ES2336642T3 - Proteina hibrida y vector que codifica para la misma para la inhibicion de la angiogenesis. - Google Patents
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Abstract
Molécula de ácido nucleico aislado, purificado o recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende tanto: a) un antagonista de un factor angiogénico como b) un regulador de la estructura endotelial vascular en la que la estructura de la secuencia de ácido nucleico de dicha molécula comprende la secuencia mostrada en la figura 3 y la secuencia mostrada en la figura 4; o una secuencia que tiene una identidad del 80% con la misma.
Description
Proteína híbrida y vector que codifica para la
misma para la inhibición de la angiogénesis.
La presente invención se refiere a una secuencia
de ácido nucleico recombinante que codifica tanto para un
antagonista de un factor de la angiogénesis específico como para un
regulador de la estructura endotelial vascular; a su preparación; a
la expresión de la proteína; y al uso de la secuencia o la proteína
en la inhibición de la angiogénesis y/o el tratamiento del
cáncer.
La angiogénesis, la formación de vasos
sanguíneos nuevos, es clave en el desarrollo y la progresión del
cáncer. La angiogénesis se rige por una gama de factores
angiogénicos y factores antiangiogénicos. Se conoce que los
factores angiogénicos incluyen una gama de citocinas, tales como
factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF) por ejemplo FGF básico (bFGF),
interleucinas (IL, por ejemplo IL-8) y factor de
crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF). Sin vasos
sanguíneos nuevos, un tumor no puede crecer más allá de 2 mm de
diámetro debido al suministro de sangre y la difusión de
nutrientes/oxígeno limi-
tados.
tados.
Además, las células tumorales pueden diseminarse
en el organismo y producir micro y macrometástasis en los órganos y
tejidos, pero permanecer invisibles durante desde meses hasta años.
Una vez que los vasos sanguíneos nuevos crezcan en estos tumores
latentes, éstos crecerán a una velocidad mucho más rápida, empezarán
a manifestar síntomas clínicos y se volverán letales para los
pacientes. Los vasos sanguíneos nuevos en el tumor proporcionan no
sólo nutrientes y oxígeno, sino también una vía para que las células
tumorales entren en la circulación y por tanto ayudan al proceso
de metástasis.
Por tanto, la antiangiogénesis se ha convertido
en un centro de atención en el desarrollo de nuevos fármacos contra
el cáncer. La importancia fundamental de la angiogénesis en el
desarrollo y la metástasis del cáncer ha llevado al descubrimiento
de un gran número de inhibidores de la angiogénesis, que incluyen
agentes diseñados específicamente como agentes antiangiogénicos
(tales como anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo
anti-bFGF, fumagilina y productos recombinantes a
base de un único gen, tal como angiostatina), y aquellos
descubiertos de manera no intencionada (tales como interferón beta,
tamoxifeno e interleucinas 4 y 12).
Algunos de los antagonistas de los factores
angiogénicos son adecuados para el propósito de la antiangiogénesis,
pero otros no los son. Por ejemplo, cada antagonista trabaja
específicamente sobre sólo un factor angiogénico particular,
mientras que existen aproximadamente de 20-40
factores angiogénicos en el organismo, en cualquier tumor dado.
Otro problema es que el uso de un antagonista específico dará como
resultado un cambio del equilibrio en el que se suprime el factor
angiogénico seleccionado como diana, pero otro(s)
factor(es) aumenta(n) en compensación. Por tanto, el
equilibrio se desplaza desde el factor angiogénico seleccionado como
diana hacia otro u otros, dando como resultado resistencia al
tratamiento antiangiogénico.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un agente para suprimir la angiogénesis, que puede
obtenerse modificando mediante ingeniería genética dos reguladores
importantes de la angiogénesis, un antagonista de un factor
angiogénico y un regulador de la estructura endotelial (tal como la
cadherina endotelial vascular).
Por tanto, se ha modificado mediante ingeniería
genética una molécula recombinante que comprende tanto una
secuencia que puede expresar un antagonista específico como una
secuencia que puede expresar un marcador de células endoteliales
específico, que es un regulador de la estructura endotelial
vascular, que es esencial para la formación de vasos sanguíneos
nuevos. Los productos recombinantes (denominados de manera colectiva
en el presente documento productos KV, tales como aquéllos
denominados KVEn, en el que n es un número entero, K representa el
antagonista de un factor angiogénico, V representa las células
endoteliales vasculares y E representa el vector de expresión, y
otros denominados mediante números de J) ambos conservan las
propiedades antagonistas de un factor antiangiogénico; y también
reconocen específicamente células que producen vasos sanguíneos
nuevos, es decir las células endoteliales vasculares.
Por tanto, los productos recombinantes
trabajarán sobre el mecanismo general para formar vasos sanguíneos
nuevos así como sobre un mecanismo específico operado por un factor
angiogénico específico; y tienen la ventaja adicional de impedir el
cambio del equilibrio y la resistencia a la angiogénesis a la que se
enfrenta actualmente el tratamiento antiangiogénico.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislado, purificado o
recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende
tanto:
- (a)
- un antagonista de un factor angiogénico y un regulador de la estructura endotelial vascular, en la que la estructura de la secuencia de ácido nucleico de dicha proteína de fusión comprende la secuencia mostrada en la figura 3 y la secuencia mostrada en la figura 4; o
- (b)
- una secuencia homóloga en el 80% a la secuencia (a).
\vskip1.000000\baselineskip
Por "homóloga" en el presente documento se
entiende una secuencia que tiene una identidad de nucleótidos (o,
en el caso de una secuencia de aminoácidos, bases) de al menos el
80% en el mismo orden dentro de la secuencia. Preferiblemente, la
secuencia tiene una homología de al menos el 85% y más
preferiblemente de al menos el 90%, tal como superior al 95%.
La presente invención proporciona además una
secuencia (de aminoácidos) de un polipéptido (proteína) codificada
por una secuencia de nucleótidos de la invención.
Por tanto, ahora se describirán realizaciones
específicas de la presente invención, con referencia a las figuras
adjuntas, en las que:
la figura 1 es la secuencia de ácido nucleico de
la KVE702 recombinante, que tiene 1695 ácidos nucleicos;
la figura 2 es la secuencia de aminoácidos
prevista de la proteína KVE702, codificada por la secuencia de
KVE702 recombinante, que se lee desde la posición 1 y que tiene 566
aminoácidos;
la figura 3 es aquella parte de la secuencia de
la figura 1 derivada de MRC-5 (el componente
antagonista angiogénico, KS2101);
la figura 4 es aquella parte de la secuencia de
la figura 1 derivada de HUVEC (el componente regulador de la
estructura endotelial vascular, VC503);
la figura 5 es la secuencia de ácido nucleico de
KS2105;
la figura 6 es la secuencia de ácido nucleico de
VC1;
la figura 7 es la secuencia de ácido nucleico de
J12;
la figura 8 es la secuencia de ácido nucleico de
la J35 recombinante;
la figura 9 es la secuencia de ácido nucleico de
J11;
la figura 10 es la secuencia de ácido nucleico
de la J36 recombinante;
la figura 11 es la secuencia de ácido nucleico
de J8;
la figura 12 es la secuencia de ácido nucleico
de J37;
la figura 13 es la secuencia de aminoácidos
prevista para la proteína J35, que corresponde a la secuencia de
ácido nucleico de la figura 8;
la figura 14 es la secuencia de aminoácidos
prevista para la proteína J36, que corresponde a la secuencia de
ácido nucleico de la figura 10;
la figura 15 es la secuencia de aminoácidos
prevista para la proteína J37, que corresponde a la secuencia de
ácido nucleico de la figura 12;
la figura 16 es la secuencia de ácido nucleico
de J9;
la figura 17 es la secuencia de ácido nucleico
de J10; y
la figura 18 es la secuencia de ácido nucleico
de J6.
Los oligonucleótidos (d) particulares que se
incluyen en esta invención son aquéllos que codifican para el
regulador de la estructura endotelial vascular. El regulador de la
estructura endotelial se deriva adecuadamente de
VE-cadherina, E-selectina, ocludina,
claudina-5 y/o molécula de adhesión de células
vasculares (VCAM), especialmente VE-cadherina,
ocludina y claudina-5.
Por consiguiente, la presente patente enseña
además una secuencia de ácido nucleico aislado, purificado o
recombinante (a continuación en el presente documento, una secuencia
de KV) que comprende:
- (a)
- una secuencia que codifica para un regulador de la estructura endotelial vascular, tal como VC1, VC503, J8, J11 y J12, tal como se define a continuación;
- (b)
- una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida con la secuencia (a) en condiciones rigurosas; o
\newpage
- (c)
- una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia (a) o (b) excepto para la degeneración del código genético; o
- (d)
- un oligonucleótido específico para cualquiera de las secuencias (a), (b) o (c).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de antagonista se deriva
adecuadamente de VEGF, bFGF, factor de crecimiento de
hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF) y/o quimiocinas.
Preferiblemente, el fragmento de antagonista se deriva de VEGF y/o
HGF/SF. Los fragmentos de antagonista particularmente preferidos son
KS2101 y KS2105, tal como se define a continuación.
En general, tales productos pueden prepararse
usando una técnica de ADN recombinante convencional. Por ejemplo,
en primer lugar, se preparan una pluralidad de fragmentos de ADN
separados, al menos uno de los cuales comprende una secuencia que
codifica para un antagonista y al menos uno de los cuales comprende
una secuencia que codifica para el regulador de la estructura
endotelial. Esto puede llevarse a cabo con cebadores específicos que
permiten que se prepare un recombinante adicional, lo que genera un
nuevo gen recombinante. En particular, ciertos genes recombinantes,
denominados a continuación en el presente documento KVE702, J35, J36
y J37, se han generado a partir de fragmentos de ADN clonados de
células endoteliales vasculares y fibroblastos humanos. Se ha usado
el nuevo gen KVE702 y sus fragmentos para transfectar células
epiteliales humanas y generar productos que pueden ser adecuados
para la intervención en la angiogénesis.
Por consiguiente, la presente patente enseña
además una secuencia de ácido nucleico aislado, purificado o
recombinante que comprende:
- (a)
- una secuencia que codifica tanto para un antagonista de un factor angiogénico que puede derivarse de una línea celular de fibroblastos humanos, preferiblemente MRC-5, como para un regulador de la estructura endotelial vascular comprendido en células endoteliales vasculares humanas (HUVEC) que pueden extraerse de una vena umbilical humana;
- (b)
- una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida con la secuencia (a) en condiciones rigurosas; o
- (c)
- una secuencia sustancialmente homóloga a o que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia (a) o (b) excepto para la degeneración del código genético; o
- (d)
- un oligonucleótido específico para cualquiera de las secuencias (a), (b) o (c).
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular MRC-5 está
disponible de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales,
y HUVEC puede obtenerse mediante extracción a partir de un cordón
umbilical fresco.
Preferiblemente, la secuencia (a) se selecciona
de las siguientes:
- tal como se muestra en la figura 1 [secuencia de KVE702];
- tal como se muestra en la figura 8 [secuencia de J35];
- tal como se muestra en la figura 10 [secuencia de J36]; y,
- tal como se muestra en la figura 12 [secuencia de J37];
\vskip1.000000\baselineskip
Aquella parte de la secuencia según la invención
[secuencia de KVE702] derivada de la línea celular
MRC-5 se muestra en la figura 3, que es una primera
parte (el componente KS2101) de la secuencia de KVE702. Aquella
parte de la secuencia según la invención [secuencia de KVE702]
derivada de HUVEC se muestra en la figura 4, que es la parte
restante (el componente VC503) de la secuencia de KVE702.
Aquella parte de la secuencia según la enseñanza
[secuencia de J35] derivada de la línea celular
MRC-5 se muestra en la figura 16, que es una
primera parte (el componente J9) de la secuencia de J35. Aquella
parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J35]
derivada de HUVEC se muestra en la figura 7, que es la parte
restante (el componente J12) de la secuencia de J35.
Aquella parte de la secuencia según la enseñanza
[secuencia de J36] derivada de la línea celular
MRC-5 se muestra en la figura 17, que es una
primera parte (el componente J10) de la secuencia de J36. Aquella
parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J36]
derivada de HUVEC se muestra en la figura 9, que es la parte
restante (el componente J11) de la secuencia de J36.
Aquella parte de la secuencia según la enseñanza
[secuencia de J37] derivada de la línea celular
MRC-5 se muestra en la figura 18, que es una
primera parte (el componente J6) de la secuencia de J37. Aquella
parte de la secuencia según la enseñanza [secuencia de J37]
derivada de HUVEC se muestra en la figura 11, que es la parte
restante (el componente J18) de la secuencia de J37.
Usando estos productos clonados, es posible
transfectar una célula adecuada y establecer transfectantes estables
para observar si la transfección afecta al comportamiento de
movilidad de las células transfectadas. La determinación de una
célula adecuada para la transfección se lleva a cabo mediante los
métodos de ensayo y error habituales conocidos en la técnica en los
que, por ejemplo, células leucémicas, fibroblásticas o epiteliales
humanas se transfectan con un plásmido que porta tanto el gen como
un gen de resistencia a antibióticos, a las que se añaden
antibióticos tóxicos (tal como G418, disponible de Invitrogen). Por
tanto, las células que no pueden incorporar el gen morirán como
resultado del antibiótico, permitiendo de ese modo la exclusión de
las células inadecuadas para la transfección. Un ejemplo de tales
células adecuadas es la línea celular de cáncer de mama humano,
MCF-7. Entonces, los transfectantes pueden usarse
para generar proteínas recombinantes para pruebas en un ensayo de
angiogénesis y la posterior selección para su uso diagnóstico y/o
terapéutico.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona además un constructo aislado, purificado o recombinante
que incorpora una secuencia de KV según la descripción anterior, en
particular, una en la que la secuencia de ácido nucleico está unida
operativamente con nucleótidos que permiten la expresión y secreción
en un huésped celular de una proteína (a continuación en el
presente documento, la proteína KV) codificada por la secuencia de
KV.
Además, esta invención proporciona ADN o ARN,
especialmente ADNc o ARNm, según cualquiera de las secuencias o los
constructos mencionados anteriormente; y un método para preparar tal
ADN o ARN tal como se describe en el presente documento, junto con
tal ADN o ARN que puede prepararse mediante un método de este
tipo.
Por consiguiente, la presente patente enseña
también un método para preparar una secuencia de KV, método que
comprende:
- (a)
- generar un fragmento de ADNc que codifica para un antagonista de un factor de la angiogénesis específico;
- (b)
- generar un fragmento de ADNc que codifica para un regulador de la estructura endotelial vascular específico, cuyos fragmentos (a) y (b) son complementarios en un extremo de los mismos; y
- (c)
- combinar los fragmentos para generar un gen recombinante que puede expresar la proteína KV correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Especialmente, la presente invención proporciona
un polipéptido aislado, purificado o recombinante que comprende
tanto un antagonista de un factor angiogénico como un regulador de
la estructura endotelial vascular, y, en particular, un polipéptido
aislado, purificado o recombinante que comprende la proteína KV, o
un mutante o variante de la misma que tiene sustancialmente la
misma actividad que la proteína KV.
Por ejemplo, se proporciona un polipéptido
aislado, purificado o recombinante que comprende la secuencia de
aminoácidos de la figura 2 [proteína KVE702 prevista].
Otras moléculas enseñadas por esta patente
incluyen la figura 13 [proteína J35 prevista], figura 14 [proteína
J36 prevista], figura 15 [proteína J37 prevista]; o cualquier
proteína KV cuando se expresa por una secuencia de ADN según esta
invención.
Resultará evidente que la invención proporciona
por tanto además una célula, un plásmido, un virus o un organismo
vivo que se ha modificado mediante ingeniería genética para producir
una proteína KV, teniendo dicha célula, plásmido, virus u organismo
vivo incorporado de manera expresable en el mismo una secuencia de
nucleótidos de KV según esta invención; un vector que comprende una
secuencia de este tipo; y/o una célula huésped transformada o
transfectada con un vector de este tipo.
Para la terapia génica, preferiblemente se
elegiría y modificaría mediante ingeniería genética un vector viral
para producir la proteína KV. Pueden usarse vectores tanto
retrovirales como adenovirales, tal como los sistemas
Retro-X^{TM} o Adeno-X^{TM} de
Clontech (EE.UU.).
Además, esta patente enseña un procedimiento
para obtener una fuente sustancialmente homóloga de proteína KV,
procedimiento que comprende cultivar células que tienen incorporadas
de manera expresable en ellas mismas una secuencia de nucleótidos
de KV según esta invención, y después recuperar las células
cultivadas.
Por tanto, la(s) proteína(s) KV
según esta invención pueden usarse en relación con cualquier estado
asociado con la angiogénesis, tal como el cáncer, para la
regulación del desarrollo de vasos sanguíneos y su formación, ya
sea en el endotelio vascular y/o un tumor. Una dosis adecuada puede
determinarse según las técnicas convencionales conocidas por los
expertos en la técnica de la farmacia, pero convenientemente puede
estar en el intervalo de desde 0,5 hasta 10 mg/kg de peso corporal,
administrada en un régimen adecuado, tal como desde una vez hasta
siete veces por
semana.
semana.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona aún adicionalmente una proteína KV de este tipo,
opcionalmente en asociación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable para la misma, para su uso en tratamiento, tal como para
su uso en cualquiera de los estados mencionados en el presente
documento. Se prefiere especialmente que, para la proteinoterapia,
se proporcione una formulación farmacéutica que comprenda una
proteína (proteína KV) de este tipo en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable para la misma. Las formulaciones
preferidas incluyen aquéllas para administración parenteral, tales
como inyecciones e infusiones para administración intravenosa o
intramuscular. Otras formulaciones adecuadas son bien conocidas para
los expertos en la técnica de los productos farmacéuticos.
También se proporcionan o se enseñan:
- \quad
- un método para preparar tales formulaciones, método que comprende asociar la proteína (proteína KV) con el vehículo;
- \quad
- un método para la profilaxis o el tratamiento de un mamífero, incluyendo el ser humano, que comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad eficaz, no tóxica de una proteína de este tipo (proteína KV);
- \quad
- una proteína KV para su uso en medicina, tal como en la inhibición de la angiogénesis y/o el tratamiento del cáncer;
- \quad
- y el uso de una proteína KV en la preparación de un medicamento, adecuado para su uso en la inhibición de la angiogénesis y/o el tratamiento del cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo
de ilustración de la presente invención.
Se usaron fibroblastos humanos (una línea
celular establecida, MRC-5) y células endoteliales
vasculares humanas (HUVEC) (extraídas de una vena umbilical humana)
(Cai J. et al. Gamma linolenic acid inhibits expression of
VE-cadherin and tube formation in human vascular
endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 1999, 258, 113-118).
Se aisló ARNm a partir de fibroblastos o células
endoteliales usando un kit de extracción de ARNm (Sigma Chemicals,
Poole, Dorset, RU). Se preparó el ADN complementario (ADNc) a partir
del ARNm usando un kit de transcripción inversa (Promega).
Se diseñaron conjuntos de cebadores de PCR para
amplificar las zonas de interés a partir del ADNc preparado, es
decir antagonista a partir de los fibroblastos y marcador
endotelial/antagonista a partir de las células endoteliales. Se
diseñaron los cebadores de PCR de tal modo que los productos de cada
reacción se usaran en la recombinación posterior. Los cebadores
fueron sintetizados por Life Technologies y se usaron exclusivamente
para este trabajo. Aquellos cebadores diseñados para la clonación
del gen recombinante denominado en el presente documento KVE702
fueron los siguientes:
- i
- CAT GAG CCT CTG GAC TAT TGT AGG TGT GGT
- ii
- ACC ACA CCT ACA ATA GTC CAG AGG CTC ATG AT
- iii
- ACC ATG GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC
- iv
- TTT GAT GGT GAA GCT GGA
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la amplificación en tres
entornos separados: en primer lugar, generar un fragmento a partir
de ADNc de fibroblastos y, en segundo lugar, generar un fragmento a
partir de ADNc de HUVEC, siendo ambos productos complementarios en
un extremo. La etapa final era generar un producto recombinante
mediante la unión de los dos fragmentos. Se realizó cada reacción
en condiciones especiales con el fin de generar los productos
deseados, tal como sigue:
\newpage
- \quad
- Entorno 1 (generar antagonista): 95ºC durante 5 minutos, luego 36 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 61ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, seguidos por 72ºC durante 7 minutos.
- \quad
- Entorno 2 (generar marcador endotelial): 95ºC durante 5 minutos, luego 36 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 58ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos, seguidos por 72ºC durante 10 minutos.
- \quad
- Entorno 3 (generar gen recombinante): sin cebador a 95ºC durante 5 minutos, luego
- \quad
- 4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 35ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
- \quad
- 4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 40ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
- \quad
- 4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 45ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
- \quad
- 4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 50ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
- \quad
- 4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
- \quad
- 4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, luego
- \quad
- 4 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 64ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 10 minutos;
- \quad
- luego, con los cebadores añadidos, 35 ciclos de 95ºC durante 40 segundos, 59ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 90 segundos, seguidos por 72ºC durante 10 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los
siguientes productos:
- 1.
- Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR, denominados en el presente documento: KS2101 (figura 3, [SEQ ID NO:]) y KS2105 (figura 5, [SEQ ID NO:]) (en relación con el antagonista). KS2105 está relacionado con KS2101, pero sin tener una cola que se corresponde con el marcador endotelial. Se preparó KS2105 usando el siguiente cebador adicional:
- v GAC TAT TGT AGG TGT GGT ATC
- 2.
- Fragmentos de ADN a partir de células HUVEC, denominados en el presente documento: VC503 (figura 4, [SEQ ID NO:]) y VC1 (figura 6, [SEQ ID NO:]) (ambos en relación con los reguladores de la estructura endotelial vascular). VC1 está relacionado con VC503 sin tener una cola que se corresponde con el antagonista y se preparó usando el siguiente cebador adicional:
- v GTG TCC TTG TCC ACA ATG ACT
- 3.
- La secuencia recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar la secuencia recombinante, mediante la unión de KS2101 y VC503, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó una secuencia recombinante específica, concretamente KVE702 (figura 1, [SEQ ID NO:]).
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron cada fragmento y el gen recombinante
en un vector de expresión de mamíferos
(pcDNA3.1/V5/His-TOPO, disponible de InVitrogen) y
se transfectaron en una E. coli competente. Se detectaron las
colonias que portaban los productos deseados usando PCR. Se
expandieron e hicieron crecer adicionalmente las colonias positivas
en gran volumen. Entonces se purificaron de estas preparaciones de
E. coli los plásmidos que resultaron de clonar los genes en
el vector (es decir que portaban los productos específicos).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron los plásmidos que portaban los
genes KS2101, KS2105, VC1, VC503 y KVE702 en células epiteliales de
mamíferos. Se usó un agente de transfección, Transfast (Promega).
Después de pruebas en serie, se encontró que las células
MCF-7 (bien conocidas como línea celular de cáncer
de mama humano) eran la célula más adecuada y aceptable para este
fin y se eligieron para ser las células para la transfección en el
actual estudio. La condición de transfección óptima fue a
Transfast:ADN = 2:1.
Tras la transfección, se seleccionaron las
células que retuvieron estos nuevos genes usando un medio de
selección que contenía G418 (de InVitrogen o Calbiochem), lo que
provocó que las células que no tenían los nuevos genes murieran
gradualmente mientras que aquéllas con los nuevos genes continuaran
dividiéndose. Se obtuvieron las células que expresaban estos nuevos
genes de interés después de una selección de más de 4 semanas (los
denominados transfectantes estables). Se observó que las células de
tipo natural (no transfectadas) morían casi todas tras dos semanas,
mientras que entre el 10-30% de las células
transfectadas con los genes de interés seguían siendo viables. En
aproximadamente 4 semanas, una cantidad suficiente de estas células
viables estaban disponibles para las pruebas biológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de someter a prueba si las células
transfectadas de manera estable (preparadas según el ejemplo 2)
eran diferentes del tipo natural, se llevó a cabo una técnica
conocida como ensayo de propagación de células/dispersión de
colonias (Jiang et al. Monocyte conditioned media possess a
novel factor which increases motility of cancer cells Int. J.
Cancer 53 426-431 (1993)). Brevemente, el tipo
natural o los transfectantes se sembraron en placa en artículos de
cultivo tisular a baja densidad y entonces se permitió que formaran
colonias (agrupamientos). Luego, se trataron o bien con medio como
control o bien con un factor que inducía dispersión (HGF/SF). Tras
24 horas, se fijaron las células y se obtuvieron imágenes
digitalizadas usando una cámara digital. Se cuantificaron la
propagación y dispersión según lo descrito por Jiang et al.
(en Gamma linolenic acid inhibits selectively regulates the
expression maspin and motility of cancer cells. Biochemical and
Biophysical Research Communications 237 639-644
(1997)) usando un paquete de análisis de imágenes (Optimas 6 de
Optimas UK); los resultados para cada cultivo fueron los
siguientes:
Las células MCF-7 de tipo
natural formaron agrupamientos compactos en el cultivo con clara
unión célula-célula. Un inductor de dispersión
(HGF/SF) puede dispersar las colonias, es decir las células
claramente se alejan unas de otras.
Las células transfectadas con VC1 aparecieron
como agrupamientos mucho más compactos, en comparación con el tipo
natural. Los transfectantes de VC1 redujeron sustancialmente su
respuesta a HGF/SF (5, 10, 2 y 50 ng/ml). Las células aparecieron
como agrupamientos compactos, pequeños, con la unión
célula-célula que permanecía visible.
El transfectante de KS2105 presentaba una
morfología celular similar, cuando se comparó con los controles.
Sin embargo, estas células redujeron su respuesta significativamente
a HGF/SF. Se observó una respuesta similar, aunque en menor grado,
con los transfectantes de KS2101.
El KSE702 establecido reveló una morfología
similar al control. El inductor de dispersión HGF/SF no indujo un
cambio significativo. Por tanto, la transfección no alteró la
morfología de la célula, pero redujo su respuesta a HGF/SF.
Por tanto, los datos obtenidos muestran
claramente que las células MCF-7 transfectadas con
VC1, KS2101 y KS2105 no cambiaron significativamente su morfología.
De hecho, las células parecieron reducir su respuesta a la
estimulación. Por tanto, los datos indican que la transfección no
alteró la agresividad de las células MCF-7.
\vskip1.000000\baselineskip
El estudio usó una técnica conocida como
análisis de formación de túbulos in vitro, para someter a
prueba el efecto de los materiales recombinantes sobre la formación
de estructuras similares a vasos sanguíneos (Kanayasu et al.
Eicosapentaenoic acid inhibits tube formation of vascular
endothelial cells in vitro. Lipids, 26
271-276 (1991); Bach et al.
VE-cadherin mediates endothelial cell capillary tube
formation in fibrin and collagen gels Exp Cell Res 238
324-334 (1998)).
En primer lugar, se recubrieron placas de 24
pocillos múltiples con Matrigel^{TM} (disponible de Beckton
Dickinson) (200 \mug/pocillo) y se dejó que formaran una capa de
gel delgada. Luego, se añadieron 5 x 10^{4} células HUVEC en 0,5
ml de DMEM con suero de ternero fetal (FCS) al 10% sobre
Matrigel^{TM} durante 24 horas. Se aspiró el medio, y se
superpusieron 0,5 ml adicionales de Matrigel^{TM} con 0,5 ml
adicionales de medio, que contenía cualquier medio, HGF, NK4 o NK4
y HGF en combinación. Se observaron los cultivos celulares con un
microscopio de contraste de fases después de 24 horas. Se fotografió
cada pocillo cuatro veces al azar y se midió la longitud de los
túbulos usando un software de análisis de imágenes (Optimas 6 de
Optimas UK). Entonces se sometieron a prueba en las células un
inductor de la angiogénesis conocido, HGF/SF, y un medio
acondicionado de los transfectantes estables. Los resultados del
estudio fueron los siguientes:
El medio acondicionado del transfectante de VC1
redujo la formación de túbulos que se indujo por HGF/SF. El medio
acondicionado por sí mismo pareció tener algún efecto menor sobre la
formación de túbulos. Curiosamente, el sobrenadante de KS2105
redujo la formación de túbulos tanto con como sin el inductor de la
angiogénesis.
El medio acondicionado de KVE702 aumentó la
longitud de los túbulos, aunque en pequeño grado. Sin embargo,
cuando se incluyó un factor angiogénico, que aumentó
significativamente la longitud de los túbulos, el sobrenadante de
KVE702 ejerció un efecto inhibidor significativo sobre la formación
de túbulos. Conclusión: por tanto, se observó que el HGF/SF aumentó
significativamente la formación de túbulos en las células
endoteliales vasculares. Los sobrenadantes de los transfectantes
estables pueden reducir este aumento en la formación de túbulos. Por
tanto, la presente invención puede presentar una nueva oportunidad
para producir agentes contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando las técnicas descritas anteriormente en
el ejemplo 2, se transfectaron MCF-7 (células de
cáncer de mama humano) con el gen KVE702 y un transfectante estable
seleccionado usando G418. Entonces se sometieron a prueba las
células usando el ensayo de invasión de Matrigel^{TM} establecido
descrito por Jiang et al. en Cancer Research, 55
5043-8 (1995). Se encontró que las células
transfectadas tenían una invasividad reducida en comparación con
las células MCF-7 naturales o con las células
MCF-7 que se habían transfectado con un plásmido
control que portaba el gen Lac-z (disponible de
InVitrogen). También se encontró que la respuesta de las células
transfectadas a HGF/SF se redujo significativamente, en comparación
con las células control y naturales.
Dado que la invasividad de las células
cancerosas está relacionada directamente con la progresión y
metástasis de un cáncer, su reducción indica un futuro potencial en
el tratamiento contra el cáncer para el producto recombinante de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el método del ejemplo 1, se preparó el
producto recombinante del título, usando los siguientes cebadores
en lugar de i-iv del ejemplo 1:
- i
- acc atg ggc gcg cag tgc acc
- ii
- ctt cag tgc tgg cac aga cgg gtc gta
- iii
- tac gac ccg tct gtg cca gca ctg aag
- iv
- gac tat tgt agg tgt ggt a
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los
siguientes productos:
- 1.
- Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR: J9 (antagonista) (figura 16, [SEQ ID NO:]).
- 2.
- Se aislaron fragmentos de ADN a partir de células HUVEC: J12 (marcador endotelial) (figura 7, [SEQ ID NO:]).
- 3.
- Un gen recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar un gen recombinante, mediante la unión de J9 y J12, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó un gen recombinante específico, concretamente: J35 (producto recombinante) (figura 8, [SEQ ID NO:]).
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el método del ejemplo 1, se preparó el
producto recombinante del título, usando los siguientes cebadores
en lugar de i-iv del ejemplo 1:
- i
- acc atg gga gtg aac cca act gct cag
- ii
- ctt cag tgc tgg ctc ctg ggg atc cac
- iii
- gtg gat ccc cag gag cca gca ctg aag
- iv
- gac tat tgt agg tgt ggt a
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los
siguientes productos:
- 1.
- Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR: J10 (antagonista) (figura 17, [SEQ ID NO:]).
- 2.
- Se aislaron fragmentos de ADN a partir de células HUVEC: J11 (marcador endotelial) (figura 9, [SEQ ID NO:]).
- 3.
- Un gen recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar un gen recombinante, mediante la unión de KS2101 y J11, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó un gen recombinante específico, concretamente: J36 (producto recombinante) (figura 10, [SEQ ID NO:]).
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo el método del ejemplo 1, se preparó el
producto recombinante del título, usando los siguientes cebadores
en lugar de i-iv del ejemplo 1:
- i
- acc atg gga aac cca act gct cag
- ii
- cca aat cca atc ctc ctg gga atc cac
- iii
- gtg gat ccc cag gag gat tgg att tgg
- iv
- ctg ggc ggc cat atc ctc gca gaa ggt
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estas reacciones, se generaron los
siguientes productos:
- 1.
- Se aislaron fragmentos de ADN a partir de fibroblastos usando RT-PCR: J6 (antagonista) (figura 18, [SEQ ID NO:]).
- 2.
- Se aislaron fragmentos de ADN a partir de células HUVEC: J8 (marcador endotelial) (figura 11, [SEQ ID NO])
- 3.
- Un gen recombinante: se llevó a cabo una etapa adicional para generar un gen recombinante, mediante la unión de KS2101 y J8, usando la técnica recombinante mencionada anteriormente. Esto generó un gen recombinante específico, concretamente: J37 (producto recombinante) (figura 10, [SEQ ID NO:]).
<110> Facultad de Medicina de la
Universidad de Gales
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencia recombinante, su
preparación y uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> WJLJ-WCM75
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 566
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1428
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1788
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 482
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1638
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
Claims (9)
1. Molécula de ácido nucleico aislado,
purificado o recombinante que codifica para una proteína de fusión
que comprende tanto:
- a)
- un antagonista de un factor angiogénico como
- b)
- un regulador de la estructura endotelial vascular
en la que la estructura de la secuencia de ácido
nucleico de dicha molécula comprende la secuencia mostrada en la
figura 3 y la secuencia mostrada en la figura 4; o una secuencia que
tiene una identidad del 80% con la misma.
2. Molécula según la reivindicación 1, en la que
la molécula de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia
mostrada en la figura 1.
3. Polipéptido codificado por una molécula de
ácido nucleico según cualquier reivindicación anterior.
4. Polipéptido según la reivindicación 3, que
comprende la secuencia mostrada en la figura 2.
5. Vector que tiene incorporado de manera
expresable en el mismo una molécula según las reivindicaciones 1 ó
2.
6. Célula, plásmido, virus, bacteria u otro
organismo vivo que tiene incorporado de manera expresable en el
mismo una molécula según las reivindicaciones 1 ó 2.
7. Célula huésped transfectada o transformada
con un vector según la reivindicación 5.
8. Uso de un polipéptido según la reivindicación
3 o la reivindicación 4 en la preparación de un medicamento para el
tratamiento o la prevención de la angiogénesis o el cáncer.
9. Formulación que comprende un polipéptido
según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en asociación con
un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma.
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