ES2317327T3 - Procedimiento de diagnostico y tratamiento de la enfermedad de crohn. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro de diagnóstico de la enfermedad de Crohn, o de determinación de una predisposición de una persona a desarrollar la enfermedad de Crohn, en el que se determina si el nivel de expresión del receptor CD66c en una muestra biológica de un sujeto a analizar, es superior al nivel de expresión en una muestra de control, lo que es indicativo de la enfermedad de Crohn, o de una predisposición del sujeto ensayado a desarrollar la enfermedad de Crohn.
Description
Procedimiento de diagnóstico y tratamiento de la
enfermedad de Crohn.
La presente invención se refiere al campo del
diagnóstico in vitro de la enfermedad de Crohn. Permite al
mismo tiempo diagnosticar la presencia de la enfermedad, y
determinar la predisposición de una persona para desarrollar la
enfermedad. Se refiere asimismo al tratamiento preventivo o curativo
de esta enfermedad.
La enfermedad de Crohn, descrita en 1932 por
Crohn et al., se caracteriza por un estado de hiperactivación
del sistema inmunitario del intestino, que evoluciona por brotes
entrecortados por periodos de remisión de duraciones variables. La
incidencia en Francia, expresada en número de casos nuevos por año
por 10^{5} habitantes, se estima en 100/10^{5} habitantes. En
2004, se han censado más de 100.000 casos en Francia.
La enfermedad de Crohn (MC o CD, por Crohn
disease) se manifiesta clínicamente por unos dolores abdominales,
diarrea, fiebre y desnutrición. Frecuentemente, se asocian unas
señales de inflamación extra-digestiva (articular,
cutánea u ocular). El diagnóstico se basa en el estado clínico, la
endoscopia, las biopsias ileo-cólicas y la
radiología del intestino delgado. El cuadro clínico, endoscópico y
anatomo-patológico no tiene ninguna especificidad,
y el establecimiento del diagnóstico necesita excluir todas las
demás afecciones curables que muestran un cuadro análogo (Colombel
y Menard, 1993). Se usan unos ensayos biológicos para el diagnóstico
y el seguimiento de la enfermedad de Crohn que incluyen los
siguientes marcadores: ANCA (perinuclear
anti-neutrophilic antibody), ASCA
(anti-Saccharomyces cerevisiae antibody) y anti OmpC (outer
membrane porine C from E. coli). Estos marcadores no son
específicos de la enfermedad de Crohn y un ensayo negativo no puede
eliminar la eventualidad de una enfermedad de Crohn (Nakamura et
al., 2003).
La enfermedad de Crohn constituye uno de los
problemas principales de la
hepato-gastro-enterología, puesto
que no tiene ningún tratamiento específico. Es una enfermedad muy
invalidante más o menos controlada mediante los corticoides, los
inmunosupresores, la asistencia nutricional y las intervenciones
quirúrgicas. El tratamiento se basa principalmente en unos datos
sintomáticos y sólo es suspensivo, puesto que no llega jamás a la
curación total del paciente. Las principales funciones de este
tratamiento son controlar los brotes y después prevenir la
recidiva. Esquemáticamente, los medicamentos usados se dividen en
dos categorías: los anti-inflamatorios tales como
los derivados salicilados o los corticoides, y los inmunosupresores.
Sin embargo, estos tratamientos resultan a menudo ineficaces y las
resecciones quirúrgicas son inevitables en el 90% de los casos.
Recientemente, el infliximab, un anticuerpo monoclonal
anti-TNF\alpha, ha resultado eficaz para el
tratamiento de algunos pacientes que presentan un cuadro clínico
severo y que no responden a los tratamientos convencionales
(Rutgeerts et al., 1999, Present et al., 1999). Sin
embargo, este tratamiento adolece de ciertos límites. En efecto,
los pacientes tratados con el infliximab producen a veces unos
anticuerpos anti-infliximab, disminuyendo la
duración de la respuesta al tratamiento (Baert et al., 2003).
Además, ciertos pacientes sometidos a este tratamiento han
desarrollado una patología infecciosa grave de tipo tuberculosis,
aspergilosis, candidosis (Wallis et al., 2004).
La etiología de la enfermedad de Crohn no está
todavía claramente elucidada. Se han considerado varios factores
que influyen en la aparición, el mantenimiento o la agravación de la
enfermedad de Crohn. Se trata en particular de factores del
entorno, inmunitarios, genéticos e infecciosos (Podolsky 2002,
Shanahan 2002).
La enfermedad de Crohn se caracteriza por un
estado de hiperactivación del sistema inmunitario a nivel intestinal
que se traduce por un reclutamiento y una activación de los
linfocitos y de los macrófagos. Actualmente, se ha establecido que
las citoquinas por-inflamatorias tales como
interleuquina-1 (Il-1),
Il-6, Il-8 y
TNF-\alpha liberadas en grandes cantidades en la
mucosa intestinal de los pacientes que padecen la enfermedad de
Crohn son responsables de la inducción de la inflamación intestinal
(Desreumaux et al., 1997).
Numerosos argumentos clínicos, experimentales y
epidemiológicos sugieren la intervención de agentes infecciosos en
la génesis y/o el mantenimiento de las lesiones de la enfermedad de
Crohn (Sartor et al., 1996). La progresión regular de la
enfermedad, su repartición en focos a veces muy activos, y la
aparición de casos familiares de enfermedad de Crohn que implican
unas parejas casadas no emparentadas y sus hijos evocan el papel de
un agente infeccioso transmisible (Bennett et al., 1991).
El estudio de cepas de E. coli aisladas
de biopsias ileales de pacientes que padecen la enfermedad de Crohn
ha mostrado que las lesiones ileales agudas y crónicas de la
enfermedad de Crohn eran anormalmente colonizadas por unas cepas de
E. coli (representando hasta el 100% de la flora total).
Estas cepas están desprovistas de los genes de virulencia
encontrados habitualmente en los diferentes patovares de E.
coli responsables de infecciones intestinales. La mayoría (80%)
de estas cepas poseen un alto poder de adhesión in vitro a
las células epiteliales intestinales Caco-2 y se ha
demostrado una relación entre el poder de adhesión y el porcentaje
de colonización de la mucosa intestinal
(Darfeuille-Michaud et al., 1998).
La cepa de E. coli LF82, aislada de una
lesión ileal crónica en un paciente que padece la enfermedad de
Crohn, presenta todas las características de un patógeno bacteriano
invasivo: (i) las bacterias son internalizadas por las células
epiteliales en cultivo con un nivel de internalización similar a los
de Shigella, (ii) su proceso de entrada activa depende al
mismo tiempo de los microtúbulos y de una polimerización de actina,
y (iii) es capaz de sobrevivir y multiplicarse en el citoplasma de
la célula hospedante después de la lisis de la vacuola de
endocitosis.
La caracterización de un fenotipo de
adhesión-invasión de la cepa LF82 y la ausencia de
determinantes genéticos de invasión ya descritos en E. coli,
Shigella y Salmonella ha conducido a definir la
existencia de un nuevo grupo patógeno de E. coli que se
puede asociar a la enfermedad de Crohn, designada AIEC por
"adherent-invasive E. coli" (Boudeau
et al., 1999). Estas cepas AIEC podrían colonizar la mucosa
intestinal de las enfermedades adhiriéndose al borde ciliado de los
enterocitos (Darfeuille-Michaud, 2002). Su
prevalencia es de 36,4% a nivel de las lesiones ileales agudas de
pacientes que padecen la enfermedad de Crohn
(Darfeuille-Michaud et al., 2004).
Una de las características histológicas de la
enfermedad de Crohn es la presencia de granulomas en 50 a 87% de
los casos. Una inflamación granulomatosa se encuentra en ciertas
infecciones bacterianas tales como las salmonelosis, yersiniosis o
paratuberculosis, que utilizan unas bacterias invasivas que poseen
asimismo la capacidad de resistir al poder bactericida de los
macrófagos. Recientemente, se ha demostrado en el 80% de los
pacientes que padecen MC la presencia de ADN de Escherichia
coli en los granulomas, confirmando la pista infecciosa que
implica E. coli (Ryan et al., 2004). Después de la
fagocitosis por unos macrófagos murinos o humanos in vitro,
la cepa AIEC LF82 sobrevive y se multiplica en una amplia vacuola,
preservando al mismo tiempo la integridad de la célula hospedante.
A consecuencia de la infección, los macrófagos segregan un
porcentaje importante de TNF\alpha. Así, las cepas AIEC son
capaces no sólo de invadir las células epiteliales sino que poseen
asimismo unos determinantes genéticos que les permiten resistir a la
acción bactericida de los macrófagos (Glasse et al.,
2001).
Los estudios de ribotipación no han podido
demostrar la presencia de una cepa única, por el contrario unas
cepas AIEC aisladas de lesiones crónicas o de recidivas presentan un
perfil de ribotipación idéntico o pertenecen a un grupo común.
Estas cepas genéticamente unidas podrían haber evolucionado a partir
de un mismo precursor mediante la adquisición de factores de
virulencia por transferencia horizontal de genes o la inserción de
islotes de patogenicidad en el cromosoma bacteriano (Masseret et
al., 2001).
Además, se ha mostrado en un modelo in
vitro de células epiteliales intestinales que los pili de tipo
1 están implicados en la adhesión de las bacterias AIEC a las
células y asimismo en la internalización activa de las bacterias
induciendo la formación de elongaciones membranarias por la célula
infectada (Boudeau et al, 2001).
El proceso de adhesión de una bacteria a unas
células eucariotas resulta de una interacción específica entre un
ligando de la superficie bacteriana denominado adhesina y un
receptor celular (Beachey et al., 1981). Los receptores
implicados en la adhesión de cepas de E. coli a través de los
pili de tipo 1 descritos hasta ahora son unas glicoproteínas con
pie de anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI) (Guignot et
al., 2000; Leusch et al., 1990; Malaviya et al.,
1999; Nowicki et al., 1993). La adhesina FimH de los pili de
tipo 1 reconoce los receptores con pie de anclaje GPI CD48 y CEACAM6
(CD66c) (Shin et al., 1999; Shin et al., 2000; Sauter
et al., 1991; Sauter et al., 1993). La glicoproteína
CD66c (CEACAM6, o también denominada NCA por
"Non-specific
Cross-reacting Antigen") pertenece
a la familia de las inmunoglobulinas, caracterizadas por unos
dominios variables en la parte N-terminal de la
proteína, y unos dominios constantes que contienen unos puentes
disulfuros que inducen la formación de bucles (Hammarstrôm y Baranov
2001). Normalmente, CD66c se expresa en la superficie de los
granulocitos, de los macrófagos, de los polinucleares neutrófilos,
pero también por las células epiteliales a nivel del colon, del
pulmón y del bazo (Audette et al., 1987; Kolbinger et
al., 1989; von Kleist et al., 1972; Jantscheff et
al., 2003).
El documento
WO-A-03/002117 se refiere a un
complejo químico que comprende uno o varios derivados carboxi de
piridinas y uno o más aminosacáridos. Se precisa que el
aminosacárido puede ser un derivado de monosacárido o de disacárido
y que en el caso en el que se trata de un monosacárido, éste se
selecciona de entre un grupo de varios compuestos que comprenden la
manosamina y éste puede ser seleccionado además de entre los
sulfatos, hidrocloruro o también
N-acetil-manosamina.
Este complejo se puede utilizar para la
preparación de un producto destinado a la supresión de la
hipersensibilidad y/o a la supresión de reacciones inflamatorias en
un mamífero. Este uso puede apuntar al tratamiento de enfermedades
dermatológicas, de enfermedades reumáticas, de problemas
articulares, del tratamiento de alergia o también del tratamiento
de enfermedades auto-inmunes o de enfermedades
inflamatorias crónicas. Se apuntan potencialmente un gran número de
enfermedades por la invención y entre ellas se cita la enfermedad de
Crohn. Los ejemplos expuestos en este documento se refieren a unas
aplicaciones tópicas o dermatológicas.
El documento
US-A-2004/005304 da a conocer una
composición para el tratamiento de desórdenes neurológicos y de
enfermedades intestinales asociadas. Esta composición comprende un
principio activo que se puede seleccionar de entre diferentes
clases de compuestos, a saber, péptido, sacárido, probiótico y metal
así como unas combinaciones de éstos. Entre los sacáridos, este
documento indica que puede tratarse de mono o de
poli-sacáridos y entre los
mono-sacáridos, se menciona la manosa. Por otra
parte, las enfermedades apuntadas se clasifican en dos grupos, por
una parte las enfermedades neurológicas, y por otra parte las
enfermedades gastro-intestinales, y entre esta
última categoría se cita la enfermedad de Crohn así como un gran
número de otras enfermedades.
El documento
WO-A-97/39356 describe un método de
diagnóstico de la enfermedad de Crohn basado en la detección de
anticuerpos pANCA y propone completarla por la detección de
anticuerpos anti-Sacchcaromyces cerevisiae que reconocen
unos epítopos con motivos manosa.
Debido a la gravedad de la afección, y de las
dificultades actuales en lo referente a su diagnóstico, un
diagnóstico precoz y fiable de predisposición o de afección de la
enfermedad de Crohn es evidentemente muy deseable. Contribuiría a
evitar los tiempos de espera importantes, siempre penalizantes para
los pacientes, que separan actualmente la recepción del paciente
del establecimiento del diagnóstico después de la exclusión de todas
las demás afecciones que muestran un cuadro clínico análogo.
Por último, existe asimismo una necesidad de un
método que permite prevenir la enfermedad de Crohn y/o tratar esta
enfermedad, que sea más centrado que los métodos usados
actualmente.
Los autores de la presente invención se han
empeñado por lo tanto en realizar unos métodos alternativos para el
diagnóstico y la terapia de la enfermedad de Crohn. En la invención,
se encuentra la demostración, realizada por los inventores, de una
sobreexpresión anormal del receptor CD66c a nivel ileal en los
pacientes que padecen la enfermedad de Crohn y de una afinidad
notable entre este receptor y las cepas de E. coli AIEC. Los
datos obtenidos por los inventores muestran, por un lado, que el
receptor está sobreexpresado a nivel del borde ciliado de los
enterocitos y, por otro lado, que las cepas E. coli de tipo
AIEC tienen una afinidad muy elevada para estos receptores, lo que
explicaría la colonización de la mucosa ileal por las bacterias
AIEC. La adhesión de las cepas AIEC al receptor CD66c se efectúa por
medio de los pili de tipo 1. La cepa de referencia de este grupo
AIEC, a saber, la cepa LF82, expresa unos pili de tipo 1 variantes
que presentan varias sustituciones de aminoácidos en la
sub-unidad mayor FimA, en las
sub-unidades menores FimI y FimF y en la adhesina
FimH (J. Boudeau et al., 2001). Los autores de la presente
invención han constatado además que el 51% de las cepas de E.
coli aisladas de pacientes que padecen la enfermedad de Crohn
presentaban unos pili de tipo 1 variantes, que tienen unas
sustituciones de aminoácidos en FimH similares a las observadas
para FimH de la cepa de referencia LF82. Estos pili de tipo 1
variantes podrían por lo tanto ser responsables de la mayor
afinidad de estas cepas para el receptor CD66c.
La presente invención tiene por lo tanto por
objeto un procedimiento in vitro de diagnóstico de la
enfermedad de Crohn, o de determinación de una predisposición de
una persona para desarrollar la enfermedad de Crohn, en el que se
determina si el nivel de expresión del receptor CD66c en una muestra
biológica de un sujeto a analizar es superior al nivel de expresión
de una muestra de control, lo que es indicativo de la enfermedad de
Crohn, o de una predisposición del sujeto analizado para desarrollar
la enfermedad de Crohn.
En el contexto de la invención, una "muestra
biológica" puede ser una biopsia ileal o una preparación de
enterocitos aislados a partir de una biopsia ileal. Mediante la
expresión "biopsia ileal" se entiende una extracción de una
parte del íleon o de la mucosa ileal, por ejemplo obtenida durante
una resección quirúrgica (se habla entonces de pieza operatoria
extraída a nivel del íleon) o durante una endoscopia. La muestra
biológica puede ser asimismo una muestra de un fluido biológico,
tal como sangre o suero, o también una muestra de heces.
Cuando el procedimiento de la invención se
realiza sobre una muestra biológica distinta de una biopsia ileal o
de una preparación de enterocitos aislados, es decir, en particular
cuando la muestra biológica es una muestra de sangre o de heces, es
ventajoso asociar a la detección de CF66c una detección
(cuantitativa o semi-cutantitativa) de marcadores
tumorales tales como el CEA ("carcinonoembryonic antigen")
(Grunert et al., 1995). Así, se puede discriminar
directamente entre pacientes que padecen cánceres colorrectales y
pacientes que padecen la enfermedad de Crohn.
El procedimiento de la invención implica o bien
la determinación cuantitativa del nivel de expresión absoluto del
receptor CD66c, y después la comparación con el nivel de expresión
del receptor en un sujeto de control, determinado en paralelo o
conocido por otro lado, o bien la determinación directa del nivel de
expresión relativo del receptor CD66c en la muestra biológica a
ensayar con relación a la muestra de control (se puede hablar
entonces de detección semi-cuantitativa). La muestra
de "control" es una muestra de un sujeto "sano" o de un
sujeto que no padece la enfermedad de Crohn, o de un sujeto que no
padece ninguna enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) o cáncer
colorrectal. Puede tratarse, según el caso, de un sujeto que
presenta unas lesiones inflamatorias del intestino delgado de
origen traumático o infeccioso. Con el fin de determinar la
evolución de la enfermedad de Crohn, puede ser útil determinar en
un sujeto el nivel de expresión de CD66c, y controlar el efecto de
un medicamento o el desarrollo de la enfermedad, analizando el
sujeto una segunda vez, por ejemplo varias semanas más tarde. En
este caso, los resultados del segundo ensayo se comparan con los
resultados del primer ensayo y en general también con los
resultados obtenidos en un sujeto "sano". La muestra de
"control" se refiere así o bien al mismo sujeto de ensayo o
bien al sujeto
"sano".
"sano".
Un "sujeto" o "paciente" es un
mamífero, preferentemente un ser humano, sea cual sea su sexo, su
edad o su condición general. Los niños también están incluidos. El
sujeto ensayado puede ser asintomático, o puede ser considerado
como susceptible de desarrollar la enfermedad de Crohn.
El término "diagnóstico" se refiere a la
determinación o a la confirmación de una afección por la enfermedad
de Crohn, sea cual sea su estado de desarrollo. Puede tratarse más
particularmente de un diagnóstico precoz o de un diagnóstico de
recidiva.
El nivel de expresión del receptor CD66c se
puede determinar de diferentes maneras. Se puede determinar en
particular dosificando el receptor CD66c o determinando su nivel de
transcripción, es decir, la cantidad de ARNm que codifica para el
receptor. También se puede determinar mediante la detección y/o la
cuantificación de los motivos manosa, de los cuales el CD66c es
rico. Se describen a continuación diferentes métodos para la
detección y/o la cuantificación de la expresión del receptor
Cd66c.
Según un primer modo de realización, el nivel de
expresión del receptor CD66c se determina por medio de la medición
de la cantidad de proteína del receptor CD66c, generalmente poniendo
en contacto una muestra biológica con una pareja de unión capaz de
interactuar de manera selectiva con el receptor CD66c presente en la
muestra. La pareja de unión es generalmente un anticuerpo, que
puede ser policlonal o monoclonal, preferentemente monoclonal.
Puede tratarse asimismo de un fragmento peptídico del receptor
CD66c, tal como uno de los péptidos descritos en la solicitud de
patente WO 01/013937, y relacionados en la tabla 1 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
El término "anticuerpos" se refiere
a cualquier anticuerpo completo o fragmento funcional de un
anticuerpo (obtenido mediante ingeniería genética o no), que
comprende, o que consiste en, por lo menos un sitio de combinación
antigénica, que permite que dicho anticuerpo se una a por lo menos
un determinante antigénico de un compuesto antigénico. A título de
ejemplo de fragmentos de anticuerpos se pueden citar los fragmentos
Fab, Fab', F(ab')_{2} así como los fragmentos variables de
cadena simple (cadenas scFv).
Mediante la expresión "anticuerpo de
captura" se entiende un anticuerpo o una parte de anticuerpo,
preferentemente fijado sobre una fase sólida, que es capaz de
retener el antígeno CD66c presente en una muestra biológica,
mediante una unión afín.
La presencia del antígeno en la muestra
biológica se revela mediante unos "medios de detección".
Tratándose de la detección del antígeno, la invención prevé en
particular una detección con la ayuda de por lo menos un
"anticuerpo de detección". Dicho anticuerpo de detección,
marcado, es capaz de unirse al antígeno capturado, mediante unión
afín, reconociendo un sitio epitópico diferente del reconocido por
el anticuerpo de captura.
El término "marcado" se refiere tanto a un
marcado directo (mediante enzimas, radioisótopos, fluorocromos,
compuestos luminiscentes, etc.) como a un marcado indirecto (por
ejemplo, mediante anticuerpos marcados a su vez de manera directa o
con la ayuda de reactivos de un "par de afinidad" marcado, tal
como, pero no exclusivamente, el par avidina
marcada-biotina, etc.).
Mediante la expresión "fragmento
antigénico" se entiende cualquier parte del CD66c capaz de
inducir la síntesis de anticuerpos sustancialmente específica del
CD66c solo en un animal inmunizado.
El término "específicamente" cuando se
refiere a un reconocimiento o a una unión específica de un
anticuerpo para un antígeno, significa que el anticuerpo interactúa
con el antígeno sin ninguna interacción sustancial con otros
antígenos.
Los anticuerpos anti-CD66c
usados en la presente invención son unos anticuerpos específicos del
antígeno. Son preferentemente unos anticuerpos monoclonales o unos
anticuerpos policlonales monoespecíficos, es decir, que reconocen
específicamente sólo un epítopo.
La producción de anticuerpos monoclonales o de
sueros policlonales monoespecíficos, o de anticuerpos obtenidos
mediante el cribado de bancos genómicos, útiles en el marco de la
invención, resulta de técnicas habituales.
Un anticuerpo policlonal
anti-CD66c puede, entre otros, ser obtenido mediante
la inmunización de un animal tal como un conejo, un ratón, etc. con
la ayuda del receptor CD66c soluble o de un fragmento antigénico de
éste, la extracción y después el agotamiento del antisuero obtenido
sobre, por ejemplo, un inmunoadsorbente que contiene el receptor
según unos métodos conocidos por el experto en la materia.
Se han desarrollado y comercializado varios
anticuerpos monoclonales. Se puede usar así el anticuerpo monoclonal
anti-CD66c clone 9A6 (Genovac, Suiza) o el
anticuerpo monoclonal anti-CD66c de InnoGenex,
Menarini Diagnostics, (Anthony, Francia).
De manera general, se pueden obtener otros
anticuerpos monoclonales según el método habitual de fusión
linfocitaria y de cultivo de hibridomas descrito por Köhler y
Milstein, (1975). Se conocen asimismo otros métodos de preparación
de anticuerpos monoclonales (Harlow et al., ed., 1988
"Antibodies: a laboratory manual"). Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar inmunizando un mamífero (por ejemplo
un ratón, una rata, un conejo, incluso un ser humano, etc.) y
usando la técnica de fusión linfocitaria que conduce a unos
hibridomas (Köhler y Milstein, 1975).
Existen unas técnicas alternativas a esta
técnica habitual. Se puede, por ejemplo, producir unos anticuerpos
monoclonales mediante la expresión de un ácido nucleico clonado a
partir de un hibridoma. Se puede asimismo producir unos anticuerpos
mediante la técnica de expresión sobre fago ("phage display"),
introduciendo unos ADNc de anticuerpos en unos vectores, que son
típicamente unos fagos filamentosos que presentan unos bancos de
genes V en la superficie del fago (por ejemplo fUSE5 para E.
coli, Scott, 1990). En Marks et al., (1991) se describen
unos protocolos de construcción de estos bancos de anticuerpos.
Los kits y reactivos útiles para la detección
del CD66c en una muestra biológica, de acuerdo con el procedimiento
de la invención, se pueden proporcionar para una puesta en práctica
de la invención fácil y se pueden aplicar a numerosas muestras
biológicas.
Unos kits de detección del CD66c en una muestra
biológica pueden contener por lo menos un anticuerpo tal como se ha
definido anteriormente.
La cantidad de glicoproteína del receptor CD6c
se mide así preferentemente mediante un ensayo inmunológico, que
comprende la puesta en contacto de la muestra biológica con un
anticuerpo anti-CD66c, eventualmente marcado, que
reconoce específicamente CD66c, y la revelación de los complejos
anticuerpos-receptores CD66c formados.
Por ejemplo, la presencia de CD66c se puede
detectar usando unas técnicas estándares de electroforesis y de
inmunodiagnóstico, incluyendo unos inmunoensayos, por ejemplo
mediante competición, reacción directa o de tipo sándwich. Dichos
ensayos incluyen en particular unas transferencias western, unos
ensayos de aglutinación, unos inmunoensayos mediante marcado
enzimático (ELISA), unos ensayos de tipo avidina/biotina, unos
radioinmunoensayos, unas inmunoelectroforesis, unas
inmunoprecipitaciones, etc. Las reacciones incluyen generalmente la
revelación de marcadores tales como unas moléculas fluorescentes,
quimioluminiscentes, radiactivas o unos marcadores enzimáticos, o
también unos colorantes.
El procedimiento de diagnóstico según la
invención se puede realizar según diversos formatos bien conocidos
por el experto en la materia: en fase sólida o en fase homogénea; en
un tiempo o en dos tiempos; en método sándwich o en método
competitivo, a título de ejemplos no limitativos.
Según un modo de realización preferido, el
anticuerpo de captura se inmoviliza sobre una fase sólida. Se puede
usar, a título de ejemplos no limitativos de fase sólida, unas
microplacas, en particular unas microplacas de poliestireno, tales
como las comercializadas por la compañía Nunc, Dinamarca. Se pueden
usar asimismo unas partículas o unas perlas sólidas, unas perlas
paramagnéticas, tales como las suministradas por Dynal o
Merck-Eurolab (Francia) (bajo la marca de
Estapor^{TM}), o también unos tubos de ensayo en poliestireno o
polipropileno, etc.
Un formato de inmunoensayo de tipo sándwich
entre dos anticuerpos (de captura y de detección) es particularmente
ventajoso para la detección de los antígenos presentes en la
muestra biológica, cuando ésta es un fluido biológico tal como
sangre, o una muestra de heces por ejemplo.
Un formato de inmunoensayo de detección de los
antígenos por competición es asimismo posible. Otras modalidades de
inmunoensayo son también posibles y bien conocidas por el experto en
la materia.
Se pueden usar dosificaciones ELISA,
radioinmunoensayos, o cualquier otra técnica de detección para
revelar la presencia de los complejos
antígenos-anticuerpos formados.
Según un modo de realización preferido, un
procedimiento in vitro de diagnóstico de la enfermedad de
Crohn comprende un ensayo inmunológico, por ejemplo de tipo ensayo
ELISA, sobre una muestra de sangre o de heces. Se puede así
realizar una dosificación inmunológica sobre placa, con un
anticuerpo de captura CD66c fijado, y diferentes diluciones de
sangre o de heces, siendo el antígeno CD66c revelado por un
anticuerpo de revelación específico, es decir, un anticuerpo
anti-CD66c marcado, por ejemplo acoplado con una
enzima o un fluorocromo. El anticuerpo anti-CD66c
puede ser, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de ratón
anti-CD6abce humano de DAKO (clon Kat4C, DAKO,
Dinamarca). Se puede usar asimismo concanavalina A en lugar del
anticuerpo fijado, para capturar el receptor
anti-CD66c mediante sus motivos manosa.
Alternativamente, el nivel de expresión del
receptor CD66c se determina mediante la medición del nivel de
producción de anticuerpos anti-CD66c. El nivel de
expresión de anticuerpos anti-CD66c se puede
determinar, preferentemente en una muestra de sangre o de heces,
mediante la puesta en contacto de la muestra con un antígeno CD66c,
eventualmente fijado, o un fragmento epitópico de éste, y la
revelación de los complejos anticuerpos-receptores
CD66c formados. Se puede así realizar una dosificación inmunológica
sobre placa, con el antígeno CD66c fijado y diferentes diluciones
de sangre o de heces, siendo los anticuerpos
anti-CD66c revelados mediante un anticuerpo
anti-IgG o anti-IgA, o también
anti-IgM marcado, por ejemplo acoplado con una
enzima o un fluorocromo.
Según otro modo de realización, el procedimiento
de la invención comprende un ensayo de inmunohistoquímica realizado
sobre una biopsia ileal.
Por ejemplo, se pueden marcar mediante un
anticuerpo anti-CD66c unos cortes de biopsia ileal
fijados, y después se pueden revelar con un anticuerpo secundario
acoplado con un fluorocromo o con una enzima de tipo peroxidasa o
fosfatasa alcalina. La expresión del receptor CD66c se puede
interpretar, después de la observación con microscopio o lectura
electrónica, y clasificar según un resultado
anatomo-patológico comprendido entre 0 (ausencia de
expresión) y 4 (muy alta expresión a nivel citoplásmico y borde
ciliado), indicando el estado de desarrollo de la enfermedad.
Alternativamente, se pueden realizar unos
ensayos de marcado poniendo unas preparaciones de enterocitos
aislados a partir de biopsia ileal, en presencia de un anticuerpo
anti-CD66c marcado directamente de manera
detectable, por ejemplo, por un fluorocromo de tipo FITC o Alexa
Fluor 488 ó 647. Se visualiza así el marcado específico de los
receptores CD66c sobreexpresados a nivel del borde ciliado de los
enterocitos en el caso de la enfermedad de Crohn.
Según otro modo de realización de la invención,
el nivel de expresión del receptor CD66c se determina de manera
indirecta mediante la detección cuantitativa de los motivos manosa
presentes a nivel del borde ciliado de los enterocitos. Este tipo
de ensayo es particularmente práctico de realizar sobre unas
biopsias ileales o unas preparaciones de enterocitos aislados.
Permite demostrar fácilmente la sobreexpresión
de los receptores CD66c, altamente manosilados, a nivel del borde
ciliado de los enterocitos. Por ejemplo, la detección cuantitativa o
semi-cuantitativa de los motivos manosa se puede
realizar mediante la puesta en contacto de la muestra biológica con
una lectina tal como la concanavalina A marcada de manera
detectable, y la revelación de los complejos formados por la
concanavalina A unida a los motivos manosa. La concanavalina A
puede estar por ejemplo acoplada a un fluorocromo, tal como el
FITC.
Según otro modo de realización de la invención,
el nivel de expresión del receptor CD66c se determina mediante la
medición de la cantidad de ARNm de CD66c en la muestra
biológica.
Los procedimientos para determinar el nivel de
transcripción de un gen son bien conocidos. Por ejemplo, el ácido
nucleico contenido en las muestras (por ejemplo una preparación de
enterocitos o una biopsia ileal), se extrae generalmente en primer
lugar según los métodos habituales, por ejemplo con la ayuda de
enzimas líticas, o de disoluciones químicas mediante unas resinas
que unen los ácidos nucleicos. El ARNm extraído se detecta a
continuación mediante hibridación (por ejemplo mediante análisis de
transferencia Northern) y/o amplificación después de la
transcripción inversa (RT-PCR), con la ayuda de
cebadores oligonucleotídicos específicos. Un ejemplo de cebadores
específicos que se pueden usar se proporciona a continuación:
| CD66c F: | 5' CCTGCAGATTGCATGTCCCC | (SEC ID nº 1) |
| CD66c R: | 5' CCAATACGATTCTGGGGCAGG | (SEC ID nº 2) |
En un ejemplo particular de realización, la
muestra biológica es una biopsia ileal o una preparación de
enterocitos aislados, y la cantidad de ARNm de CD66c se mide
mediante RT-PCR en tiempo real, preferentemente
después de la extracción de los ARN totales.
Otro aspecto de la invención proporciona unos
métodos terapéuticos para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad de Crohn. Estos métodos se basan en la demostración de
que el receptor CD66c está sobreexpresado en los pacientes que
padecen de la enfermedad de Crohn y es responsable de la unión de
las bacterias Escherichia coli AIEC al borde ciliado de los
enterocitos. Cualquier agente que inhibe específicamente la
interacción entre el receptor CD66c y las cepas de E. coli
AIEC es por lo tanto útil para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad de Crohn.
La invención tiene por objetivo asimismo el uso
de un agente que inhibe específicamente la interacción entre el
receptor CD66c y las cepas de Escherichia coli AIEC para la
preparación de un medicamento destinado a la prevención o al
tratamiento de la enfermedad de Crohn.
Este agente puede ser un anticuerpo
anti-CD66c inhibidor, que reconoce específicamente
el receptor CD66c y bloquea la unión de este receptor con una cepa
de E. coli AIEC.
Dicho agente puede ser de manera alternativa una
glicoproteína del receptor CD66c o una glicoproteína de síntesis
que imita el CD66c.
Puede tratarse asimismo de un fragmento
peptídico del receptor CD66c, tal como uno de los péptidos descritos
en la solicitud de patente WO 01/013937, y relacionados
anteriormente.
El agente puede ser asimismo un manósido, tal
como una D-manosa,
metil-D-manosa, o una partícula que
comprende uno o unos motivos manosas. Por definición, el término
manósido incluye por lo tanto la D-manosa y los
compuestos susceptibles de liberar una D-manosa
mediante hidrólisis, por ejemplo los poliholósidos y los
oligoholósidos que liberan D-manosa mediante
hidrólisis (homo- o heteroholósidos), así como cualquier derivado de
D-manosa susceptibles de interactuar con la
adhesina FimH de las cepas AIEC. Las partículas que comprenden uno o
unos motivos manosa pueden ser por ejemplo unas perlas o partículas
inertes o unas células vivas o asesinadas.
Más particularmente, el agente usado puede ser
un agente que bloquea específicamente la interacción entre el
receptor CD66c y la adhesina FimH de las cepas AIEC.
La invención proporciona por otro lado un
procedimiento in vitro de cribado de sustancias candidatas
para la prevención o el tratamiento de la enfermedad de Crohn, que
comprende:
- (i)
- poner en contacto el receptor CD66c expresado en la superficie de una célula, con por lo menos una cepa de Escherichia coli AIEC, en presencia o en ausencia de una sustancia a ensayar;
- (ii)
- determinar la capacidad de la sustancia para inhibir específicamente la interacción entre el receptor CD66c y dicha cepa, y seleccionar y/o identificar dicha sustancia.
Unas sustancias candidatas pueden ser de
cualquier tipo, incluyendo unos compuestos naturales o sintéticos o
unas mezclas de compuestos. La sustancia puede ser estructuralmente
definida o de una estructura desconocida, por ejemplo en forma de
un extracto biológico.
Para determinar la capacidad de la sustancia
candidata para inhibir la unión entre las cepas E. coli AIEC
y el receptor CD66c, se pueden realizar unos ensayos de competición
estándares sobre unos cultivos celulares que expresan el receptor
CD66c. Puede tratarse, por ejemplo, de células transformadas
genéticamente para sobreexpresar el receptor, o de enterocitos
aislados de biopsia ileal de pacientes que padecen la enfermedad de
Crohn. Puede tratarse de células epiteliales intestinales
cultivadas en monocapas (a título de ejemplos las células HT29,
Caco-2, T84, Intestine-407). En el
caso en el que la sustancia candidata es un compuesto identificado,
éste puede ser marcado, por ejemplo mediante un marcador radiactivo
o no radiactivo (por ejemplo fluoresceína).
El marcador específicamente unido al receptor
CD66c se puede cuantificar después en presencia de una concentración
variable de dicha sustancia candidata, por ejemplo de 10^{-10} a
10^{-5} M. De manera alternativa, se puede seguir la competición
de la sustancia candidata con la bacteria E. coli AIEC frente
al receptor CD66c mediante unos ensayos de adhesión.
Los agentes que inhiben específicamente la
interacción entre el receptor CD66c y las cepas de E. coli
AIEC se pueden formular en forma de composición farmacéutica,
preferentemente para una administración por vía oral.
Estas composiciones se pueden administrar por
ejemplo por vía oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, de
cápsulas blandas o de gránulos de liberación inmediata o
controlada.
Una composición sólida para una administración
oral se prepara mediante la adición al principio activo de una
carga y, llegado el caso, de un ligando, de un agente desagregante,
de un lubrificante, de un colorante, o de un corrector de sabor, y
mediante el conformado de la mezcla en un comprimido, un comprimido
recubierto, un granulado, un polvo o una cápsula.
Unos ejemplos de cargas engloban la lactosa, el
almidón de maíz, la sacarosa, la glucosa, el sorbitol, la celulosa
cristalina y el dióxido de silicio, y unos ejemplos de ligandos
engloban el poli(alcohol vinílico), el poli(éter vinílico),
la etilcelulosa, la metilcelulosa, la acacia, la goma adragante, la
gelatina, el Shellac, la hidroxipropilcelulosa, la
hidroxipropilmetilcelulosa, el citrato de calcio, la dextrina y la
pectina.
Unos ejemplos de lubrificantes engloban el
estearato de magnesio, el talco, el polietilenglicol, la sílice, y
los aceites vegetales endurecidos. El colorante puede ser cualquiera
de los autorizados para un uso en los medicamentos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Unos ejemplos de correctores de sabor comprenden
el cacao en polvo, la menta en forma de hierba, el polvo aromático,
la menta en forma de aceite, el borneol y la canela en polvo. Se
debe entender que el comprimido o el granulado puede ser
convenientemente recubierto con azúcar, gelatina o análogo.
Las dosis y posologías eficaces de
administración de los agentes terapéuticos, destinadas a la
prevención o al tratamiento de la enfermedad de Crohn dependen de
un gran número de factores, y por ejemplo de la naturaleza del
agente, del tamaño del paciente, del estado de la enfermedad, de la
composición farmacéutica específica usada y de las observaciones y
de las conclusiones del médico tratante.
Por ejemplo, en el caso de una administración
por vía oral, por ejemplo un comprimido o una cápsula blanda, una
posología posible conveniente se sitúa entre aproximadamente 0,1
mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día,
preferentemente entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 50
mg/kg de peso corporal por día, más preferentemente entre
aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal
por día y más preferentemente aún entre aproximadamente 2 mg/kg y
aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día de materia
activa.
Si se consideran unos pesos corporales
representativos de 10 kg y 100 kg a fin de ilustrar la gama de
posología diaria por vía oral que se puede usar y tal como se ha
descrito anteriormente, unas posologías convenientes estarán
comprendidas entre aproximadamente 1-10 mg y
1.000-10.000 mg por día, preferentemente entre
aproximadamente 5-50 mg y 500-5.000
mg por día, más preferentemente entre aproximadamente
10,0-100,0 mg y
100,0-0-1.000,0 mg por día, y más
preferentemente aún entre aproximadamente 20,0-200,0
mg y aproximadamente 50,0-500,0 mg por día, de
principio activo.
Estas gamas de posología representan unas
cantidades totales de principio activo por día para un paciente
determinado. El número de administración por día al que se
administra una dosis puede variar en grandes proporciones, en
particular en función de los factores farmacocinéticos.
Las figuras y ejemplos siguientes ilustran la
invención sin limitar su alcance.
La figura 1 representa unos cortes de mucosa
ileal en unos sujetos que no padecen ninguna enfermedad inflamatoria
del intestino de tipo enfermedad de Crohn o rectocolitis
hemorrágica (1A y 1B) y en unos sujetos que padecen la enfermedad
de Crohn (1C y 1D). Las figuras 1A y 1C son unos cortes de secciones
de mucosa sin ninguna inflamación, y las figuras 1B y 1D son unos
cortes de secciones de mucosa con inflamación tal como lo muestra la
presencia de polinucleares neutrófilos infiltrados. La figura 1A no
muestra ningún marcado con el anticuerpo anti CD66c, lo que indica
que esta glicoproteína no está expresada en el tejido sano. Se debe
observar que incluso en el tejido que presenta unas señales de
inflamación (figura 1B) de un sujeto que no padece la enfermedad de
Crohn cuya inflamación intestinal es de origen traumático
(perforación del intestino delgado sobre brida), no se observa
ningún marcado con el anticuerpo CD66c. Así, la presencia de la
glicoproteína CD66c a nivel ileal no está relacionada con el estado
inflamatorio de la mucosa. La figura 1C muestra una expresión de
CD66c a nivel del borde ciliado de los enterocitos de un paciente
que padece la enfermedad de Crohn. Esta expresión se observa en
ausencia de inflamación a nivel de una mucosa no ulcerada. La figura
1D representa una hiperexpresión de CD66c a nivel del borde ciliado
de los enterocitos así como una expresión citoplásmica de esta
proteína en zona inflamatoria y lesionada en un paciente que padece
la enfermedad de Crohn. El inmunomarcado se realiza con la ayuda de
anticuerpos anti-CD66c marcados con el complejo
peroxidada avidina-biotina, acoplado con un
cromógeno.
La figura 2 es un gráfico que representa el
porcentaje de pacientes o sujetos de control que muestran un marcado
mediante el anticuerpo anti-CD66c (según el
protocolo de la figura 1). El marcado se anota de – a +++ según la
intensidad. Aparece que el 85% de los pacientes que padecen la
enfermedad de Crohn expresan de manera anormal el receptor CD66c a
nivel ileal contra sólo el 15% de los sujetos sanos.
Se usa la cepa E. coli LF82, aislada de
una lesión ileal crónica de un paciente que padece la enfermedad de
Crohn, como cepa de referencia (Adherent-Invasive
E. coli). Esta cepa se describe en J. Boudeau et al.
(1999). Se adhiere e invade las células epiteliales intestinales en
cultivo y se replica en el citoplasma de las células hospedantes
después de la lisis de los vacuoles de endocitosis. Es capaz de
sobrevivir y replicarse en los macrófagos murinos
J774-A1 induciendo una fuerte secreción de citoquina
pro-inflamatoria TNF-alfa. Se
multiplica asimismo en unos macrófagos peritoneales de ratón y en
unos macrófagos humanos derivados de monocitos.
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Se han usado asimismo en este caso unos mutantes
de la cepa LF82 que no expresan ningún pili de tipo 1 tras una
inserción del transposón Tn5phoA en el gen fimA
(mutante 52D11) o en el gen fimH (mutante ZG2) del operón
fim que codifica para los pili de tipo 1, tales como se describen en
J. Boudeau et al. (2001).
Las bacterias se cultivan en caldo
Luria-Bertani (LB) o sobre unas placas de agar LB o
Mueller-Hinton (MH) (Instituto Pasteur Production,
Marnes-la-Coquette, Francia).
Se han aislado unos enterocitos de piezas
operatorias ileales obtenidas mediante cirugía o mediante biopsias
endoscópicas ileales de 12 pacientes que padecen la enfermedad de
Crohn (pacientes CD o MC) y de 7 sujetos que no presentan ninguna
enfermedad inflamatoria del intestino ("Inflammatory bowel
disease" IBD). Se han congelado las muestras a -80ºC en medio de
Eagle modificado (MEM, Seromed, Biochrom, Berlin, Alemania) que
contiene 10% de glicerol y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma
Chemical Company, St-Louis, Mo.) inmediatamente
después de la extracción.
Los ensayos de adhesión se han llevado a cabo
tal como se describe en Darfeuille-Michaud et
al., (1990); S. Knutton et al., (1985) y B. Lafeuille
et al., (1981). Las muestras intestinales congeladas se han
lavado 3 veces en PBS y se ha raspado la mucosa ileal con una
laminilla para despegar los enterocitos en tampón PBS adicionado
con 0,25 M de EDTA. Se han mezclado aproximadamente 10^{5}
enterocitos aislados con 10^{8} células de E. coli en un
medio MEM que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS, Seromed).
Después de 2 horas de incubación, a 37ºC y con agitación moderada,
se han lavado los enterocitos 3 veces en PBS (pH 7,2). Se ha
cuantificado la adhesión de las bacterias examinando con microscopio
de contraste de fase con una ampliación x1000. El recuento se ha
realizado en doble ciego para determinar la cantidad de E.
coli que se adhiere al borde ciliado de 30 a 50 enterocitos. El
índice de adhesión se expresa en número de bacterias adheridas al
borde ciliado de un enterocito.
En el caso de los enterocitos que proceden de
enfermos, el índice de adhesión observado era de 0,542 a 1,999
contra 0,096 a 0,511 para los controles (tabla 2).
Un índice de adhesión superior a 1 se considera
como indicativo de una adhesión eficaz al borde ciliado (S. Knutton
et al., (1985); B. Larfeuille et al., (1981)). En el
experimento, se han observado unos índices superiores a 1 con los
enterocitos de 9 de 13 pacientes CD, es decir 69%, y ningún índice
superior a 1 para los controles. La capacidad de la cepa LF82 para
adherirse al borde ciliado de los enterocitos es significativamente
más elevada con los enterocitos aislados de pacientes CD que con los
controles (P=0,006). Esto ha conducido a considerar que los
pacientes CD podrían expresar un receptor situado en el borde
ciliado de los enterocitos ileales, receptor que estaría implicado
en la adhesión de la cepa AIEC LF82.
La adhesina FimH, situada sobre los pili de tipo
1, actúa como una lectina y reconoce el motivo manosil de los
glicolípidos o de las glicoproteínas expresadas en la superficie de
las células hospedantes. Basándose en ello, se ha usado la
concanavalina A (ConA) que une específicamente los residuos de
manosa para buscar la presencia de residuos manosa libres sobre el
borde ciliado de los enterocitos de los pacientes CD y de los
controles. Se han incubado los enterocitos aislados durante 1 hora
en PBS que contiene 50 \mug/ml de ConA-FITC (ConA
marcada con FITC, Sigma). Después de 4 lavados, se han observado los
enterocitos con microscopio de fluorescencia con una ampliación
x400.
La observación ha mostrado que la lectina se
unía al borde ciliado de los enterocitos de los pacientes CD. Por
el contrario, no se ha observado ninguna fijación de la lectina a
los enterocitos de control, lo que demuestra la expresión de una
molécula altamente manosilada sobre el borde ciliado de los
enterocitos de pacientes CD, lo cual no se ha observado en los
controles.
Se han obtenido unas muestras de mucosa
inflamatoria y de mucosa sana mediante resección quirúrgica sobre
20 pacientes CD y sobre 20 controles respectivamente. A partir de
fragmentos fijados al AFA (alcohol-formol-ácido
acético) y después incluidos en parafina y preparación de cortes
finos de 4 \mum, se han realizado unos inmunomarcados con la
ayuda de un aparato automático de inmunomarcado por anticuerpo
anti-CD66c (Ventana Medical System), usando el
método con complejo peroxidada avidina-biotina. Se
han sometido los cortes a un tratamiento con calor durante 3
minutos a presión en una olla a presión para descubrir los
epítopos.
Como anticuerpo, se ha usado el anticuerpo
monoclonal anti-CD66c clon 9A6 (Genovac, Suiza) con
la dilución 1:50.
Se han coloreado los cortes mediante
hematoxilina de Mayer.
Los resultados se presentan en las figuras 1 y
2. El 85% de los sujetos sanos no tienen ningún marcado por este
antígeno CD66c. Sin embargo, los pacientes que padecen la enfermedad
de Crohn muestran una sobreexpresión de los receptores de CD66c a
nivel del borde ciliado de las células epiteliales. Esta expresión
es muy aguda en el caso de mucosas que presentan una fuerte
inflamación y unas ulceraciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha ensayado el poder inhibidor de la
D-manosa sobre la adhesión de la cepa E. coli
LF82 en el borde ciliado de los enterocitos a través de los pili de
tipo 1. Se han llevado a cabo unos ensayos de adhesión en presencia
de 2% (p/v) de D-manosa (Sigma) en MEM que contiene
10% de FCS, y procediendo tal como se ha descrito anteriormente
sobre unos enterocitos que proceden de 3 pacientes CD (A, B y C).
Los resultados se presentan en la tabla 3.
La adición de D-manosa hace
disminuir significativamente el índice de adhesión de la cepa LF82
en el borde ciliado de los enterocitos de pacientes que padecen la
enfermedad de Crohn.
Se han ensayado asimismo unos mutantes de la
cepa LF82, a saber, el mutante 52D11 que no expresa ningún pili de
tipo 1 y el mutante ZG2 que no expresa la adhesina FimH. Estos
mutantes han perdido su capacidad de adhesión en el borde ciliado,
tal como se muestra en los resultados presentados en la tabla 4.
Estos resultados confirman que los pili de tipo
1, y más particularmente la adhesina FimH de la cepa LF82 están
implicados en la adhesión al borde ciliado de los enterocitos
ileales de pacientes que padecen la enfermedad de Crohn.
Anticuerpos monoclonales ensayados: monoclonal
anti-CD66c (InnoGenex, Menarini Diagnostics,
Anthony, Francia) y monoclonal anti-CD48
(PeliCluster, Tebu, Le Perray en Yvelines, Francia). Estos
anticuerpos se usan con la dilución 1/100 en MEM que contiene 10%
de FCS.
Los enterocitos se pretratan durante 30 min. a
37ºC con los anticuerpos. Se añaden a continuación las bacterias
LF82 y se llevan a cabo los ensayos de adhesión como se ha descrito
anteriormente.
Los resultados se presentan en la tabla 5:
El pretratamiento con el anticuerpo
anti-CD66c hace disminuir drásticamente la adhesión
de la cepa LF82. Por el contrario, el anticuerpo
anti-CD48 no afecta a la adhesión, lo que indica una
especificidad de la inhibición observada con el anticuerpo CD66c.
Estos resultados confirman que la adhesión de la cepa LF82 a la
mucosa ileal de pacientes CD implica una unión de los pili de tipo
1 a los receptores CD66c sobreexpresados a nivel del borde ciliado
de las células epiteliales intestinales.
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<110> Universidad d'Auvergne
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de diagnóstico de la
enfermedad de Crohn
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BFF04a0022
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
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<400> 1
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\hfill20
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<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
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\hfill21
Claims (24)
1. Procedimiento in vitro de diagnóstico
de la enfermedad de Crohn, o de determinación de una predisposición
de una persona a desarrollar la enfermedad de Crohn, en el que se
determina si el nivel de expresión del receptor CD66c en una
muestra biológica de un sujeto a analizar, es superior al nivel de
expresión en una muestra de control, lo que es indicativo de la
enfermedad de Crohn, o de una predisposición del sujeto ensayado a
desarrollar la enfermedad de Crohn.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la muestra biológica es una biopsia ileal o una preparación
de enterocitos aislados a partir de una biopsia ileal.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la muestra biológica es una muestra de sangre o de heces.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el nivel de expresión del receptor
CD66c se determina mediante la medición de la cantidad de
glicoproteína del receptor CD66c.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que la cantidad de proteína del receptor CD66c se mide mediante
un ensayo inmunológico, que comprende la puesta en contacto de la
muestra biológica con un anticuerpo anti-CD66c,
eventualmente marcado, que reconoce específicamente CD66c, y la
revelación de los complejos anticuerpos-receptores
CD66c formados.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el anticuerpo anti-CD66c es un anticuerpo
monoclonal.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la muestra biológica es una biopsia ileal, y el ensayo
inmunológico es un ensayo de inmunohistoquímica.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la muestra biológica es una muestra de sangre o de heces, y
el ensayo inmunológico es un ensayo ELISA.
9. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el nivel de expresión del receptor CD66c se determina de
manera indirecta por la detección cuantitativa de los motivos manosa
presentes a nivel del borde ciliado de los enterocitos.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que la detección cuantitativa de los motivos manosa se realiza
mediante la puesta en contacto de la muestra biológica con la
concanavalina A marcada de manera detectable, y la revelación de
los complejos formados por la concanavalina A unida a los motivos
manosa.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el nivel de expresión del receptor
CD66c se determina mediante la medición de la cantidad de ARNm de
CD66c en la muestra biológica.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que la muestra biológica es una biopsia ileal y la cantidad de
ARNm de CD66c se mide mediante RT-PCR en tiempo
real.
13. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el nivel de expresión del receptor CD66c se determina
mediante la medición del nivel de producción de anticuerpos
anti-CD66c.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
que comprende la puesta en contacto de una muestra de sangre o de
heces a ensayar, con un antígeno CD66c, eventualmente fijado, o un
fragmento epitópico de éste, y la revelación de los complejos
anticuerpos-receptores CD66c formados.
15. Uso de un anticuerpo
anti-CD66c, que reconoce específicamente el receptor
CD66c, para la preparación de un medicamento destinado a la
prevención o al tratamiento de la enfermedad de Crohn.
16. Uso de una proteína del receptor CD66c o una
glicoproteína que imita el CD66c, para la preparación de un
medicamento destinado a bloquear específicamente la interacción
entre el receptor CD66c y las cepas de Escherichia Coli
AIEC, para la prevención o el tratamiento de la enfermedad de
Crohn.
17. Uso de un manósido o de una partícula que
comprende uno o unos motivos manosa para la preparación de un
medicamento destinado a bloquear específicamente la interacción
entre el receptor CD66c y las cepas de Escherichia Coli
AIEC, para la prevención o el tratamiento de la enfermedad de
Crohn.
18. Procedimiento in vitro de cribado de
sustancias candidatas para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad de Crohn, que comprende:
- (i)
- poner en contacto el receptor CD66c, en forma soluble o expresado en la superficie de una célula, con por lo menos una cepa de Escherichia coli AIEC, en presencia o en ausencia de una sustancia a ensayar;
- (ii)
- determinar la capacidad de la sustancia para inhibir específicamente la interacción entre el receptor CD66c y dicha cepa, y seleccionar y/o identificar dicha sustancia.
19. Anticuerpos anti-CD66c que
reconocen específicamente el receptor CD66c, para ser usados como
medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de la
enfermedad de Crohn.
20. Medicamento que comprende un anticuerpo
anti-CD66c que reconoce específicamente el receptor
CD66c, destinado a la prevención o al tratamiento de la enfermedad
de Crohn.
21. Proteína del receptor de CD66c o
glicoproteína que imita el CD66c para ser usada como medicamento
destinado a bloquear específicamente la interacción entre el
receptor CD66c y las cepas de Escherichia Coli AIEC, para la
prevención o el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
22. Medicamento que comprende una proteína del
receptor CD66c o una glicoproteína que imita el CD66c, destinado a
bloquear específicamente la interacción entre el receptor CD66c y
las cepas de Escherichia coli AIEC, para la prevención o el
tratamiento de la enfermedad de Crohn.
23. Manósido o partícula que comprende uno o
unos motivos manosa, para ser usado como medicamento destinado a
bloquear específicamente la interacción entre el receptor CD66c y
las cepas de Escherichia Coli AIEC, para la prevención o el
tratamiento de la enfermedad de Crohn.
24. Medicamento que comprende un manósido o una
partícula que comprende uno o más motivos manosa, destinado a
bloquear específicamente la interacción entre el receptor CD66c y
las cepas de Escherichia Coli AIEC, para la prevención o el
tratamiento de la enfermedad de Crohn.
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