ES2331783A1 - Compuesto para el etiquetado de biomoleculas basado en vinilsulfona, ppreparacion y usos. - Google Patents
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Abstract
Compuesto para el etiquetado de biomoléculas basado en vinilsulfona, preparación y usos. Compuestos que comprenden una molécula etiqueta y un grupo vinilsulfona. Además, se refiere al uso de los compuestos como agentes de etiquetado, al procedimiento de obtención de los mismos y sus usos en el marcaje de biomoléculas, y más concretamente de proteínas.
Description
Compuesto para el etiquetado de biomoléculas
basado en vinilsulfona, preparación y usos.
La presente invención se refiere a un compuesto
de fórmula general (I) que contiene una molécula etiqueta y un
grupo vinilsulfona, cuya función es llevar a cabo la unión
covalente a las moléculas susceptibles de etiquetado. La presente
invención también se refiere a sus procedimientos de obtención y a
sus usos. Más particularmente, se refiere al uso de estos
compuestos, conteniendo un fluoróforo, para el etiquetado de
biomoléculas y a sus aplicaciones biotecnológicas.
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El etiquetado de biomoléculas es una herramienta
básica en el campo de la genómica y la proteómica para la
detección, purificación y estudio de interacciones entre
biomoléculas.
De entre la gama de etiquetados de biomoléculas
que son plausibles, destacan por su especial importancia los
etiquetados con fluoróforos y con biotina debido a sus aplicaciones
biotecnológicas y su impacto comercial.
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El etiquetado fluorescente es un elemento clave
para la detección y análisis de biomoléculas (Patton, W.F.
Electrophoresis (2000), vol. 21, pp.
1123-1144) y es el motor de una industria de miles
de millones de euros. Las ventajas del etiquetado fluorescente,
frente a métodos convencionales como son el azul Coomassie, la
plata, el oro coloidal o la radioactividad son las siguientes:
- Detección rápida y de sensibilidad elevada:
cada etiqueta fluorescente puede originar del orden de
10^{7}-10^{8} fotones por segundo.
- Versatilidad: Distintos etiquetados originan
distintos "colores", siendo posible realizar un etiquetado
"policromático" como el empleado, por ejemplo, en la
secuenciación de ADN (Smith, L., et al., Nature
(1986), vol. 321, pp. 674-679).
- Inercia: Tamaño y propiedades del fluoróforo
raramente interfieren con la biomolécula marcada.
- Localización de la señal en el punto de
etiquetado, a diferencia del etiquetado enzimático.
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Sin embargo, su potencial va más allá de la
detección pasiva dado que técnicas como la polarización de
fluorescencia y FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer,
también denominado Forster Resonance Energy Transfer) permiten
evaluar cambios conformacionales, interacciones entre proteínas o
entre proteína y ligando. La medida de la polarización proporciona
información sobre orientaciones y movilidad que permite estudiar
las interacciones receptor-ligando (Jameson, D.M.,
Seifried, S.E., Methods (1999), vol. 19, pp.
222-233). FRET es una interacción entre fluoróforos
en la cual la excitación pasa de un fluoróforo excitado (donante) a
otro que se excita (aceptor) sin la emisión de un fotón. Esta
interacción se produce cuando la longitud de onda de emisión del
donante es muy próxima a la de excitación del aceptor y es muy
dependiente de la distancia entre donante y aceptor, por lo que se
ha empleado como regla (Remedios, C.G., Moens, P.D., J.
Struct. Biol. (1995), vol. 115, pp. 175-185)
para analizar cambios conformacionales e interacción entre
biomoléculas.
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Actualmente existe una gran cantidad y variedad
de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de
biomoléculas se encuentran el dansilo, la fluoresceína y la
rodamina B, cuyas características fundamentales y algunas de sus
aplicaciones se resumen en la tabla adjunta:
Por otro lado, el etiquetado con biotina también
tiene gran importancia biotecnológica (Wilchek, M.; Bayer, E. A.,
Anal. Biochem. (1988), vol. 171, pp. 1-32).
La biotina es una molécula que actúa como coenzima de determinadas
carboxilasas relacionadas con el metabolismo del dióxido de
carbono. Sin embargo, su interés biotecnológico radica en la alta
especificidad y afinidad que la avidina, estreptavidina y otras
proteínas relacionadas presentan por esta biomolécula (constante de
disociación del orden de 10^{-15} M^{-1}), haciendo que la
interacción tenga la fortaleza de un enlace covalente sin serlo.
Así, la biotinilización transforma moléculas difícilmente
detectables en sondas que pueden ser detectadas o capturadas con
avidina/estreptavidina marcadas o inmovilizadas. Este principio es
común para localizar antígenos en tejidos, células y para detectar
biomoléculas en inmunoensayos y en pruebas de hibridación de ADN.
Sin embargo, para determinadas aplicaciones, como por ejemplo la
purificación mediante cromatografía de afinidad, se necesita que la
interacción biotina-avidina sea reversible, para lo
cual se puede modificar tanto la avidina (por nitrosación de las
tirosinas del centro activo (Morag, E., et al., Biochem.
J. (1996), vol. 316, pp. 193-199) como usar
derivados de biotina (destiobiotina e iminobiotina). Existen
biotinas marcadas fluorescentemente para cuantificar los sitios
activos de la avidina (Gruber, H. J, et al., Biochim.
Biophys. Acta (1998), vol. 1381, pp. 203-212) y
biotina etiquetada con DNP
(DNP-X-biocytin-X,
US5180828A) (dinitrofenol), etiquetado versátil que además de
actuar como cromóforo es reconocido por anticuerpos
anti-DNP, permitiendo la correlación entre
fluorescencia y estudios de microscopia electrónica. Existe también
en el mercado peroxidasa de rábano picante (HRP) etiquetada con
biotina.
Un aspecto fundamental de cara al uso de
cualquier etiquetado es la unión a la biomolécula y la estabilidad
de dicha unión. Desde un punto de vista químico existen cuatro
grupos presentes en las biomoléculas susceptibles de actuar como
dianas para el anclaje de los reactivos de etiquetado
convenientemente derivatizados a través de la formación de un enlace
covalente, como son las aminas, tioles, alcoholes y ácidos
carboxílicos, que a continuación se detallan:
Aminas: Son la diana más común de los
reactivos de modificación covalente y la principal en proteínas. En
la mayoría de estas biomoléculas el extremo amino esta libre y
además prácticamente todas tienen lisina, residuo en cuya cadena
lateral hay un grupo \varepsilon-amino fácilmente
modificable dado que se localiza mayoritariamente en la superficie
de las proteínas. Estos grupos reaccionan con reactivos acilantes y
la reactividad es dependiente del reactivo acilante, del tipo de
amina, basicidad y pH de reacción. Las aminas alifáticas, como la
de la cadena lateral de la lisina, son moderadamente básicas y
reaccionan con la mayoría de los reactivos acilantes a pH superior
a 8.
Tres son las derivatizaciones de los reactivos
de etiquetado que reaccionan con las aminas de las
biomoléculas:
- Succinimidil ésteres. Reaccionan con aminas
para originar amidas. Es la derivatización más frecuente dada la
estabilidad del enlace amida que se genera. Reaccionan bien con
aminas alifáticas y presentan baja reactividad con aminas
aromáticas, alcoholes, fenoles (tirosina) e imidazoles (histidina).
En presencia de tioles (cisteína) pueden formar tiosteres pero en
proteínas el grupo acilo puede ser transferido a una amina vecina.
Uno de los principales inconvenientes de los succinimidil ésteres
es su solubilidad, que en algunos casos puede ser muy baja. Por
ello, en el mercado existen derivados de ácidos carboxílicos que
pueden convertirse en sulfosuccinimidil ésteres (Staros, J.V.,
et al., Anal. Biochem. (1986), vol. 156, pp.
220-222) o STP ésteres (Gee, K.R., et al.,
Tetrahedron Lett. (1999), vol. 40, pp.
1471-1474), que son más polares, y por ello más
solubles en agua, aunque también menos reactivos con aminas poco
expuestas.
- Isotiocianatos. Reaccionan con aminas para
formar tioureas, las cuales son razonablemente estables en la
mayoría de los casos.
- Cloruros de ácido sulfónico. Reaccionan con
aminas y producen sulfonamidas. Son muy reactivos e inestables en
medios acuosos, especialmente al pH alcalino necesario para que
reaccionen con las aminas alifáticas, por lo que se trabaja a baja
temperatura. Una vez conjugados el enlace es extremadamente estable
y resistente. También reaccionan con fenoles (tirosina), alcoholes
alifáticos (polisacáridos), tioles (cisteína), e imidazoles
(histidina), aunque los conjugados con tioles e imidazoles son
inestables y los conjugados con alcoholes alifáticos pueden sufrir
desplazamientos nucleofílicos.
- Otras funcionalizaciones pueden ser: aldehídos
y agentes arilantes. Aldehídos que reaccionan con las aminas para
formar bases de Schiff. Se han preparado derivados del
o-ftalaldehído (OPA), naftalendicarboxaldehído (NDA) y
3-acrilquinilencarbaxaldehído
(OTTO-TAG) y se han empleado para cuantificación de
aminas en solución (Liu, J., Hsieh, et al., Anal.
Chem. (1991), vol. 163, pp. 408-412). Y agentes
arilantes como el cloruro o fluoruro de
4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol
(NBD) (Watanable, Y., Imai, K., J. Chromatogr. (1982), vol.
239, pp. 723-732).
Tioles. Son dianas más selectivas que el
grupo amino, pues son poco frecuentes en biomoléculas y para ser
reactivos tienen que estar libres (no formar puente disulfuro). El
grupo sulfhídrico puede ser introducido en la macromolécula a
marcar vía modificación química, reducción de puentes disulfuro o
vía inteína (Tan, L.P., Yao, S.Q., Protein and Pept. Lett.
(2005), vol. 12, pp. 769-751) (en el caso de
proteínas), o mediante mutagénesis dirigida para introducir
cisteína.
Los grupos tioles reaccionan a pH fisiológico
(pH 6.5-8) con reactivos alquilantes (como son las
yodoacetamidas y las maleimidas) o arilantes (como el
7-cloro ó
7-fluor-4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol
(NBD)), para originar tioéteres estables. Reaccionan también con
muchos de los reactivos acilantes de aminas, incluyendo
isotiocianatos y succinimidil ésteres. Tambien los disulfuros
simétricos como la
didansyl-L-cisteína o el ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)
(DTNB) (Daly, T.J., et al., Biochemistry (1986), vol.
25, pp. 5468-5474) reaccionan con los tioles para
dar uniones de tipo disulfuro no simétrico.
Alcoholes. La función hidroxilo está
presente en las cadenas laterales de la tirosina, serina y
treonina, en esteroles y carbohidratos, pero su reactividad en
soluciones acuosas es extremadamente baja, especialmente en
proteínas por la presencia de nucleófilos más activos como las
aminas y los tioles. Una función que reacciona específicamente con
dioles vecinales es el ácido borónico y forma complejos cíclicos
(Gallop, P.M., et al., Science (1982), vol. 217, pp.
166-169). Sin embargo, un procedimiento estándar
para incrementar la reactividad, especialmente en el caso de
carbohidratos, es la oxidación con peryodato para originar la
función aldehído. Las principales funcionalizaciones de los
reactivos de etiquetado que reaccionan con la función aldehído de
las biomoléculas son: amina, hidrazidas, semicarbazida,
carbohidrazida y O-alquilhidroxilaminas.
Ácidos carboxílicos. Son abundantes en
macromoléculas pero poco reactivos, por lo que es habitual
derivatizarlos de forma tal que se introducen aminas que reaccionan
con las funcionalizaciones anteriormente descritas.
Actualmente es posible adquirir comercialmente
toda una gama de productos de etiquetado con fluorescencia y con
biotina convenientemente derivatizados. La estrategia más frecuente
para funcionalizar los reactivos de etiquetado es la derivatización
como succinimidil ésteres para reaccionar con las funciones aminas
de la biomolécula.
Por otro lado, y desde una perspectiva química
las sulfonas \alpha,\beta-insaturadas (vinil
sulfonas) son reconocidas como intermediarios sintéticos de gran
utilidad debido fundamentalmente a su capacidad para participar en
reacciones de adición 1,4 (aceptores de Michael). Adicionalmente,
las vinilsulfonas son fáciles de preparar, a través de una amplia
variedad de procesos sintéticos, y de manipular (Simphinks, N. S.,
Tetrahedron (1990), vol. 282, pp.
6951-6984). Estas características han encontrado
recientemente utilidad en el diseño de fármacos y en química médica
cuando se demostró su capacidad para inhibir de forma potente y
reversible una variedad de procesos enzimáticos, fundamentalmente
aquellos en los que están implicados cistein proteasas a las que se
unen a través de reacciones de adición con el grupo tiol presente
en el residuo de cisteína del sitio activo de estas enzimas
(Meadows, D. C., et al., Med. Res. Rev. (2006), vol.
26(6), pp. 793-814).
Sin embargo, desde un punto de vista
biotecnológico su potencial va más allá. La reactividad de las
vinilsulfonas con biomoléculas se ha aprovechado para la
introducción de polietilenglicol vía reacción con tioles (Morpurgo,
M., et al., Bioconjug. Chem. (1996) vol. 7, pp.
363-368), para la formación de hidrogeles mediante
entrecruzamiento de péptidos con polietilenglicol funcionalizado
con vinilsulfona (Rizzi, S. C., et al., Biomacromolecules
(2006), vol. 7, pp. 3019-3029) y para la
introducción de moléculas de glucosa derivatizada con vinilsulfona
vía reacción con las aminas de las proteínas
(López-Jaramillo, et al., Acta Cryst.
(2005) vol. F61, pp. 435-438).
Como marcadores, se han descrito diferentes
compuestos coloreados que contienen grupos vinilsulfona. En este
sentido, la patente US4473693 describe colorantes, para el marcaje
intracelular, basados en amarillo Lucifer y que contienen un grupo
vinilsulfona. En la patente EP0187076 se describen compuestos
fluorescentes que contienen un grupo vinilsulfona, estos compuestos
son útiles para estudios inmunológicos.
En la presente invención se proporciona un nuevo
compuesto de fórmula general (I) que comprende una molécula
etiqueta, además de un grupo vinilsulfona, y que permite llevar a
cabo el etiquetado de biomoléculas de una forma altamente eficaz y
sencilla. Estos compuestos constituyen una alternativa a las
derivatizaciones empleadas en proteómica y genómica para introducir
un reactivo de etiquetado en biomoléculas.
Así, un primer aspecto de la presente invención
se refiere a los compuestos de fórmula general (I) (a partir de
ahora compuestos de la invención):
donde:
X se selecciona de entre NR, oxígeno (O) ó
azufre (S), donde:
R es un radical, sustituido o no sustituido, que
se selecciona de entre un grupo alquilo
(C_{1}-C_{10}), hidroxialquilo o el grupo
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}OH;
donde n toma valores de entre 2 y 20.
R^{1} es un grupo alquilo
(C_{1}-C_{10}), sustituido o no sustituido;
preferiblemente R^{1} es un grupo alquilo
(C_{2}-C_{6}); más preferiblemente R^{1} es un
grupo etilo (CH_{2}-CH_{2});
Y no existe o es un grupo -SO_{2}R^{2},
donde
R^{2} es un radical, sustituido o no
sustituido, que se selecciona del grupo que comprende las
siguientes fórmulas: -CH_{2}CH_{2}OR^{3}OCH_{2}CH_{2}, ó
-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}; donde
m toma un valor de entre 2 y 20; y
R^{3} es un radial, sustituido o no
sustituido, que se selecciona de entre los grupos alquilo
(C_{1}-C_{10}) ó dialquilarilo
((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10}));
y
Cuando Y es un grupo -SO_{2}R^{2}, los
compuestos de la invención tienen la siguiente fórmula general
(II):
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donde: R^{1}, X y R^{2} están
definidos
anteriormente.
En una realización preferida, R^{2} es un
grupo de fórmula -(CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}.
En otra realización preferida, m puede tomar un valor de 2 a 10,
más preferiblemente m es 2, 3, 4, 5 ó 6; y aún más preferiblemente
m puede ser 2 ó 5.
Cuando Y no existe, los compuestos de la
invención tienen la siguiente fórmula general (III):
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donde: R^{1} y X están definidos
anteriormente.
El término "alquilo" se refiere en la
presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas,
que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo,
n-butilo, tert-butilo,
sec-butilo, n-pentilo, etc.
Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 2 a 6 átomos de
carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos
por uno o más sustituyentes como por ejemplo arilo, halógeno,
hidroxilo, alcoxilo, amino, etc. Si están sustituidos por un
hidroxilo se refiere a un "hidroxialquilo".
Por "dialquilarilo" se entiende en la
presente invención a un grupo arilo que está sustituido con dos
grupos alquilo que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, más
preferiblemente tiene de 1 a 5 átomos de carbono. Los grupos
alquilo pueden ser iguales o diferentes, preferiblemente son iguales
y por "arilo" se entiende en la presente invención a una
cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 12 átomos de
carbono, puede ser de anillo único ó múltiple, separados y/o
condensados. Los grupos arilo típicos contiene de 1 a 3 anillos
separados o condensados y desde 6 hasta 18 átomos de carbono de
anillo, tales como radicales fenilo, naftilo, indenilo, fenantrilo
o antracilo.
El término "molécula etiqueta" se refiere
en esta descripción a cualquier sustancia biorreconocible,
colorante, fluoróforo o cualquier otro grupo detectable por
técnicas espectrofotométricas, fluorímétricas, de microscopia
óptica, fluorescencia o confocal, anticuerpos y /o RMN, y que
permite fácilmente la detección de otra molécula que por sí sola es
difícil de detectar y/o cuantificar.
Preferiblemente, esta molécula etiqueta es un
fluoróforo seleccionado del grupo de marcadores fluorescentes que
son susceptibles de ser derivatizados para la introducción de un
grupo hidroxilo, tiol o amina secundaria, con mantenimiento de sus
propiedades fluorescentes. Más preferiblemente este fluoróforo es
dansilo ó cualquiera de sus derivados.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere al método de obtención de los compuestos de la invención,
es decir, de los compuestos de fórmula general (I), y que comprende
reaccionar:
- (a)
- una vinilsulfona funcionalizada de fórmula general (IV), para su unión con las moléculas de etiquetado:
- donde Y está definido anteriormente.
- (b)
- con una molécula etiqueta o cualquiera de sus derivados funcionalizados, que contiene un grupo amino secundario, hidroxilo o tiol, según la siguiente fórmula general (V):
- donde X y R^{1} están definidos anteriormente.
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Los compuestos (IV) y (V) reaccionan a través de
una reacción de adición tipo Michael, según el siguiente
esquema:
donde: X, Y y R^{1} están
definidos
anteriormente.
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En una realización preferida, estos compuestos
de fórmula general (IV), cuando Y es -SO_{2}R, se obtienen por
reacción de divinilsulfona (DVS) con dioles (fórmula general (VI))
en una proporción mayor o igual de 2:1 (\geq2:1) para dar
bis-vinilsulfonas.
donde m toma valores de entre 2 y
20.
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En una realización aún más preferida, estos
dioles son etilenglicol (cuando m es 2) y tetraetilenglicol (cuando
m es 5), es decir, las bis-vinilsulfonas de fórmula
general (IV) son los siguientes compuestos:
De esta forma, se obtienen compuestos
homodifuncionales altamente reactivos pero que permiten modular su
reactividad mediante el control de la estequiometria de los
reactivos. Así, según el método de la presente invención las
vinilsulfonas de fórmula general (IV) permiten llevar a cabo la
incorporación, a través de reacciones de adición tipo Michael, de
cualquier etiqueta o derivado de las mismas que contenga grupos
funcionales con una reactividad complementaria (grupos amino,
hidroxilo ó tiol) y que dejen inalterado uno de los grupos
vinilsulfona para la posterior ligación de los compuestos de la
invención resultantes a biomoléculas.
En particular se pueden utilizar, pero sin
limitarse a, derivados de moléculas etiqueta conteniendo al menos
a) la función amino, b) la función hidroxilo o c) la función tiol
(compuestos de fórmula general (V)) que en su reacción con las
bis-vinilsulfona de fórmula general (IV) conducen a
los agentes de etiquetado de la presente invención. En una
realización preferida, los compuestos de fórmula general (V) se
obtienen por reacciones de moléculas etiquetas o de sus derivados
del tipo cloruros de ácido o cloruros de sulfonilo con compuestos
aminados de fórmula general (VII) que sean portadores a su vez de
las funciones amina secundaria (X = NR), hidroxilo (X = OH) o tiol
(X = SH) según se indica en el esquema 1.
\newpage
Esquema
1
Síntesis de los derivados
funcionalizados de moléculas etiqueta de fórmula
(V)
En una realización preferida del método de
obtención de los compuestos de la presente invención, el agente de
etiquetado utilizado es dansilo. En una realización aún más
preferida se utilizan los cloruros derivados de este agente de
etiquetado:
En una realización preferida de la presente
invención, las aminas de fórmula general (VII) usadas son a)
2-(2-aminoetil)-aminoetanol, b)
2-aminoetanol ó c)
2-aminoetanotiol.
En una realización preferida de la presente
invención, los derivados funcionalizados de las moléculas etiqueta
de fórmula general (V) reaccionan con las
bis-vinilsulfonas de fórmula general (IV) a través
de una reacción de adición tipo Michael usando una estequiometria
1:1. De esta forma se obtiene los compuestos de la invención de
fórmula general (I) conteniendo un grupo
vinil-sulfona.
Los compuestos de la invención proporcionan una
técnica de etiquetado que se basa en la ligación quimioselectiva de
la función vinilsulfona con grupos presentes de forma natural en
las biomoléculas (grupos amino y grupos tioles) y con los que
reaccionan a través de reacciones de adición tipo Michael. Además,
los compuestos son compatibles con la naturaleza biológica de las
biomoléculas y la técnica no requiere ninguna estrategia de
activación.
El uso de la función vinilsulfona como
derivatización de los reactivos de etiquetado para lleva a cabo la
unión covalente biomolécula-etiqueta presenta las
siguientes ventajas:
- a)
- Formación de una unión covalente estable.
- b)
- La reacción es rápida y con altos rendimientos no generándose ningún tipo de subproducto.
- c)
- No se requieren grandes excesos de reactivos.
- d)
- Las reacciones se llevan a cabo en ausencia de catalizadores por simple mezcla de los reactivos.
- e)
- Las reacciones pueden llevarse a cabo en agua sin el uso de co- solventes.
- f)
- Las reacciones pueden llevarse a cabo bajo condiciones fisiológicas: medio acuoso, rango de pH estrecho, temperaturas suaves.
- g)
- Procesos de purificación y aislamiento sencillos.
- h)
- Existe una tolerancia hacia los otros grupos funcionales presentes en las biomoléculas distintos de los grupos amino y tioles con los que reaccionan las vinil-sulfonas.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere al uso de los compuestos de fórmula general (I) como
agentes de etiquetado.
Los agentes de etiquetado comprenden un grupo
vinilsulfona (compuestos de fórmula general (I)) y pueden ser
ligados a cualquier biomolécula que contenga grupos funcionales
complementarios (grupos amino y/ó tiol) presentes en las mismas de
forma natural o artificial a través de una reacción de adición tipo
Michael (Esquema 2). En una realización preferida de la presente
invención, las biomoléculas son proteínas.
Esquema
2
Reacción entre los compuestos de
fórmula general (I) y las
biomoléculas
donde: R^{1}, X e Y están
definidos anteriormente y R^{4} puede ser NH ó
S.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aún mas preferida de la
presente invención, las proteínas son seleccionadas del grupo que
comprende albúmina sérica bovina (BSA), Concanalina A y
lisozima.
En una realización preferida de la presente
invención el etiquetado de proteínas se realiza en una solución de
las mismas en un tampón que no contenga aminas primarias o
secundarias como por ejemplo, pero sin limitarse a, fosfato o
HEPES, de fuerza fónica moderada (200 mM) y pH básico (7,5) y
reacción con un exceso de los reactivos de etiquetado de fórmula
general (I) durante un tiempo suficiente (aproximadamente 5 horas a
temperatura ambiente) eliminándose el exceso de reactivo mediante
diálisis.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1. Representa la fluorescencia de gel
SDS-PAGE de una mezcla de albúmina sérica bovina
(66 kDa), concanavalina A (26 kDa) y lisozima (14 kDa) etiquetadas
con el compuesto 14 que revela la posición de las proteínas al ser
iluminado con un transiluminador (\lambda=365 nm).
Fig. 2. Representa la fluorescencia de gel
SDS-PAGE de una mezcla de albúmina sérica bovina
(66 kDa), concanavalina A (26 kDa) y lisozima (14 kDa) etiquetadas
con el compuesto 15 que revela la posición de las proteínas al ser
iluminado con un transiluminador (\lambda=365 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Compuesto 4: A una disolución de etilenglicol 2
(330 mg, 5.3 mmol) en THF (100 mL) se le adicionaron DVS (1.6 mL,
16 mmol) y t-BuOK (119 mg, 1.1 mmol). La mezcla de
reacción se dejó a temperatura ambiente (30 min). El disolvente se
eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (AcOEt-hexano 2:1 a 3:1)
obteniéndose 4 como un sirope (800 mg, 51%).
Compuesto 5: A una disolución de
tetraetilenglicol 3 (1.02 g, 5.26 mmol) en tolueno (20 mL) se le
adicionaron DVS (1.5 mL, 15.5 mmol) y DBU (390 mg, 2.5 mmol). La
mezcla de reacción se calientó a 50°C (40 h). El disolvente se
eliminó por evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 10:1)
obteniéndose 5 como un líquido (886 mg, 40%).
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 10. A una disolución de cloruro de
dansilo 6 (236 mg, 0.87 mmol) en Cl_{2}CH_{2} (5 mL) se le
adicionaron
2-(2-aminoetil)-aminoetanol 7 (273
mg, 2.63 mmol). La mezcla de reacción se dejó a temperatura
ambiente (30 min). Tras dilución con Cl_{2}CH_{2} (100 mL) se
lavó con salmuera (2 x 30 mL). La capa orgánica se secó
(Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se eliminó por evaporación a
vacío. El crudo obtenido fue el compuesto 10 que puede ser
utilizado directamente sin purificación en la siguiente etapa.
Compuesto 11. A una disolución de cloruro de
dansilo 6 (270 mg, 1.0 mmol) en Cl_{2}CH_{2} (5 mL) se le
adicionó aminoetanol 10 (183 mg, 3 mmol). La mezcla de reacción se
dejó a temperatura ambiente (60 min). Tras dilución con
Cl_{2}CH_{2} (100 mL) se lavó con salmuera (2 x 30 mL). La capa
orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se eliminó por
evaporación a vacío. El crudo obtenido fue el compuesto 11 que
puede ser utilizado directamente sin purificación en la siguiente
etapa.
Compuesto 12. A una disolución de cloruro de
dansilo 6 (600 mg, 2.22 mmol) en Cl_{2}CH_{2} (15 mL) se le
adicionaron 2-aminoetanotiol 9 (505 mg, 4.45 mmol)
y Et_{3}N (1.1 mL, 7.78 mmol). La mezcla de reacción se dejó a
temperatura ambiente (30 min).El disolvente se eliminó por
evaporación a vacío. Al crudo obtenido se le adicionaron AcOH (30
mL) y Zn (1.8 g). La disolución resultante se refluyó (3.5 h). Tras
filtrado sobre celita y dilución con Cl_{2}CH_{2} (100 mL) se
lavó con agua, disolución saturada de NaHCO_{3} y agua La capa
orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se eliminó por
evaporación a vacío. El crudo obtenido se purificó por cromatografía
en columna (éter-hexano 1:1\rightarrow 2:1)
obteniéndose 12 como un sólido (467 mg, 68%).
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Compuesto 13. Una disolución de 10, obtenido
según el procedimiento arriba indicado a partir de cloruro de
dansilo 6 (236 mg, 0.87 mmol), y el compuesto 5 (490 mg, 1.14 mmol)
en t-BuOH-acetonitrilo 1:1 (10 mL)
se calentó a reflujo (2.5 h). La mezcla de reacción se evaporó a
vacío y el crudo obtenido se purificó por cromatografía en columna
(AcOEt-MeOH 12:1) obteniéndose 13 como un sirupo
(276 mg, 41% rendimiento total a partir de 6).
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Compuesto 14. A Una disolución de 11, obtenido
según el procedimiento arriba indicado a partir de cloruro de
dansilo 6 (270 mg, 1.0 mmol), y el compuesto 5 (430 mg, 1.0 mmol)
en THF(10 mL), se le adicionaron t-BuOK (10 mg). La
mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente (2 h). A
continuación se evaporó a vacío y el crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (AcOEt-MeOH 10:1)
obteniéndose 14 como un sirope (305 mg, 47% rendimiento total a
partir de 6).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 15. A una disolución de 12 (50 mg,
0.16 mmol), y el compuesto 1 (29 mg, 0.24 mmol) en
THF-isopropanol (1:2, 10 mL), se le pasó una
corriente de Ar (5 min) y se le adicionaron Et_{3}N (5 \mumL).
La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente (16 h). A
continuación se evaporó a vacío y el crudo obtenido se purificó por
cromatografía en columna (éter-hexano
1:1\rightarroweter) obteniéndose 15 como un sirope (45 mg,
65%).
\newpage
Ejemplo
4.1
Se hicieron reaccionar 3.75 nmoles de una
solución equimolecular (0.39 mM en agua) de BSA (SIGMA A4503),
concanavalina A (SIGMA L7647) y lisozima (SIGMA L6876) con 117
nmoles de 14 (58.7 mM en 1:1 metanol-agua) durante 5
horas en tampón HEPES 200 mM pH 7.6 y se analizó el resultado en
SDS-PAGE (Fig. 1). La fluorescencia se visualizó con
un transiluminador comercial (\lambda=365 nm). El marcaje fue
compatible con la detección mediante Coomassie.
Ejemplo
4.2
Se hicieron reaccionar 3.75 nmoles de una
solución equimolecular (0.39 mM en agua) de BSA (SIGMA A4503),
concanavalina A (SIGMA L7647) y lisozima (SIGMA L6876) con 154
nmoles de 15 (58.7 mM en 1:1 metanol-agua) durante 5
horas en tampón HEPES 200 mM pH 7.6 y se analizó el resultado en
SDS-PAGE (Fig. 2). La fluorescencia se visualizó con
un transiluminador comercial (\lambda=365 nm). El marcaje fue
compatible con la detección mediante Coomassie.
Claims (18)
1. Compuesto de fórmula general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
X es oxígeno (O), azufre (S), ó el grupo NR,
donde
R es un radical, sustituido o no sustituido, que
se selecciona de entre un grupo alquilo
(C_{1}-C_{10}), hidroxialquilo o un grupo
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}OH;
donde n toma valores de entre 2 y 20;
R^{1} es un grupo alquilo
(C_{1}-C_{10}), sustituido o no sustituido,
Y no existe o es un grupo -SO_{2}R^{2},
donde
R^{2} es un radical, sustituido o no
sustituido, que se selecciona de entre los grupos:
-CH_{2}CH_{2}OR^{3}OCH_{2}CH_{2}, ó
-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}, donde:
R^{3} es un radical, sustituido o no
sustituido, que se selecciona de entre los grupos alquilo
(C_{1}-C_{10}) ó dialquilarilo
((C_{1}-C_{10})Ar(C_{1}-C_{10}));
y
m toma valores de entre 2 y 20; y
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1, donde la
molécula etiqueta es un fluoróforo.
3. Compuesto según la reivindicación 2, donde el
fluoróforo es dansilo.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde R^{1} es un grupo etilo
(CH_{2}CH_{2}).
\vskip1.000000\baselineskip
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde Y es un grupo -SO_{2}R^{2}, con
la siguiente fórmula general (II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde: R^{1}, X y R^{2} están
definidos en la reivindicación
1.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Compuesto según la reivindicación 5, donde
R^{2} es (CH_{2}CH_{2}O)_{m}CH_{2}CH_{2}, y m
está descrito en la reivindicación 1.
7. Compuesto según la reivindicación 6, donde m
toma valores de 2 a 6.
8. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde Y no existe, con la siguiente fórmula
general (III),
\vskip1.000000\baselineskip
donde: R^{1} y X están definidos
en la reivindicación
1.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde m toma valores 2 ó
5.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde m toma valores 2 ó
5.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
12. Método de obtención del compuesto de fórmula
general (I) que comprende la reacción de:
a) una vinilsulfona de fórmula general (IV):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde Y esta definido en la
reivindicación
1
\vskip1.000000\baselineskip
b) con una molécula etiqueta o cualquiera de sus
derivados funcionalizados, según la fórmula general (V):
donde: X y R' están definidos en la
reivindicación
1.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Método según la reivindicación 12, donde la
vinilsulfona del paso (a) se selecciona de entre los compuestos de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
14. Método según la reivindicación 12, donde la
molécula etiqueta del paso (b) se selecciona de entre los
compuestos de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
15. Uso de un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, como agente de etiquetado.
16. Agente de etiquetado que comprende un
compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
17. Uso del agente de etiquetado según la
reivindicación 16, para el marcaje de biomoléculas.
18. Uso del agente de etiquetado según la
reivindicación 17, donde las biomoléculas son proteínas.
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|---|---|---|---|
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| ES200801474A ES2331783B1 (es) | 2008-05-20 | 2008-05-20 | Compuesto para el etiquetado de biomoleculas basado en vinilsulfona, preparacion y usos. |
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Also Published As
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|---|---|
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