ES2316429T3 - Proceso de preparacion de una masa refrigerada. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar una masa refrigerada, comprendiendo el procedimiento el mezclado de harina de cereal y agua con una proteína que reduce o impide la degradación enzimática del arabinoxilano presente en la harina de cereal, siendo dicha proteína un inhibidor de la xilanasa.
Description
Proceso de preparación de una masa
refrigerada.
La presente invención se refiere a un
procedimiento. Particularmente, la presente invención se refiere a
un procedimiento de preparación de una masa. Más particularmente,
la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar
una masa refrigerada.
Típicamente, las masas refrigeradas comprenden
harina de trigo y agua. En este sentido, son similares a otras
masas de pan blanco. En la masa refrigerada, la harina de trigo
contiene de 2 a 5% de arabinoxilano (AX) (Fincher y Stone, 1986)
que se origina en las paredes celulares del endospermo. El AX es un
polímero no de almidón complejo que presenta una capacidad única
para enlazar agua. Girhammer (1992) da a conocer que los AX son
capaces de enlazar agua en cantidades de hasta aproximadamente 10
veces su propio peso.
Las masas refrigeradas constituyen un mercado
del pan en rápida expansión. En este sentido, la masa prefabricada
preparada por panaderías industriales se puede almacenar durante un
período prolongado, y el consumidor final puede preparar fácil y
rápidamente pan recién hecho. El concepto de masa refrigerada se
adapta bien a las demandas crecientes de los consumidores, es
decir, poder disponer de pan recién hecho independientemente de los
horarios de apertura, la distancia hasta la panadería, etc.
Sin embargo, la masa refrigerada presenta un
problema. En este sentido, se conoce el hecho de que las masas
refrigeradas exhiben tendencia a adoptar consistencia de jarabe.
Este fenómeno es una consecuencia de la ruptura muy negativa del
AX, y en consecuencia de la disminución en la capacidad de retención
de agua de la masa. En otras palabras, la adopción de una
consistencia de jarabe o jarabización es una ausencia de capacidad
de retención de agua en función del tiempo, de tal manera que es
capaz de provocar la precipitación de líquido en la superficie de
la masa.
Se cree que la ruptura del AX es debida a la
actividad de xilanasas endógenas en la harina de trigo. La harina
de trigo contiene diversas actividades enzimáticas capaces de
modificar el AX (Cleemput, G. y otros (1997), Bonnin, E y otros
(1998)), lo que provoca una disminución del peso molecular y, en
consecuencia, de la capacidad de retención de agua del AX en la
masa.
Se ha intentado solucionar el problema de la
jarabización añadiendo hidrocoloides a la masa. Estos hidrocoloides
enlazan agua y, hasta cierto punto, retrasan dicho fenómeno de
jarabización. A título de ejemplo, se debe hacer referencia al
documento US-A-5792499, que describe
la adición de xilano a la masa.
Sin embargo, existen problemas asociados con la
adición de hidrocoloides a la masa. A título de ejemplo, afectan a
la capacidad de la masa de ser procesada en máquinas, a las
propiedades viscoelásticas de la masa y a la distribución de agua
dentro de la misma.
La presente invención pretende dar a conocer una
masa que presenta un nivel reducido o incluso nulo de
jarabización.
La presente invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de que es posible reducir, e incluso eliminar, la
jarabización en masas refrigeradas utilizando una proteína. Este
descubrimiento contrasta con la propuesta de la técnica anterior de
utilizar hidrocoloides. Dicho descubrimiento resulta sorprendente,
ya que, en algunos casos, se ha esperado que la adición de
proteínas adicionales tuviera un efecto negativo sobre la masa.
Particularmente, se esperaba que, en algunos casos, la utilización
de un inhibidor de una de las enzimas presentes en la masa
-particularmente cantidades adicionales de inhibidores enzimáticos
endógenos- tuvieran un efecto muy negativo sobre la masa
resultante. Sin embargo, sorprendentemente, hemos descubierto que
éste no es el caso, y que es posible utilizar proteínas a efectos
de reducir o impedir la degradación enzimática del arabinoxilano
presente en la harina de cereal, particularmente en la harina de
trigo. En un aspecto preferente, la presente invención se refiere a
la utilización de un inhibidor de la xilanasa endógeno en masas
refrigeradas a efectos de impedir la jarabización. En una forma de
realización preferente, la presente invención se refiere a la
utilización de un inhibidor de la xilanasa endógeno en masas
refrigeradas a efectos de impedir la jarabización.
Según un aspecto de la presente invención, se da
a conocer un procedimiento para preparar una masa refrigerada,
comprendiendo dicho procedimiento el mezclado de harina de cereal
(por ejemplo, harina de trigo) y agua con una proteína que puede
reducir o impedir la degradación enzimática del arabinoxilano
presente en la harina de cereal, siendo dicha proteína un inhibidor
de la xilanasa.
La masa se puede preparar mezclando la harina de
cereal con el agua inicialmente y añadiendo posteriormente la
proteína. Alternativamente, la masa se puede preparar mezclando la
harina de cereal y la proteína inicialmente y añadiendo
posteriormente agua. Alternativamente, la masa se puede preparar
mezclando el agua con la proteína inicialmente y añadiendo
posteriormente la harina de cereal. Las combinaciones de estas
etapas del procedimiento entran dentro del alcance de la presente
invención.
La masa resultante puede comprender ingredientes
distintos de la harina de cereal, el agua y la proteína. Por
ejemplo, la masa puede comprender cantidades añadidas de uno o más
de entre: sal, azúcar, frutas, especia o especias, enzimas tales
como la xilanasa o xilanasas, amilasa o amilasas, proteasa o
proteasas, oxidasa u oxidasas, lipasa o lipasas, mejorador o
mejoradores de pan, etc.
Según un aspecto de la presente invención, se da
a conocer la utilización de un inhibidor de la xilanasa endógeno a
cereal (por ejemplo, trigo) en masas refrigeradas a efectos de
impedir la jarabización.
Una masa refrigerada preparada mediante el
procedimiento según la presente invención; un producto de panadería
preparado a partir del procedimiento según la presente invención o
la masa refrigerada según la presente invención; y una masa
refrigerada que comprende harina de cereal, agua y una proteína que
puede reducir o impedir la degradación enzimática del arabinoxilano
presente en la harina de cereal, se exponen también en el presente
documento como referencia.
Para mayor facilidad de referencia, estos y
otros aspectos de la presente invención se describen a continuación
bajo los títulos apropiados para cada sección. Sin embargo, las
descripciones expuestas en cada sección no están limitadas
necesariamente a cada sección en particular.
La proteína es un inhibidor de la xilanasa.
Preferentemente, el inhibidor de la xilanasa es
un inhibidor de la xilanasa endógeno del cereal.
El inhibidor de la xilanasa endógeno del cereal
se puede obtener a partir de cereales adecuados, tales como trigo,
centeno, etc.
Preferentemente, el inhibidor de la xilanasa es
un inhibidor de la xilanasa endógeno del trigo.
Preferentemente, la harina de cereal es harina
de trigo.
Una ventaja clave de la masa refrigerada
preparada mediante el procedimiento según la presente invención
consiste en que la misma presenta un nivel reducido, o nulo, de
jarabización.
Otra ventaja de la masa refrigerada preparada
mediante el procedimiento según la presente invención consiste en
que la misma es fácil de preparar.
Otra ventaja de la masa refrigerada preparada
mediante el procedimiento según la presente invención consiste en
que dicha masa se puede adaptar fácilmente para ajustarse a
requisitos específicos, simplemente añadiendo proteínas específicas
de acuerdo con la presente invención o combinaciones de proteínas
específicas.
Otra ventaja de la masa refrigerada preparada
mediante el procedimiento según la presente invención consiste en
que la adición de proteína, particularmente inhibidor de la xilanasa
endógeno del cereal, puede no afectar a uno o más de entre la
absorción de la harina, las propiedades del estado de la masa, las
propiedades de manejo de la masa, el procesamiento en máquinas de
la masa, o la distribución de agua dentro de la misma.
La expresión "harina de trigo", tal como se
utiliza en el presente documento, es un sinónimo para la harina de
grano fino de trigo. Preferentemente, sin embargo, el término se
refiere a harina obtenida a partir de trigo en sí y no a partir de
otro grano. Así, y a menos que se indique lo contrario, las
referencias a "harina de trigo", tal como se utilizan en el
presente documento, se refieren preferentemente a referencias a la
harina de trigo en sí, así como a la harina de trigo cuando está
presente en un medio, como por ejemplo una masa.
Una característica esencial de una masa
refrigerada preparada mediante el procedimiento según la presente
invención es la presencia de una proteína que puede reducir o
impedir la degradación enzimática del arabinoxilano presente en la
harina de cereal.
La proteína puede ser cualquier proteína
adecuada capaz de reducir o impedir la degradación enzimática del
arabinoxilano presente en la harina de cereal.
La proteína puede ser una proteína que se ha
aislado de una fuente adecuada, o se puede haber preparado
sintéticamente o utilizando técnicas de ADN recombinante. La
proteína también puede ser un mutante o variante de dichas
proteínas.
Las xilanasas se han utilizado en panadería
durante diversos años.
Entre otras cosas, las xilanasas son capaces de
catalizar la despolimerización del arabinoxilano que puede estar
presente en un cereal (por ejemplo, trigo), por ejemplo una enzima
que, entre otras cosas, es capaz de catalizar la solubilización de
pentosano insoluble en agua (WIP) y catalizar la despolimerización
de pentosano soluble en agua (WSP) que pueden estar presentes en un
cereal (por ejemplo, trigo).
En este sentido, se conoce el hecho de que la
harina de cereal (por ejemplo, harina de trigo) contiene
arabinoxilano que se origina en las paredes celulares del
endospermo. La cantidad de arabinoxilano en la harina varía en
función del origen de dicha harina; por ejemplo, véase Rouau y
otros, Journal of Cereal Science (1994), 19,
259-272 Effect of an Enzyme Preparation
Containing Pentosanases on the Bread-making Quality
of Flour in Relation to Changes in Pentosan Properties; Fincher
y Stone, (1986) Advances in Cereal Technology, Vol. Vlil (Y
Pomeranz, Ed.) AACC, St Paul, Minnesota, 207-295; y
Meuser y Suckow (1986), Chemistry and Physics of Baking (J.
M. V. Blanchard, P J Frasier y T Gillard, Eds.) Royal Society of
Chemistry, Londres, 42-61. Típicamente, la cantidad
de arabinoxilano puede variar de 2 a 5% ((p/p) en base al peso seco
del harina). En J. of Cereal Sci. (1999), 30, 39-43
"Triticum Zestivum Xylanase Inhibitor (TAXI), a new Class of
Enzyme Inhibitor Affecting Breadmaking", Debyser W. y otros
exponen que se puede alcanzar el volumen del pan seleccionando
variedades de trigo que tengan niveles bajos de inhibidor de la
xilanasa o variedades que no contengan inhibidor de la
xilanasa.
Fincher y Stone (1986) recogen que el 70% de los
polisacáridos en la pared celular del endospermo son arabinoxilano.
Una característica del arabinoxilano es su capacidad de enlazar
agua. Parte del arabinoxilano es pentosano insoluble en agua (WIP),
y parte del mismo es pentosano soluble en agua (WSP). Los resultados
experimentales han puesto de manifiesto una correlación entre la
degradación de WIP a polímeros solubles en agua de peso molecular
alto (HMW) y el volumen del pan.
Durante la preparación de un producto de
panadería, se conoce el hecho de que la utilización de una xilanasa
con una dosificación adecuada puede dar lugar a un sistema de masa
más estable (que típicamente comprenderá sal, harina, levadura y
agua) y un mejor volumen, por ejemplo, de pan subido.
En este sentido, una buena xilanasa para
aumentar el volumen del pan debe disolver el WIP, confiriendo una
mayor viscosidad al líquido de masa sin una degradación adicional
del WSP en oligómeros de xilosa. Se cree que esta degradación del
WIP en WSP de peso molecular bajo (LMW) es perjudicial para las
propiedades de la masa y puede dar lugar a pegajosidad (Rouau y
otros y McCleary (1986) International Journal of Biological
Macro Molecules, 8, 349-354).
El documento
US-A-5306633 da a conocer una
xilanasa obtenida a partir de una cepa de Bacillus subtilis.
Aparentemente, esta xilanasa puede mejorar la consistencia y
aumentar el volumen del pan y los productos de panadería que la
contienen.
Se ha aislado y secuenciado otra xilanasa a
partir de Bacillus subtilis (véase Paice, M. G., Bourbonnais,
R., Desrochers, M., Jurasek, L. y Yaguchi, M. A xylanase gene from
Bacillus subtilis: nucleotide sequence and comparison with B.
pumilus gene, Arch. Microbiol. 144, 201-206
(1986)).
Hasta el presente, en el sector de la panadería
se han utilizado típicamente xilanasas fúngicas. Por ejemplo, J
Maat y otros. (Xylans y Xylanases, editado por J. Visser y otros,
349-360, Xylanases and their application in
bakery) dan a conocer una
\beta-1,4-xilanasa producida por
una cepa de Aspergillus niger var. awamori. Según
estos autores, la xilanasa fúngica es efectiva para aumentar el
volumen específico de los panes, sin por ello dar lugar a un efecto
secundario negativo sobre el manejo de la masa (pegajosidad de la
misma), tal como se puede observar en xilanasas derivadas de otras
fuentes fúngicas o bacterianas.
A pesar de los efectos beneficiosos documentados
de las xilanasas, ahora hemos descubierto que se pueden obtener
otros efectos beneficiosos utilizando inhibidores de las
xilanasas.
En la presente invención, el inhibidor es un
inhibidor de la xilanasa que puede reducir o impedir la degradación
enzimática del arabinoxilano presente en la harina de cereal.
A continuación, se describe un ensayo para
determinar la actividad de la
endo-\beta-1,4-xilanasa.
Se diluyen muestras de xilanasa en tampón de
ácido cítrico (0,1 M)-hidrogenofosfato disódico (0,2
M), a pH 5,0, a efectos de obtener aproximadamente una densidad
óptica (OD) = 0,7 en el ensayo final. Tres diluciones de la muestra
y un estándar interno con una actividad definida se mantienen a
temperatura constante durante 5 minutos a 40ºC. Cuando tiempo = 5
minutos, se añade 1 lengüeta de xilazima (substrato de xilano
reticulado teñido) a la solución de enzima. Cuando tiempo = 15
minutos (o en algunos casos mayor, dependiendo de la actividad de
xilanasa presente en la muestra), la reacción se termina añadiendo
10 ml de TRIS 2%. La mezcla de reacción se centrifuga y se mide la
OD del sobrenadante a 590 nm. Teniendo en cuenta las diluciones y la
cantidad de xilanasa, la actividad (TXU, unidades totales de
xilanasa) de la muestra se puede calcular en relación a un
estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha indicado anteriormente, en un
aspecto preferente de la presente invención el agente que puede
reducir o impedir la degradación enzimática del arabinoxilano
presente en la harina de cereal es un inhibidor de la xilanasa.
El inhibidor de la xilanasa puede ser cualquier
inhibidor de la xilanasa adecuado. En una sección posterior se
indica un ensayo adecuado para seleccionar inhibidores de la
xilanasa adecuados.
A título de ejemplo, el inhibidor de la xilanasa
puede ser el inhibidor descrito en el documento
WO-A98/49278 y/o el inhibidor de la xilanasa
descrito en Rouau, X. y Surget, A. (1998), McLauchlan, R., y otros.
(1999) y/o el inhibidor de la xilanasa descrito en la solicitud de
patente UK número 9828599.2 (presentada el 23 de diciembre de
1998), la solicitud de patente UK número 9907805.7 (presentada el 6
de abril de 1999) y la solicitud de patente UK número 9908645.6
(presentada el 15 de abril de 1999).
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan 100 \mul de fracción de inhibidor
candidato, 250 \mul de solución de xilanasa (conteniendo 12 TXU
de xilanasa microbiana/ml) y 650 \mul de tampón (tampón de ácido
cítrico 0,1 M - hidrogenofosfato disódico 0,2 M, pH 5,0). La mezcla
se mantiene a temperatura constante durante 5 minutos a 40,0ºC.
Cuando tiempo = 5 minutos, se añade 1 lengüeta de xilazima. Cuando
tiempo = 15 minutos, la reacción se termina añadiendo 10 ml de TRIS
2%. La mezcla de reacción se centrifuga (3.500 g, 10 minutos,
temperatura ambiente) y se mide el sobrenadante a 590 nm. La
inhibición se calcula como actividad residual comparada con el
blanco. El blanco se prepara del mismo modo, excepto que se
sustituyen los 100 \mul de inhibidor por 100 \mul de tampón
(tampón de ácido cítrico 0,1 M - hidrogenofosfato disódico 0,2 M, pH
5,0).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha indicado, un inhibidor de la
xilanasa que se puede utilizar de acuerdo con la presente invención
es el inhibidor de la xilanasa descrito en la solicitud de patente
UK número 9828599.2 (presentada el 23 de diciembre de 1998), la
solicitud de patente UK número 9907805.7 (presentada el 6 de abril
de 1999) y la solicitud de patente UK número 9908645.6 (presentada
el 15 de abril de 1999).
Este inhibidor endógeno de
endo-\beta-1,4-xilanasa
se puede obtener a partir de harina de trigo. El inhibidor es un
dipéptido con un PM de aproximadamente 40 kDa (medido por SDS o MS)
y con un pl de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9,5.
Hasta ahora, el análisis secuencial ha revelado
que el inhibidor presenta, por lo menos, una o más de las
secuencias indicadas como SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEQ ID No 3, SEC
ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y/o SEC ID nº 7.
De este modo, la presente invención incluye un
inhibidor de
endo-\beta-1,4-xilanasa
que comprende, por lo menos, una o más de las secuencias indicadas
como SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEQ ID No 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº
5, SEC ID nº 6 y/o SEC ID nº 7 o una variante, un homólogo o un
fragmento de las mismas.
Los términos "variante" u "homólogo"
son sinónimos con variaciones alélicas de las secuencias.
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación con el inhibidor según la presente
invención incluyen cualquier sustitución, variación, modificación,
reemplazo, eliminación o adición de uno (o más) aminoácidos de la
secuencia, siempre y cuando la secuencia de aminoácidos resultante
presente acción inhibidora de la xilanasa, preferentemente
presentando, por lo menos, la misma actividad que un inhibidor que
tiene, por lo menos, una o más de las secuencias indicadas como SEC
ID nº 1, SEC ID nº 2, SEQ ID Nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID
nº 6 y/o SEC ID nº 7. Particularmente, el término "homólogo"
incluye homología con respecto a la estructura y/o la función,
siempre y cuando el inhibidor resultante presente acción inhibidora
de la xilanasa, preferentemente presentando, por lo menos, la misma
actividad que un inhibidor que tiene, por lo menos, una o más de
las secuencias indicadas como SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEQ ID Nº 3,
SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 y/o SEC ID nº 7. Con respecto
a la homología de secuencia (es decir, la similitud de secuencia o
identidad de secuencia), preferentemente existe, por lo menos, un
75%, más preferentemente, por lo menos, un 80%, más
preferentemente, por lo menos, un 85%, más preferentemente, por lo
menos, un 90% de homología con respecto a la secuencia mostrada en
las listas de secuencia adjuntas. Más preferentemente, existe, por
lo menos, un 95%, más preferentemente, por lo menos, un 98% de
homología con respecto a la secuencia mostrada en las listas de
secuencia adjuntas.
Particularmente, el término "homología",
tal como se utiliza en el presente documento, se puede igualar al
término "identidad". En este caso, la homología de secuencia
con respecto a la secuencia de nucleótidos de la presente invención
y la secuencia de aminoácidos de la presente invención se puede
determinar mediante una sencilla comparación de "globo ocular"
(es decir, una comparación estricta) de cualquiera una o más de las
secuencias con otra secuencia para comprobar si esa otra secuencia
presenta, por lo menos, un 75% de identidad con respecto a la
secuencia o secuencias. La homología relativa de secuencia (es
decir, la identidad de secuencia) también se puede determinar
mediante programas informáticos comercialmente disponibles, que
pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. Un
ejemplo típico de un programa informático de este tipo es
CLUSTAL.
En consecuencia, las comparaciones de homología
se pueden llevar a cabo a ojo. Sin embargo, más habitualmente se
llevan a cabo con la ayuda de programas de comparación de secuencia
fácilmente disponibles. Estos programas informáticos comercialmente
disponibles pueden calcular el % de homología entre dos o más
secuencias.
El % de homología se puede calcular a lo largo
de secuencias contiguas, es decir, que una secuencia se alinea con
la otra secuencia y cada aminoácido de una secuencia se compara
directamente con el correspondiente aminoácido de la otra
secuencia, residuo a residuo. Esto se designa alineación "sin
huecos". Típicamente, estas alineaciones sin huecos se llevan a
cabo únicamente a lo largo de un número relativamente corto de
residuos (por ejemplo, menos de 50 aminoácidos contiguos).
Aunque esto constituye un método muy sencillo y
consistente, no tiene en cuenta, por ejemplo, que en un par de
secuencias, por lo demás idénticas, una inserción o eliminación
provocará que los siguientes residuos aminoácidos estén
desalineados, lo que potencialmente dará lugar a una gran reducción
en el % de homología cuando se lleva a cabo una alineación global.
En consecuencia, muchos métodos de comparación secuencial se diseñan
para que realicen alineaciones óptimas que toman en consideración
posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar por ello
indebidamente el índice de homología global. Esto se consigue
insertando "huecos" en la alineación de secuencia a efectos de
intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan
"penalizaciones de hueco" a cada hueco que aparece en la
alineación, de tal modo que, por ejemplo, para el mismo número de
aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con tan pocos
huecos como sea posible -que refleja una mayor relación entre las
dos secuencias comparadas- alcanzará una puntuación más alta que
otra con muchos huecos. Se utilizan típicamente "costes de huecos
afines", que cargan un coste relativamente elevado por la
existencia de un hueco y una penalización menor para cada residuo
posterior del hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más
comúnmente utilizado. Evidentemente, penalizaciones elevadas de
hueco producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La
mayoría de programas de alineación permite modificar las
penalizaciones de hueco. Sin embargo, resulta preferente utilizar
los valores por defecto cuando se utiliza software de este tipo para
la comparación de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el
paquete GCG Wisconsin Bestfit (véase a continuación), la
penalización de hueco por defecto para las secuencias de
aminoácidos es de -12 para un hueco y de -4 para cada extensión.
En consecuencia, el cálculo del % máximo de
homología requiere en primer lugar la realización de una alineación
óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones de hueco. Un programa
informático adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el
paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.;
Devereux y otros, 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Otros
ejemplos de software que puede llevar a cabo comparaciones de
secuencias incluyen, sin limitarse a los mismos, el paquete BLAST
(véase Ausubel y otros., 1999 ibid, capítulo 18), FASTA
(Atschul y otros., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y
el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparación. BLAST y FASTA
están disponibles para una búsqueda offline y online (véase Ausubel
y otros., 1999 ibid, páginas 7-58 a
7-60). Sin embargo, resulta preferente utilizar el
programa GCG Besffit.
Aunque el % final de homología se puede medir en
términos de identidad, el proceso de alineación en sí mismo
típicamente no se basa en una comparación por pares de "todo o
nada". En lugar de ello, generalmente se utiliza una escala de
matriz de puntuación de similitud que asigna puntuaciones a cada
comparación por pares en base a la similitud química o a la
distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo
comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62 -matriz por defecto para
el conjunto de programas BLAST-. Generalmente, los programas GCG
Wisconsin utilizan los valores por defecto públicos o una tabla de
comparación simbólica a medida si la misma se suministra (véase
manual del usuario para más detalles). Resulta preferente utilizar
los valores por defecto públicos para el paquete GCG o, en el caso
de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez que el software ha producido una
alineación óptima, es posible calcular el % de homología,
preferentemente el % de identidad de secuencia. Típicamente, el
software lleva esto a cabo como parte de la comparación de
secuencia y genera un resultado numérico.
Preferentemente, las comparaciones secuenciales
se llevan a cabo utilizando el sencillo algoritmo de búsqueda BLAST
disponible en http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST, que utiliza
los parámetros por defecto.
La presente invención también incluye fragmentos
de la secuencia de aminoácidos presentada y variantes de la misma
presentes en el presente documento. Los fragmentos adecuados tendrán
un tamaño, por lo menos, de 5 aminoácidos, por ejemplo, por lo
menos, de 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos.
Las secuencias presentadas en el presente
documento también se pueden modificar a efectos de que contengan
una o más (por ejemplo, por lo menos, 2, 3, 5 ó 10) sustituciones,
eliminaciones o inserciones, incluyendo sustituciones
conservadas.
Las sustituciones conservadas se pueden realizar
de acuerdo con la siguiente tabla, que indica sustituciones
conservativas, en las que aminoácidos del mismo bloque en la segunda
columna y, preferentemente, en la misma línea de la tercera
columna, se pueden sustituir entre sí:
Se puede preparar un alimento (particularmente
un producto de panadería) a partir de masa refrigerada. Los típicos
productos de panadería (horneados) de acuerdo con la presente
invención incluyen pan (tal como hogazas, panecillos, bollitos,
bases de pizza, etc.), bretzels, tortillas, pasteles, galletas,
pastas, galletas saladas, etc.
A continuación se describe la presente
invención, únicamente a título de ejemplo, y haciendo referencia
a:
la figura 1 - que muestra un gráfico; y
la figura 2 - que ilustra masas.
Mas detalladamente:
La figura 1 es un gráfico que muestra el aumento
de OD en el ensayo de xilanasa en función del extracto xilanolítico
endógeno de trigo añadido; y
La figura 2 ilustra cuatro masas preparadas
según el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se extrajeron 2 kg de harina de trigo (reforma
danesa, lote 99056) con agua, utilizando una relación harina:agua
de 1:2, durante 10 minutos de agitación. El inhibidor de la xilanasa
endógeno soluble se separó de la suspensión
harina-agua por centrifugación. La extracción y
centrifugación se llevaron a cabo a 4ºC. El inhibidor se purificó a
partir del extracto de agua mediante las siguientes técnicas
cromatográficas y de concentración: HPLC-SEC,
HPLC-CIEC, evaporación rotativa,
HPLC-HIC, HPLC-SEC y evaporación
rotativa. El inhibidor de la xilanasa se pudo controlar durante la
purificación utilizando el ensayo de inhibidor de la xilanasa
descrito anteriormente. Para determinar la cantidad de inhibidor
obtenida, se utilizó el siguiente método de cuantificación de
inhibidor.
Se define 1 XIU (unidad de inhibidor de la
xilanasa) como la cantidad de inhibidor que hace disminuir 1 TXU a
0,5 TXU en las condiciones descritas a continuación.
250 \mul de solución de xilanasa que contiene
12 TXU/ml, aproximadamente 100 \mul de solución de inhibidor de
la xilanasa y tampón de ácido cítrico (0,1
M)-hidrogenofosfato disódico (0,2 M), a pH 5,0, para
hacer reaccionar un volumen de reacción de 1.000 \mul, se
preincuban durante 5 minutos a 40ºC. Cuando t = 5 minutos, se añade
un comprimido de 1 xilazima (Megazyme, Irlanda) a la mezcla de
reacción. Cuando t = 15 minutos, la reacción se termina añadiendo
10 ml de TRIS/NaOH 2%, pH 12. La solución se filtra y se mide la
absorbancia del sobrenadante a 590 nm. Seleccionando diversas
concentraciones diferentes de inhibidor en el ensayo anterior es
posible generar un gráfico de OD frente a la concentración de
inhibidor. Utilizando el pendiente (a) y la intersección (b) de
dicho gráfico, y la con-
centración de xilanasa, es posible calcular la cantidad de XIU en una determinada solución de inhibidor (ecuación 1).
centración de xilanasa, es posible calcular la cantidad de XIU en una determinada solución de inhibidor (ecuación 1).
Ecuación
1((b/2)/-a)/TXU en
ensayo
A partir de la purificación de inhibidor de la
xilanasa endógeno, se recuperó el siguiente rendimiento de
inhibidor (tabla 1). La muestra de inhibidor era pura y libre de
actividades xilanolíticas endógenas de trigo.
Ejemplo
2
Se extrajeron 5 g de harina (lote 99056 que
contiene 590 XIU/g) con 15 ml de agua fría durante 10 minutos con
agitación. Las enzimas xilanolíticas solubles se separaron de la
suspensión de harina-agua por centrifugación (10
minutos, 4ºC, 10.000 g). El sobrenadante contenía las enzimas
xilanolíticas extraíbles. Se obtuvieron 12 ml de extracto
xilanolítico.
Una cantidad diferente del extracto xilanolítico
se incubó con substrato de xilazima (Megazyme, Irlanda) con y sin
inhibidor de la xilanasa endógeno de trigo purificado adicional.
Véanse las condiciones experimentales detalladas a continuación
(tabla 2). El inhibidor purificado contenía 1.200 XIU/ml. En todos
los ensayos, el volumen de reacción de 1.000 \mul se alcanzó
añadiendo tampón de ácido cítrico (0,1
M)-hidrogenofosfato disódico (0,2 M), a pH 5,0. La
incubación se terminó mediante la adición de 5 ml de TRIS/NaOH 2%,
pH 12, tras 6 horas y 30 minutos.
El inhibidor de la xilanasa endógeno de trigo
purificado puede inhibir las enzimas xilanolíticas extraíbles de
trigo con mucha eficacia. Las enzimas xilanolíticas extraídas pueden
producir un aumento lineal de la OD en el ensayo (véase figura
1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se preparan masas utilizando la siguiente receta
(tabla 3) y harina 2000063.
\vskip1.000000\baselineskip
El mezclado de las masas anteriores dio lugar a
los siguientes datos de mezclado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las masas anteriores (tabla 3) se prepararon
mezclando durante 5 minutos en un mezclador farinógrafo.
Las masas se mantuvieron en un recipiente
cerrado herméticamente (se aplicó atmósfera de CO_{2}) durante 10
días a 10ºC. Las masas se evaluaron visualmente en el día 0 y en el
día 10. En la tabla 5, se indican los resultados. Además, los
resultados también se visualizan en la figura 2. La figura 2 muestra
claramente que el jarabe marronoso está ausente en la masa que
contiene 10 veces la cantidad de inhibidor de la xilanasa, y sólo
estará ligeramente presente en la masa que contiene 2 veces la
cantidad de inhibidor de la xilanasa, en comparación con las masas
A y D.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
CADENA A de inhibidor
Fuente de la secuencia: inhibidor de la xilanasa
de harina de trigo
\vskip1.000000\baselineskip
N-terminal:
GAPVARAVEAVAPFGVCYDTKTLGNNLGGYAVPNV (35aa) SEC
ID nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
C-terminal:
KRLGFSRLPHFTGCGGL (17aa) SEC ID nº 2
CADENA B de inhibidor
Fuente de la secuencia: inhibidor de la xilanasa
de harina de trigo
\vskip1.000000\baselineskip
N-terminal:
LPVPAPVTKDPATSLYTIPFH (21aa) SEC ID nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
Cadena B digerida con Lys-C:
LLASLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQK (31aa) SEC ID nº
4
GGSPAHYISARFIEVGDTRVPSVE (24aa) SEC ID nº 5
VNVGVLAACAPSK (13aa) SEC ID nº 6
VANRFLLCLPTGGPGVAIFGGGPVPWPQFTQSMPYTLVVVK SEC ID
nº 7
Claims (4)
1. Procedimiento para preparar una masa
refrigerada, comprendiendo el procedimiento el mezclado de harina de
cereal y agua con una proteína que reduce o impide la degradación
enzimática del arabinoxilano presente en la harina de cereal,
siendo dicha proteína un inhibidor de la xilanasa.
2. Procedimiento para preparar una masa
refrigerada, comprendiendo dicho procedimiento el mezclado de harina
de cereal y agua con una proteína que tiene un efecto inhibidor,
por lo menos, sobre una enzima que tiene un efecto muy negativo
sobre el arabinoxilano, siendo dicha proteína un inhibidor de la
xilanasa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho inhibidor de la xilanasa es un
inhibidor de la xilanasa endógeno del cereal.
4. Utilización de un inhibidor de la xilanasa
endógeno de cereal en una masa refrigerada para impedir que adquiera
aspecto de jarabe.
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