PT1278874E - Proteína híbrida e vector que codifica a mesma para inibição da angiogénese - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Proteína híbrida e vector que codifica a mesma para inibição da angiogénese" A presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica simultaneamente um antagonista de um factor de angiogénese especifico e um regulador da estrutura endotelial vascular; à sua preparação; à expressão da proteína; e à utilização da sequência ou da proteína na inibição da angiogénese e/ou no tratamento de cancro. A angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos, é um ponto-chave no desenvolvimento e progressão do cancro. A angiogénese é governada por uma gama de factores angiogénicos e factores anti-angiogénicos. Sabe-se que os factores angiogénicos incluem uma gama de citoquinas, tais como o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) eg FGF Básico (bFGF), interleucinas (IL, eg IL-8) e factor de crescimento de hepatócitos/factor de dispersão (HGF/SF). Sem novos vasos sanguíneos, um tumor não pode crescer para além de 2 mm de diâmetro, devido aos limitados fornecimento de sangue e difusão de nutrientes/oxigénio.

Adicionalmente, as células tumorais podem disseminar-se no corpo e produzir micro- e macro-metástases em órgãos e tecidos, mas permanecem invisíveis durante meses a anos. Uma vez que cresçam novos vasos sanguíneos nestes tumores quiescentes, estes irão crescer a uma velocidade muito maior, começando a manifestar sintomas clínicos e tornam-se letais para os pacientes. Novos vasos sanguíneos no tumor não apenas fornecem nutrientes e oxigénio, como também proporcionam uma passagem para as células tumorais entrarem na circulação e portanto ajudam no processo de metástase.

Assim, a anti-angiogénese tem-se tornado um foco no desenvolvimento de novos fármacos anti-cancerosos. A importância fundamental da angiogénese no desenvolvimento do cancro e na metástase levou à identificação de um grande número de inibidores da angiogénese, incluindo agentes 2 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ especificamente designados como agentes anti-angiogénese (tais como o anticorpo anti-VEGF, o anticorpo anti-bFGF, a fumagilina e produtos recombinantes baseados num único gene, tais como a angiostatina), e os identificados não intencionalmente (tais como o beta-interferão, o tamoxifeno e as interleuquinas-4 e -12).

Alguns antagonistas de factores angiogénicos são adequados para anti-angiogénese, mas outros não são. Por exemplo, cada antagonista funciona especificamente em apenas um factor angiogénico particular, enquanto existem cerca de 20-40 factores angiogénicos no corpo, em qualquer tumor determinado. Outro problema é que a utilização de um antagonista especifico resultará num desvio do equilíbrio em que o factor angiogénico alvo é suprimido, mas outro(s) factor(es) aumentam em compensação. Portanto, os desvios de equilíbrio do factor angiogénico alvo para outro ou outros, resultam em resistência à terapia anti-angiogénese.

Assim, a presente invenção é dirigida a um agente para suprimir a angiogénese, obtenível por engenharia genética de dois importantes reguladores da angiogénese, um antagonista de um factor angiogénico e um regulador da estrutura endotelial (tal como a caderina endotelial vascular).

Manipulámos portanto geneticamente uma molécula recombinante que compreende tanto uma sequência capaz de expressar um antagonista específico como uma sequência capaz de expressar um marcador de células endoteliais específico, sendo um regulador da estrutura endotelial vascular, que é essencial para a formação de novos vasos sanguíneos. Os produtos recombinantes (referidos colectivamente aqui por produtos KV, tais como os referidos por KVEn, em que n é um número inteiro, K representa o antagonista do factor angiogénico, V representa células endoteliais vasculares e E representa o vector de expressão, e outros referidos por números J) retêm todos as propriedades antagonistas de um factor anti-angiogénico; e também reconhecem especificamente células que produzem novos vasos sanguíneos, ie células endoteliais vasculares. 3 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Portanto, os produtos recombinantes irão funcionar sobre o mecanismo geral para a formação de novos vasos sanguíneos assim como sobre mecanismos específicos operados por um factor angiogénico específico; e têm a vantagem adicional de evitar o desvio do equilíbrio e a resistência à angiogénese que presentemente enfrenta a terapia anti-angiogénese.

Assim, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico purificada ou recombinante, isolada, que codifica uma proteína de fusão compreendendo simultaneamente: (a) um antagonista de um factor angiogénico e um regulador da estrutura endotelial vascular, em que a estrutura da sequência de ácido nucleico da referida proteína de fusão compreende a sequência apresentada na Figura 3 e a sequência apresentada na Figura 4; ou; (b) uma sequência 80% homóloga à sequência (a).

Por 'homólogo' entenda-se aqui uma sequência possuindo pelo menos 80% de identidade de nucleótidos (ou, no caso de uma sequência de aminoácidos, de bases) pela mesma ordem dentro da sequência. Preferivelmente, a sequência possui pelo menos 85% e mais preferivelmente pelo menos 90%, tal como mais de 95% de homologia. A presente invenção proporciona ainda uma sequência polipeptídica (de aminoácidos) (proteína) codificada por uma sequência de nucleótidos da invenção.

Concretizações específicas da presente invenção serão portanto agora descritas com referência às Figuras anexas, nas quais: a Figura 1 é a sequência de ácido nucleico do KVE702 recombinante, possuindo 1695 ácidos nucleicos; a Figura 2 é a sequência de aminoácidos prevista da proteína kve 702, codificada pela sequência de KVE702 recombinante, lendo a partir da posição 1 e possuindo 566 aminoácidos; a Figura 3 é a parte da sequência da Figura 1 derivada de MRC-5 (a componente do antagonista angiogénico, KS2101); 4 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ a Figura 4 é a parte da sequência da Figura 1 derivada de HUVEC (a componente do regulador da estrutura endotelial vascular, VC503); a Figura 5 é a sequência de ácido nucleico de KS2105; a Figura 6 é a sequência de ácido nucleico de VC1; a Figura 7 é a sequência de ácido nucleico de J12; a Figura 8 é a sequência de ácido nucleico de J35 recombinante; a Figura 9 é a sequência de ácido nucleico de Jll; a Figura 10 é a sequência de ácido nucleico de J36 recombinante; a Figura 11 é a sequência de ácido nucleico de J8; a Figura 12 é a sequência de ácido nucleico de J37; a Figura 13 é a sequência de aminoácidos prevista para a proteina J35, correspondente à sequência de ácido nucleico da

Figura 8; a Figura 14 é a sequência de aminoácidos prevista para a proteina J36, correspondente à sequência de ácido nucleico da

Figura 10; a Figura 15 é a sequência de aminoácidos prevista para a proteina J37, correspondente à sequência de ácido nucleico da

Figura 12; a Figura 16 é a sequência de ácido nucleico de J9; a Figura 17 é a sequência de ácido nucleico de J10; e a Figura 18 é a sequência de ácido nucleico de J6.

Os oligonucleótidos particulares (d) que estão incluídos na presente invenção são aqueles que codificam o regulador da estrutura endotelial vascular. O regulador da estrutura endotelial é adequadamente derivado de VE-caderina, E-selectina, ocludina, claudina-5 e/ou da molécula de adesão celular vascular (VCAM), especialmente VE-caderina, ocludina e claudina-5.

Assim, a presente patente ensina ainda uma sequência de ácido nucleico purificada ou recombinante, isolada, (daqui em diante, uma sequência KV) compreendendo: 5 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ (a) uma sequência que codifica um regulador da estrutura endotelial vascular, tal como VC1, VC503, J8, Jll e J12, como definido adiante; (b) uma sequência substancialmente homóloga a, ou que híbrida com, a sequência (a) sob condições rigorosas; ou (c) uma sequência substancialmente homóloga a, ou que híbrida sob condições rigorosas com a sequência (a) ou (b) excepto quanto à degenerescência do código genético; ou (d) um oligonucleótido específico para qualquer das sequências (a), (b) ou (c) . 0 fragmento antagonista é adequadamente derivado de VEGF, bFGF, factor de crescimento de hepatócitos/factor de dispersão (HGF/SF) e/ou quimioquinas. Preferivelmente, o fragmento antagonista é derivado de VEGF e/ou HGF/SF. Os fragmentos antagonistas particularmente preferidos são KS2101 e KS2105, como definido adiante.

Em geral, estes produtos podem ser preparados utilizando uma técnica de ADN recombinante convencional. Por exemplo, primeiro, preparam-se uma pluralidade de fragmentos de ADN separados, em que pelo menos um compreende uma sequência que codifica um antagonista e em que pelo menos um compreende uma sequência que codifica o regulador da estrutura endotelial. Isto pode ser realizado com iniciadores específicos que permitem que seja preparado um recombinante adicional, que geram um novo gene recombinante. Em particular, determinados genes recombinantes, aqui referidos adiante como KVE702, J35, J36 e J37, foram gerados a partir de fragmentos de ADN clonados a partir de fibroblastos humanos e células endoteliais vasculares. 0 novo gene KVE702 e seus fragmentos foram utilizados para transfectar células epiteliais humanas e para gerar produtos que podem ser adequados para intervenção na angiogénese.

Assim, a presente patente ensina ainda uma sequência de ácido nucleico purificada ou recombinante, isolada, compreendendo: (a) uma sequência que codifica simultaneamente um antagonista de um factor angiogénico derivável de uma linha celular de fibroblastos humanos, preferivelmente MRC-5, e um 6 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ regulador da estrutura endotelial vascular compreendida em células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) extractáveis da veia umbilical humana; (b) uma sequência substancialmente homóloga a, ou que híbrida com, a sequência (a), sob condições rigorosas; ou (c) uma sequência substancialmente homóloga a, ou que híbrida sob condições rigorosas com a sequência (a) ou (b) excepto quanto à degenerescência do código genético; ou (d) um oligonucleótido específico para qualquer das sequências (a), (b) ou (c). A linha celular MRC-5 está disponível a partir da European Collection of Animal Cell Cultures, e a HUVEC é obtenível por extracção a partir do cordão umbilical fresco.

Preferivelmente, a sequência (a) é seleccionada das seguintes: como mostrado na Figura 1 [sequência KVE702]; como mostrado na Figura 8 [sequência J35]; como mostrado na Figura 10 [sequência J36]; e, como mostrado na Figura 12 [sequência J37]; A parte da sequência de acordo com a invenção [sequência KVE702] derivada da linha celular MRC-5 está mostrada na Figura 3, sendo uma primeira parte (a componente KS2101) da sequência KVE702. A parte da sequência de acordo com a invenção [sequência KVE702] derivada de HUVEC está mostrada na Figura 4, sendo a parte restante (a componente VC503) da sequência KVE702. A parte da sequência de acordo com o ensinamento [sequência J35] derivada da linha celular MRC-5 está mostrada na Figura 16, sendo uma primeira parte (a componente J9) da sequência J35. A parte da sequência de acordo o ensinamento [sequência J35] derivada de HUVEC está mostrada na Figura 7, sendo a parte restante (a componente J12) da sequência J35. A parte da sequência de acordo com o ensinamento [sequência J36] derivada da linha celular MRC-5 está mostrada na Figura 17, sendo uma primeira parte (a componente J10) da sequência J36. A parte da sequência de acordo com o 7 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ ensinamento [sequência J36] derivada de HUVEC está mostrada na Figura 9, sendo a parte restante (a componente Jll) da sequência J36. A parte da sequência de acordo com o ensinamento [sequência J37] derivada da linha celular MRC-5 está mostrada na Figura 18, sendo uma primeira parte (a componente J6) da sequência J37. A parte da sequência de acordo com o ensinamento [sequência J37] derivada de HUVEC está mostrada na Figura 11, senso a parte restante (a componente J8) da sequência J37.

Utilizando estes produtos clonados, é possível transfectar uma célula adequada e estabelecer transfectantes estáveis para ver se a transfecção afecta o comportamento móvel das células transfectadas. A determinação de uma célula adequada para transfecção é realizada por métodos usuais de tentativa-e-erro conhecidos na especialidade, em que, por exemplo, células humanas epiteliais, fibroblásticas ou leucémicas, são transfectadas com um plasmídeo portador tanto do gene como de um gene de resistência a antibiótico, ao qual são adicionados antibióticos tóxicos (tais como G418, disponível de Invitrogen). As células que são capazes de incorporar o gene morrerão portanto em resultado do antibiótico, desse modo permitindo a exclusão de células inadequadas para a transfecção. Um exemplo destas células adequadas é a linha celular de cancro da mama humano, MCF-7. Os transfectantes podem então ser utilizados para gerar proteínas recombinantes para testes num ensaio de angiogénese e subsequente selecção para utilização terapêutica e/ou em diagnóstico.

Assim, a presente invenção proporciona ainda uma construção purificada ou recombinante, isolada, que incorpora uma sequência KV de acordo com a descrição anterior, em particular, uma em que a sequência de ácido nucleico está ligada operativamente a nucleótidos que permitem a expressão e a secreção num hospedeiro celular de uma proteína (daqui adiante, a proteína KV) codificada pela sequência KV.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona ADN ou ARN, especialmente ADNc ou ARNm, de acordo com qualquer das 8 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ sequências ou construções atrás mencionadas; e um método para a preparação deste ADN ou ARN como aqui descrito, juntamente com o ADN ou ARN preparável por um tal método.

Assim, a presente patente ensina também um método para a preparação de uma sequência KV, método este que compreende: (a) gerar um fragmento de ADNc que codifica um antagonista de um factor de angiogénese especifico; (b) gerar um fragmento de ADNc que codifica um regulador da estrutura endotelial vascular especifico, em que os fragmentos (a) e (b) são complementares numa sua extremidade; e (c) combinar os fragmentos para gerar um gene recombinante capaz de expressar a proteína KV correspondente.

Especialmente, a presente invenção proporciona um polipéptido purificado ou recombinante, isolado, compreendendo simultaneamente um antagonista de um factor angiogénico e um regulador da estrutura endotelial vascular, e, em particular, um polipéptido purificado ou recombinante, isolado, compreendendo proteína KV, ou um seu mutante ou uma sua variante possuindo substancialmente a mesma actividade que a proteína KV.

Por exemplo, é proporcionado um polipéptido purificado ou recombinante, isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos da Figura 2 [proteína KVE702 prevista].

Outra molécula ensinada nesta patente inclui a Figura 13 [proteína J35 prevista]; a Figura 14 [proteína J36 prevista]; e a Figura 15 [proteína J37 prevista]; ou qualquer proteína KV quando expressa por uma sequência de ADN de acordo com a presente invenção.

Será evidente que a invenção portanto proporciona ainda uma célula, um plasmídeo, um vírus ou um organismo vivo, que foram geneticamente manipulados para produzir uma proteína KV, os referidos célula, plasmídeo, vírus ou organismo vivo possuindo incorporado de forma expressável uma sequência de nucleótidos de KV de acordo com a presente invenção; um vector 9 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ compreendendo essa sequência; e/ou uma célula hospedeira transformada ou transfectada com esse vector.

Para terapia génica, preferivelmente, será escolhido um vector virai e geneticamente manipulado para produzir a proteína KV. Podem ser utilizados tanto vectores retrovirais como adenovirais, tais como os sistemas Retro-X™ ou Adeno-X™ da Clontech (EUA).

Adicionalmente, a presente patente ensina um processo para obtenção de uma fonte substancialmente homóloga de proteína KV, processo este que compreende a cultura de células possuindo incorporada de forma expressável uma sequência de nucleótidos de KV de acordo com a presente invenção, e a posterior recuperação das células cultivadas. A (s) proteína(s) KV de acordo com a presente invenção podem portanto ser utilizadas em ligação a qualquer condição associada com angiogénese, tal como cancro, para a regulação do desenvolvimento de vasos sanguíneos e da sua formação, seja no endotélio vascular e/ou um tumor. Uma dose adequada pode ser determinada de acordo com técnicas convencionais conhecidas dos peritos na arte da farmácia, mas pode estar convenientemente na gama de 0,5 a 10 mg/kg de peso corporal, administrados num regime adequado, tal como de uma vez a sete vezes por semana.

Assim, a presente invenção proporciona ainda adicionalmente esta proteína KV, opcionalmente em associação com um seu transportador farmaceuticamente aceitável, para utilização em terapia, tal como para utilização em qualquer das condições acima mencionadas. Prefere-se especialmente que, para terapia com proteínas, seja proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo esta proteína (proteína KV) em associação com um seu transportador farmaceuticamente aceitável. As formulações preferidas incluem aquelas para administração parentérica, tais como injecções e infusões para administração intravenosa ou intramuscular. Outras formulações adequadas são bem conhecidas dos peritos na arte da farmácia. São igualmente proporcionados ou ensinados: 10 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ um método para a preparação destas formulações, método este que compreende levar a proteína (proteína KV) a associação com o transportador; um método para a profilaxia ou tratamento de um mamífero, incluindo o homem, compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz, não tóxica, desta proteína (proteína KV); uma proteína KV para utilização em medicina, tal como na inibição da angiogénese e/ou no tratamento do cancro; e a utilização de uma proteína KV na preparação de um medicamento, adequado para utilização na inibição da angiogénese e/ou no tratamento do cancro.

Os exemplos seguintes são proporcionados a titulo de ilustração da presente invenção.

Exemplo 1: Clonagem do gene recombinante KVE702 Células utilizadas

Utilizaram-se fibroblastos humanos (uma linha celular estabelecida, MRC-5) e células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) (extraídas da veia umbilical humana) (Cai J et al. "Gamma linolenic acid inhibits expression of VE-cadherin and tube formation in human vascular endothelial cells". Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999, 258, 113-118).

Preparação de molde de ARNm e ADNc humano

Isolou-se ARNm de fibroblastos ou células endoteliais utilizando um kit de extracção de ARNm (Sigma Chemicals, Poole, Dorset, RU) . Preparou-se o ADN complementar (ADNc) a partir do ARNm utilizando um kit de transcrição inversa (Promega).

Oligonucleótidos (iniciadores) utilizados na reacção PCR e PCR recombinante

Desenharam-se conjuntos de iniciadores de PCR para amplificar as áreas de interesse a partir do ADNc preparado, íe antagonista, a partir dos fibroblastos e marcador endotelial/antagonista a partir de células endoteliais. Os 11 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ iniciadores de PCR foram desenhados de modo a que os produtos de cada reacção pudessem ser utilizados na recombinação subsequente. Os iniciadores foram sintetizados por Life Technologies e utilizados exclusivamente para este trabalho. Os iniciadores desenhados para a clonagem do gene recombinante aqui denominado KVE702 foram os seguintes:

i CAT GAG CCT CTG GAC TAT TGT AGG TGT GGT

ii ACC ACA CCT ACA ATA GTC CAG AGG CTC ATG AT

iii ACC ATG GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC

iv TTT GAT GGT GAA GCT GGA A amplificação foi realizada em três cenários separados: primeiro, para gerar um fragmento de ADNc de fibroblastos e, em segundo lugar, para gerar um fragmento do ADNc de HUVEC, sendo ambos os produtos complementares numa extremidade. 0 passo final foi gerar um produto recombinante unindo os dois fragmentos. Cada reacção foi realizada sob condições especiais de modo a gerar os produtos desejados, como se segue:

Cenário 1 (para gerar antagonista): 95°C durante 5 minutos, depois 36 ciclos de 95°C durante 1 minuto, 61°C durante 1 minuto e 72°C durante 2 minutos, seguidos de 72°C durante 7 minutos.

Cenário 2 (para gerar marcador endotelial): 95°C durante 5 minutos, depois 36 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 58°C durante 2 minutos e 72°C durante 2 minutos, seguidos de 72°C durante 10 minutos.

Cenário 3 (para gerar gene recombinante): sem iniciador a 95°C durante 5 minutos, depois 4 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 35°C durante 1 minuto e 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C durante 90 segundos, depois 4 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 40°C durante 1 minuto e 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C durante 90 segundos, depois 4 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 45°C durante 1 minuto e 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C durante 90 segundos, depois 12 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ minuto e durante minuto e durante minuto e durante minuto e durante 4 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 50°C durante 1 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C 90 segundos, depois 4 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 55°C durante 1 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C 90 segundos, depois 4 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 60°C durante 1 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C 90 segundos, depois 4 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 64°C durante 1 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C 90 segundos, seguidos de 72°C durante 10 minutos; depois, com iniciadores adicionados, 35 ciclos de 95°C durante 40 segundos, 59°C durante 1 minuto e 72°C durante 90 segundos, seguidos de 72°C durante 10 minutos. A partir destas reacções, geraram-se os seguintes produtos: 1. Isolaram-se fragmentos de ADN a partir de fibroblastos utilizando RT-PCR, aqui referidos como: KS2101 (Figura 3, [SEQ ID NO: ]) & KS2105 (Figura 5, [SEQ ID NO: ]) (relativos ao antagonista). KS2105 está relacionado com KS2101, mas não possuindo uma cauda correspondente ao marcador endotelial. O KS2105 foi preparado utilizando o seguinte iniciador adicional:

v GAC TAT TGT AGG TGT GGT ATC 2. Fragmentos de ADN de células HUVEC, aqui referidos como: VC503 (Figura 4, [SEQ ID NO: ]) e VC1 (Figura 6, [SEQ ID NO: ]) (ambos relativos aos reguladores da estrutura endotelial vascular). O VC1 está relacionado com VC503 mas não possuindo uma cauda correspondente ao antagonista e foi preparado utilizando o seguinte iniciador adicional:

v GTG TCC TTG TCC ACA ATG ACT 3. A sequência recombinante: Foi realizado um passo adicional para gerar a sequência recombinante, unindo KS2101 e VC503, utilizando a técnica recombinante acima mencionada. Isto gerou uma sequência recombinante especifica, denominada KVE702 (Figura 1, [SEQ ID NO: ]). 13 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Clonagem dos produtos específicos

Cada fragmento e o gene recombinante foram clonados num vector de expressão de mamífero (pcDNA3.l/V5/His-T0P0, disponível de InVitrogen) que foi transfectado numa E. coli competente. As colónias que eram portadoras dos produtos desejados foram detectadas utilizando PCR. As colónias positivas foram adicionalmente expandidas e crescidas em grande volume. Os plasmídeos resultantes da clonagem dos genes no vector (íe que eram portadores dos produtos específicos) foram então purificados a partir destas preparações de E. COlí .

Exemplo 2: Transfecção e estabelecimento de uma célula que expressa KVE702

Os plasmídeos portadores do gene KS2101, KS2105, VC1, VC503 e KVE702 foram transfectados em células epiteliais de mamífero. Utilizou-se um agente de transfecção, Transfast (Promega). Após testes em série, verificou-se que células MCF-7 (bem conhecidas como uma linha celular de cancro da mama humano) eram as mais adequadas e células aceitáveis para este fim e foram escolhidas como as células para transfecção no presente estudo. A condição óptima de transfecção foi a Transfast : ADN =2:1.

Após a transfecção, seleccionaram-se as células que retinham estes novos genes utilizando um meio de selecção contendo G418 (de InVitrogen ou Calbiochem), que fazia com que as células que não possuiam os novos genes morressem gradualmente enquanto as que possuiam os novos genes continuavam a dividir-se. As células que expressam estes novos genes de interesse foram obtidas após mais de 4 semanas de selecção (os denominados transfectantes estáveis). Observou-se que as células de tipo selvagem (não transfectadas) estavam quase todas mortas após duas semanas, enquanto entre 10-30% das células transfectadas com os genes de interesse permaneciam viáveis. Em aproximadamente 4 semanas, estavam disponíveis suficientes destas células viáveis para testes biológicos. 14 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Exemplo 3: Testes de transfectantes estáveis estabelecidos de novo - Mobilidade

De modo a testar se as células transfectadas de modo estável (preparadas de acordo com o Exemplo 2) eram diferentes do tipo selvagem, realizou-se a técnica conhecida como o ensaio de disseminação celular/dispersão de colónias (Jiang et al., Monocyte conditioned media possess a novel factor which increases motility of câncer cells, Int. J. Câncer 53 426-431 (1993)). Resumidamente, as células de tipo selvagem ou transfectantes foram plaqueadas em instrumentos de cultura de tecidos a baixa densidade e depois deixou-se que formassem colónias (agrupamentos). Estas foram então tratadas ou com meio para controlo ou com um factor indutor de dispersão (HGF/SF). Após 24 horas, fixaram-se as células e obtiveram-se imagens digitalizadas utilizando uma câmara digital. A disseminação e a dispersão foram quantificadas como descrito por Jiang et al. (em Gamma linolenic acid selectively regulates the expression maspin and motility of câncer cells, Biochemical and Biophysical Research Communications 237 639-644 (1997)) utilizando um pacote de análise de imagens (Óptimas 6 da Óptimas UK); os resultados de cada cultura foram os seguintes:

Tipo Selvagem

As células MCF-7 de tipo selvagem formaram agrupamentos fortemente compactados em cultura com aparente união célula-célula. Um indutor de dispersão (HGF/SF) consegue dispersar as colónias, ie as células aparentemente afastam-se umas das outras.

Transfectantes VC1

As células transfectadas com VC1 surgiam na forma de agrupamentos muito mais fortes, em comparação com o tipo selvagem. Os transfectantes de VC1 substancialmente reduziram a sua resposta a HGF/SF (5, 10, 2 e 50ng/ml) . As células surgiam em agrupamentos pequenos, fortemente compactados, permanecendo visível a união célula-célula. 15 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Transfectantes KS2105 Ε KS2101

Os transfectantes KS2105 exibiam uma morfologia celular similar, quando comparados com os controlos. Estas células, contudo, reduziram significativamente a sua resposta a HGF/SF. Uma resposta similar, embora em menor grau, foi observada com transfectantes KS2101.

Transfectantes KVE702

As KVE702 estabelecidas revelaram uma morfologia similar ao controlo. 0 indutor de dispersão HGF/SF não induziu uma alteração significativa. Assim, a transfecção não alterou a morfologia da célula, mas reduziu a sua resposta a HGF/SF.

Conclusão

Os resultados obtidos mostram portanto claramente que as células MCF-7 transfectadas com VC1, KS2101 e KS2105 não alteram significativamente a sua morfologia. De facto, as células pareceram reduzir a sua resposta à estimulação. Os resultados indicam portanto que a transfecção não alterou a agressividade das células MCF-7.

Exemplo 4: Teste do produto recombinante na anqiogénese 0 estudo utilizou uma técnica conhecida como análise de formação de túbulos in vitro, para testar o efeito de materiais recombinantes sobre a formação de estruturas semelhantes a vasos sanguíneos (Kanayasu et al.,

Eicosapentaenoic acid inhibits tube formation of vascular endothelial cells in vitro. Lipids, 26 271-276 (1991); Bach et al VE-cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels, Exp Cell Res 238 324-334 (1998)).

Revestiram-se primeiro 24 placas de poços múltiplos com

TM

Matrigel (disponível de Beckton Dickinson) (200pg/poço) e deixou-se que formasse uma camada fina de gel. Adicionaram-se então 5χ104 células HUVEC em 0,5 ml de DMEM com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) sobre Matrigel™ durante 24 horas. Aspirou-se o meio, e aplicou-se uma sobrecamada de 0,5 ml de Matrigel™ com mais 0,5 ml de meio, que continha meio, HGF, NK4, ou NK4 e HGF em combinação. Observaram-se as culturas 16 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ celulares com um microscópio de contraste de fases após 24 horas. Cada poço foi fotografado quatro vezes aleatoriamente e mediu-se o comprimento dos túbulos utilizando um software de análise de imagem (Óptimas 6 da Óptimas UK) . Testaram-se então nas células um indutor de angiogénese conhecido, HGF/SF, e meio condicionado dos transfectantes estáveis. Os resultados do estudo foram os seguintes:

Os produtos VC1 e KS2105 reduziram a formação de túbulos 0 meio condicionado do transfectante VC1 reduziu a formação de túbulos que foi induzida por HGF/SF. 0 meio condicionado por sua vez pareceu ter um efeito menor sobre a formação de túbulos. É interessante que o sobrenadante de KS2105 reduziu a formação de túbulos com e sem indutor de angiogénese. KVE702 reduziu a formação de túbulos 0 meio condicionado de KVE702 aumentou o comprimento dos túbulos, embora em menor grau. Contudo, quando foi incluído um factor angiogénico, que aumentou significativamente o comprimento dos túbulos, o sobrenadante de KVE702 exerceu um efeito inibidor significativo sobre a formação de túbulos. Conclusão: Portanto, foi observado que HGF/SF aumentou significativamente a formação de túbulos a partir de células endoteliais vasculares. Os sobrenadantes dos transfectantes estáveis podem reduzir este aumento na formação de túbulos. Assim, a presente invenção pode apresentar uma nova oportunidade para produzir agentes anticancerosos.

Exemplo 5: Teste do Produto Recombinante sobre a Capacidade de Invasão

Utilizando as técnicas descritas acima no Exemplo 2, transfectaram-se MCF-7 (células de cancro da mama humano) com o gene KVE702 e seleccionou-se um transfectante estável utilizando G418. As células foram então testadas utilizando o

TM ensaio de invasao Matrigel estabelecido descrito por Jiang et al em Câncer Research, 55 5043-8 (1995) . Verificou-se que as células transfectadas tinham uma reduzida capacidade de invasão em comparação com células MCF-7 selvagens ou com células MCF-7 que tinham sido transfectadas com um plasmídeo 17 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ de controlo portador do gene de Lac-z (disponível de InVitrogen). A resposta das células transfectadas a HGF/SF verificou-se também significativamente reduzida, em comparação com células selvagens e de controlo.

Como a capacidade de invasão de células de cancro está directamente relacionada com a progressão e a metástase de um cancro, a sua redução indica um potencial futuro na terapia do cancro para o produto recombinante da invenção.

Exemplo 6: Clonagem do Gene Recombinante J35

Seguindo o método do Exemplo 1, preparou-se o produto recombinante em epígrafe, utilizando os seguintes iniciadores em vez de i-iv do Exemplo 1: i acc atg ggc gcg cag tgc acc ii ctt cag tgc tgg cac aga cgg gtc gta iii tac gac ccg tct gtg cca gca ctg aag iv gac tat tgt agg tgt ggt a A partir destas reacções, geraram-se os seguintes produtos: 1. Os fragmentos de ADN foram isolados de fibroblastos utilizando RT-PCR: J9 (antagonista) (Figura 16, [SEQ ID NO: ]). 2. Os fragmentos de ADN foram isolados de células HUVEC: J12 (marcador endotelial) (Figura 7, [SEQ ID NO: ]). 3. Um gene recombinante: realizou-se um passo adicional para gerar um gene recombinante, unindo J9 e J12, utilizando a técnica recombinante supramencionada. Isto gerou um gene recombinante específico, nomeadamente: J35 (produto recombinante) (Figura 8, [SEQ ID NO: ]).

Exemplo 7: Clonagem do Gene Recombinante J36

Seguindo o método do Exemplo 1, preparou-se o produto recombinante em epígrafe, utilizando os seguintes iniciadores em vez de i-iv do Exemplo 1: i acc atg gga gtg aac cca act gct cag 18 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ ii ctt cag tgc tgg ctc ctg ggg ate cac iii gtg gat ccc cag gag cca gea ctg aag iv gac tat tgt agg tgt ggt a A partir destas reacções, geraram-se os seguintes produtos: 1. Os fragmentos de ADN foram isolados de fibroblastos utilizando RT-PCR: J10 (antagonista) (Figura 17, [SEQ ID NO: ]) . 2. Os fragmentos de ADN foram isolados de células HUVEC: Jll (marcador endotelial) (Figura 9, [SEQ ID NO: ]) 3. Um gene recombinante: realizou-se um passo adicional para gerar um gene recombinante, unindo KS2101 e Jll, utilizando a técnica recombinante supramencionada. Isto gerou um gene recombinante especifico, nomeadamente: J36 (produto recombinante) (Figura 10, [SEQ ID NO: ]).

Exemplo 8: Clonagem do Gene Recombinante J37

Seguindo o método do Exemplo 1, preparou-se o produto recombinante em epígrafe, utilizando os seguintes iniciadores em vez de i-iv do Exemplo 1: i acc atg gga gtg aac cca act gct cag ii cca aat cca ate ctc ctg gga ate cac iii gtg gat ccc cag gag gat tgg att tgg iv ctg ggc ggc cat ate ctc gea gaa ggt A partir destas reacções geraram-se os seguintes produtos: 1. Os fragmentos de ADN foram isolados de fibroblastos utilizando RT-PCR: J6 (antagonista) (Figura 18, [SEQ ID NO: ] ) . 2. Os fragmentos de ADN foram isolados de células HUVEC: J8 (marcador endotelial) (Figura 11, [SEQ ID NO ]) 3. Um gene recombinante: realizou-se um passo adicional para gerar um gene recombinante, unindo KS2101 e J8, utilizando a técnica recombinante supramencionada. Isto gerou um gene 19 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ (produto recombinante específico, nomeadamente: J37 recombinante) (Figura 10, [SEQ ID NO: ]).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> University of Wales College of Medicine <120> Sequência recombinante, sua preparação e utilização <130> WJLJ-WCM75 < 14 0 > < 141 > <16 0> 18 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1695

<212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1 atagatccag cactgaagat aaaaaccaaa aaagtgaata ctgcagacca atgtgctaat 60 agatgtacta ggaataatgg acttccattc acttgcaagg cctttgtttt tgataaagcg 120 agaaaacaat gcctctggtt ccccttcaat agcatgtcaa gtggagtgaa gaaagaattt 180 ggccatgaat ttgacctcta tgaaaacaaa gactacatta gaaactgcat catcggtaaa 240 ggacgcagct acaagggaac agtatotatc actaagagtg gcatcaaatg tcagccctgg 300 agttccatga.taccacacga acacagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta 360 caggaaaact actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc 420 aatccagagg tacgctacga agtctgtgac attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg 480 acctgcaatg gggagagtta tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg caagatttgt 540 cagcgctggg atcatcagac accacaccgg cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac 600 aagggctttg atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat 660 actcttgacc .ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact 720 gtaaatgata ctgatgttcc tatggaaaca actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc 780 tacaggggca ctgccaatac catttggaat ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag 840 tatcctcaca agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat 900 tactgccgaa atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc 960 cgagttggtt actgctccca aattccaaac tgtgatatgt caaatggaca agattgttat 1020 cgtgggaatg gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa caagatctgg actaacgtgt 1080 tcaatgtgga acaagaacat ggaagactta caccgtcata tcttctggga accagatgca 1140 agtaagctga atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc 1200 tacacgggaa atccactcat tccttgggat tattgcecta tttctcgttg tgaaggtgat 1260 accacaccta caatagtcca gaggctcatg atgctcctcg ccacatcggg cgcctgcctg 1320 ggcctgctgg cagtggcagc agtggcagca gcaggtgcta accctgccca acgggacacc 1380 cacagcctgc tgcccaccca ccggcgccaa aagagagatt ggatttggaa ccagatgcac 1440 attgatgaag agaaaaacac ctcacttccc catcatgtág gcaagatcaa gtcaagcgtg 1500 agtcgcaaga atgccaagta cctgctcaaa ggagaatatg tgggcaaggt cttccgggtc 1560 gatgcagaga caggagacgt gttcgccatt gagaggctgg accgggagaa tatctcagag 1620 tacoacctca ctgctgtcat tgtggacaag gacactggtg aaaacctgga gactccttcc 1680 agcttcacca tcaaa 1695 20 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

<210> 2 <211> 566 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2

Lys Xle Asp Pro Ala Leu Lys He Lys Thr Lys Lys Vai Asn Thr Ala 15 10 15

Asp Gin Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Asn Gly Leu Pro Phe Thr 20 25 30

Cys Lys Ala Phe Vai Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gin Cys Leu Trp Phe 35 40 45

Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Vai Lys Lys Glu Phe Gly His Glu 50 55 60

Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly 65 70 75 80

Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Vai Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile 85 90 95

Lys Cys Gin Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu 100 105 110

Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gin Glu Asn Tyr Cys Arg Asn 115 120 125

Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu 130 135 140

Vai Arg Tyr Glu Vai Cys Asp Ile Pro Gin Cys Ser Glu Vai Glu Cys 145 150 155 160

Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu 165 170 175

Ser Gly Lys Ile Cys Gin Arg Trp Asp His Gin Thr Pro His Arg His 180 185 190

Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr 195 200 205 21 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gin Pro Arg Pro Irp Cys Tyr Thr Leu Asp 210 215 220

Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn 225 230 235 240

Thr Val Asn Asp Thr Asp Vai Pro Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gin 245 250 255

Gly Gin Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ala Asn Thr Ile Trp Asn Gly 260 265 270

Ile Pro Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gin Tyr Pro His Lys His Asp Met 275 280 285

Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg 290 295 300

Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn 305 310 315 320

Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gin Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser Asn 325 330 335

Gly Gin Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu 340 345 350

Ser Gin Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asn Lys Asn Met 355 360 365

Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu 370 375 380

Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp 385 390 395 400

Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser 405 410 415

Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Gin Arg Leu Met Met 420 425 430

Leu Leu Ala Thr Ser Gly Ala Cys Leu Gly Leu Leu Ala Val Ala Ala 435 440 445

Val Ala Ala Ala Gly Ala Asn Pro Ala Gin Arg Asp Thr His Ser Leu 450 455 460 22 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Leu Pro Thr His Arg Arg Gin Lys 465 470

His Ile Asp Glu Glu Lys Asn Thr 485

Ile Lys Ser Ser Vai Ser Arg Lys 500

Glu Tyr Vai Gly Lys Vai Phe Arg 515 520

Phe Ala Ile Glu Arg Leu Asp Arg 530 535

Thr Ala Vai Ile Vai Asp Lys Asp 545 550

Ser Ser Phe Thr Ile Lys 565

< 210 > 3 <211> 1278 <212> ADN <213> Homo sapíens < 4 0 0 > 3 atagatccag cactgaagat aaaaaccaaa agatgtacta ggaataatgg acttccattc agaaaacaat gcctctggtt ccccttcaat ggccatgaat 'ttgacctcta tgaaaacaaa ggacgcagct acaagggaac agtatctatc agttccatga taccacacga acacagcttt caggaaaact actgtcgaaa tcctcgaggg aatccagagg tacgctacga agtctgtgac acctgcaatg gggagagtta tcgaggtctc cagcgctggg atcatcagac accacaccgg aagggctttg atgataatta ttgcsgcaat actcttgacc ctcacacccg ctgggagtac gtaaatgata ctgatg'ttcc tatggaaaca tacaggggca ctgccaatac catttggaat tatcctcaca agcatgacat gactcctgaa tactgccgaa atccagatgg gtctgaatca cgagttggtt actgctccca aattccaaac cgtgggaatg gcaaaaatta tatgggcaac tcaatgtgga acaagaacat ggaagactta agtaagctga atgagaatta ctgccgaaat tacacgggaa atccactcat tccttgggat accacaccta caatagtc

Arg Asp Trp Ile Trp Asn Gin Met 475 480

Ser Leu Pro His His Vai Gly Lys 490 495

Asn Ala Lys Tyr Leu Leu Lys Gly 505 510

Vai Asp Ala Glu Thr Gly Asp Vai 525

Glu Asn Ile Ser Glu Tyr His Leu 540

Thr Gly Glu Asn Leu Glu Thr Pro 555 560 aaagtgaata ctgcagacca atgtgctaat 60 acttgcaagg cctttgtttt tgataaagcg 120 agcatgtcaa gtggagtgaa gaaagaattt 180 gactacatta gaaactgcat catcggtaaa 240 actaagagtg gcatcaaatg tcagccctgg 300 ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta 360 gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc 420 attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg 480 atggatcata cagaatcagg caagatttgt 540 cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac 600 cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat 660 tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact 720 actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc 780 ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag 840 aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat 900 ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc 960 tgtgatatgt caaatggaca agattgttat 1020 ttatcccaaa caagatctgg actaacgtgt 1080 caccgtcata tcttctggga accagatgca 1140 ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc 1200 tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat 1260 1278 23 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ cagaggctca tgatgctcct gcagtggcag cagcaggtgc caccggcgcc aaaagagaga acctcacttc cccatcatgt tacctgctca aaggagaata gtgttcgcca ttgagaggct attgtggaca aggacactgg

<210> 4 <211> 437 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 accacaccta caatagtcca tgggcctgct ggcagtggca cccacagcct gctgcccacc acattgatga agagaaaaac tgagtcgcaa gaatgccaag tcgatgcaga gacaggagac agtaccacct cactgctgtc ccagcttcac catcaaa cgccacatcg ggcgcctgcc 60 taaccctgcc caacgggaca 120 ttggatttgg aaccagatgc 180 aggcaagatc aagtcaagcg 240 tgtgggcaag gtcttccggg 300 ggaccgggag aatatctcag 360 tgaaaacctg gagactcctt 420 437

<210> 5 <211> 1287 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 accatgatca tagatccagc actgaagata tgtgctaata gatgtactag gaataatgga gataaagcga gaaaacaatg cctctggttc aaagaatttg gccatgaatt tgacctctat atcggtaaag gacgcagcta caagggaaca cagccctgga -gttccatgat accacacgaa aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca tatcccgaca agggctttga tgataattat tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc gacaatactg taaatgatac tgatgttcct ggagaaggct acaggggcac tgccaatacc gattctcagt atcctc'acaa gcatgacatg cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg ccaaacatcc gagttggtta ctgctcccaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat ctaacgtgtt caatgtggaa caagaacatg ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt gaaggtgata ccacacctac aatagtc aaaaccaaaa aagtgaatac tgcagaccaa 60 cttccattca cttgcaaggc ctttgttttt 120 cccttcaata gcatgtcaag tggagtgaag 180 gaaaacaaag actacattag aaactgcatc 240 gtatctatca ctaagagtgg catcaaatgt 300 cacagctttt tgccttcgag ctatcggggt 360 cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt 420 gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt 480 cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc 540 ccacaccggc acaaattcfct gcctgaaaga 600 tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca 660 tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct 720 atggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa 780 atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg 840 actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta 900 tctgaatcac cctggtgttt taccactgat 960 attccaaact gtgatatgtc aaatggacaa 1020 atgggcaact tatcccaaac aagatctgga 1080 gaagacttac accgtcatat cttctgggaa 1140 tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga 1200 ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt 1260

<210> 6 <211> 415 <212> ADN <213> Homo sapiens 1287 24 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ < 4 Ο Ο > 6 gaggctcatg atgctcctcg ccacateggg agtggcagca gcaggtgcta accctgccca ccggcgccaa aagagagatt ggatttggaa ctcacttccc catcatgtag gcaagatcaa cctgctcaaa ggagaatatg tgggcaaggt gttcgccatt gagaggctgg accgggagaa tgtggacaag gacactggtg aaaacctgga cgcctgcctg ggcctgctgg cagtggcagc 60 acgggacacc cacagcctgc tgcccaccca 120 ccagatgcac attgatgaag agaaaaacac 180 gtcaagcgtg agtcgcaaga atgccaagta 240 cttccgggtc gatgcagaga caggagacgt 300 tatctcagag taccacctca ctgctgtcat 360 gactccttcc agcttcacca tcaaa 415 <210> 7 <211> 156

< 212 > ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 7 ggcccggcca aggcgcgtgt ggccctcacg 60 ctggcgctcg tgccactctg ctggttcgcc 120 tctgtg 156 ggcgcgcagt gcaccacctg cgtggccccg ggaggcgtgc tctacctgtt ttgcgggctg aacattgtcg tccgcgagtt ttacgacccg

<210> 8 <211> 1428 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 8 ggcgcgcagt gcaccacctg cgtggccccg ggaggcgtgc tctacctgtt ttgcgggctg aacattgtcg tccgcgagtt ttacgacccg aaagtgaata ctgcagacca atgtgctaat acttgcaagg cctttgtttt tgataaagcg agcatgtcaa gtggagtgaa gaaagaattt gactacatta gaaact:'gcat catcggtaaa actaagagtg gcatcaaatg tcagccctgg ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg atggatcata cagaatcagg caagatttgt cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc tgtgatatgt caaatggaca agattgttat ttatcccaaa caagatctgg actaacgtgt caccgtcata tcttctggga accagatgca ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat ggcccggcca aggcgcgtgt ggccctcacg 60 ctggcgctcg tgccactctg ctggttcgcc 120 tctgtgccag cactgaagat aaaaaccaaa 180 agatgtacta ggaataatgg acttccattc 240 agaaaacaat gcctctggtt ccccttcaat 300 ggccatgaat ttgacctcta tgaaaacaaa 360 ggacgcagct acaagggaac agtatctatc 420 agttccatga taccacacga acacagcttt 480 caggaaaact actgtcgaaa tcctcgaggg 540 aatccagagg tacgctacga agtctgtgac 600 acctgcaatg gggagagtta tcgaggtctc 660 cagcgctggg atcatcagac accacaccgg 720 aagggctttg atgataatta ttgccgcaat 780 actcttgacc ctcacacccg ctgggagtac 840 gtaaatgata ctgatgttcc tatggaaaca 900 tacaggggca ctgccaatac catttggaat 960 tatcctcaca agcatgacat gactcctgaa 1020 tactgccgaa atccagatgg gtctgaatca 1080 cgagttggtt actgctccca aattccaaac 1140 cgtgggaatg gcaaaaatta tatgggcaac 1200 tcaatgtgga acaagaacat ggaagactta 1260 agtaagctga atgagaatta ctgccgaaat 1320 tacacgggaa atccactcat tccttgggat 1380 accacaccta caatagtc 1428 25 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

<210> 9 <211> 144 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 9 ggagtgaacc caactgctca gtcttctgga tctctatatg gttcacaaat atatgccctc 60 tgcaaccaat tttatacacc tgcagctact ggactctacg tggatcagta tttgtatcac 120 tactgtgttg tggatcccca ggag 144 < 210 > 10 <211> 1416

< 212 > ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 10 ggagtgaacc caactgctca gtcttctgga tgcaaccaat tttatacacc tgcagctact tactgtgttg-tggatcccca ggagccagca gcagaccaat gtgctaatag atgtactagg tttgtttttg ataaagcgag aaaacaatgc ggagtgaaga aagaatttgg ccatgaattt aactgcatca tcggtaaagg acgcagctac atcaaatgtc agccctggag ttccatgata tatcggggta aagacctaca ggaaaactac ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct acatgcgctg acaatactgt aaatgatact caaggtcaag gagaaggcta caggggcact cagcgttggg attctcagta tcctcacaag aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat tctctatatg gttcacaaat atatgccctc 60 ggactctacg tggatcagta tttgtatcac 120 ctgaagataa aaaccaaaaa agtgaatact 180 aataatggac ttccattcac ttgcaaggcc 240 ctctggttcc ccttcaatag catgtcaagt 300 gacctctatg aaaacaaaga ctacattaga 360 aagggaacag tatctatcac taagagtggc 420 ccacacgaac acagcttttt gccttcgagc 480 tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga 540 cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt 600 gagagttatc gagçtctcat ggatcataca 660 catcagacac cacaccggca caaattcttg 720 gataattatt gccgcaatcc cgatggccag 780 cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa 840 gatgttccta tggaaacaac tgaatgcatc 900 gccaatacca tttggaatgg aattccatgt 960 catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc 1020 ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt 1080 accactgatc caaacatccg agttggttac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca 1140 aatggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca 1200 agatctggac taacgtgttc aatgtggaac aagaacatgg aagacttaca ccgtcatatc 1260 ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat 1320 gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt 1380 tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtc 1416

<210> 11 <211> 150 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 accatgggag tgaacccaac tgctcagtct tctggatctc tatatggttc acaaatatat 60 gccctctgca accaatttta tacacctgca gctactggac tctacgtgga tcagtatttg 120 tatcactact gtgttgtgga tccccaggag 150 26 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ < 210 > 12 <211> 1788

< 212 > ADN <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 12 tctggatctc tatatggttc acaaatatat 60 gctactggac tctacgtgga tcagtatttg 120 gattggattt ggaaccagat gcacattgat 180 gtaggcaaga tcaagtcaag cgtgagtcgc 240 tatgtgggca aggtcttccg ggtcgatgca 300 ctggaccggg agaatatctc agagtaccac 360 ggtgaaaacc tggagactcc ttccagcttc 420 tggcctgtgt tcacgcatcg gttgttcaat 480 acctcagtca tctctgtgac agcagtggat 540 tctgtcatgt accaaatcct gaaggggaaa 600 attatcacaa taacgaaaag cttggaccga 660 gaagcgcgag atgcccaggg cctccggggg 720 ctgcaagaca tcaatgacaa cttccccttc 780 cctgaagaca cccgtgtggg cacctctgtg 840 ccccagaacc ggatgaccaa gtacagcatc 900 attgagacaa accccgccca caacgagggc 960 gaatacatcc agcaatacag cttcatcgtc 1020 tacatgagcc ctcccgcggg aaacagagcc 1080 gagcccccca ttttccagca gcctttctac 1140 cctctgattg gcacagtgct ggccatggac 1200 tccatccgca ggaccagtga caagggccag 1260 tacaatgaga aagaactgga cagagaagtc 1320 aaagaactgg attccactgg aacccccaca 1380 accatgggag tgaacccaac tgctcagtct gccctctgca accaatttta tacacctgca tatcactact gtgttgtgga tccccaggag gaagagaaaa acacctcact tccccatcat aagaatgcca agtacctgct caaaggagaa gagacaggag acgtgttcgc cattgagagg ctcactgctg tcattgtgga caaggacact accatcaaag -ttcatgacgt gaacgacaac gcgtccgtgc ctgagtcgtc ggctgtgggg gcagacgacc ccactgtggg agaccacgcc gagtattttg ccatcgataa ttctggacgt gagaagcagg ccaggtatga gatcgtggtg gactcgggca cggccaccgt gctggtcact ttcacccaga ccaagtacac atttgtcgtg ggctctctgt ttgttgagga cccagatgag ttgcggggcg actaccagga cgctttcacc atcatcaagc ccatgaiagcc tctggattat gaggccacag accccaccat cgacctccga caggtcatta tcaacatcac agatgtggac cacttccago tgaaggaaaa ccagaagaag cctgatgcgg ctaggcatag cattggatac ttcttcçgag tcacaaaaaa gggggacatt tacccctggt ataacctgac tgtggaggcc ggaaaagaat ccattgtgca agtccacatt gaagttttgg atgagaatga caatgccccg 1440 gagtttgcca agccctacca gcccaaagtg tgtgagaacg ctgtccatgg ccagctggtc 1500 ctgcagatct ccgcaataga caaggacata acaccacgaa acgtgaagtt caaattcatc 1560 ttgaatactg agaacaactt taccctcacg gataatcacg ataacacggc caacatcaca 1620 gtcaagtatg ggcagtttga ccgggagcat accaaggtcc acttcctacc cgtggtcatc 1680 tcagacaatg çgatgccaag tcgcacgggc accagcacgc tgaccgtggc cgtgtgcaag 1740 tgcaacgagc agggcgagtt caccttctgc gaggatatgg ccgcccag 1788 < 210 > 13 <211> 482

< 212 > PRT <213> Homo sapiens 27 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ < 4 Ο Ο > 13

Gly Ala Gin Cys Thr Thr Cys Vai Ala Pro Gly Pro Ala Lys Ala Arg 15 10 15

Vai Ala Leu Thr Gly Gly Vai Leu Tyr Leu Phe Cys Gly Leu Leu Ala 20 25 30

Leu Vai Pro Leu Cys Trp Phe Ala Asn Xle Vai Vai Arg Glu Phe Tyr 35 40 45

Asp Pro Ser Vai Pro Vai Ser Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys 50 55 60

Thr Lys Lys Vai Asn Thr Ala Asp Gin Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg 65 70 75 80

Asn Asn Gly Leu Pro Phe' Thr Cys Lys Ala Phe Vai Phe Asp Lys Ala 85 90 95

Arg Lys Gin Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Vai 100 105 110

Lys Lys Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr 115 120 125

Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Vai 130 135 140

Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gin Pro Trp Ser Ser Met Ile 145 150 155 160

Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu 165 170 175 28 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Gin Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp 180 185 190

Cys Phe The Ser Asn Pro Glu Vai Arg Tyr Glu Vai Cys Asp Ile Pro 195 200 205

Gin Cys Ser Glu Vai Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg 210 215 220

Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gin Arg Trp Asp 225 230 235 240

His Gin Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp 245 250' 255

Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gin Pro Arg 260 265 270

Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala 275 280 285

Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Vai Asn Asp Thr Asp Vai Pro Met 290 295 300

Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gin Gly Gin Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr 305 310 315 320

Ala Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gin 325 330 335

Tyr Pro His Lys His Asp' Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp 340 345 350

Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp 355 360 365

Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Vai Gly Tyr Cys Ser Gin Ile 370 375 380

Pro Asn Cys Asp Met Ser Ash Gly Gin Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly 385 390 395 400

Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gin Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys 405 410 415

Ser Met Trp Asn Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp 420 425 430 29 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp 435 440 445

Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro 450 455 460

Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr 465 470 475 ,480

Ile Vai <210> 14 <211> 475 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 14

Gly Vai Asn Pro Thr Ala Gin Ser Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Ser Gin 15 10 15

Ile Tyr Ala Leu Cys Asn Gin Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Thr Gly Leu 20 25 30

Tyr Vai Asp Gin Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Vai Vai Asp' Pro Gin Glu 35 40 45

Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Vai Asn Thr Ala 50 55 60

Asp Gin Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Asn Gly Leu Pro Phe Thr 65 70 75 80

Cys Lys Ala Phe Vai Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gin Cys Leu Trp Phe 85 90 95

Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Vai Lys Lys Glu Phe Gly His Glu 100 105 110

Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly 115 120 125

Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Vai Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile 130 135 140

Lys Cys Gin Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu 145 150 155 160 30 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gin Glu Asn Tyr Cys Arg Asn 165 170 175

Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu 180 185 190

Vai Arg Tyr Glu Vai Cys Asp Ile Pro Gin Cys Ser Glu Vai Glu Cys 195 200 205

Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu 210 215 220

Ser Gly Lys Ile Cys Gin Arg Trp Asp His Gin Thr Pro His Arg His 225 230 235 240

Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr 245 250 255

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gin Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp 260 265 270

Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn 275 280 285

Thr Vai Asn Asp Thr Asp Vai Pro Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gin 290 295 300

Gly Gin Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ala Asn Thr Ile Trp Asn Gly 305 310 315 320

Ile Pro Cys Gin Arg Trp Asp Ser Gin Tyr Pro His Lys His Asp Met 325 330 335

Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg 340 345 350

Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn 355 360 365

Ile Arg Vai Gly Tyr Cys Ser Gin Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser Asn 370 1 375 380

Gly Gin Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu 385 390 395 400

Ser Gin Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp A.sn Lys Asn Met 405 410 415 31 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ

Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu 420 425 430

Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp 435 440 445

Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser 450 455 460

Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Vai 465 470 475 <210> 15 <211> 594 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 15

Gly Vai Asn Pro Thr Ala Gin Ser Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Ser Gin 15 10 15

Ile Tyr Ala Leu Cys Asn Gin Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Thr Gly Leu 20 25 30

Tyr Vai Asp Gin Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Vai Vai Asp Pro Gin Glu 35 40 45

Asp Trp Ile Trp Asn Gin Met His Ile Asp Glu Glu Lys Asn Thr Ser 50 ’ 55 60

Leu Pro HiS His Vai Gly Lys Ile Lys Ser Ser Vai Ser Arg Lys Asn 65 70 75 B0 Ala Lys Tyr Leu Leu Lys Gly Glu Tyr Vai Gly Lys Vai Phe Arg Vai 85 90 95 Asp Ala Glu Thr Gly Asp Vai Phe Ala Ile Glu Arg Leu Asp Arg Glu 100 105 110 Asn Ile Ser /*1 .1 VJJ.U Αγ,ι. ílxs Leu Thr m v α ^ Ile Vai Δ ΟΓ”Ν T.irc XJJ _ Ά βΤΛ Thr 115 120 125 Gly Glu Asn Leu Glu Thr Pro Ser Ser Phe Thr Ile Lys Vai His Asp 130 135 140

Vai Asn Asp Asn Trp Pro Vai Phe Thr His Arg Leu Phe Asn Ala Ser 32 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ 145 150 155 150

Vai Pro Glu Ser Ser Ala Vai Gly Thr Ser Vai Ile Ser Vai Thr Ala 165 170 175

Vai Asp Ala Asp Asp Pro Thr Vai Gly Asp His Ala Ser Vai Met Tyr 180 185 . 190

Gin Ile Leu Lys Gly Lys Glu Tyr Phe Ala Ile Asp Asn Ser Gly Arg 195 200 205

Ile Ile Thr Ile Thr Lys Ser Leu Asp Arg Glu Lys Gin Ala Arg Tyr 210 215 220

Glu Ile Vai Vai Glu Ala Arg Asp Ala Gin Gly Leu Arg Gly Asp Ser 225 230 235 240

Gly Thr Ala Thr Vai Leu Vai Thr Leu Gin Asp Ile Asn Asp Asn Phe 245 250 255

Pro Phe Phe Thr Gin Thr Lys Tyr Thr Phe Vai Vai Pro Glu Asp Thr 250 265 270

Arg Vai Gly Thr Ser Vai Gly Ser Leu Phe Vai Glu Asp Pro Asp Glu 275 280 285

Pro Gin Asn Arg Met Thr Lys Tyr Ser Ile Leu Arg Gly Asp Tyr Gin 290 295 300

Asp Ala Phe Thr Ile Glu Thr Asn Pro Ala His Asn Glu Gly Ile Ile 305 310' 315 320

Lys Pro Met Lys Pro Leu Asp Tyr Glu Tyr Ile Gin Gin Tyr Ser Phe 325 330 335

Ile Vai Glu Ala Thr Asp Pro Thr Ile Asp Leu Arg Tyr Met Ser Pro 340 345 350

Pro Ala Gly Asn Arg Ala Gin Vai Ile Ile Asn Ile Thr Asp Vai Asp 355 360 365

Glu Pro Pro Ile Phe Gin Gin Pro Phe Tyr His Phe Gin Leu Lys Glu 370 375 380

Asn Gin Lys Lys Pro Leu Ile Gly Thr Vai Leu Ala Met Asp Pro Asp 385 390 395 400

Ala Ala Arg His Ser Ile Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Thr Ser Asp Lys 33 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ 405 410 415

Gly Gin Phe Phe Arg Vai Thr Lys Lys Gly Asp Ile Tyr Asn Glu Lys 420 425 430

Glu Leu Asp Arg Glu Vai Tyr Pro Trp Tyr Asn Leu Thr Vai Glu Ala 435 440 445

Lys Glu Leu Asp Ser Thr Gly Thr Pro Thr Gly Lys Glu Ser Ile Vai 450 455 460

Gin Vai His Ile Glu Vai Leu Asp Glu Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe 465 470 475 480

Ala Lys Pro Tyr Gin Pro Lys Vai Cys Glu Asn Ala Vai His Gly Gin 485 490 495

Leu Vai Leu Gin Ile Ser Ala Ile Asp Lys Asp Ile Thr Pro Arg Asn 500 505 510

Vai Lys Phe Lys Phe Thr Leu Asn Thr Glu Asn Asn Phe Thr Leu Thr 515 520 525

Asp Asn His Asp Asn Thr Ala Asn Ile Thr Vai Lys Tyr Gly Gin Phe 530 535 540

Asp Arg Glu His Thr Lys Vai His Phe Leu Pro Vai Vai Ile Ser Asp 545 550 555 560

Asn Gly Met Pro Ser Arg Thr Gly Thr Ser Thr Leu Thr Vai Ala Vai 565 570 575

Cys Lys Cys Asn Glu Gin Gly Glu Phe Thr Phe Cys Glu Asp Met Ala 580 585 590

Ala Gin

<210> 16 <211> 1272 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 16 ccagcactga agataaaaac caaaaaagtg aatactgcag accaatgtgc taatagatgt 60 actaggaata atggacttcc attcacttgc aaggcctttg tttttgataa agcgagaaaa 120 caatgcctct ggttcccctt caatagcatg tcaagtggag tgaagaaaga atttggccat 180 34 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ gaatttgacc tctatgaaaa caaagactac attagaaact gcatcatcgg taaaggacgc 240 agctacaagg gaacagtatc tatcactaag agtggcatca aatgtcagcc ctggagttcc 300 aatactgcag accaatgtgc taatagatgt 60 aaggcctttg tttttgataa agcgagaaaa 120 tcaagtggag tgaagaaaga atttggccat 180 attagaaact gcatcatcgg taaaggacgc 240 agtggcatca aatgtcagcc ctggagttcc'300 tcgagctatc ggggtaaaga cctacaggaa 360 gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca 420 cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc 480 catacagaat caggcaagat ttgtcagcgc 540 ttcttgcctg aaagatatcc cgacaagggc 600 ggccagccga ggccatggtg ctatactctt 660 attaaaacat gcgctgacaa tactgtaaat 720 tgcatccaag gtcaaggaga aggctacagg 780 ccatgtcagc gttgggattc tcagtatcct 840 aagtgcaagg acctacgaga aaattactgc SOO tgttttacca ctgatccaaa catccgagtt 960 atgtcaaatg gacaagattg ttatcgtggg 1020 caaacaagat ctggactaac gtgttcaatg 1080 catatcttct gggaaccaga tgcaagtaag 1140 gatgatgctc atggaccctg gtgctacacg 1200 cctatttctc gttgtgaagg tgataccaca 1260 atgataccac acgaacacag ctttttgcct aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct aatggggaga gttatcgagg tctcatggat tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa tttgatgata attattgccg caatcccgat gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca gatactgatg ttcctatgga aacaactgaa ggcactgcca ataccatttg gaatggaatt cacaagcatg acatgactcc tgaaaatttc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg ggttactgct cccaaattcc aaactgtgat aatggcaaaa attatatggg caacttatcc tggaacaaga acatggaaga cttacaccgt ctgaatgaga attactgccg aaatccagat ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctacaatag tc <210> 17 <211> 1272

<212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 17 ccagcactga agataaaaac caaaaaagtg actaggaata atggacttcc attcacttgc caatgcctct ggttcccctt caatagcatg gaatttgacc tctatgaaaa caaagactac agctacaagg gaacagtatc tatcactaag atgataccac "acgaacacag ctttttgcct aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct aatggggaga gttatcgagg tctcatggat tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa tttgatgata attattgccg caatcccgat gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca gatactgatg ttcctatgga aacaactgaa ggcactgcca ataccatttg gaatggaatt cacaagcatg acatgactcc tgaaaatttc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg ggttactgct cccaaattcc aaactgtgat aatggcaaaa attatatggg caacttatcc tggaacaaga acatggaaga cttacaccgt ctgaatgaga attactgccg aaatccagat ggaaatccac tcattccttg ggattattgc tcgagctatc ggggtaaaga cctacaggaa 360 gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca 420 cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc 480 catacagaat caggcaagat ttgtcagcgc 540 ttcttgcctg aaagatatcc cgacaagggc 600 ggccagccga ggccatggtg ctatactctt 660 attaaaacat gcgctgacaa tactgtaaat 720 tgcatccaag gtcaaggaga agçctacagg 780 ccatgtcagc gttgggattc tcagtatcct 840 aagtgcaagg acctacgaga aaattactgc 900 tgttttacca otgatcoaaa catccgagtt 960 atgtcaaatg gacaagattg ttatcgtggg 1020 caaacaagat ctggactaac gtgttcaatg 1080 catatcttct gggaaccaga tgcaagtaag 1140 gatgatgctc atggaccctg gtgctacacg 1200 cctatttctc gttgtgaagg tgataccaca 1260 1272 cctacaatag tc

<210> 18 <211> 1638 <212> ADN <213> Homo sapiens 1272 35 35 gaagagaaaa acacctcact tccccatcat 60 aagaatgcca agtacctgct caaaggagaa 120 gagacaggag acgtgttcgc cattgagagg 180 ctcactgctg tcattgtgga caaggacact 240 accatcaaag ttcatgacgt gaacgacaac 300 gcgtccgtgc ctgagtcgtc ggctgtgggg 360 gcagacgacc ccactgtggg agaccacgcc 420 gagtattttg ccatcgataa ttctggacgt 480 gagaagcagg ccaggtatga gatcgtggtg 540 gactcgggca cggccaccgt gctggtcact 600 ttcacccaga ccaagtacac atttgtcgtg 660 ggctctctgt ttgttgagga cccagatgag 720 ttgcggggcg actaccagga cgctttcacc 780 atcatcaagc ccatgaagcc tctggattat 840 gaggccacag accccaccat cgacctccga 900 caggtcatta tcaacatcac agatgtggac 960 cacttccagc tgaaggaaaa ccagaagaag 1020 cctgatgcgg ctaggcatag cattggatac 1080 ttcttccgag tcacaaaaaa gggggacatt 1140 tacccctggt ataacctgac tgtggaggcc 1200 ggaaaagaat ccattgtgca agtccacatt 1260 gagtttgcoa agccotacoa gcccaaagtg 1320 ctgcagatct ccgcaataga caaggacata 1380 ttgaatactg agaacaactt taccctcacg 1440 gtcaagtatg ggcagtttga ccgggagcat 1500 tcagacaatg ggatgccaag tcgcacgggc 1560 tgcaacgagc agggcgagtt caccttctgc 1620 1638 ΕΡ 1 278 874/ΡΤ <400> 18 gattggattt ggaaccagat gcacattgat çtaggcaaga tcaagtcaag cgtgagtcgc tatgtgggca aggtcttccg ggtcgatgca ctggaccggg agaatatctc agagtaocac ggtgaaaacc tggagactcc ttccagcttc tggcctgtgt tcacgcatcg gttgttcaat acctcagtca tctctgtgac agcagtggat tctgtcatgt accaaatcct gaaggggaaa attatcacaa taacgaaaag cttggaccga gaagcgcgag atgcccaggg cctccggggg ctgcaagaca tcaatgacaa cttccccttc cctgaagaca cccgtgtggg cacctctgtg ccccagaacc ggatgaccaa gtacagcatc attgagacaa accccgccca caacgagggc gaatacatcc agcaatacag cttcatcgtc tacatgagcc ctcccgcggg aaacagagcc gagcccccca ttttccagca gcctttctac cctctgattg gcacagtgct ggccatggac fcccatccgca ggaccagtga caagggccag tacaatgaga aagaactgga cagagaagtc aaagaactgg attccactgg aacccccaca gaagttttgç atgagaatga caatgccccg tgtgagaacg ctgtccatgg ccagctggtc acaccacgaa “acgtgaagtt caaattcatc gataatcacg ataacacggc caacatcaca accaaggtcc acttcctacc cgtggtcatc accagcacgc tgaccgtggc cgtgtgcaag gaggatatgg ccgcccag

Lisboa, 2010-02-10

Claims (9)

1. ΕΡ 1 278 874/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico purificada ou recombinante, isolada, que codifica uma proteína de fusão compreendendo simultaneamente: a) um antagonista de um factor angiogénico e b) um regulador da estrutura endotelial vascular em que a estrutura da sequência de ácido nucleico da referida molécula compreende a sequência apresentada na Figura 3 e a sequência apresentada na Figura 4; ou uma sequência possuindo 80% de identidade com esta.
2. 2. Molécula de acordo com a reivindicação 1, em que a molécula de ácido nucleico recombinante compreende a sequência apresentada na Figura 1.
3. 3. Polipéptido codificado por uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer reivindicação precedente.
4. 4. Polipéptido de acordo com a reivindicação 3, compreendendo a sequência apresentada na Figura 2.
5. 5. Vector possuindo incorporada de forma expressável uma molécula de acordo com a reivindicações 1 ou 2.
6. 6. Célula, plasmídeo, vírus, bactéria ou outro organismo vivo possuindo incorporada de forma expressável uma molécula de acordo com as reivindicações 1 ou 2.
7. 7. Célula hospedeira transfectada ou transformada com um vector de acordo com a reivindicação 5.
8. 8. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4 na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de angiogénese ou cancro.
9. 9. Formulação compreendendo um polipéptido de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4 em associação com um seu transportador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 2010-02-10