KR20030044696A - 피키아 파스토리스에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1단백질을 연속적으로 생산하는 방법 - Google Patents

피키아 파스토리스에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1단백질을 연속적으로 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피키아 파스토리스에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질을 연속적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, pGAPZαA/rhIGF-1 벡터, 피키아 파스토리스/rhIGF-1 및 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)은 생리활성을 가지는 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질을 세포외로 발현할 뿐만 아니라 저가의 생산비용으로 다량의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 생산한다.

Description

피키아 파스토리스에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질을 연속적으로 생산하는 방법{CONTINUOUS PRODUCING METHOD OF RECOMBINANT PROTEIN HUMAN INSULIN LIKE GROWTH FACTOR-1 IN PICHIA PASTORIS}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 피키아 파스토리스에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질을 연속적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 인슐린 유사 성장인자-1, pGAPZαA/rhIGF-1 및 피키아 파스토리스/rhIGF-1에 관한 것이다. 또한 본 발명은 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질을 다량으로 쉽게 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
인슐린 유사 성장인자-1(Insulin like growth factor-1)은 1978년에 처음으로 아미노산 서열이 결정되었으며,(Rinderknecht & Humbel(1978)J. Biol. Chem. 253 : 2769-2776) 70개의 아미노산으로 구성된 약 7.5KDa의 단일 가닥 폴리펩타이드이다.
인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1)은 인슐린과 유사하게 작용하여 티로신에 인산화를 유발하여 신호를 세포 내로 전달한다. 인슐린 유사 성장인자-1은 성장 호르몬의 효과를 중개하여 다양한 세포(근육, 뼈, 신경, 난소, 신장 등)의 성장을 촉진시키는 역할을 하며,(U.S. Pat. No. 5,612,198) 다른 성장인자들과 상호 작용하여 상승효과를 나타낸다.(Lynch et al. (1989) J. Clin., Periodontol, 16:545;and Lynch et al. (1987)Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 7696)
인슐린 유사 성장인자-1은 포유동물의 신장 발생을 촉진시키고,(U.S. Pat. No. 5,985,830) 뇌의 발생, 성숙(Werther et al., Mol. Endocrinol. 4:773-778 (1990)) 및 말초 신경재생에 관계한다(Karje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989)) 인슐린 유사 성장인자-1은 제 1형 당뇨병(U.S. Pat. No. 5,674,845), 류마티즘성 관절염(Rheumatoid arthritis, U.S. Pat. No. 5,712,249) 및 골다공증(Osteoporosis) 치료제로서도 사용될 수 있다.(EP 560 723, EP 436 469)
대장균에서 인슐린 유사 성장인자-1을 발현시키기 위한 연구가 진행되었고,(Chang and Swartz American Chemical Society, 1998, pp. 178-188) 사카로마이시스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)에서 세포외로 분비시켜 제조하는 방법이 시도되었다.(ElliottJ. Protein Chem., 1990, 9:95-104) 대장균에서 이황화 결합을 포함하고 있는 인슐린 유사 성장인자-1 단백질을 발현시킬 경우 대장균이 이황화 결합을 생성할 능력이 없어 불안정하고 불활성화된 불용성 단백질이 제조되는 문제점이 있었다. 또한 인슐린 유사 성장인자-1의 시작 코돈이 글리신이어서, 대장균에서 발현시키려면 글리신 앞에 메티오닌을 결합시킨 융합 단백질 형태로 발현시킨 후 메티오닌을 잘라내는 까다로운 단계를 거쳐야 한다.(U.S. Pat. No. 5,612,198) 또한 미국특허 제 5,324,639호는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 메탄올 유도 하에 인슐린 유사 성장인자-1을 생산하는 방법을 개시하였으나 발현유도체인 메탄올을 배양 과정 중 첨가한 후 최종단계에서 제거하여야 하는 번거로움이 발생한다.
이에 진핵생물 발현 시스템을 이용하고, 유도체를 사용하지 않으면서 대량의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 대량으로 생산할 수 있는 방법이 확립되어야 한다.
따라서, 본 발명은 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 다량으로, 쉽게 생산할수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 연속적으로 발현할 수 있는 진핵생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 생리활성을 가지는 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 재조합 벡터(pGAPZαA/rhIGF-1)의 제조 모식도를 도시한 것이고,
도 2는 본 발명의 피키아 파스토리스/rhIGF-1에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 발현 여부를 확인한 전기영동사진이고,
도 3은 본 발명의 본 발명의 피키아 파스토리스/rhIGF-1에서 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 발현 여부를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 확인한 것이고,
도 4는 본 발명의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 생리활성을 검증하고자 시험관내 (in vitro)에서 CHO세포를 이용하여 세포증식 효과를 확인한 것이고,
도 5는 본 발명의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 처리여부에 따른 CHO 세포의 성장정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 프로모터(GAP), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자 리더 서열(α-factor leader sequence), 인슐린 유사 성장인자-1 유전자 및 번역종결코돈을 포함하는 재조합 벡터 pGAPZαA/rhIGF-1을 제공한다.
또한 본 발명은 pGAPZαA/rhIGF-1으로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)에서 발현된 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 pGAPZαA 벡터에 인슐린 유사 성장인자-1 유전자를 삽입하여 pGAPZαA/rhIGF-1를 제조하고, pGAPZαA/rhIGF-1를 피키아 파스토리스 X33에 형질전환하고, 형질전환된 피키아 파스토리스 X33은 제오신을 포함하는 배지에 배양하여 pGAPZαA/rhIGF-1가 다수카피로 삽입된 피키아 파스토리스/rhIGF-1를 선별하고,피키아 파스토리스/rhIGF-1를 연속배양하여 인슐린 유사 성장인자-1를 세포외로 발현시키고, 발현된 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 정제하여 수득하는 것을 포함하는 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
인슐린 유사 성장인자-1을 피키아 파스토리스에서 다량으로 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터는 통상적인 벡터와 인슐린 유사 성장인자-1 유전자를 포함하는 것이다. 바람직한 제조합 벡터는 pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, B, C, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, B, C, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1으로 구성된 군으로부터 선택된 벡터 및 사람 인슐린 유사 성장인자-1 유전자를 포함하는 것이다. 가장 바람직하게는 사람 인슐린 유사 성장인자-1 및 pGAPZαA를 포함하는 pGAPZαA/rhIGF-1이다. 상기 pGAPZαA 벡터는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 유전자(GAP)의 프로모터, 발현된 단백질을 효모 세포 밖으로 분비시키는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자 리더 서열(α-factor leader sequence) 및 숙주 내로 형질도입 여부를 확인할 수 있는 표지로 이용 가능한 제오신(Zeor) 유전자를 포함하고 있다.(도 1)
인간 인슐린 유사 성장인자-1을 포함하는 재조합 벡터는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환하여 형질전환체를 제조하였다. 상기 형질전환체 중 재조합 벡터가 다수 카피(muti copy)로 삽입된 형질전환체를 선별하였고, 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)로 기탁하였다.
본 발명의 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)는 YPD 배지에서 배양하는 것이 바람직하고, 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 세포외로 다량 발현시킨다. 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 발현을 증가시키기 위하여 4 내지 5일에 한번씩 계대배양하는 것이 바람직하다. 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)는 호기성 플라스크 배양조에서 YPD 배지상 96시간 연속 배양하였을 때 80 ㎎/L 내지 100 mg/L의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 생산한다.(도 2, 도 3)
피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)은 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 발현을 위하여 유도체(inducer)를 사용할 필요가 없어, 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 정제가 용이하다. 또한 연속적으로 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 발현하고, 새로운 배지로 교환하여 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 발현을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1은 인체에 존재하는 당질화되지 않은 인슐린 유사성장인자-1 단백질과 동일한 약 7.5 kDa의 분자량을 가지며, 인슐린 유사 성장인자-1 고유의 생리활성을 가지고 있다.(도 4) 따라서, 인슐린 유사 성장인자-1은 인슐린 유사 성장인자-1 단백질의 생리학적 활성을 유지하여 왜소증, 제 1형 당뇨병, 류마티즘성 관절염 및 골다공증(Osteoporosis) 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 벡터제조
(1) 균주 및 플라스미드 벡터
본 실험에서 사용한 균주 및 플라스미드는 하기의 표 1 과 같다.
계 통 유전자형 표현형
피키아 파스토리스 X-33 Zeocin 야생형
E. coliTop10 F' F'{lacIq, Tn10(TetR)},mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80lacZΔM15, ΔlacX74,deoRrecA1,araD139,Δ(ara-leu)7697,galU,galK,rpsL(StrR),endA1,nupG
플라스미드 벡터pGAPZαA Zeor
테트라사이클린 내성 유전자를 선별 마커로 포함하는 박테리아E. coliTop10 F' 및 피키아 파스토리스 X-33는 인비트로젠사(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구입하였다.
(2) 재조합 벡터
유전자 클로닝 및 발현을 위해 인비트로젠사의 피키아 파스토리스 발현 키트에 제공되는 연속 발현 벡터인 pGAPZαA를 이용하였다.
재조합 벡터는 pGAPZαA(인비트로젠사의 피키아 파스토리스 발현 키트에 제공되는 연속 발현 벡터)에 인간 인슐린 유사 성장인자-1 유전자를 삽입하여 제조하였다.(도 1)
인슐린 유사 성장인자-1 유전자 (NCBI GeneBank #NM_000618)를 간(liver)의 cDNA 라이브러리(CLONTECH Cat.# 7407-1)를 주형(template)으로 적당한 프라이머를사용하여 PCR을 하여 얻어낸 후, 제한효소XhoI/XbaI(Promega)를 처리한 다음, 동일 제한효소를 처리한 pGAPZαA 및 T4 DNA 라이게이즈(Promega)를 첨가하여 15 ℃에서 3시간 반응시켰고, 번역종결코돈인 TGA를 유전자 말단에 삽입하여 pGAPZαA/rhIGF-1을 제조하였다. 그리고 칼슘클로라이드 방법으로 대장균 균주 Top10 F'에 pGAPZαA/rhIGF-1을 형질전환시킨 후, 형질전환체를 제오신을 포함하는 저염(low salt) LB 평판배지(1 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출액, 0.5 % 염화나트륨, 1.5% 아가)에서 배양하여 선별하였다. 선별된 클론은 PCR과 제한효소처리를 통한 검증실험으로 확인하였고, 최종적으로 인간 인슐린 유사 성장인자-1 DNA가 삽입된 재조합 벡터(pGAPZαA/rhIGF-1)와 형질전환체(pGAPZαA/rhIGF-1,E. coliTOP10 F')를 확보하였다.
실시예 2: 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 발현하는 피키아 파스토리스의 제조
(2) 재조합 벡터의 피키아 파스토리스로의 형질전환
피키아 파스토리스 X-33 단일 콜로니를 YPD 배지 10 ㎖에 접종 후 28 - 30 ℃에서 200-250 rpm으로 12 - 15시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 YPD 배지 10 ㎖에 흡광도(OD600) 0.1 - 0.2정도로 희석한 후 28 - 30 ℃에서 미드-로그 상태(mid-log phase)까지 배양하여 500 xg로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 세포는 용액 I(DMSO, 에틸렌 글리콜) 10 ㎖에 부유시키고, 원심분리(500 xg)한 다음 용액 I 1 ㎖로 재부유시켰다. 부유액은 1.5 ㎖ 멸균 처리된 튜브에 50 ㎕씩 분주한 후 장기간 보존을 위해 -80℃에서 천천히 냉동, 보관하였다. 냉동 보관 되었던 피키아 파스토리스 X-33을 천천히 녹인 후 사용하였다.
제한효소Avr II처리로 선형화된 약 3 ㎍의 pGAPZαA/rhIGF-1 DNA을 인비트로젠사의 이지컴 키트(EasycompTM kit) 및 리튬 클로라이드(LiCl) 방법으로 피키아 파스토리스 X-33 세포에 형질도입하였다. 형질도입체는 YPDS Zeo+평판배지(1 % 효모 추출물, 2 % 포도당, 2 % 펩톤, 1 M 소비톨, 2 % 아가, 0.25 ㎎/㎖ 제오신)에서 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환체는 pGAPZαA/rhIGF-1 벡터에 포함된 제오신을 발현함으로써 상기의 YPDS Zeo+평판배지 상에서 성장하는 것이다.
pGAPZαA/rhIGF-1 재조합 유전자가 복수 삽입정도가 많을수록 형질전환제의 제오신에 대한 내성정도가 증가하고, 또한 다량의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 생산하게 된다. 이에 형질전환체의 게놈상에 pGAPZαA/rhIGF-1가 복수삽입(multicopy integration)된 것을 선별하기 위하여 다양한 농도의 YPD-Zeo+(1 % 효모추출액, 2 % 펩톤, 2 % 포도당, 0.25-2.0 ㎎/㎖의 제오신) 평판배지에서 형질전환체를 배양하였다. 0.25, 1, 2 ㎎/㎖의 제오신을 포함하는 배지에서 자란 형질전환체가 선별되었으며, 2 ㎎/㎖의 제오신을 포함하는 배지에서 안정적 배양된 형질전환체를 선별하였다. 선별된 피키아 파스토리스/rhIGF-1은 2001년 10월 11일자로 기탁되어 KCCM10323를 수여받았다.
실시예 3: 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 발현
(1) 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 발현
피키아 파스토리스/rhIGF-1을 10 ㎖ YPD 배지에 접종하여, 200 rpm, 28 ℃에서 1일간 배양하였다. 피키아 파스토리스/피키아 파스토리스/rhIGF-1 100 ㎕을 50 ㎖ YPD 배지로 재부유하고, 배플드 플라스크(baffled flask)에서 200 rpm으로 28℃에서 4일간 배양하였다. 배양액은 배양 시간대별(24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr)로 각각 1 ㎖씩 수득하여 원심분리하고, 상층액만을 새 튜브에 모아 다음 분석 전까지 -80 ℃로 얼려 보관하였다. 상층액은 피키아 파스토리스/rhIGF-1에서 분비된 인슐린 유사 성장인자-1을 포함하고 있다. 상층액은 트리신 SDS-PAGE(sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다.
도 2 는 피키아 파스토리스/rhIGF-1을 배양하고, 배양 시간대별(24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr) 재조합 인간 인슐린 유사 성장인자-1을 전기영동으로 확인한 사진이다. M 은 분자량 마커(Biorad Cat No. 161-0326)이고, 레인 1 내지 4는 배양시간별 배양 상층액을 나타낸 것이다. 도 2에서 7.5 kDa의 단백질이 생성되었음을 확인할 수 있다. SDS-PAGE로 시판되고 있는 재조합 IGF-1의 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L, 200 mg/L 농도와 비교하여 본 실험에서 발현시킨 재조합 IGF-1이 약 100 mg/L 정도로 발현된다는 것을 확인하였다.
(2) 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 검정(Western blot)
도 2에서 확인된 단백질이 피키아 파스토리스/rhIGF-1에서 발현된 단백질이 재조합 인슐린 유사 성장인자-1인지를 확인하고자 웨스턴 블롯을 실시하였다.
도 2의 전기영동 젤에 토끼 항-인간-인슐린 유사 성장인자-1(Rabbit anti-human insulin like growth factor-1, 고마 바이오텍사) 항체를 상온에서 1시간 반응시키고, 알칼라인 포스포테이트를 포함하는 항-토끼 IgG(Alkaline phosphotate-conjugated anti-rabbit IgG, Promega)를 상온에서 30분간 반응시켜 발색을 확인하였다. 그 결과 도 3에서 약 7.5 kDa의 분자량을 갖는 단백질이 발색을 나타내어 재조합 인슐린 유사 성장인자-1임을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 생리활성 측정
(1) 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 정제
피키아 파스토리스/rhIGF-1을 200 ml YPD 배지에 3일 동안 배양한 후 원심분리하여 상층액만을 얻어내고 70% 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 사용하여 농축시킨 후 10 ml PBS에 녹여 스펙트럼사의 스펙트라/포르 막(SPECTRUM사, Spectra/Por membrane, MWCO : 3,500)에 넣고 4 ℃에서 교반시키면서 투석(dialysis)하였다. 투석된 샘플을 겔필터레이션(Sephadex G-50 medium, 시그마사 Cat. No. G-50-150)하고 60 mM 소듐 아세테이트 및 500 mM 소듐 클로라이드(pH 5.5) 용출완충액을 사용하여 양이온교환 크로마토그래피(CM-cellulose, 시그마사 Cat. No. C4146)를 수행하였다. 본 정제 과정을 거쳐 약 40 mg/L의 rhIGF-1 단백질을 수득하였다.
(2) 생리활성 검정
피키아 파스토리스/rhIGF-1에서 생산된 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 생리활성을 측정하였다. 피키아 파스토리스/rhIGF-1를 배양한 후 상층액을 수득하고, 희석하여 생리활성을 검정하였다.
생산된 인슐린 유사 성장인자-1 단백질이 생리학적 활성을 지니는지 확인하기 위하여 인슐린 유사 성장인자-1에 의해 증식이 활성화되는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 실험에 이용하였다.
세포를 혈청 배지에 웰(well) 당 0.2×104개 세포가 되도록 96 웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 37 ℃, 5 % 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 웰의 배지를 제거하고 여러 희석배수의 인슐린 유사 성장인자-1을 포함한 무혈청 배지로 바꿔주고 48시간동안 배양하였다. 엘리자 키트(Cell proliferation ELISA, BrdU(colorimetric), Cat No.1 647 229, Roche Diagnotics Coporation)를 사용하여 CHO의 DNA 합성 정도를 측정하여 세포성장 정도를 확인하였다.
도 4a는 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 농도에 따른 CHO 세포의 성장정도를 측정한 그래프로, 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 농도가 증가함에 따라 어느 정도까지는 CHO 세포의 성장정도가 증가하나 농도가 매우 높은 경우는 오히려 CHO 세포가 스트레스를 받아 성장정도가 감소함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1은 생리활성을 가짐을 확인할 수 있었다. 도 4b는 시그마사의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1(Cat. No. I 3769)의 농도에 따른 CHO 세포의 성장 정도를 측정한 그래프이다.
또한 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 처리한 세포(도 5b)를 현미경으로 관찰하여 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 처리하지 않은 대조군(도 5a)과 비교하였다. 그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 처리한 CHO 세포에서 성장이 왕성하였다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 pGAPZαA/rhIGF-1로 형질전환된 피키아 파스토리스는 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 발현유도제의 사용 없이도 연속적으로 발현시킨다. 또한 세포외로 발현시켜 이후 정제과정이 간편하다. 또한 본 발명의 재조합 인슐린 유사 성장인자-1은 생리학적 활성을 유지하여 왜소증, 제 1형 당뇨병, 류마티스 관절염 및 골다공증질환에 사용할 수 있다.

Claims (5)

  1. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 프로모터(GAP), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자 리더 서열, 인슐린 유사 성장인자-1 유전자 및 번역종결코드를 포함하는 재조합 벡터 pGAPZαA/rhIGF-1.
  2. pGAPZαA/rhIGF-1로 형질전환된 피키아 파스토리스.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 피키아 파스토리스는 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)인 것인 피키아 파스토리스.
  4. 피키아 파스토리스/rhIGF-1(KCCM10323)에서 발현된 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 단백질.
  5. (1) pGAPZαA 벡터에 인슐린 유사 성장인자-1 유전자를 삽입하여 pGAPZαA/rhIGF-1를 제조하고;
    (2) pGAPZαA/rhIGF-1를 피키아 파스토리스 X33에 형질전환하고;
    (3) 형질전환된 피키아 파스토리스 X33은 제오신을 포함하는 배지에 배양하여 pGAPZαA/rhIGF-1가 다수카피로 삽입된 피키아 파스토리스/rhIGF-1를 선별하고;
    (4) 피키아 파스토리스/rhIGF-1를 연속배양하여 인슐린 유사 성장인자-1를세포외로 발현시키고; 및
    (5) 발현된 재조합 인슐린 유사 성장인자-1을 정제하여
    수득하는 것을 포함하는 재조합 인슐린 유사 성장인자-1의 제조방법.
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