ES2336642T3 - Proteina hibrida y vector que codifica para la misma para la inhibicion de la angiogenesis. - Google Patents

Proteina hibrida y vector que codifica para la misma para la inhibicion de la angiogenesis. Download PDF

Info

Publication number
ES2336642T3
ES2336642T3 ES01929782T ES01929782T ES2336642T3 ES 2336642 T3 ES2336642 T3 ES 2336642T3 ES 01929782 T ES01929782 T ES 01929782T ES 01929782 T ES01929782 T ES 01929782T ES 2336642 T3 ES2336642 T3 ES 2336642T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
sequence
recombinant
cells
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01929782T
Other languages
English (en)
Inventor
Wen G. Jiang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cardiff Biologicals Ltd
Original Assignee
Cardiff Biologicals Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cardiff Biologicals Ltd filed Critical Cardiff Biologicals Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2336642T3 publication Critical patent/ES2336642T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475Growth factors; Growth regulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Color Image Communication Systems (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Molécula de ácido nucleico aislado, purificado o recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende tanto: a) un antagonista de un factor angiogénico como b) un regulador de la estructura endotelial vascular en la que la estructura de la secuencia de ácido nucleico de dicha molécula comprende la secuencia mostrada en la figura 3 y la secuencia mostrada en la figura 4; o una secuencia que tiene una identidad del 80% con la misma.

Description

Proteína híbrida y vector que codifica para la misma para la inhibición de la angiogénesis.
La presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica tanto para un antagonista de un factor de la angiogénesis específico como para un regulador de la estructura endotelial vascular; a su preparación; a la expresión de la proteína; y al uso de la secuencia o la proteína en la inhibición de la angiogénesis y/o el tratamiento del cáncer.
La angiogénesis, la formación de vasos sanguíneos nuevos, es clave en el desarrollo y la progresión del cáncer. La angiogénesis se rige por una gama de factores angiogénicos y factores antiangiogénicos. Se conoce que los factores angiogénicos incluyen una gama de citocinas, tales como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) por ejemplo FGF básico (bFGF), interleucinas (IL, por ejemplo IL-8) y factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF). Sin vasos sanguíneos nuevos, un tumor no puede crecer más allá de 2 mm de diámetro debido al suministro de sangre y la difusión de nutrientes/oxígeno limi-
tados.
Además, las células tumorales pueden diseminarse en el organismo y producir micro y macrometástasis en los órganos y tejidos, pero permanecer invisibles durante desde meses hasta años. Una vez que los vasos sanguíneos nuevos crezcan en estos tumores latentes, éstos crecerán a una velocidad mucho más rápida, empezarán a manifestar síntomas clínicos y se volverán letales para los pacientes. Los vasos sanguíneos nuevos en el tumor proporcionan no sólo nutrientes y oxígeno, sino también una vía para que las células tumorales entren en la circulación y por tanto ayudan al proceso de metástasis.
Por tanto, la antiangiogénesis se ha convertido en un centro de atención en el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer. La importancia fundamental de la angiogénesis en el desarrollo y la metástasis del cáncer ha llevado al descubrimiento de un gran número de inhibidores de la angiogénesis, que incluyen agentes diseñados específicamente como agentes antiangiogénicos (tales como anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo anti-bFGF, fumagilina y productos recombinantes a base de un único gen, tal como angiostatina), y aquellos descubiertos de manera no intencionada (tales como interferón beta, tamoxifeno e interleucinas 4 y 12).
Algunos de los antagonistas de los factores angiogénicos son adecuados para el propósito de la antiangiogénesis, pero otros no los son. Por ejemplo, cada antagonista trabaja específicamente sobre sólo un factor angiogénico particular, mientras que existen aproximadamente de 20-40 factores angiogénicos en el organismo, en cualquier tumor dado. Otro problema es que el uso de un antagonista específico dará como resultado un cambio del equilibrio en el que se suprime el factor angiogénico seleccionado como diana, pero otro(s) factor(es) aumenta(n) en compensación. Por tanto, el equilibrio se desplaza desde el factor angiogénico seleccionado como diana hacia otro u otros, dando como resultado resistencia al tratamiento antiangiogénico.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un agente para suprimir la angiogénesis, que puede obtenerse modificando mediante ingeniería genética dos reguladores importantes de la angiogénesis, un antagonista de un factor angiogénico y un regulador de la estructura endotelial (tal como la cadherina endotelial vascular).
Por tanto, se ha modificado mediante ingeniería genética una molécula recombinante que comprende tanto una secuencia que puede expresar un antagonista específico como una secuencia que puede expresar un marcador de células endoteliales específico, que es un regulador de la estructura endotelial vascular, que es esencial para la formación de vasos sanguíneos nuevos. Los productos recombinantes (denominados de manera colectiva en el presente documento productos KV, tales como aquéllos denominados KVEn, en el que n es un número entero, K representa el antagonista de un factor angiogénico, V representa las células endoteliales vasculares y E representa el vector de expresión, y otros denominados mediante números de J) ambos conservan las propiedades antagonistas de un factor antiangiogénico; y también reconocen específicamente células que producen vasos sanguíneos nuevos, es decir las células endoteliales vasculares.
Por tanto, los productos recombinantes trabajarán sobre el mecanismo general para formar vasos sanguíneos nuevos así como sobre un mecanismo específico operado por un factor angiogénico específico; y tienen la ventaja adicional de impedir el cambio del equilibrio y la resistencia a la angiogénesis a la que se enfrenta actualmente el tratamiento antiangiogénico.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado, purificado o recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende tanto:
(a)
un antagonista de un factor angiogénico y un regulador de la estructura endotelial vascular, en la que la estructura de la secuencia de ácido nucleico de dicha proteína de fusión comprende la secuencia mostrada en la figura 3 y la secuencia mostrada en la figura 4; o
(b)
una secuencia homóloga en el 80% a la secuencia (a).
\vskip1.000000\baselineskip
Por "homóloga" en el presente documento se entiende una secuencia que tiene una identidad de nucleótidos (o, en el caso de una secuencia de aminoácidos, bases) de al menos el 80% en el mismo orden dentro de la secuencia. Preferiblemente, la secuencia tiene una homología de al menos el 85% y más preferiblemente de al menos el 90%, tal como superior al 95%.
La presente invención proporciona además una secuencia (de aminoácidos) de un polipéptido (proteína) codificada por una secuencia de nucleótidos de la invención.
Por tanto, ahora se describirán realizaciones específicas de la presente invención, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
la figura 1 es la secuencia de ácido nucleico de la KVE702 recombinante, que tiene 1695 ácidos nucleicos;
la figura 2 es la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína KVE702, codificada por la secuencia de KVE702 recombinante, que se lee desde la posición 1 y que tiene 566 aminoácidos;
la figura 3 es aquella parte de la secuencia de la figura 1 derivada de MRC-5 (el componente antagonista angiogénico, KS2101);
la figura 4 es aquella parte de la secuencia de la figura 1 derivada de HUVEC (el componente regulador de la estructura endotelial vascular, VC503);
la figura 5 es la secuencia de ácido nucleico de KS2105;
la figura 6 es la secuencia de ácido nucleico de VC1;
la figura 7 es la secuencia de ácido nucleico de J12;
la figura 8 es la secuencia de ácido nucleico de la J35 recombinante;
la figura 9 es la secuencia de ácido nucleico de J11;
la figura 10 es la secuencia de ácido nucleico de la J36 recombinante;
la figura 11 es la secuencia de ácido nucleico de J8;
la figura 12 es la secuencia de ácido nucleico de J37;
la figura 13 es la secuencia de aminoácidos prevista para la proteína J35, que corresponde a la secuencia de ácido nucleico de la figura 8;
la figura 14 es la secuencia de aminoácidos prevista para la proteína J36, que corresponde a la secuencia de ácido nucleico de la figura 10;
la figura 15 es la secuencia de aminoácidos prevista para la proteína J37, que corresponde a la secuencia de ácido nucleico de la figura 12;
la figura 16 es la secuencia de ácido nucleico de J9;
la figura 17 es la secuencia de ácido nucleico de J10; y
la figura 18 es la secuencia de ácido nucleico de J6.
Los oligonucleótidos (d) particulares que se incluyen en esta invención son aquéllos que codifican para el regulador de la estructura endotelial vascular. El regulador de la estructura endotelial se deriva adecuadamente de VE-cadherina, E-selectina, ocludina, claudina-5 y/o molécula de adhesión de células vasculares (VCAM), especialmente VE-cadherina, ocludina y claudina-5.
Por consiguiente, la presente patente enseña además una secuencia de ácido nucleico aislado, purificado o recombinante (a continuación en el presente documento, una secuencia de KV) que comprende:
(a)
una secuencia que codifica para un regulador de la estructura endotelial vascular, tal como VC1, VC503, J8, J11 y J12, tal como se define a continuación;
(b)
una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida con la secuencia (a) en condiciones rigurosas; o
\newpage
(c)
una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia (a) o (b) excepto para la degeneración del código genético; o
(d)
un oligonucleótido específico para cualquiera de las secuencias (a), (b) o (c).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de antagonista se deriva adecuadamente de VEGF, bFGF, factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF) y/o quimiocinas. Preferiblemente, el fragmento de antagonista se deriva de VEGF y/o HGF/SF. Los fragmentos de antagonista particularmente preferidos son KS2101 y KS2105, tal como se define a continuación.
En general, tales productos pueden prepararse usando una técnica de ADN recombinante convencional. Por ejemplo, en primer lugar, se preparan una pluralidad de fragmentos de ADN separados, al menos uno de los cuales comprende una secuencia que codifica para un antagonista y al menos uno de los cuales comprende una secuencia que codifica para el regulador de la estructura endotelial. Esto puede llevarse a cabo con cebadores específicos que permiten que se prepare un recombinante adicional, lo que genera un nuevo gen recombinante. En particular, ciertos genes recombinantes, denominados a continuación en el presente documento KVE702, J35, J36 y J37, se han generado a partir de fragmentos de ADN clonados de células endoteliales vasculares y fibroblastos humanos. Se ha usado el nuevo gen KVE702 y sus fragmentos para transfectar células epiteliales humanas y generar productos que pueden ser adecuados para la intervención en la angiogénesis.
Por consiguiente, la presente patente enseña además una secuencia de ácido nucleico aislado, purificado o recombinante que comprende:
(a)
una secuencia que codifica tanto para un antagonista de un factor angiogénico que puede derivarse de una línea celular de fibroblastos humanos, preferiblemente MRC-5, como para un regulador de la estructura endotelial vascular comprendido en células endoteliales vasculares humanas (HUVEC) que pueden extraerse de una vena umbilical humana;
(b)
una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida con la secuencia (a) en condiciones rigurosas; o
(c)
una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia (a) o (b) excepto para la degeneración del código genético; o
(d)
un oligonucleótido específico para cualquiera de las secuencias (a), (b) o (c).
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular MRC-5 está disponible de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales, y HUVEC puede obtenerse mediante extracción a partir de un cordón umbilical fresco.
Preferiblemente, la secuencia (a) se selecciona de las siguientes:
tal como se muestra en la figura 1 [secuencia de KVE702];
tal como se muestra en la figura 8 [secuencia de J35];
tal como se muestra en la figura 10 [secuencia de J36]; y,
tal como se muestra en la figura 12 [secuencia de J37];
\vskip1.000000\baselineskip
Aquella parte de la secuencia según la invención [secuencia de KVE702] derivada de la línea celular MRC-5 se muestra en la figura 3, que es una primera parte (el componente KS2101) de la secuencia de KVE702. Aquella parte de la secuencia según la invención [secuencia de KVE702] derivada de HUVEC se muestra en la figura 4, que es la parte restante (el componente VC503) de la secuencia de KVE702.
Aquella parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J35] derivada de la línea celular MRC-5 se muestra en la figura 16, que es una primera parte (el componente J9) de la secuencia de J35. Aquella parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J35] derivada de HUVEC se muestra en la figura 7, que es la parte restante (el componente J12) de la secuencia de J35.
Aquella parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J36] derivada de la línea celular MRC-5 se muestra en la figura 17, que es una primera parte (el componente J10) de la secuencia de J36. Aquella parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J36] derivada de HUVEC se muestra en la figura 9, que es la parte restante (el componente J11) de la secuencia de J36.
Aquella parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J37] derivada de la línea celular MRC-5 se muestra en la figura 18, que es una primera parte (el componente J6) de la secuencia de J37. Aquella parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J37] derivada de HUVEC se muestra en la figura 11, que es la parte restante (el componente J18) de la secuencia de J37.
Usando estos productos clonados, es posible transfectar una célula adecuada y establecer transfectantes estables para observar si la transfección afecta al comportamiento de movilidad de las células transfectadas. La determinación de una célula adecuada para la transfección se lleva a cabo mediante los métodos de ensayo y error habituales conocidos en la técnica en los que, por ejemplo, células leucémicas, fibroblásticas o epiteliales humanas se transfectan con un plásmido que porta tanto el gen como un gen de resistencia a antibióticos, a las que se añaden antibióticos tóxicos (tal como G418, disponible de Invitrogen). Por tanto, las células que no pueden incorporar el gen morirán como resultado del antibiótico, permitiendo de ese modo la exclusión de las células inadecuadas para la transfección. Un ejemplo de tales células adecuadas es la línea celular de cáncer de mama humano, MCF-7. Entonces, los transfectantes pueden usarse para generar proteínas recombinantes para pruebas en un ensayo de angiogénesis y la posterior selección para su uso diagnóstico y/o terapéutico.
Por consiguiente, la presente invención proporciona además un constructo aislado, purificado o recombinante que incorpora una secuencia de KV según la descripción anterior, en particular, una en la que la secuencia de ácido nucleico está unida operativamente con nucleótidos que permiten la expresión y secreción en un huésped celular de una proteína (a continuación en el presente documento, la proteína KV) codificada por la secuencia de KV.
Además, esta invención proporciona ADN o ARN, especialmente ADNc o ARNm, según cualquiera de las secuencias o los constructos mencionados anteriormente; y un método para preparar tal ADN o ARN tal como se describe en el presente documento, junto con tal ADN o ARN que puede prepararse mediante un método de este tipo.
Por consiguiente, la presente patente enseña también un método para preparar una secuencia de KV, método que comprende:
(a)
generar un fragmento de ADNc que codifica para un antagonista de un factor de la angiogénesis específico;
(b)
generar un fragmento de ADNc que codifica para un regulador de la estructura endotelial vascular específico, cuyos fragmentos (a) y (b) son complementarios en un extremo de los mismos; y
(c)
combinar los fragmentos para generar un gen recombinante que puede expresar la proteína KV correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Especialmente, la presente invención proporciona un polipéptido aislado, purificado o recombinante que comprende tanto un antagonista de un factor angiogénico como un regulador de la estructura endotelial vascular, y, en particular, un polipéptido aislado, purificado o recombinante que comprende la proteína KV, o un mutante o variante de la misma que tiene sustancialmente la misma actividad que la proteína KV.
Por ejemplo, se proporciona un polipéptido aislado, purificado o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 2 [proteína KVE702 prevista].
Otras moléculas enseñadas por esta patente incluyen la figura 13 [proteína J35 prevista], figura 14 [proteína J36 prevista], figura 15 [proteína J37 prevista]; o cualquier proteína KV cuando se expresa por una secuencia de ADN según esta invención.
Resultará evidente que la invención proporciona por tanto además una célula, un plásmido, un virus o un organismo vivo que se ha modificado mediante ingeniería genética para producir una proteína KV, teniendo dicha célula, plásmido, virus u organismo vivo incorporado de manera expresable en el mismo una secuencia de nucleótidos de KV según esta invención; un vector que comprende una secuencia de este tipo; y/o una célula huésped transformada o transfectada con un vector de este tipo.
Para la terapia génica, preferiblemente se elegiría y modificaría mediante ingeniería genética un vector viral para producir la proteína KV. Pueden usarse vectores tanto retrovirales como adenovirales, tal como los sistemas Retro-X^{TM} o Adeno-X^{TM} de Clontech (EE.UU.).
Además, esta patente enseña un procedimiento para obtener una fuente sustancialmente homóloga de proteína KV, procedimiento que comprende cultivar células que tienen incorporadas de manera expresable en ellas mismas una secuencia de nucleótidos de KV según esta invención, y después recuperar las células cultivadas.
Por tanto, la(s) proteína(s) KV según esta invención pueden usarse en relación con cualquier estado asociado con la angiogénesis, tal como el cáncer, para la regulación del desarrollo de vasos sanguíneos y su formación, ya sea en el endotelio vascular y/o un tumor. Una dosis adecuada puede determinarse según las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica de la farmacia, pero convenientemente puede estar en el intervalo de desde 0,5 hasta 10 mg/kg de peso corporal, administrada en un régimen adecuado, tal como desde una vez hasta siete veces por
semana.
Por consiguiente, la presente invención proporciona aún adicionalmente una proteína KV de este tipo, opcionalmente en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma, para su uso en tratamiento, tal como para su uso en cualquiera de los estados mencionados en el presente documento. Se prefiere especialmente que, para la proteinoterapia, se proporcione una formulación farmacéutica que comprenda una proteína (proteína KV) de este tipo en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma. Las formulaciones preferidas incluyen aquéllas para administración parenteral, tales como inyecciones e infusiones para administración intravenosa o intramuscular. Otras formulaciones adecuadas son bien conocidas para los expertos en la técnica de los productos farmacéuticos.
También se proporcionan o se enseñan:
\quad
un método para preparar tales formulaciones, método que comprende asociar la proteína (proteína KV) con el vehículo;
\quad
un método para la profilaxis o el tratamiento de un mamífero, incluyendo el ser humano, que comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad eficaz, no tóxica de una proteína de este tipo (proteína KV);
\quad
una proteína KV para su uso en medicina, tal como en la inhibición de la angiogénesis y/o el tratamiento del cáncer;
\quad
y el uso de una proteína KV en la preparación de un medicamento, adecuado para su uso en la inhibición de la angiogénesis y/o el tratamiento del cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración de la presente invención.
Ejemplo 1 Clonación del gen recombinante KVE702 Células usadas
Se usaron fibroblastos humanos (una línea celular establecida, MRC-5) y células endoteliales vasculares humanas (HUVEC) (extraídas de una vena umbilical humana) (Cai J. et al. Gamma linolenic acid inhibits expression of VE-cadherin and tube formation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999, 258, 113-118).
Preparación del molde de ARNm y ADNc humano
Se aisló ARNm a partir de fibroblastos o células endoteliales usando un kit de extracción de ARNm (Sigma Chemicals, Poole, Dorset, RU). Se preparó el ADN complementario (ADNc) a partir del ARNm usando un kit de transcripción inversa (Promega).
Oligonucleótidos (cebadores) usados en la reacción PCR y PCR recombinante
Se diseñaron conjuntos de cebadores de PCR para amplificar las zonas de interés a partir del ADNc preparado, es decir antagonista a partir de los fibroblastos y marcador endotelial/antagonista a partir de las células endoteliales. Se diseñaron los cebadores de PCR de tal modo que los productos de cada reacción se usaran en la recombinación posterior. Los cebadores fueron sintetizados por Life Technologies y se usaron exclusivamente para este trabajo. Aquellos cebadores diseñados para la clonación del gen recombinante denominado en el presente documento KVE702 fueron los siguientes:
i
CAT GAG CCT CTG GAC TAT TGT AGG TGT GGT
ii
ACC ACA CCT ACA ATA GTC CAG AGG CTC ATG AT
iii
ACC ATG GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC
iv
TTT GAT GGT GAA GCT GGA
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la amplificación en tres entornos separados: en primer lugar, generar un fragmento a partir de ADNc de fibroblastos y, en segundo lugar, generar un fragmento a partir de ADNc de HUVEC, siendo ambos productos complementarios en un extremo. La etapa final era generar un producto recombinante mediante la unión de los dos fragmentos. Se realizó cada reacción en condiciones especiales con el fin de generar los productos deseados, tal como sigue:
\newpage
\quad
Entorno 1 (generar antagonista): 95ºC durante 5 minutos, luego 36 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 61ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, seguidos por 72ºC durante 7 minutos.
\quad
Entorno 2 (generar marcador endotelial): 95ºC durante 5 minutos, luego 36 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 58ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos, seguidos por 72ºC durante 10 minutos.
\quad
Entorno 3 (generar gen recombinante): sin cebador a 95ºC durante 5 minutos, luego
\quad
4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 35ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
\quad
4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 40ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
\quad
4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 45ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
\quad
4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 50ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
\quad
4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
\quad
4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
\quad
4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 64ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 10 minutos;
\quad
luego, con los cebadores añadidos, 35 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 59ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los siguientes productos:
1.
Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR, denominados en el presente documento: KS2101 (figura 3, [SEQ ID NO:]) y KS2105 (figura 5, [SEQ ID NO:]) (en relación con el antagonista). KS2105 está relacionado con KS2101, pero sin tener una cola que se corresponde con el marcador endotelial. Se preparó KS2105 usando el siguiente cebador adicional:
v GAC TAT TGT AGG TGT GGT ATC
2.
Fragmentos de ADN a partir de células HUVEC, denominados en el presente documento: VC503 (figura 4, [SEQ ID NO:]) y VC1 (figura 6, [SEQ ID NO:]) (ambos en relación con los reguladores de la estructura endotelial vascular). VC1 está relacionado con VC503 sin tener una cola que se corresponde con el antagonista y se preparó usando el siguiente cebador adicional:
v GTG TCC TTG TCC ACA ATG ACT
3.
La secuencia recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar la secuencia recombinante, mediante la unión de KS2101 y VC503, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó una secuencia recombinante específica, concretamente KVE702 (figura 1, [SEQ ID NO:]).
\vskip1.000000\baselineskip
Clonación de los productos específicos
Se clonaron cada fragmento y el gen recombinante en un vector de expresión de mamíferos (pcDNA3.1/V5/His-TOPO, disponible de InVitrogen) y se transfectaron en una E. coli competente. Se detectaron las colonias que portaban los productos deseados usando PCR. Se expandieron e hicieron crecer adicionalmente las colonias positivas en gran volumen. Entonces se purificaron de estas preparaciones de E. coli los plásmidos que resultaron de clonar los genes en el vector (es decir que portaban los productos específicos).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Transfección y establecimiento de una célula que expresa KVE702
Se transfectaron los plásmidos que portaban los genes KS2101, KS2105, VC1, VC503 y KVE702 en células epiteliales de mamíferos. Se usó un agente de transfección, Transfast (Promega). Después de pruebas en serie, se encontró que las células MCF-7 (bien conocidas como línea celular de cáncer de mama humano) eran la célula más adecuada y aceptable para este fin y se eligieron para ser las células para la transfección en el actual estudio. La condición de transfección óptima fue a Transfast:ADN = 2:1.
Tras la transfección, se seleccionaron las células que retuvieron estos nuevos genes usando un medio de selección que contenía G418 (de InVitrogen o Calbiochem), lo que provocó que las células que no tenían los nuevos genes murieran gradualmente mientras que aquéllas con los nuevos genes continuaran dividiéndose. Se obtuvieron las células que expresaban estos nuevos genes de interés después de una selección de más de 4 semanas (los denominados transfectantes estables). Se observó que las células de tipo natural (no transfectadas) morían casi todas tras dos semanas, mientras que entre el 10-30% de las células transfectadas con los genes de interés seguían siendo viables. En aproximadamente 4 semanas, una cantidad suficiente de estas células viables estaban disponibles para las pruebas biológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Pruebas de movilidad de los transfectantes estables establecidos recientemente
Con el fin de someter a prueba si las células transfectadas de manera estable (preparadas según el ejemplo 2) eran diferentes del tipo natural, se llevó a cabo una técnica conocida como ensayo de propagación de células/dispersión de colonias (Jiang et al. Monocyte conditioned media possess a novel factor which increases motility of cancer cells Int. J. Cancer 53 426-431 (1993)). Brevemente, el tipo natural o los transfectantes se sembraron en placa en artículos de cultivo tisular a baja densidad y entonces se permitió que formaran colonias (agrupamientos). Luego, se trataron o bien con medio como control o bien con un factor que inducía dispersión (HGF/SF). Tras 24 horas, se fijaron las células y se obtuvieron imágenes digitalizadas usando una cámara digital. Se cuantificaron la propagación y dispersión según lo descrito por Jiang et al. (en Gamma linolenic acid inhibits selectively regulates the expression maspin and motility of cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 237 639-644 (1997)) usando un paquete de análisis de imágenes (Optimas 6 de Optimas UK); los resultados para cada cultivo fueron los siguientes:
Tipo natural
Las células MCF-7 de tipo natural formaron agrupamientos compactos en el cultivo con clara unión célula-célula. Un inductor de dispersión (HGF/SF) puede dispersar las colonias, es decir las células claramente se alejan unas de otras.
Transfectantes de VC1
Las células transfectadas con VC1 aparecieron como agrupamientos mucho más compactos, en comparación con el tipo natural. Los transfectantes de VC1 redujeron sustancialmente su respuesta a HGF/SF (5, 10, 2 y 50 ng/ml). Las células aparecieron como agrupamientos compactos, pequeños, con la unión célula-célula que permanecía visible.
Transfectantes de KS2105 y KS2101
El transfectante de KS2105 presentaba una morfología celular similar, cuando se comparó con los controles. Sin embargo, estas células redujeron su respuesta significativamente a HGF/SF. Se observó una respuesta similar, aunque en menor grado, con los transfectantes de KS2101.
Transfectantes de KSE702
El KSE702 establecido reveló una morfología similar al control. El inductor de dispersión HGF/SF no indujo un cambio significativo. Por tanto, la transfección no alteró la morfología de la célula, pero redujo su respuesta a HGF/SF.
Conclusión
Por tanto, los datos obtenidos muestran claramente que las células MCF-7 transfectadas con VC1, KS2101 y KS2105 no cambiaron significativamente su morfología. De hecho, las células parecieron reducir su respuesta a la estimulación. Por tanto, los datos indican que la transfección no alteró la agresividad de las células MCF-7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Pruebas del producto recombinante en la angiogénesis
El estudio usó una técnica conocida como análisis de formación de túbulos in vitro, para someter a prueba el efecto de los materiales recombinantes sobre la formación de estructuras similares a vasos sanguíneos (Kanayasu et al. Eicosapentaenoic acid inhibits tube formation of vascular endothelial cells in vitro. Lipids, 26 271-276 (1991); Bach et al. VE-cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels Exp Cell Res 238 324-334 (1998)).
En primer lugar, se recubrieron placas de 24 pocillos múltiples con Matrigel^{TM} (disponible de Beckton Dickinson) (200 \mug/pocillo) y se dejó que formaran una capa de gel delgada. Luego, se añadieron 5 x 10^{4} células HUVEC en 0,5 ml de DMEM con suero de ternero fetal (FCS) al 10% sobre Matrigel^{TM} durante 24 horas. Se aspiró el medio, y se superpusieron 0,5 ml adicionales de Matrigel^{TM} con 0,5 ml adicionales de medio, que contenía cualquier medio, HGF, NK4 o NK4 y HGF en combinación. Se observaron los cultivos celulares con un microscopio de contraste de fases después de 24 horas. Se fotografió cada pocillo cuatro veces al azar y se midió la longitud de los túbulos usando un software de análisis de imágenes (Optimas 6 de Optimas UK). Entonces se sometieron a prueba en las células un inductor de la angiogénesis conocido, HGF/SF, y un medio acondicionado de los transfectantes estables. Los resultados del estudio fueron los siguientes:
Los productos de VC1 y KS2105 redujeron la formación de túbulos
El medio acondicionado del transfectante de VC1 redujo la formación de túbulos que se indujo por HGF/SF. El medio acondicionado por sí mismo pareció tener algún efecto menor sobre la formación de túbulos. Curiosamente, el sobrenadante de KS2105 redujo la formación de túbulos tanto con como sin el inductor de la angiogénesis.
KVE702 redujo la formación de túbulos
El medio acondicionado de KVE702 aumentó la longitud de los túbulos, aunque en pequeño grado. Sin embargo, cuando se incluyó un factor angiogénico, que aumentó significativamente la longitud de los túbulos, el sobrenadante de KVE702 ejerció un efecto inhibidor significativo sobre la formación de túbulos. Conclusión: por tanto, se observó que el HGF/SF aumentó significativamente la formación de túbulos en las células endoteliales vasculares. Los sobrenadantes de los transfectantes estables pueden reducir este aumento en la formación de túbulos. Por tanto, la presente invención puede presentar una nueva oportunidad para producir agentes contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Pruebas del producto recombinante en la invasividad
Usando las técnicas descritas anteriormente en el ejemplo 2, se transfectaron MCF-7 (células de cáncer de mama humano) con el gen KVE702 y un transfectante estable seleccionado usando G418. Entonces se sometieron a prueba las células usando el ensayo de invasión de Matrigel^{TM} establecido descrito por Jiang et al. en Cancer Research, 55 5043-8 (1995). Se encontró que las células transfectadas tenían una invasividad reducida en comparación con las células MCF-7 naturales o con las células MCF-7 que se habían transfectado con un plásmido control que portaba el gen Lac-z (disponible de InVitrogen). También se encontró que la respuesta de las células transfectadas a HGF/SF se redujo significativamente, en comparación con las células control y naturales.
Dado que la invasividad de las células cancerosas está relacionada directamente con la progresión y metástasis de un cáncer, su reducción indica un futuro potencial en el tratamiento contra el cáncer para el producto recombinante de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Clonación del gen recombinante J35
Siguiendo el método del ejemplo 1, se preparó el producto recombinante del título, usando los siguientes cebadores en lugar de i-iv del ejemplo 1:
i
acc atg ggc gcg cag tgc acc
ii
ctt cag tgc tgg cac aga cgg gtc gta
iii
tac gac ccg tct gtg cca gca ctg aag
iv
gac tat tgt agg tgt ggt a
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los siguientes productos:
1.
Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR: J9 (antagonista) (figura 16, [SEQ ID NO:]).
2.
Se aislaron fragmentos de ADN a partir de células HUVEC: J12 (marcador endotelial) (figura 7, [SEQ ID NO:]).
3.
Un gen recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar un gen recombinante, mediante la unión de J9 y J12, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó un gen recombinante específico, concretamente: J35 (producto recombinante) (figura 8, [SEQ ID NO:]).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Clonación del gen recombinante J36
Siguiendo el método del ejemplo 1, se preparó el producto recombinante del título, usando los siguientes cebadores en lugar de i-iv del ejemplo 1:
i
acc atg gga gtg aac cca act gct cag
ii
ctt cag tgc tgg ctc ctg ggg atc cac
iii
gtg gat ccc cag gag cca gca ctg aag
iv
gac tat tgt agg tgt ggt a
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los siguientes productos:
1.
Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR: J10 (antagonista) (figura 17, [SEQ ID NO:]).
2.
Se aislaron fragmentos de ADN a partir de células HUVEC: J11 (marcador endotelial) (figura 9, [SEQ ID NO:]).
3.
Un gen recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar un gen recombinante, mediante la unión de KS2101 y J11, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó un gen recombinante específico, concretamente: J36 (producto recombinante) (figura 10, [SEQ ID NO:]).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Clonación del gen recombinante J37
Siguiendo el método del ejemplo 1, se preparó el producto recombinante del título, usando los siguientes cebadores en lugar de i-iv del ejemplo 1:
i
acc atg gga aac cca act gct cag
ii
cca aat cca atc ctc ctg gga atc cac
iii
gtg gat ccc cag gag gat tgg att tgg
iv
ctg ggc ggc cat atc ctc gca gaa ggt
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los siguientes productos:
1.
Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR: J6 (antagonista) (figura 18, [SEQ ID NO:]).
2.
Se aislaron fragmentos de ADN a partir de células HUVEC: J8 (marcador endotelial) (figura 11, [SEQ ID NO])
3.
Un gen recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar un gen recombinante, mediante la unión de KS2101 y J8, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó un gen recombinante específico, concretamente: J37 (producto recombinante) (figura 10, [SEQ ID NO:]).
<110> Facultad de Medicina de la Universidad de Gales
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencia recombinante, su preparación y uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> WJLJ-WCM75
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 566
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
2
\hskip1cm
3
\hskip1cm
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1428
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1788
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 482
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
20
\hskip1cm
21
\hskip1cm
22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
23
\hskip1cm
24
\hskip1cm
25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
26
\hskip1cm
27
\hskip1cm
28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
29
\hskip1cm
30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1638
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
32

Claims (9)

1. Molécula de ácido nucleico aislado, purificado o recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende tanto:
a)
un antagonista de un factor angiogénico como
b)
un regulador de la estructura endotelial vascular
en la que la estructura de la secuencia de ácido nucleico de dicha molécula comprende la secuencia mostrada en la figura 3 y la secuencia mostrada en la figura 4; o una secuencia que tiene una identidad del 80% con la misma.
2. Molécula según la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia mostrada en la figura 1.
3. Polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según cualquier reivindicación anterior.
4. Polipéptido según la reivindicación 3, que comprende la secuencia mostrada en la figura 2.
5. Vector que tiene incorporado de manera expresable en el mismo una molécula según las reivindicaciones 1 ó 2.
6. Célula, plásmido, virus, bacteria u otro organismo vivo que tiene incorporado de manera expresable en el mismo una molécula según las reivindicaciones 1 ó 2.
7. Célula huésped transfectada o transformada con un vector según la reivindicación 5.
8. Uso de un polipéptido según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la angiogénesis o el cáncer.
9. Formulación que comprende un polipéptido según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma.
ES01929782T 2000-05-04 2001-05-04 Proteina hibrida y vector que codifica para la misma para la inhibicion de la angiogenesis. Expired - Lifetime ES2336642T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0010630 2000-05-04
GBGB0010630.2A GB0010630D0 (en) 2000-05-04 2000-05-04 Sequence

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2336642T3 true ES2336642T3 (es) 2010-04-15

Family

ID=9890846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01929782T Expired - Lifetime ES2336642T3 (es) 2000-05-04 2001-05-04 Proteina hibrida y vector que codifica para la misma para la inhibicion de la angiogenesis.

Country Status (12)

Country Link
US (2) US7247716B2 (es)
EP (1) EP1278874B1 (es)
JP (1) JP2003531600A (es)
AT (1) ATE448311T1 (es)
AU (1) AU783059C (es)
CA (1) CA2408034C (es)
DE (1) DE60140439D1 (es)
DK (1) DK1278874T3 (es)
ES (1) ES2336642T3 (es)
GB (1) GB0010630D0 (es)
PT (1) PT1278874E (es)
WO (1) WO2001083562A2 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6061932B2 (ja) * 2011-08-12 2017-01-18 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼを特異的にレギュレートするための組成物および方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03130091A (ja) * 1989-06-05 1991-06-03 Toyobo Co Ltd 組換ヒト肝実質細胞増殖因子
US6225290B1 (en) * 1996-09-19 2001-05-01 The Regents Of The University Of California Systemic gene therapy by intestinal cell transformation
SE9604731D0 (sv) * 1996-12-20 1996-12-20 Tamas Bartfai Konsulting Ab A component of intercellular junctions in the endothelium
WO1999029860A1 (en) * 1997-12-08 1999-06-17 Ontogeny, Inc. Cadherin-like polypeptides, methods and compositions related thereto
EP1097165A4 (en) * 1998-07-13 2001-09-12 Parkash S Gill NEW INHIBITORS OF ANGIOGENESIS AND TUMOR GROWTH

Also Published As

Publication number Publication date
EP1278874B1 (en) 2009-11-11
CA2408034A1 (en) 2001-11-08
CA2408034C (en) 2011-09-27
GB0010630D0 (en) 2000-06-21
DE60140439D1 (de) 2009-12-24
US20060104964A1 (en) 2006-05-18
ATE448311T1 (de) 2009-11-15
PT1278874E (pt) 2010-02-17
US20040253239A1 (en) 2004-12-16
WO2001083562A2 (en) 2001-11-08
DK1278874T3 (da) 2010-03-29
JP2003531600A (ja) 2003-10-28
AU783059C (en) 2006-03-30
AU5646401A (en) 2001-11-12
EP1278874A2 (en) 2003-01-29
US7247716B2 (en) 2007-07-24
WO2001083562A3 (en) 2002-01-31
AU783059B2 (en) 2005-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2256027T3 (es) Complejos de anticuerpos que contienen multiples citoquinas.
ES2429034T3 (es) Uso de antagonistas de ANGPTL3 para el tratamiento de enfermedades hepáticas
AU741856B2 (en) Vascular endothelial growth factor-B
US6235713B1 (en) Vascular endothelial growth factor-D (VEGF-D) polypeptides
ES2231991T3 (es) Modulo de trimerizacion.
ES2361621T3 (es) Péptidos de lactoferrina útiles como péptidos de penetración celular.
ES2638342T3 (es) Viriones de virus adenoasociado con cápside variante y métodos para su uso
ES2285701T3 (es) Factor-gamma de necrosis tumoral.
ES2653843T3 (es) Sistemas y procedimientos de producción de proteínas
EA027315B1 (ru) Молекула нуклеиновой кислоты и белок для индукции иммунного ответа против антигена рака предстательной железы, плазмида, вектор экспрессии, способ лечения и фармацевтическая композиция
MXPA03002045A (es) Composiciones analogas de factor estimulador de colonias de granulocitos y metodos para su elaboracion.
PT1509253E (pt) Cd154 quimérico novo
CN109715670A (zh) 对muc1特异性的嵌合抗原受体(car)及其使用方法
US20070134206A1 (en) Targeting proteins to deliver therapeutic or diagnostic reagents
KR100911624B1 (ko) Il-12 및 il-23의 효율적인 공동발현 방법
ES2428863T3 (es) Mutante de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y polipéptido químicamente del mismo
CZ88298A3 (cs) Upravený neurotrofní faktor odvozený z gliové buněčné linie
CN101506226A (zh) 改良的色素上皮衍生因子变体及其用途
JP2001000194A (ja) 神経成長因子を真核生物細胞において発現させるための遺伝子ベクター
ES2422879T3 (es) Linfopoyetina estromal tímica humana modificada
ES2336642T3 (es) Proteina hibrida y vector que codifica para la misma para la inhibicion de la angiogenesis.
ES2957688T3 (es) Construcción génica suicida doble e inducible y su uso en terapia génica
ES2234714T3 (es) Interferon beta para el tratamiento de enfermedades inmunes.
JPH05103666A (ja) ヒト神経成長因子を発現させるための方法
AU2007212260A1 (en) Method for treating peripheral arterial disease with zinc finger proteins