ES2321242T3 - Proceso de purificacion de igf-1. - Google Patents

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ES2321242T3
ES2321242T3 ES96912727T ES96912727T ES2321242T3 ES 2321242 T3 ES2321242 T3 ES 2321242T3 ES 96912727 T ES96912727 T ES 96912727T ES 96912727 T ES96912727 T ES 96912727T ES 2321242 T3 ES2321242 T3 ES 2321242T3
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Russell A. Brierley
Joan N. Abrams
John M. Hanson
Francis C. Maslanka
Cynthia Cowgill
Luis G. Juarbe-Osorio
Patricio Riquelme
Glenn Dorin
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Cephalon LLC
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NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC
Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Cephalon LLC
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/65Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • GPHYSICS
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Abstract

SE DESCUBRE UN PROCESO PARA OBTENER FACTOR DE CRECIMIENTO I SIMILAR A INSULINA (TAMBIEN CONOCIDO COMO SOMATOMEDINA C) CORRECTAMENTE PLEGADO, INTACTO, MONOMERICO Y PURIFICADO. EL PROCESO INCLUYE LA ADICION DE UNA ETAPA DE DESPLEGAMIENTO/REPLEGAMIENTO DE IGF EN FASE REVERSA POR UNA ETAPA DE CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRACION PARA AUMENTAR EL RENDIMIENTO FINAL. EL PROCESO INCLUYE TAMBIEN LAS SIGUIENTES ETAPAS, EN ORDEN: PRIMER INTERCAMBIO CATIONICO, DESPLEGAMIENTO/REPLEGAMIENTO, CROMATOGRAFIA DE INTERACCION HIDROFOBICA, SEGUNDO INTERCAMBIO CATIONICO, Y CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA.

Description

Proceso de purificación de IGF-1.
Esta invención se refiere a purificación de proteínas.
El factor de crecimiento de tipo insulina I ("IGF-I"; también conocido como "somatomedina-C") es un factor de crecimiento de mamíferos esencial para el crecimiento y desarrollo normal. Tiene efectos de tipo insulina en músculo y tejido adiposo, y tiene efectos mitogénicos sobre varios tipos celulares. IGF-I tiene una variedad de usos clínicos. Por ejemplo, se puede usar para potenciar la supervivencia de neuronas como neuronas colinérgicas no mitóticas (Lewis y cols., Patente de EE.UU Nº 5,093,317).
Se conoce la secuencia de aminoácidos completa de la proteína IGF-I, y el ADN que codifica IGF-I humano se ha clonado y expresado en E. Coli y levaduras (véase, por ejemplo, Brierley y cols., Patente de EE.UU Nº 5,324,639). La proteína IGF-I humana consiste en un solo polipéptido de 70 aminoácidos que incluye seis restos de cisteina, los cuales participan en la formación de tres uniones intracatenarias disulfuro (Axelsson y cols., Eur. J. Biochem. 206:987 (1992)). Las tres uniones disulfuro, con todos los tres restos de cisteina correctamente apareados, son necesarias para que IGF-I tenga su correcta (es decir, natural) estructura terciaria. En la reducción y reoxidación de las uniones disulfuro, IGF-I puede replegarse de varias formas, formando tantas como 15 configuraciones monoméricas (Meng y cols., J. Chrom. 433:183 (1988)). Además, los polipéptidos de IGF-I pueden interaccionar entre sí para formar estructuras multiméricas. Se han publicado procesos para obtener IGF-I purificado plegado correctamente (véase, por ejemplo, Holtz y cols., Patente de EE.UU Nº 5,231,178 ("Holtz"); Chang y cols., Patente de EE. UU Nº 5,288,931; y Hart y cols., Biotech. Appl. Biochem. 20:217 (1994)).
Se ha descubierto un proceso mejorado para obtener IGF-I purificado, monomérico, intacto, correctamente plegado (es decir, "auténtico"). Más particularmente, se ha descubierto cómo aumentar, en al menos tres veces, el rendimiento final de IGF-I auténtico obtenido en el proceso de purificación de IGF-I descrito en Holtz (arriba). El aumento del rendimiento se obtiene fundamentalmente: (1) incluyendo una etapa de desplegamiento/replegamiento de la proteína IGF-I, llevado a cabo tras la primera etapa de cromatografía de catión; y (2) sustituyendo la etapa de filtración en gel descrito en Holtz por una etapa de cromatografía en fase reversa.
Por consiguiente, la invención caracteriza un proceso para la purificación del polipéptido IGF-I monomérico, intacto, correctamente plegado a partir de un medio que contiene polipéptidos IGF-I, comprendiendo dicho proceso las etapas de:
(i) poner en contacto el medio con una cantidad suficiente de una primera matriz de intercambio catiónico bajo condiciones que permiten la adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% de IGF-I total a partir del medio;
(ii) lavar la primera matriz de intercambio catiónico cargada con IGF-I con un primer tampón de lavado de intercambio catiónico;
(iii) eluir todas las formas de IGF-I adsorbidas a partir de la matriz de intercambio catiónico de la etapa (i) poniendo en contacto dicha matriz de intercambio catiónico con una cantidad suficiente de un primer tampón de elución de intercambio catiónico, que tiene un pH o fuerza iónica suficientemente altos para desplazar sustancialmente todos dichos IGF-I auténticos y no auténticos a partir de dicha matriz de intercambio catiónico;
(iv) poner en contacto IGF-I eluído a partir de la etapa (iii), tras transferirlo dentro de un sistema disolvente adecuado, con una cantidad suficiente de una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica bajo condiciones que permitan la adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% de dicho IGF-I a partir de dicho eluato;
(v) lavar la matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica cargada de IGF-I con un tampón de lavado de interacción hidrofóbica que tiene una fuerza iónica lo suficientemente baja como para eliminar la mayoría de los IGF-I no auténticos, pero no tan baja como para eliminar una proporción importante de IGF-I auténtico de la matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica.
(vi) eluir IGF-I adsorbido a partir de dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica poniendo en contacto dicha matriz con un tampón de elución de interacción hidrofóbica, que tiene un pH lo suficientemente alto, o una fuerza iónica lo suficientemente baja, como para causar desplazamiento de sustancialmente todo el IGF-I auténtico adsorbido de dicha matriz;
(vii) contactar el eluato de la etapa (vi) con una cantidad suficiente de una segunda matriz de intercambio catiónico bajo condiciones que permiten adsorción de, al menos, aproximadamente 95% del IGF-I a partir del eluato;
(viii) lavar la segunda matriz de intercambio catiónico cargada con IGF-I con un tampón de lavado de intercambio catiónico que tiene una fuerza iónica lo suficientemente alta, o pH suficientemente alto, como para eliminar una porción importante de IGF-I no auténtico, pero no tan alto como para eliminar una proporción significativa de IGF-I auténtico;
(ix) eluir el IGF-I adsorbido a partir de dicha segunda matriz de intercambio catiónico por contacto de dicha matriz con un segundo tampón de elución de intercambio catiónico, que tiene una fuerza iónica lo suficientemente alta, o pH suficientemente alto, como para desplazar sustancialmente todo el IGF-I auténtico adsorbido a partir de dicha matriz; y
(x) someter el IGF-I auténtico eluido a partir de la etapa (ix) a otra etapa de cromatografía;
caracterizado porque, el lavado de la etapa (ii) comprende aplicar 3,0 volúmenes de columna de ácido acético
0,02 M, seguido de 3,0 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5), a dicha primera matriz de intercambio catiónico, con el fin de eliminar una cantidad sustancial de material de no IGF-I adsorbido sin eliminar una cantidad sustancial de IGF-I auténtico o no auténtico, previamente a la etapa (iv); el eluato que contiene IGF-I del la etapa (iii) se transfiere a un tampón de desplegamiento/replegamiento, que comprende urea entre 1,5 y 3,0 M, cloruro sódico entre 1,0 y 3,0 M, entre 5% y 20% (v/v) de etanol, borato sódico entre 1 mM y 15 mM, y ditiotreitol d entre 0,005 mM y 10.0 mM, y que tiene un pH entre 8,5 y 10,0, con el fin de: (a) reducir las uniones disulfuro intracatenarias de la proteína IGF-I y promover desplegamiento sin desnaturalización permanente; y (b) permitir replegamiento del IGF-I y reoxidación para formar uniones disulfuro intracatenarias correctamente emparejadas, para formar IGF-I replegado; y más aún, caracterizado por que la etapa de cromatografía de la etapa (x) es una etapa de cromatografía en fase reversa que comprende: (c) poner en contacto el eluato de la etapa (ix), en un tampón acuoso, con una matriz de resina polimérica de cromatografía en fase reversa para adsorber, al menos, 95% del IGF-I del eluato; (d) lavar la matriz de cromatografía en fase reversa cargada de IGF-I con un tampón de lavado en fase reversa acuoso/orgánico, donde dicha etapa de lavado comprende aplicar un volumen de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 0% de etanol, seguido de 4 volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contiene 19% de etanol, a dicha matriz de cromatografía en fase reversa, con el fin de eliminar una proporción sustancial de IGF-I no auténtico pero no eliminar una proporción significativa de IGF-I auténtico; y (e) eluir el IGF-I adsorbido de dicha matriz de cromatografía en fase reversa por elución con un tampón acuoso/orgánico, donde dicha etapa de elución comprende aplicar a dicha matriz de cromatografía en fase reversa cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 19% de etanol, seguido de un gradiente de 19% a 25% de etanol (v/v), en ácido acético 0,2 M, donde el gradiente se selecciona del grupo que consiste en gradiente lineal y gradiente de paso, con el fin de eliminar sustancialmente todo el IGF-I auténtico sin eliminar una proporción significativa de formas multiméricas de IGF-I.
Realizaciones preferidas de la invención se describen abajo o se definen en las reivindicaciones dependientes.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "auténtico" significa IGF-I monomérico, intacto, correctamente plegado, con tres uniones disulfuro intracatenarias que implican restos de cisteina apareados, es decir, apareados como en IGF-I natural.
Tal como se utiliza aquí, el término "volumen de columna" significa el volumen ocupado por una matriz de cromatografía, incluyendo líquido intersticial.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "degradado" significa IGF-I en el que se han escindido una o más de las uniones covalentes presentes en la estructura polipeptídica o en las cadenas laterales de aminoácidos del IGF-I auténtico.
Tal como se utiliza aquí, IGF-I "des-2" significa IGF-I que pierde los dos primeros restos de aminoácido del IGF-I auténtico.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "glucosilado"significa IGF-I con uno o más restos de carbohidratos covalentemente unidos.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "intacto" significa IGF-I que no está degradado.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "mal plegado" significa IGF-I cuya estructura secundaria es otra de la de IGF-I auténtico.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "multimérico" significa dos o más cadenas polipeptídicas de IGF-I unidas por uniones químicas covalentes o no covalentes.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "oxidado" significa IGF-I que contiene, al menos, un resto aminoacídico oxidado.
Tal como se utiliza aquí, el término IGF-I "reoxidado" significa IGF-I en el que se forman una o más uniones disulfuro intracatenarias, tras escisión de aquellas uniones.
Tal como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" en referencia a un valor numérico significa +/-10% del valor, por ejemplo, "aproximadamente" 50% significa entre 45% y 55%.
La Fig. 1 es un gráfico de flujo que compara las etapas del proceso de Holtz con los pasos de una realización de la invención.
La Fig. 2 es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la primera etapa de intercambio catiónico del proceso de Holtz.
La Fig. 3 es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la primera etapa de intercambio catiónico de la invención.
La Fig. 4A una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado antes de la etapa de desplegamiento/replegamiento en la invención.
La Fig. 4B es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado tras la etapa de desplegamiento/replegamiento en el proceso de la invención.
La Fig. 5A es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la etapa HIC en el proceso de Holtz.
La Fig. 5B es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la etapa HIC en el proceso de la invención.
La Fig. 6A es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la segunda etapa de la cromatografía de intercambio catiónico en el proceso de Holtz.
La Fig. 6B es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la segunda etapa de la cromatografía de intercambio catiónico en la invención
La Fig. 7A es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la etapa de cromatografía de filtración en gel en el proceso de Holtz.
La Fig. 7B es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir de la etapa de cromatografía en fase reversa en la invención.
La Fig 8A es una escala analítica de un ciano cromatograma en fase reversa de material producido por el proceso de Holtz.
La Fig. 8B es una escala analítica típica de un ciano cromatograma en fase reversa de material purificado por el proceso de la invención.
La Fig. 9A es una escala analítica típica de un cromatograma HPLC C8 en fase reversa de material purificado por el proceso de Holtz.
La Fig. 9B es una escala analítica de un cromatograma HPLC C8 en fase reversa de material purificado por el proceso de la invención.
La Fig. 10A es una escala analítica de un cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico generados a partir de material reducido purificado por el proceso de Holtz.
La Fig. 10B es una escala analítica de un cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico generados a partir de material reducido purificado por el proceso de la invención.
La Fig. 11A es una escala analítica de un cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico generados a partir de material no reducido purificado por el método de Holtz.
La Fig. 11B es una escala analítica de un cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico generados a partir de material no reducido purificado por el método de la invención.
La Fig. 12A es una escala analítica de un cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico generados a partir de material IGF-I no reducido correctamente plegado.
La Fig. 12B es una escala analítica de un cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico generados a partir de material IGF-I no reducido no plegado.
La invención proporciona un proceso mejorado para la purificación de IGF-I monomérico, intacto, correctamente plegado.
Material de Partida de IGF-I y Extracción Celular
El material de partida de IGF-I con el que se pone en práctica la invención puede ser un medio contaminado con varias sales, ácidos, bases, moléculas orgánicas pequeñas, macromoléculas no proteicas, proteínas no IGF-I, fragmentos de IGF-I, IGF-I multimérico, IGF-I plegado incorrectamente, o cualquier combinación de lo anterior. El IGF-I puede ser de fuentes naturales o puede ser IGF-I recombinante producido por células eucarióticas transformadas genéticamente. En una realización preferida, el GF-I es IGF-I recombinante producido por levaduras transformadas genéticamente. En una realización particularmente preferida, el IGF-I es producido en cepas GS115 de Pichia pastoris (NRRL Y-15851) transformadas de forma estable con el vector de expresión pIGF201, pIGF202, pIGF204 o pIGF206. La producción de IGF-I en la cepa GS115 de Pichia pastoris utilizando vectores de expresión pIGF201, pIGF202, pIGF204 e pIGF206 está descrita en Brierley y cols., Patente de EE.UU Nº 5,324,639.
Preferiblemente, esta invención se pone en práctica con IGF-I recombinante, que es secretado por células de levadura transformadas. La secreción por las células de levaduras se da como resultado cuando las células de levadura han sido transformadas con un vector de expresión de IGF-I que codifica una proteína precursora de IGF-I que comprende un péptido señal N-terminal. El péptido señal causa la secreción de la proteína precursora de IGF-I a través de la membrana plasmática de la célula de levadura al medio de crecimiento. Durante el proceso de secreción, el péptido señal es escindido para dar lugar al polipéptido IGF.I maduro.
Cuando la invención se pone en práctica con células de levadura recombinante, el IGF-I es secretado al medio durante un proceso de fermentación. Etapas/procesos de fermentación particularmente preferidos están descritos en la Patente de EE.UU Nº 5,324,639. Utilizando la fermentación particularmente preferida que se muestra en la Patente de EE.UU Nº 5,324,639, la cantidad de trazas de sales "PTM1" añadidas durante la fermentación se pueden reducir beneficiosamente a aproximadamente 10 veces, con una sola adición de 2 ml por litro de medio de partida. Preferiblemente, los niveles de ácido sulfúrico, cobre, zinc y hierro en el "PTM1" se reducen 3 veces en comparación con el proceso descrito en la patente 5,324,639.
Cuando la invención se pone en práctica con IGF-I recombinante secretado, la célula hospedadora debe ser separada del medio que contiene IGF-I. La eliminación celular puede darse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, centrifugación o microfiltración, o ambos.
Primera Etapa de Intercambio Catiónico
Tras la separación de la célula hospedadoralar, la primera etapa en el proceso de esta invención es poner en contacto una solución muestra que contiene IGF-I con una cantidad adecuada de una primera matriz de intercambio catiónico bajo condiciones que permitan la adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% del IGF-I total de la solución.
La solución que contiene IGF-I puede ponerse en contacto con la primera matriz de intercambio catiónico de varias maneras. Por ejemplo, la primera matriz de intercambio catiónico puede estar dentro de un recipiente, dentro del cual se introduce el medio que contiene IGF-I, y después se decanta el medio reducido en IGF-I a partir de la primera matriz de intercambio catiónico. De forma alternativa, la primera matriz de intercambio catiónico puede añadirse al recipiente que contiene el medio que contiene IGF-I, seguido de separación de la solución reducida en IGF-I a partir de la primera matriz de intercambio catiónico. Preferiblemente, la primera matriz de intercambio catiónico está en una columna a través de la cual se permite el flujo del medio que contiene IGF-I.
Las matrices que pueden utilizarse en la primera etapa de intercambio catiónico son bien conocidas en la materia. Preferiblemente, la matriz de intercambio catiónico es compatible con un una relación de flujo alta, es decir, capaz de soportar altas presiones, posee una estructura microporosa, y es capaz de unir IGF-I a lo largo de un amplio intervalo de pH. Se pueden utilizar soportes de matriz como celulosa, poliestireno, dextranos, agarosa, y agarosa reticulada para la primera matriz de intercambio catiónico. Las matrices de intercambio catiónico preferidas para usar en esta etapa son matrices sulfilpropiladas ("SP"). Una matriz de intercambio catiónico particularmente preferida es Toyopearl SP550C^{TM} (TosoHaas, Philadelphia, PA).
Un experto en la materia está acreditado con el reconocimiento que antes de poner en contacto la muestras de solución que contiene IGF-I con la primera matriz de intercambio iónico, es necesario que la matriz sea regenerada y/o activada. La regeneración y/o activación se llevará a cabo de acuerdo a la recomendación del proveedor de la matriz y los métodos conocidos en la materia.
La cantidad del material de la primera matriz de intercambio catiónico utilizado es típicamente, al menos, aproximadamente 0,031, a 1,0 litros de matriz por gramo de IGF-I auténtico. Típicamente, la solución que contiene IGF-I se pone en contacto con la primera matriz de intercambio iónico durante aproximadamente 0,01 a 1 hora, o más, a una temperatura de aproximadamente 2º a 30ºC. Una temperatura de aproximadamente 20º a 25ºC es preferida.
Una vez que la solución que contiene IGF-I ha estado en contacto con la primera matriz de intercambio catiónico para permitir la adsorción de IGF-I, la solución reducida en IGF-I se separa. Esto se puede hacer de varias formas, por ejemplo, filtración, decantación, o centrifugación. En una realización preferida, el contacto de la solución que contiene IGF-I y la separación del medio reducido en IGF-I se hacen en una etapa, haciendo pasar el medio que contiene IGF-I a través de una columna de cromatografía que comprende la primera matriz de intercambio catiónico.
Una vez que IGF-I ha sido adsorbido dentro de la primera matriz de intercambio catiónico, y antes de la elución de IGF-I, la matriz cargada con IGF-I se lava con 3,0 volúmenes de columna de ácido acético 0,02 M; seguido de aproximadamente 3.0 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5).
En algunos procesos descritos previamente, la primera columna de intercambio catiónico cargada con IGF-I además se lava con un ácido débil diluido (o tampón) que contiene sal, por ejemplo, cloruro sódico 0,1 M, para eliminar impurezas, incluyendo formas multiméricas y/o monoméricas mal plegadas de IGF-I, que están menos fuertemente unidas a la primera matriz de intercambio catiónico de lo que está IGF-I. En la presente invención, dichas etapas de lavado de alta fuerza iónica se evitan en la primera etapa de intercambio catiónico, porque es ventajoso recuperar formas multiméricas o monoméricas mal plegadas de IGF-I, que pueden ser convertidas en IGF-I auténtico en la subsiguiente etapa de desplegamiento/replegamiento, incrementando, con ello, el rendimiento global de IGF-I auténtico.
Una vez que la primera matriz de intercambio catiónico cargada de IGF-I ha sido lavada (tal como se describe arriba), se eluye el IGF-I por contacto de la matriz con una cantidad suficiente de un sistema disolvente ("tampón de elución") que tiene un pH o fuerza iónica lo suficientemente altos como para desplazar sustancialmente todo el IGF-I de la matriz.
El tampón de elución comprenderá un agente tamponante adecuado para mantener un pH en el intervalo de 5,0 a 7,0, y una concentración salina de aproximadamente 0,2 a 1,0 M. Un tampón de elución preferido consiste en acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) y cloruro sódico 0,4 M.
La cantidad de tampón de elución utilizada es variable, pero preferiblemente es entre 3 y 10 volúmenes de columna. Cuando el tampón de elución cosiste en acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) y cloruro sódico 0,4 M, la cantidad de tampón de elución preferida es cuatro volúmenes de columna.
La elución de IGF-I de la matriz de intercambio catiónico se puede hacer bajo varias condiciones. Preferiblemente, se emplea una temperatura de aproximadamente 2º a 30ºC. Preferiblemente, el tiempo de elución es relativamente corto, es decir, aproximadamente 0,01 a 1,0 horas, aunque se pueden emplear tiempos más largos o cortos.
Etapa de desplegamiento/replegamiento de IGF-I
Una característica esencial de esta invención es la inclusión de una etapa de desplegamiento/replegamiento de IGF-I, seguido de la etapa de primer intercambio catiónico. Para la etapa de desplegamiento/replegamiento, el eluato de intercambio catiónico se transfiere a un tampón que promueve intercambio de uniones disulfuro ("tampón de desplegamiento/replegamiento"). Dicha transferencia puede ser por cualquiera de varias maneras, incluyendo dilución, filtración en gel, diálisis, o diafiltración.
El tampón de desplegamiento/replegamiento, generalmente, puede estar caracterizado como alcalino, débilmente reductor, débilmente desnaturalizante y solubilizante. El tampón puede ser capaz de: 1) reducir las uniones disulfuro intracatenarias del IGF-I y promover desplegamiento de la proteína IGF-I sin desnaturalización permanente; y (2) permitir replegamiento del IGF-I con reoxidación, para formar uniones disulfuro intracatenarias correctamente emparejadas de IGF-I.
El tampón de desplegamiento/replegamiento tiene un pH de entre 8,5 y 10,0 y comprende urea a una concentración de 1,5 a 3,0 M, cloruro sódico a una concentración de 1,0 a 3,0 M, etanol a una concentración de 5 a 20% (v/v), borato sódico a una concentración de 1 mM a 15 mM, y ditiotreitol a una concentración de 0,005 mM a 10 mM. Lo más preferiblemente, el pH del tampón de desplegamiento/replegamiento está entre aproximadamente 9,0 y 9,5 y el tampón consiste en urea 2 mM, cloruro sódico 1,5 mM, etanol al 15%, borato sódico 5 mM y DTT 0,2 mM.
Preferiblemente, la concentración total de IGF-I está entre aproximadamente 0,1 y 5 mg/ml; más preferiblemente, esta concentración está entre 0,2 y 2 mg/ml.
Preferiblemente, la composición del tampón de desplegamiento/replegamiento y las concentraciones de los componentes son tales que el replegamiento y la reoxidación comienza dentro de una hora del desplegamiento y la reducción, y esencialmente se completa dentro de 4 a 40 horas. Más preferiblemente, el replegamiento y la reoxidación esencialmente se completan dentro de 15 a 20 horas.
Cuando se utiliza el tampón de desplegamiento/replegamiento más preferido (descrito arriba), la reducción de disulfuro puede ocurrir en segundos. Con agitación suave en presencia de aire, a temperatura ambiente, la reoxidación puede comenzar dentro de aproximadamente una hora. El replegamiento y reoxidación esencialmente se completan dentro de aproximadamente 15 a 20 horas.
Etapa de Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)
Tras la etapa de desplegamiento/replegamiento, el IGF-I parcialmente purificado y replegado se pone en contacto con una cantidad suficiente de una matriz HIC, para adsorber, al menos, aproximadamente el 95% del IGF-I. Preferiblemente, la matriz HIC está en una columna a través de la cual pasa el tampón que contiene IGF-I.
Previamente a contactar una solución de IGF-I replegado con la matriz HIC, se ajusta el pH y la concentración salina de la muestra que contiene IGF-I. Preferiblemente, el pH se ajusta a entre 4,0 y 5,0, y la concentración salina se ajusta a entre 0,4 M y 2,0 M. Más preferiblemente el pH se ajusta a entre 4,0 y 4,5, y la concentración salina se ajusta a entre 1,0 y 1,5 M.
Aumentando la concentración salina del medio que contiene IGF-I se promueve la unión de IGF-I a la matriz HIC. Sales adecuadas para dicho uso incluyen sulfato sódico, sulfato potásico, sulfato amónico, fosfato potásico, acetato sódico, acetato amónico, cloruro sódico, citrato sódico.
Matrices HIC adecuadas para uso en esta invención son matrices HIC alquil o aril-sustituidas. Matrices HIC ilustrativas incluyen matrices butil-, octil-, o fenil-sustituidas. Soportes de matrices HIC útiles en la práctica de la presente invención incluyen polímeros sintéticos, por ejemplo, poliestireno, poli(metacrilatos), etc; celulosa, dextranos, agarosa, agarosa reticulada.
Una matriz HIC particularmente preferida es una matriz de polimetacrilato de cromatografía de interacción hidrofóbica butil-sustituida (por ejemplo, Toyopearl Butyl 650M^{TM}o Toyopearl Butyl 650C, TosoHaas, Philadelphia, PA).
Tras cualquier regeneración necesaria, la columna se equilibra con 5 a 10 volúmenes de un tampón acetato/fosfato que contiene sal, que tiene un pH de aproximadamente 2,5 a 4,5, y preferiblemente aproximadamente 3,0.
La cantidad de matriz HIC utilizada en la práctica de esta invención puede variar. Típicamente, aproximadamente se utiliza 0,05 a 1 litro de matriz por gramo de IGF-I auténtico.
Típicamente, el IGF-I se contacta con la matriz HIC durante al menos aproximadamente 0,1 a 30 minutos, con una temperatura de aproximadamente 15 a 30ºC. Una temperatura entre 20º y 25ºC es preferida.
Una vez que sustancialmente todo el IGF-I ha sido adsorbido por la primera matriz HIC, la matriz se contacta (es decir, "se lava") con un tampón que elimina una cantidad significativa de material contaminante (es decir, otro material que no sea IGF-I monomérico, intacto, correctamente plegado) de la matriz, sin eliminar cantidades significativas de la forma intacta, monomérica, correctamente plegada del IGF-I adsorbido. En un procedimiento de lavado de columna particularmente preferido, la columna HIC se lava con aproximadamente tres volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene cloruro sódico 0,5 M. Luego, la columna HIC se lava con aproximadamente diez volúmenes de columna de ácido acético 0.2 M, que contiene cloruro sódico 0,15 a 0,25 M.
En la finalización del procedimiento del lavado de la columna, la matriz HIC se pone en contacto con un tampón de elución HIC, es decir, un tampón adecuado para eliminar sustancialmente todo el IGF-I auténtico adsorbido restante de la matriz.
El IGF-I adsorbido puede ser eluido de la matriz HIC bajo varias condiciones. Preferiblemente, la temperatura del tampón de elución está entre 15º y 30ºC. Más preferiblemente, está entre 20º y 25ºC. El tiempo de elución variará en función de las dimensiones de la columna y del material de la matriz. El flujo de eluyente a través de la columna es preferiblemente de aproximadamente 10 a 300 cm/h.
Un procedimiento de elución HIC particularmente preferido consiste en aplicar aproximadamente cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene cloruro sódico 0 a 0,02 M, y que tiene un pH de 3,0.
Una etapa HIC que incluye los materiales y procedimientos particularmente preferidos descritos tienen varias ventajas sobre los procesos de la técnica anterior: (1) evitan precipitación potencial de IGF-I asociada con impurezas en sulfato amónico; (2) es más simple, en virtud de que evita un gradiente salino; y (3) se evitan los cambios de pH.
Opcionalmente, parte, o todo el eluato de la matriz HIC puede ser sometido a una segunda ronda de purificación HIC. Opcionalmente, parte, o todo el lavado de la matriz HIC puede ser sometido a desplegamiento/replegamiento, seguido de una segunda ronda de HIC.
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Segunda Etapa de Intercambio Catiónico
El IGF-I parcialmente purificado obtenido a partir de la etapa HIC se someta a una segunda etapa de purificación por intercambio catiónico. Los principios implicados en la selección de materiales y procedimientos en la segunda etapa de intercambio catiónico son esencialmente los mismos que en la primera etapa de intercambio catiónico. Por consiguiente, típicamente se utiliza el mismo tipo de matriz de intercambio catiónico en las etapas primera y segunda de intercambio catiónico. En la realización más preferida de la invención, la segunda etapa de intercambio catiónico incluye los siguientes procedimientos.
Una columna de intercambio catiónico, preferiblemente una columna SP, y lo más preferiblemente una columna Toyopearl SP550C^{TM}, SP650S^{TM}, o CM-650M^{TM} TosoHaas), (previamente regenerada) se equilibra con un tampón que consiste esencialmente en tampón de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5). Tras cargar IGF-I parcialmente purificado obtenido a partir de la etapa HCI dentro de la columna de intercambio catiónico, preferiblemente, la columna se lava con 7-10 volúmenes de columna de tampón de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) que contiene NaCl 0,1 M. Luego, el IGF-I preferiblemente se eluye en aproximadamente 7 volúmenes de columna de tampón de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) que contiene cloruro sódico 0,4 M.
La cantidad de la segunda matriz de intercambio catiónico utilizada, es decir, el tamaño de la segunda columna de intercambio catiónico dependerá de la cantidad total de IGF-I a ser adsorbido en la matriz. El proveedor comercial proporciona las capacidades de varias matrices de intercambio catiónico disponibles comercialmente, y el cálculo de la relación correcta de la matriz con IGF-I está dentro del nivel de expertos en la materia.
Etapa de Cromatografía en Fase Reversa
El IGF-I parcialmente purificado, replegado obtenido en la etapa del segundo intercambio catiónico se somete a una etapa de cromatografía en fase reversa. En un punto correspondiente en los métodos para IGF-I previamente descritos, se ha utilizado una cromatografía de filtración en gel. La filtración en gel elimina contaminantes de alto peso molecular. Asimismo, la cromatografía en fase reversa de la presente invención elimina contaminantes de alto peso molecular. Además, sin embargo, la etapa de cromatografía en fase reversa elimina varias formas de IGF-I no auténticas, incluyendo formas oxidadas, glucosiladas, y parcialmente degradadas.
Se usa cromatografía en fase reversa de resina polimérica. Entre las ventajas del medio de polímero de resina está la estabilidad química que permite despirogenación y salubridad con hidróxido sódico. Un medio de cromatografía en fase reversa particularmente preferido es Aberchrom CG1000sd^{TM} (TosoHaas, Philadelphia, PA). Disolventes orgánicos ilustrativos para uso en la etapa de cromatografía en fase reversa son metanol, etanol, 2-propanol, y acetonitrilo. Etanol es particularmente preferido.
La muestra de IGF-I parcialmente purificada obtenida a partir de la segunda etapa de intercambio catiónico se carga dentro de la columna de fase reversa, después de que la columna ha sido equilibrada con ácido acético 0,2 M.
La columna de fase reversa, con IGF-I adsorbido, luego se somete a un primer lavado isocrático con aproximadamente un volumen de columna de ácido acético 0,2 M. Luego, la columna se somete a un segundo lavado isocrático con etanol al 19% en ácido acético 0,2 M, para eliminar contaminantes menos hidrofóbicos que el IGF-I auténtico (por ejemplo, oxidados, glucosilados y algunos parcialmente degradados, por ejemplo, des-2 IGF-I, formas de
IGF-I).
El IGF-I auténtico se recupera a través de elución isocrática con un tampón acuoso/orgánico, seguido de elución en gradiente. La elución isocrática es con cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contiene etanol al 19%, y el gradiente (escalonado o lineal) de etanol de 19% a 25% (v/v), en ácido acético 0,2 M. Los materiales contaminantes más hidrofóbicos que el IGF-I auténtico permanecen adsorbidos a la columna y, por ello, se separan del IGF-I auténtico. Más eluciones de IGF-I se llevan a cabo con un gradiente de solvente orgánico. El gradiente de etanol puede ser un gradiente escalonado o un gradiente lineal.
Tras elución del IGF-I auténtico, los restantes componentes adsorbidos, es decir, los que son más hidrofóbicos que el IGF-I auténtico, se "destilan" (separan) de la columna en fase reversa. Preferiblemente, la columna se desntila con una alta concentración de etanol, es decir, una concentración entre aproximadamente 70% y 100%.
Concentración/Diafiltración
Tras la etapa de cromatografía en fase reversa, el IGF-I auténtico purificado se somete a un procedimiento de concentración que implica ultrafiltración. El propósito de esta etapa es concentrar el IGF-I purificado a una concentración final de aproximadamente 12-16 mg/ml y reemplazar el tampón de elución de la cromatografía en fase reversa con un tampón adecuado para etapas subsiguientes en la formulación del producto final.
Membranas de ultrafiltración, hechas de varios materiales y que tienen varios tamaños de poro (los cuales determinan el corte de peso molecular), están disponibles comercialmente. En una realización preferida de la invención, se pueden utilizar membranas planas de polisulfona, con un corte de peso molecular de 1000 (Filtron, Northborough, MA). En una realización más preferida, se utilizan membranas de fibra hueca de polisulfona con un corte de peso molecular de 3000 o 5000 (AG Technology, Needham, MA). Las membranas de fibra hueca tienen relaciones de flujo mayores y mejor capacidad de retención de IGF-I que las membranas planas, a pesar de la diferencia en las especificaciones de corte de peso molecular.
La concentración/diafiltración se puede realizar a la conclusión de cualquier, o todos, las etapas anteriores en el proceso. Por ejemplo, en casos donde la purificación del material se termina en distintos lugares, la concentración/diafiltración se puede realizar tras la etapa HIC. Las necesidades del experto pueden dictar cuándo se realiza la etapa de concentración/diafiltración.
Procedimientos Analíticos
En cada etapa del proceso de purificación de IGF-I, se ensayan, preferiblemente por uno o más métodos analíticos, alícuotas de muestras que contienen IGF-I, soluciones reducidas en el número de IGF-I, lavados de columna y fracciones completas. Dichos ensayos permiten que sean monitorizados aspectos seleccionados del proceso de purificación. El ensayo apropiado para una muestra dada dependerá del tipo de muestra y de la información buscada. Por ejemplo, puede ser deseable ensayar IGF-I, o contaminantes, o ambos.
Se conocen varios métodos analíticos de IGF-I, incluyendo, por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, Transferencia Western, mapeo peptídico, secuenciación de aminoácido N-terminal, y HPLC. Los métodos analíticos de IGF-I preferidos para su uso en conexión con esta invención son los métodos HPLC, por ejemplo, C4 RP HPLC, C8 RP HPLC, HPLC de intercambio catiónico o SEC HPLC. Uno o más de estos métodos de HPLC se utilizan típicamente para ensayar fracciones de cromatografía en columna durante todo el proceso de IGF-I.
Otro método analítico de IGF-I preferido es "cromatografía ciano en fase reversa" (YMC, Wilmington, NC). Cuando se utiliza la cromatografía ciano en fase reversa como método analítico en conexión con la presente invención, se utiliza un gradiente superficial de acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,1% ("TFA") para separar y cuantificar IGF-I auténtico y las formas principales contaminantes no auténticas e IGF-I.
Información Experimental
El proceso del estado de la técnica, descrito esencialmente en Holtz (arriba), y el proceso preferido de esta invención, se compararon en pruebas experimentales efectuadas sobre una escala de desarrollo de fermentación de 10 litros. El material de partida que contiene IGF-I consistía en el caldo de fermentación de 10 litros de la cepa GS115 de P. Pastoris. Esta cepa está establemente transformada con el plásmido pIGF206, que codifica IGF-I humano recombinante con un péptido señal N-terminal. Debido a la presencia del péptido señal, el IGF-I humano recombinante se secreta dentro del medio de crecimiento de P. Pastoris. El medio de crecimiento y las condiciones de fermentación se describen en Holtz (arriba). Se redujo 10 veces la adición de trazas de sal de PTM1; además, se redujeron aproximadamente 3 veces los niveles de ácido sulfúrico, cobre, zinc y hierro en PTML.
Durante la fermentación, se secretaron al medio de crecimiento varias formas de IGF-I. La Fig. 2 muestra un ciano cromatograma en fase reversa típico del IGF-I recuperado a partir de la primera etapa de intercambio catiónico. Estas formas de IGF-I incluyen eluato de IGF-I auténtico (aproximadamente el 18% de IGF-I total) a los 7,3 minutos; eluato de IGF-I monomérico mal plegado (aproximadamente el 15%) a los 5,08 minutos; eluato de forma monomérica degradada o fragmentada en el amino terminal (des-2) (aproximadamente el 1% del total) a los 6,0 minutos; eluato de formas monoméricas oxidadas y glucosiladas (aproximadamente el 7% del total) a los 6,7 minutos; eluato de una variedad de formas monoméricas degradadas o rotas (aproximadamente el 7% del total) entre 8 y 11 minutos; y eluato de numerosas formas multiméricas (aproximadamente el 50% del total) entre 11 y 22 minutos.
La Tabla I compara las etapas básicas del proceso de Holtz con las etapas preferidas en el proceso de esta invención. Los cambios de optimización para las etapas en el proceso de Holtz se resumen en la Tabla II. Los rendimientos de IGF-I auténtico (determinado por análisis de cromatografía ciano en fase reversa) en cada etapa en el proceso se muestran en la Tabla III. Los datos de la Tabla III respecto al proceso preferido de esta invención son valores promedio que representan seis pistas de producción de 10 litros. Los datos de la Tabla III, en relación con el proceso de la técnica anterior, son a partir de una pista de producción de 10 litros.
TABLA I Comparación del Proceso de Holtz y del Proceso de la Invención
1
TABLA II
2
TABLA III Rendimientos de IGF-I Auténtico para el Proceso de Holtz y el Proceso de la Invención (Escala de Desarrollo de 10L)
3
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Tras la separación celular, el medio de fermentación libre de células se cargó dentro de una columna Toyopearl SP550C^{TM} de 270 ml (Tosohaas, Philadelphia, PA) (5 cm x 14 cm), a una relación de flujo de 130 ml/min, a 20-25ºC. La columna cargada, primero se lavó con aproximadamente 3 volúmenes de columna de ácido acético 0,02 M y luego se lavó con aproximadamente 3 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5), a caudal de 130 ml/min, a 20-25ºC. IGF-I se eluyó de la columna con cuatro volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5), cloruro sódico 0,4 M. El material recuperado de la etapa del primer intercambio catiónico está resumido en la Tabla IV.
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TABLA IV Análisis de ciano HPLC en Fase Reversa del Material de la Etapa de la Primera Recuperación Catiónica
4
La primera etapa de intercambio catiónico en el proceso de esta invención difiere de la primera etapa de intercambio catiónico en el proceso de Holtz en que el cloruro sódico en el segundo tampón de lavado se ha eliminado. Esto permite, de forma ventajosa, la recuperación de las formas multiméricas de IGF-I (que son convertidas en formas monoméricas en la subsiguiente etapa de desplegamiento/replegamiento). El aumento en la cantidad de IGF-I multimérico recuperado se ve comparando los cromatogramas analíticos del producto del primer intercambio catiónico de Holtz ("SP1") y el producto SP1 obtenido utilizando el proceso de la invención. Excepto por los niveles de IGF-I multimérico, no hay diferencias significativas entre los dos perfiles de cromatografía SP1 (Figs. 2 y 3).
El conjunto SP1 recuperado se combinó con una variedad concentrada (concentración 2X) de tampón de desplegamiento/replegamiento para producir las siguientes concentraciones finales: urea 2 M; cloruro sódico 1,5 M; etanol al 15%; borato sódico 5 mM; y DTT 0,2 mM (pH 9-9,5). Se permitió a proceder el desplegamiento/replegamiento, con mezclado suave, a temperatura ambiente durante 15 a 20 horas. Cromatogramas ciano en fase reversa típicos a partir de análisis hechos antes y después de la etapa de desplegamiento/replegamiento se muestran en las Figs. 4A y 4B. Las cantidades relativas de las varias formas de IGF-I (como porcentaje de IGF-I total) antes y después de la etapa de desplegamiento/replegamiento se presentan en la Tabla V. La reducción en picos de IGF-I multimérico y el aumento en el pico de IGF-I auténtico son claramente visibles en las Figs. 4A y 4B. Como resultado de los picos multiméricos reducidos, IGF-I auténtico se incrementó de 14% a 44% del IGF-I total presente. Puesto que un alto porcentaje de IGF-I multimérico es convertido a monomérico (64% de multimérico reducido a 21% multimérico) también hay un aumento en la cantidad de algunas formas monoméricas no auténticas. Por ejemplo, la formas oxidadas y glucosiladas (7,25 minutos) aumentaron de 5% a 12% del total; una forma degradada, llamada des 2 (6,86 minutos) aumentó de 1,5% a 3,4% (Tabla V).
Sin embargo, se debe tener en cuenta que la relación de formas monoméricas no auténticas con el IGF-I auténtico no aumentó, porque la cantidad de IGF-I auténtico también aumentó. No se identificaron nuevos contaminantes como resultado de la etapa de desplegamiento/replegamiento. El proceso de desplegamiento/replegamiento se ha llevado a cabo en experimentos correspondientes a la escala de fermentación de 100 litros y 1500 litros, y se obtuvieron resultados comparables (datos no mostrados).
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TABLA V Análisis ciano HPLC en Fase Reversa de Material Antes y Después de la Etapa de Desplegamiento/Replegamiento
5
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En la preparación para cargar en la columna HIC, el pH del conjunto replegado se ajustó a 4,2 con ácido acético y luego, se diluyó con un volumen igual de cloruro sódico 1 M. El conjunto replegado con pH ajustado, que contiene cloruro sódico 1,25 M, se cargó dentro de la columna HIC Toyopearl Butyl 650M^{TM} (TosoHaas, Philadelphia, PA) (3,2 cm x 47 cm) a 40 ml/min, a 20-25ºC.
La columna HIC, con IGF-I adsorbido, se lavó con aproximadamente tras volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contienen cloruro sódico 0,5 M. Luego, la columna HIC se lavó con aproximadamente diez volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contienen cloruro sódico 0,25 M. Luego, el IGF-I adsorbido se eluyó de la columna HIC con cuatro volúmenes de ácido acético 0,2 M, que contienen cloruro sódico 0,02 M.
En las Figuras 5A y 5B se muestran ciano cromatogramas en fase reversa típicos a partir de análisis del producto recuperado tras la etapa HIC. Esencialmente no existe diferencia en los perfiles cromatográficos. Las cantidades relativas de las variadas formas de IGF-I (como porcentaje de IGF-I total) tras la etapa HIC en el proceso de Holtz y en el proceso de esta invención se presentan en la Tabla VI.
TABLA VI Análisis Ciano HPLC en Fase Reversa de Material de las Etapas HIC
6
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La etapa de segundo intercambio catiónico se llevó a cabo en una columna Toyopearl SP550C (TosoHaas, Philadelphia, PA), a una relación de flujo de 10 ml/min.
Tras la carga, la segunda columna de intercambio catiónica se lavó con aproximadamente un volumen de columna de tampón de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5). Luego, la columna se lavó con aproximadamente 7 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M, cloruro sódico 0,1 M (pH 5,5). El IGF-I se eluyó con aproximadamente 7 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M, cloruro sódico 0,4 M (pH 5,5). Las cantidades relativas de las variadas formas de IGF-I (como porcentaje de IGF-I total) tras la etapa de segundo intercambio catiónico en el proceso de Holtz y en el proceso de esta invención se presentan en la Tabla VII.
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TABLA VII Análisis Ciano HPLC en Fase Reversa de Material a Partir de la Etapa de Segundo Intercambio Catiónico
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El material recuperado de la etapa de segundo intercambio catiónico se cargó dentro de una columna de cromatografía en fase reversa Aberchromb CG1000sd^{TM} (TosoHaas, Philadelphia, PA) (2,6 cm x 21 cm), equilibrada con aproximadamente 3 volúmenes de columna de tampón de ácido acético 0,2 M (20 ml/min de relación de flujo). Tras la carga, la columna de fase reversa se lavó con un volumen de columna de ácido acético 0,2 M. Luego, la columna se lavó con cuatro volúmenes de ácido acético 0,2 M que contienen etanol al 19% (la relación de flujo se redujo a 15 ml/min). El IGF-I se eluyó a partir de la columna de fase reversa utilizando un gradiente de etanol de 19% a 25%. Tras la recuperación de IGF-I, la columna se desnudó con una alta concentración de etanol (es decir, 70-100%). La Fig. 7 muestra ciano cromatogramas en fase reversa típicos de análisis del producto de la filtración en gel de Holtz y del producto en fase reversa del proceso de esta invención. Las cantidades relativas de las variadas formas de IGF-I (como porcentaje de IGF-I total) tras la etapa de filtración en gel en el proceso de Holtz y la etapa de cromatografía en fase reversa en el proceso de esta invención se presentan en la Tabla VIII.
TABLA VIII % de Perfil de Pureza de Ciano HPLC en Fase Reversa de las Etapas Finales de la Cromatografía
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Análisis y Caracterización del Producto Final
Con el fin de asegurar la pureza, identidad y potencia del producto final obtenido en la práctica de esta invención, se han empleado varias pruebas.
SDS-PAGE
La pureza e identidad del producto se determinó por SDS-PAGE. El producto del proceso de esta invención co-migra con el patrón de referencia del proceso de Holtz, y no contiene cantidades detectables de proteínas de peso molecular superior (datos no mostrados).
Transferencia Western t/ELISA
Proteínas que no eran IGF-I se midieron por ensayos de Western Blot y ELISA. Para esta prueba, se levantaron anticuerpos primarios frente a proteínas recuperadas a partir de la primera etapa de intercambio catiónico de un control negativo de fermentación de Pichia pastoris. Los anticuerpos se utilizaron para sondear la presencia de proteínas contaminantes de la célula hospedadora. La cantidad de proteína contaminante de la célula hospedadora es aproximadamente 10 veces menos en el producto del proceso de la presente invención, en comparación con el producto del proceso de Holtz. Se utilizaron ensayos de ELISA de mancha en ranura ("slot blot") para hacer determinaciones cuantitativas. LA Tabla IX resume los resultados de la determinación por ELISA.
TABLA IX Resumen de Niveles de Proteínas Contaminantes de Levaduras
9
Ciano HPLC de Fase Reversa
La pureza del producto final también se evaluó utilizando una ciano columna de fase reversa (Cyano Zorbax, MacMod Analytical, Chadds Ford, PA). Se utilizó un gradiente superficial de acetonitrilo con tampón fosfato 25 mM a pH 6,8 para separar los análogos principales de IGF-I y determinar la concentración y pureza del IGF-I auténtico. Este ensayo ciano de fase reversa resuelve de forma exitosa varios análogos de IGF-I (oxidados y glucosilados) a partir del IGF-I auténtico. La Tabla X resume los resultados de pureza para tres lotes del material producido por el proceso de esta invención, en comparación con varios lotes producidos por el proceso de Holtz. El cromatograma HPLC en fase reversa en la Fig. 8 muestra la comparación entre el proceso de Holtz y el proceso de esta invención.
TABLA X Resumen de Datos de Pureza para Producto Final (Evaluado por Ciano Cromatografía Fosfato)
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HPLC de Exclusión de Tamaño
Se utilizó HPLC de exclusión de tamaño para detectar la presencia de agregados de alto peso molecular en el producto. LA Tabla XI resume los resultados de las pruebas de cada lote. El proceso de esta invención elimina de forma eficaz los materiales de alto peso molecular del producto.
TABLA XI
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Enfoque Isoeléctrico
Los geles de enfoque isoeléctrico también confirman la identidad de los productos del proceso de esta invención, cuando se comparan con los productos producidos por el proceso de Holtz (datos no mostrados).
Secuenciación Proteica
La secuenciación N-terminal del producto confirmó la secuencia correcta de la proteína, con respecto al producto producido por el proceso de Holtz y la secuencia de IGF-I humano recombinante publicada.
Mapeo Peptídico
Los resultados del mapeo peptídico para el producto de esta invención son idénticos a los resultados obtenidos con el material del proceso de Holtz. Ambos mapas reducidos y no reducidos coinciden. La Fig. 10 ilustra los resultados de los estudios de mapeo. Debido a que el producto producido por el proceso de esta invención está replegado, el tiempo d retención del IGF-I no digerido por RP-HPLC y en picos del mapa del péptido no reducido confirman el plegamiento correcto del IGF-I producido por el proceso de esta invención. Además, la Fig. 11 muestra los mapas peptídicos de IGF-I no plegado obtenido a partir del proceso de purificación. Como se esperaba, el mapa no reducido difiere de los mapas del IGF-I auténtico plegado correctamente.
Espectroscopia de Masas
Se ha realizado, además, caracterización de identidad por espectroscopia de masas. Se observó un componente principal, con una masa de 7649 +/- 5 AMU, para cada lote de material a partir del proceso de esta invención. También están presentes componentes secundarios, de intensidad similar a aquellos en el material del proceso de Holtz.
Actividad Biológica
Resultados del ensayo radio-receptor para el material producido por el proceso de esta invención concuerdan bien con la potencia esperada del producto, basado en ensayos de HPLC y espectroscopia ultravioleta de proteína total.
La potencia biológica de los variados lotes de material producido por el proceso de esta invención también se probaron en un bioensayo mitogénico. IGF-I es un potente mitógeno. Su efecto se midió por la incorporación de dimetiltiazol-2 il difeniltetrazolium (MT) dentro del ADN de la línea celular MG-63 de osteosarcoma humano. La potencia de varios lotes de IGF-I producido por ambos procesos son comparables (datos no mostrados).
Los productos producidos por el proceso de esta invención tienen las características esperadas del rhIGF-I auténtico. La pureza del producto ha aumentado en aproximadamente 1-4% sobre el producto del proceso de Holtz.

Claims (26)

1. Un proceso para purificar correctamente el factor I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) monomérico correctamente plegado, a partir de un medio que contiene péptidos IGF-I, que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto el medio con una cantidad suficiente de una primera matriz de intercambio catiónico bajo condiciones que permiten la adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% de IGF-I total a partir del medio;
(ii) lavar la primera matriz de intercambio catiónico cargada con IGF-I con un primer tampón de lavado de intercambio catiónico;
(iii) eluir todas las formas de IGF-I adsorbidas a partir de la matriz de intercambio catiónico de la etapa (i) por contacto de dicha matriz de intercambio catiónico con una cantidad suficiente de un primer tampón de intercambio catiónico, que tiene un pH o fuerza iónica suficientemente altos para desplazar sustancialmente todos dichos IGF-I auténticos y no auténticos a partir de dicha matriz de intercambio catiónico;
(iv) poner el contacto IGF-I eluído a partir de la etapa (iii), tras transferirlo dentro de un sistema disolvente adecuado, con una cantidad suficiente de una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica bajo condiciones que permitan la adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% de dicho IGF-I a partir de dicho eluato;
(v) lavar la matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica cargada de IGF-I con un tampón de lavado de interacción hidrofóbica que tiene una fuerza iónica suficientemente baja para eliminar la mayoría de los IGF-I no auténticos, pero no tan baja como para eliminar una proporción importante de IGF-I auténtico de la matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica.
(vi) eluir IGF-I adsorbido a partir de dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica poniendo en contacto dicha matriz con un tampón de elución de interacción hidrofóbica, que tiene un pH suficientemente alto, o una fuerza iónica suficientemente baja, para causar desplazamiento de sustancialmente todo el IGF-I auténtico adsorbido de dicha matriz;
(vii) poner en contacto el eluato de la etapa (vi) con una cantidad suficiente de una segunda matriz de intercambio catiónico bajo condiciones que permiten adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% del IGF-I a partir del eluato;
(viii) lavar la segunda matriz de intercambio catiónico cargada con IGF-I con un tampón de lavado de intercambio catiónico que tiene una fuerza iónica lo suficientemente alta, o pH suficientemente alto, para eliminar una porción importante de IGF-I auténtico, pero no tan alto como para eliminar una proporción significativa de IGF-I auténtico;
(ix) eluir el IGF-I adsorbido a partir de dicha segunda matriz de intercambio catiónico por contacto de dicha matriz con un segundo tampón de elución de intercambio catiónico, que tiene una fuerza iónica lo suficientemente alta, o pH suficientemente alto, para desplazar sustancialmente todo el IGF-I auténtico adsorbido a partir de dicha matriz; y
(x) someter el IGF-I auténtico eluido a partir de la etapa (ix) a otra etapa de cromatografía;
caracterizado porque, el lavado de la etapa (ii) comprende aplicar 3,0 volúmenes de columna de ácido acético 0,02 M, seguido de 3,0 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5), a dicha primera matriz de intercambio catiónico, con el fin de separar una cantidad sustancial de material no IGF-I adsorbido sin separar una cantidad sustancial de IGF-I auténtico o no auténtico, previamente a la etapa (iv); el eluato que contiene IGF-I de la etapa (iii) se transfiere a un tampón de desplegamiento/replegamiento, que comprende urea entre 1,5 y 3,0 M, cloruro sódico de entre 1,0 y 3,0 M, entre 5% y 20% (v/v) de etanol, borato sódico entre 1 mM y 15 mM, y ditiotreitol entre 0,005 mM y 10.0 mM, y que tiene un pH entre 8,5 y 10,0, con el fin de: (a) reducir las uniones disulfuro intracatenarias de la proteína IGF-I y promover desplegamiento sin desnaturalización permanente; y (b) permitir replegamiento del IGF-I y reoxidación para formar uniones disulfuro intracatenarias correctamente emparejadas, para formar IGF-I replegado; y más aún, caracterizado por que la etapa de cromatografía de la etapa (x) es una etapa de cromatografía en fase reversa que comprende: (c) poner en contacto el eluato de la etapa (ix), en un tampón acuoso, con una matriz de resina polimérica de cromatografía en fase reversa para adsorber, al menos, aproximadamente 95% del IGF-I del eluato; (d) lavar la matriz de cromatografía en fase reversa cargada de IGF-I con un tampón de lavado en fase reversa acuoso/orgánico, donde dicha etapa de lavado comprende aplicar un volumen de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 0% de etanol, seguido de 4 volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contiene 19% de etanol, a dicha matriz de cromatografía en fase reversa, con el fin de separar una proporción sustancial de IGF-I no auténtico pero no separar una proporción significativa de IGF-I auténtico; y (e) eluir el IGF-I adsorbido de dicha matriz de cromatografía en fase reversa por elución con un tampón acuoso/orgánico, donde dicha etapa de elución comprende aplicar a dicha matriz de cromatografía en fase reversa cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contienen 19% de etanol, seguido de un gradiente de 19% a 25% de etanol (v/v), en ácido acético 0,2 M, donde el gradiente se selecciona del grupo que consiste en gradiente lineal y gradiente escalonado, con el fin de separar sustancialmente todo el IGF-I auténtico sin eliminar una proporción significativa de formas multiméricas de IGF-I.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde dicho IGF-I es un IGF-I recombinante humano.
3. El proceso de la reivindicación 2, donde dicho IGF-I recombinante humano está producido en células transformadas de levadura.
4. El proceso de la reivindicación 3, donde dichas células transformadas de levadura son de la especie Pichia pastoris.
5. El proceso de la reivindicación 4, donde dicha especie Pichia pastoris es de la cepa GS115.
6. El proceso de la reivindicación 3, donde dicho IGF-I es secretado dentro del medio de crecimiento de levaduras.
7. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha matriz de primer intercambio catiónico en la etapa (i) está sulfopropilada y presente en una columna de cromatografía.
8. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha elución en la etapa (III), comprende aplicar a dicha matriz de primer intercambio catiónico entre 3 y 10 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) y cloruro sódico 0,4 M.
9. El proceso de la reivindicación 1, donde dicho tampón de desplegamiento/replegamiento comprende urea 2 M, cloruro sódico 1,5 M, etanol al 15%, borato sódico 5 mM y DDT 0,2 mM y tiene un pH entre 9,0 y 9,5.
10. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica en la etapa (iv) es una matriz de polimetacrilato butil-sustituída.
11. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha etapa de lavado (v) comprende aplicar a dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica tres volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contienen cloruro sódico 0,5 M; seguido de 10 volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene cloruro sódico de 0,15 a 0,25 M.
12. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha etapa de elución (vi) comprende aplicar a dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contienen cloruro sódico de 0 a 0,02 M, y que tiene un pH de 3,0.
13. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha matriz de segundo intercambio catiónico en la etapa (vii) está sulfilpropilada y presente en una columna de cromatografía.
14. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha etapa de lavado (viii) comprende aplicar a dicha matriz de segundo intercambio catiónico siete volúmenes de columna de tampón de acetato sódico 0,05 M, que contiene NaCl 0,1 M, y que tiene un pH de 5,5.
15. El proceso de la reivindicación 1, donde dicho segundo tampón de elución de intercambio catiónico en la etapa (ix) comprende siete volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M, cloruro sódico 0,4 M, que tiene un pH de 5,5.
16. Un proceso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medio es un medio celular de levadura que contiene IGF-I recombinante a partir del cual se han separado células de levaduras transformadas.
17. Un proceso según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el eluato que contiene IGF-I de la etapa (iii) de la reivindicación 1 está en contacto con el tampón de desplegamiento durante 15 horas a 20 horas a temperatura ambiente.
18. El proceso de la reivindicación 1, donde la cantidad de dicha matriz de primer intercambio catiónico en la etapa (i) puesta en contacto con el medio es de 0,031 L a 1,0 L de matriz por gramo de IGF-I auténtico.
19. El proceso de la reivindicación 1, donde la cantidad de dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica en la etapa (iv) es aproximadamente de 0,05 L a 1,0 L de matriz por gramo de IGF-I auténtico.
20. El proceso de la reivindicación 1, donde dicha etapa de lavado (v) comprende lavar la matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica cargada con IGF-I con tres volúmenes de columna de un tampón de lavado de interacción hidrofóbica que comprende ácido acético 0,2 M y cloruro sódico 0,5 M seguido de lavado de la matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica cargada con IGF-I con diez volúmenes de columna de un tampón de lavado de interacción hidrofóbica que comprende ácido acético 0,2 M que contiene cloruro sódico de 0,15 a 0,25 M.
21. El proceso de la reivindicación 1, donde dicho tampón de elución de interacción hidrofóbica en la etapa (vi) comprende cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contienen cloruro sódico de 0 a 0,02 M.
22. El proceso de la reivindicación 1, donde se utilizan 7-10 volúmenes del tampón de lavado de intercambio catiónico en la etapa (viii) y comprenden acetato sódico 0,05 M y NaCl 0,1 M de pH 5,5.
23. El proceso de la reivindicación 1, donde el segundo tampón de elución de intercambio catiónico en la etapa (ix) comprende acetato sódico 0,05 M y cloruro sódico 0,4 M a pH 5,5.
24. Un proceso de la reivindicación 1, donde el tampón de desplegamiento/replegamiento contiene un agente tamponante adecuado para mantener el pH entre 8,0 y 10,5, un agente caotrópico, un alcohol, una sal y un agente reductor.
25. Un proceso de la reivindicación 1, donde el IGF-I auténtico recuperado en la etapa (e) es recuperado a través de elución isocrática con un tampón acuaso/orgánico, seguido de un gradiente de elución.
26. Un proceso de la reivindicación 1, donde la etapa (ii) además comprende lavar con un segundo primer tampón de lavado de intercambio catiónico que no contiene cloruro sódico.
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