ES2328650T3

ES2328650T3 - Metodo de seleccion directa de celulas t especificas de antigeno.

Info

Publication number: ES2328650T3
Application number: ES99924167T
Authority: ES
Inventors: Mario Assenmacher; Stefan Miltenyi; Jurgen Schmitz
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2009-11-16
Anticipated expiration: 2019-05-10
Also published as: EP1078263B1; US6576428B1; AU4073699A; JP2002514765A; ATE437366T1; WO1999058977A1; CA2330678C; CA2330678A1; DE69941150D1; AU765085B2; US20040023377A1; EP1078263A1; JP4601166B2; DK1078263T3

Abstract

Un método de marcaje de células T específicas de antígeno con un producto secretado y liberado por las células, en el que el producto se secreta en respuesta a estimulación antigénica, comprendiendo dicho método: (a) exponer una población mixta de células que comprenden células T a al menos un antígeno en condiciones eficaces para generar una estimulación específica de antígeno de al menos una célula T y permitir la expresión de al menos un producto por la célula T estimulada, en el que el producto se secreta en respuesta a la estimulación antigénica; (b) modificar la superficie de las células para que contenga un resto de captura específico para el producto de modo que el resto de captura se acople a la superficie celular, (c) cultivar la población en condiciones en las que el producto se secreta, se libera y se une específicamente al resto de captura, marcando de este modo las células secretoras de producto; y en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden.

Description

Método de selección directa de células T específicas de antígeno.

Campo técnico

La invención es en el campo del análisis de poblaciones celulares y separación de células y las composiciones obtenidas de este modo. Más particularmente, la invención se refiere al análisis y la separación de células T específicas de antígeno basados en el marcaje primario de células con sus productos secretados mediante la captura de estos productos por un compañero de unión específica para el producto anclado o unido a la superficie celular.

Técnica antecedente

Se han realizado numerosos intentos para analizar poblaciones de células y para separar células basándose en los productos que producen. Dichas estrategias para el análisis y la separación de células son especialmente útiles en la evaluación de las células que son capaces de secretar un producto deseado (el "producto"), o que son relativamente buenas secretoras del producto. Estos métodos incluyen clonación en placas de microtitulación y análisis del sobrenadante del cultivo para producto, clonación en agar y análisis por métodos para la identificación del producto de las células localizadas; los métodos de identificación incluyen, por ejemplo, ensayos de placas y transferencia de western. La mayoría de los métodos para el análisis y la selección de células basados en la secreción de producto implican aislar físicamente la célula, seguido de incubación en condiciones que permitan la secreción de producto y la exploración de las localizaciones celulares para detectar la célula o los clones celulares que producen el producto. Cuando las células están en suspensión, después de que las células hayan secretado el producto, el producto difunde desde la célula sin dejar un marcador que permita la identificación de la célula desde la que se secretó. Por lo tanto, las células secretoras no pueden separarse de células no secretoras con estos tipos de sistemas.

En otros casos, las células tanto secretoras como no secretoras pueden asociar el producto con la membrana celular. Un ejemplo de este tipo de sistema son líneas celulares procedentes de células B que producen anticuerpos monoclonales. Se ha descrito que estos tipos de líneas celulares se separaron por separación de células activadas por fluorescencia (FACS) y otros métodos que dependen de la presencia de marcadores de superficie celular de anticuerpos. Sin embargo, los procedimientos que analizan y separan células por marcadores que se asocian de forma natural con la superficie celular no pueden identificar con precisión y/o usarse en la separación de células secretoras de células no secretoras. Además, los sistemas de este tipo no son útiles en la identificación de diferencias cuantitativas en células secretoras (es decir, secretoras de bajo nivel de secretoras de alto nivel).

Un método que se ha usado para superar los problemas asociados con la difusión de producto desde las células ha sido poner la célula en un medio que inhiba la velocidad de difusión desde la célula. Un método típico ha sido inmovilizar la célula en un medio similar a gel (agar) y después explorar las placas de agar para la producción de producto usando un sistema que depende de transferencia, por ejemplo, transferencias de Western. Estos sistemas son engorrosos y caros si se van a analizar grandes cantidades de células para determinar las propiedades de secreción, no secreción o cantidad de secreción.

Köhler et al han descrito un sistema de selección negativa en el que se enriquecieron mutantes de una línea de hibridoma que secreta IgM con especificidad anti-trinitrofenilo (anti-TNP) por acoplamiento del hapteno (es decir, TNP) a la superficie celular e incubación de las células en presencia de complemento. De este modo, se lisaron las células que secretaban IgG de tipo silvestre, mientras que las células que secretaban IgM con actividad lítica reducida o que no se unían a TNP sobrevivieron preferentemente. Kohler y Schulman (1980) Eur J. Immunol. 10: 467-476.

Más recientemente se ha descrito un sistema para marcar y separar células basándose en el producto secretado. Documento PCT/US93/10126 (WO 94/09117) (véase también Manz et al Proc. Natl. Acad. Sci Vol. 92, 1995, 1921-1925). En este sistema, un compañero de unión específica para un producto secretado se acopla a la superficie de células. El producto se secreta, se libera y une a la célula por el compañero de unión específica. Después, las células se separan basándose en el grado en el que se marcan con el producto unido.

Otros sistemas permiten que las células secreten sus productos en el contexto de microgotas de gel de agarosa que contienen reactivos que se unen a los productos de secreción y encapsulación de las células. Se han descrito dichos métodos en publicaciones por Nir et al. (1990) Applied and Environ. Microbiol 56: 2870-2875; y Nir et al. (1991) Applied and Environ. Microbiol 56: 3861-3866. Estos métodos son insatisfactorios por una diversidad de razones. En el proceso de microencapsulación, se produce la inmovilización estadística de varias células en las cápsulas, dando como resultado un elevado número de cápsulas vacías cuando se produce la encapsulación a bajas concentraciones de células o a múltiples células por cápsula cuando la encapsulación se produce a altas concentraciones de células. El producto secretado se inmoviliza en la gota de agarosa por el anticuerpo de captura y se detecta mediante un segundo anticuerpo fluorocromado. Este proceso, aunque permite la detección y el aislamiento de células basándose en el producto secretado, es complicado, requiere un equipamiento especial y no es adecuado para todos los tipos de métodos de separación.

Para analizar y separar células individuales o grupos de células individuales mediante esta técnica, deben manipularse grandes volúmenes para trabajar con números relativamente pequeños de células debido a los números de cápsulas vacías y debido al tamaño de las microcápsulas (50-100 \mum). El gran volumen de gotas da como resultado problemas de fondo usando análisis y separación por citometría de flujo. Además, las cápsulas no permiten la separación usando perlas magnéticas o selección para separación de células.

Se han usado diversos métodos para acoplar marcadores a superficies celulares en los que el marcador, tal como un fluorocromo, está destinado a una detección directa. Por ejemplo, se ha descrito que enlazadores hidrófobos insertados en la membrana celular acoplan marcadores fluorescentes con células en el documento PCT WO 90/02334, publicado el 8 de marzo de 1990. Los anticuerpos dirigidos contra HLA también se han usado para unir marcadores a superficies celulares. Dicha unión da como resultado una menor dimensión que las gotas encapsuladas que se han descrito anteriormente y dichas células pueden usarse convenientemente en procedimientos de separación convencionales que incluyen separaciones por citometría de flujo y magnéticas.

Se han usado ensayos ELISpot y métodos para tinción intracelular de citoquinas para la enumeración y caracterización de células T CD4^{+} y CD8^{+} específicas de antígeno. Lalvani et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 859-865; y Waldrop et al. (1997) J. Clin Invest. 99: 1739-1750. Estos métodos pueden ser bastante útiles para el mapeo de epitopos de células T o para el control de la inmunogenicidad en ensayos de vacunas, pero no permiten el aislamiento de células T específicas de antígeno vivas, por ejemplo, para ensayos clínicos de inmunoterapia adoptiva específica de cáncer o infecciones. Kern et al. (1998) Nat. Med. 4: 975-978; El Ghazali et al. (1993) Curr. Opin Immunol. 23: 2740-2745; y Yee et al (1997) Curr. Opin. Immund. 9: 702-708.

Se han aprovechado recientemente complejos multivalentes solubles de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) cargadas con péptido para detectar y también aislar células T específicas de antígeno. Altman et al. (1996) Science 274: 94-96; Dunbar et al. (1998) Curr. Biol. 8: 413-416; Ogg et al. (1998) 279: 2103-2106; Luxembourg et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16: 281-285; Murali-Krishna et al. (1998) Immunity 8: 177-187; Gallimore et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 1383-1393; y Flynn et al. (1998) Immunity 8: 683-691. Estos reactivos son altamente específicos, pero la estrategia se limita a combinaciones bien definidas de péptidos antigénicos y alelos de HLA de restricción.

El sistema inmune comprende dos tipos de células específicas de antígeno: células B y células T. Las células T pueden caracterizarse fenotípicamente por el modo en el que reconocen al antígeno, por sus marcadores de superficie celular y por sus productos secretados. A diferencia de las células B, que reconocen antígeno soluble, las células T reconocen antígeno solamente cuando el antígeno se presenta a las mismas en forma de pequeños fragmentos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de otra célula. Cualquier célula que exprese moléculas de MHC asociadas con fragmentos de antígeno en su superficie puede considerarse una célula presentadora de antígenos (APC). Sin embargo, en la mayoría de las situaciones, más que la mera presentación de fragmento de antígeno unido a MHC sobre una superficie celular, es necesario activar un linfocito T. Además de la señal suministrada por el receptor de células T (TCR) acoplado por la molécula de MHC más antígeno, la célula T también debe recibir señales coestimuladoras de la APC. Típicamente, las APC son células dendríticas, macrófagos o linfocitos B activados.

Las células T expresan moléculas de membrana distintivas. Entre estas se incluyen el receptor de antígeno de células T (TCR), que aparece en la superficie celular junto con CD3; y moléculas accesorias tales como CD5, CD28 y CD45R. Las subpoblaciones de células T pueden diferenciarse por la presencia de moléculas de membrana adicionales. Por lo tanto, por ejemplo, las células T que expresan CD4 reconocen antígeno asociado con moléculas de MHC clase II y funcionan generalmente como células auxiliares, mientras que las células T que expresan CD8 reconocen antígeno asociado con moléculas de MHC clase I y funcionan generalmente como células citotóxicas. La subpoblación CD4^{+} de células T puede categorizarse adicionalmente en al menos dos subconjuntos basándose en los tipos de citoquinas secretadas por la célula. Por lo tanto, aunque ambos subconjuntos secretan IL-3 y GM-CSF, las células TH1 secretan generalmente IL-2, IFN-\gamma y TNF-\alpha, mientras que las células TH2 secretan generalmente IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13.

Los cambios minoritarios en el péptido unido a la molécula de MHC no pueden afectar a la afinidad de la interacción de péptido-molécula de MHC, aunque pueden generar señales parciales que conduzcan a una respuesta intermedia caracterizada por proliferación y secreción de solamente una fracción de las citoquinas producidas durante un respuesta completa de células T. Algunos péptidos modificados pueden incluso bloquear la proliferación y secreción de citoquinas por completo e inducir un estado de anergia o insensibilidad de células T. Por tanto, existen tres tipos diferentes de péptidos: agonista (los que estimulan una respuesta completa), agonista parcial (los que estimulan una respuesta parcial) y antagonista (los que inducen insensibilidad). Cuando una sola APC presenta una mezcla de un agonista y un antagonista sobre su superficie, el efecto negativo del último puede superar el efecto positivo del primero, incluso si el antagonista está presente en cantidades mucho menores que el agonista. Algunos virus parecen usar mutaciones en sus proteínas para producir péptidos antagonistas capaces de suprimir la actividad de los clones de células T que reconocen péptidos agonistas obtenidos del virus de tipo silvestre original.

La secreción por una célula T de una citoquina particular generalmente se asocia con una función particular. Por ejemplo, se piensa que las diferencias en las citoquinas secretadas por los subconjuntos TH1 y TH2 de células T CD4^{+} reflejan diferentes funciones biológicas de estos dos subconjuntos. El subconjunto TH1 es responsable de funciones clásicas mediadas por células tales como hipersensibilidad de tipo retardado y activación de células T citotóxicas, mientras que el subconjunto TH2 funciona más eficazmente como un auxiliar para la activación de células B. El subconjunto TH1 puede ser particularmente adecuado para responder a infecciones víricas y patógenos intracelulares ya que secreta IL-2 e IFN-\gamma, que activan células T citotóxicas. El subconjunto TH2 puede ser más adecuado para responder a bacterias extracelulares y parásitos helmínticos y puede mediar reacciones alérgicas, ya que se sabe que IL-4 e IL-5 inducen la producción de IgE y la activación de eosinófilos, respectivamente. También existen pruebas considerables que sugieren que la activación preferente de células TH1 desempeña un papel central en la patogenia de varias enfermedades autoinmunes. Se piensa que la secreción de IL-10 por células TH2 suprime, de un modo indirecto, la producción de citoquinas por células TH1 y, por consiguiente, tiene un efecto inmunosupresor general. Un cambio en el equilibrio TH1/TH2 puede dar como resultado una respuesta alérgica, por ejemplo, o una respuesta aumentada de células T citotóxicas.

Los cambios iniciados por el TCR en los primeros pocos minutos a horas de activación conducen a la transición de la célula de la fase G0 a G1 del ciclo celular. Varias horas después de la estimulación de la célula T, comienza a expresar IL-2 y receptor de IL-2 de alta afinidad. La expresión del gen IL2 se efectúa por un conjunto de factores de transcripción que se activan por las rutas de señalización convergentes desencadenadas por el ligamiento de TCR, CD28 y posiblemente otras moléculas de superficie de células T.

Los factores de transcripción también inducen la expresión del gen de CD25, que codifica la subunidad a del receptor de IL-2 de alta afinidad. La interacción de IL-2 con el receptor de alta afinidad inicia rutas de señalización que provocan que la célula T pase de la fase G1 a la S del ciclo celular y avance hasta la división celular. La rutas de señalización controlan la expresión y la actividad de varias proteínas clave necesarias para la división celular. Algunas de estas también se activan directamente por señales dependientes de TCR y CD28, mientras que otras se activan solamente por señales proporcionadas a través del receptor de IL-2.

La célula T estimulada experimenta una secuencia de cambios fenotípicos que comienzan con su progresión del estado de reposo a la mitosis y, posteriormente, a la diferenciación en células efectoras y de memoria. Entre los cambios más tempranos (inmediatos), observables en los 15-30 minutos siguientes a la estimulación, están la expresión de genes que codifican factores de transcripción tales como c-Fos, NF-AT, c-Myc y NF-\kappaB, proteínas quinasas tales como Jak-3 y fosfatasas de proteínas tales como Pac-1. Los cambios tempranos posteriores, que se producen en el intervalo de varias horas desde la estimulación, marcan el comienzo de la expresión de genes que codifican antígenos de activación. Estos incluyen varias citoquinas (IL-2 y otras), subunidad \alpha del receptor de IL-2 (CD25), receptor de insulina, receptor de transferrina y varias moléculas de superficie adicionales tales como CD26, CD30, CD54, CD69 y
CD70.

Los antígenos de activación alcanzan un nivel máximo de expresión justo antes de la primera división, 24 horas después de la estimulación. Durante este periodo aumenta el nivel de expresión de varias moléculas adicionales ya expresadas en células T en reposo. En un momento posterior, algunos días después de que haya comenzado la activación, se expresan antígenos de activación tardía en las células T. Estos incluyen moléculas de MHC clase II y varios miembros de la familia de integrinas \beta1. La expresión de antígenos de activación tardía marca la diferenciación de la célula activada en células T efectoras o de memoria.

Las células T desempeñan papeles importantes en la autoinmunidad, inflamación, citotoxicidad, rechazo de injertos, alergia, hipersensibilidad de tipo retardado, hipersensibilidad mediada por IgE y modulación de la respuesta humoral. Las patologías pueden ser el resultado de la activación de células T autorreactivas, de la activación de células T que provoquen reacciones alérgicas o de la activación de células T autorreactivas después de determinadas infecciones bacterianas y parasitarias, que pueden producir antígenos que mimeticen la proteína humana, convirtiendo estas proteínas en "autoantígenos". Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, las enfermedades autoinmunes, trastornos autoinmunes que se producen como un acontecimiento secundario a infección con determinadas bacterias o parásitos, alergias mediadas por células T y determinadas enfermedades cutáneas tales como psoriasis y vasculitis. Además, el rechazo no deseado de un antígeno extraño puede dar como resultado el rechazo de injerto o incluso infertilidad y dicho rechazo puede deberse a la activación de poblaciones de linfocitos T específicos. También pueden surgir afecciones patológicas a partir de una respuesta inadecuada de células T contra un tumor o una infección vírica. En estos casos, sería deseable aumentar una respuesta de células T específica de antígeno para reducir o eliminar el tumor o erradicar una infección.

Las enfermedades autoinmunes tienen una diversidad de causas. Por ejemplo, pueden provocarse reacciones autoinmunes por lesión o inmunización con colágeno, por superantígenos, por factores genéticos o errores en la regulación inmune. Los superantígenos son activadores policlonales que pueden, entre otras cosas, estimular clones previamente anergizados por encuentro con un autoantígeno o clones que ignoraron los autoantígenos potenciales debido a su baja expresión o disponibilidad. Determinadas enfermedades autoinmunes están causadas principalmente por autoanticuerpos, otras están mediadas por células T. Las células T autorreactivas provocan lesión tisular en varias enfermedades autoinmunes que incluyen artritis reumatoide y esclerosis múltiple.

En el tratamiento de trastornos autoinmunes, se han usado agentes inmunosupresores inespecíficos para ralentizar la enfermedad; estas terapias causan con frecuencia una inmunosupresión por destrucción o inhibición aleatoria de células inmunocompetentes. Los intentos para tratar trastornos autoinmunes por modulación de la actividad de células T autorreactivas han incluido la inmunización con péptidos TCR, el tratamiento con interferón-\beta (IFN-\beta) y la vacunación con linfocitos T. Ebers (1994) Lancet 343: 275-278; Hohlfeld (1997) Brain 120: 865-916; y Hafler et al. (1992) Clin. Immunol. Immunopathol. 62: 307-313.

El desarrollo de sensibilización alérgica, sensibilidad por contacto e inflamación depende de la activación y estimulación de células T que presentan funciones proalérgicas. Se piensa que las células T específicas de alergeno desempeñan un papel importante en la fisiopatología de alergias atópicas. La eliminación o supresión de células T específicas de alergeno podría ayudar a mejorar enfermedades alérgicas provocadas por dichas células T.

En la fase inicial de una reacción alérgica, el antígeno (alergeno) entra en el cuerpo, se capta por APC, se presenta por las mismas en el contexto de moléculas de MHC clase II y es reconocido por precursores de células T auxiliares. Estos se estimulan para proliferar y diferenciarse principalmente hacia células TH2, que ayudan a los linfocitos B a diferenciarse en células plasmáticas productoras de anticuerpos. Como en cualquier otra respuesta mediada por anticuerpos, las células B que reciben ayuda específica de células TH son las que reconocen el alergeno a través de sus receptores de superficie. Algunas de las citoquinas producidas por las células TH2, especialmente IL-4 e IL-13, estimulan las células B para efectuar un cambio de isotipo de inmunoglobulina y producir anticuerpos IgE. Los anticuerpos se unen a receptores Fc de alta afinidad sobre la superficie de mastocitos en el tejido conectivo y la mucosa, así como a los de la superficie de basófilos en la circulación y la mucosa e inician las manifestaciones de reacción alérgica.

El rechazo de aloinjerto está causado principalmente por una respuesta inmune mediada por células contra aloantígenos (principalmente moléculas de MHC) expresadas en células del injerto. El análisis de las subpoblaciones de linfocitos T implicadas en el rechazo de aloinjertos ha implicado a poblaciones tanto CD4+ como CD8+. Las células TH1 inician la reacción inflamatoria de la hipersensibilidad de tipo retardado, conduciendo al reclutamiento de monocitos y macrófagos hacia el injerto. Las células asesinas naturales (NK), presumiblemente avisadas por la ausencia en el injerto de moléculas de MHC presentes en el receptor, también pueden atacar al injerto en las fases tempranas de la respuesta. Los neutrófilos son principalmente responsables de limpiar la herida o eliminar las células dañadas y residuos celulares en la fase tardía de la reacción de aloinjerto.

La mayoría de los tratamientos inmunosupresores desarrollados tienen la desventaja de ser inespecíficos; es decir, dan como resultado una inmunosupresión generalizada que sitúa al receptor en un riesgo aumentado de infección. Los agentes inmunosupresores empleados para evitar el rechazo de órganos incluyen inhibidores mitóticos tales como azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato; corticosteroides; y fármacos tales como ciclosporina, FK506 y rapamicina, que inhiben la transcripción de los genes que codifican IL-2 y el receptor de alta afinidad para IL-2.

En el tratamiento de cánceres, se ha empleado inmunoterapia celular como una alternativa o junto con terapias convencionales tales como quimioterapia y terapia de radiación. Por ejemplo, las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) pueden dirigirse contra antígenos específicamente o preferentemente presentados por células tumorales. Después de la activación con citoquinas de células T en presencia de antígeno tumoral apropiadamente presentado, los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) proliferan en cultivo y adquieren potentes propiedades citolíticas antitumorales. Weidmann et al. (1994) Cancer Immunol. Immunother. 39: 1-14.

La introducción en un paciente con cáncer de poblaciones de linfocitos activados in vitro ha obtenido cierto éxito. La inmunoterapia adoptiva, la infusión de células inmunológicamente activas en un paciente con cáncer para lograr una regresión tumoral ha sido una estrategia atractiva para la terapia del cáncer durante varias décadas. Se han seguido dos estrategias generales. En la primera, se recogen células de donantes que son naturalmente reactivas contra el tumor del hospedador, basándose en diferencias en la expresión de antígenos de histocompatibilidad, o hechas reactivas usando una diversidad de técnicas de "inmunización". Estas células de donante activadas se transfunden después a un hospedador que lleva un tumor. En la segunda estrategia general, se recogen linfocitos de un paciente con cáncer, se activan ex vivo contra el tumor y después se vuelven a infundir en el paciente. Triozzi (1993) Stem Cells 11: 204-211; y Sussman et al. (1994) Annals Surg. Oncol. 1: 296.

Los métodos actuales de tratamiento del cáncer son relativamente no selectivos. La cirugía elimina el tejido enfermo, la radioterapia encoge tumores sólidos y la quimioterapia destruye rápidamente células en división. El suministro sistémico de agentes quimioterápicos, en particular, da como resultado numerosos efectos secundarios, en algunos casos lo bastante graves para impedir el uso de fármacos potencialmente eficaces.

Las enfermedades víricas también son candidatas para inmunoterapia. Heslop et al. (1996) Nature Med. 2: 551-555. Las respuestas inmunológicas a patógenos virales son a veces ineficaces para erradicar o reducir los suficiente el virus. Además, la naturaleza altamente mutable de ciertos virus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana, les permite eludir el sistema inmune.

Claramente, existe la necesidad de identificar, analizar y enriquecer poblaciones de células T implicadas en las patologías mencionadas anteriormente. Actualmente, existen varios métodos para el análisis y el enriquecimiento de células T específicas de antígenos y/o secretoras de citoquinas. El enriquecimiento de células T específicas de antígeno puede lograrse usando técnicas de cultivo selectivas para obtener líneas de células T y clones de células T. Estas técnicas implican generalmente el cultivo de células T in vitro durante un periodo de varias semanas y el uso de métodos bastante incómodos para seleccionar líneas o clones que presenten el fenotipo deseado, tal como secreción de citoquinas. Otros intentos para detectar y enriquecer para células T específicas de antígeno han empleado complejos MHC-antígeno y MHC-péptido multiméricos definidos. Patente de Estados Unidos Nº 5.635.363. Sin embargo, para que dicha técnica tenga éxito, son necesarios complejos de MHC-antígeno del alotipo de MHC correcto y la selección se limita a especificidad de antígeno, es decir, no se proporciona selección para secreción de citoquinas mediante esta técnica.

La tinción de citoquinas intracelulares después de la activación antigénica, seguida de análisis por FACS, es el método usado para obtener información respecto a la especificidad antigénica y a la cinética de producción de citoquinas. Waldrop et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 1739-1750. Este método es útil para análisis solamente, puesto que las células no son viables después de este procedimiento. De forma similar, los ensayos ELISPOT de citoquinas son útiles para análisis solamente. Miyahira et al. (1995) J. Immunol. Met. 181: 45-54; y Lalvani et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 859-865. En estos ensayos, las citoquinas secretadas se inmovilizan en una matriz que las rodea para análisis, pero no existe ningún mecanismo para identificar y recuperar la célula que secretó la citoquina. La tecnología de microgotas en gel no es adecuada para procesar grandes cantidades de células, como las que serían necesarias para tratamiento de las indicaciones mencionadas anteriormente.

Es evidente a partir de la discusión anterior que existe la necesidad de técnicas fiables para analizar y separar poblaciones de células T, basándose en el producto secretado, para varios fines terapéuticos y diagnósticos. La presente invención aborda esta necesidad proporcionando métodos para analizar, separar y enriquecer poblaciones de células T específicas de antígeno.

Descripción de la invención

La invención proporciona un método para un análisis y separación celular convenientes de células T específicas de antígeno basado en uno o más productos secretados por estas células en respuesta a la estimulación antigénica. Las células T se proporcionan con un resto de captura específico para el producto (o "compañero de unión específica"), que después puede usarse directamente como marcador. La unión del producto al resto de captura da como resultado un "producto capturado". Como alternativa, las células se unen al producto a través del resto de captura y pueden marcarse adicionalmente mediante restos marcadores que se unen específicamente al producto y que están, a su vez, marcados directamente o indirectamente con materiales de marcaje tradicionales tales como fluoróforos, isótopos radiactivos, cromóforos o partículas magnéticas.

Las células marcadas pueden separarse después usando técnicas de separación de células convencionales basadas en estos marcadores. Dichas técnicas incluyen, pero sin limitación, citometría de flujo, FACS, separación en gradiente magnético de alto gradiente, centrifugación.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método de marcaje de células T específicas de antígeno con un producto secretado y liberado por las células, en el que el producto se secreta en respuesta a estimulación antigénica, comprendiendo dicho método:

a) exponer una población mixta de células que comprenden células T a al menos un antígeno en condiciones eficaces para generar una estimulación específica de antígeno de al menos una célula T y permitir la expresión de al menos un producto por la célula T estimulada, donde el producto se secreta en respuesta a estimulación antigénica;

b) modificar la superficie de las células para que contengan un resto de captura específico para el producto de modo que el resto de captura se acopla a la superficie celular;

c) cultivar la población en condiciones en las que el producto se secreta, se libera y se une específicamente al resto de captura, marcando de este modo las células secretoras de producto; y

en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden.

De acuerdo con la invención, también se proporciona una población de células marcadas y/o separadas de acuerdo con los métodos de la invención.

Por lo tanto, la invención incluye un método para estimular y separar células T específicas de antígeno de una población de células de acuerdo con un producto secretado y liberado por las células T específicas de antígeno en respuesta a la estimulación. El método comprende estimular una mezcla de células que contienen células T con antígeno y efectuar una separación de células estimuladas con antígeno de acuerdo con el grado en el que estén marcadas con el producto. Las estimulación antigénica se consigue por exposición de las células a al menos un antígeno en condiciones eficaces para generar estimulación específica de antígeno de al menos una células T. El marcaje con el producto se consigue por modificación de la superficie de las células para que contengan al menos un resto de captura, cultivo de las células en condiciones en las que el producto se secrete, se libere y se una específicamente ("se capture" o "se inmovilice") a dicho resto de captura; y marcaje del producto capturado con un resto marcador, donde las células marcadas no se lisan como parte del procedimiento de marcaje ni como parte del procedimiento de separación.

También se describe una composición de sustancia que contiene células T específicas de antígeno capaces de capturar un producto secretado y liberado por estas células en respuesta a la estimulación antigénica, donde la superficie de las células se modifica para contener un resto de captura para el producto. El producto capturado puede marcarse por separado mediante un resto marcador.

También se describen células T específicas de antígeno y progenie de las mismas separadas por el método descrito anteriormente.

También se describe un método para marcar células T específicas de antígeno con un producto secretado y liberado por las células en respuesta a estimulación antigénica, por modificación de la superficie de estas células para contener un compañero de unión específica para el producto acoplado a la superficie celular y cultivo de las células en condiciones en las que el producto se secreta y se libera.

También se describe un método de análisis de una población de células T específicas de antígeno para determinar la proporción de células que secretan una cantidad de producto respecto a otras células en la población, donde el producto se secreta en respuesta a estimulación antigénica. El método comprende marcar las células mediante el método descrito anteriormente, marcar adicionalmente las células con un segundo marcador que no marque el producto capturado y detectar la cantidad de marcador de producto respecto al segundo marcador celular. Dichos métodos son útiles, por ejemplo, en la evaluación del estado inmune de un individuo.

Un aspecto adicional de la invención son poblaciones de células T enriquecidas en células T específicas de antígeno para el uso en métodos de tratamiento. Los métodos comprenden administrar a un individuo que necesite tratamiento una composición que comprende una población de célula T enriquecida en células T específicas de antígenos. Dichas composiciones son útiles para tratar una diversidad de afecciones patológicas, incluyendo cáncer, alergias, inmunodeficiencias, trastornos autoinmunes y enfermedades víricas.

También se describe un kit para el uso en la separación de células T específicas de antígeno a partir de una población mixta que comprende células efectoras. El kit puede contener un medio fisiológicamente aceptable que puede ser de grados variables de viscosidad hasta una consistencia de tipo gel, un sistema de captura de producto que comprende restos de anclaje y de captura; un sistema marcador para detectar el producto capturado; e instrucciones para el uso de los reactivos, todos envasados en recipientes apropiados. Opcionalmente, el kit comprende además un sistema de marcaje magnético y/o uno o más modificadores biológicos.

También se describe un kit para el uso en la detección/separación de células T específicas de antígeno que secreten un producto deseado en respuesta a estimulación antigénica, comprendiendo el kit un sistema de captura de producto que comprende restos de anclaje y de captura; un sistema marcador para detectar el producto capturado; instrucciones para el uso de los reactivos, todos envasados en recipientes apropiados. Opcionalmente, el kit comprende además un sistema de marcaje magnético y/o antígeno y/o uno o más modificadores biológicos.

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Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1-AP son representaciones de FACS que muestran el análisis de células sometidas al protocolo de separación descrito en el Ejemplo 1. Las A-H muestran el análisis de células de control cultivadas sin péptido; las IP muestran análisis de células estimuladas con péptido. Las A, C, I y K muestran propiedades de dispersión de la población celular de partida (A e I) y la población celular enriquecida (C y K). Las B, D, J y L muestran perfiles de tinción PI frente a PE de la población celular de partida (B y J) y la población celular enriquecida (D y L). Las representaciones E-H y M-P muestran anti-CD8 marcado con FITC frente a tinción anti-IFN-\gamma marcado con PE de la población celular de partida (E y M), la primera población negativa (F y N), la segunda población negativa (G y O) y la población celular enriquecida (H y P).

Las Figuras 2A-N son representaciones de FACS que muestran el análisis de células sometidas al protocolo de separación descrito en el Ejemplo 2. Las A-G muestran el análisis de células de control cultivadas sin péptido; las N-R muestran el análisis de células estimuladas con péptido. Las A-D y H-K muestran tinción con anti-CD8 marcado con FITC frente a con anti-IFN-\gamma marcado con PE de la población celular de partida (A y J), las primera población negativa (B e I), la segunda población negativa (C y J) y la población celular enriquecida (D y K). F y M muestran tinción para V\beta17TCR de la población celular enriquecida.

La Figura 3 es una serie de representaciones de puntos que muestran enriquecimiento basado en secreción de IFN-\gamma y detección de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno vivas. Las representaciones de puntos muestran tinción con CD8-Cy5 frente a anti IFN-\gamma-PE (A-D) o con CD4-Cy5 frente a anti IFN-\gamma-PE (E-L) de PBMC de donantes adultos sanos estimuladas con (A, B) o sin (C, D) el péptido FLU 58-66 restringido por HLA-A0201, una preparación de virus infuenza A purificado (con (E, F), sin (G, H)) y rTT.C (con (I, J), sin (K, L)) antes (A, C, E, G, I, K) y después (B, D, F, H, J, L) de enriquecimiento magnético de células secretoras de IFN-\gamma. Se activaron de acuerdo con las propiedades de dispersión de luz y exclusión de yoduro de propidio.

La Figura 4 es una serie de representaciones de puntos que muestran un análisis fenotípico de células T CD8+ específicas de péptido FLU 58-66. Se tiñeron células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma enriquecidas a partir de PBMC estimuladas con péptido FLU 58-66 (A, B, E, F) y, como control, a partir de PBMC no estimuladas (C, D, G, H) con anti IFN-\gamma-PE y se contratiñeron con anticuerpos conjugados con FITC contra CD27, CD28, CD57 y la cadena V\beta17 de TCR. Se usaron las propiedades de dispersión de luz, tinción con yoduro de propidio y CD8-Cy5 para la selección de células T CD8^{+} vivas.

La Figura 5 es una gráfica que representa la actividad citolítica de células T específicas de péptido FLU 58-66 enriquecidas y expandidas. Las células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de PBMC estimuladas con péptido FLU 58-66 se expandieron durante 18 días en cultivo tisular en presencia de IL-2 y después se ensayaron por ensayo de actividad de CTL. El diagrama muestra el porcentaje de células HLA-A2.1+ T2 estimuladas con péptido FLU 58-66 o el péptido de control negativo Melan A/MART 1 27-35.

La Figura 6 es una serie de representaciones de puntos que representan el aislamiento y la detección de células T CD4+ secretoras de IL-4 específicas de TT. Las representaciones de puntos muestran la tinción con CD4-Cy5 frente a anti IL-4-PE de PBMC de donantes adultos sanos estimuladas con (A, C) o sin (B, D) enriquecimiento magnético de células secretoras de IL-4. Se seleccionaron los linfocitos vivos de acuerdo con las propiedades de dispersión de luz y la exclusión de yoduro de propidio.

Modos de realizar la invención

La presente invención proporciona métodos para detectar, analizar y separar células T de estimuladas con antígeno en base al producto secretado, donde el producto se secreta como resultado de la estimulación antigénica. Los métodos se basan en la captura y relocalización en la superficie celular del producto secretado. El producto capturado permite que la célula se detecte, se analice y, si se desea, se separe de acuerdo con la presencia, ausencia o cantidad del producto presente. El medio de captura comprende un compañero de unión específico de producto ("resto de captura") anclado a la superficie celular por un medio adecuado para la célula a separar.

La estrategia que se presenta en este documento combina, entre otras, las siguientes ventajas: (a) permite un aislamiento, enumeración, fenotipado y expansión rápida de linfocitos T específicos de antígeno vivos sin la necesidad de activación cíclica de células T con antígeno y APC; (b) generalmente es aplicable para el aislamiento de células T reactivas contra APC que se han estimulado con péptidos sintéticos, proteínas nativas, extractos celulares, patógenos no viables, transducido con vectores retrovirales, infectado con vectores virales recombinantes, transfectado con ARN o ADN, etc; (c) puede usarse para el aislamiento tanto de células Th específicas de antígeno CD4+ como de CTL específicos de antígeno CD8+, y (d) permite el aislamiento selectivo de células T específicas de antígeno con funciones efectoras mediadas por citoquinas particulares; por ejemplo, de linfocitos tipo Th1, Th2 o Th3 específicos de antígeno.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se incluyen en la técnica especialista. Dichas técnicas se explican en detalle en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); y "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991).

Se conocen en la técnica métodos de separación de células y análisis de células y se describen en, por ejemplo, The Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes 1 a 4, (D. N. Weir, editor) y Flow Cytometry and Cell Sorting (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 1992).

Como se usa en este documento, un "compañero de unión específica" o "resto de captura" se refiere a un miembro de una pareja de moléculas (un "pareja de unión específica") que interacciona por medio de interacciones no covalentes específicas que dependen de las estructuras tridimensionales de las moléculas implicadas. Un "resto marcador" es detectable, directa o indirectamente. Cuando el resto de captura es un anticuerpo, puede denominarse "anticuerpo de captura" o "anticuerpo de inmovilización". Los restos de captura son los que se unen tanto a la célula, directa o indirectamente, como al producto. Los restos marcadores son los que se unen al producto y puede marcarse directamente o indirectamente.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos, haptenos y fragmentos de anticuerpos y moléculas que sean equivalentes de anticuerpos en el sentido de que se unan específicamente a un epítopo en el antígeno producto. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales de cualquier isotipo (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM) o una porción de unión a antígeno de los mismos, incluyendo, pero sin limitación, fragmentos F(ab) y Fv tales como scFv, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos también pueden inmovilizarse, por ejemplo, sobre un polímero o una partícula.

Las expresiones "anticuerpo biespecífico" y "anticuerpos biespecíficos" también conocidos como anticuerpos bifuncionales, se refieren a anticuerpos que reconocen dos antígenos diferentes en virtud de poseer al menos un primer sitio de combinación con antígeno específico para un primer antígeno o hapteno y al menos un segundo sitio de combinación con antígeno específico para un segundo antígeno o hapteno. Dichos anticuerpos pueden producirse por métodos de ADN recombinante o incluir, pero sin limitación, anticuerpos químicamente por métodos conocidos en la técnica. Anticuerpos biespecíficos generados químicamente que se han reducido y reformado para conservar sus características bivalentes y anticuerpos que se han acoplado químicamente de modo que tienen al menos dos sitios de reconocimiento de antígeno para cada antígeno. Los anticuerpos biespecíficos incluyen todos los anticuerpos o conjugados de anticuerpos o formas poliméricas de anticuerpos que son capaces de reconocer dos antígenos diferentes. El resto marcador puede ser un anticuerpo antiproducto fluorocromado que puede incluir, pero sin limitación, anticuerpos conjugados con perlas magnéticas, conjugados con perlas coloidales, conjugados con FITC, Ficoeritrina, PerCP, AMCA, partículas fluorescentes o liposomas. Como alternativa, el resto marcador puede ser cualquier marcador adecuado incluyendo, pero sin limitación, los descritos en este documento. Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos que se han reducido y reformado para conservar sus características bivalentes y anticuerpos que se han acoplado químicamente de modo que tienen varios sitios de reconocimiento antigénico para cada antígeno.

Como se usa en este documento, la expresión "población de células efectoras" se refiere a una población celular que comprende al menos una célula T. Puede obtenerse una población de células efectoras a partir de una población celular de partida a partir de la que se enriquecen células T específicas de antígeno.

Las expresiones "célula" y "células" y "población celular", usadas de forma intercambiable se refieren a una o más células de mamífero. Las expresiones incluyen la progenie de una célula o población celular. Los especialistas en la técnica reconocerán que el término "células" incluye la progenie de una sola célula y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o dotación de ADN total) a la célula parental original debido a mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado.

Las expresiones "linfocito T", "célula T", "células T" y "población de células T", usadas de forma intercambiable, se refieren a una célula o células que presentan en su superficie una o más características antigénicas de células T, tales como, por ejemplo, CD2 y CD3. El término incluye la progenie de una célula T o población de célula T. Un "linfocito T" o "célula T" es una célula que expresa CD3 en su superficie celular y un receptor de antígeno de célula T (TCR) capaz de reconocer un antígeno cuando se presenta en la superficie de células autólogas o cualquier matriz presentadora de antígenos, junto con una o más moléculas de MHC, una o más moléculas de MHC no clásicas. La expresión "células T", como se usa en este documento, indica cualquier célula T conocida en la técnica, por ejemplo linfocitos que son fenotípicamente CD3^{+}, es decir que expresan CD3 en la superficie celular, detectada típicamente usando un anticuerpo monoclonal anti-CD3 en combinación con una técnica de marcaje adecuada. Las células T enriquecidas mediante los métodos de esta invención son generalmente CD3^{+}. Las células T enriquecidas por los métodos de esta invención también son generalmente, aunque no necesariamente, positivas para CD4, CD8 o ambos.

La expresión "sustancialmente enriquecida", como se usa en este documento, indica que una población celular está al menos aproximadamente 50 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 500 veces y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 5.000 veces o más enriquecida a partir de una población celular mixta original que comprende la población celular deseada.

La expresión "matriz presentadora de antígeno", como se usa en este documento, se refiere a una molécula o moléculas que pueden presentar antígenos de tal forma que el antígeno pueda unirse por un receptor de antígeno de célula T en la superficie de una célula T. La matriz presentadora de antígeno puede estar en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC), en una preparación de vesículas de APC, o puede estar en forma de una matriz sintética en una perla o una placa. La expresión "célula presentadora de antígeno", como se usa en este documento, se refiere a cualquier célula que presente en su superficie un antígeno junto con MHC o una porción del mismo, o una o más moléculas de MHC no clásicas o una porción de las mismas.

Los términos "autógeno", "autólogo" o "propio" como se usan en este documento, indican el origen de una célula. Por lo tanto, una célula es autógena si la célula se obtuvo de un individuo (el "donante") o un individuo genéticamente idéntico y se va a volver a administrar al individuo. Una célula autógena también puede se la progenie de una célula autógena. El término también indica que células de diferentes tipos celulares se obtienen del mismo donante o de donantes genéticamente idénticos. Por lo tanto, se dice que una célula efectora y una célula presentadora de antígeno son autógenas si proceden del mismo donante o de un individuo genéticamente idéntico al donante, y si son progenie de células obtenidas del mismo donante o de un individuo genéticamente idéntico al donante.

De forma similar, el término "alogénica" o "no propia", como se usa en este documento, indica el origen de una célula. Por lo tanto, una célula o la progenie de la misma es alogénica si la célula se obtuvo de un individuo no genéticamente idéntico al receptor al que se administra. El término se refiere a la no identidad en moléculas de MHC expresadas. El término también indica que se obtienen células de diferentes tipos celulares a partir de donantes genéticamente no idénticos, o si son progenie de células obtenidas de donantes genéticamente no idénticos. Por ejemplo, se dice que una APC es alogénica respecto a una célula efectora si proceden de donantes genéticamente no idénticos.

Una "enfermedad o afección relacionada con una población de células T específicas de antígeno" es una que puede estar relacionada con una población de células T específicas de antígeno o con la ausencia de números adecuados de las mismas e incluye, por ejemplo, enfermedades autoinmunes en las que las células T específicas de antígeno son principalmente responsables de la patogenia de la enfermedad; cánceres en los que el crecimiento de células cancerosas no está adecuadamente controlado por células T citotóxicas específicas de tumores; enfermedades víricas en las que las células infectadas por virus no se lisan por células T citotóxicas; alergias, en las que células T específicas de alergenos median efectos no deseados; inmunodeficiencias, en las que están presentes cantidades inadecuadas de células T en un individuo debido a infección (tal como VIH) o de forma congénita (tal como síndrome de DiGeorge). También es una en la que las células T específicas de antígeno modulan o regulan la actividad de otra célula o población celular que es principalmente responsable de una patología; también es una en la que la presencia de una población de células T específicas de antígeno no es la causa primaria de la enfermedad, pero desempeña un papel clave en la patogenia de la enfermedad; y también es una en la que una población de células T específicas de antígeno media un rechazo no deseado de un antígeno extraño.

Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja humanos, animales de deporte y mascotas.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de células T específicas en antígeno es una cantidad que es suficiente para diagnosticar, paliar, mejorar, estabilizar, revertir, ralentizar o retrasar la progresión de la patología.

Como se usa en este documento, el "tratamiento" es una estrategia para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, alivio de síntomas, disminución del grado de enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir que no empeora), evitar la propagación de la enfermedad (es decir, metástasis), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación de la patología y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. El "tratamiento", también puede referirse a prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

"Paliar" una enfermedad significa que el grado y/o las manifestaciones clínicas indeseables de una patología se reducen y/o el curso de tiempo de la progresión se ralentiza o alarga, en comparación con no administrar poblaciones de células T enriquecidas de la presente invención.

La presente invención proporciona métodos para obtener un población celular enriquecida en células T específicas de antígeno que secreten un producto, donde el producto se secreta como resultado de estimulación antigénica. Los métodos implican generalmente obtener una población mixta de células que comprenden células T; exponer la población de células al menos un antígeno en condiciones eficaces para generar una estimulación específica de antígeno de al menos una célula T; modificar la superficie de dicha población mixta para que contenga unida a la misma un compañero de unión específico para el producto; permitir la expresión de al menos un producto por la células T estimuladas, donde el producto se secreta en respuesta a la estimulación; permitir la unión del producto a un resto de captura acoplado en la superficie de la célula para formar un complejo de resto de captura unido a célula-producto, marcando por lo tanto las células; y separar las células T estimuladas de acuerdo con el grado en que estén marcadas con dicho producto.

Por supuesto, la modificación de la superficie celular con un compañero de unión específica puede realizarse antes, durante o después de la estimulación antigénica.

Matrices presentadoras de antígeno y poblaciones de células efectoras

La presente invención proporciona métodos para obtener una población celular enriquecida en células T específicas de antígeno que secreten un producto en respuesta a la estimulación antigénica. Los métodos comprenden obtener una población mixta de células (es decir, una "población de células efectoras") y exponer la población celular a al menos un antígeno. La población celular mixta puede obtenerse por cualquier método conocido en la técnica y preferiblemente está enriquecida para células T. La exposición a antígeno puede conseguirse usando matrices presentadoras de antígeno que pueden estar en la superficie de células presentadoras de antígeno (APC). Las matrices presentadoras de antígeno y células efectoras pueden obtenerse a partir de una diversidad de fuentes. La población mixta de células puede estimularse por antígeno in vitro o in vivo o modificarse de cualquiera de una diversidad de modos, por ejemplo, modificarse químicamente o genéticamente.

Matrices presentadoras de antígeno

Las poblaciones de células T que sometan a los métodos de la presente invención se exponen al menos un antígeno en condiciones eficaces para generar una estimulación específica de antígeno. Se dice que una célula T que se estimula mediante el al menos un antígeno es específica de antígeno, es decir, presenta en su superficie celular un receptor de antígeno que reconoce específicamente y se une a un antígeno asociado con una molécula capaz de presentar antígeno, tal como una molécula de MHC clásica o no clásica o una porción de la misma, o una matriz presentadora de antígeno, por ejemplo, una matriz presentadora de antígeno sintética o una que esté presente en la superficie de una APC.

La molécula presentadora de antígeno puede ser una molécula de MHC que puede ser clase I o clase II o una molécula de MHC no clásica tal como CD1; un epítopo de MHC; una proteína de fusión que comprende un epítopo MHC; o un epítopo MHC sintético. La naturaleza de la molécula presentadora de antígeno no es crítica siempre que sea capaz de presentar antígenos a una célula efectora. Se conocen en la técnica métodos para preparar epitopos de MHC.

Las matrices presentadoras de antígeno incluyen aquellas en la superficie de una APC, así como matrices presentadoras de antígeno sintéticas. Las APC adecuadas para el uso en la presente invención son capaces de presentar un péptido o proteína exógena o un antígeno endógeno a células T junto con un molécula presentadora de antígeno, tal como una molécula de MHC. Las APC incluyen, pero sin limitación, macrófagos, células dendríticas, células B activadas por CD40, células B específicas de antígeno, células tumorales, células infectadas por virus y células modificadas genéticamente.

Pueden obtenerse APC de una diversidad de fuentes, incluyendo, pero sin limitación células mononucleares de sangre periférica (PBMC), sangre completa o fracciones de la misma que contienen poblaciones mixtas, células de bazo, células de médula ósea, linfocitos infiltrantes de tumores, células obtenidas por leucoféresis, ganglios linfáticos, por ejemplo, ganglios linfáticos de drenaje de un tumor. Los donantes adecuados incluyen un donante inmunizado, un donantes no inmunizado (sin tratamiento previo), donantes tratados o sin tratar. Un donante "tratado" es uno que se ha expuesto a uno o más modificadores biológicos. Un donante "sin tratar" no se ha expuesto a uno o más modificadores biológicos. También se pueden tratarse APC in vitro con uno o más modificadores biológicos.

Generalmente las APC están vivas pero también pueden estar irradiadas, tratadas con mitomicina, atenuadas o fijadas químicamente. Además, las APC no tienen que ser células completas. En su lugar pueden usarse preparaciones de vesículas de APC.

Las APC pueden modificarse genéticamente, es decir, transfectarse con una construcción polinucleotídica recombinante de modo que expresen un polipéptido o una molécula de ARN que normalmente no expresarían o que normalmente expresarían a niveles inferiores. Los ejemplos de polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, los que codifican una molécula de MHC; una molécula coestimuladora tal como B7; o un antígeno. Por ejemplo, la expresión de un polinucleótido que codifica una molécula de MHC bajo el control transcripcional de un promotor fuerte tal como el promotor de CMV puede dar como resultado un alto nivel de expresión de la molécula de MHC en la superficie celular, aumentando por lo tanto la densidad de presentación de antígeno. Como alternativa, una APC puede transfectarse con una construcción polinucleotídica que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno bajo control transcripcional de un promotor fuerte, tal como el promotor de CMV de modo que el antígeno se expresa en la superficie de la célula junto con una molécula de MHC.

La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido está unida operativamente a secuencias de control para transcripción y traducción. Una secuencia de control está "unida operativamente" a una secuencia codificante si la secuencia de control regula la transcripción o traducción. Cualquier método en la técnica puede usarse para la transformación o inserción de un polinucleótido exógeno en una APC, por ejemplo, lipofección, transducción, infección o electroporación usando ADN purificado, vectores virales o virus de ADN o ARN. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora.

Las células que normalmente no funcionan in vivo en mamíferos como APC pueden modificarse para funcionar como APC. Una amplia diversidad de células pueden funcionar como APC cuando se modifican apropiadamente. Son ejemplos de dichas células células de insecto, por ejemplo Drosophila o Spodoptera; células de acogida, tales como la línea celular humana T2, que lleva una mutación en su ruta de presentación de antígeno que restringe la asociación de péptidos endógenos con moléculas de MHC clase I de superficie celular. Zweerink et al. (1993) J. Immunol. 150: 1763-1771. Por ejemplo, pueden introducirse en estas células vectores de expresión que dirigen la síntesis de uno o más polipéptidos presentadores de antígeno, tales como moléculas de MHC y, opcionalmente, moléculas accesorias tales como B7 para lograr la expresión en la superficie de estas moléculas de presentación de antígenos en células y, opcionalmente, moléculas accesorias o porciones funcionales de las mismas. Como alternativa, pueden usarse polipéptidos presentadores de antígeno y moléculas accesorias que pueden insertarse por sí mismos en la membrana celular. Por ejemplo, los polipéptidos modificados con glicosil-fosfatidilinositol (GPI) pueden insertarse por sí mismo en las membranas de células. Medof et al. J. Exp. Med. 160: 1558-1578; y Huang et al. Immunity 1: 607-613. Las moléculas accesorias incluyen, pero sin limitación, anticuerpos coestimuladores tales como anticuerpos específicos para CD28, CD80 o CD86; moléculas coestimuladoras incluyendo, pero sin limitación, B7.1 y B7.2; moléculas de adhesión tales como ICAM-1 y LFA-3; y moléculas de supervivencia tales como ligando Fas y CD70. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO 97/46256.

Como alternativa, puede usarse una matriz presentadora de antígeno sintética para presentar un antígeno a células efectoras. Una matriz sintética puede incluir una molécula presentadora de antígeno, preferiblemente una molécula de MHC Clase I o MHC Clase II, inmovilizada en un soporte sólido, por ejemplo, perlas o placas. Pueden estar presentes moléculas accesorias que pueden estar coinmovilizadas o solubles, incluyendo las moléculas, pero sin limitación, anticuerpos coestimuladores tales como anticuerpos específicos para CD28, CD80 o CD86; moléculas coestimuladoras incluyendo, pero sin limitación, B7.1 y B7.2; moléculas de adhesión tales como ICAM-1 y LFA-3; y moléculas de supervivencia tales como ligando Fas y CD70. También pueden usarse porciones de moléculas accesorias siempre que se mantenga su función. Los soportes sólidos incluyen metales o plásticos, materiales porosos, microperlas, placas de microtitulación, glóbulos rojos y liposomas. Véase, por ejemplo, la publicación PCT Nº WO 97/46256 y WO 97/35035.

Se conocen en la técnica métodos para determinar si una matriz presentadora de antígeno, ya esté en una superficie celular o en un soporte sintético, es capaz de presentar antígenos a célula efectora e incluyen, por ejemplo, captación de ^{3}H-timidina por células efectoras, producción de citoquinas por células efectoras y ensayos de liberación citolítica de ^{51}Cr.

Poblaciones de células efectoras

Pueden aislarse células T específicas de antígeno a partir de una población de células efectoras, es decir, una población de células hematopoyéticas, preferiblemente enriquecida para células T. La población de células efectoras es una población de partida a partir de la que se aíslan células T específicas de antígeno.

Una población de células efectoras adecuada para usar en la presente invención puede ser autógena o alogénica, preferiblemente autógena. Cuando las células efectoras son alogénicas, preferiblemente se reduce el contenido de células alorreactivas de las células antes del uso. Esto puede conseguirse por cualquier medio conocido, incluyendo, por ejemplo, mezcla de las células efectoras alogénicas y una población de células receptoras e incubación de las mismas durante un tiempo adecuado, reduciendo después las células CD69^{+} o inactivando células alorreactivas o induciendo anergia en la población de células alorreactivas.

La población de células efectoras puede comprender células no separadas, es decir, una población mixta, por ejemplo, una población de PBMC, sangre completa y similares. La población de células efectoras puede manipularse por selección positiva basándose en la expresión de marcadores de superficie celular, selección negativa basándose en la expresión de marcadores de superficie celular, estimulación con uno o más antígenos in vitro o in vivo, tratamiento con uno o más modificadores biológicos in vitro o in vivo, estimulación sustractiva con uno o más antígenos o modificadores biológicos o una combinación de cualquiera o todas estos.

Pueden obtenerse células efectoras a partir de una diversidad de fuentes incluyendo, pero sin limitación, PBMC, sangre completa o fracciones de la misma que contienen poblaciones mixtas, células de bazo, células de médula ósea, linfocitos infiltrantes de tumores, células obtenidas por leucoféresis, tejido de biopsia, ganglios linfáticos, por ejemplo, ganglios linfáticos de drenaje de un tumor. Los donantes adecuados incluyen un donante inmunizado, un donante no inmunizado (sin tratamiento previo), donantes tratados o sin tratar. Un donante "tratado" es uno que se ha expuesto a uno o más modificadores biológicos. Un donante "sin tratar" no se ha expuesto a uno o más modificadores
biológicos.

Se conocen bien métodos de extracción y cultivo de células efectoras. Por ejemplo, pueden obtenerse células efectoras por leucoféresis, aféresis mecánica usando un separador de células de flujo continuo. Por ejemplo, pueden aislarse linfocitos y monocitos a partir de la capa leucoplaquetaria por cualquier método conocido, incluyendo, pero sin limitación, separación sobre gradiente de Ficoll-Hypaque^{TM} separación sobre un gradiente de Percoll o elutriación. La concentración de Ficoll-Hypaque^{TM} puede ajustarse para obtener la población deseada, por ejemplo, una población enriquecida en células T. Se conocen y pueden usarse otros métodos basados en columnas de afinidad específica de células. Estos incluyen, por ejemplo, separación de células activadas por fluorescencia (FACS), adhesión de células, separación con perlas magnéticas y similares. Los métodos basados en afinidad pueden utilizar anticuerpos o porciones de los mismos que sean específicos para marcadores de superficie celular y que estén disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD). Los métodos basados en afinidad pueden utilizar como alternativa ligandos o análogos de ligandos de receptores de superficie celular.

La población de células efectoras puede someterse a uno o más protocolos de separación basándose en la expresión de marcadores de superficie celular. Por ejemplo, las células pueden someterse a selección positiva en base a la expresión de uno o más polipéptidos de superficie celular, incluyendo pero sin limitación, marcadores de superficie celular de "grupo de diferenciación" tales como CD2, CD3, CD4, CD8, TCR, CD45, CD45RO, CD45RA, CD11b, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD40L; otros marcadores asociados con activación de linfocitos tales como el producto del gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), molécula de señalización de activación del linfocito (SLAM), T1/ST2; receptores de quimioquinas tales como CCR3, CCR4, CXCR3, CCR5; receptores buscadores tales como CD26L, CD44, CLA, CD146, \alpha4\beta7, \alphaE\beta7; marcadores de activación tales como CD25, CD69 y OX40; y lipoglicanos presentados por CD1. La población de células efectoras puede someterse a selección negativa por reducción de células no T y/o conjuntos de células T particulares. Puede realizarse una selección negativa en base a la expresión en superficie celular de una diversidad de moléculas, incluyendo, pero sin limitación, marcadores de células B tales como CD19 y CD20; marcador de monocitos CD14; el marcador de células NK CD56.

La población de células efectoras puede manipularse por exposición, in vivo o in vitro a uno o más antígenos. Los antígenos incluyen, pero sin limitación, péptidos, proteínas; glicoproteínas; lípidos; glicolípidos; células; extractos celulares; extractos tisulares; microorganismos completos tales como protozoos, bacterias y virus. Los antígenos pueden ser sin modificar, es decir, usados en su estado nativo. Como alternativa, un antígeno puede modificarse por cualquier medio conocido, incluyendo, pero sin limitación, calentamiento, por ejemplo para desnaturalizar una proteína o inactivar un patógeno; modificación química para desnaturalizar una proteína o para entrecruzar dos moléculas antigénicas; glicosilación, modificación química con restos que incluyen, pero sin limitación polietilenglicol; y digestión enzimática. Si se usa más de un antígeno, la exposición puede ser simultánea o secuencial.

Las células efectoras pueden cultivarse en presencia de al menos un antígeno asociado con una afección a tratar. El antígeno puede ser un solo antígeno con múltiples determinantes antigénicos o puede ser una mezcla de antígenos. El antígeno puede ser un autoantígeno o un antígeno extraño, dependiendo de la afección a tratar. Los autoantígenos incluyen antígenos asociados con enfermedades autoinmunes y los asociados con células cancerosas. El antígeno puede ser una proteína, células, un tejido o un órgano diana. Si el antígeno es un autoantígeno, el autoantígeno puede ser parte de un órgano, por ejemplo, el cerebro o la glándula tiroidea y no tiene que estar purificado a partir del mismo. También pueden usarse autoantígenos purificados o mezclas de autoantígenos purificados.

El cocultivo de leucocitos de sangre periférica (PBL) o linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) con células tumorales autólogas se acompaña generalmente de estimulación con citoquinas. Sport et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 175-180; y Peyret et al. (1991) Chirurgie 177: 700-709.

Una población de células efectoras puede manipularse por exposición in vivo o in vitro a uno o más modificadores biológicos. Los modificadores biológicos adecuados incluyen, pero sin limitación, citoquinas tales como IL-2, IL-4, IL-10, TNF-\alpha, IL-12, IFN-\gamma, modificadores inespecíficos tales como fitohemaglutinina (PHA), ésteres de forbol tales como miristato acetato de forbol (PMA), concanavalina-A e ionomicina; anticuerpos específicos para marcadores de superficie celular tales como anti-CD2, anti-CD3, anti-receptor de IL-2, anti-CD28; quimioquinas, incluyendo, por ejemplo, linfotactina. Los modificadores biológicos pueden ser factores nativos obtenidos de fuentes naturales, factores producidos mediante tecnología de ADN recombinante, polipéptidos químicamente sintetizados u otras moléculas, o cualquier derivado de las mismas que tenga la actividad funcional del factor nativo. Si se usa más de un modificador biológico, la exposición puede ser simultánea o secuencial.

La presente invención proporciona composiciones que comprenden células T enriquecidas en células específicas de antígeno, enriquecidas de acuerdo con los métodos de la invención. Por "enriquecida" se entiende que una población celular está al menos aproximadamente 50 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 500 veces y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 5000 veces o más enriquecida a partir de una población celular mixta original que comprende la población celular deseada. La proporción de la población celular enriquecida que comprende las células específicas de antígeno deseadas puede variar sustancialmente, de menos del 10% hasta el 100% de células específicas de antígeno. El porcentaje que es específico de antígeno puede determinarse fácilmente, por ejemplo, mediante un ensayo de captación de ^{3}H-timidina en el que la población de células T se expone a una matriz presentadora de antígeno que presenta el antígeno o antígenos deseados.

Marcaje de células

Los métodos en este documento se basan en el marcaje de las células con un producto secretado por las células, donde el producto se secreta en respuesta a la estimulación antigénica. Para conseguir el marcaje, la superficie celular de una población celular se modifica de modo que un resto que se une específicamente a un producto, el "compañero de unión específica" se une a la superficie celular directamente o a través de un medio de anclaje (o un "resto de anclaje"), opcionalmente a través de un enlazador para formar un resto de captura. La población celular puede contener numerosos tipos de células y generalmente está constituida por una población mixta. Preferiblemente, la población celular es hematopoyética más preferiblemente, la población celular son células efectoras, más preferiblemente la población celular son células T o un subconjunto de las mismas. Pueden aislarse subconjuntos en virtud de marcadores de superficie celular, por ejemplo, CD45 para linfocitos, CD8 para células citotóxicas, etc.

Se conocen en la técnica productos secretados en respuesta a estimulación antigénica e incluyen, pero sin limitación, citoquinas, tales como IL-2, IL-4, IL-10, TNF-\alpha, TGF-\beta e IFN-\gamma.

Los compañeros de unión específica incluyen cualquier resto por el que exista una afinidad y una especificidad relativamente elevadas entre producto y compañero de unión y en el que la disociación del complejo de producto:compañero sea relativamente lenta, de modo que el complejo de producto:compañero se detecte durante la técnica de separación celular. Los compañeros de unión específica incluyen, pero sin limitación, sustratos o análogos de sustratos con los que se unirá un producto, péptidos, polisacáridos, esteroides, biotina, digitoxina, digitonina y derivados de los mismos. En una realización preferida, el compañero de unión específica es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo. La expresión "fragmento de unión a antígeno" incluye cualquier péptido que se une específicamente al producto. Típicamente, estos fragmentos incluyen fragmentos de inmunoglobulina tales como Fab, F(ab')_{2}, Fab', scFv (formas tanto monomérica como polimérica) y cadenas H y L aisladas. Un fragmento de unión a antígeno conserva la especificidad de la inmunoglobulina intacta, aunque pueden alterarse la avidez y/o la afinidad.

En la práctica de la invención, el resto de captura puede unirse a una membrana celular (o pared celular) mediante una diversidad de métodos. Los métodos adecuados incluyen, pero sin limitación, acoplamiento químico directo a grupos amino de los componentes proteicos, acoplamiento con tioles (formados después de la reducción de puentes disulfuro) de los componentes proteicos, acoplamiento indirecto a través de anticuerpos (incluyendo parejas de anticuerpos) o lectinas, anclaje en la bicapa lipídica por medio de un anclaje hidrófobo y unión a la superficie celular cargada negativamente por policationes.

En otras realizaciones de la invención, el resto de captura se introduce usando dos o más etapas, por ejemplo, por marcaje de las células con al menos un resto de anclaje que permite el acoplamiento del resto de captura con el resto de anclaje directamente, por ejemplo, mediante un complejo de biotina/avidina o indirectamente, a través de un resto o restos de enlace adecuados.

Los restos de anclaje adecuados incluyen moléculas lipófilas tales como ácidos grasos. Como alternativa, también pueden usarse anticuerpos u otros agentes de unión específica a marcadores de superficie celular tales como los antígenos o glicoproteínas de MHC.

El "resto de captura" puede acoplarse al resto de anclaje a través de un agente de enlace y también puede incluir un enlazador que multiplique el número de resto de captura disponibles y, por lo tanto, el potencial para la captura de producto, tales como polímeros ramificados incluyendo, por ejemplo, moléculas de dextrano modificado; polietilenglicol, propilenglicol, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona.

Se conocen en la técnica métodos para acoplamiento químico directo de anticuerpos a la superficie celular e incluyen, por ejemplo, acoplamiento usando anticuerpos activados con glutaraldehído o maleimida. Los métodos para acoplamiento químico usando procedimientos multietapa, incluyen, pero sin limitación, biotinilación, acoplamiento de trinitrofenol (TNP) o digoxigenina usando, por ejemplo, ésteres de succinimida de estos compuestos. La biotinilación puede conseguirse, por ejemplo, mediante el uso de D-biotinil-N-hidroxisuccinimida. Los grupos succinimida reaccionan eficazmente con grupos amino a valores de pH por encima de 7 y, preferiblemente entre pH 8,0 y aproximadamente pH 8,5. La biotinilación puede conseguirse, por ejemplo, por tratamiento de las células con ditiotreitol seguido de adición de biotina-maleimida.

El acoplamiento con las células también puede conseguirse usando anticuerpos contra antígenos de superficie celular ("marcadores"). Los anticuerpos dirigidos contra antígenos de superficie requieren generalmente en el intervalo de 0,1 a 1 \mug de anticuerpo por 10^{7} células. Sin embargo, este requerimiento variará ampliamente en respuesta a la afinidad del anticuerpo con el producto y deberá determinarse empíricamente. Dicha determinación está bien dentro de la habilidad de un especialista en la técnica. Por lo tanto, la cantidad apropiada de anticuerpo debe determinarse empíricamente y está dentro de la habilidad de un especialista en la técnica. Esto permite el acoplamiento con células específicas en la expresión de marcadores específicos de tipo celular. Por ejemplo, pueden marcarse específicamente clases de células tales como células T o subconjuntos de las mismas. Como un resto de captura, puede usarse un anticuerpo biespecífico que tiene un sitio de reconocimiento de antígeno para la célula o un resto de anclaje colocado sobre el mismo y el producto.

Un resto de captura, particularmente anticuerpos de captura debería seleccionarse basándose en la cantidad de producto secretado. Por ejemplo, para las células que secretan solamente unas pocas moléculas, un anticuerpo de alta afinidad capturará la mayoría de las moléculas secretadas. Como alternativa, en el caso en el que la célula secrete muchas moléculas durante el tiempo de incubación, puede preferirse un anticuerpo de menor afinidad para evitar una saturación demasiado temprana de la matriz de inmovilización. La determinación de afinidades adecuadas para el nivel de proteínas secretadas se determina empíricamente y está dentro de la habilidad de un especialista en la técnica.

Células que llevan grandes cantidades de ácido N-acetilneuramínico en su superficie como constituyente de sus lipopolisacáridos llevan una carga negativa a valores de pH fisiológicos. El acoplamiento de restos de captura puede ser mediante interacciones de carga. Por ejemplo, los restos que llevan policationes se unen a células cargadas negativamente. Se conocen en la técnica policationes e incluyen, por ejemplo, polilisina y quitosana. La quitosana es un polímero que consiste en grupos D-glucosamina unidos entre sí por enlaces \alpha-(1-4) glucósido.

Otro método de acoplamiento de compañeros de unión (que puede comprender uno o más restos de captura) a las células es por acoplamiento con los polisacáridos de la superficie celular. Se conocen en la técnicas sustancias que se unen con polisacáridos e incluyen, por ejemplo, lectinas, incluyendo concanavalina A, lectinas de Solanum tuberosum, Aleuria aurantia, Datura stramonium, Galanthus nivalis, Helix pomatia, Lens culínaris y otras lectinas conocidas suministradas por varias compañías, incluyendo, por ejemplo, Sigma Chemical Company y Aldrich Chemical Company.

En algunas realizaciones de la invención, el compañero de unión a productos se acopla a la célula por anclaje hidrófobo a la membrana celular. Se conocen en la técnica grupos hidrófobos adecuados que interaccionarán con la bicapa lipídica de la membrana e incluyen, pero sin limitación, ácidos grasos y detergentes no iónicos (incluyendo, por ejemplo, Tween-80). Una desventaja de la unión del resto de captura a la célula mediante la inserción de un anclaje hidrófobo es que la velocidad de integración del resto hidrófobo en la célula es lenta. Por lo tanto, con frecuencia son necesarias altas concentraciones del resto con el anclaje hidrófobo. Con frecuencia esta última situación no es económica cuando el resto de captura es una sustancia relativamente limitada o cara, por ejemplo, un anticuerpo.

El bajo rendimiento de moléculas hidrófobas que se embeben por sí mismas en la membrana es relevante sólo cuando estas moléculas están disponibles en cantidades relativamente limitadas. Este problema puede superarse mediante el uso de un sistema de formación de enlaces que incluye un compañero de anclaje y un compañero que contiene el resto de captura, en el que uno de los compañeros es de mayor disponibilidad y en el que las dos partes del sistema de formación de enlaces tiene un alto grado de especificidad y afinidad entre sí. Por ejemplo, en una realización, se une avidina o estreptavidina a la superficie celular mediante un anclaje hidrófobo, mientras que el compañero con el resto de captura de producto son anticuerpos anti-producto biotinilados. En otra realización, la superficie celular se marca con digoxigenina seguido de conjugados de fragmentos de anticuerpos anti-digoxigenina y anticuerpos anti-producto. Esta estrategia puede usarse con otras parejas de moléculas capaces de formar un enlace, incluyendo, por ejemplo, hapteno con anticuerpos antihapteno, NTA con restos de polihistidina o lectinas con polisacáridos. Una realización preferida es una permite la "amplificación" del sistema por aumento del número de restos de captura por resto de anclaje.

En una realización ilustrativa, se une un dextrano ramificado a ácido palmítico, proporcionando de este modo una multiplicidad de sitios de unión disponibles. El dextrano se acopla a su vez a biotina y se trata con un anticuerpo conjugado con avidina específico para el producto.

Se contempla por supuesto entre las realizaciones de la invención que pueden usarse sistemas de formación de enlaces entre el resto de anclaje y el resto de captura cuando el resto de anclaje se acopla de cualquier modo a la superficie celular. Por tanto, por ejemplo, un resto enlazador de avidina (o estreptavidina) biotina puede unir un resto de anclaje de anticuerpo con un resto de captura. Los sistemas de anticuerpos biespecíficos también pueden actuar como restos enlazadores.

Para analizar y, si se desea, seleccionar células que tengan la capacidad de secretar el producto, se incuban células modificadas como anteriormente para que contengan el resto de captura en condiciones que permitan la producción y secreción del producto en una cantidad suficiente para permitir la unión a y la detección de las células que contengan el producto capturado. Estas condiciones son conocidas para los especialistas en la técnica e incluyen, entre otros, temperatura apropiada, pH y concentraciones de sales, factores de crecimiento y sustratos en el medio de incubación, así como las concentraciones apropiadas de gas en la fase gaseosa. Cuando es deseable distinguir entre células altas y bajas productoras, el tiempo de incubación es tal que la secreción de producto por las células sea todavía una fase lineal. Las condiciones apropiadas pueden determinarse empíricamente y dicha determinación está dentro de la habilidad de un especialista en la técnica.

Además, puede modificarse la secreción celular, es decir, regularse positivamente, inducirse o reducirse usando modificador biológico. Los modificadores biológicos pueden añadirse en cualquier momento pero preferiblemente se añaden al medio de incubación. Como alternativa, las células puede pretratarse con estos agentes o células antes de la etapa de incubación. Los modificadores biológicos adecuados incluyen, pero sin limitación, moléculas y otras células. Las moléculas adecuadas incluyen, pero sin limitación, fármacos, citoquinas, moléculas pequeñas, hormonas, combinaciones de interleuquinas, lectinas y otros agentes estimulantes, por ejemplo, PMA, LPS, anticuerpos biespecíficos y otros agentes que modifican las funciones celulares o la expresión de proteína.

Las células adecuadas incluyen, pero sin limitación, interacciones directas célula-célula tales como entre una célula tumoral y T e interacciones indirectas célula-célula tales como las inducidas por la proximidad de otras células que secretan un modificador biológico. Las células adecuadas incluyen, pero sin limitación, células sanguíneas, células de médula ósea periférica y diversas líneas celulares.

Las condiciones de incubación también son tales que el producto esencialmente no se captura o se captura en mucho menor grado por otra célula, para distinguir células no productoras de células productoras de producto, o altas productoras de bajas productoras. Generalmente, el tiempo de incubación es de entre cinco minutos y diez horas y, más habitualmente, de entre una y cinco horas. El medio de incubación puede incluir opcionalmente una sustancia que ralentice la difusión del producto desde la célula productora. Se conocen en la técnica sustancias que inhiben la difusión de producto en medios líquidos y que no son tóxicas para las células e incluyen una diversidad de sustancias que gelifican parcialmente o completamente, incluyendo, por ejemplo, alginato, agarosa de bajo punto de fusión y gelatina. Variando la viscosidad o permeabilidad del medio, puede modularse la captura local mediante una célula productora de productos de diferente tamaño. La exclusión por tamaño de peso molecular del medio puede ajustarse para optimizar la reacción. La composición óptima del medio puede determinarse empíricamente y está influida por la concentración celular, el nivel de secreción y el peso molecular del producto y la afinidad de los restos de captura para el producto. Dichas determinaciones están dentro de la habilidad de un especialista en la técnica.

Preferiblemente, los geles se solubilizan después de la incubación para permitir el aislamiento de las células o grupos de células a partir de los medios mediante técnicas de separación celular. Por lo tanto, por ejemplo, los geles pueden unirse mediante enlaces disulfuro que pueden disociarse mediante agentes reductores de sulfhidrilo tales \beta-mercaptoetanol o ditiotreitol, o los geles pueden contener entrecruzantes fónicos incluyendo, por ejemplo, iones de calcio, que se solubilizan mediante la adición de un agente quelante tal como EDTA.

Al final de la fase de secreción las células habitualmente se refrigeran para evitar una secreción adicional, y la matriz de gel (si existe) se solubiliza. Por supuesto, este orden puede invertirse. Puesto que la protección terminal puede tener lugar después de que se añada el resto de captura debido a entrecruzamiento, puede añadirse una etapa de incubación para disminuir la protección terminal en este punto. Las células pueden incubarse por ejemplo en citochalasina A o B o cualquier otra sustancia adecuada que evite la protección terminal. Las células que contienen el producto inmovilizado se marcan después con un resto marcador. El marcaje puede realizarse por cualquier método conocido por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos anti-producto para marcar directa o indirectamente las células que contienen el producto. Los marcadores usados son los que son adecuados para el uso en sistemas en los que las células se van a analizar o separar basándose en la unión del resto marcador al
producto.

En otras realizaciones, pueden detectarse restos de captura que no contienen producto capturado. Esto permite, por ejemplo, el aislamiento de células que secreten grandes cantidades por empleo de un método de separación negativa, es decir, detección de células que no estén altamente saturadas con producto. Las células pueden marcarse con otras sustancias de marcaje que reconozcan, por ejemplo, marcadores de superficie celular, tipo celular, parámetros celulares tales como contenido de ADN, estado celular o número de restos de captura.

La enumeración de restos de captura reales puede ser importante para compensar cantidades variables de estas moléculas debido a, por ejemplo, diferentes potenciales de conjugación de las células. Puede ser especialmente importante para el aislamiento de células poco frecuentes excluir células con una capacidad disminuida o aumentada para unirse al sistema de captura de producto, incluyendo los restos de anclaje y de captura. Como alternativa, las reacciones pueden desarrollarse simultáneamente en una "reacción de una etapa".

Análisis celular y separación de células

El análisis de la población celular y la separación de células basada en la presencia del marcador puede conseguirse por varios procedimientos conocidos en la técnica. Las células pueden analizarse o separarse, por ejemplo, mediante citometría de flujo o FACS. Estas técnicas permiten el análisis y la separación de acuerdo con uno o más parámetros de las células. Habitualmente pueden analizarse uno o múltiples parámetros de secreción simultáneamente en combinación con otros parámetros medibles de la célula incluyendo, pero sin limitación, tipo celular, marcadores de superficie celular, contenido de ADN, etc. Los datos pueden analizarse y las células separarse usando cualquier fórmula o combinación de los parámetros medidos. Se conocen en la técnica métodos de separación de células y análisis de células y se describen, por ejemplo, en The Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes 1 a 4 (D. N. Weir, editor); Flow Cytometry Cell Sorting (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 1992); y Cell Separation Methods and Applications (D. Recktenwald y A. Radbruch, eds. 1997) Marcel Dekker, Inc. N. Y. Las células también pueden analizarse usando técnicas de microscopía que incluyen, por ejemplo, microscopía de barrido láser, microscopia de fluorescencia; también pueden usarse técnicas tales como estas en combinación con sistemas de análisis por imagen. Otros métodos para separación de células incluyen, por ejemplo, selección y separación usando técnicas de afinidad, incluyendo las técnicas que usan soportes sólidos tales como placas, perlas y columnas.

Algunos métodos para separación de células utilizan separaciones magnéticas y algunos de estos métodos utilizan perlas magnéticas. Están disponibles diferentes perlas magnéticas a partir de varias fuentes, incluyendo por ejemplo, Dynal (Noruega), Advanced Magnetics (Cambridge, MA, Estados Unidos), Immuncon (Philadelphia, Estados Unidos), Immunotec (Marseilles, Francia) y Miltenyi Biotec GmbH (Alemania).

Los métodos de marcaje magnético preferidos incluyen partículas superparamagnéticas coloidales en un intervalo de tamaño de 5 a 200 nm, preferiblemente en un tamaño de 10 a 100 nm. Estas partículas magnéticas permiten un marcaje magnético cuantitativo de células, por lo tanto, la cantidad de marcador magnético acoplado es proporcional a la cantidad de producto unido, y los métodos de separación magnéticas son sensibles a diferentes cantidades de secreción de producto. Se conocen en la técnica partículas coloidales con diversas especificidades y están disponibles, por ejemplo, a través de Miltenyi Biotec GmbH. El uso de liposomas fluorescentes o magnéticos inmunoespecíficos también puede usarse para el marcaje cuantitativo de producto capturado. En estos casos, los liposomas contienen material magnético y/o colorantes fluorescentes conjugados con anticuerpo en sus superficies y se usa la separación magnética para permitir una separación óptima entre células no productoras, bajas productoras y altas
productoras.

La separación magnética puede conseguirse con alta eficacia por combinación de una segunda fuerza con la fuerza magnética de atracción, provocando una separación basada en las diferentes intensidades de las dos fuerzas opuestas. Son fuerzas opuestas típicas, por ejemplo, fuerzas inducidas por fluidos magnéticos mezclados en el medio de separación en la cámara de separación magnética, gravedad y fuerzas de viscosidad inducidas por velocidad de flujo del medio respecto a la célula. Se usará cualquier método de separación magnética, preferiblemente métodos de separación magnética que permitan una separación cuantitativa. También se contempla que puedan combinarse diferentes métodos de separación, por ejemplo, la separación magnética de células puede combinarse con FACS para aumentar la calidad de la separación o para permitir la separación por múltiples parámetros.

Las técnicas preferidas incluyen separación magnética de alto gradiente (HGMS), un procedimiento para retener de forma selectiva materiales magnéticos en una cámara o columna dispuesta en un campo magnético. En una aplicación de esta técnica el producto se marca por unión del mismo a una partícula magnética. La unión es generalmente a través de la asociación del producto con un resto marcador que se conjuga con un recubrimiento sobre la partícula magnética que proporciona un grupo funcional para la conjugación. El producto capturado acoplado de este modo a un "marcador" magnético se suspende en un fluido que después se aplica a la cámara. En presencia de un gradiente magnético suministrado a través de la cámara, la célula diana marcada magnéticamente queda retenida en la cámara; si la cámara contiene una matriz, se asocia con la matriz. Las células que no tienen o que sólo tienen una baja cantidad de marcadores magnéticos pasan a través de la cámara.

Las células retenidas pueden eluirse después por modificación de la intensidad de, o por eliminación del campo magnético o por introducción de un fluido magnético. La selectividad por un producto capturado se suministra por el resto marcador conjugado directamente o indirectamente con la partícula magnética o mediante el uso de un anticuerpo primario y una partícula magnética que reconozca el anticuerpo primario. La cámara a través de la que se aplica el campo magnético se proporciona con frecuencia con una matriz de un material de susceptibilidad magnética adecuada para inducir un alto gradiente de campo magnético localmente en la cámara en volúmenes próximos a la superficie de la matriz. Esto permite la retención de partículas bastante débilmente magnetizadas. Se conocen en la técnica publicaciones que describen una diversidad de sistemas de HGMS e incluyen, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.452.773, Patente de Estados Unidos 4.230.685; Solicitud PCT WO 85/04330, Patente de Estados Unidos Nº 4.770.183 y documento PCT/EP89/01602; también se describen sistemas en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.411.863; 5.543.289; 5.385.707 y 5.693.539, que son de propiedad común y que por la presente se incorporan en este documento como referencia.

Además, en otras realizaciones los procesos incluyen el marcaje de las células que contienen el producto capturado por el resto de captura si existe. Otras realizaciones también pueden incluir analizar la población celular para detectar células marcadas si existen y, si se desea, separar las células marcadas si existen.

Métodos de diagnóstico para detectar células T específicas de antígeno

La presente invención proporciona además métodos de diagnóstico para detectar células T específicas de antígeno. Estos incluyen métodos para analizar una población de células enriquecida para células T para identificar o numerar células T específicas de antígeno, así como métodos de determinación de la distribución de células T específicas de antígeno que secretan un producto en respuesta a la estimulación antigénica.

Los métodos para analizar una población de células enriquecida en células T para identificar o enumerar células T específicas de antígeno que secretan y liberan una cantidad de producto respecto a otras células en la población, en los que el producto se secreta y se libera en respuesta a una estimulación antigénica, comprenden las etapas de marcar las células mediante los métodos de la presente invención; marcar las células con al menos un marcador adicional que no marque el producto capturado; y detectar la cantidad de marcador de producto respecto al marcador adicional. Dichos métodos son útiles, por ejemplo, en la determinación de la proporción de una población celular que sea específica para un antígeno dado. El método puede usarse para proporcionar información respecto al estado inmune de un individuo, incluyendo evaluar una respuesta inmune a alergenos, un tumor o virus, o evaluar la proporción de células en un individuo que son autorreactivas para detectar o controlar enfermedades autoinmunes.

Método de tratamiento usando células T específicas de antígeno enriquecidas

La presente invención proporciona métodos de tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con una población de células T específicas de antígeno, usando las células T enriquecidas de la invención.

Los métodos de tratamiento incluyen aquellos en los que una población de células T específicas de antígeno se identifica, se enriquece y se introduce en un individuo; aquellos en los que una población de células T específicas de antígeno se identifica, se enriquece y se expande in vitro antes de la introducción en un individuo; aquellos en los que una población de células T específicas de antígeno se identifica y se elimina de una población de células que se va introducir en un individuo; la modificación genética ex vivo previa a la administración; y la selección de células T específicas de antígeno seleccionadas de acuerdo con la expresión de citoquinas. Los ejemplos de células T específicas de antígeno seleccionadas de acuerdo con la expresión de citoquinas incluyen, pero sin limitación, células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma o TNF-\alpha (citotóxicas) para el tratamiento de cáncer, infecciones víricas (por ejemplo CMV, EBV) y bacterianas (por ejemplo, listeria, micobacterias); células T CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma para las mismas indicaciones y también para la supresión y/o contrarregulación de alergia o vacunación contra alergia, supresión de enfermedades autoinmunes asociadas con TH2 o vacunación contra estas enfermedades autoinmunes; células T CD4^{+} secretoras de IL-10 o TGF-beta para la supresión de enfermedades autoinmunes asociadas a TH1, pero también a TH2, o vacunación contra enfermedades autoinmunes (inducción de tolerancia); células T CD4^{+} secretoras de IL-4 para la supresión de enfermedades autoinmunes asociadas con TH1 o vacunación contra estas enfermedades autoinmunes; y células T CD4^{+} secretoras de IL-4 e IL-5 para el tratamiento de infecciones por helmintos.

Pueden usarse poblaciones de células T enriquecidas de acuerdo con los métodos de la presente invención para tratar una diversidad de trastornos. Entre ellos se incluye el cáncer. Pueden obtenerse células T específicas para un antígeno tumoral usando los métodos de la presente invención. Pueden obtenerse células tumorales a partir de un individuo y estas pueden cocultivarse in vitro con células T obtenidas del mismo individuo. Después del cocultivo de las células durante un tiempo adecuado, pueden enriquecerse células específicas de tumor de acuerdo con los métodos de la presente invención. Después, esta población enriquecida puede reintroducirse en el paciente. Se conocen en las técnicas métodos para inmunoterapia antitumoral usando células T autólogas. Véase, por ejemplo, el documento WO 97/05239.

Como alternativa, las células usadas en tratamientos de inmunoterapia antitumoral pueden ser alogénicas. Se han descrito en la técnica diversos modos de tratamiento del cáncer con células T alogénicas y pueden usarse en los métodos de la presente invención. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO 96/37208. Opcionalmente, pueden activarse células T alogénicas antes de la introducción en un individuo. La activación puede efectuarse por contacto con un modificador biológico, un anticuerpo dirigido contra un marcador de superficie celular o un ligando o análogo del mismo para un receptor de superficie celular.

Otro uso de poblaciones de células T enriquecidas de la presente invención es en la inmunomodulación, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos autoinmunes, trastornos inflamatorios, alergias e hipersensibilidades tales como hipersensibilidad de tipo retardado e hipersensibilidad de contacto. Las células T que son capaces de destruir o suprimir la actividad de células autorreactivas pueden enriquecerse in vitro, opcionalmente expandirse in vitro y después reintroducirse en un paciente. En el tratamiento de respuestas alérgicas, puede alterarse la proporción de células TH1 o TH2 o pueden enriquecerse células reactivas contra células específicas de alergeno e introducirse en un individuo.

También puede usarse la inducción de anergia de células T para tratar, mejorar o prevenir el rechazo de aloinjertos mejorando de este modo los resultados del trasplante de órganos y aumentando el intervalo de histotipos con el que puede hacerse histocompatible un paciente.

Las composiciones que comprenden poblaciones de células T enriquecidas pueden usarse adicionalmente como vacunas, para prevenir o reducir sustancialmente la probabilidad de la aparición de una patología tal como una infección vírica, trastorno autoinmune, respuesta alérgica, cáncer u otro trastorno o reducir la gravedad o la duración de la enfermedad si se infecta o sufre posteriormente la enfermedad.

Las composiciones de células pueden administrarse por cualquier vía conocida, incluyendo, pero sin limitación, por vía intravenosa, parenteral o local. En los métodos de tratamiento de la presente invención, se administran células T enriquecidas a un individuo. El número total de células, el número de dosis y el número de células por dosis dependerá de la afección que se trate. Generalmente, se administran de aproximadamente 10^{6} a 10^{11} células en un volumen que varía de aproximadamente 5 ml a 1 litro. Las células pueden administrarse en una sola dosis o en varias dosis a lo largo de intervalos de tiempo seleccionados. De las células que se administran, preferiblemente al menos aproximadamente el 10%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 20%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, son células T específicas de antígeno que secretan un producto.

Kits

Se contempla que los reactivos usados en la detección de células secretoras de productos deseados pueden envasarse en forma de kits por comodidad. Los kits contendrán, por ejemplo, opcionalmente uno o más materiales para el uso en la preparación de un medio de cultivo celular gelatinoso, el medio que se va a usar para la incubación celular para la producción del producto secretado deseado; un sistema de captura de producto compuesto por restos de anclaje y de captura; un resto marcador; e instrucciones para el uso de los reactivos. Todos los reactivos se envasarían en recipientes apropiados.

El kit también puede formularse para incluir lo siguiente. En este caso, todos los reactivos se colocan preferiblemente en un solo vial al que se añaden las células. Al menos un anticuerpo que es biespecífico para una estructura de superficie celular particular o un resto de anclaje y el producto. Al menos un resto marcador y, opcionalmente, modificadores biológicos.

Opcionalmente, el kit puede incluir un tampón fisiológicamente aceptable. Se conocen en la técnica dichos tampones e incluyen, pero sin limitación, PBS con y sin BSA, solución salina isotónica, medios de cultivo celular y cualquier medio especial requerido por el tipo celular particular. Pueden usarse tampones que reducen el marcaje cruzado y aumentan la concentración local de producto alrededor de las células. Los tampones pueden incluir agentes para aumentar la viscosidad o disminuir la permeabilidad. Se describen en este documento agentes adecuados. La viscosidad del medio puede reducirse antes del análisis por cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, disolución en tampón fisiológicamente aceptable, calor de disolución, EDTA y enzimas. En ausencia de medio añadido, las células ya suspendidas en un medio pueden añadirse directamente al vial. Las suspensiones de células adecuadas incluyen, pero sin limitación líneas celulares y muestras biológicas. Las muestras biológicas incluyen, pero sin limitación, sangre, orina y plasma.

Pueden añadirse estructuras adicionales para inmovilizar producto no unido para reducir la contaminación cruzada de células, reduciendo de este modo la difusión de productos lejos de las células productoras. Estos incluyen, pero sin limitación, anticuerpo anti-producto inmovilizado en elementos de gel, perlas, perlas magnéticas y polímeros.

También pueden añadirse modificares biológicos al tampón o medio para inducir una secreción específica.

También pueden estar presentes restos marcadores adicionales tales como anticuerpos (magnéticamente o fluorescentemente marcados) incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anti-marcador de superficie celular para identificar tipos celulares, yoduro de propidio para marcar células muertas y perlas magnéticas para marcar ciertos tipos celulares.

En esta realización, todos los materiales pueden ponerse en un solo recipiente tal como un vial y añadirse la muestra de células. Los contenidos se incuban para permitir la secreción de un producto y la posterior captura del producto y la unión del resto marcador al producto. Después, las células que tienen el producto secretado y unido pueden separarse y/o analizarse basándose en la presencia, ausencia o cantidad del producto capturado. La separación puede realizarse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, dilución simple, tisis de eritrocitos, etapa de centrifugación-lavado, separación magnética, FACS y separación en Ficoll. El análisis de las células puede realizarse por una diversidad de métodos, incluyendo, pero sin limitación, FAGS, análisis por imagen, marcaje citológico e inmunoensayo.

Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos y no para limitar el alcance de la invención. A la luz de la presente descripción, serán evidentes numerosas realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones para los especialistas en la técnica.

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Ejemplo 1

Se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en RPMI 1640 completo (Gibco BRL, Grand Island, NY) que contenía penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, glutamina 0,3 mg/ml, 2-mercaptoetanol 10 mM y suero humano tipo AB al 10% (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de células de 2 x 10^{6} células/ml. Se añadió péptido Ml- 58-66 de proteína de la matriz del virus influenza (GILGFVFTL; Neosystem, Strasbourg, Francia) a una concentración final de 1 \muM. Se cultivaron células de control sin péptido.

Se incubaron las células a 37ºC en una atmósfera que contenía CO_{2} al 7,5%. Después de 5 horas y 30 minutos, las células se recogieron por centrifugación. Las células se incubaron a una concentración celular de 5 x 10^{7} células/ml en RPMI 1640 completo con anticuerpo monoclonal (mAb) anti-interferón gamma humano (IFN-\gamma) 4SB3 conjugado con mAb anti-CD45 humano 5B1 (30 \mug/ml) a 8ºC durante 7 minutos. Después, las células se diluyeron a 2 x 10^{6} células/ml con RPMI 1640 completo que contenía FCS al 10% y se incubaron durante 45 minutos a 37ºC. Después las células se sedimentaron y se incubaron con mAb anti-interferón gamma humano (IFN-\gamma) conjugado con ficoeritrina (PE) NIB42 (4 \mug/ml) y mAb anti-CD8 marcado con FITC en solución de PBS/BSA/EDTA con BSA al 0,05% y EDTA 2 mM, durante 10 minutos a 4ºC. Después las células se lavaron en PBS/BSA/EDTA y se marcaron con mAb de ratón anti-PE 80-5 conjugado con MicroBeads (Miltenyi Biotec) en PBS/BSA/EDTA durante 15 minutos a 8ºC. Las células se lavaron y se resuspendieron en 500 \mul de PBS/BSA/EDTA.

Se enriquecieron las células secretoras de IFN-\gamma con el sistema de separación magnética de células MACS. Se pipeteó una suspensión de células marcadas magnéticamente sobre una columna de separación MiniMACS en una unidad de separación MiniMACS, la suspensión celular se dejó pasar a su través y la columna se lavó con 3 x 500 \mul de tampón. El efluente se recogió como una fracción negativa (N1). La columna se retiró del separador y se colocó en un tubo adecuado. Se pipeteó 1 ml de tampón en la parte superior de la columna y las células marcadas magnéticamente se retiraron por lavado abundante usando un émbolo y se aplicaron a una segunda vuelta de separación
MiniMACS.

Las células originales (es decir, antes de la separación por MACS), fracciones de células negativas (de la primera así como de la segunda separación por MACS, denominadas N1 y N2, respectivamente) y la fracción de células positivas (P2) de la segunda separación por MACS se analizaron mediante citometría de flujo. Se usó el programa informático de búsqueda FACScan y CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se excluyeron las células muertas y residuos celulares de acuerdo con las propiedades de dispersión y la tinción con yoduro de propidio (PI;
0,3 \mug/ml).

Los resultados se muestran en las Figuras 1 A-P. Aunque las representaciones de puntos A-H muestran análisis de células de control cultivadas sin péptido, las representaciones I-P muestran análisis de células estimuladas con péptido. Las representaciones de puntos muestran las propiedades de dispersión de la población celular de partida (A e I) y las poblaciones celulares enriquecidas (C y K); y la fluorescencia PI frente a PE de la población celular de partida (B y J) y la población celular enriquecida (D y L).

Las representaciones de puntos E-H y M-P muestran tinción con anti-CD8-FITC frente a con anti-IFN-\gamma-PE de células seleccionadas en la fracción de células original (E y M), primera negativa (F y N), segunda negativa (G y O) y en la positiva final (H y P).

Aunque en la población de células de control, las células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} se enriquecieron hasta el 11% entre células vivas (Figura 1H), en la población celular estimulada con péptido, las células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} se enriquecieron hasta el 40% (Figura 1P). A partir de una población de partida de 3,5 x 10^{7} células de control, se aislaron aproximadamente 600 células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} en comparación con 4100 células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de una población de partida de 3,5 x 10^{7} células estimuladas con péptido.

Las células CD8- teñidas intensamente con anti-IFN-\gamma marcado con PE eran células B CD19^{+}, más probablemente células B específicas para un reactivo de separación, probablemente PE. Estas células se enriquecieron en la misma medida que las células de control en comparación con células estimuladas con péptido.

Además, las células CD8^{-} débilmente teñidas con anti-IFN-\gamma marcado con PE (como las células CD8^{+} IFN-\gamma^{+}) se enriquecían en la misma medida que las células de control en comparación con células estimuladas con péptido. Dichas células se tiñen parcialmente para CD4 y CD56 y por lo tanto más probablemente son células T auxiliares o células NK que secretan IFN-\gamma.

Por lo tanto existe un nivel basal de secreción de IFN-\gamma por células T auxiliares (CD4+), células T citotóxicas (CD8^{+}) y células NK (CD56^{+}) sin estimulación específica de antígeno intencionada in vitro que refleja muy probablemente la secreción de IFN-\gamma inducida ya in vivo en respuestas inmunes en curso en el momento de la toma de muestra de sangre.

Sin embargo, las células CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma^{+} inducidas por estimulación con el péptido de influenza restringido por HLA clase I MI 58-66 se enriquecían significativamente por encima de este nivel de fondo; por lo tanto, la mayoría de las células CD8+ IFN-\gamma^{+} enriquecidas a partir de células estimuladas con péptido son células T específicas de péptido. La especificidad de células enriquecidas se confirmó adicionalmente por tinción para determinar la presencia de V\beta17 TCR, que es un segmento de receptor de célula T (TCR) conservado en células T citotóxicas específicas de MI 58-66. Lehner et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 79-91; y Lalvani et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 859-865. Entre las células IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células estimuladas con péptido, pero no entre las células IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células de control, la mayoría expresa V\beta17^{+} TCR.

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Ejemplo 2

Se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en RPMI 1640 completo (Gibco BRL, Grand Island, NY) que contenía penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, glutamina 0,3 mg/ml, 2-ME 10 mM y suero humano de tipo AB al 10% (Sigma, St. Louis, MO) a 2 x 10^{6} células/ml. Se añadió péptido Ml 58-66 de la proteína de la matriz del virus influenza (GILGFVFTL; Neosystem, Strasbourg, Francia) a una concentración final de 1 \muM. Se cultivaron células de control sin péptido.

Después de 5 horas y 30 minutos las células se recogieron por centrifugación. Las células se incubaron a 5 x 10^{7} células/ml en RPMI 1640 completo con mAb anti-IFN-\gamma humano 4SB3 conjugado con mAb anti-CD45 humano 5B1 (30 \mug/ml) a 8ºC durante 7 minutos. Después, las células se diluyeron hasta 2 x 106 células/ml con RPMI 1640 completo que contenía FCS al 10% y se incubaron durante 45 minutos a 37ºC. Después, las células se precipitaron por centrifugación y se incubaron como mAb anti-IFN-\gamma humano conjugado con ficoeritrina (PE) NIB42 (4 \mug/ml) y anti-CD8 marcado con FITC en PBS/BSA/EDTA durante 10 minutos a 4ºC. Después las células se lavaron en PBS/BSA/EDTA y se marcaron con mAb de ratón anti-PE 80-5 conjugado con MicroBeads (Miltenyi Biotec) en PBS/BSA/EDTA durante 15 minutos a 8ºC. Las células se lavaron y se suspendieron en 500 \mul de PBS/BSA/EDTA.

Las células secretoras de IFN-\gamma se enriquecieron con el sistema de separación magnética de células MACS. Se pipeteó una suspensión de células marcadas magnéticamente en la parte superior de una columna de separación MiniMACS en una unidad de separación MiniMACS, la suspensión celular se dejó pasar a su través y la columna se lavó con 3 x 500 \mul de tampón. Se recogió el efluente como una fracción negativa. La columna se retiró del separador y se colocó en un tubo adecuado. Se pipeteó 1 ml de tampón en la parte superior de la columna y se retiraron por lavado abundante las células marcadas magnéticamente usando un émbolo y se aplicaron a una segunda vuelta de separación por MiniMACS.

Se analizaron células originales (es decir, antes de la separación por MACS), fracciones de células negativas (de la primera así como de la segunda separación por MACS) y una fracción de células positivas de la segunda separación por MACS mediante citometria de flujo. Se usó un programa de búsqueda FACScan y CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA) para análisis citométrico de flujo. Se excluyeron las células muertas y los residuos celulares de acuerdo con las propiedades de dispersión y la tinción con yoduro de propidio (PI; 0,3 \mug/ml) como se muestra en le Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Aunque las representaciones de puntos 2A-G muestran análisis de células de control cultivadas sin péptido, las representaciones 2J-R muestran análisis de células estimuladas con péptido.

Las representaciones de puntos 2A-D y 2J-M muestran tinción con anti-CD8 marcado con FITC frente a con anti-IFN-\gamma marcado con PE de células seleccionadas en la fracción de células original (A, J), primera negativa (B, K), segunda negativa (C, L) y en la positiva final (D, M).

En las células de control se enriquecieron células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} hasta el 8,2% entre las células vivas (2D), de las células estimuladas con péptido las células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} se enriquecieron hasta el 41,6% (2M). De las 6,1 x 10^{7} células de control, se aislaron aproximadamente 1360 células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} en comparación con 11700 células CD8^{+} IFN-\gamma^{+} de las 6,9 x 10^{7} células estimuladas con péptido.

Las células CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma^{+} inducidas por estimulación con el péptido de influenza restringido por HLA clase I MI 58-66 estaban significativamente enriquecidas por encima de este nivel de fondo; es decir, la mayoría de las células CD8+ IFN-\gamma^{+} enriquecidas a partir de las células estimuladas con péptido deben ser células T específicas de péptido. La especificidad de las células enriquecidas se confirmó adicionalmente por tinción contra V\beta17 TCR, que es un segmento de receptor de célula T (TCR) conservado en células T citotóxicas específicas de MI 58-66 (Lehner 1995 Lalvani 1997). Sólo entre las células IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células estimuladas con péptido, pero no entre las células IFN-\gamma^{+} aisladas a partir de células de control, la mayoría expresan V\beta17^{+} TCR (2F frente a 2O).

Los siguientes ejemplos muestran que con estimulación específica de antígeno apropiada, los linfocitos CD4^{+} y CD8^{+} expresan rápidamente citoquinas. La técnica se demuestra en este documento para linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8^{+} específicos de péptido 58-66 de la proteína de la matriz de influenza (FLU) restringida por HLA-A0201, células T auxiliares tipo 1 (Th1) específicas de fragmento de virus influenza A y toxina tetánica C recombinante (rTT.C) y células auxiliares T tipo 2 (Th2) específicas de toxoide tetánico (TT).

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Ejemplo 3

Materiales y Métodos para los Ejemplo 4-8 Células y estimulación ex vivo

Se obtuvieron capas leucoplaquetarias del Institute for Transfusions medicine, Hospital Merheim, Cologne, Alemania y, si es necesario, se seleccionaron en base al tipo de HLA. Se prepararon PBMC mediante centrifugación en gradiente densidad de Ficoll-Pacque (Pharmacia, Uppsal, Suecia) convencional, se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron a una concentración celular de 2 x 10^{6} células por ml en medio de celular que consistía en RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, Reino Unido) complementado con suero humano AB al 10% (p/v) (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania), L-alanil-glutamina 1 mM (Life Technologies), penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Life Technologies), 2-mercaptoetanol 0,05 mM (Life Technologies) y piruvato sódico 1 mM (Life Technologies). Se colocaron 12, 5 ml de la suspensión celular en placas de cultivo de tejidos de 100 x 20 mm (Sarstedt, Newton, MA) y se añadió péptido FLU 58-66 (Neosystems, Strasbourg, Francia) a una concentración final de 1 \muM, se añadió preparación de virus influenza A purificado (Biodesign, Kennebunk, ME) a una concentración final de \mug/ml, se añadió rTT.C (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) a una concentración final de 7 \mug/ml y se añadió TT purificado (Statens Serum Institut, Copenhage, Dinamarca) a una concentración final de 1 \mug/ml. Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 7,5% humidificada durante 5-10 horas.

Captura de citoquinas secretadas mediante matrices de afinidad celular

Se produjeron conjugados Ab-Ab dirigidos contra CD45 e IL-4 o IFN-\gamma mediante técnicas de acoplamiento de proteínas convencionales. Aslam et al. (1998) Bioconjugation, Macmillan Referente Ltd., Londres. Después de la estimulación ex vivo, las células se recogieron usando un raspador de células desechable (Costar, Cambridge, MA) y se marcaron durante 7 min a una concentración celular de 10^{8} células por ml en medio enfriado en hielo con 50 \mug por ml de los conjugados Ab-Ab. Después, las células se diluyeron con medio hasta una concentración celular final de 2 x 10^{6} células por ml y se dejó que se secretaran durante 45 min a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 7,5% humidificada.

Enriquecimiento magnético y detección de células secretoras de citoquinas

Después del periodo de captura de citoquinas, las células se recogieron de nuevo, se resuspendieron a una concentración celular de 10^{8} células por ml en solución salina tamponada con fosfato que contenía albúmina de suero bovino al 0,5% (p/v) y EDTA 5 mM (tampón) y se tiñeron durante 10 min a +4ºC con anti-IFN-\gamma-PE o anti-IL-4-PE 5 \mug/ml, respectivamente. Las células se lavaron con tampón (300 x g, 10 min), se resuspendieron en 400 \mul de tampón y se marcaron magnéticamente durante 15 min a +4ºC con 100 \mul de Ab anti-PE-microbeads (Myltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Alemania). Después del lavado, las células se aplicaron sobre una columna MS+ y se colocaron en un imán MiniMACS (Miltenyi Biotec). La columna se aclaró con tampón y las células retenidas se eluyeron a partir de la columna después de retirarlas del campo magnético para conseguir un mayor índice de enriquecimiento, las células eluidas de la primera columna se aplicaron a otra columna de MS+ y se repitió la separación magnética. Las muestras de células se analizaron en un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) usando el programa informático CellQuest.

Enriquecimiento magnético y detección de células secretoras de citoquinas

Para la detección, enumeración y fenotipado de células secretoras de citoquinas, se usaron los siguientes reactivos: anti-IFN-\gamma-CD45 (anti-IFN-\gamma, clon 4SB3; CD45, clon 5B1, W. Knapp, Viena, Austria), anti-IFN-\gamma-PE (clon 45-15), anti-L-4-CD45 (anti-IL-4, clon 1 A-610; CD45, clon 5B1, W. Knapp Viena, Austria), anti-IL-4-PE (clon 7A3-3), CD8-Cy5 (clon BM135/80, Behring Diagnostics, Marburg, Alemania), CD4-Cy5 (clon M-T321, Behring), CD4-FITC (clon SK3, Becton Dickinson), CD27-FITC (clon M-T217, Pharmingen, San Diego, CA), CD28-FITC (clon CD28.2, Pharmingen) CD57-FITC (clon HNK-1, Becton Dickinson), anti-V\beta17.FITC (clon E17.5F3.15.13, Coulter-Immunotech, Marseille, Francia). Meager et al., (1984) Interferon Res. 4: 619-625; Alkan et al., (1994) J. Immunoassay 15: 217-225; y Bird et al., (1991) Cytokine: 3: 562-567.

Ensayo de actividad citolítica

Se analizó la actividad citotóxica de células secretoras de citoquinas enriquecidas usando un ensayo basado en citometria de flujo que se ha descrito previamente. Mattis et al. (1997) J. Immunol. Met. 204: 135-142. En resumen, se marcaron 1 x 10^{6} células T2 HLA-A2.1^{+} con 4 \mug por ml del colorante verde fluorescente DiO (Molecular Probes, Eugene, OR) en solución salina tamponada con fosfato que contenía EDTA 5 mM y suero fetal de ternera al 3% durante 45 min a 37ºC. Las células se lavaron tres veces con tampón, se resuspendieron en medio de cultivo de células y se cargaron con péptido Flu 58-66 1 \muM o péptido Melan A/MART 1 27-35 (Bachem, Heidelberg, Alemania) durante una noche a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 7,5% humidificada. Se expandieron células secretoras de citoquinas enriquecidas durante 18 días en cultivos de tejidos en presencia de IL-2 humana recombinante (Peprotech, Londres, Reino Unido). Las células secretoras de citoquinas expandidas y células T2 HLA-A2.1^{+} marcadas con DiO cargadas con péptido se cocultivaron durante 16 h a una proporción de 1:1 a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 7,5% modificada. Después del periodo de cultivo, las células se recogieron y se analizaron mediante citometría de flujo. Para permitir la discriminación entre células T2 marcadas con DiO vivas y muertas, las muestras se contratiñeron con colorante de exclusión rojo fluorescente yoduro de propidio.

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Ejemplo 4

La capacidad para secretar citoquinas efectoras como IFN-\gamma después de una reestimulación antigénica a corto plazo con APC estimuladas con péptido sintético o antígeno nativo es una característica típica de células T CD4^{+} (tipo Th1) y CD8^{+} de memoria/efectoras. Salmon et al. (1989) J. Immunol. 143: 907-912; y Hamaan et al. (1997) 186: 1407-1418. Para aislar células T CD4^{+} y CD8^{+} específicas de antígeno de memoria/efectoras de baja frecuencia directamente a partir de sangre periférica basándose en la secreción inducida por antígeno de IFN-\gamma y en la tecnología de matriz de afinidad celular, se estimularon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes de sangre adultos sanos del mismo HLA durante 5-6 h con: (a) el péptido FLU 58-66 restringido por HLA-A0201, (b) una preparación de virus influenza A purificado y (c) rTT.C. Después del periodo de estimulación, se generó una matriz de afinidad para IFN-\gamma en la superficie celular usando conjugados de anticuerpo (Ab)-Ab dirigidos contra CD45 e IFN-\gamma y se dejó que las células secretaran IFN-\gamma en cultivo durante 45 min. Después, el IFN-\gamma relocalizado en la matriz de afinidad de las células secretoras se tiñó con Ab específico de IFN-\gamma conjugado con ficoeritrina (PE) y las células marcadas con PE se enriquecieron mediante MACS usando Microbeads con Ab anti-PE. Véase, también Brosterhus et al. 10^{th} International Congress in Immunology, Nueva Delhi, India, 1-6 Nov. 1998, págs. 1469-1473.

En comparación con las muestras de control no estimuladas, una proporción significativamente superior de células CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma era detectable después del enriquecimiento en la muestra estimulada con péptido FLU 58-66 (Figura 3A: 38,3% frente al 13,7%) y eran detectables proporciones significativamente superiores de células CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma después del enriquecimiento en las muestras estimuladas con la preparación de virus influenza A (Figura 3B: 35,5% frente al 1,1%) y rTT.C (Figura 3C: 6,1% frente al 0,3%), respectivamente. Cuando se observan los números absolutos de células T secretoras de IFN-\gamma enriquecidas y sus frecuencias entre PBMC totales, son incluso más notables las diferencias entre las muestras estimuladas y no estimuladas: (a) se aislaron 12.500 células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de 5,3 x 10^{7} PBMC estimuladas con péptido FLU 58-66 (frecuencia de 1 en 4.200) y se aislaron 1370 células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de 5,1 x 10^{7} PBMC no estimuladas (frecuencia: 1 en 37.000); (b) se aislaron 351 células T CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de 5 x 10^{6} PBMC estimuladas con virus influenza A (frecuencia de 1 en 14.000) y se aislaron 4 células T CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de 5,0 x 10^{6} PBMC no estimuladas (frecuencia de 1 en 1.250.000); y (c) se aislaron 132 células T CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de 1,8 x 10^{7} PBMC estimuladas con rTT.C (frecuencia: 1 en 136.000) y se aislaron 7 células CD4^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de 1,9 x 10^{7} PBMC no estimuladas (frecuencia: \sim1 en 2.710.000). Considerando estos resultados experimentales, es evidente que pueden detectarse con esta técnica células T secretoras de IFN-\gamma presentes a frecuencias por debajo>> de 10^{-6}.

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Ejemplo 5

Células T CD8^{+} de tipo tanto de memoria como efectoras eran capaces de secretar IFN-\gamma. Hamann et al. (1997). Para determinar el fenotipo de células T CD8^{+} específicas de péptido FLU 58-66, se analizaron células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma enriquecidas a partir de la muestra estimulada con péptido FLU 58-66 y la muestra se control se analizó mediante inmunofluorescencia de tres colores para determinar la expresión de un panel de marcadores de superficie de leucocitos que permite distinguir entre células T CD8^{+} de tipo memoria y efectoras. Hamann et al. Como se muestra en la Figura 2, la mayoría de las células T CD8^{+} específicas de péptido FLU 58-66 eran (1997) CD27^{+}, CD28^{+} y CD57^{-}, lo que concuerda con una fenotipo de memoria, mientras que la mayoría de las CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma que se habían aislado independientemente del péptido FLU 58-66 eran CD27^{-}, CD28^{-}, CD57^{+}, lo que concuerda con un fenotipo efector. Estas últimas podían haberse inducido in vivo para secretar IFN-\gamma y por lo tanto podrían reflejar respuestas inmunes en curso.

Más del 54,8% de las células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma de la muestra estimulada con péptido FLU 58-66 expresaban la cadena V\beta17 TCR en comparación con menos del 2,2% de las células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma de la muestra de control (Figura 4). Esto confirma los informes previos que muestran un sesgo de células T CD8^{+} específicas de péptido FLU 58-66 se han restringidas por HLA-A0201 hacia el uso de cadena de V\beta17 TCR, primero en CTL clonados y después, usando tetrámeros fluorescentes de moléculas HLA-A2.1 cargadas con péptido FLU 58-66, también en PBMC. Lehner et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 79-91; y Dunbar et al. (1998).

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Ejemplo 6

Para confirmar adicionalmente la especificidad de las células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma enriquecidas a partir de las PBMC estimuladas con péptido FLU 58-66 y para estudiar su actividad citolítica, las células se expandieron durante 18 días en cultivos de tejidos en presencia de IL-2 y después se ensayaron para determinar la actividad de CTL a una proporción de efector:diana de 1:1. Como se muestra en la Figura 5, se observó una destrucción significativa cuando las células diana se cargaron con péptido FLU 58-66 pero no cuando las células diana se cargaron con un péptido de control (Melan A/MART 1 27-35).

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Ejemplo 7

Se cultivaron PBMC de 49 individuos HLA-A2+ con o sin el péptido FLU 58-66 y se sometieron al procedimiento de enriquecimiento para células secretoras de IFN-\gamma como se describe en el Ejemplo 3. En 45 casos, se aislaron de media aproximadamente 80 veces más células T CD8^{+} secretoras de IFN-\gamma a partir de la muestra estimulada con péptido FLU 58-66 en comparación con la muestra de control. Sólo en tres casos, no se detectaron diferencias significativas entre ambas muestras. La frecuencia mediana de células T CD8^{+} específicas de péptido FLU 58-66 entre PBMC, según se determinó por resta de las frecuencias de las muestras de control de las frecuencias de las muestras estimuladas con péptido FLU 58-66, era de 1 en 30.000 (intervalo entre 1 en 600.000 y 1 en 1000). Estos resultados concuerdan completamente con los informes previos en los que las frecuencias de células T CD8+ específicas de péptido FLU 58-66 se determinaron usando inmunoensayos ligados a enzimas en manchas (ELISPOT) para liberación de IFN-\gamma de una sola célula o tetrámeros de moléculas HLA-A2.1 cargadas con péptido FLU-58-56. Lalvani et al. (1997) y Dunbar et al. (1998).

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Ejemplo 8

Para demostrar que esta estrategia aísla células T CD4^{+} tipo Th2 específicas de antígeno vivas, se estimularon PBMC con TT purificado y células T CD4^{+} secretoras de IL-4. Se aislaron células usando un conjugado Ab-Ab dirigido contra CD45 e IL-4. Después de 10 h de estimulación con TT, podían aislarse 150 células T CD4^{+} secretoras de IL-4 a partir de 2,2 x 10^{7} PMBC con una pureza del 6,89% (Figura 6). Esto se corresponde con una frecuencia de células Th2 específicas de TT entre células T CD4^{+} totales de 1 en 94.000. La frecuencia de células T CD4^{+} secretoras de IL-4 en el cultivo de control sin TT era de aproximadamente 10 veces inferior.

Claims

1. Un método de marcaje de células T específicas de antígeno con un producto secretado y liberado por las células, en el que el producto se secreta en respuesta a estimulación antigénica, comprendiendo dicho método:

(a) exponer una población mixta de células que comprenden células T a al menos un antígeno en condiciones eficaces para generar una estimulación específica de antígeno de al menos una célula T y permitir la expresión de al menos un producto por la célula T estimulada, en el que el producto se secreta en respuesta a la estimulación antigénica;

(b) modificar la superficie de las células para que contenga un resto de captura específico para el producto de modo que el resto de captura se acople a la superficie celular,

(c) cultivar la población en condiciones en las que el producto se secreta, se libera y se une específicamente al resto de captura, marcando de este modo las células secretoras de producto; y

en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el resto de captura es un anticuerpo o es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que resto de captura se acopla a la superficie de las células mediante:

(a) un anclaje lipídico unido al resto de captura opcionalmente a través de un resto de enlace;

(b) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo unido al resto de captura, opcionalmente a través de un enlazador;

(c) acoplamiento químico directo del resto de captura con componentes en la superficie celular, opcionalmente a través de un enlazador; o

(d) unión especifica del anticuerpo a la célula.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la superficie de las células se modifica en la etapa (b) por combinación de las células con al menos un anticuerpo biespecífico que tiene sitios de combinación específicos para una molécula de superficie celular y el producto.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula de superficie celular es CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11b, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD38, CD40L, CD45RO, CD45RA, LAG3, TI/ST2, SLAM, una molécula de MHC Clase I, molécula de MHC Clase II; receptor de antígeno de célula T o \beta_{2}-microglobulina.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 a 6, que comprende además la etapa de marcar el producto con un resto marcador.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el resto marcador es un anticuerpo específico para el producto.

9. Un método de la reivindicación 7 u 8, en el que el resto marcador se marca directamente o indirectamente con un fluoróforo, un isótopo radioactivo, un cromóforo, un resto magnetizable o comprende partículas magnéticas.

10. Un método de la reivindicación 9, en el que el resto marcador comprende partículas magnéticas coloidales con un diámetro de aproximadamente 5 a 200 nm.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las condiciones de incubación incluyen un medio de alta viscosidad o formador de gel.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además separar las células de acuerdo con el grado en el que estén marcadas.

13. Un método de la reivindicación 12, en el que las células se separan de acuerdo con el grado en el que estén marcadas con el producto por separación celular para obtener una población de células enriquecidas al menos 50 veces en células T específicas de antígeno.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además la etapa de expandir la población de células que está enriquecida al menos 50 veces en células T específicas de antígeno.

15. Una población de células marcadas de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Una población de células separadas de acuerdo con el método de la reivindicación 12.

17. Una población de células obtenidas de acuerdo con el método de la reivindicación 13 ó 14, en el que la población está enriquecida al menos 50 veces en células T específicas de antígeno.

18. Una población de células de acuerdo con la reivindicación 17, para el uso en el tratamiento de un trastorno autoinmune, rechazo de injertos o una respuesta alérgica.

19. Una población de células de acuerdo con la reivindicación 17, para el uso en el tratamiento del cáncer o de una infección.