ES2321242T3 - Proceso de purificacion de igf-1. - Google Patents
Proceso de purificacion de igf-1. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2321242T3 ES2321242T3 ES96912727T ES96912727T ES2321242T3 ES 2321242 T3 ES2321242 T3 ES 2321242T3 ES 96912727 T ES96912727 T ES 96912727T ES 96912727 T ES96912727 T ES 96912727T ES 2321242 T3 ES2321242 T3 ES 2321242T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- igf
- matrix
- cation exchange
- buffer
- authentic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 title abstract description 223
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 title abstract description 223
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 113
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 100
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims abstract description 69
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 26
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 99
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 86
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 72
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 48
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 45
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 36
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims description 20
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 19
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 17
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 17
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 16
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 16
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 16
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 8
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 6
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 claims description 6
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 3
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 claims description 2
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 claims description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 101100322245 Caenorhabditis elegans des-2 gene Proteins 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 butyl- Chemical group 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- FCERNNLMTCOKHX-UHFFFAOYSA-O 1,5-diphenyl-2H-tetrazol-1-ium Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=[NH+]N=NN1C1=CC=CC=C1 FCERNNLMTCOKHX-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010777 Disulfide Reduction Effects 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000002932 cholinergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000013542 high molecular weight contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
SE DESCUBRE UN PROCESO PARA OBTENER FACTOR DE CRECIMIENTO I SIMILAR A INSULINA (TAMBIEN CONOCIDO COMO SOMATOMEDINA C) CORRECTAMENTE PLEGADO, INTACTO, MONOMERICO Y PURIFICADO. EL PROCESO INCLUYE LA ADICION DE UNA ETAPA DE DESPLEGAMIENTO/REPLEGAMIENTO DE IGF EN FASE REVERSA POR UNA ETAPA DE CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRACION PARA AUMENTAR EL RENDIMIENTO FINAL. EL PROCESO INCLUYE TAMBIEN LAS SIGUIENTES ETAPAS, EN ORDEN: PRIMER INTERCAMBIO CATIONICO, DESPLEGAMIENTO/REPLEGAMIENTO, CROMATOGRAFIA DE INTERACCION HIDROFOBICA, SEGUNDO INTERCAMBIO CATIONICO, Y CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA.
Description
Proceso de purificación de
IGF-1.
Esta invención se refiere a purificación de
proteínas.
El factor de crecimiento de tipo insulina I
("IGF-I"; también conocido como
"somatomedina-C") es un factor de crecimiento
de mamíferos esencial para el crecimiento y desarrollo normal. Tiene
efectos de tipo insulina en músculo y tejido adiposo, y tiene
efectos mitogénicos sobre varios tipos celulares.
IGF-I tiene una variedad de usos clínicos. Por
ejemplo, se puede usar para potenciar la supervivencia de neuronas
como neuronas colinérgicas no mitóticas (Lewis y cols., Patente de
EE.UU Nº 5,093,317).
Se conoce la secuencia de aminoácidos completa
de la proteína IGF-I, y el ADN que codifica
IGF-I humano se ha clonado y expresado en E.
Coli y levaduras (véase, por ejemplo, Brierley y cols., Patente
de EE.UU Nº 5,324,639). La proteína IGF-I humana
consiste en un solo polipéptido de 70 aminoácidos que incluye seis
restos de cisteina, los cuales participan en la formación de tres
uniones intracatenarias disulfuro (Axelsson y cols., Eur. J.
Biochem. 206:987 (1992)). Las tres uniones disulfuro, con todos los
tres restos de cisteina correctamente apareados, son necesarias para
que IGF-I tenga su correcta (es decir, natural)
estructura terciaria. En la reducción y reoxidación de las uniones
disulfuro, IGF-I puede replegarse de varias formas,
formando tantas como 15 configuraciones monoméricas (Meng y cols.,
J. Chrom. 433:183 (1988)). Además, los polipéptidos de
IGF-I pueden interaccionar entre sí para formar
estructuras multiméricas. Se han publicado procesos para obtener
IGF-I purificado plegado correctamente (véase, por
ejemplo, Holtz y cols., Patente de EE.UU Nº 5,231,178
("Holtz"); Chang y cols., Patente de EE. UU Nº 5,288,931; y
Hart y cols., Biotech. Appl. Biochem. 20:217 (1994)).
Se ha descubierto un proceso mejorado para
obtener IGF-I purificado, monomérico, intacto,
correctamente plegado (es decir, "auténtico"). Más
particularmente, se ha descubierto cómo aumentar, en al menos tres
veces, el rendimiento final de IGF-I auténtico
obtenido en el proceso de purificación de IGF-I
descrito en Holtz (arriba). El aumento del rendimiento se obtiene
fundamentalmente: (1) incluyendo una etapa de
desplegamiento/replegamiento de la proteína IGF-I,
llevado a cabo tras la primera etapa de cromatografía de catión; y
(2) sustituyendo la etapa de filtración en gel descrito en Holtz
por una etapa de cromatografía en fase reversa.
Por consiguiente, la invención caracteriza un
proceso para la purificación del polipéptido IGF-I
monomérico, intacto, correctamente plegado a partir de un medio que
contiene polipéptidos IGF-I, comprendiendo dicho
proceso las etapas de:
(i) poner en contacto el medio con una cantidad
suficiente de una primera matriz de intercambio catiónico bajo
condiciones que permiten la adsorción de, al menos, aproximadamente
el 95% de IGF-I total a partir del medio;
(ii) lavar la primera matriz de intercambio
catiónico cargada con IGF-I con un primer tampón de
lavado de intercambio catiónico;
(iii) eluir todas las formas de
IGF-I adsorbidas a partir de la matriz de
intercambio catiónico de la etapa (i) poniendo en contacto dicha
matriz de intercambio catiónico con una cantidad suficiente de un
primer tampón de elución de intercambio catiónico, que tiene un pH o
fuerza iónica suficientemente altos para desplazar sustancialmente
todos dichos IGF-I auténticos y no auténticos a
partir de dicha matriz de intercambio catiónico;
(iv) poner en contacto IGF-I
eluído a partir de la etapa (iii), tras transferirlo dentro de un
sistema disolvente adecuado, con una cantidad suficiente de una
matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica bajo condiciones
que permitan la adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% de
dicho IGF-I a partir de dicho eluato;
(v) lavar la matriz de cromatografía de
interacción hidrofóbica cargada de IGF-I con un
tampón de lavado de interacción hidrofóbica que tiene una fuerza
iónica lo suficientemente baja como para eliminar la mayoría de los
IGF-I no auténticos, pero no tan baja como para
eliminar una proporción importante de IGF-I
auténtico de la matriz de cromatografía de interacción
hidrofóbica.
(vi) eluir IGF-I adsorbido a
partir de dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica
poniendo en contacto dicha matriz con un tampón de elución de
interacción hidrofóbica, que tiene un pH lo suficientemente alto, o
una fuerza iónica lo suficientemente baja, como para causar
desplazamiento de sustancialmente todo el IGF-I
auténtico adsorbido de dicha matriz;
(vii) contactar el eluato de la etapa (vi) con
una cantidad suficiente de una segunda matriz de intercambio
catiónico bajo condiciones que permiten adsorción de, al menos,
aproximadamente 95% del IGF-I a partir del
eluato;
(viii) lavar la segunda matriz de intercambio
catiónico cargada con IGF-I con un tampón de lavado
de intercambio catiónico que tiene una fuerza iónica lo
suficientemente alta, o pH suficientemente alto, como para eliminar
una porción importante de IGF-I no auténtico, pero
no tan alto como para eliminar una proporción significativa de
IGF-I auténtico;
(ix) eluir el IGF-I adsorbido a
partir de dicha segunda matriz de intercambio catiónico por contacto
de dicha matriz con un segundo tampón de elución de intercambio
catiónico, que tiene una fuerza iónica lo suficientemente alta, o pH
suficientemente alto, como para desplazar sustancialmente todo el
IGF-I auténtico adsorbido a partir de dicha matriz;
y
(x) someter el IGF-I auténtico
eluido a partir de la etapa (ix) a otra etapa de cromatografía;
caracterizado porque, el lavado de la etapa (ii)
comprende aplicar 3,0 volúmenes de columna de ácido acético
0,02 M, seguido de 3,0 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5), a dicha primera matriz de intercambio catiónico, con el fin de eliminar una cantidad sustancial de material de no IGF-I adsorbido sin eliminar una cantidad sustancial de IGF-I auténtico o no auténtico, previamente a la etapa (iv); el eluato que contiene IGF-I del la etapa (iii) se transfiere a un tampón de desplegamiento/replegamiento, que comprende urea entre 1,5 y 3,0 M, cloruro sódico entre 1,0 y 3,0 M, entre 5% y 20% (v/v) de etanol, borato sódico entre 1 mM y 15 mM, y ditiotreitol d entre 0,005 mM y 10.0 mM, y que tiene un pH entre 8,5 y 10,0, con el fin de: (a) reducir las uniones disulfuro intracatenarias de la proteína IGF-I y promover desplegamiento sin desnaturalización permanente; y (b) permitir replegamiento del IGF-I y reoxidación para formar uniones disulfuro intracatenarias correctamente emparejadas, para formar IGF-I replegado; y más aún, caracterizado por que la etapa de cromatografía de la etapa (x) es una etapa de cromatografía en fase reversa que comprende: (c) poner en contacto el eluato de la etapa (ix), en un tampón acuoso, con una matriz de resina polimérica de cromatografía en fase reversa para adsorber, al menos, 95% del IGF-I del eluato; (d) lavar la matriz de cromatografía en fase reversa cargada de IGF-I con un tampón de lavado en fase reversa acuoso/orgánico, donde dicha etapa de lavado comprende aplicar un volumen de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 0% de etanol, seguido de 4 volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contiene 19% de etanol, a dicha matriz de cromatografía en fase reversa, con el fin de eliminar una proporción sustancial de IGF-I no auténtico pero no eliminar una proporción significativa de IGF-I auténtico; y (e) eluir el IGF-I adsorbido de dicha matriz de cromatografía en fase reversa por elución con un tampón acuoso/orgánico, donde dicha etapa de elución comprende aplicar a dicha matriz de cromatografía en fase reversa cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 19% de etanol, seguido de un gradiente de 19% a 25% de etanol (v/v), en ácido acético 0,2 M, donde el gradiente se selecciona del grupo que consiste en gradiente lineal y gradiente de paso, con el fin de eliminar sustancialmente todo el IGF-I auténtico sin eliminar una proporción significativa de formas multiméricas de IGF-I.
0,02 M, seguido de 3,0 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5), a dicha primera matriz de intercambio catiónico, con el fin de eliminar una cantidad sustancial de material de no IGF-I adsorbido sin eliminar una cantidad sustancial de IGF-I auténtico o no auténtico, previamente a la etapa (iv); el eluato que contiene IGF-I del la etapa (iii) se transfiere a un tampón de desplegamiento/replegamiento, que comprende urea entre 1,5 y 3,0 M, cloruro sódico entre 1,0 y 3,0 M, entre 5% y 20% (v/v) de etanol, borato sódico entre 1 mM y 15 mM, y ditiotreitol d entre 0,005 mM y 10.0 mM, y que tiene un pH entre 8,5 y 10,0, con el fin de: (a) reducir las uniones disulfuro intracatenarias de la proteína IGF-I y promover desplegamiento sin desnaturalización permanente; y (b) permitir replegamiento del IGF-I y reoxidación para formar uniones disulfuro intracatenarias correctamente emparejadas, para formar IGF-I replegado; y más aún, caracterizado por que la etapa de cromatografía de la etapa (x) es una etapa de cromatografía en fase reversa que comprende: (c) poner en contacto el eluato de la etapa (ix), en un tampón acuoso, con una matriz de resina polimérica de cromatografía en fase reversa para adsorber, al menos, 95% del IGF-I del eluato; (d) lavar la matriz de cromatografía en fase reversa cargada de IGF-I con un tampón de lavado en fase reversa acuoso/orgánico, donde dicha etapa de lavado comprende aplicar un volumen de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 0% de etanol, seguido de 4 volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contiene 19% de etanol, a dicha matriz de cromatografía en fase reversa, con el fin de eliminar una proporción sustancial de IGF-I no auténtico pero no eliminar una proporción significativa de IGF-I auténtico; y (e) eluir el IGF-I adsorbido de dicha matriz de cromatografía en fase reversa por elución con un tampón acuoso/orgánico, donde dicha etapa de elución comprende aplicar a dicha matriz de cromatografía en fase reversa cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 19% de etanol, seguido de un gradiente de 19% a 25% de etanol (v/v), en ácido acético 0,2 M, donde el gradiente se selecciona del grupo que consiste en gradiente lineal y gradiente de paso, con el fin de eliminar sustancialmente todo el IGF-I auténtico sin eliminar una proporción significativa de formas multiméricas de IGF-I.
Realizaciones preferidas de la invención se
describen abajo o se definen en las reivindicaciones
dependientes.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "auténtico" significa
IGF-I monomérico, intacto, correctamente plegado,
con tres uniones disulfuro intracatenarias que implican restos de
cisteina apareados, es decir, apareados como en
IGF-I natural.
Tal como se utiliza aquí, el término "volumen
de columna" significa el volumen ocupado por una matriz de
cromatografía, incluyendo líquido intersticial.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "degradado" significa
IGF-I en el que se han escindido una o más de las
uniones covalentes presentes en la estructura polipeptídica o en las
cadenas laterales de aminoácidos del IGF-I
auténtico.
Tal como se utiliza aquí, IGF-I
"des-2" significa IGF-I que
pierde los dos primeros restos de aminoácido del
IGF-I auténtico.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "glucosilado"significa
IGF-I con uno o más restos de carbohidratos
covalentemente unidos.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "intacto" significa IGF-I
que no está degradado.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "mal plegado" significa
IGF-I cuya estructura secundaria es otra de la de
IGF-I auténtico.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "multimérico" significa dos o más cadenas
polipeptídicas de IGF-I unidas por uniones químicas
covalentes o no covalentes.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "oxidado" significa IGF-I
que contiene, al menos, un resto aminoacídico oxidado.
Tal como se utiliza aquí, el término
IGF-I "reoxidado" significa
IGF-I en el que se forman una o más uniones
disulfuro intracatenarias, tras escisión de aquellas uniones.
Tal como se utiliza aquí, el término
"aproximadamente" en referencia a un valor numérico significa
+/-10% del valor, por ejemplo, "aproximadamente" 50% significa
entre 45% y 55%.
La Fig. 1 es un gráfico de flujo que compara las
etapas del proceso de Holtz con los pasos de una realización de la
invención.
La Fig. 2 es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la primera etapa de intercambio catiónico del proceso de
Holtz.
La Fig. 3 es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la primera etapa de intercambio catiónico de la invención.
La Fig. 4A una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado antes de
la etapa de desplegamiento/replegamiento en la invención.
La Fig. 4B es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado tras la
etapa de desplegamiento/replegamiento en el proceso de la
invención.
La Fig. 5A es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la etapa HIC en el proceso de Holtz.
La Fig. 5B es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la etapa HIC en el proceso de la invención.
La Fig. 6A es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la segunda etapa de la cromatografía de intercambio catiónico en
el proceso de Holtz.
La Fig. 6B es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la segunda etapa de la cromatografía de intercambio catiónico en
la invención
La Fig. 7A es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la etapa de cromatografía de filtración en gel en el proceso de
Holtz.
La Fig. 7B es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material recuperado a partir
de la etapa de cromatografía en fase reversa en la invención.
La Fig 8A es una escala analítica de un ciano
cromatograma en fase reversa de material producido por el proceso de
Holtz.
La Fig. 8B es una escala analítica típica de un
ciano cromatograma en fase reversa de material purificado por el
proceso de la invención.
La Fig. 9A es una escala analítica típica de un
cromatograma HPLC C8 en fase reversa de material purificado por el
proceso de Holtz.
La Fig. 9B es una escala analítica de un
cromatograma HPLC C8 en fase reversa de material purificado por el
proceso de la invención.
La Fig. 10A es una escala analítica de un
cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico
generados a partir de material reducido purificado por el proceso de
Holtz.
La Fig. 10B es una escala analítica de un
cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico
generados a partir de material reducido purificado por el proceso de
la invención.
La Fig. 11A es una escala analítica de un
cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico
generados a partir de material no reducido purificado por el método
de Holtz.
La Fig. 11B es una escala analítica de un
cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico
generados a partir de material no reducido purificado por el método
de la invención.
La Fig. 12A es una escala analítica de un
cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico
generados a partir de material IGF-I no reducido
correctamente plegado.
La Fig. 12B es una escala analítica de un
cromatograma en fase reversa de productos de mapeo peptídico
generados a partir de material IGF-I no reducido no
plegado.
La invención proporciona un proceso mejorado
para la purificación de IGF-I monomérico, intacto,
correctamente plegado.
El material de partida de IGF-I
con el que se pone en práctica la invención puede ser un medio
contaminado con varias sales, ácidos, bases, moléculas orgánicas
pequeñas, macromoléculas no proteicas, proteínas no
IGF-I, fragmentos de IGF-I,
IGF-I multimérico, IGF-I plegado
incorrectamente, o cualquier combinación de lo anterior. El
IGF-I puede ser de fuentes naturales o puede ser
IGF-I recombinante producido por células
eucarióticas transformadas genéticamente. En una realización
preferida, el GF-I es IGF-I
recombinante producido por levaduras transformadas genéticamente. En
una realización particularmente preferida, el IGF-I
es producido en cepas GS115 de Pichia pastoris (NRRL
Y-15851) transformadas de forma estable con el
vector de expresión pIGF201, pIGF202, pIGF204 o pIGF206. La
producción de IGF-I en la cepa GS115 de Pichia
pastoris utilizando vectores de expresión pIGF201, pIGF202,
pIGF204 e pIGF206 está descrita en Brierley y cols., Patente de
EE.UU Nº 5,324,639.
Preferiblemente, esta invención se pone en
práctica con IGF-I recombinante, que es secretado
por células de levadura transformadas. La secreción por las células
de levaduras se da como resultado cuando las células de levadura han
sido transformadas con un vector de expresión de
IGF-I que codifica una proteína precursora de
IGF-I que comprende un péptido señal
N-terminal. El péptido señal causa la secreción de
la proteína precursora de IGF-I a través de la
membrana plasmática de la célula de levadura al medio de
crecimiento. Durante el proceso de secreción, el péptido señal es
escindido para dar lugar al polipéptido IGF.I maduro.
Cuando la invención se pone en práctica con
células de levadura recombinante, el IGF-I es
secretado al medio durante un proceso de fermentación.
Etapas/procesos de fermentación particularmente preferidos están
descritos en la Patente de EE.UU Nº 5,324,639. Utilizando la
fermentación particularmente preferida que se muestra en la Patente
de EE.UU Nº 5,324,639, la cantidad de trazas de sales "PTM1"
añadidas durante la fermentación se pueden reducir beneficiosamente
a aproximadamente 10 veces, con una sola adición de 2 ml por litro
de medio de partida. Preferiblemente, los niveles de ácido
sulfúrico, cobre, zinc y hierro en el "PTM1" se reducen 3 veces
en comparación con el proceso descrito en la patente 5,324,639.
Cuando la invención se pone en práctica con
IGF-I recombinante secretado, la célula hospedadora
debe ser separada del medio que contiene IGF-I. La
eliminación celular puede darse por cualquier medio adecuado, por
ejemplo, centrifugación o microfiltración, o ambos.
Tras la separación de la célula hospedadoralar,
la primera etapa en el proceso de esta invención es poner en
contacto una solución muestra que contiene IGF-I con
una cantidad adecuada de una primera matriz de intercambio catiónico
bajo condiciones que permitan la adsorción de, al menos,
aproximadamente el 95% del IGF-I total de la
solución.
La solución que contiene IGF-I
puede ponerse en contacto con la primera matriz de intercambio
catiónico de varias maneras. Por ejemplo, la primera matriz de
intercambio catiónico puede estar dentro de un recipiente, dentro
del cual se introduce el medio que contiene IGF-I, y
después se decanta el medio reducido en IGF-I a
partir de la primera matriz de intercambio catiónico. De forma
alternativa, la primera matriz de intercambio catiónico puede
añadirse al recipiente que contiene el medio que contiene
IGF-I, seguido de separación de la solución reducida
en IGF-I a partir de la primera matriz de
intercambio catiónico. Preferiblemente, la primera matriz de
intercambio catiónico está en una columna a través de la cual se
permite el flujo del medio que contiene IGF-I.
Las matrices que pueden utilizarse en la primera
etapa de intercambio catiónico son bien conocidas en la materia.
Preferiblemente, la matriz de intercambio catiónico es compatible
con un una relación de flujo alta, es decir, capaz de soportar altas
presiones, posee una estructura microporosa, y es capaz de unir
IGF-I a lo largo de un amplio intervalo de pH. Se
pueden utilizar soportes de matriz como celulosa, poliestireno,
dextranos, agarosa, y agarosa reticulada para la primera matriz de
intercambio catiónico. Las matrices de intercambio catiónico
preferidas para usar en esta etapa son matrices sulfilpropiladas
("SP"). Una matriz de intercambio catiónico particularmente
preferida es Toyopearl SP550C^{TM} (TosoHaas, Philadelphia,
PA).
Un experto en la materia está acreditado con el
reconocimiento que antes de poner en contacto la muestras de
solución que contiene IGF-I con la primera matriz de
intercambio iónico, es necesario que la matriz sea regenerada y/o
activada. La regeneración y/o activación se llevará a cabo de
acuerdo a la recomendación del proveedor de la matriz y los métodos
conocidos en la materia.
La cantidad del material de la primera matriz de
intercambio catiónico utilizado es típicamente, al menos,
aproximadamente 0,031, a 1,0 litros de matriz por gramo de
IGF-I auténtico. Típicamente, la solución que
contiene IGF-I se pone en contacto con la primera
matriz de intercambio iónico durante aproximadamente 0,01 a 1 hora,
o más, a una temperatura de aproximadamente 2º a 30ºC. Una
temperatura de aproximadamente 20º a 25ºC es preferida.
Una vez que la solución que contiene
IGF-I ha estado en contacto con la primera matriz de
intercambio catiónico para permitir la adsorción de
IGF-I, la solución reducida en IGF-I
se separa. Esto se puede hacer de varias formas, por ejemplo,
filtración, decantación, o centrifugación. En una realización
preferida, el contacto de la solución que contiene
IGF-I y la separación del medio reducido en
IGF-I se hacen en una etapa, haciendo pasar el medio
que contiene IGF-I a través de una columna de
cromatografía que comprende la primera matriz de intercambio
catiónico.
Una vez que IGF-I ha sido
adsorbido dentro de la primera matriz de intercambio catiónico, y
antes de la elución de IGF-I, la matriz cargada con
IGF-I se lava con 3,0 volúmenes de columna de ácido
acético 0,02 M; seguido de aproximadamente 3.0 volúmenes de columna
de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5).
En algunos procesos descritos previamente, la
primera columna de intercambio catiónico cargada con
IGF-I además se lava con un ácido débil diluido (o
tampón) que contiene sal, por ejemplo, cloruro sódico 0,1 M, para
eliminar impurezas, incluyendo formas multiméricas y/o monoméricas
mal plegadas de IGF-I, que están menos fuertemente
unidas a la primera matriz de intercambio catiónico de lo que está
IGF-I. En la presente invención, dichas etapas de
lavado de alta fuerza iónica se evitan en la primera etapa de
intercambio catiónico, porque es ventajoso recuperar formas
multiméricas o monoméricas mal plegadas de IGF-I,
que pueden ser convertidas en IGF-I auténtico en la
subsiguiente etapa de desplegamiento/replegamiento, incrementando,
con ello, el rendimiento global de IGF-I
auténtico.
Una vez que la primera matriz de intercambio
catiónico cargada de IGF-I ha sido lavada (tal como
se describe arriba), se eluye el IGF-I por contacto
de la matriz con una cantidad suficiente de un sistema disolvente
("tampón de elución") que tiene un pH o fuerza iónica lo
suficientemente altos como para desplazar sustancialmente todo el
IGF-I de la matriz.
El tampón de elución comprenderá un agente
tamponante adecuado para mantener un pH en el intervalo de 5,0 a
7,0, y una concentración salina de aproximadamente 0,2 a 1,0 M. Un
tampón de elución preferido consiste en acetato sódico 0,05 M (pH
5,5) y cloruro sódico 0,4 M.
La cantidad de tampón de elución utilizada es
variable, pero preferiblemente es entre 3 y 10 volúmenes de columna.
Cuando el tampón de elución cosiste en acetato sódico 0,05 M (pH
5,5) y cloruro sódico 0,4 M, la cantidad de tampón de elución
preferida es cuatro volúmenes de columna.
La elución de IGF-I de la matriz
de intercambio catiónico se puede hacer bajo varias condiciones.
Preferiblemente, se emplea una temperatura de aproximadamente 2º a
30ºC. Preferiblemente, el tiempo de elución es relativamente corto,
es decir, aproximadamente 0,01 a 1,0 horas, aunque se pueden emplear
tiempos más largos o cortos.
Una característica esencial de esta invención es
la inclusión de una etapa de desplegamiento/replegamiento de
IGF-I, seguido de la etapa de primer intercambio
catiónico. Para la etapa de desplegamiento/replegamiento, el eluato
de intercambio catiónico se transfiere a un tampón que promueve
intercambio de uniones disulfuro ("tampón de
desplegamiento/replegamiento"). Dicha transferencia puede ser por
cualquiera de varias maneras, incluyendo dilución, filtración en
gel, diálisis, o diafiltración.
El tampón de desplegamiento/replegamiento,
generalmente, puede estar caracterizado como alcalino, débilmente
reductor, débilmente desnaturalizante y solubilizante. El tampón
puede ser capaz de: 1) reducir las uniones disulfuro intracatenarias
del IGF-I y promover desplegamiento de la proteína
IGF-I sin desnaturalización permanente; y (2)
permitir replegamiento del IGF-I con reoxidación,
para formar uniones disulfuro intracatenarias correctamente
emparejadas de IGF-I.
El tampón de desplegamiento/replegamiento tiene
un pH de entre 8,5 y 10,0 y comprende urea a una concentración de
1,5 a 3,0 M, cloruro sódico a una concentración de 1,0 a 3,0 M,
etanol a una concentración de 5 a 20% (v/v), borato sódico a una
concentración de 1 mM a 15 mM, y ditiotreitol a una concentración de
0,005 mM a 10 mM. Lo más preferiblemente, el pH del tampón de
desplegamiento/replegamiento está entre aproximadamente 9,0 y 9,5 y
el tampón consiste en urea 2 mM, cloruro sódico 1,5 mM, etanol al
15%, borato sódico 5 mM y DTT 0,2 mM.
Preferiblemente, la concentración total de
IGF-I está entre aproximadamente 0,1 y 5 mg/ml; más
preferiblemente, esta concentración está entre 0,2 y 2 mg/ml.
Preferiblemente, la composición del tampón de
desplegamiento/replegamiento y las concentraciones de los
componentes son tales que el replegamiento y la reoxidación comienza
dentro de una hora del desplegamiento y la reducción, y
esencialmente se completa dentro de 4 a 40 horas. Más
preferiblemente, el replegamiento y la reoxidación esencialmente se
completan dentro de 15 a 20 horas.
Cuando se utiliza el tampón de
desplegamiento/replegamiento más preferido (descrito arriba), la
reducción de disulfuro puede ocurrir en segundos. Con agitación
suave en presencia de aire, a temperatura ambiente, la reoxidación
puede comenzar dentro de aproximadamente una hora. El replegamiento
y reoxidación esencialmente se completan dentro de aproximadamente
15 a 20 horas.
Tras la etapa de desplegamiento/replegamiento,
el IGF-I parcialmente purificado y replegado se pone
en contacto con una cantidad suficiente de una matriz HIC, para
adsorber, al menos, aproximadamente el 95% del
IGF-I. Preferiblemente, la matriz HIC está en una
columna a través de la cual pasa el tampón que contiene
IGF-I.
Previamente a contactar una solución de
IGF-I replegado con la matriz HIC, se ajusta el pH y
la concentración salina de la muestra que contiene
IGF-I. Preferiblemente, el pH se ajusta a entre 4,0
y 5,0, y la concentración salina se ajusta a entre 0,4 M y 2,0 M.
Más preferiblemente el pH se ajusta a entre 4,0 y 4,5, y la
concentración salina se ajusta a entre 1,0 y 1,5 M.
Aumentando la concentración salina del medio que
contiene IGF-I se promueve la unión de
IGF-I a la matriz HIC. Sales adecuadas para dicho
uso incluyen sulfato sódico, sulfato potásico, sulfato amónico,
fosfato potásico, acetato sódico, acetato amónico, cloruro sódico,
citrato sódico.
Matrices HIC adecuadas para uso en esta
invención son matrices HIC alquil o
aril-sustituidas. Matrices HIC ilustrativas incluyen
matrices butil-, octil-, o fenil-sustituidas.
Soportes de matrices HIC útiles en la práctica de la presente
invención incluyen polímeros sintéticos, por ejemplo, poliestireno,
poli(metacrilatos), etc; celulosa, dextranos, agarosa,
agarosa reticulada.
Una matriz HIC particularmente preferida es una
matriz de polimetacrilato de cromatografía de interacción
hidrofóbica butil-sustituida (por ejemplo, Toyopearl
Butyl 650M^{TM}o Toyopearl Butyl 650C, TosoHaas, Philadelphia,
PA).
Tras cualquier regeneración necesaria, la
columna se equilibra con 5 a 10 volúmenes de un tampón
acetato/fosfato que contiene sal, que tiene un pH de aproximadamente
2,5 a 4,5, y preferiblemente aproximadamente 3,0.
La cantidad de matriz HIC utilizada en la
práctica de esta invención puede variar. Típicamente,
aproximadamente se utiliza 0,05 a 1 litro de matriz por gramo de
IGF-I auténtico.
Típicamente, el IGF-I se
contacta con la matriz HIC durante al menos aproximadamente 0,1 a 30
minutos, con una temperatura de aproximadamente 15 a 30ºC. Una
temperatura entre 20º y 25ºC es preferida.
Una vez que sustancialmente todo el
IGF-I ha sido adsorbido por la primera matriz HIC,
la matriz se contacta (es decir, "se lava") con un tampón que
elimina una cantidad significativa de material contaminante (es
decir, otro material que no sea IGF-I monomérico,
intacto, correctamente plegado) de la matriz, sin eliminar
cantidades significativas de la forma intacta, monomérica,
correctamente plegada del IGF-I adsorbido. En un
procedimiento de lavado de columna particularmente preferido, la
columna HIC se lava con aproximadamente tres volúmenes de columna de
ácido acético 0,2 M, que contiene cloruro sódico 0,5 M. Luego, la
columna HIC se lava con aproximadamente diez volúmenes de columna de
ácido acético 0.2 M, que contiene cloruro sódico 0,15 a 0,25 M.
En la finalización del procedimiento del lavado
de la columna, la matriz HIC se pone en contacto con un tampón de
elución HIC, es decir, un tampón adecuado para eliminar
sustancialmente todo el IGF-I auténtico adsorbido
restante de la matriz.
El IGF-I adsorbido puede ser
eluido de la matriz HIC bajo varias condiciones. Preferiblemente, la
temperatura del tampón de elución está entre 15º y 30ºC. Más
preferiblemente, está entre 20º y 25ºC. El tiempo de elución variará
en función de las dimensiones de la columna y del material de la
matriz. El flujo de eluyente a través de la columna es
preferiblemente de aproximadamente 10 a 300 cm/h.
Un procedimiento de elución HIC particularmente
preferido consiste en aplicar aproximadamente cuatro volúmenes de
columna de ácido acético 0,2 M, que contiene cloruro sódico 0 a 0,02
M, y que tiene un pH de 3,0.
Una etapa HIC que incluye los materiales y
procedimientos particularmente preferidos descritos tienen varias
ventajas sobre los procesos de la técnica anterior: (1) evitan
precipitación potencial de IGF-I asociada con
impurezas en sulfato amónico; (2) es más simple, en virtud de que
evita un gradiente salino; y (3) se evitan los cambios de pH.
Opcionalmente, parte, o todo el eluato de la
matriz HIC puede ser sometido a una segunda ronda de purificación
HIC. Opcionalmente, parte, o todo el lavado de la matriz HIC puede
ser sometido a desplegamiento/replegamiento, seguido de una segunda
ronda de HIC.
\vskip1.000000\baselineskip
El IGF-I parcialmente purificado
obtenido a partir de la etapa HIC se someta a una segunda etapa de
purificación por intercambio catiónico. Los principios implicados en
la selección de materiales y procedimientos en la segunda etapa de
intercambio catiónico son esencialmente los mismos que en la primera
etapa de intercambio catiónico. Por consiguiente, típicamente se
utiliza el mismo tipo de matriz de intercambio catiónico en las
etapas primera y segunda de intercambio catiónico. En la realización
más preferida de la invención, la segunda etapa de intercambio
catiónico incluye los siguientes procedimientos.
Una columna de intercambio catiónico,
preferiblemente una columna SP, y lo más preferiblemente una columna
Toyopearl SP550C^{TM}, SP650S^{TM}, o
CM-650M^{TM} TosoHaas), (previamente regenerada)
se equilibra con un tampón que consiste esencialmente en tampón de
acetato sódico 0,05 M (pH 5,5). Tras cargar IGF-I
parcialmente purificado obtenido a partir de la etapa HCI dentro de
la columna de intercambio catiónico, preferiblemente, la columna se
lava con 7-10 volúmenes de columna de tampón de
acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) que contiene NaCl 0,1 M. Luego, el
IGF-I preferiblemente se eluye en aproximadamente 7
volúmenes de columna de tampón de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) que
contiene cloruro sódico 0,4 M.
La cantidad de la segunda matriz de intercambio
catiónico utilizada, es decir, el tamaño de la segunda columna de
intercambio catiónico dependerá de la cantidad total de
IGF-I a ser adsorbido en la matriz. El proveedor
comercial proporciona las capacidades de varias matrices de
intercambio catiónico disponibles comercialmente, y el cálculo de la
relación correcta de la matriz con IGF-I está dentro
del nivel de expertos en la materia.
El IGF-I parcialmente
purificado, replegado obtenido en la etapa del segundo intercambio
catiónico se somete a una etapa de cromatografía en fase reversa. En
un punto correspondiente en los métodos para IGF-I
previamente descritos, se ha utilizado una cromatografía de
filtración en gel. La filtración en gel elimina contaminantes de
alto peso molecular. Asimismo, la cromatografía en fase reversa de
la presente invención elimina contaminantes de alto peso molecular.
Además, sin embargo, la etapa de cromatografía en fase reversa
elimina varias formas de IGF-I no auténticas,
incluyendo formas oxidadas, glucosiladas, y parcialmente
degradadas.
Se usa cromatografía en fase reversa de resina
polimérica. Entre las ventajas del medio de polímero de resina está
la estabilidad química que permite despirogenación y salubridad con
hidróxido sódico. Un medio de cromatografía en fase reversa
particularmente preferido es Aberchrom CG1000sd^{TM} (TosoHaas,
Philadelphia, PA). Disolventes orgánicos ilustrativos para uso en la
etapa de cromatografía en fase reversa son metanol, etanol,
2-propanol, y acetonitrilo. Etanol es
particularmente preferido.
La muestra de IGF-I parcialmente
purificada obtenida a partir de la segunda etapa de intercambio
catiónico se carga dentro de la columna de fase reversa, después de
que la columna ha sido equilibrada con ácido acético 0,2 M.
La columna de fase reversa, con
IGF-I adsorbido, luego se somete a un primer lavado
isocrático con aproximadamente un volumen de columna de ácido
acético 0,2 M. Luego, la columna se somete a un segundo lavado
isocrático con etanol al 19% en ácido acético 0,2 M, para eliminar
contaminantes menos hidrofóbicos que el IGF-I
auténtico (por ejemplo, oxidados, glucosilados y algunos
parcialmente degradados, por ejemplo, des-2
IGF-I, formas de
IGF-I).
IGF-I).
El IGF-I auténtico se recupera a
través de elución isocrática con un tampón acuoso/orgánico, seguido
de elución en gradiente. La elución isocrática es con cuatro
volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que contiene etanol al
19%, y el gradiente (escalonado o lineal) de etanol de 19% a 25%
(v/v), en ácido acético 0,2 M. Los materiales contaminantes más
hidrofóbicos que el IGF-I auténtico permanecen
adsorbidos a la columna y, por ello, se separan del
IGF-I auténtico. Más eluciones de
IGF-I se llevan a cabo con un gradiente de solvente
orgánico. El gradiente de etanol puede ser un gradiente escalonado o
un gradiente lineal.
Tras elución del IGF-I
auténtico, los restantes componentes adsorbidos, es decir, los que
son más hidrofóbicos que el IGF-I auténtico, se
"destilan" (separan) de la columna en fase reversa.
Preferiblemente, la columna se desntila con una alta concentración
de etanol, es decir, una concentración entre aproximadamente 70% y
100%.
Tras la etapa de cromatografía en fase reversa,
el IGF-I auténtico purificado se somete a un
procedimiento de concentración que implica ultrafiltración. El
propósito de esta etapa es concentrar el IGF-I
purificado a una concentración final de aproximadamente
12-16 mg/ml y reemplazar el tampón de elución de la
cromatografía en fase reversa con un tampón adecuado para etapas
subsiguientes en la formulación del producto final.
Membranas de ultrafiltración, hechas de varios
materiales y que tienen varios tamaños de poro (los cuales
determinan el corte de peso molecular), están disponibles
comercialmente. En una realización preferida de la invención, se
pueden utilizar membranas planas de polisulfona, con un corte de
peso molecular de 1000 (Filtron, Northborough, MA). En una
realización más preferida, se utilizan membranas de fibra hueca de
polisulfona con un corte de peso molecular de 3000 o 5000 (AG
Technology, Needham, MA). Las membranas de fibra hueca tienen
relaciones de flujo mayores y mejor capacidad de retención de
IGF-I que las membranas planas, a pesar de la
diferencia en las especificaciones de corte de peso molecular.
La concentración/diafiltración se puede realizar
a la conclusión de cualquier, o todos, las etapas anteriores en el
proceso. Por ejemplo, en casos donde la purificación del material se
termina en distintos lugares, la concentración/diafiltración se
puede realizar tras la etapa HIC. Las necesidades del experto pueden
dictar cuándo se realiza la etapa de
concentración/diafiltración.
En cada etapa del proceso de purificación de
IGF-I, se ensayan, preferiblemente por uno o más
métodos analíticos, alícuotas de muestras que contienen
IGF-I, soluciones reducidas en el número de
IGF-I, lavados de columna y fracciones completas.
Dichos ensayos permiten que sean monitorizados aspectos
seleccionados del proceso de purificación. El ensayo apropiado para
una muestra dada dependerá del tipo de muestra y de la información
buscada. Por ejemplo, puede ser deseable ensayar
IGF-I, o contaminantes, o ambos.
Se conocen varios métodos analíticos de
IGF-I, incluyendo, por ejemplo,
SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, Transferencia
Western, mapeo peptídico, secuenciación de aminoácido
N-terminal, y HPLC. Los métodos analíticos de
IGF-I preferidos para su uso en conexión con esta
invención son los métodos HPLC, por ejemplo, C4 RP HPLC, C8 RP HPLC,
HPLC de intercambio catiónico o SEC HPLC. Uno o más de estos métodos
de HPLC se utilizan típicamente para ensayar fracciones de
cromatografía en columna durante todo el proceso de
IGF-I.
Otro método analítico de IGF-I
preferido es "cromatografía ciano en fase reversa" (YMC,
Wilmington, NC). Cuando se utiliza la cromatografía ciano en fase
reversa como método analítico en conexión con la presente invención,
se utiliza un gradiente superficial de acetonitrilo con ácido
trifluoroacético al 0,1% ("TFA") para separar y cuantificar
IGF-I auténtico y las formas principales
contaminantes no auténticas e IGF-I.
El proceso del estado de la técnica, descrito
esencialmente en Holtz (arriba), y el proceso preferido de esta
invención, se compararon en pruebas experimentales efectuadas sobre
una escala de desarrollo de fermentación de 10 litros. El material
de partida que contiene IGF-I consistía en el caldo
de fermentación de 10 litros de la cepa GS115 de P. Pastoris.
Esta cepa está establemente transformada con el plásmido pIGF206,
que codifica IGF-I humano recombinante con un
péptido señal N-terminal. Debido a la presencia del
péptido señal, el IGF-I humano recombinante se
secreta dentro del medio de crecimiento de P. Pastoris. El
medio de crecimiento y las condiciones de fermentación se describen
en Holtz (arriba). Se redujo 10 veces la adición de trazas de sal de
PTM1; además, se redujeron aproximadamente 3 veces los niveles de
ácido sulfúrico, cobre, zinc y hierro en PTML.
Durante la fermentación, se secretaron al medio
de crecimiento varias formas de IGF-I. La Fig. 2
muestra un ciano cromatograma en fase reversa típico del
IGF-I recuperado a partir de la primera etapa de
intercambio catiónico. Estas formas de IGF-I
incluyen eluato de IGF-I auténtico (aproximadamente
el 18% de IGF-I total) a los 7,3 minutos; eluato de
IGF-I monomérico mal plegado (aproximadamente el
15%) a los 5,08 minutos; eluato de forma monomérica degradada o
fragmentada en el amino terminal (des-2)
(aproximadamente el 1% del total) a los 6,0 minutos; eluato de
formas monoméricas oxidadas y glucosiladas (aproximadamente el 7%
del total) a los 6,7 minutos; eluato de una variedad de formas
monoméricas degradadas o rotas (aproximadamente el 7% del total)
entre 8 y 11 minutos; y eluato de numerosas formas multiméricas
(aproximadamente el 50% del total) entre 11 y 22 minutos.
La Tabla I compara las etapas básicas del
proceso de Holtz con las etapas preferidas en el proceso de esta
invención. Los cambios de optimización para las etapas en el proceso
de Holtz se resumen en la Tabla II. Los rendimientos de
IGF-I auténtico (determinado por análisis de
cromatografía ciano en fase reversa) en cada etapa en el proceso se
muestran en la Tabla III. Los datos de la Tabla III respecto al
proceso preferido de esta invención son valores promedio que
representan seis pistas de producción de 10 litros. Los datos de la
Tabla III, en relación con el proceso de la técnica anterior, son a
partir de una pista de producción de 10 litros.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la separación celular, el medio de
fermentación libre de células se cargó dentro de una columna
Toyopearl SP550C^{TM} de 270 ml (Tosohaas, Philadelphia, PA) (5 cm
x 14 cm), a una relación de flujo de 130 ml/min, a
20-25ºC. La columna cargada, primero se lavó con
aproximadamente 3 volúmenes de columna de ácido acético 0,02 M y
luego se lavó con aproximadamente 3 volúmenes de columna de acetato
sódico 0,05 M (pH 5,5), a caudal de 130 ml/min, a
20-25ºC. IGF-I se eluyó de la
columna con cuatro volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M (pH
5,5), cloruro sódico 0,4 M. El material recuperado de la etapa del
primer intercambio catiónico está resumido en la Tabla IV.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera etapa de intercambio catiónico en el
proceso de esta invención difiere de la primera etapa de intercambio
catiónico en el proceso de Holtz en que el cloruro sódico en el
segundo tampón de lavado se ha eliminado. Esto permite, de forma
ventajosa, la recuperación de las formas multiméricas de
IGF-I (que son convertidas en formas monoméricas en
la subsiguiente etapa de desplegamiento/replegamiento). El aumento
en la cantidad de IGF-I multimérico recuperado se ve
comparando los cromatogramas analíticos del producto del primer
intercambio catiónico de Holtz ("SP1") y el producto SP1
obtenido utilizando el proceso de la invención. Excepto por los
niveles de IGF-I multimérico, no hay diferencias
significativas entre los dos perfiles de cromatografía SP1 (Figs. 2
y 3).
El conjunto SP1 recuperado se combinó con una
variedad concentrada (concentración 2X) de tampón de
desplegamiento/replegamiento para producir las siguientes
concentraciones finales: urea 2 M; cloruro sódico 1,5 M; etanol al
15%; borato sódico 5 mM; y DTT 0,2 mM (pH 9-9,5). Se
permitió a proceder el desplegamiento/replegamiento, con mezclado
suave, a temperatura ambiente durante 15 a 20 horas. Cromatogramas
ciano en fase reversa típicos a partir de análisis hechos antes y
después de la etapa de desplegamiento/replegamiento se muestran en
las Figs. 4A y 4B. Las cantidades relativas de las varias formas de
IGF-I (como porcentaje de IGF-I
total) antes y después de la etapa de desplegamiento/replegamiento
se presentan en la Tabla V. La reducción en picos de
IGF-I multimérico y el aumento en el pico de
IGF-I auténtico son claramente visibles en las Figs.
4A y 4B. Como resultado de los picos multiméricos reducidos,
IGF-I auténtico se incrementó de 14% a 44% del
IGF-I total presente. Puesto que un alto porcentaje
de IGF-I multimérico es convertido a monomérico (64%
de multimérico reducido a 21% multimérico) también hay un aumento en
la cantidad de algunas formas monoméricas no auténticas. Por
ejemplo, la formas oxidadas y glucosiladas (7,25 minutos) aumentaron
de 5% a 12% del total; una forma degradada, llamada des 2 (6,86
minutos) aumentó de 1,5% a 3,4% (Tabla V).
Sin embargo, se debe tener en cuenta que la
relación de formas monoméricas no auténticas con el
IGF-I auténtico no aumentó, porque la cantidad de
IGF-I auténtico también aumentó. No se identificaron
nuevos contaminantes como resultado de la etapa de
desplegamiento/replegamiento. El proceso de
desplegamiento/replegamiento se ha llevado a cabo en experimentos
correspondientes a la escala de fermentación de 100 litros y 1500
litros, y se obtuvieron resultados comparables (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la preparación para cargar en la columna HIC,
el pH del conjunto replegado se ajustó a 4,2 con ácido acético y
luego, se diluyó con un volumen igual de cloruro sódico 1 M. El
conjunto replegado con pH ajustado, que contiene cloruro sódico 1,25
M, se cargó dentro de la columna HIC Toyopearl Butyl 650M^{TM}
(TosoHaas, Philadelphia, PA) (3,2 cm x 47 cm) a 40 ml/min, a
20-25ºC.
La columna HIC, con IGF-I
adsorbido, se lavó con aproximadamente tras volúmenes de columna de
ácido acético 0,2 M que contienen cloruro sódico 0,5 M. Luego, la
columna HIC se lavó con aproximadamente diez volúmenes de columna de
ácido acético 0,2 M que contienen cloruro sódico 0,25 M. Luego, el
IGF-I adsorbido se eluyó de la columna HIC con
cuatro volúmenes de ácido acético 0,2 M, que contienen cloruro
sódico 0,02 M.
En las Figuras 5A y 5B se muestran ciano
cromatogramas en fase reversa típicos a partir de análisis del
producto recuperado tras la etapa HIC. Esencialmente no existe
diferencia en los perfiles cromatográficos. Las cantidades relativas
de las variadas formas de IGF-I (como porcentaje de
IGF-I total) tras la etapa HIC en el proceso de
Holtz y en el proceso de esta invención se presentan en la Tabla
VI.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa de segundo intercambio catiónico se
llevó a cabo en una columna Toyopearl SP550C (TosoHaas,
Philadelphia, PA), a una relación de flujo de 10 ml/min.
Tras la carga, la segunda columna de intercambio
catiónica se lavó con aproximadamente un volumen de columna de
tampón de acetato sódico 0,05 M (pH 5,5). Luego, la columna se lavó
con aproximadamente 7 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M,
cloruro sódico 0,1 M (pH 5,5). El IGF-I se eluyó con
aproximadamente 7 volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M,
cloruro sódico 0,4 M (pH 5,5). Las cantidades relativas de las
variadas formas de IGF-I (como porcentaje de
IGF-I total) tras la etapa de segundo intercambio
catiónico en el proceso de Holtz y en el proceso de esta invención
se presentan en la Tabla VII.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El material recuperado de la etapa de segundo
intercambio catiónico se cargó dentro de una columna de
cromatografía en fase reversa Aberchromb CG1000sd^{TM} (TosoHaas,
Philadelphia, PA) (2,6 cm x 21 cm), equilibrada con aproximadamente
3 volúmenes de columna de tampón de ácido acético 0,2 M (20 ml/min
de relación de flujo). Tras la carga, la columna de fase reversa se
lavó con un volumen de columna de ácido acético 0,2 M. Luego, la
columna se lavó con cuatro volúmenes de ácido acético 0,2 M que
contienen etanol al 19% (la relación de flujo se redujo a 15
ml/min). El IGF-I se eluyó a partir de la columna de
fase reversa utilizando un gradiente de etanol de 19% a 25%. Tras la
recuperación de IGF-I, la columna se desnudó con una
alta concentración de etanol (es decir, 70-100%). La
Fig. 7 muestra ciano cromatogramas en fase reversa típicos de
análisis del producto de la filtración en gel de Holtz y del
producto en fase reversa del proceso de esta invención. Las
cantidades relativas de las variadas formas de IGF-I
(como porcentaje de IGF-I total) tras la etapa de
filtración en gel en el proceso de Holtz y la etapa de cromatografía
en fase reversa en el proceso de esta invención se presentan en la
Tabla VIII.
Con el fin de asegurar la pureza, identidad y
potencia del producto final obtenido en la práctica de esta
invención, se han empleado varias pruebas.
La pureza e identidad del producto se determinó
por SDS-PAGE. El producto del proceso de esta
invención co-migra con el patrón de referencia del
proceso de Holtz, y no contiene cantidades detectables de proteínas
de peso molecular superior (datos no mostrados).
Proteínas que no eran IGF-I se
midieron por ensayos de Western Blot y ELISA. Para esta prueba, se
levantaron anticuerpos primarios frente a proteínas recuperadas a
partir de la primera etapa de intercambio catiónico de un control
negativo de fermentación de Pichia pastoris. Los anticuerpos
se utilizaron para sondear la presencia de proteínas contaminantes
de la célula hospedadora. La cantidad de proteína contaminante de la
célula hospedadora es aproximadamente 10 veces menos en el producto
del proceso de la presente invención, en comparación con el producto
del proceso de Holtz. Se utilizaron ensayos de ELISA de mancha en
ranura ("slot blot") para hacer determinaciones cuantitativas.
LA Tabla IX resume los resultados de la determinación por ELISA.
La pureza del producto final también se evaluó
utilizando una ciano columna de fase reversa (Cyano Zorbax, MacMod
Analytical, Chadds Ford, PA). Se utilizó un gradiente superficial de
acetonitrilo con tampón fosfato 25 mM a pH 6,8 para separar los
análogos principales de IGF-I y determinar la
concentración y pureza del IGF-I auténtico. Este
ensayo ciano de fase reversa resuelve de forma exitosa varios
análogos de IGF-I (oxidados y glucosilados) a partir
del IGF-I auténtico. La Tabla X resume los
resultados de pureza para tres lotes del material producido por el
proceso de esta invención, en comparación con varios lotes
producidos por el proceso de Holtz. El cromatograma HPLC en fase
reversa en la Fig. 8 muestra la comparación entre el proceso de
Holtz y el proceso de esta invención.
Se utilizó HPLC de exclusión de tamaño para
detectar la presencia de agregados de alto peso molecular en el
producto. LA Tabla XI resume los resultados de las pruebas de cada
lote. El proceso de esta invención elimina de forma eficaz los
materiales de alto peso molecular del producto.
Los geles de enfoque isoeléctrico también
confirman la identidad de los productos del proceso de esta
invención, cuando se comparan con los productos producidos por el
proceso de Holtz (datos no mostrados).
La secuenciación N-terminal del
producto confirmó la secuencia correcta de la proteína, con respecto
al producto producido por el proceso de Holtz y la secuencia de
IGF-I humano recombinante publicada.
Los resultados del mapeo peptídico para el
producto de esta invención son idénticos a los resultados obtenidos
con el material del proceso de Holtz. Ambos mapas reducidos y no
reducidos coinciden. La Fig. 10 ilustra los resultados de los
estudios de mapeo. Debido a que el producto producido por el proceso
de esta invención está replegado, el tiempo d retención del
IGF-I no digerido por RP-HPLC y en
picos del mapa del péptido no reducido confirman el plegamiento
correcto del IGF-I producido por el proceso de esta
invención. Además, la Fig. 11 muestra los mapas peptídicos de
IGF-I no plegado obtenido a partir del proceso de
purificación. Como se esperaba, el mapa no reducido difiere de los
mapas del IGF-I auténtico plegado correctamente.
Se ha realizado, además, caracterización de
identidad por espectroscopia de masas. Se observó un componente
principal, con una masa de 7649 +/- 5 AMU, para cada lote de
material a partir del proceso de esta invención. También están
presentes componentes secundarios, de intensidad similar a aquellos
en el material del proceso de Holtz.
Resultados del ensayo
radio-receptor para el material producido por el
proceso de esta invención concuerdan bien con la potencia esperada
del producto, basado en ensayos de HPLC y espectroscopia
ultravioleta de proteína total.
La potencia biológica de los variados lotes de
material producido por el proceso de esta invención también se
probaron en un bioensayo mitogénico. IGF-I es un
potente mitógeno. Su efecto se midió por la incorporación de
dimetiltiazol-2 il difeniltetrazolium (MT) dentro
del ADN de la línea celular MG-63 de osteosarcoma
humano. La potencia de varios lotes de IGF-I
producido por ambos procesos son comparables (datos no
mostrados).
Los productos producidos por el proceso de esta
invención tienen las características esperadas del
rhIGF-I auténtico. La pureza del producto ha
aumentado en aproximadamente 1-4% sobre el producto
del proceso de Holtz.
Claims (26)
1. Un proceso para purificar correctamente el
factor I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I)
monomérico correctamente plegado, a partir de un medio que contiene
péptidos IGF-I, que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto el medio con una cantidad
suficiente de una primera matriz de intercambio catiónico bajo
condiciones que permiten la adsorción de, al menos, aproximadamente
el 95% de IGF-I total a partir del medio;
(ii) lavar la primera matriz de intercambio
catiónico cargada con IGF-I con un primer tampón de
lavado de intercambio catiónico;
(iii) eluir todas las formas de
IGF-I adsorbidas a partir de la matriz de
intercambio catiónico de la etapa (i) por contacto de dicha matriz
de intercambio catiónico con una cantidad suficiente de un primer
tampón de intercambio catiónico, que tiene un pH o fuerza iónica
suficientemente altos para desplazar sustancialmente todos dichos
IGF-I auténticos y no auténticos a partir de dicha
matriz de intercambio catiónico;
(iv) poner el contacto IGF-I
eluído a partir de la etapa (iii), tras transferirlo dentro de un
sistema disolvente adecuado, con una cantidad suficiente de una
matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica bajo condiciones
que permitan la adsorción de, al menos, aproximadamente el 95% de
dicho IGF-I a partir de dicho eluato;
(v) lavar la matriz de cromatografía de
interacción hidrofóbica cargada de IGF-I con un
tampón de lavado de interacción hidrofóbica que tiene una fuerza
iónica suficientemente baja para eliminar la mayoría de los
IGF-I no auténticos, pero no tan baja como para
eliminar una proporción importante de IGF-I
auténtico de la matriz de cromatografía de interacción
hidrofóbica.
(vi) eluir IGF-I adsorbido a
partir de dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica
poniendo en contacto dicha matriz con un tampón de elución de
interacción hidrofóbica, que tiene un pH suficientemente alto, o una
fuerza iónica suficientemente baja, para causar desplazamiento de
sustancialmente todo el IGF-I auténtico adsorbido de
dicha matriz;
(vii) poner en contacto el eluato de la etapa
(vi) con una cantidad suficiente de una segunda matriz de
intercambio catiónico bajo condiciones que permiten adsorción de, al
menos, aproximadamente el 95% del IGF-I a partir del
eluato;
(viii) lavar la segunda matriz de intercambio
catiónico cargada con IGF-I con un tampón de lavado
de intercambio catiónico que tiene una fuerza iónica lo
suficientemente alta, o pH suficientemente alto, para eliminar una
porción importante de IGF-I auténtico, pero no tan
alto como para eliminar una proporción significativa de
IGF-I auténtico;
(ix) eluir el IGF-I adsorbido a
partir de dicha segunda matriz de intercambio catiónico por contacto
de dicha matriz con un segundo tampón de elución de intercambio
catiónico, que tiene una fuerza iónica lo suficientemente alta, o pH
suficientemente alto, para desplazar sustancialmente todo el
IGF-I auténtico adsorbido a partir de dicha matriz;
y
(x) someter el IGF-I auténtico
eluido a partir de la etapa (ix) a otra etapa de cromatografía;
caracterizado porque, el lavado de la
etapa (ii) comprende aplicar 3,0 volúmenes de columna de ácido
acético 0,02 M, seguido de 3,0 volúmenes de columna de acetato
sódico 0,05 M (pH 5,5), a dicha primera matriz de intercambio
catiónico, con el fin de separar una cantidad sustancial de material
no IGF-I adsorbido sin separar una cantidad
sustancial de IGF-I auténtico o no auténtico,
previamente a la etapa (iv); el eluato que contiene
IGF-I de la etapa (iii) se transfiere a un tampón de
desplegamiento/replegamiento, que comprende urea entre 1,5 y 3,0 M,
cloruro sódico de entre 1,0 y 3,0 M, entre 5% y 20% (v/v) de etanol,
borato sódico entre 1 mM y 15 mM, y ditiotreitol entre 0,005 mM y
10.0 mM, y que tiene un pH entre 8,5 y 10,0, con el fin de: (a)
reducir las uniones disulfuro intracatenarias de la proteína
IGF-I y promover desplegamiento sin
desnaturalización permanente; y (b) permitir replegamiento del
IGF-I y reoxidación para formar uniones disulfuro
intracatenarias correctamente emparejadas, para formar
IGF-I replegado; y más aún, caracterizado por
que la etapa de cromatografía de la etapa (x) es una etapa de
cromatografía en fase reversa que comprende: (c) poner en contacto
el eluato de la etapa (ix), en un tampón acuoso, con una matriz de
resina polimérica de cromatografía en fase reversa para adsorber, al
menos, aproximadamente 95% del IGF-I del eluato; (d)
lavar la matriz de cromatografía en fase reversa cargada de
IGF-I con un tampón de lavado en fase reversa
acuoso/orgánico, donde dicha etapa de lavado comprende aplicar un
volumen de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene 0% de
etanol, seguido de 4 volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M que
contiene 19% de etanol, a dicha matriz de cromatografía en fase
reversa, con el fin de separar una proporción sustancial de
IGF-I no auténtico pero no separar una proporción
significativa de IGF-I auténtico; y (e) eluir el
IGF-I adsorbido de dicha matriz de cromatografía en
fase reversa por elución con un tampón acuoso/orgánico, donde dicha
etapa de elución comprende aplicar a dicha matriz de cromatografía
en fase reversa cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M,
que contienen 19% de etanol, seguido de un gradiente de 19% a 25% de
etanol (v/v), en ácido acético 0,2 M, donde el gradiente se
selecciona del grupo que consiste en gradiente lineal y gradiente
escalonado, con el fin de separar sustancialmente todo el
IGF-I auténtico sin eliminar una proporción
significativa de formas multiméricas de IGF-I.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicho IGF-I es un IGF-I recombinante
humano.
3. El proceso de la reivindicación 2, donde
dicho IGF-I recombinante humano está producido en
células transformadas de levadura.
4. El proceso de la reivindicación 3, donde
dichas células transformadas de levadura son de la especie Pichia
pastoris.
5. El proceso de la reivindicación 4, donde
dicha especie Pichia pastoris es de la cepa GS115.
6. El proceso de la reivindicación 3, donde
dicho IGF-I es secretado dentro del medio de
crecimiento de levaduras.
7. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha matriz de primer intercambio catiónico en la etapa (i) está
sulfopropilada y presente en una columna de cromatografía.
8. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha elución en la etapa (III), comprende aplicar a dicha matriz de
primer intercambio catiónico entre 3 y 10 volúmenes de columna de
acetato sódico 0,05 M (pH 5,5) y cloruro sódico 0,4 M.
9. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicho tampón de desplegamiento/replegamiento comprende urea 2 M,
cloruro sódico 1,5 M, etanol al 15%, borato sódico 5 mM y DDT 0,2 mM
y tiene un pH entre 9,0 y 9,5.
10. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica en la etapa
(iv) es una matriz de polimetacrilato
butil-sustituída.
11. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha etapa de lavado (v) comprende aplicar a dicha matriz de
cromatografía de interacción hidrofóbica tres volúmenes de columna
de ácido acético 0,2 M, que contienen cloruro sódico 0,5 M; seguido
de 10 volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que contiene
cloruro sódico de 0,15 a 0,25 M.
12. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha etapa de elución (vi) comprende aplicar a dicha matriz de
cromatografía de interacción hidrofóbica cuatro volúmenes de columna
de ácido acético 0,2 M, que contienen cloruro sódico de 0 a 0,02 M,
y que tiene un pH de 3,0.
13. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha matriz de segundo intercambio catiónico en la etapa (vii) está
sulfilpropilada y presente en una columna de cromatografía.
14. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha etapa de lavado (viii) comprende aplicar a dicha matriz de
segundo intercambio catiónico siete volúmenes de columna de tampón
de acetato sódico 0,05 M, que contiene NaCl 0,1 M, y que tiene un pH
de 5,5.
15. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicho segundo tampón de elución de intercambio catiónico en la etapa
(ix) comprende siete volúmenes de columna de acetato sódico 0,05 M,
cloruro sódico 0,4 M, que tiene un pH de 5,5.
16. Un proceso según se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, donde el medio es un medio
celular de levadura que contiene IGF-I recombinante
a partir del cual se han separado células de levaduras
transformadas.
17. Un proceso según se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, donde el eluato que contiene
IGF-I de la etapa (iii) de la reivindicación 1 está
en contacto con el tampón de desplegamiento durante 15 horas a 20
horas a temperatura ambiente.
18. El proceso de la reivindicación 1, donde la
cantidad de dicha matriz de primer intercambio catiónico en la etapa
(i) puesta en contacto con el medio es de 0,031 L a 1,0 L de matriz
por gramo de IGF-I auténtico.
19. El proceso de la reivindicación 1, donde la
cantidad de dicha matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica
en la etapa (iv) es aproximadamente de 0,05 L a 1,0 L de matriz por
gramo de IGF-I auténtico.
20. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicha etapa de lavado (v) comprende lavar la matriz de cromatografía
de interacción hidrofóbica cargada con IGF-I con
tres volúmenes de columna de un tampón de lavado de interacción
hidrofóbica que comprende ácido acético 0,2 M y cloruro sódico 0,5 M
seguido de lavado de la matriz de cromatografía de interacción
hidrofóbica cargada con IGF-I con diez volúmenes de
columna de un tampón de lavado de interacción hidrofóbica que
comprende ácido acético 0,2 M que contiene cloruro sódico de 0,15 a
0,25 M.
21. El proceso de la reivindicación 1, donde
dicho tampón de elución de interacción hidrofóbica en la etapa (vi)
comprende cuatro volúmenes de columna de ácido acético 0,2 M, que
contienen cloruro sódico de 0 a 0,02 M.
22. El proceso de la reivindicación 1, donde se
utilizan 7-10 volúmenes del tampón de lavado de
intercambio catiónico en la etapa (viii) y comprenden acetato sódico
0,05 M y NaCl 0,1 M de pH 5,5.
23. El proceso de la reivindicación 1, donde el
segundo tampón de elución de intercambio catiónico en la etapa (ix)
comprende acetato sódico 0,05 M y cloruro sódico 0,4 M a pH 5,5.
24. Un proceso de la reivindicación 1, donde el
tampón de desplegamiento/replegamiento contiene un agente tamponante
adecuado para mantener el pH entre 8,0 y 10,5, un agente caotrópico,
un alcohol, una sal y un agente reductor.
25. Un proceso de la reivindicación 1, donde el
IGF-I auténtico recuperado en la etapa (e) es
recuperado a través de elución isocrática con un tampón
acuaso/orgánico, seguido de un gradiente de elución.
26. Un proceso de la reivindicación 1, donde la
etapa (ii) además comprende lavar con un segundo primer tampón de
lavado de intercambio catiónico que no contiene cloruro sódico.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/422,436 US5650496A (en) | 1995-04-14 | 1995-04-14 | IGF-I purification process |
US422436 | 1995-04-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2321242T3 true ES2321242T3 (es) | 2009-06-03 |
Family
ID=23674879
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96912727T Expired - Lifetime ES2321242T3 (es) | 1995-04-14 | 1996-04-12 | Proceso de purificacion de igf-1. |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5650496A (es) |
EP (1) | EP0820463B1 (es) |
JP (1) | JP3894570B2 (es) |
AT (1) | ATE415411T1 (es) |
AU (2) | AU696516B2 (es) |
CA (1) | CA2218111C (es) |
DE (1) | DE69637760D1 (es) |
ES (1) | ES2321242T3 (es) |
NO (1) | NO322326B1 (es) |
NZ (1) | NZ306782A (es) |
WO (1) | WO1996032407A1 (es) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10504971A (ja) * | 1994-09-08 | 1998-05-19 | カイロン コーポレイション | インスリン様増殖因子の改善された生産方法 |
US6756484B1 (en) | 1995-04-14 | 2004-06-29 | Cephalon, Inc. | IGF-I purification process |
JP2002514890A (ja) * | 1995-06-07 | 2002-05-21 | カイロン コーポレイション | 酵母宿主から真性のigfを精製するための方法 |
US7071313B1 (en) * | 1995-06-07 | 2006-07-04 | Cephalon, Inc. | Methods of purifying authentic IGF from yeast hosts |
US7193042B1 (en) | 1995-06-07 | 2007-03-20 | Chiron Corporation | Methods for purifying authentic IGF from yeast hosts |
CN1268639C (zh) * | 1996-11-15 | 2006-08-09 | 基因技术股份有限公司 | 神经营养蛋白的纯化 |
AU2151401A (en) | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Novo Nordisk A/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
GB0011278D0 (en) | 2000-05-10 | 2000-06-28 | Univ London | Repair of nerve damage |
AU2001279073B2 (en) * | 2000-07-28 | 2006-08-24 | Christopher J. Murphy | Transplant media |
AU2002327795A1 (en) * | 2001-10-09 | 2003-04-22 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human | Methods and compositions for production and purification of recombinant staphylococcal enterotoxin b (rseb) |
KR20030044696A (ko) * | 2001-11-30 | 2003-06-09 | 정종문 | 피키아 파스토리스에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1단백질을 연속적으로 생산하는 방법 |
GB0202906D0 (en) | 2002-02-07 | 2002-03-27 | Univ London | Prevention of myocardial damage |
US7229554B2 (en) * | 2002-09-25 | 2007-06-12 | Novo Nordisk A/S | Purification process comprising microfiltration at elevated temperatures |
US20070207209A1 (en) * | 2004-08-27 | 2007-09-06 | Murphy Christopher J | Trophic factor combinations for nervous system treatment |
WO2006097682A1 (en) * | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Ucl Business Plc | Mechano growth factor peptides and their use |
KR102028628B1 (ko) | 2008-09-02 | 2019-10-04 | 나트릭스 세퍼레이션즈, 인코포레이티드 | 크로마토그래피 막, 이를 포함하는 장치 및 이의 이용방법 |
UA105785C2 (uk) | 2009-02-19 | 2014-06-25 | Кселлія Фармасьютікалз Апс | Спосіб очищення ліпопептидів |
CA2780095C (en) * | 2009-11-13 | 2018-12-11 | Natrix Separations Inc. | Hydrophobic interaction chromatography membranes, and methods of use thereof |
WO2012158896A2 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-22 | Natrix Separations Inc. | Layered tubular membranes for chromatography, and methods of use thereof |
AU2018212974B2 (en) * | 2017-01-30 | 2023-08-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for reducing bioburden in chromatography |
KR20230098304A (ko) * | 2020-11-05 | 2023-07-03 | 시믹 홀딩스 씨오., 엘티디. | 재조합 인슐린 유사 성장 인자 i의 제조 방법 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5093317A (en) * | 1989-06-05 | 1992-03-03 | Cephalon, Inc. | Treating disorders by application of insulin-like growth factor |
AU8417091A (en) * | 1990-08-20 | 1992-03-17 | Novo Nordisk A/S | Biologically active compound, a process for the preparation thereof and use of the same |
JPH06500470A (ja) * | 1990-09-04 | 1994-01-20 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生 |
US5231178A (en) * | 1991-01-16 | 1993-07-27 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1 |
US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
WO1993019084A1 (en) * | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Synergen, Inc. | Refolding and purification of insulin-like growth factor i |
US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
US5451660A (en) * | 1993-12-13 | 1995-09-19 | Genentech, Inc. | Method for purifying polypeptides |
US5446024A (en) * | 1993-12-17 | 1995-08-29 | Genentech, Inc. | Purification of insulin-like growth factor |
-
1995
- 1995-04-14 US US08/422,436 patent/US5650496A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-12 AT AT96912727T patent/ATE415411T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-04-12 NZ NZ306782A patent/NZ306782A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-04-12 JP JP53122996A patent/JP3894570B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-12 ES ES96912727T patent/ES2321242T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-12 DE DE69637760T patent/DE69637760D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-12 CA CA002218111A patent/CA2218111C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-12 AU AU55433/96A patent/AU696516B2/en not_active Revoked
- 1996-04-12 WO PCT/US1996/005099 patent/WO1996032407A1/en active Application Filing
- 1996-04-12 EP EP96912727A patent/EP0820463B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-05 US US08/851,162 patent/US6207806B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-13 NO NO19974740A patent/NO322326B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-23 AU AU2007201259A patent/AU2007201259A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2218111C (en) | 2008-07-08 |
AU2007201259A1 (en) | 2007-04-05 |
NZ306782A (en) | 1998-11-25 |
EP0820463A4 (en) | 2001-08-08 |
JPH11503733A (ja) | 1999-03-30 |
NO974740D0 (no) | 1997-10-13 |
NO974740L (no) | 1997-12-12 |
NO322326B1 (no) | 2006-09-18 |
DE69637760D1 (de) | 2009-01-08 |
US5650496A (en) | 1997-07-22 |
AU696516B2 (en) | 1998-09-10 |
US6207806B1 (en) | 2001-03-27 |
WO1996032407A1 (en) | 1996-10-17 |
ATE415411T1 (de) | 2008-12-15 |
CA2218111A1 (en) | 1996-10-17 |
EP0820463A1 (en) | 1998-01-28 |
AU5543396A (en) | 1996-10-30 |
JP3894570B2 (ja) | 2007-03-22 |
EP0820463B1 (en) | 2008-11-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2321242T3 (es) | Proceso de purificacion de igf-1. | |
JP2798351B2 (ja) | 正確に連結されたシスチン橋を有するプロインスリンの取得方法 | |
US5663291A (en) | Process for obtaining insulin having correctly linked cystine bridges | |
JP4291900B2 (ja) | 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 | |
Hunkapiller et al. | Contemporary methodology for protein structure determination | |
Light‐Wahl et al. | Collisionally activated dissociation and tandem mass spectrometry of intact hemoglobin β‐chain variant proteins with electrospray ionization | |
ES2070855T5 (es) | Metodo para purificar una proteina. | |
VELOURS et al. | Subunit 4 of ATP synthase (F0F1) from yeast mitochondria: Purification, amino‐acid composition and partial N‐terminal sequence | |
Lobl et al. | On-resin biotinylation of chemically synthesized proteins for one-step purification | |
Power et al. | Reversed-phase high-performance liquid chromatographic purification of subunits of oligomeric membrane proteins: The nuclear coded subunits of yeast cytochrome c oxidase | |
Rahali et al. | Chemical cleavage of bovine β-lactoglobulin by BNPS-skatole for preparative purposes: comparative study of hydrolytic procedures and peptide characterization | |
US6075127A (en) | Preparation of purified (poly)peptides | |
Kaplan et al. | Solid‐phase synthesis and characterization of carcinoembryonic antigen (CEA) domains | |
US6756484B1 (en) | IGF-I purification process | |
Pen et al. | Structural comparison of two esterases from Drosophila mojavensis isolated by immunoaffinity chromatography | |
Pettersson et al. | Studies on cellulolytic enzymes: IV. Chemical and physicochemical characterization of a cellulose from Penicillium notatum | |
ES2341270T3 (es) | Complejos rhigf-i/rhigfbp-3 purificados y procedimientos de fabricacion de los mismos. | |
Moya et al. | Isolation and characterization of modified species of a mutated (Cys125–Ala) recombinant human interleukin-2 | |
Sabatier | Chemical synthesis and characterization of small proteins: example of scorpion toxins | |
Palczewska et al. | Concanavalin A-agarose removes mannan impurities from an extracellularly expressed Pichia pastoris recombinant protein | |
Siemiatkowski-Juszczak | LIMITED PROTEOLYSIS OF BOVINE RHODOPSIN AND SEQUENCE DETERMINATION OF THE F2 FRAGMENT. | |
Ko et al. | Metal affinity engineering of proinsulin carrying genetically attached (His) 10-X-Met affinity tail and removal of the tag by cyanogen bromide | |
Leon et al. | THE STRUCTURE OF THE ACIDIC POLYPEPTIDE CHAINS FROM α‐CRYSTALLIN. AMINO ACID COMPOSITION, PEPTIDE MAPPING, AND N‐TERMINUS | |
Bhushan et al. | Reversed‐phase high‐performance liquid chromatographic, gel electrophoretic and size exclusion chromatographic studies of subunit structure of arachin and its molecular species | |
Novotný et al. | Study on a Family of Cystine‐Containing Fragments from the Variable Part of Pig Immunoglobulin k‐Chains: Demonstration of Variability in Amino Acid Sequence |