos de polietileno, vinilpirolidona, sulfonatos de poliestireno, polisulfonatos, derivados de alquilfosfocolina y otros; son también particularmente útiles los acrilatos de silicona órgano-modificados, que son una especie reticulable de polisiloxanos órgano-modificados y agentes tensioactivos fluorados. Los recubrimientos apropiados proporcionan un ángulo de contacto con el agua típico inferior a 35º y una energía superficial típica superior a 50 mN/m.

La capa base y la capa superior adecuadas como sustrato para el proceso de impresión pueden estar formadas con un material de tipo vidrio, acetato de polivinilo, metacrilato de polimetilo, polidimetilsiloxano, poliésteres y resinas de poliéster que contienen anillos fluoreno, poliestirenos, policarbonatos y copolímeros injertados policarbonato-poliestireno, policarbonatos terminal modificados, poliolefinas, cicloolefinas y copolímeros de cicloolefinas y/o copolímeros de olefina-maleimida.

En caso de que el sustrato tenga un carácter hidrofóbico intermedio, también es posible la impresión de las vías hidrofílicas con un modelo hidrofóbico circundante, es decir, una combinación de las construcciones de la Figura 5a y la Figura 5b.

Además, es posible elevar físicamente las zonas de alta energía superficial de la primera y segunda superficies desde las zonas de baja energía superficial mediante grabado, estampado o simplemente por impresión de la capa hidrofílica con un espesor incrementado en tres a cinco veces sobre las superficies primera y segunda. Debido a esta elevación, el espacio capilar de las vías hidrofílicas se reduce con respecto a la zona circundante y ejerce una fuerza capilar mayor sobre el líquido de muestra.

La exigencia en volumen para el sistema de distribución de muestras contenido en el elemento de prueba de coagulación de la realización preferente se encuentra aproximadamente en 0,5 \mul-1,0 \mul, muy pequeño, y requiere sólo aproximadamente 100 nl-150 nl por zona de detección, estén creadas las zonas de alta y baja energía superficial por elementos de guiado hidrofóbico o por vías hidrofílicas o por una combinación de ambos. Sin embargo, es evidente para el especialista en la técnica que el volumen del sistema de distribución de muestras variará según los diversos diseños y según el número de zonas de detección predeterminadas empleadas.

La Figura 6 muestra distintos modelos del sistema de distribución de muestras, que pueden estar compuestos por vías hidrofílicas, tal como se ilustra en la Figura 5b, o por "elementos de guiado" hidrofóbicos, tal como se ilustra en la Figura 5a, o por una combinación de vías hidrofílicas y elementos de guiado hidrofóbicos. El sistema de distribución de muestras seleccionado debe ser apropiado para el parámetro fisiológico seleccionado a evaluar y para la química de detección empleada.

Así, es posible repetir las mediciones del estándar y de muestras para muestras particulares de suero y sangre total con las realizaciones mostradas en las filas II a IV. Del mismo modo, es posible utilizar el elemento de prueba de coagulación proporcionado en la fila IV para al evaluación de dos parámetros de coagulación, tal como el Tiempo de Protrombina y el Tiempo de Trombina Parcial Activado.

Tal como se establece anteriormente, la formación de un coágulo de fibrina depende de la reacción entre la tromboplastina y los iones calcio que reaccionan con la sangre, como se muestra más abajo:

(Reacción 1)Tromboplastina + Ca^{++} + Sangre (o Plasma) \rightarrow Coágulo de fibrina

Para que tenga lugar la Reacción (1), las zonas de detección 6'a del sistema de distribución de muestras 6 de la primera superficie 2a de la capa base 2 o de la segunda superficie 4a de la capa superior 4 se caracterizan porque están recubiertas con las formulaciones 18, 19, tal como se muestra en las Fig. 5a y 5b, lo que permite la potenciación y detección de una reacción de coagulación en una muestra de sangre.

En una realización del elemento de prueba de la invención, la formulación 18 contiene un reactivo estimulante de la coagulación, tal como tromboplastina (por ejemplo, de Dade Behring Holding GmbH, Höchster Strasse 70, 65835 Liederbach, Alemania), mientras que la formulación 9 contiene iones calcio. El reactivo estimulante de la coagulación es un promotor para la coagulación sanguínea en una zona de detección, permitiendo así la detección de las propiedades ópticas mediante fotometría de transmisión o absorbancia o difusión de luz.

El Tiempo de Protrombina o el Tiempo de Trombina Parcial Activado pueden ser controlados mediante el cambio de absorbancia de la luz o de difusión de la luz. Durante el proceso de coagulación, el fibrinógeno se convierte en fibrina, que fuerza la distribución previamente arbitraria de los glóbulos rojos y plaquetas en una etapa básicamente asociada, con lo cual los glóbulos rojos y plaquetas son retenidos y se conectan con las fibras de fibrina y entre sí mientras se forma el coágulo de sangre. Estos cambios en la consistencia física de la muestra de sangre conducen a una reducción de los centros de dispersión y, por tanto, a un cambio en la absorbancia de luz y en la turbidez de la muestra de sangre examinada. Para la evaluación de los cambios de absorbancia de luz es apropiado el detector representado en la Figura 7a.

La Figura 7a muestra un detector para medir la densidad óptica de la muestra dentro del elemento de prueba de coagulación según la Figura 5b. El detector incluye una fuente de luz 20, que emite una luz 24 de cierta longitud de onda en dirección a la zona de detección de muestras. La luz emitida desde la fuente de luz 20 pasa por una disposición óptica 21, por ejemplo un difusor o una lente, y por una abertura 22, por la capa base 2, por la muestra 15 y por la capa superior 4 de la zona de detección y es detectada en el lado opuesto del dispositivo con un medio detector 23.

El elemento de prueba de coagulación está diseñado para realizar más de una determinación, con el fin de proporcionar medidas adicionales de control de calidad. En este caso, el elemento de prueba de coagulación proporciona al menos dos, preferentemente tres, zonas de detección de coagulación. Preferentemente, todas las zonas de detección 6'a en la primera superficie 2a están recubiertas del reactivo estimulante de la coagulación 18 (por ejemplo trombina), el cual potencia la reacción entre los componentes químicos para generar un coágulo de fibrina, mientras que una zona de detección de muestras, por ejemplo la 6a2, de la segunda superficie 4a está recubierta de una formulación química que contiene un acelerador de la coagulación, que potencia una coagulación rápida y completa (control positivo), y otra zona de detección, por ejemplo la 6a3, de la segunda superficie 4a está provista de una formulación química que contiene un inhibidor de la coagulación, que suprime la coagulación de la sangre (control negativo).

Para que tenga lugar la Reacción (1), las cantidades de tromboplastina, iones calcio y, si fuera necesario, las formulaciones de control de calidad, tal como un inhibidor o un acelerador de la coagulación, se dosifican con precisión en dichas zonas de detección de muestras. Preferentemente, la dosificación se lleva a cabo mediante métodos de deposición de gotas según demanda, aunque los especialistas en la técnica conocen otras técnicas, tales como impresión por chorro de tinta. La dosificación exacta de reactivo estimulante de la coagulación aplicado a las zonas de detección de muestras es crítica para un procedimiento adecuado de la reacción y, por tanto, para un cálculo fiable del punto final de una reacción de coagulación. Por ejemplo, en un ejemplo de realización, la cantidad de tromboplastina puede ser constante para cada una de las zonas de detección de muestra, mientras que puede variar la concentración de inhibidor de coagulación, por ejemplo EDTA.

En otra realización del elemento de prueba de la invención, además de la dosificación de tromboplastina, iones calcio y formulaciones de control de calidad, tal como un inhibidor o un acelerador de la coagulación, se puede aplicar otro componente que ayude a la detección de fluorescencia, en las zonas de detección de muestras de la primera y/o la segunda superficie(s) 2a, 4a. Si dichas zonas de detección se suministran con los llamados rotores moleculares fluorescentes, la reacción de coagulación se puede controlar mediante fluorescencia.

La fluorescencia es la emisión de luz procedente de cualquier sustancia y tiene lugar desde el primer estado excitado de una molécula. En el proceso de inicialización, dicha molécula es excitada por la absorción de luz. Durante los siguientes pocos nanosegundos, la molécula vuelve a su estado fundamental y se libra de su energía de excitación emitiendo luz -llamada fluorescencia- o mediante movimientos y rotaciones de su estructura molecular.

La fluorescencia se produce típicamente en moléculas aromáticas. Las moléculas aromáticas que absorben luz visible en el rango entre 400 y 800 nm aparece coloreadas. Además, un cromóforo es la parte de un tinte que determina las propiedades de absorción y emisión de la molécula total. La cantidad o la intensidad de emisión de un cromóforo específico se cuantifica por su rendimiento cuántico de fluorescencia. El rendimiento cuántico de fluorescencia se define como el número de fotones emitidos con respecto al número de fotones absorbidos. Un amplio rango de tintes fluorescentes comúnmente utilizados tienen un rendimiento cuántico fijo, por lo que todos los tintes de altos rendimientos cuánticos, que se aproximan al 100% de eficacia de emisión, muestran emisiones más luminosas, tal como Sulforhodamine 101, también conocido por Rojo Texas.

Los tintes que llevan grupos flexibles al final de su cromóforo se conocen como rotores moleculares y su rendimiento cuántico de fluorescencia depende de la viscosidad del disolvente. Cuanto mayor es la viscosidad del disolvente, mayor es el rendimiento cuántico de fluorescencia de aquellos tintes. Este efecto se puede atribuir a la movilidad de los grupos flexibles no rígidos al final del cromóforo, que se ve reducida por el aumento de viscosidad. Cuanta más impedida es la movilidad de los grupos laterales unidos al cromóforo, menos puede relajarse la molécula de tinte a su estado fundamental a través de movimientos de su esqueleto molecular y se deshace de su energía de excitación emitiendo luz. Ejemplos de tintes fluorescentes sensibles a la viscosidad del disolvente se pueden encontrar en las clases de tintes de xanteno, oxazina y carbopironina.

El efecto se puede atribuir a la movilidad de los grupos dietilamino, que se reduce al aumentar la viscosidad. Un ejemplo de tinte de este tipo en la clase del xanteno es rodamina B, cuya estructura química se muestra a continuación:

2

La estructura química inferior muestra, a modo de ejemplo, la movilidad de los grupos dietilamino, que se ve posteriormente reducida por el contacto con los reactivos de la Reacción 1. Debido a que los reactivos conducen a la formación de un coágulo de fibrina, es decir la coagulación de un fluido fisiológico, la viscosidad de la muestra aumenta y con ello la fluorescencia de las moléculas. Los grupos dietilamino marcados al final del cromóforo son no rígidos y giran como marcados alrededor del enlace. Como este movimiento está fuertemente impedido por el aumento de viscosidad debido a la coagulación, la emisión de fluorescencia del tinte se incrementa.

3

Con respecto a la invención descrita, las sondas de fluorescencia sensibles a los cambios de viscosidad son las más útiles. Otros ejemplos de rotores moleculares son Auramina O., violeta Cristal 4, p-N,N-dimetilaminobenzonitrilo 5, p-N,N-dimetilaminobenzonitrilo 6, Julolidinabenzilidenomalononitrilo, rodamina 19, rodamina G6, rodamina B, oxazina 1, oxazina 4, oxazina 170. Se muestran en la Figura 8 sus estructuras moleculares.

En caso de que la reacción sea controlada por fluorescencia, resulta más útil disponer la fuente de luz y el medio de detección no enfrente uno de otro sino más bien en un ángulo de aproximadamente 90 grados para lograr la máxima sensibilidad, como se muestra en la Figura 7b. El ángulo preferente entre la fuente de luz y el medio de detección oscila entre 80 y 120 grados, pero es preferente que sea de aproximadamente 109 grados y que el sistema de prueba de coagulación esté colocado en la disposición de detección óptica de modo tal que el ángulo entre la capa base y la fuente de luz y el ángulo entre la capa superior y el medio de detección sea de aproximadamente 54 grados, para evitar el ruido de fondo debido a reflexiones internas en las distintas superficies de la zona de detección (o de forma más general del sistema de prueba de coagulación). Para una operación total, dicho detector 23 está configurado, además de la disposición óptica 21 y 22, con los filtros ópticos 21a y 22a, para discriminar entre la longitud de onda de excitación y de emisión y, por ello, el medio de detección sólo verá la luz 24 procedente de los tintes de fluorescencia y no la luz 24a originada por la fuente de luz. Un especialista en la técnica sabrá si es necesario optimizar el ángulo actual para una aplicación específica, la sensibilidad necesaria y los requisitos del medidor con respecto al dispositivo de detección.

El elemento de ensayo de coagulación 1 tiene al menos una zona de detección 6a que es necesaria para la medida exacta del tiempo de protrombina, pero en una realización preferente se pueden utilizar tres zonas de detección 6a1 a 6a3. La composición física del elemento de prueba de coagulación 1 permite cierta flexibilidad en la composición de los compuestos aplicados sobre varias zonas de detección. Por ejemplo, las zonas de detección 6a-6c pueden tener distintas concentraciones de reactivo estimulante de coagulación, tal como tromboplastina, aplicadas sobre una primera superficie 2a de una capa base 2, mientras los iones calcio y el rotor molecular fluorescente se pueden aplicar sobre una segunda superficie 4a de una capa superior 4. Como alternativa, todos los reactivos se pueden aplicar sobre la primera superficie 2a de la capa base 2 o sobre la segunda superficie 4a de la capa superior 4 del elemento de prueba de coagulación 1.

Tras aplicar el fluido fisiológico, tal como sangre o plasma, sobre la zona de aplicación de muestras 9 y distribuirse en las zonas de detección por la acción capilar, éste disuelve el reactivo estimulante de la coagulación contenido en la formulación 18 sobre las zonas de detección de la primera superficie 2a así como el rotor molecular y/o un inhibidor de la coagulación potencial, tal como EDTA, contenido en la formulación 19, sobre las zonas de detección predeterminadas de la segunda superficie 4a, formando una mezcla de sangre o plasma con el reactivo estimulante de la coagulación, tal como tromboplastina, y con los iones calcio más los materiales adicionales proporcionados en la segunda superficie.

Preferentemente, los reactivos estimulantes de la coagulación aplicados sobre las zonas de detección predeterminadas son fácilmente solubles en un fluido fisiológico como la sangre y se posicionan uno cerca del otro para permitir una rápida mezcla difusiva de todos los componentes, permitiendo así una reacción rápida de los componentes contenidos en las zonas de detección con el fin de acelerar la determinación fotométrica rápida de la reacción de coagulación en formación.

Cuando existen más de dos, preferentemente tres, zonas de detección de muestras dispuestas dentro del sistema de distribución de muestras, se puede utilizar una, por ejemplo 6a1, para detectar el Tiempo de Protrombina o el Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado. Se puede configurar una zona adicional de detección de muestras, por ejemplo 6a2, para proporcionar un control negativo por medio de un inhibidor de la coagulación sobre la segunda superficie 4a u omitir el agente estimulante de la coagulación en la primera superficie 2a, con lo cual se puede configurar otra zona de detección de muestras, por ejemplo 6a3, para proporcionar un control positivo gracias a un acelerador de la coagulación, por ejemplo un agente gelificante que imita la coagulación de la sangre incluso cuando ésta tiene un defecto de coagulación. Así, el medio de procesamiento del dispositivo de medición puede comparar el resultado de la medición de la muestra con los dos estándares proporcionados, permitiendo una decisión clara o la indicación de una medición errónea.

La Figura 9 muestra una evaluación esquemática y la medición del tiempo de coagulación por medio de un rotor molecular como sonda de fluorescencia y ayuda para la detección. La figura muestra también la comparación de la señal de medición relacionada con la muestra de sangre 27 con un estándar positivo 26, proporcionando la máxima fluorescencia obtenible después de la formación completa del coágulo de sangre, y la comparación con un estándar negativo 25, proporcionando la mínima señal de fluorescencia relacionada con una muestra de sangre no coagulada. Después de la aplicación de la muestra de sangre total sobre la zona de aplicación de muestras 9, la muestra de sangre 15 es transportada por la acción capilar creada por el sistema de distribución de muestras hacia las distintas zonas de detección de muestras 6a/6'a mostradas en la Figura 3. La muestra disolverá el reactivo estimulante de la coagulación, proporcionado en la primera superficie 2a de la capa base 2, permitiendo que la reacción de coagulación empiece inmediatamente después de haberse llenado la zona de detección de muestras 6'a1. La unidad de detección del dispositivo de medición registrará la introducción de la muestra de sangre y, así, el medio de procesamiento del dispositivo de detección puede iniciarse para permitir una evaluación del tiempo resuelto de reacción de la coagulación.

Tal como se ha mencionado anteriormente, se puede configurar una zona de detección de muestras, por ejemplo 6a2, como estándar negativo, proporcionando el medio de comparación de la señal de medición de la muestra de sangre en la zona de detección de muestras 6a1 con la señal de medición de una muestra de sangre que no muestra ninguna reacción de coagulación. Este comportamiento se puede lograr por la deposición de un reactivo estimulante de la no coagulación en la zona de detección de muestras 6'a2 o por la deposición de un inhibidor de la coagulación sobre la zona de detección de muestras 6a2. Inhibidores de la coagulación típicos son heparina de litio y sodio con respecto a la sal de potasio de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA).

Por otra parte, se puede obtener un estándar positivo mediante la aceleración de la reacción de coagulación o imitando la viscosidad de un coágulo de sangre totalmente formado con un agente reticulante diferente, que proporciona un tiempo de reacción más rápido que una muestra de sangre patógena, y así el valor positivo de referencia se obtiene antes de que se coagule la muestra de sangre en la zona de detección 6a1. Este tipo de reticulación se puede lograr proporcionando la concentración correcta de alginato en la segunda superficie 4a de la segunda capa 4. El alginato se mezclará con la sangre y empezará a gelificarse, respectivamente coagularse, debido a la reacción con los iones calcio dentro de la muestra de sangre y/o a iones calcio adicionales proporcionados en la primera superficie de la capa base. Sin embargo, un especialista en la técnica reconocerá que también se pueden aplicar otros agentes gelificantes que sean útiles para esta reacción.

Durante las reacciones, el medio de procesamiento del dispositivo de medición puede comparar la lectura de la zona de detección de muestras 6a1 con el estándar negativo 25 y el estándar positivo 26. En cuanto la señal de medición de la muestra de sangre proporcionada por la zona de detección de muestras 6a1 alcanza la misma magnitud que el estándar positivo (indicado con el número 28 en la Figura 9), una unidad de procesamiento del dispositivo de medición puede parar el contador y evaluar el resultado final. Además, la unidad de procesamiento puede realizar algunas comprobaciones adicionales de calidad para verificar que el análisis se realizó correctamente y proporcionar datos significativos al usuario/paciente. A este respecto, la unidad de procesamiento puede comparar los valores de medida actuales de los estándares positivo y negativo, que necesitan separarse en un valor mínimo y un valor preprogramado. Si la amplitud de ambas señales se reduce demasiado, el dispositivo puede emitir un mensaje de error, indicando que la determinación no ha tenido éxito. Además, el dispositivo puede calcular la pendiente 27 de la reacción de coagulación y compararla de nuevo con algunos valores fisiológicos preprogramados, los cuales describen los valores más extremos observados por los facultativos.

Mientras se controla la turbidez de la muestra en un amplio rango del especto, por ejemplo utilizando una lámpara halógena como fuente luminosa, es útil limitar la ventana de control a una parte estrecha del espectro cuando los cambios de muestras son controlados mediante la absorbancia de la luz. La Figura 10 muestra un espectro de sangre total entre 500 y 700 nm. La característica predominante del espectro es el doble pico de hemoglobina 40 entre 520 y 600 nm. Principalmente, se puede evaluar que el progreso de la reacción de coagulación por absorción de luz en cualquier parte en la región proporcionada del espectro de sangre total es más sencillo en el dispositivo de medición técnica cuando la reacción es controlada a una longitud de onda fuera del rango de absorbancia de la hemoglobina, es decir 600 nm, tal como lo indica el número 41.

La Figura 11 proporciona un ejemplo de evaluación de la reacción de coagulación por absorción de luz a 600 nm. Se introduce sangre en el elemento de prueba de coagulación por el orificio de aplicación de muestras 9 y la transmisión de luz se reduce rápidamente con respecto a la absorbancia de luz, que aumenta rápidamente tal como se indica con el número 42. Posteriormente, la formulación de coagulación proporcionada en las zonas de detección de muestras 6'a de la primera superficie 2a de la capa base 2 se disuelve y la reacción de coagulación es iniciada por la reacción del factor del tejido (tromboplastina del tejido) con la muestra de sangre o de plasma. Este punto en el tiempo se define como t=0 y la unidad de procesamiento empezará el registro de los datos de medición. El período de tiempo entre los eventos 42 y 43 se puede entender como una fase de demora de la reacción, aquí se consigue la disolución total de los reactivos y su mezcla con la muestra de sangre o de plasma y la tromboplastina del tejido activa una serie de factores de coagulación de la vía extrínseca. Véase en la secuencia la activación del factor VII, factor X, factor V y factor II. Las últimas etapas de la cascada de coagulación se pueden controlar entre los eventos 43 y 44, donde el fibrinógeno se transforma en fibrina. A menudo, el coágulo de fibrina no es estable y empieza a deteriorarse después de haber alcanzado la meseta 44. La velocidad de deterioro y la cantidad dependen de la cantidad de fibras de fibrina del coágulo y varía de un paciente a otro. Normalmente, las muestras de sangre de alta viscosidad muestran un deterioro más lento que las muestras de sangre de baja viscosidad.

Generalmente, el resultado de la medición y el resultado del Tiempo de Protrombina de acuerdo con el ejemplo anterior deben evaluarse entre los eventos 42 y 43, indicando el período de tiempo t_{1} y entre los eventos 43 y 44, indicando el período de tiempo t_{2}, en la siguiente ecuación general 1:

4

Los factores a y b son necesarios para dar un peso proporcional a los períodos de tiempo t_{1} y t_{2}, que contribuyen siempre en distintas proporciones al resultado PT dado por f_{PT}. Así, t_{1} está más influenciado por el tipo de ingredientes inertes de la formulación de coagulación que rige la disolución del factor del tejido, t_{2} está principalmente influenciado por la actividad del factor mismo del tejido aplicado y la concentración de iones calcio. Además, ambos períodos de tiempo t_{1} y t_{2} son modulados por la temperatura de reacción, que se establecería idealmente en, o sería cercana a, 37ºC, regímenes de temperaturas más bajas prolongarían el tiempo de coagulación. Sin embargo, para dispositivos manuales, se tendrá que encontrar siempre la mejor solución entre la portabilidad, consumo de energía y rendimiento en laboratorio.

\newpage

La Figura 12 muestra un diagrama de bloques simplificado de un medidor 80 para su uso en conjunto con la presente invención. El medidor 80 se puede diseñar alrededor de una unidad de procesamiento, tal como el microcontrolador MAXQ2000 (disponible de Dallas Semiconductor Corporation, 4401 South Beltwood Parkway, Dallas, Texas, USA). La unidad de procesamiento 81 puede atender las siguientes funciones de control: (1) temporización del sistema completo; (2) procesamiento de los datos procedentes del medio de detección de luz; (3) cálculo del tiempo PT procedente de los datos medidos; y (4) cálculo del tiempo PT o del valor INR en un medio de visualización 83. Un circuito de memoria puede almacenar los datos así como el programa operativo de la unidad de procesamiento. El medio de visualización 83 puede adoptar varias formas, tales como cristal líquido o pantalla LED. El medidor 80 puede incluir asimismo un conmutador de arranque-parada y puede proporcionar una salida de tiempo audible o visible para indicar el momento de aplicar las muestras, tomar las lecturas, etc., si se desea.

La unidad de procesamiento 81 se puede programar con un software de forma que pueda realizar, junto con el medidor 80, una medición de la coagulación. La luz emitida desde la fuente luminosa 20 pasa por una disposición óptica 21 y es detectada por un medio de detección 23. El software programado dentro de la unidad de procesamiento 81 puede contener además un algoritmo para calcular el tiempo de coagulación como Coeficiente Internacional Normalizado, formulado a mediados de los años 80, para estandardizar los valores PT, de modo tal que los resultados de las distintas tromboplastinas y analizadores de coagulación sean equivalentes. La expresión se presenta a continuación como:

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donde ISI es el Índice Internacional de Sensibilidad, PT_{paciente} es el tiempo para la coagulación de una muestra de sangre procedente de un paciente, PT_{medio-normal} es el tiempo PT medio para alrededor de 20 individuos. El valor ISI es dado por los distintos fabricantes de tromboplastina.

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El método de utilización del elemento de prueba de coagulación 1 de la presente invención se puede entender con referencia al diagrama de bloques de un medidor que se muestra en la Figura 12. El usuario inserta un elemento de prueba de coagulación 1 en un porta-tiras 82 de un medidor 80 que se activa automáticamente mediante la activación de un conmutador "pulsador" que se puede integrar en el mismo. Las características de presentación diseñadas en el elemento 1 encajan con las características de presentación en el porta-tiras 82 para asegurar que el elemento 1 esté colocado en una posición correcta. Dicho emplazamiento correcto del elemento es de suma importancia para asegurar la operación del medidor 80 combinado con la tira 1. Opcionalmente, el medidor 80 puede ser activado por un usuario apretando un conmutador. En consecuencia, el usuario realiza una punción digital y aplica sangre total a la zona de aplicación 9 del elemento de prueba de coagulación insertado 1.

El volumen de sangre necesario para realizar una prueba de la presente invención es del orden de 1 \mul. Como el agente hidrofílico impreso en la superficie hidrofóbica es altamente humectable por un fluido fisiológico o acuoso, las zonas de alta energía superficial que crean las vías hidrofílicas del sistema de distribución de muestras ejercerá una fuerza capilar positiva sobre el fluido de muestra fisiológica aplicado, transportando el fluido de muestra hacia las zonas de detección individuales. Por tanto, la muestra fisiológica se distribuirá rápidamente hacia cada zona de detección de muestras (6a-c) y activará los reactivos estimulantes de coagulación de su interior.

A continuación, empieza a contar el tiempo de prueba de coagulación, ya que el reactivo de las zonas de detección 6a-6c ayuda en el proceso de coagulación permitiendo que tenga lugar la coagulación y que se procesen las propiedades ópticas, proporcionando el momento en que ha tenido lugar la coagulación.

Método de preparación del elemento de prueba de la coagulación

El elemento de prueba de la coagulación de la presente invención, que se produce preferentemente en forma de tira, puede prepararse fácilmente mediante procesos conocidos por los especialistas en la técnica de la impresión, estampado y laminación. El diseño del elemento de prueba de coagulación permite un proceso de producción sencillo y rentable, que preferentemente, pero no forzosamente, es de naturaleza continua.

En una primera etapa del método de preparación, se forma un patrón del sistema de distribución de muestras 6 mediante la creación de zonas de alta y baja energía superficial en un sustrato. En una primera realización, las zonas de alta energía superficial que forman las vías de muestra 6b y las zonas de detección 6a, 6'a en la primera y segunda superficies 2a, 4a se crean mediante la aplicación de una formulación hidrofílica sobre una superficie hidrofóbica de un sustrato. Tal como se detalló anteriormente, es posible también crear zonas de alta y baja energía superficial mediante la aplicación de un patrón de "elementos de guiado" hidrofóbicos en una superficie hidrofílica. En el caso preferente, el sustrato tiene un carácter hidrofóbico intermedio típico de las películas poliméricas transparentes comerciales, donde las zonas de alta y baja energía superficial del sistema de distribución de muestras y de las zonas de detección de muestras se crean mediante la impresión de las vías hidrofílicas debajo de, o rodeadas por, el modelo hidrofóbico de los elementos de guiado hidrofóbicos.

El material puede estar formado de un material de tipo vidrio, acetato de polivinilo, metacrilato de polimetilo, polidimetilsiloxano, poliestirenos, poliésteres y resinas de poliéster que contienen anillos fluoreno, policarbonatos y copolímeros injertados policarbonato-poliestireno, policarbonatos terminal modificados, poliolefinas, cicloolefinas y copolímeros de cicloolefinas y/o copolímeros de olefina-maleimida.

La aplicación de un patrón hidrofílico en un sustrato hidrofóbico y/o la aplicación de "elementos de guiado" hidrofóbicos en un sustrato hidrofílico o cualquier combinación de los mismos se puede llevar a cabo mediante flexografía, litografía, grabado, método de revestimiento con tinta sólida o procesos de impresión por chorro de tinta.

Sin embargo, el método de fabricación preferente es flexografía, que permite una impresión de alta resolución en prensas rotativas y soporta una producción a alta velocidad. Es una tecnología establecida para imprimir sobre sustratos de películas poliméricas y se utiliza ampliamente en la industria de los envases. El proceso de detección óptica mostrado en las Figuras 8a y 8b requiere tinta transparente y clara de baja viscosidad para el modelo hidrofílico. Son preferentes tintas poco viscosas para conseguir un recubrimiento fino y uniforme de aproximadamente 2 a 4 micras. La ventana óptica de la tinta debe situarse en el rango de longitud de onda adecuado para la detección óptica de la reacción química. Los requisitos para las tintas hidrofóbicas, aparte de su naturaleza hidrofóbica, son menos exigentes y se podrían utilizar también para decorar el elemento de prueba de coagulación con un color deseado, de forma que son preferentes para esta etapa tintas no transparentes. La operación de una impresora flexográfica de cuatro colores es una práctica establecida y no conlleva problemas operativos. Igual ocurre para el dispositivo de litografía.

Son más convenientes para la preparación del elemento de prueba de coagulación las tintas basadas en disolventes, de cuya gran variedad disponen varios fabricantes. Además, todas dichas tintas disponibles pueden estar finamente unidas con aditivos y pigmentos adicionales para optimizar los parámetros necesarios. Muchas de estas tintas se basan en mezclas de nitrocelulosa con etanol, polivinilbutiral en etanol, y se pueden obtener, por ejemplo, de Sun Chemicals Inc. (35 Waterview Boulevard, Parsippany, NJ, USA) o Flint Ink Inc. (4600 Arrowhead Drive, Ann Arbor, MI, USA).

Aunque las tintas basadas en disolventes o endurecibles por UV son aplicables para preparar el elemento de prueba de coagulación, las tintas endurecibles por haz electrónico (EB) poseen algunas propiedades preferentes. Estas tintas proporcionan una resistencia más elevada a factores mecánicos y químicos y contienen un 100% de polímeros, opcionalmente pigmentos, pero no disolventes orgánicos volátiles ni tampoco fotoiniciadores, que han demostrado afectar a la estabilidad de la química de los sensores. Estas ventajas positivas en las características de rendimiento proceden de la capacidad de los electrones para formar películas poliméricas reticuladas y penetrar en la superficie.

Las tintas utilizadas en el endurecimiento por EB hacen uso de la capacidad de polimerización de los monómeros y oligómeros acrílicos. La química acrílica tiene un significado especial en las tintas actuales (J.T. Kunjappu, "The Emergence of Polyacrylates in Ink Chemistry", Ink World, febrero 1999, p. 40). Se presenta la estructura del compuesto acrílico más sencillo, el ácido acrílico, en la fórmula (I):

(I)CH_{2} = CH-COOH

El doble enlace en la parte acrílica se abre durante la interacción con los electrones (iniciación) y forma un radical libre que actúa sobre otros monómeros formando una cadena (propagación), que conduce a polímeros de alto peso molecular. Tal como se ha mencionado anteriormente, la polimerización inducida por radiación requiere que no haya ningún iniciador externo, ya que la radiación misma genera radicales libres con el resultado de que no permanece ninguna especie iniciadora en el recubrimiento.

Se dispone de una amplia variedad de monómeros acrílicos para el endurecimiento por EB, que varían entre acrilatos simples como acrilato de 2-fenoxietilo y acrilato de isooctilo, y prepolímeros como bisfenol A, epoxiacrilato y acrilatos de poliéster/poliéter (R. Golden, J. Coatings Technol., 69 (1997), p. 83). Esta tecnología de endurecimiento permite diseñar "tintas funcionales" centradas en las propiedades químicas y físicas deseadas sin necesidad de disolventes ni tampoco de una química de endurecimiento, requeridos para otras tintas, lo que puede complicar el proceso de diseño.

Generalmente, las tintas hidrofóbicas adecuadas pueden contener monómeros, oligómeros y prepolímeros con funciones hidrofóbicas, como acrilatos de isooctilo, acrilatos de dodecilo, derivados de estireno o de silicio, sistemas con cadenas carbonadas parcialmente fluoradas y aditivos y/o cargas adicionales de hidrofobización, tales como los agentes de hidrofobización que pertenecen a la Serie TEGO Phobe (TEGO Chemie Service, Essen, Alemania), pigmentos hidrofóbicos como ftalozianos de cobre, carbón, grafito o cargas hidrofóbicas como sílice ahumada modificada con silicio o polvos de PTFE y granulados de PTFE. Debido a la gran variedad de aditivos, pigmentos y cargas, los compuestos sugeridos más arriba tendrán solamente un carácter ilustrativo.

Las tintas con funciones hidrofílicas se pueden obtener a partir de una amplia selección de polímeros solubles en etanol y agua, así como mezclas poliméricas de los mismos. Los polímeros y derivados poliméricos, copolímeros y compuestos basados en alginato, celulosa y éster de celulosa, hidroxietilcelulosa, goma, ácido acrílico, polivinil alcohol, polietilenglicol, óxido de polietileno, vinilpirolidona, sulfonato de poliestireno, poli(metil vinil éter)/ácido maleico), copolímeros vinilpirolidona/trimetilamonio y derivados de alquilfosfocolina son útiles. Además, se pueden optimizar con aditivos de acrilatos de siliconas órgano modificadas, que son una especie reticulable de polisiloxanos órgano modificados, y agentes tensioactivos fluorados. Un recubrimiento típicamente adecuado proporciona un ángulo de contacto con el agua típicamente inferior a 35º y una energía superficial típicamente superior a 50 mN/m.

La segunda etapa del proceso de producción comprende la aplicación de las formulaciones de coagulación, que contienen el reactivo estimulante de la coagulación y agentes adicionales, para producir una tinta imprimible y/o dispensable que forma una capa uniforme dentro de las zonas de detección de muestras.

En una realización preferente, la cantidad de tromboplastina en la primera superficie 2a de la capa base 2 se dosifica con precisión utilizando un método adecuado, tal como impresión por chorro de tinta. Efectivamente, es obvio para los especialistas en la técnica que pueden utilizar otras técnicas de dosificación con el propósito de esta invención.

En todas las zonas de detección de muestras correspondientes de la superficie opuesta se proporcionarán las formulaciones exigidas de control de calidad que contienen la cantidad adecuada de alginato u otro acelerador de la coagulación, EDTA u otros inhibidores de la coagulación, y el rotor molecular fluorescente como ayuda para la detección si es necesario para el régimen anticipado de detección.

Debido a que el nivel de concentración con respecto a la cantidad total de reactivo estimulante de la coagulación aplicado a las zonas de detección de muestras predeterminadas 6'a1 a 6'a3 es responsable de la sensibilidad y del rango dinámico de los diversos elementos de prueba de coagulación expuestos, así como el nivel de concentración y la precisión de los compuestos de control de calidad aplicados son responsables de la exactitud de los resultados de prueba, es sumamente importante que esta aplicación proporcione elementos de prueba de coagulación con una dosificación precisa de los elementos, compuestos e ingredientes anteriores. Dicha dosificación precisa se puede conseguir, por ejemplo, utilizando un sistema microdispensador (disponible de, por ejemplo, Vermes Technik GmbH & Co., KG, Palnkamer Str. 18-20, D-83624 Otterfing, Alemania). Se deben preparar las formulaciones de recubrimiento de forma que sean altamente solubles en el medio de muestra líquido, para permitir una reconstitución rápida y exenta de residuos después de la introducción del fluido de muestra.

La siguiente etapa comprende el procedimiento de laminación, donde la capa base y la capa superior que presentan la primera y la segunda superficies del sistema de distribución de muestras se laminan sobre una capa central, definiendo así una distancia entre la primera y la segunda superficies de la capa base y la capa superior. La capa central proporciona una discontinuidad para crear una cavidad para el sistema de distribución de muestras en las zonas en las que se forma el sistema de distribución de muestras en la primera y la segunda superficies de la capa base y la capa superior. Los modelos de alta y baja energía superficial formados en la primera y la segunda superficies de la capa base y la capa superior deben estar alineados para ser esencialmente congruentes y permitir la formación de un sistema funcional de distribución de muestras entre la primera y la segunda superficies.

El registro xy preciso de la capa base y la capa superior se convierte en una tarea crítica para el funcionamiento del elemento, si este registro no se logra, el sistema de distribución de muestras no funcionará adecuadamente y/o tendrá una mayor variabilidad con respecto al volumen de muestra especificado. Las tolerancias del registro deben encontrarse dentro del límite \pm 5% del ancho de las vías hidrofílicas para obtener un buen rendimiento.

La Figura 13 muestra una vista superior (izquierda) y transversal (derecha) del elemento de prueba de coagulación y del efecto de la calidad de registro. En el caso 13a, el sistema de distribución de muestras está montado adecuadamente con una buena alineación de las vías hidrofílicas de la primera 2a y la segunda 4a superficies. El resultado de un elemento de prueba de coagulación inadecuadamente alineado se muestra en la Figura 13b. Aunque el espaciador entre la capa base 2 y la capa superior 4 es idéntico en el caso 13a y el caso 13b, el volumen de muestra está ampliado equivocadamente en el caso b, ya que el fluido de muestra cubre parcialmente los elementos de guiado hidrofóbicos del sistema de distribución de muestras. El efecto se debe al fluido de muestra dentro del elemento de prueba de coagulación, que busca minimizar la zona superficial expuesta al aire con el fin de obtener el estado energético más favorable y, por tanto, anulando el efecto de las zonas hidrofóbicas.

En una realización alternativa, tal como se muestra en la Figura 13c, el sistema de distribución de muestras de la capa superior 4 tiene un diseño aproximadamente un 10% más pequeño que el sistema de distribución de muestras de la capa base 2, por tanto, el volumen total de la muestra del elemento de prueba de coagulación viene definido por la extensión del sistema de distribución de muestras de la capa base, permitiendo mayor tolerancia para el proceso de registro durante la fabricación sin comprometer la precisión del volumen de muestra exigido.

La aplicación de la capa central, que puede ser una cinta adhesiva por dos lados con un espesor preferente de 80 micras o alternativamente un adhesivo fundido en caliente depositado sobre un espesor equivalente, es menos exigente debido a la discontinuidad relativamente grande en el material en comparación con el tamaño de las vías hidrofílicas. El registro es especialmente importante en las líneas de producción continua, en las que el sustrato avanza de varios metros hasta decenas de metros por minuto. La dilatación del sustrato y la tensión de la membrana hacen que el registro en la dirección-x (dirección del movimiento de la membrana) resulte más difícil que en la dirección-y, perpendicular al movimiento de la membrana.

Un método de preparación para películas poliméricas flexibles que proporcionan un registro exacto de los patrones de la primera y la segunda superficies se ilustra en la Figura 14, que muestra partes de un proceso continuo de producción de membranas. En una primera etapa de producción según la Figura 14a, los patrones del sistema de distribución de muestras 6 de la capa base y la capa superior están impresos en un sustrato de membrana 49, que representa el material de los elementos de prueba de coagulación producidos. Tal como se ilustra en la Figura 14, los patrones impresos del sistema de distribución de muestras 6 están dispuestos en los sustratos de membrana 49 de modo que dos sistemas de distribución de muestras están enfrentados entre sí a la izquierda y a la derecha de una línea especular. Opcionalmente, el sistema de distribución de muestras puede estar conectado en las zonas que forman las zonas de aplicación de muestras. Por tanto, la posición de las zonas de detección predeterminadas 6a, 6'a se fija de forma relativa entre sí y permanece no afectada por la dilatación del material y la tensión de la membrana.

La línea de puntos 50 indica las futuras líneas de corte para separar los elementos de prueba de coagulación en tiras, mientras la línea de puntos 51 indica la línea especular de la ilustración de la tira y la futura línea de doblado del sustrato de membrana.

Tras la impresión de las vías de flujo del elemento de prueba de coagulación, las zonas de detección 6a, 6'a del sistema de distribución de muestras se recubren con las formulaciones necesarias. Por ejemplo, la zona de detección 6a de la fila superior del sustrato de membrana 49, que representará la segunda superficie del elemento de prueba de coagulación, está recubierta con las formulaciones de control de calidad. Una de las formulaciones de control de calidad (por ejemplo posicionada en 6'a1) no contiene compuestos activos que inhiban o potencien la reacción de coagulación y, por tanto, proporciona el resultado determinado del análisis de coagulación, mientras que la zona de detección 6'a de la fila inferior del sustrato de membrana 49, que representará la primera superficie del elemento de prueba de coagulación, está recubierta con las formulaciones de coagulación que contienen la tromboplastina del tejido para iniciar la reacción de coagulación. En casos especiales, compuestos distintos de la tromboplastina del tejido estarán recubiertos en la zona de detección de muestras 6'a, que accionará y activará la vía de coagulación en distintas posiciones, para determinar la funcionalidad de otros factores de coagulación.

A continuación, se lamina una capa adicional en una de las superficies, por ejemplo la superficie 2a de la capa base 2, que representa la capa central 52 del elemento de prueba de coagulación que se muestra en la Figura 14b. La capa central 52 puede estar compuesta de una cinta adhesiva por dos lados o de un adhesivo fundido en caliente, que proporciona perforaciones 5 que exponen los sistemas de distribución de muestras 6 para crear cavidades para los sistemas de distribución de muestras en los elementos de prueba de coagulación después de la etapa final de montaje.

Después, se ensambla el elemento de prueba de coagulación de la presente invención doblando los dos lados a lo largo de la línea especular 51, por ejemplo con la ayuda de un hierro de plegado u otro equipo adecuado, tal como se ilustra en la Figura 14c, creando una membrana plegada y laminada 53 como se muestra en la Figura 14d. Posteriormente, un rodillo prensador puede asegurar una conexión muy precisa entre la capa central, la capa base y la capa superior.

Finalmente, la membrana laminada 53 se corta o perfora en la forma de producto deseada, mientras que la línea 50 proyecta una forma ilustrativa de la tira final de prueba de coagulación sobre la membrana 53 antes del proceso de separación. Con el método de preparación ilustrado en la Figura 14, la parte superior del sustrato se puede plegar sobre la parte inferior sin correr el riesgo de perder el registro en la dirección-x de la membrana y proporciona un método más cómodo para obtener el registro correcto de la primera y la segunda superficies que forman el sistema de distribución de muestras en comparación con el proceso de una sola hoja.

Será evidente para un especialista en la técnica que la capa base y la capa superior son intercambiables en las realizaciones expuestas sin afectar al principio de la invención.

Esta invención proporciona un sistema de prueba para determinar las características de coagulación de muestras de plasma y de sangre total, que se compone de un elemento de prueba de coagulación y de un pequeño y sencillo dispositivo medidor manual adecuado para instituciones de cuidado a domicilio y diagnóstico inmediato. El elemento de prueba de coagulación está provisto de un sistema de control de calidad integrado adecuado para su formato en tiras de prueba con un reactivo seco y un volumen muy pequeño de muestra, de aproximadamente 0,5 \mul. La producción del elemento de prueba de coagulación de la invención implica sólo unas pocas etapas de producción no complicadas, permitiendo una producción barata del elemento.

Claims

1. Elemento de prueba para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre total que posee una primera superficie (2a) y una segunda superficie (4a) a una distancia predeterminada una frente a otra, estando provistas dichas ambas superficies de dos modelos sustancialmente equivalentes que forman zonas de alta y baja energía superficial que están alineados de forma esencialmente congruente, con lo cual las zonas de alta energía superficial crean un sistema de distribución de muestras (6) con al menos dos zonas de detección de la coagulación (6a1, 6a2), caracterizado porque al menos una de las zonas de detección (6a, 6'a) de la primera y la segunda superficies (2a, 4a) está provista de al menos un reactivo estimulante de la coagulación.

2. Elemento de prueba de la coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una zona de detección de coagulación está provista de una formulación que contiene un acelerador de la coagulación que potencia una coagulación rápida y completa del fluido de muestra.

3. Elemento de prueba de la coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una zona de detección de coagulación está provista de una formulación que contiene un inhibidor de la coagulación que suprime la coagulación en el fluido de muestra.

4. Elemento de prueba de coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de distribución de muestras (6) comprende al menos tres zonas de detección de la coagulación, estando provista al menos una zona de detección de la coagulación de una formulación que acelera la coagulación del fluido de muestra y estando provista al menos una zona de detección de la coagulación de una formulación que suprime la coagulación en el fluido de muestra.

5. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el(los) reactivo(s) estimulante(s) de la coagulación es(son) tromboplastina y/o iones calcio.

6. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones 2, 4 ó 5, caracterizado porque la formulación que acelera la coagulación del fluido de muestra comprende un agente gelificante.

7. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones 3, 4, 5 ó 6, caracterizado porque la formulación que inhibe la coagulación en el fluido de muestra comprende heparina de litio y/o
EDTA.

8. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos una de las superficies primera y segunda (2a, 4a) de la(s) zona(s) de detección (6a, 6'a) está(n) provista(s) de un compuesto que permite la determinación de la reacción de coagulación mediante fotometría de transmisión o absorbancia.

9. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos una de las superficies primera y segunda (2a, 4a) de la(s) zona(s) de detección (6a, 6'a) está(n) provista(s) de(un) compuesto(s) que permite(n) la determinación de la reacción de coagulación mediante fluorescen-
cia.

10. Elemento de prueba de la coagulación según la reivindicación 9, caracterizado porque el(los) compuesto(s) que permite(n) la determinación de la reacción de coagulación mediante fluorescencia es(son) (un) rotor(es) molecu-
lar(es) fluorescente(s).

11. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación que comprende las etapas de:

-: generar zonas de alta y baja energía superficial sobre una capa base (2) que tiene una primera superficie (2a), formando las zonas de alta energía superficial un sistema hidrofílico de distribución de muestras (6) con al menos dos zonas de detección predeterminadas (6a1, 6a2),

-: generar un patrón correspondiente de zonas de alta y baja energía superficial sobre una capa superior (4) que tiene una segunda superficie (4a),

-: recubrir al menos una de las zonas de detección predeterminadas (6a, 6'a) de la primera superficie (2a) y/o de la segunda superficie (4a) con al menos un reactivo estimulante de la coagulación,

-: aplicar las capas de la primera y la segunda superficies en los lados opuestos de una capa central (3) que tiene una discontinuidad (5) que proporciona una cavidad para el sistema de distribución de muestras (6) formado por las zonas de alta energía superficial sobre la primera y la segunda superficies (2a, 4a) de la primera y la segunda capa (2, 4).

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12. Método según la reivindicación 11, que comprende las etapas adicionales de:

-: recubrir al menos una de la primera y la segunda superficies (2a, 4a) de otra zona de detección de coagulación (6a2) con una formulación que contiene un acelerador de la coagulación que potencia una coagulación rápida y completa del fluido de muestra,

-: recubrir al menos una de la primera y la segunda superficies (2a, 4a) de otra zona de detección de coagulación (6a3) con una formulación que contiene un inhibidor de la coagulación que suprime la coagulación en el fluido de muestra.

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13. Método según la reivindicación 11 ó 12 que comprende la etapa adicional de:

-: recubrir al menos una de las superficies primera y segunda (2a, 4a) de la(s) zona(s) de detección de coagulación con (un) compuesto(s) que permite(n) la determinación de la reacción de coagulación mediante fluorescencia.

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14. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque dichas zonas de alta energía superficial se crean mediante la aplicación de una composición hidrofílica insoluble en agua sobre la primera y la segunda superficies (2a, 4a).

15. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque dichas zonas de baja energía superficial se crean mediante la aplicación de composiciones hidrofóbicas sobre la primera y la segunda superficies (2a, 4a).

16. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 14 y 15, caracterizado porque dicha(s) composición(es) hidrofílica(s) y/o hidrofóbica(s) está(n) impresa(s) sobre la primera y la segunda superficies (2a, 4a) por medio de flexografía, litografía, grabado, método de recubrimiento con tinta sólida o impresión por chorro de tinta.

17. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque dicho(s) reactivo(s) estimulante(s) de la coagulación y/o formulación(es) de control de calidad y/o asistente(s) de detección de fluorescencia recubre(n) las zonas de detección (6a, 6'a) de la primera y/o la segunda superficies (2a, 4a) mediante impresión por microcontacto o microdispensación.

18. Sistema de prueba de la coagulación para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre total que comprende:

-: un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 1 a 10,

-: medios de detección para detectar cambios en la absorbancia de luz o la fluorescencia en el fluido de muestra de suero o de sangre total localizado en la(s) zona(s) de detección predeterminada(s),

-: medios de procesamiento para procesar los datos procedentes del medio de detección luminosa y calcular el tiempo de coagulación y/o el valor INR, y

-: medios de visualización para indicar los valores de salida al usuario.

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19. Método para determinar la coagulación en un fluido de muestra de suero o de sangre total, comprendiendo dicho método:

-: la aplicación de un fluido de muestra de suero o de sangre total en un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 1 a 10,

-: la inserción del elemento de prueba de la coagulación en un dispositivo medidor que incluye el medio de detección y de procesamiento,

-: la lectura de los valores de salida en un medio de visualización.