ES2322388T3 - Cadena de adn util para incrementar la produccion de carotenoides. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la producción de carotenoides que comprende la introducción de un ADN de uno cualquiera de los siguientes (a) a (c) dentro de un organismo que produce carotenoides, el cultivo de dichos organismos transformados y la obtención de carotenoides en el caldo de cultivo y células: (a) un ADN que contiene una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido descrita en una cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 y SEC. ID NO:3 y que tiene actividad isopentenil (IPP) isomerasa; (b) un ADN que contiene una secuencia de nucleótido que se hibrida con el ADN de (a) anterior bajo condiciones restrictivas, y de codificación de un polipéptido que tiene actividad isopentenil (IPP) isomerasa; (c) un ADN que es un isómero degenerado del ADN de (a) anterior y de codificación de un polipéptido que tiene actividad isopentenil (IPP) isomerasa.
Description
Cadena de ADN útil para incrementar la
producción de carotenoides.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de carotenoides caracterizado por
la introducción de una cadena de ADN que contiene una secuencia de
nucleótido, la cual se define en la reivindicación, dentro de un
microorganismo que produce carotenoide para expresar dicha cadena y
para obtener mayor contenido de carotenoide.
Carotenoide es un nombre general de un tipo de
pigmentos naturales. Generalmente, los carotenoides tienen 40
átomos de carbono y están constituidos por estructuras de isopreno,
y los carotenoides son abundantes en la naturaleza.
Aproximadamente, se han aislado e identificado hasta el presente 600
tipos de carotenoides [véase, Key to carotenoids,
Basel-Boston, Birkhauser, 1987, (Pfander, H., ed.)].
Los carotenoides se han sintetizado a través de una vía de
biosíntesis de isoprenoide, una parte de la cual es común a las vías
para esteroides y otros terpenoides. Mediante el paso a través de
la vía de biosíntesis común de isopreno, la
hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA)
se convierte en pirofosfato de isopentenilo (IPP), el cual tiene 5
átomos de carbono, vía mevalonato. A continuación, el IPP se
convierte en pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP) mediante
isomerización. A continuación, mediante policondensación con IPP el
cual tiene 5 átomos de carbono, el DMAPP se convierte
secuencialmente en pirofosfato de geranilo (GPP, el cual tiene 10
átomos de carbono), pirofosfato de farnesilo (FPP el cual tiene 15
átomos de carbono), pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP el cual
tiene 20 átomos de carbono) y así sucesivamente (Figura 1).
La vía de biosíntesis de carotenoide se ramifica
a partir de la vía común del isopreno en el punto que se forma
GGPP. En ese punto, se condensan dos moléculas de GGPP para
sintetizar fitoeno, el cual es el primer carotenoide e incoloro. A
continuación, el fitoeno se convierte en licopeno mediante reacción
de desaturación. A continuación, el licopeno se convierte en
\beta-caroteno mediante ciclación. Se han
sintetizado diversas xantofilas tales como zeaxantina y astaxantina
mediante la introducción de grupos hidroxilo o grupos ceto en
\beta-caroteno. El Documento EP 0 393 690 describe
secuencias de ADN que son útiles para la síntesis de
zeaxantina-diglucósido, el cual es un carotenoide
amarillo-naranja. Dichas secuencias de ADN se han
obtenido de Erwinia uredovora y codifican enzimas para la
vía de biosíntesis del zeaxantina-diglucósido,
denominado zeaA a zeaF. La transformación de estas secuencias de
ADN a E. coli dio como resultado la producción de
carotenoide (véase D1, pág. 4, lín. 20 - pág. 10, lín. 26).
Más aún, Anderson, M.S. y otros, describen la
purificación y aislamiento de la IPP isomerasa y el gen de
codificación de dicha enzima a partir de Saccharomyces
cerevisiae. Los transformantes de levadura que contienen
múltiples copias extracromosómicas del gen IPP isomerasa
proporcionan un incremento de 5 veces en la actividad IPP isomerasa
por encima de los controles.
Recientemente, los inventores de la presente
invención han clonado los genes de la biosíntesis de carotenoide
obtenidos de Erwinia uredovora, el cual es un bacterio
epifítico no fotosintético en Escherichia coli mediante el
uso de color amarillo de Er. uredovora como marcadores y
determinaron las funciones de los genes. A continuación, se
introdujeron diversas combinaciones de estos genes para expresar, y
hacer posible que microorganismos tales como E. coli y
levadura produzcan fitoeno, licopeno,
\beta-caroteno, zeaxantina, etc. (véase Figura
2): [véase Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S.,
Izawa, Y., Nakamura, K. y Harashima, K., "Elucidation of the
Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by
functional analysis of gene products expressed in Escherichia
coli", J. Bacteriol., vol. 172, págs.
6704-6712, (1990); Misawa, N., Yamano, S., y
Ikenaga, H., "Production of \beta-carotene in
Zymomonas mobilis y Agrobacterium tumefaciens by
introduction of the biosynthesis genes from Erwinia
uredovora", Appl. Environ. Microbiol., vol. 57, págs.
1847-1849, (1991); Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa,
M., Ikenaga, H., y Misawa, N., "Metabolic engineering for
production of \beta-carotene and lycopene in
Saccharomyces cerevisiae, Biosci. Biotech. Biochem.,
vol. 58, págs. 1112-1114, (1994) y Solicitud de
Patente Japonesa abierta a consulta pública No. HEI
3-58786 (Solicitud de Patente Japonesa No. de
presentación HEI 2-53255): "A DNA chain useful
for synthesis of carotenoids" por los inventores de la presente
invención]. Con los genes de la biosíntesis de carotenoide a partir
de Er. uredovora pueden sintetizarse carotenoides a partir de
FPP. Puesto que el FPP es el substrato común no solamente para
carotenoides sino también para otros terpenoides, las bacterias
incapaces de sintetizar carotenoides tienen también FPP. De acuerdo
con ello, por ejemplo, cuando cuatro genes crt, crtE,
crtB, crtI y crtY, los cuales son necesarios
para la biosíntesis de \beta-caroteno a partir de
FPP, se introdujeron en microorganismos, el microorganismo fue
capaz de producir \beta-caroteno (véase Figura 2).
Además, mediante los mismos procedimientos mencionados
anteriormente, los inventores clonaron los genes de la biosíntesis
de carotenoide obtenidos de un bacterio marino, Agrobacterium
aurantiacum en E. coli. Mediante la expresión de
diversas combinaciones de los genes procedentes del bacterio y de
los procedentes de la Er. uredovora anteriormente
mencionada, fue posible que microorganismos tales como E.
coli produjeran astaxantina, cantaxantina, etc. (véase Figura
3): (Norihiko Misawa y otros, "Elucidation of an astaxanthin
biosynthetic pathway at the level of the biosynthesis genes'',
Abstract of the 36^{th} Symposium on the chemistry of natural
products, págs. 175-180, (1994)). Entre los
anteriores carotenoides, la astaxantina, zeaxantina y
\beta-caroteno son ya de uso práctico y se
consideran como substancias prometedoras. Se han usado para aditivos
de alimentos o piensos como agentes colorantes naturales rojo o
amarillo o como adyuvantes nutricionales que tienen actividad
profiláctica frente al cáncer, actividad inmunopotenciadora o
actividad de provitamina A. De acuerdo con ello, cuando los genes
de biosíntesis de carotenoide obtenidos por los inventores se usan
para expresarlos como genes exógenos para la transformación de
microorganismos tal como E. coli, proporcionaron a
microorganismos tal como E. coli la capacidad de biosíntesis
para la producción de carotenoides útiles. Hasta ahora, la única
vía para mejorar la producción de carotenoides útiles era encontrar
microorganismos que pudieran sintetizar suficiente cantidad de un
carotenoide diana, y ensayar la forma de incrementar su producción
investigando las condiciones de cultivo o el tratamiento de
mutación. Teniendo en cuenta los estudios realizados por los
inventores, ha sido posible elegir un microorganismo huésped que se
cultiva fácilmente y prolifera rápidamente, y está garantizado que
es seguro para alimentación independientemente de su capacidad para
la producción de carotenoide. Indudablemente, es posible igualmente
usar microorganismos que puedan sintetizar suficiente cantidad de
carotenoides útiles originalmente. En tal caso, mediante la
transformación de los microorganismos con genes de biosíntesis de
carotenoide, puede llegar a ser posible obtener mayor producción de
carotenoide o de alterar los productos carotenoides finales. Por
ejemplo, cuando se introdujeron tanto los genes crtW como
crtZ procedentes de Ag. auriantiacum dentro de un
microorganismo capaz de producir \beta-caroteno
como un producto final para expresarlo, el microorganismo se
transformó en otro que produce astaxantina como un producto
final.
Por otra parte, tanto la astaxantina como el
\beta-caroteno pueden sintetizarse también
mediante procedimientos de síntesis orgánica. En estos casos,
considerando que estos carotenoides se usan como aditivos para
piensos o alimentos, existen problemas de que se produzcan también
subproductos y dichos productos sintéticos no son preferidos por
los consumidores dado que prefieren productos naturales. Sin
embargo, los carotenoides producidos mediante los procedimientos de
fermentación convencionales no podrían competir con los de los
procedimientos de síntesis orgánica en precio. Tal como se ha
mencionado antes, cuando se usan los genes de biosíntesis de
carotenoide anteriormente mencionados, mejoran los procedimientos de
fermentación, considerándose, de esta forma, que el carotenoide
producido por los procedimientos de fermentación será capaz de
competir con los de los procedimientos de síntesis orgánica en
precio. Si el microorganismo puede acumular suficiente cantidad de
carotenoide en sí mismo, el carotenoide producido por los
microorganismos tendrá éxito en dicha competición de precios. En
consecuencia, durante mucho tiempo se ha esperado una tecnología
para obtener mayor contenido de carotenoide mediante el uso de
microorganismos.
Hasta ahora, con el fin de obtener mayor
producción de carotenoide en su biosíntesis, el procedimiento de
mutación al azar tradicional es el únicamente usado para seleccionar
cepas mutantes con mayor contenido de carotenoide con agente
mutagénico tal como NTG. Sin embargo, este procedimiento requiere
enorme cantidad de tiempo y trabajo de técnicos. Además, incluso si
se logra con éxito la potenciación de la síntesis de carotenoide,
el procedimiento requiere enorme cantidad de tiempo y esfuerzo para
inhibir la disminución del contenido de carotenoide causado por
frecuentes mutaciones inversas que tienen lugar de manera natural
dado que el procedimiento carece de su base teórica.
El objeto de la presente invención es
incrementar la cantidad de carotenoides producidos biosintéticamente
por microorganismos.
Con el fin de resolver el problema anterior, los
inventores han investigado intensamente el problema y han
desarrollado una nueva tecnología, la cual proporciona una cantidad
varias veces mayor de producción de carotenoide mediante la
introducción de una cadena de ADN que contiene únicamente un gen
dentro de un microorganismo de producción de carotenoide para
expresar el gen en él.
Más específicamente, los inventores de la
presente invención han encontrado lo que sigue a continuación y
completado la presente invención. Cuando una cadena de ADN que
contiene un gen de codificación substancialmente de una secuencia
de aminoácido de IPP isomerasa, que convierte el IPP en DMAPP, se
introduce en microorganismos tal como E. coli que tiene el
gen de la síntesis de carotenoide obtenido de Er. Uredovora,
etc, el contenido de carotenoide en células, tal como licopeno y
\beta-caroteno, pasa a ser 1,5-4,5
mayor de lo que puede alcanzarse en las células de control. El gen
de codificación substancialmente de la secuencia de aminoácido de
IPP isomerasa, que convierte el IPP en DMAPP, se obtuvo de
microorganismos que producen astaxantina tales como Phaffia
rhodozyma y Haematococcus pluvialis.
Las características de la cadena de ADN usada en
la presente invención son las siguientes.
(1) Una cadena de ADN capaz de incrementar la
cantidad de producción de carotenoide y que contiene la secuencia
de nucleótido que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácido substancialmente mostrada en la Secuencia ID No.1, o una
cadena de ADN que puede hibridarse con dicha cadena de ADN bajo
condiciones restrictivas y de codificación de un polipéptido que
tiene actividad IPP isomerasa.
(2) Una cadena de ADN capaz de incrementar la
producción de carotenoide y que contiene la secuencia de nucleótido
que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido
substancialmente mostrada en la Secuencia ID No.2, o una cadena de
ADN que puede hibridarse con dicha cadena de ADN bajo condiciones
restrictivas y de codificación de un polipéptido que tiene
actividad IPP isomerasa.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la producción de carotenoide. Las características
de los procedimientos de producción de carotenoides de la presente
invención son las siguientes.
(3) Un procedimiento de producción caracterizado
por la introducción de la cadena de ADN mencionada anteriormente o
bien en (1) o bien en (2), dentro de un microorganismo de producción
de carotenoide, cultivo de dicho microorganismo transformado e
incremento del contenido en carotenoide en las células y caldo de
cultivo.
(4) Un procedimiento de producción caracterizado
por la introducción de la cadena de ADN que contiene la secuencia
de nucleótido que codifica el polipéptido que tiene substancialmente
la misma secuencia de aminoácido mostrada en la Secuencia ID No.3,
o una cadena de ADN que puede hibridarse con dicha cadena de ADN
bajo condiciones restrictivas, y de codificación de un polipéptido
que tiene actividad IPP isomerasa, dentro de un microorganismo de
producción de carotenoide, cultivo de dicho microorganismo e
incremento del contenido en carotenoide en las células y caldo de
cultivo.
La presente invención se describe aquí a
continuación.
Tal como se ha descrito anteriormente, mediante
la introducción del gen de biosíntesis de carotenoide obtenido de
microorganismos tales como Erwinia uredovora, la bacteria
terrestre no fotosintética y Agrobacterium aurantiacum, la
bacteria marina, dentro de otros microorganismos que no producen
carotenoides útiles tal como E. coli, el microorganismo
puede producir carotenoides útiles tales como astaxantina,
zeaxantina, \beta-caroteno y licopeno. Con el fin
de competir en precio con el carotenoide producido mediante el uso
de procedimientos de síntesis orgánica, es necesario lograr una
producción de carotenoide tan alta como sea posible. El gen IPP
isomerasa, el cual incluye el gen de codificación del polipéptido
cuya secuencia de aminoácido es substancialmente IPP isomerasa, tal
como se ha definido anteriormente, es extremadamente útil para
incrementar la cantidad de producción de carotenoides. Mediante el
uso de la moderna biotecnología, es relativamente fácil incrementar
la cantidad de producción de una proteína codificada por un gen
exógeno mediante la potenciación del nivel de expresión del gen.
Sin embargo, si las cantidades de substrato necesario para una
proteína, es decir la enzima, está limitada, una mayor producción
de la proteína no conduce a una mayor producción de productos
bioquímicos tales como carotenoides. Por ejemplo, sin cantidad
suficiente de FPP, que es el primer substrato, la potenciación del
nivel de expresión de los genes de la síntesis de carotenoide no
conduce a una mayor cantidad de producción de carotenoides. Ahora,
los presentes inventores han tenido éxito en el incremento de la
cantidad de producción de carotenoide mediante la introducción del
gen IPP isomerasa. Se considera que la introducción del gen IPP
isomerasa permite que el flujo, más arriba de la vía hacia el FPP,
sea más grande (más eficaz) y, en consecuencia, el incremento de
suministro de FPP conduzca a una mayor cantidad de producción de
carotenoide. La presente invención se inicia a partir de los
hallazgos de que mediante la introducción de o bien el gen de
codificación de IPP isomerasa, que convierte de IPP a DMAPP y
viceversa, o bien la codificación de la proteína homóloga al IPP
isomerasa dentro de un microorganismo que produce carotenoide tal
como E. coli, para expresar el gen, se incrementa la
cantidad de producción de carotenoide. Mediante el uso de genes de
biosíntesis de carotenoide a partir de Er. uredovora, se
prepararon bibliotecas de expresión de ADNc de Phaffia
rhodozyma, Haematococcus pluvialis, etc, en E. coli
productor de \beta-caroteno como un huésped. Al
lograrse un incremento de contenido en
\beta-caroteno en E. coli, parte de las
colonias amarillentas avivaron su color hasta casi naranja. Los
plásmidos extraídos a partir de dichas colonias de E. coli
se analizaron y se encontró que tenían genes con alta homología con
la IPP isomerasa de Saccharomyces cerevisiae. Se ha
especulado que la HMG-CoA reductasa (Figura 1), la
cual cataliza la reacción de HMG-CoA a mevalonato,
puede ser la enzima limitadora de la cantidad de terpenoides
incluyendo carotenoides. Sin embargo, al igual que para la IPP
isomerasa, no se ha presentado ningún informe en ese sentido. Por
ello, el incremento de producción de carotenoide mediante la
introducción de un gen IPP isomerasa ha sido un nuevo
hallazgo.
hallazgo.
La presente invención usa una cadena de ADN que
tiene las características de incrementar la cantidad de producción
de carotenoide, y de contener la secuencia de nucleótido que
codifica el polipéptido que tiene substancialmente la misma
secuencia de aminoácido que la de la IPP isomerasa, y un
procedimiento de producción de carotenoide caracterizado por la
introducción de dicha cadena de ADN dentro del microorganismo de
producción de carotenoide, el cultivo de dicho microorganismo
transformado y el incremento del contenido de carotenoide en el
caldo de cultivo y células.
Las cadenas de ADN usadas aquí incluyen las
cadenas de ADN mencionadas anteriormente en (1) ó (2), o las cadenas
de ADN que se hibridan a dichas cadenas bajo condiciones
restrictivas.
Substancialmente, los polipéptidos codificados
por las cadenas de ADN de la presente invención tienen las
secuencias de aminoácidos mostradas en la SECUENCIA ID No.1
(A-B en las Figuras 4 y 5) o en la SECUENCIA ID
No.2 (C-D en las Figuras 6 y 7). Las cadenas de ADN
usadas en el procedimiento de la presente invención incluyen no
solamente las cadenas que tienen las secuencias de nucleótido que
codifican las secuencias de aminoácido mostradas en la SECUENCIA ID
No.1 y 2 (Figuras 4 a 5), sino también los isómeros degenerados de
las cadenas, los cuales difieren solamente en codones degenerados y
codifican los mismos polipéptidos que las cadenas originales.
Un procedimiento para obtener una cadena de ADN
que tenga la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de
aminoácido de la proteína anterior es la síntesis química de la
cadena de ADN de al menos una parte de la cadena de acuerdo con el
procedimiento de síntesis de ácido nucleico conocido. Sin embargo,
considerando que existen demasiados aminoácidos unidos en la
proteína, se-ría más preferible que la síntesis
química el hacer bibliotecas de ADNc de Haematococcus
pluvialis o de Phaffia rhodozyma o similares, para
obtener una cadena de ADN diana mediante la aplicación de algún
procedimiento popular en el campo de la ingeniería genética tal
como la hibridación con sondas apropiadas.
Puede lograrse un mayor contenido de carotenoide
en el caldo de cultivo o células de microorganismos mediante la
introducción de la cadena de ADN anteriormente mencionada dentro de
microorganismos apropiados tales como bacterias productoras de
carotenoide tales como E. coli y Zymomonas mobilis
conteniendo genes de biosíntesis de carotenoides procedentes de
Erwinia uredovora y otras, o levadura productora de
carotenoide tal como Saccharomyces cerevisiae conteniendo
genes de biosíntesis de carotenoides procedentes de Erwinia
uredovora y otras.
El esquema del procedimiento para introducir
genes exógenos dentro de microorganismos preferibles se menciona a
continuación.
Los procedimientos para introducir y expresar
genes exógenos in microorganismos tal como E. coli, además
de los mencionados más adelante en la presente invención, incluyen
los ampliamente usados en el campo de la ingeniería genética. Los
mismos son aplicables a la invención. Véase "Vectors for cloning
genes", Methods in Enzymology, vol. 216, págs.
469-631, (1992), Academic Press; "Other bacterial
systems", Methods in Enzymology, vol. 204, págs.
305-636, (1991), Academic Press).
Existen algunos procedimientos establecidos y
eficaces para introducir genes exógenos a E. coli tal como
el procedimiento de Hanahan y el procedimiento del rubidio, los
cuales son aplicables a la presente invención (Véase Sambrook, J.,
Fritsch, E.F., Maniatis, T., "Molecular Cloning - A laboratory
manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). La
expresión de genes exógenos en E. coli puede llevarse a cabo
mediante procedimientos conocidos (Véase "Molecular Cloning - A
laboratory manual", cita anterior), por ejemplo, pueden usarse
vectores para E. coli tales como vectores pUC y pBluescript
que tienen el promotor lac. Los inventores de la presente
invención han usado el vector pSPORT1 o el vector pBluescript II KS
que tienen el promotor lac como vectores para E.
coli, e insertado el gen IPP isomerasa, obtenido de
Haematococcus pluvialis, Phaffia rhodozyma o
Saccharomyces cerevisiae, dentro del promotor lac con
la dirección de lectura a lo largo de la transcripción, y expresado
el gen en E. coli.
Existen algunos procedimientos establecidos tal
como el procedimiento del litio para introducir genes exógenos
dentro de Saccharomyces cerevisiae, levadura, siendo dichos
procedimientos aplicables a la presente invención (Véase "New
biotechnology on yeast", Ed. Bio-industry
Association (Yuichi Akiyama, editor in chef), Igaku Syuppan
Center). La expresión de genes exógenos en levadura puede llevarse a
cabo tal como sigue. Usando tanto promotores como terminadores, por
ejemplo, para PGK y GPD, se construyó una caja de
expresión mediante la inserción del gen exógeno de manera tal que
durante la transcripción, el gen se leyera a lo largo de la misma
en la posición entre el promotor y el terminador. La expresión puede
llevarse a cabo mediante la inserción de la caja de expresión
dentro de un vector para S. cerevisiae tal como los vectores
YRp (vectores multi-copia para levadura,
iniciadores de replicación en la secuencia ARS del cromosoma de
levadura), vectores YEp (vectores multi-copia para
levadura, iniciadores de replicación en 2 \mum de ADN) y vectores
YIp (vectores para cromosoma de levadura, sin punto de inicio de
replicación en levadura) (Véase "New biotechnology on yeast",
cita anterior; "Genetic engineering for production of
substances", Ed. Japanese Society of Agrocultural Chemistry,
Asakura Publishing company; o Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M.,
Ikenaga, H., Misawa, N., "Metabolic engineering for production of
\beta-carotene and lycopene in Saccharomyces
cerevisiae", Biosci. Biotech. Biochem., vol. 58,
págs. 1112-1114, (1994)).
La introducción de genes exogenous dentro de
Zymomonas mobilis, el bacterio productor de etanol, puede
llevarse a cabo mediante el procedimiento de transferencia de
conjugación que es de uso común para bacterias
gram-negativas. La expresión de gen exógeno en
Zymomonas mobilis puede llevarse a cabo mediante el uso del
vector pZA22 para este bacterio (Véase Katsumi Nakamura,
"Molecular breeding of Zymomonas bacteria", Journal
of the Japanese Society of Agrocultural Chemistry, vol. 63,
págs.. 1016-1018, (1989); y Misawa, N., Yamano, S.,
Ikenaga, H., "Production of \beta-carotene in
Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by
introduction of the biosynthesis genes from Erwinia
uredovora", Appl. Environ. Microbiol., vol. 57, págs.
1847-1849, (1991)).
Mediante la aplicación de los procedimientos
anteriormente mencionados para la introducción y expresión de genes
exógenos en microorganismos, pueden introducirse tanto genes de
síntesis de carotenoide como gel IPP isomerasa para expresar, y
pueden obtenerse microorganismos capaces de producir gran cantidad
de carotenoide.
El pirofosfato de farnesilo (FPP) es el
substrato común no solamente para carotenoides sino también para
otros terpenoides tales como sesquiterpenos, triterpenos, esteroles
y hopanoles. En general, puesto que los microorganismos están
sintetizando terpenoides incluso considerando que no sean capaces de
sintetizar carotenoides, básicamente todos los microorganismos
poseen FPP como un metabolito intermedio. Por otra parte, la
Erwinia uredovora, el bacterio no fotosintético que tiene
los genes de síntesis de carotenoide, puede sintetizar hasta
diversos carotenoides útiles tales como licopeno,
\beta-caroteno, zeaxantina usando FPP como un
substrato. Cuando los genes se combinan con los genes de síntesis
de carotenoide de Agrobacterium auranticum, el bacterio
marino, pueden sintetizarse igualmente hasta diversos carotenoides
útiles tales como cantaxantina y astaxantina (Véanse Figuras 2 y
3). Los inventores de la presente invención han confirmado ya que
mediante la introducción de genes crt de Erwinia
uredovora dentro de microorganismos tales como Saccharomyces
cerevisiae, levadura y Zymomonas mobilis, bacteria
productora de etanol, estos microorganismos pueden producir
carotenoides tal como \beta-caroteno tal como se
ha anticipado [Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M., Ikenaga, H.,
Misawa, N., "Metabolic engineering for production of
\beta-carotene and lycopene in Saccharomyces
cerevisiae", Biosci. Biotech. Biochem., vol. 58,
págs. 1112-1114, (1994); Misawa, N., Yamano, S.,
Ikenaga, H., "Production of \beta-carotene in
Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by
introduction of the biosynthesis genes from Erwinia
uredovora", Appl. Environ. Microbiol., vol. 57, págs.
1847-1849, (1991); y Solicitud de Patente Japonesa
abierta a consulta pública No. HEI 3-58786
(Solicitud de Patente Japonesa No. de presentación HEI
2-53255): "A DNA chain useful for synthesis of
carotenoids" por los inventores].
A partir de los hallazgos anteriores, puede
esperarse que cuando se introducen unas combinaciones apropiadas de
los genes de síntesis de carotenoide obtenidos de Er.
uredovora y los procedentes de bacterias marinas (típicamente,
los genes de síntesis de carotenoide obtenidos de Ag.
auranticum) dentro del mismo microorganismo simultáneamente, en
principio, todos los microorganismos, en los cuales se han
introducido dichos genes y de los cuales se ha establecido el
sistema de introducción-expresión, pueden producir
carotenoides útiles tales como astaxantina y zeaxantina.
En dichos casos, si el gen IPP isomerasa
(típicamente, obtenido de Haematococcus pluvialis, Phaffia
rhodozyma y Saccharomyces cerevisiae) se introduce de
acuerdo con el procedimiento anteriormente mencionado, y se expresa
simultáneamente con el gen de síntesis de carotenoide anterior,
puede lograrse mayor cantidad de producción de carotenoides
útiles.
La cepa JM109 de E. coli recombinante ha
sido depositada de acuerdo con el National Institute of Bioscience
and Human-technology, la Agency of Industrial
Science and Technology. La cepa contiene el plásmido que tiene el
gen aislado que es la cadena de ADN tal como se ha definido
anteriormente. Los nombres de los plásmidos se muestran entre
paréntesis.
(i) JM109 (pRH1)
- Depósito No.: FERM BP-5032
- Fecha de recepción: 6 de Marzo de 1995
(ii) JM109 (pHP11)
- Depósito No.: FERM BP-5031
- Fecha de recepción: 6 de Marzo de 1995
(ii) JM109 (pSI1)
- Depósito No.: FERM BP-5033
- Fecha de recepción: 6 de Marzo de 1995
La Figura 1 muestra la vía de biosíntesis común
del isopreno desde HMG-CoA hasta FPP.
La Figura 2 muestra la vía de biosíntesis de
carotenoide, y las funciones de los genes de síntesis de carotenoide
de Erwinia uredovora, el bacterio no fotosintético.
La Figura 3 muestra la vía de biosíntesis de
carotenoide, y las funciones de los genes de síntesis de carotenoide
de Agrobacterium aurantiacum, el bacterio marino. La línea
continua muestra la vía de biosíntesis principal y la línea de
puntos muestra la vía secundaria.
Las Figuras 4 y 5 muestran la secuencia de
nucleótido del gen IPP isomerasa y la secuencia de aminoácido del
polipéptido codificado por dicho gen de Phaffia rhodozyma, la
levadura productora de astaxantina. En la Figura, la secuencia
desde la señal A hasta B muestra el marco de lectura abierto de
codificación del polipéptido constituido por 251 aminoácidos.
\newpage
Las Figuras 6 y 7 muestran la secuencia de
nucleótido del gen IPP isomerasa y la secuencia de aminoácido del
polipéptido codificado por dicho gen de Haematococcus
pluvialis, el alga verde productora de astaxantina. En la
Figura, la secuencia desde la señal C hasta D muestra el marco de
lectura abierto de codificación del polipéptido constituido por 259
aminoácidos.
Las Figuras 8 y 9 muestran la secuencia de
nucleótido del gen IPP isomerasa y la secuencia de aminoácido del
polipéptido codificado por dicho gen de Saccharomyces
cerevisiae, la levadura para uso de laboratorio. En la Figura,
la secuencia desde la señal E hasta F muestra el marco de lectura
abierto de codificación del polipéptido constituido por 288
aminoácidos.
La Figura 10 muestra los plásmidos que contienen
los genes de biosíntesis de carotenoide de Erwinia uredovora,
el bacterio no fotosintético.
La Figura 11 muestra los plásmidos que contienen
el gen IPP isomerasa de Phaffia rhodozyma, Haematococcus
pluvialis o Saccharomyces cerevisiae.
La Figura 12 muestra la curva de desarrollo en
el caldo de cultivo de las cepas (L:) de E. coli productoras
de licopeno. En la Figura, "control" significa la cepa de E.
coli que no tiene gen IPP isomerasa exógeno.
La Figura 13 muestra la curva de producción de
licopeno en el caldo de cultivo de las cepas (L:) de E. coli
productoras de licopeno. En la Figura, "control" significa la
cepa de E. coli que no tiene gen IPP isomerasa exógeno.
La Figura 14 muestra la producción de licopeno
(L:), \beta-caroteno (\beta:) y fitoeno (P:) en
las células cultivadas de las cepas de E. coli. En la
Figura, "control" significa la cepa de E. coli que no
tiene gen IPP isomerasa exógeno.
Ejemplo
Los ejemplos siguientes ilustran la presente
invención con más detalle; sin embargo, la presente invención no
está limitada a ellos. Los experimentos de recombinación genética
usados aquí están basados en procedimientos convencionales
(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., "Molecular Cloning - A
laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989)), salvo que se establezca lo contrario.
Se usó la cepa ATCC 24230 de Phaffia
rhodozyma (levadura productora de astaxantina) registrada en el
American Type Culture Collection (ATCC). Se usó medio YM (extracto
de levadura al 0,3%, extracto de malta al 0,3%, bactopeptona al
0,5%, glucosa al 1%) para Ph. Rhodozyma. Se usó la cepa
NIES-144 de Haematococcus pluvialis, el alga
verde productora de astaxantina, registrada en el Global
Environmental Forum. El Ha pluvialis se cultivó a 20ºC
durante aproximadamente 4 días en medio de cultivo básico (extracto
de levadura al 0,2%, acetato sódico al 0,12%,
L-asparagina al 0,04%, cloruro magnésico hexahidrato
al 0,02%, sulfato ferroso heptahidrato al 0,001%, cloruro cálcico
dihidrato al 0,002%) bajo la condición de 12 horas de luz (20
\muE/m^{2}s)/12 horas de oscuridad. Además, con el fin de
inducir la síntesis de astaxantina en Ha pluvialis, tuvo que
inducirse la formación de quiste, un tipo de diferenciación. Para
inducir la formación del quiste, se agregaron ácido acético 45 mM y
sulfato ferroso heptahidrato 450 \muM a las concentraciones
finales. El Ha pluvialis en el medio se cultivó durante
aproximadamente 12 horas a 20ºC con luz (125 \muE/m^{2}s). Se
usó la cepa S288C de Saccharomyces cerevisiae (levadura para
uso de laboratorio) registrada en el Yeast Genetic
Stock Center. Para Sa. cerevisiae se usó medio YDP (extracto de levadura al 1%, bactopeptona al 2%, glucosa al 2%).
Stock Center. Para Sa. cerevisiae se usó medio YDP (extracto de levadura al 1%, bactopeptona al 2%, glucosa al 2%).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa ATCC 24230 de Phaffia rhodozyma
se cultivó con agitación durante aproximadamente 24 horas a 20ºC en
400 ml de medio YM. Cuando la turbidez del medio alcanzó una
OD_{600} = 0,4, las bacterias se recogieron y congelaron en
nitrógeno líquido. Las bacterias congeladas se almacenaron en el
congelador a -80ºC y se usaron para la preparación del ARN total.
Después de descongelar las bacterias congeladas en un tubo sobre
hielo, las bacterias se suspendieron en 6 ml de de tampón ANE
(acetato sódico 10 mM, cloruro sódico 100 mM, EDTA 1 mM, pH 6,0).
Se agregaron perlas de vidrio para cubrir la superficie de la capa
de bacterias. A continuación, se agregaron 600 \mul de SDS al 1%
y 6 ml de fenol precalentado a 65ºC. La suspensión se mantuvo a 65ºC
durante 5 minutos, y el tubo se batió para triturar las membranas
de las células cada 30 segundos. A continuación, la suspensión se
enfrió rápidamente hasta temperatura ambiente y se centrifugó
durante 10 minutos a 1.500 x g a temperatura ambiente. Se agregó un
volumen igual de fenol al sobrenadante y se batió durante 2 minutos.
A continuación, la suspensión se centrifugó durante 10 minutos a
1.500 x g a temperatura ambiente. A continuación, usando un volumen
igual de fenol/cloroformo (1/1 (v/v)) y cloroformo solamente, se
llevó a cabo el mismo procedimiento anterior. Al sobrenadante
resultante, se agregaron un décimo del volumen de acetato sódico 3 M
y tres volúmenes de etanol; a continuación, el sobrenadante se
almacenó en el congelador a -20ºC durante 30 minutos. El
sobrenadante se centrifugó durante 15 minutos a 15.000 x g a 4ºC,
el gránulo resultante se lavó con etanol al 70% y se secó. El
residuo se disolvió en 200 \mul de agua esterilizada para formar
la solución de ARN total de Ph. rhodozyma. Mediante este
procedimiento de preparación, se obtuvieron 1,6 mg de ARN total.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa NIES-144 de
Haematococcus pluvialis se cultivó durante aproximadamente 4
días en 800 ml de medio de cultivo básico bajo la condición de
20ºC, intensidad de luz a 20 \muE/m^{2}s y ciclo de 12 horas de
luz/12 horas de oscuridad. A continuación, se agregó ácido acético
45 mm y sulfato ferroso heptahidrato 450 \muM como
concentraciones finales. El H. pluvialis en el medio se
cultivó durante aproximadamente 12 horas a 20ºC con luz (125
\muE/m^{2}s). Las bacterias se recogieron del medio, se
congelaron en nitrógeno líquido y se trituraron en el mortero,
proporcionando un polvo. A continuación, se agregaron tres ml de
ISOGEN-LS (Nippon Gene K.K.) al polvo y se dejó
reposar durante 5 minutos. A continuación, se agregaron 0,8 ml de
cloroformo, y la solución se agitó vigorosamente durante 15
segundos y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3
minutos. La solución se centrifugó durante 15 minutos a 4ºC, a
12.000 x g, se agregaron dos ml de isopropanol al sobrenadante y el
sobrenadante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10
minutos. A continuación, la solución se centrifugó durante 10
minutos a 4ºC, a 12.000 x g. El gránulo resultante se lavó con
etanol al 70% para secarlo. Después de secarlo, el residuo se
disolvió en 1 ml de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH
8,0, EDTA 1 mM) para formar la solución de ARN total de Ha.
pluvialis. Mediante este procedimiento de preparación, se
obtuvieron 4,1 mg de ARN entero.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el uso de Oligotex-dT30
Super (Takara Syuzo K.K.), se purificaron poly A + ARN procedente de
Phaffia rhodozyma y Haematococcus pluvialis a partir
de 1 mg aproximadamente de ARN total, respectivamente. La
purificación se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos
mencionados en el folleto del envase. Siguiendo el procedimiento,
se purificaron 26 \mug aproximadamente de poly A + ARNm procedente
de Ph. rhodozyma y 14 \mug del mismo procedente de Ha.
pluvialis.
La preparación del ADNc se llevó a cabo con el
sistema de plásmido Superscript^{TM} (GIBCO BRL) mediante el
procedimiento mencionado en el folleto del envase con algunas
modificaciones. Aproximadamente se usaron 5 \mug de poly A +
ARNm. Como cebador, se usó un ADN sintético constituido por la
secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción
NotI y oligo-dT 15mero. El ADN complementario
se sintetizó con transcriptasa inversa, SUPERSCRIPT RT. A
continuación, mediante el uso de ADN ligasa de Eschericchia
coli, ADN polimerasa de E. coli y RNasa H de E.
coli, se sintetizó ADN de doble hebra. A continuación, se unió
el ligador de la enzima de restricción SalI usando ADN
ligasa T4. El ADNc se diseñó de forma tal que tuviera el sitio
SalI más arriba del terminal del mismo y el sitio NotI
más abajo de poli A. El fraccionamiento por tamaño de estos ADNc se
llevó a cabo mediante electroforesis y las fracciones comprendidas
dentro del intervalo de desde 0,7 kb hasta 3,5 kb se recogieron. El
ADNc en las fracciones recogidas se ligó al vector de expresión de
ADNc pSPORT I NotI-SalI-Cut usando
tanto el tampón de ligamiento incluido en el kit,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM,
DTT 1 mM, PEG 8.000 al 5%, como ADN ligasa T4. El vector de
expresión de ADNc pSPORT I tiene el promotor lac más arriba
del sitio SalI y puede expresar ADNc en E. coli. A
continuación, usando el total de la solución de ADN ligado, se
llevó a cabo la transformación de las células competentes de E.
coli DH5\alpha de acuerdo con el procedimiento descrito en
"Molecular Cloning" 2nd edition: Cold Spring Harbor
Laboratory, págs.. 1.21-1.41, (1989). Se obtuvieron
aproximadamente 200.000 cepas transformadas de Ph. rhodozyma
y aproximadamente 40.000 cepas transformadas de Ha.
pluvialis. Después de recoger todos los transformantes, se
preparó el ADN plásmido de acuerdo con el procedimiento descrito en
"Molecular Cloning" 2nd edition, cita anterior. Como un
resultado de ello, se obtuvieron 0,9 mg y 0,6 mg de ADNs plásmidos
respectivamente y los cuales se asignaron como bibliotecas ADNc de
Ph. rhodozyma y Ha. pluvialis.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCAR16 (Misawa, N., Nakagawa, M.,
Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., Harashima, K.,
"Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid
biosynthetic pathway by functional analysis of gene products
expressed in Escherichia coli", J. Bacteriol., vol.
172, págs. 6704-6712, (1990) y Solicitud de Patente
Japonesa abierta a consulta pública No. HEI 3-58786
(Solicitud de Patente Japonesa No. de presentación HEI
2-53255): "A DNA chain useful for synthesis of
carotenoids" por los presentes inventores) que tiene los genes
de síntesis de carotenoide excepto para crtZ obtenido de
Erwinia uredovora, se digerió con BstEII, se trató
con enzima de Klenow y se volvió a ligar para inactivar el gen
crtX por cambio del marco. Después de esto, se extrajo el
fragmento Asp718(KpnI)-EcoRI de 6,0 kb que
contiene los genes crtE, crtB, crtI y
crtY necesarios para la producción de
\beta-caroteno. A continuación, el fragmento se
insertó dentro de los sitios EcoRV del vector pACYC184 de
E. coli y se obtuvo el plásmido deseable (denominado
pACCAR16\DeltacrtX, Figura 10). La E. coli que contiene
este plásmido (pACCAR16\DeltacrtX) es resistente al cloramfenicol
y tiene color amarillento debido a la producción de
\beta-caroteno.
A continuación, el plásmido pCAR16 se digerió
con BstEII/SnaBI, se trató con enzima de Klenow y se
volvió a ligar para eliminar el fragmento
BstEII-SnaBI de 2,26 kb que contiene los genes
crtX y crtY. Después de esto, se extrajo el fragmento
Asp718(KpnI)-EcoRI de 3,75 kb que
contiene los genes crtE, crtB y crtI
necesarios para la producción de licopeno. A continuación, el
fragmento se insertó dentro de los sitios EcoRV del vector
pACYC184 de E. coli y se obtuvo el plásmido deseable
(denominado pACCRT-EIB, Figura 10). La E.
coli que contiene pACCRT-EIB es resistente al
cloramfenicol y tiene color rojizo debido a la producción de
licopeno. (Cunningham, Jr., F.X., Chamovitz, D., Misawa, N., Gatt,
E., Hirschberf, J., "Cloning and functional expression in
Escherichia coli of a cyanobacterial gen for lycopene
cyclase, the enzyme that catalyzes the biosynthesis of
\beta-carotene", FEBS Lett., vol. 328,
págs. 130-138, (1993)).
A continuación, el plásmido pCAR16 se digerió
con BstEII/Eco52I, se trató con enzima de Klenow y se
volvió a ligar para eliminar el fragmento
BstEII-Eco52I de 3,7 kb que contiene los genes
crtX, crtY y crtI. Después de esto, se extrajo
el fragmento Asp718(KpnI)-EcoRI de 2,3 kb que
contiene los genes crtE y crtB (Figura 2) necesarios
para la producción de fitoeno. A continuación, el fragmento se
insertó dentro de los sitios EcoRV del vector pACYC184 de
E. coli y se obtuvo el plásmido deseable (denominado
pACCRT-EB, Figura 10). La E. coli que
contiene pACCRT-EB es resistente al cloramfenicol y
no muestra cambio de color puesto que el fitoeno es incoloro
(Linden, H., Misawa, N., Chamovitz, D., Pecker, I., Hisrchberg, J.,
Sandmann, G., "Functional complementation in Escherichia
coli of diferent phytoene desaturase genes and analysis of
accumulated carotenes", Z. Naturforsch., vol. 46c, págs.
1045-1051, (1991)).
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que la cepa JM101 de E. coli que
contiene el plásmido anterior pACCAR16\DeltacrtX muestra color
amarillento debido a la producción de
\beta-caroteno, se investigó si puede obtenerse
más transformante amarillento mediante la introducción de la
biblioteca de expresión de ADNc de Phaffia rhodozyma o
Haematococcus pluvialis. Como una primera etapa, se
prepararon células competentes de JM101 de E. coli
conteniendo pACCAR16\DeltacrtX de acuerdo con el procedimiento
convencional descrito en "Molecular cloning" 2nd edition: Cold
Spring Harbor Laboratory, págs. 1.21-1.41, (1989). A
continuación, se introdujeron cien ng de cada biblioteca de
expresión de ADNc de Ph. rhodozyma y Ha. pluvialis a 1
ml de las células competentes. Se obtuvieron aproximadamente
200.000 transformantes de Ph. rhodozyma y aproximadamente
40.000 transformantes de Ha. pluvialis y se inocularon para
rastreo sobre la placa LB (bactotriptona al 1%, extracto de levadura
al 0,5%, NaCl al 1%, agar al 1,5%) que contenía 150 \mug/ml de
ampicilina, 30 \mug/ml de cloramfenicol y 1 mM de IPTG. A partir
del rastreo, 5 cepas de Ph. rhodozyma y 10 cepas de Ha.
pluvialis muestran color amarillento más fuerte que otras
cepas, asilándose las mismas. El ADN plásmido extraído a partir de
estas cepas se sometió a análisis de enzima de restricción,
encontrándose que los plásmidos procedentes de las cinco cepas y de
las diez cepas tienen un fragmento de ADN común, respectivamente.
De estos plásmidos rastreados obtenidos de las bibliotecas de
expresión de ADNc un plásmido procedente de Ph. rhodozyma se
le denominó pRH1 (Figura 11) y otro plásmido procedente de Ha.
pluvialis se le denominó pHP1. Además de lo anterior, se extrajo
un fragmento después de la digestión de pHP1 con SalI y
NotI, y a continuación, el fragmento se insertó dentro de
pBluescript KS+. Al plásmido resultante se le denominó pHP11 (Figura
11) y se usó para los experimentos mencionados más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los plásmidos pRH1 y pHP1, se
prepararon los plásmidos de deleción que carecen de diversas
longitudes a partir de los plásmidos originales, mediante los
procedimientos siguientes. Mediante el uso de dichos plásmidos de
deleción, se determinaron las secuencias de nucleótido. La
descomposición de pRP1 se llevó a cabo tanto con EcoRI y
PstI, como con NotI y SphI. La descomposición
de pHP1 se llevó a cabo tanto con AatII y BamI, como
con KpnI y EcoRI. Después de extracción con
fenol/cloroformo, el ADN se recuperó mediante precipitación con
etanol. A continuación, cada fracción de ADN se disolvió en
porciones de 100 \mul de tampón ExoIII (Tris-HCl
50 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM,
2-mercaptoetanol 10 mM, pH 8,0) y se mantuvo a 37ºC
después de la adición de 180 unidades de ExoIII nucleasa. Cada 30
segundos se tomaron muestras de porciones de 10 \mul y se
transfirieron a tubos que contenían 10 \mul de tampón MB (NaCl 40
mM, ZnCl_{2} 2 mM, glicerol al 10%, pH 4,5) en un baño de hielo.
Después de la toma de muestras, los 10 tubos se mantuvieron a 65ºC
durante 10 minutos para inactivar la enzima. A continuación, se
agregaron 5 unidades de nucleasa de judía de mung y se mantuvieron
a 37ºC durante 30 minutos. A partir de un plásmido original, se
recuperaron diez tipos diferentes de fragmentos de ADN mediante
electroforesis de gel de agarosa. El grado de deleción de cada
fragmento varía. Los terminales de los ADNs recuperados se lisaron
con enzima de Klenow para someter a reacción de ligamiento a 16ºC
durante una noche, y mediante el uso de del ADN resultante, se
transformó el DH5\alpha de E. coli para obtener clones.
Los plásmidos se prepararon a partir de los diversos clones
obtenidos, y las secuencias de nucleótidos se determinaron mediante
el uso del kit de secuencia de ciclo de cebador de luminiscencia
(Applied Biosystems Corp.), con un secuenciador automático.
Como un resultado de ello, se encontró que la
secuencia de nucleótido del ADNc en pRH1 obtenido de Phaffia
rhodozyma está constituida por 1.099 pares de bases (SECUENCIA
ID No.4), y que existe un marco de lectura abierto que codifica un
polipéptido que tiene 251 aminoácidos (que corresponden a la región
desde A hasta B en las Figuras 4 y 5). Igualmente, se encontró que
la secuencia de nucleótido del ADNc en pHP1 obtenido de
Haematococcus pluvialis está constituida por 1.074 pares de
bases (SECUENCIA ID No.5), y que existe un marco de lectura abierto
que codifica un polipéptido que tiene 259 aminoácidos (que
corresponden a la región desde C hasta D en las Figuras 6 y 7). Las
secuencias de aminoácidos esperadas a partir de estos marcos de
lectura abiertos se investigaron mediante análisis de homología en
el Gene Bank. Tanto las secuencias de aminoácidos de Ph.
rhodozyma como de Ha. pluvialis tienen homología
significativa con el gen IPP isomerasa de Saccharomyces
cerevisiae, 27% para Ph. rhodozyma y 20,3% para Ha.
pluvialis. En consecuencia, los genes se identificaron como el
gen IPP isomerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de ADN total en Saccharomyces
cerevisiae se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento
descrito en "Methods in Yeast Genetics; a laboratory course
manual"; Cold Spring Harbor Laboratory, págs.
131-132, (1990). La cepa S288C de Sa.
cerevisiae se inoculó en 10 ml de medio YPD y se cultivó a 30ºC
durante una noche. Las células cultivadas se recogieron y
suspendieron en 0,5 ml de agua esterilizada para su lavado. Después
de descartar el sobrenadante, la levadura se recogió nuevamente. Se
agregaron 0,2 ml de la mezcla (Triton X-100 al 2%,
SDS al 1%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8), EDTA
1 mM), 0,2 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25/24/1
(v/v/v)) y 0,3 g de perlas de vidrio. Después de mezclar mediante
batido durante 3-4 minutos, se agregaron 200 \mul
de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, (pH 8), EDTA 1 mM). A
continuación, la solución se centrifugó durante 5 minutos, y el
sobrenadante se transfirió a otro tubo y se agregó 1 ml de etanol. A
continuación, la solución se centrifugó nuevamente durante 2
minutos. El gránulo resultante se disolvió en 0,4 ml de tampón TE.
A continuación, se agregaron 2 \mul de ARNasa A (10 mg/ml) y la
solución se dejó en reposo durante 5 minutos a 37ºC. A
continuación, se agregaron 10 \mul de acetato amónico 4 M y 1 ml
de etanol. Después de mezclarla bien, la solución se centrifugó
durante 2 minutos y el gránulo resultante se recuperó. Después de
secar el gránulo, este se disolvió con 50 \mul de tampón TE para
obtener el ADN total de la cepa S288C de S. cerevisiae.
Mediante este procedimiento de preparación, se obtuvieron 3,4 \mug
de ADN total.
\vskip1.000000\baselineskip
En base a secuencia de nucleótido del gen IPP
isomerasa de S. cerevisiae informada en la referencia
anteriormente mencionada (Anderson, M.S., Muehlbacher, M., Street,
I.P., Profitt, J., Poulter, C.D., "Isopentenyl diphosphate:
dimethylallyl diphosphate isomerase - an improved purification of
the enzime and isolation of the gene from Saccharomyces
cerevisiae", J. Biol. Chem., vol. 264, págs.
19169-19175, (1989)), se sintetizaron los cebadores
siguientes.
| Cebador No. | 1 5'-TCGATGGGGGTTGCCTTTCTTTTTCGG-3' |
| Cebador No. | 2 5'-CGCGTTGTTATAGCATTCTATGAATTTGCC-3' |
El procedimiento se diseñó con el fin de obtener
gen IPP isomerasa amplificado mediante PCR conteniendo sitios
TaqI en el terminal más arriba y la región AccII en el
terminal más abajo. Se llevaron a cabo 30 ciclos de PCR con 200 ng
de ADN total de S. cerevisiae y PfuDNA polimerasa
(STRATAGENE). Para expresar el gen IPP isomerasa obtenido mediante
PCR en E. coli, este se digerió tanto con TaqI como
con AccII. A continuación, el gen se insertó dentro de
sitios ClaI y sitios SmaI del vector pBluescript KS+.
Al plásmido resultante se le denominó pSI1 (Figura 11). Este ADN
obtenido de S. cerevisiae tenía una secuencia de nucleótido
constituida por 1.058 bp (SECUENCIA ID No. 6) y contenía un gen que
codifica IPP isomerasa constituido por 288 aminoácidos
(correspondientes a desde E hasta F en las Figuras 8 y 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de la cepa JM101 de E. coli
productora de licopeno (abreviada como L aquí en adelante) que
contiene pACCRT-EIB (Figura 10), se introdujeron
respectivamente el vector pSPORT1, el plásmido pRH1 que contiene el
gen IPP isomerasa de Phaffia rhodozyma, el plásmido pHP11 que
contiene el gen IPP isómerasa de Haematococcus pluvialis o
el plásmido pSI1 que contiene el gen IPP isómerasa de
Saccharomyces cerevisiae (Figura 11). A continuación, estos
transformantes de E. coli se sembraron sobre la placa LB que
contenía 150 \mug/ml de ampicilina (Ap), 30 \mug/ml de
cloramfenicol (Cm) y 1 mM de IPTG, y se cultivaron a 28ºC durante
una noche. Las tres cepas, en las cuales se introdujeron cada gen
IPP isomerasa, mostraron color rojizo intenso debido a la
producción de licopeno comparado con el control (E coli
productor de licopeno) en el cual se introdujo únicamente el
vector. Además, la velocidad de desarrollo de las tres cepas sobre
placas de agar fue más rápida que las cepas de control durante el
cultivo. Se consideró que, debido a la introducción y expresión del
gen IPP isomerasa, más arriba de la vía de biosíntesis a FPP la hace
ser más eficaz (véase Figura 1) y, en consecuencia, el incremento
de suministro de FPP conduce a un incremento de licopeno. En cuanto
a la velocidad de desarrollo más rápido, se consideró igualmente
que debido al incremento de FPP, puede suministrarse cantidad
suficiente del substrato no solamente para la producción de licopeno
sino además para la producción de otros componentes de membrana
obtenidos de FPP, es decir, proteína de unión de FPP o GGPP, y estos
componentes son necesarios para el desarrollo de E.
coli.
El incremento de cantidad de producción de
licopeno mediante E. coli que porta el gen IPP isomerasa se
confirmó igualmente mediante cultivo del líquido. Después de cultivo
con agitación durante una noche del medio LB (5 ml) que contenía
tanto Ap como Cm a 28ºC, se tomaron 2 ml del medio y se
transfirieron a 200 ml de medio de cultivo 2YT (bactotriptona al
1,6%, extracto de levadura al 1%, NaCl al 0,5%) que contenía Ap, Cp
e IPTG 0,1 mM, y se llevó a cabo la agitación del cultivo a 230
rpm, a 28ºC. Se tomaron muestras de 5 ml de cada medio a intervalos
de diversas horas para determinar la velocidad de desarrollo y el
contenido de licopeno. La velocidad de desarrollo se determinó a
partir de la absorbancia a 650 nm. El contenido en licopeno se
determinó de acuerdo con el procedimiento siguiente. Las células se
recogieron mediante centrifugación, se agregaron 2,5 ml de acetona
a las células y se dejaron reposar durante 30 minutos. Se mezclaron
por batido según necesidad. Después de filtración, se midió la
absorbancia a 474 nm para determinar el contenido en licopeno en
base a la absorbancia a 185,0 para licopeno 1 mM (paso de luz: 1
cm). Se usó un espectrofotómetro JASCO UVIDEC-220B.
Mediante el uso de HPLC, se confirmó que estas cepas realmente
produjeron licopeno y la absorbancia a 474 nm es atribuible al
licopeno. En el Ejemplo 11 se mencionan las condiciones de la HPLC.
Los resultados se muestran en la Figura 12 (curva de desarrollo) y
la Figura 13 (curva de producción de licopeno). En cuanto a la
velocidad de desarrollo (Figura 12), no existe diferencia entre
ninguna de las cepas incluyendo las cepas de control. Este
resultado es diferente del obtenido a partir de las placas de
cultivo. Probablemente, cuando se llevó a cabo el cultivo del
líquido, incluso en la cepa de control que no tiene gen IPP
isomerasa exógeno puede desarrollarse rápidamente, puesto que el
suministro del substrato por los componentes de membrana tal como
la proteína de unión de FPP y GGPP es suficiente comparado con
cuando se realiza el cultivo en agar. Por el contrario, existe una
gran diferencia entre la cepa de control que no tiene gen IPP
isomerasa exógeno y las tres cepas que portan el gen IPP isomerasa
exógeno. Durante el cultivo, las tres cepas siempre mostraron
cantidad de producción de licopeno varias veces mayor comparada con
la cepa de control. En la Figura 14 se muestra la cantidad de
producción de licopeno por peso seco de E. coli a las 28
horas después del inicio del cultivo. Las tres cepas que contienen
el gen IPP isomerasa mostraron una producción
3,6-4,5 veces mayor que la cepa de control. El
E. coli productor de licopeno que contiene pHP11 es capaz de
producir 1,03 mg de licopeno por 1 g de peso seco.
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de la cepa JM101 de E. coli
productora de \beta-caroteno (abreviada como
\beta aquí en adelante) que contiene pACCAR16\DeltacrtX (Figura
10), se introdujeron por separado o bien el vector pSPORT1 o bien
el plásmido pRH1 que contiene el gen IPP isomerasa de Phaffia
rhodozyma. Después de cultivo bajo agitación durante una noche
del medio LB (5 ml) que contiene tanto Ap como Cm a 28ºC, se tomó 1
ml del medio y se transfirió a 100 ml del medio 2YT que contiene
Ap, Cm e IPTG 0,1 mM, y el cultivo bajo agitación se llevó a cabo a
230 rpm a 28ºC durante 28 horas. Las bacterias se recogieron
mediante centrifugación y se lavaron con NaCl al 0,85%. Después del
lavado, las bacterias se suspendieron en 40 ml de acetona y se
dejaron reposar durante 30 minutos. Se mezclaron por batido según
necesidad. Después de filtración, se midió la absorbancia a 454 nm
para determinar el contenido en \beta-caroteno en
base a la absorbancia a 134,4 para \beta-caroteno
1 mM (paso de luz: 1 cm). En la Figura 14 se muestra el resultado.
El E. coli productor de \beta-caroteno que
contiene pRH1 produjo 709 \mug de \beta-caroteno
por 1 g de peso seco. Esta cantidad es 1,5 veces mayor que la del
control.
Mediante el uso de HPLC sobre extracto en
acetona anterior, se confirmó que estas cepas realmente produjeron
\beta-caroteno y la absorbancia a 454 nm es
atribuible al \beta-caroteno. Como columna, se usó
Novapack HR 6 \mu C18 (3,9 x 300 mm, Waters). Como diluyente de
elución, se usó acetonitrilo/metanol/2-propanol
(90/6/4 (v/v/v)). Se usó un detector de dispositivo de fotodiodo
996 (Waters) para controlar un perfil de elución. Los resultados
mostraron que casi el 100% de un pico que apareció en un espectro
visible es \beta-caroteno. Como preparación
convencional de \beta-caroteno, se usó
\beta-caroteno químicamente sintetizado
(Sigma).
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de la cepa JM101 de E. coli
productora de fitoeno (abreviada como P aquí en adelante) que
contiene pACCRT-EB (Figura 10), se introdujeron por
separado cualquiera de entre el vector pSPORT1, el plásmido pRH1
que contiene el gen IPP isomerasa de Phaffia rhodozyma o el
plásmido pHP11 que contiene el gen IPP isomerasa de
Haematococcus pluvialis. Después de cultivo bajo agitación
durante una noche del medio LB (5 ml) que contiene tanto Ap como Cm
a 28ºC, se tomó 1 ml del medio y se transfirió a 100 ml del medio
2YT que contiene Ap, Cm e IPTG 0,1 mM, y el cultivo bajo agitación
se llevó a cabo a 230 rpm a 28ºC durante 28 horas. Las bacterias se
recogieron mediante centrifugación y se lavaron con NaCl al 0,85%.
Después del lavado, las bacterias se suspendieron en 40 ml de
acetona y se dejaron reposar durante 30 minutos. Se mezclaron por
batido según necesidad. Después de filtración y secado mediante
evaporador rotatorio, se llevó a cabo el reparto con 40 ml de éter
de petróleo y agua. Se midió la absorbancia de la capa de éter a 286
nm para determinar el contenido en fitoeno en base a la absorbancia
a 41,2 para fitoeno 1 mM (paso de luz: 1 cm). El análisis mediante
HPLC descrito en el Ejemplo 11 mostró que el 70% de la absorbancia
a 286 nm es atribuible al fitoeno, e igualmente el contenido real
de fitoeno se ajustó al 70% del valor anterior. En la Figura 14 se
muestra el resultado. El E. coli productor de fitoeno que
contiene el gen IPP isomerasa produjo 1,7-2,1 veces
más fitoeno que la cepa de control.
A partir de los ejemplos anteriores, los
presentes inventores han mostrado que mediante la introducción del
gen IPP isomerasa dentro de E. coli productor de
\beta-caroteno, licopeno y fitoeno, se logró
realmente una producción de carotenoide varias veces mayor. Se
considera que debido a la introducción y expresión del gen IPP
isomerasa, más arriba de la vía de biosíntesis a FPP, se vuelve más
eficaz (véase Figura 1) y, en consecuencia, incrementa el
suministro de FPP dando lugar a un incremento de estos carotenoides.
Por ello, se considera que estos hallazgos pueden ser aplicables no
solamente para producciones de \beta-caroteno,
licopeno y fitoeno, sino además para todos los otros carotenoides
tales como astaxantina y zeaxantina.
Se describe una cadena de ADN que puede
incrementar de manera significativa la producción de carotenoide en
la biosíntesis de carotenoide por microorganismos y un procedimiento
para obtener una cantidad de producción de carotenoide varias veces
mayor mediante la introducción y expresión de dicha cadena de ADN
dentro de microorganismos que producen carotenoide. Es de esperar
que dicha cadena de ADN pueda ser aplicable para incrementar la
producción en microorganismos no solamente para carotenoides sino
también para terpenoides, etc., los cuales requieren el mismo
substrato (FPP) que los carotenoides.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> HEBRA DE ADN ÚTIL EN EL INCREMENTO
DEL RENDIMIENTO DE CAROTENOIDE
\vskip1.000000\baselineskip
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<130>
PH-294PCT-EP
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<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaffia rhodozyma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haematococcus pluvialis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1099
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phaffia rhodozyma
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (99)..(851)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 1074
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Haematococcus pluvialis
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (145)..(921)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 1058
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisae
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (187)..(1050)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (1)
1. Un procedimiento para la producción de
carotenoides que comprende la introducción de un ADN de uno
cualquiera de los siguientes (a) a (c) dentro de un organismo que
produce carotenoides, el cultivo de dichos organismos transformados
y la obtención de carotenoides en el caldo de cultivo y células:
(a) un ADN que contiene una secuencia de
nucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácido descrita en una cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2
y SEC. ID NO:3 y que tiene actividad isopentenil (IPP)
isomerasa;
(b) un ADN que contiene una secuencia de
nucleótido que se hibrida con el ADN de (a) anterior bajo
condiciones restrictivas, y de codificación de un polipéptido que
tiene actividad isopentenil (IPP) isomerasa;
(c) un ADN que es un isómero degenerado del ADN
de (a) anterior y de codificación de un polipéptido que tiene
actividad isopentenil (IPP) isomerasa.
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