WO2020118465A1 - Polipéptido con actividad xilanasa, secuencia nucleotídica que lo codifica, ingrediente y proceso que comprende dicho ingrediente para la preparación de un producto alimenticio - Google Patents

Polipéptido con actividad xilanasa, secuencia nucleotídica que lo codifica, ingrediente y proceso que comprende dicho ingrediente para la preparación de un producto alimenticio Download PDF

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WO2020118465A1
WO2020118465A1 PCT/CL2019/050138 CL2019050138W WO2020118465A1 WO 2020118465 A1 WO2020118465 A1 WO 2020118465A1 CL 2019050138 W CL2019050138 W CL 2019050138W WO 2020118465 A1 WO2020118465 A1 WO 2020118465A1
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enzyme
amino acid
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Renato Antonio CHÁVEZ ROSALES
Carlos GIL DURÁN
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Universidad De Santiago De Chile
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Definitions

  • the present invention is related to the technical field of biotechnology, particularly with a new polypeptide with xylanase activity, the nucleotide sequence that encodes it, an ingredient that contains said polypeptide, and a process for the preparation of a food product that comprises adding said ingredient to the preparation.
  • Xylanases are a class of enzymes that degrade linear xylan polysaccharides into xylose by catalyzing the hydrolysis of the b- (1, 4) glycosidic bond.
  • bh ⁇ o-b- (1, 4) -D-xylanases commonly called endoxylanases
  • endoxylanases that catalyze the hydrolysis of the internal glycosidic bond b- (1, 4) of the xylan chain of xyloses, generating low molecular weight xylooligosaccharides (XOS) with or without branches
  • GH glycoside hydrolase
  • endoxylanases are classified in the GH10 and GH1 families 1.
  • the GH10 family xylanases are approximately 35kDa in size, and are capable of hydrolyzing glycosidic bonds near branch points and towards the non-reducing end, while GH1 family xylanases are not capable of hydrolyzing said glycosidic bonds and they have a size of approximately 20kDa (Cooper Bribiesca, BL Bacterial xylanolytic enzymes and their industrial applications. VERTIENTES Specialized Journal of Health Sciences. 2013. Vol. 16 (1): 19-22).
  • Endoxylanases are of great interest in the food industry. For example, they are widely used in the wine industry, in the manufacture of beer, in the clarification process of fruit juice, in the extraction of starch, coffee and vegetable oils, improvement of nutritional properties of silages and grains, and in processes of the baking industry. In particular for this last mentioned industry, endoxylanases allow to improve a series of characteristics in bakery products, such as the properties of the dough and the volume of the bread. When these enzymes are added during kneading, the viscoelastic characteristics of the dough are modified, the absorption of water, the development time of the dough and its stability decrease.
  • bread and derived products have better characteristics such as crumb volume, firmness and structure (Elgharbi, F., Hmida-Sayari, A., Zaafouri, Y., & Bejar, S. Expression of an Aspergillus niger xylanase in yeast: Application in breadmaking and in vitro digestion. International Journal of Biological Macromolecules. 2015. Vol. 79: 103-109).
  • patent document US 2015/0291945 A1 refers to an endo-1, 4-xylanase from the fungus Macrophomina phaseolina in which it teaches a series of nucleotide sequences that encode said enzyme. He mentions that these enzymes can be used in the food industry, for the manufacture of animal feed, in the production of pulp and paper, and in the cleaning agent industry, however, he does not show concrete examples of the improvement in their capacity. hydrolytic.
  • US patent document 9,732,366 B2 discloses a high temperature thermostable GH10 family xylanase having a catalytic domain containing (A) a polypeptide including a particular amino acid sequence, and (B) a polypeptide including a amino acid sequence in which at least one amino acid has been removed, substituted or added in said particular sequence, or (C) an amino acid sequence having at least 80% or more sequence identity with said particular sequence.
  • the advantage of xylanase disclosed in US 9,732,366 B2 is that it has activity under conditions of 85 Q C, and pH 6.0, however, it does not mention or exemplify advantages of said enzyme for the food production industry.
  • Patent document US 2016/0345609 A1 refers to a modified GH10 family xylanase or a fragment thereof with xylanase activity, where said mutant has greater thermostability at high temperatures compared to the native enzyme. The modifications correspond to point mutations in certain positions of the amino acid sequence, which give them stability at temperatures close to 75 Q C.
  • patent document WO 2015/1 141 10 A1 discloses synthetic xylanases belonging to the GH10 family. that solubilize insoluble arabinoxylans, particularly from substrates such as corn, wheat, DDGS, etc. This document also focuses on obtaining thermostable xylanases at high temperatures, demonstrating that it is still active in temperature ranges between 61 -71 Q C.
  • thermostability of xylanase at very high temperatures can be considered as an advantageous characteristic in certain chemical processes, it is completely irrelevant for food production processes and in particular for baking, whose fermentation process is carried out at a Approximate temperature of 30 Q C. In this sense, it is more relevant to obtain xylanases whose maximum activity is in a temperature range close to those 30 Q C and which also provide specific advantages for food manufacturing processes.
  • a first object of the present invention is a polypeptide for preparing a food product, which has xylanase activity and comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of: the amino acid sequence of SEQ ID No. 1; and an amino acid sequence that is at least 80% similar to the sequence of SEQ ID No. 1 and that maintains its xylanase activity.
  • Said polypeptide is encoded by a nucleotide sequence that is selected from the group consisting of: the nucleotide sequence of SEQ ID No. 3; and a nucleotide sequence having at least 80% identity with the sequence of SEQ ID No. 3.
  • a second object of the present invention is a nucleotide sequence encoding a polypeptide having xylanase activity to prepare a food product, wherein said sequence is selected from the group consisting of: the nucleotide sequence of SEQ ID No. 3; and a nucleotide sequence having at least 80% identity with the sequence of SEQ ID No. 3.
  • a third object of the present invention is an ingredient for preparing a food product containing a polypeptide having xylanase activity, the amino acid sequence of which is selected from the group consisting of: the amino acid sequence of SEQ ID No. 1; and an amino acid sequence that is at least 80% similar to the sequence of SEQ ID No. 1 and that maintains its xylanase activity.
  • a fourth object of the present invention is a process for preparing a food product, comprising the steps of: providing an ingredient containing a polypeptide having xylanase activity whose amino acid sequence is selected from the group consisting of:
  • the flour that is used in the process to prepare a food product is selected from the group consisting of wheat flour, cassava flour, flour of barley, rice flour, rye flour, corn flour, quinoa flour, and buckwheat flour.
  • the liquid that is used to prepare a food product is selected from the group consisting of water, aqueous saline solutions, milk and infusions.
  • the food product obtained from the process described in the present invention is bread.
  • FIG. 1 shows a schematic of the three-dimensional structure of the native enzyme with xylanase activity (XynA) derived from a strain of Cladosporium sp.
  • FIG. 2 shows a schematic of the three-dimensional structure of the modified enzyme with xylanase activity (XynAA29N) of SEQ ID No. 1.
  • FIG. 3 shows a polyacrylamide gel electrophoresis under denaturating conditions of the purified recombinant enzymes.
  • the protein migration profile is shown along with the standard.
  • B Lane 1. PageRuler TM Prestained Protein Ladder 10-180 kDA (Thermo Scientific TM) with their molecular masses (on the left).
  • FIG. 4 shows a graph with the results on the effect of pH on the activity of enzymes.
  • XynA dotted line
  • XynAA29N solid line
  • FIG. 5 shows a graph with the results on the specific activity profile of XynA (dotted line) and XynAA29N (solid line) at different temperatures. The tests were carried out in triplicate. The bars corresponding to the standard deviation were very small, so they cannot be seen in the figure.
  • FIG. 6 shows a graph with the results of XynA thermal stability kinetics. The enzyme was pre-incubated at temperatures between 5 and 40 ° C. The residual enzyme activity was then measured. Enzymatic activity was expressed as a percentage, 100% being the reaction at time 0 (without pre-incubation). The measurements were made in triplicate and the bars correspond to the standard deviation.
  • FIG. 7 shows a graph with the results of the thermal stability determination of XynAA29N.
  • the enzyme was pre-incubated at temperatures between 5 and 70 ° C. The residual enzyme activity was then measured. The enzymatic activity was expressed as a percentage, with the reaction being 100% at time 0 (without pre-incubation). The measurements were made in triplicate and the bars correspond to the standard deviation.
  • FIG. 8 shows a graph with the activity of the enzymes on different substrates.
  • the bars correspond to XynA (black color) and XynAA29N (gray color). The measurements were made in triplicate and the bars correspond to the standard deviation.
  • FIG. 9 shows the result of a thin layer chromatography of the hydrolysis products obtained by the action of XynA on xylan.
  • Lanes 1 and 4 standard, xylooligosaccharide mixture (X1: xylose, X2: xylobiose, X3: xylotriose and X4: xylotetraose); lane 2, rye arabinoxylan; lane 3, rye arabinoxylan plus XynA; lane 5, wheat arabinoxylan; lane 6, wheat arabinoxylan plus XynA; lane 7, oat arabinoxylan; lane 8, arabinoxylan oats plus XynA; lane 9, beech xylan; lane 10, beech xylan plus XynA; lane 1 1, birch xylan and lane 12, birch xylan plus XynA. Incubation conditions were for 20 min at 50 Q C.
  • FIG. 10 shows the result of a thin layer chromatography of the xylan hydrolysis products by XynAA29N.
  • Lanes 1 and 4 standard, xylooligosaccharide mixture (X1: xylose, X2: xylobiose, X3: xylotriose and X4: xylotetraose); lane 2, rye arabinoxylan; lane 3, rye arabinoxylan plus XynA; lane 5, wheat arabinoxylan; lane 6, wheat arabinoxylan plus XynA; lane 7, oat xylan; lane 8, oat xylan plus XynA; lane 9, beech xylan; lane 10, beech xylan plus XynA; lane 1 1, birch xylan; lane 12, birch xylan more XynA.
  • the incubation conditions were for 20 min at 50 Q C. In the black
  • FIG. 1 1 shows the result of a thin layer chromatography of the hydrolysis products using xylooligosaccharides as substrate.
  • Lane 1 xylobiose; lane 2, xylobiose plus XynA; lane 3, xylobiose plus XynAA29N; lane 4, xilotriose; lane 5, xilotriose plus XynA; lane 6, xilotriose plus XynAA29N; lane 7, xylotetraose; lane 8, xylotetraose plus XynA; lane 9, xylotetraose plus XynAA29N; lane 10, mixture of xylooligosaccharides (X1: xylose, X2: xylobiose, X3: xylotriose and X4: xylotetraose). Incubation conditions were for 20 min
  • FIG. 12 shows photographs of elaborate breads.
  • A Bread without enzyme.
  • B Bread made with commercial enzyme
  • C Bread made with addition of XynA.
  • D Bread made with the addition of XynAA29N.
  • the present invention relates to a new polypeptide with xylanase activity, specifically suitable for improving products derived from the food industry, preferably for the bakery industry.
  • This new polypeptide By adding this new polypeptide to the mixtures to generate food products derived from the bakery industry, it allows them to have a better elasticity and less toughness, and to obtain a higher volume final product, compared to polypeptides with xylanase activity currently available on the market. .
  • nucleotide sequence or “nucleotide sequence” should be understood as meaning a double strand of DNA, or a single strand of DNA, natural or synthetic, or products of the transcription of said DNA (for example, RNA molecules) . It should be understood that the present invention does not relate to genomic nucleotide sequences in their natural state, but rather refers to sequences of nucleotides in an isolated, or purified, or partially purified, or recombinant state, obtained by any genetic engineering method known in the state of the art.
  • amino acid sequence or "polypeptide” is to be understood as meaning a natural or synthetic amino acid sequence, or RNA translation products. When these polypeptides have a stable and three-dimensional structure, they are called proteins. It should be understood that the present invention does not relate to amino acid sequences in their natural state, but rather refers to amino acid sequences or polypeptides in an isolated, or purified, or partially purified, or recombinant state, obtained by any engineering method genetics known in the state of the art.
  • enzyme should be understood as a polypeptide that acts as a biological catalyst that accelerates chemical reactions that would otherwise occur but at very low speeds. Enzymes convert substrates into different molecules called products. These enzymes have specific affinities to their substrates according to their three-dimensional structure. The biological activity of these molecules is sensitive to the conditions of the medium, such as pH and temperature, or even other molecules that can increase or inhibit their activity.
  • xylanase activity should be understood as the enzymatic activity that a polypeptide that produces the xylan hydrolysis performs, when this molecule is the substrate.
  • recombinant is understood to mean any nucleotide (DNA, RNA) or amino acid sequence modified by any genetic engineering method known in the state of the art, which results in a new nucleotide or amino acid sequence different from the one it is found in nature.
  • identity between nucleotide sequences is to be understood as the percentage of identical nucleotides that the compared sequences share with each other, in a particular window of comparison.
  • the percent identity can be calculated using a sequence comparison algorithm or by manual alignment and visual inspection.
  • identity sequences and percentages can be obtained using computing resources available at Internet such as the BLAST computer program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) or the FastDB computer program.
  • Sequence identity can also be determined by hybridization assays thereof. The greater the degrees of hybridization stringency used in the assay, the greater the complementarity of the sequences required for them to hybridize. High astringency conditions are described by Sambrook et al.
  • amino acids of conserved coincidence correspond to those amino acids that belong to the same classification according to their physicochemical characteristics of their side chain (R), and that can be amino acids with polar R groups but not charged (Ser, Thr, Asn, Gln) , with positively charged R groups (Lys, Arg, His), negatively charged R groups (Glu, Asp), hydrophobic R groups (Ala, lie, Leu, Met, Phe, Trp, Val, Tyr), or special amino acids (Cys , Gly, Pro).
  • R side chain
  • a first object of the present application corresponds to a modified polypeptide or enzyme with xylanase activity, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID No. 1.
  • This corresponds to an amino acid sequence modified from a native enzyme with xylanase activity (SEQ ID No. 2, GenBank access code MG007677), which was isolated from the fungus Cladosporium sp., Obtained from Antarctic marine sponges (Henr ⁇ quez M , etal. Diversity of cultivable fung ⁇ associated with Antarctic marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World J Microbio! Biotechnol. 2014. Vol. 30 (1): 65-76).
  • the modification of the native enzyme was carried out using genetic engineering techniques known in the state of the art. To this enzyme, 29 amino acid residues were removed from the N-terminus (amino terminus), which gives a surprising advantage to the enzyme with xylanase activity claimed in the present invention compared to the native enzyme, significantly improving its activity on various substrates, at different temperatures and pHs.
  • the xylanase-modified polypeptide of the present invention has a specific activity over a wide pH range, its activity being stable and optimal between pH 5 to 8.
  • the polypeptide of the present invention has a specific activity in a optimum temperature range for processes in the food industry, in a range between 30 and 50 Q C.
  • the enzyme maintains a stable maximum activity, unlike other enzymes described in the state of the art which usually have a maximum peak of activity at a particular temperature and then decay rapidly at temperatures close to that maximum, so the temperature range is limited.
  • This maximum activity in this temperature range is particularly desired for baking processes, the enzyme being active during the kneading stage until the beginning of the cooking stage.
  • any xylanase enzyme that has 29 + 10 amino acids removed from its amino terminus is within the scope of the present invention, without that approximate value being a limitation of the scope of the present invention.
  • the xylanase-active polypeptide is capable of degrading the b- (1,4) -xilane polysaccharides into xylose.
  • Said polypeptide preferably has an endo- - (1, 4) -D-xylanase activity, which catalyzes the hydrolysis of the internal glycosidic bond b- (1, 4) of the xylan chain of xyloses.
  • the present enzyme with xylanase activity can hydrolyze other substrates such as, xylooligosaccharides (xylotriose, xylotetraose), p-nitrophenyl bd-xylopyranoside (pNPX), p-nitrophenyl bD-glucopyranoside (pNPG), p-nitrophenyl-a-l-a , p-nitrophenyl-aL-arabinopyranoside, p-nitrophenyl ⁇ -L-arabinopyranoside, p-nitrophenyl-b- D-mannopyranoside, p-nitrophenyl-aD-galactopyranoside, p-nitrophenyl ⁇ -D- galactopyranoside, glucans composed of b-1, 3, b-1, 4 and b-1, 6 linkages, oligosaccharides composed of b-1, 4 and b-1, 6 link
  • any amino acid sequence of the new polypeptide with xylanase activity that contains at least 80% similarity with the sequence described in SEQ ID No. 1, preferably 90% similarity, is also within the scope of the present invention. More preferably 95% similarity, provided that any of the variants maintain their advantageous xylanase activity.
  • Any person with knowledge of the state of the art will recognize that certain amino acids share their physicochemical characteristics depending on their side chain, so the modification of some or some of the amino acids of SEQ ID No. 1 will be irrelevant and will not change the activity. biological of said enzyme, therefore said variants are also the object of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by any biotechnological technique known in the state of the art for this purpose.
  • the present polypeptide can be obtained by recombinant DNA techniques, expressing a polynucleotide that encodes said polypeptide in a suitable expression vector, which is introduced into an appropriate organism for the production of said polypeptide.
  • the production of the polypeptide can be carried out in bioreactors to obtain it on a large scale.
  • a second object of the present invention is a nucleotide sequence encoding the xylanase-active polypeptide previously described, and shown in SEQ ID No. 3.
  • This nucleotide sequence was modified from the nucleotide sequence encoding the native polypeptide with xylanase activity (SEQ ID No. 4, GenBank access code MG007677), which was isolated from the fungus Cladosporium sp., obtained from Antarctic marine sponges (Henr ⁇ quez M, et al. Diversity of cultivable fungi associated with Antarctic marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World J Microbiol Biotechnol. 2014. Vol. 30 (1): 65-76).
  • nucleotide sequence encoding a xylanase-active polypeptide having, for example, 29 + 5 amino acids removed from its amino-terminal end is within the scope of the present invention, without that approximate value limiting the scope of the present invention.
  • the present invention also considers any variant of said nucleotide sequence that contains at least 80% identity with the sequence described in SEQ ID No. 3, preferably 90% identity, more preferably 95% identity, as long as any of the variants maintain the ability to encode a polypeptide that maintains its xylanase activity.
  • any person with knowledge of the state of the art will recognize that the genetic code is degenerate, and as such the nucleotide sequence can have different codons that encode the same amino acid. Consequently, certain changes in the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 may be irrelevant and will not change the biological activity of the enzyme that is encoded by said sequence.
  • a third object of the present invention is an ingredient for preparing a food product containing the polypeptide having xylanase activity, the amino acid sequence of which is selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID No. 1; and an amino acid sequence that is at least 80% similar to the sequence of SEQ ID No. 1 and that maintains its xylanase activity.
  • Said ingredient that contains the polypeptide is useful to improve the organoleptic characteristics of the final food products and / or improve the characteristics of these during their manufacturing process.
  • the present enzyme when added during the baking process, it allows the dough to have a greater elasticity, less tenacity, greater formation of the gluten network is observed with less water, less kneading time, and greater volume of the Final product.
  • the present enzyme can also be used in the beverage production industry to improve the properties of juices, wines and beers.
  • the xylanase of the present invention allows increase the yield of obtaining fruit juices when added to the manufacturing process during the maceration process of said fruits.
  • the present enzyme improves the clarity of juices, wines and beers, and reduces turbidity, highly desired characteristics in these products.
  • composition of this ingredient in addition to the xylanase-active polypeptide, may optionally contain excipients suitable for subsequent use in the food industry.
  • excipients can be stabilizers (eg salts, inert proteins, carbohydrates), preservatives, solvents, diluents, coated, among others, that allow the stability of the polypeptide to be maintained over time, increase its half-life on the market, avoid its agglomeration, etc.
  • the ingredient can be in a liquid or solid formulation. It can be formulated as a solution with the polypeptide in suspension, or in powder, for example, lyophilized.
  • a fourth object of the present invention is a process for preparing a food product, comprising the steps of: providing an ingredient containing a polypeptide having xylanase activity whose amino acid sequence is selected from the group consisting of:
  • the flour used in the process to prepare a food product is any fine powder obtained from cereals or ground grains or other starch-rich foods.
  • the flour used can be wheat flour, cassava flour, barley flour, rice flour, rye flour, corn flour, quinoa flour and buckwheat flour.
  • the liquid that is used to prepare a food product is selected from the group consisting of water, saline solutions, milk and infusions, but any other liquid approved for human consumption can also be used.
  • Other appropriate ingredients such as vegetable or animal fat (oils, butters, margarines, butters, etc.), flavorings (salts, sugars, spices, etc.), yeast, baking powder (mixed citric or tartaric acid) can optionally be added with sodium carbonate or bicarbonate), sodium bicarbonate, grains and seeds (flaxseed, chia, poppy seeds, pumpkin seeds, oats, sesame, etc.), nuts (almonds, walnuts, peanuts, raisins, etc.) , fresh or dehydrated fruits and vegetables, eggs and other proteins, among others.
  • the kneading of the mixture can be done manually or mechanically, with kneading machines.
  • a step of rest of the dough can be optionally added prior to cooking it.
  • the cooking of the dough that is used in the baking process described in the present invention is preferably baking.
  • any other known cooking method such as stir fry, fried, steamed, etc. can be used.
  • the food product obtained from the process described in the present invention is bread.
  • Said bread can be of any type and must be understood in its broadest meaning, such as any derivative of a dough whose minimum ingredients are flour and a liquid. Includes sweet or savory, white, whole grain breads of any shape and cooking.
  • the present invention is not limited to these, being possible to use the enzyme in tortilla preparations, or doughs with spongy textures, such as cookies, muffins, donuts, kuchen, cakes, cakes, etc.
  • Example 1 Isolation of the nucleotide sequence encoding the xylanase-active polypeptide from Cladosporium sp.
  • RNA extraction was performed with the RNeasy Plant Mini kit (Qiagen ® ) according to the manufacturer's instructions. The RNA obtained was quantified and treated with DNase I-RNase-free, for which the manufacturer's instructions were followed. RNA was stored at -80 ° C until use.
  • RT-PCR was performed to obtain the native xylanase gene.
  • the reverse transcriptase reaction was performed using the RevertAid Reverse Transcriptase enzyme (Thermo Scientific TM) and oligo (dT) 20 was used to obtain cDNA.
  • a PCR was performed using recombinant Taq polymerase (Invitrogen), where the oligonucleotides used for said PCR were Picz-Xyl-Ecorl-Fw (SEQ ID No. 5) and Picz-Xyl-Sacll-Rv (SEQ ID No. 6 ). PCR products were visualized by electrophoresis, purified, and cloned into pGEM ® -T Easy (Promega ® ) for sequencing.
  • the nucleotide sequence of the native xylanase was obtained (XynA SEQ ID No. 4).
  • the three-dimensional structure of the polypeptide sequence encoded by SEQ ID No. 4 is shown in FIG 1, which was modeled by the Modeller ® program. This scheme was obtained by XynA homology. In the central part are the glutamate residues that possibly carry out the catalytic activity. Note that the amino terminal end is not modeled by the Modeller ® program.
  • PDB Protein Data Bank
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence encoding the modified xylanase of SEQ ID NO: 1.
  • RNA Cloning of the cDNA obtained from RNA was performed by reverse transcription according to what was previously described, and subsequently amplified by PCR, using the Picz-Xyl-Ecorl-Fw (SEQ ID No. 5) and Picz- oligonucleotides.
  • Xyl-Sacll-Rv (SEQ ID No. 6) for cDNA-XynA (native xylanase) and oligonucleotides Picz-xylA29N-Ecorl fw (SEQ ID No. 7) and Picz-Xyl-Sacll-Rv (SEQ ID No. 6) for cDNA-XynA29N (modified xylanase).
  • Digestion of the vector pPICZa obtained from the EasySelect TM Pichia Expression kit, Invitrogen TM
  • the cDNAs cDNA-XynA and cDNA-XynA29N
  • EcoRI and Sacll Digestions were carried out separately.
  • the Sacll enzyme in a final volume of 20 pL, 2 pL of 10X tango buffer, 2 pL of enzyme (20 Units), 4 pL of DNA at a concentration of 1 pg / pL and 12 pL of water were added. The digestion was incubated for 2 hours at 37 ° C, then the fragments were purified. Subsequently, the digestion was carried out with the EcoRI enzyme.
  • the buffer used was buffer O.
  • the digested plasmid pPICZa was dephosphorylated, using Antarctic alkaline phosphatase. This reaction was performed in conjunction with the final digestion with EcoRI, adding 1 ml of the Antarctic alkaline phosphatase (10 Units) and 2 ml of the buffer. Finally, all the products were purified.
  • the fragments obtained after double digestion were ligated to pPICZa (EasySelect TM Pichia Expression Kit, Invitrogen TM).
  • a vector: insert ratio of 1: 3 in 10 pL was used as the final volume.
  • 1 ⁇ L of the buffer “10X ligation buffer”, 2 ⁇ L of T4 ligase (5 U / pL), 1 pL of vector pPICZa (50 ng / pL), 3 pL of the digested PCR products were added to a concentration of 150 ng / pL, and 4 pL of MiliQ water.
  • the reaction was incubated for 16 hours at 15 ° C.
  • the bacterial transformation was carried out.
  • the transformants were seeded in LB agar medium with low salt pH 7.5, supplemented with Zeocin 0.1 mg / mL.
  • the presence of the insert was verified in the colonies obtained after transformation by PCR using the oligonucleotides Xyl RT Fw (SEQ ID No. 5) and Xyl RT Rv (SEQ ID No. 6).
  • Positive transformants were cultured in LB liquid medium with low salt pH 7.5, for subsequent extraction of the plasmid.
  • Each clone was seeded in 20 mL of BMGY medium in 250 mL flasks, and incubated for 1 day at 28 ° C and 200 rpm. Then, the culture was centrifuged 2400 g for 5 minutes at room temperature, and the cells were resuspended in 50 mL of BMMY, to induce the expression of the gene of interest with methanol for 8 days. Each day a 1 mL aliquot of the culture supernatant was taken to assay xylanase activity as described below.
  • Reducing sugars were detected for the measurement of xylanolytic activity by the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay (Bailey, MJ, Biely, P., & Poutanen, K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology 1992. Vol. 23 (3): 257-270).
  • DNS 3,5-dinitrosalicylic acid
  • 450 pL of a 1% beech xylan solution (substrate) were pre-incubated in 50 mM citrate buffer pH 5.3 for 10 min at 50 Q C. Then, 50 pL of the samples were added, and incubated by 10 minutes (reaction time) at 50 Q C.
  • the reaction was stopped using 750 pL of DNS reagent (1% 3,5-dinitrosalicylic acid, 30% sodium and potassium tartrate, and 1.6% NaOH). Subsequently, it was incubated at 100 Q C for 10 minutes. The samples were cooled to room temperature, centrifuged at 8600 g to remove residual xylan, and absorbance at 540 nm was measured in the supernatant. Xylose was used for the calibration curve in concentrations from 0 to 20 mM. One unit (U) of enzyme activity was defined as the amount of enzyme needed to produce 1 pmol of reducing sugars per minute.
  • XynA shows an optimal pH of 6.0, with a specific activity of 457 ⁇ 2.0 U / mg.
  • the specific activity of XynA drops to 283 ⁇ 2.5 U / mg.
  • pH 4.0, pH 3.0, and pH 2.2 a decrease in specific activity values is observed at 23 ⁇ 2.0, 19 ⁇ 2.0 and 15 ⁇ 8.0 U / mg respectively.
  • the specific activity obtained was 408 ⁇ 8.0 U / mg, at pH 8.0 it drops to 164 ⁇ 1.0 U / mg and at pH 9.0 and 10.0 the activity obtained was 32 ⁇ 1, 0 and 20 ⁇ 1.0 U / mg.
  • the activity obtained is 404 ⁇ 7.0 U / mg
  • the specific activity is 374 ⁇ 4.0 U / mg
  • at 30 Q C, 20 Q C and 10 Q C the specific activity was 274 ⁇ 6.0 U / mg; 190 ⁇ 2.0 U / mg and 126 ⁇ 2.0 U / mg, respectively.
  • the specific activity of XynA was 106 ⁇ 2.0 U / mg.
  • the XynAA29N enzyme has its maximum activity at 45 Q C (648 ⁇ 3.0 U / mg).
  • the specific activity was 630 ⁇ 1.0 U / mg, while at temperatures of 55 Q C, 60 Q C and 70 Q C the specific activities obtained were 498 ⁇ 1.0 U / mg; 322 ⁇ 2.0 U / mg; and 207 ⁇ 1.0 U / mg, respectively.
  • the specific activity was 630 ⁇ 1.0 U / mg, while at temperatures of 30 Q C, 20 Q C, 10 Q C a moderate decrease in activity was observed, retaining 600 ⁇ 4.0 U / mg, 478 ⁇ 2.0 U / mg and 415 ⁇ 13.0 U / mg respectively.
  • thermostability determination was performed in a temperature range between 5-40 ° C. The results obtained are observed in FIG. 6. The enzyme loses very little activity when it is pre-incubated between 5 and 25 Q C for 3 hours. However, when performing a pre-incubation at 35 Q C for 1 hour, the enzyme shows a loss of 50% of its activity. Important, after 20 minutes at 40 Q C, the enzyme completely loses its activity. This indicates that XynA is a highly thermolabile enzyme.
  • FIG. 7 presents the results of the same experiment for the enzyme XynAA29N.
  • removal of the 29 amino acids from the amino terminus dramatically increased the thermal stability of the enzyme.
  • XynAA29N still retains around 100% of its activity, which decreases when incubating at higher temperatures.
  • the maximum temperature tested 70 ° C
  • the enzyme still retains detectable activity after 20 minutes of incubation. This result indicates that deletion of the 29 amino acids at the amino terminus of the XynA protein results in an increase in its thermal stability.
  • the conditions used were pH 6.0 for both enzymes, and a temperature of 50 ° C for XynA and 45 ° C for XynAA29N.
  • the substrates used were rye arabinoxylan, wheat arabinoxylan, oatmeal xylan, beech xylan and birch xylan.
  • the enzyme was incubated with the substrates at 1% and the activity was determined using the following protocol. Reducing sugars were detected for the measurement of xylanolytic activity by the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay (Bailey, MJ, Biely, P., & Poutanen, K.
  • DNS 3,5-dinitrosalicylic acid
  • the effect of the XynA and XynAA29N enzymes on the masses was evaluated by means of alveographic analysis.
  • An alveograph (Chopin, France) was used to measure the rheological characteristics of the mass. This alveograph is made up of three elements: a mixer for the preparation of the dough, the fermentation chamber, and the curve recorder (standard manometer).
  • the hydrostatic valve was opened and air was let through to the mass, taking the shape of a balloon that progressively grows until it ruptures. This last step was repeated with the remaining four samples. Opening the hydrostatic valve, the register drew a diagram. Once the five diagrams were drawn, the mean of the samples analyzed was obtained and the toughness (P, corresponding to the capacity of the mass to resist deformation) and the extensibility (L, corresponding to the maximum volume of air that may contain mass bubble; Method 54-30A, AACC International 2000).
  • Tenacity (P) assesses the resistance to deformation of the mass.
  • the results in Table 1 indicate that the addition of xylanases to the flour leads to a decrease in the value of this parameter, indicating a decrease in the stiffness and formation of the gluten network.
  • the results show that XynA decreases the tenacity of the mass by 8.8%, while the treatment with CghAD29N, toughness decreases by about 18%, a significant difference compared to other treatments.
  • the elasticity (L) measures the ability of the flour to be stretched once mixed with water.
  • the action of xylanases on the masses generated a change in elasticity, which is reflected in an increase in this parameter (Table 1). All treatments showed an increase in elasticity, in the case of XynA it increases about 10%, similar to that obtained with the commercial enzyme. In the case of treatment with XynAA29N, the elasticity of the mass increased by 21%.
  • the Brabender farinograms are standard curves that allow observing the amount of water a flour needs to obtain the ideal consistency, the appropriate kneading time to obtain a correctly developed dough and the stability of the dough. Therefore, this experiment allowed to determine the water absorption, the development time of the mass and the stability.
  • a Brabender ® Farinograph (CW Brabender Instruments, Inc., Germany) was used. For it, 50 grams of flour were added to the equipment's mixer, 30 mL of water and xylanase (20 ppm) were added. The mixture was kneaded at a constant speed of 100 rpm, recording the resistance that the dough opposes to continuous mechanical work as a function of time. First, the amount of water necessary for the dough to reach a previously determined consistency was determined in 500 Brabender ® units (standardized value of maximum consistency). Then, from the diagram obtained from the farinogram, the parameters related to the industrial aptitude of the flour were obtained.
  • the breads were made using the following formulation: 200 grams of wheat flour (Molino Puente Alto), 8 grams of skim milk powder (Svelty ® , Nestlé), 6 grams of lard (Astra ® ), 6 grams of fresh yeast ( Lefersa ® ), 4 grams of sodium chloride (Merck ® ) and 8 grams of common sugar (IANSA ® ) and 1 12 mL of water. For enzyme treatments, these were added at 20 ppm. The ingredients were mixed and kneaded for 7 min with a mixer (Kitchenaid ® ). Subsequently, the resulting mass was pre-fermented for 105 min at 30 Q C, in a chamber with an atmosphere of 96% relative humidity.
  • the dough was then manually degassed and brought back to the fermentation chamber for another 50 minutes under the same conditions. At the end of this time, the degassed mass was molded and portioned into 125-gram pieces with the help of a spatula. The pieces of dough were placed in molds for a final fermentation of 25 min. Finally, the pieces were baked at 215 Q C for 25 min in a gas oven (Maigas ® ). Each baking test was performed in triplicate.
  • the measurement of the volume of the bread was determined by displacement of ca ⁇ ala seeds, after 1 h of baking.
  • the specific volume was obtained by dividing the volume of the sample by its weight.
  • FIG. 12 shows the result of this bread making.
  • the use of the modified XynAA29N xylanase of the present invention improves the alveographic parameters (toughness and elasticity) of the dough, which allows breads with a higher specific volume to be obtained when compared to the native enzyme and the commercial enzyme.

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Abstract

La presente invención se relaciona con un nuevo polipéptido con actividad xilanasa, la secuencia nucleotídica que lo codifica, un ingrediente que contiene dicho polipéptido, y un proceso para la preparación de un producto alimenticio que comprende agregar dicho ingrediente a la preparación. Este nuevo polipéptido con actividad xilanasa es particularmente útil para la industria panadera, otorgando a las masas una mayor elasticidad, menos tenacidad, mayor formación de red de gluten con menos agua, disminución de tiempo de amasado, y mayor volumen del producto final.

Description

POLIPÉPTIDO CON ACTIVIDAD XILANASA, SECUENCIA NUCLEOTÍDICA QUE LO CODIFICA, INGREDIENTE Y PROCESO QUE COMPRENDE DICHO INGREDIENTE PARA LA PREPARACIÓN DE UN PRODUCTO ALIMENTICIO
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se relaciona con el campo técnico de la biotecnología, particularmente con un nuevo polipéptido con actividad xilanasa, la secuencia nucleotídica que lo codifica, un ingrediente que contiene dicho polipéptido, y un proceso para la preparación de un producto alimenticio que comprende agregar dicho ingrediente a la preparación.
ANTECEDENTES
Las xilanasas son una clase de enzimas que degradan polisacáridos lineales de xilano en xilosa catalizando la hidrólisis del enlace glicosídico b-(1 ,4). Dentro de este grupo de enzimas existen las bhόo-b-(1 ,4)-D-xilanasas (comúnmente llamadas endoxilanasas) que catalizan la hidrólisis del enlace glucosídico interno b-(1 ,4) de la cadena de xilosas del xilano, generando xilooligosacáridos (XOS) de bajo peso molecular con o sin ramificaciones (Biely, P. Microbial xylanolytic Systems. Trends in Biotechnology. 1985. Vol. 3(1 1 ): 286-290). Estas enzimas se clasifican en diferentes familias glucósido hidrolasa (GH) de acuerdo con sus propiedades fisicoquímicas. Principalmente, las endoxilanasas se clasifican en las familias GH10 y GH1 1 . Las xilanasas de la familia GH10 tienen un tamaño aproximado de 35kDa, y son capaces de hidrolizar enlaces glucosídicos cercanos a puntos de ramificación y hacia el extremo no reductor, mientras que las xilanasas de la familia GH1 1 no son capaces de hidrolizar dichos enlaces glucosídicos y tienen un tamaño menor aproximado de 20kDa (Cooper Bribiesca, B. L. Enzimas xilanolíticas bacterianas y sus aplicaciones industriales. VERTIENTES Revista Especializada en Ciencias de la Salud. 2013. Vol. 16(1 ): 19-22).
Las endoxilanasas son de gran interés en la industria alimentaria. Por ejemplo, son ampliamente usadas en la industria de los vinos, en la fabricación de cerveza, en el proceso de clarificado del zumo de frutas, en la extracción de almidón, café y aceites vegetales, mejoramiento de propiedades nutricionales de ensilados y granos, y en procesos de la industria panadera. En particular para esta última industria mencionada, las endoxilanasas permiten mejorar una serie de características en productos de panadería, tales como las propiedades de la masa y el volumen del pan. Cuando estas enzimas se adicionan durante el amasado, se modifican las características viscoelásticas de la masa, disminuye la absorción de agua, el tiempo de desarrollo de la masa y su estabilidad. Como resultado, el pan y productos derivados resultan con mejores características como el volumen, firmeza y estructura de la miga (Elgharbi, F., Hmida-Sayari, A., Zaafouri, Y., & Bejar, S. Expression of an Aspergillus niger xylanase in yeast: Application in breadmaking and in vitro digestión. International Journal of Biological Macromolecules. 2015. Vol. 79: 103-109).
En el estado de la técnica existen diversas xilanasas derivadas de microorganismos o modificadas genéticamente, las cuales están enfocadas principalmente para la industria papelera. Por ejemplo, el documento de patente US 2015/0291945 A1 , se refiere a una endo-1 ,4- -xilanasa proveniente del hongo Macrophomina phaseolina en el que enseña una serie de secuencias nucleotídicas que codifican dicha enzima. Menciona que estas enzimas se pueden utilizar en la industria alimenticia, para la fabricación de alimentos de animales, en la producción de pulpa y papel, y en la industria de agentes de limpieza, sin embargo, no muestra ejemplos concretos de la mejora en su capacidad hidrolítica.
Por otra parte, el documento de patente US 9,732,366 B2 divulga una xilanasa de la familia GH10 termoestable a altas temperaturas que tiene un dominio catalítico que contiene (A) un polipéptido que incluye una secuencia aminoacídica particular, y (B) un polipéptido que incluye una secuencia aminoacídica en el cual al menos un aminoácido ha sido eliminado, sustituido o añadido en dicha secuencia particular, o (C) una secuencia aminoacídica que tiene al menos 80% o más de identidad de secuencias con dicha secuencia particular. La ventaja de la xilanasa divulgada en US 9,732,366 B2 es que tiene actividad bajo condiciones de 85QC, y pH 6,0, sin embargo, no menciona ni ejemplifica ventajas de dicha enzima para la industria de la producción de alimentos. El documento de patente US 2016/0345609 A1 se refiere a una xilanasa de la familia GH10 modificada o un fragmento de ésta con actividad xilanasa, donde dicha mutante tiene mayor termoestabilidad a altas temperaturas comparado con la enzima nativa. Las modificaciones corresponden a mutaciones puntuales en ciertas posiciones de la secuencia aminoacídica, que les confieren estabilidad a temperaturas cercanas a los 75QC. A su vez, el documento de patente WO 2015/1 141 10 A1 divulga xilanasas sintéticas pertenecientes a la familia GH10 que solubilizan arabinoxilanos insolubles, particularmente de sustratos tales como maíz, trigo, DDGS, etc. En este documento también se enfocan en obtener xilanasas termoestables a altas temperaturas, demostrando que es aún es activa en rangos de temperatura entre los 61 -71 QC.
Si bien la termoestabilidad de la xilanasa a muy altas temperaturas puede considerarse como una característica ventajosa en ciertos procesos químicos, es completamente irrelevante para los procesos de la producción de alimentos y en particular para la panificación, cuyo proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura aproximada de 30QC. En ese sentido, es más relevante obtener xilanasas cuya máxima actividad esté en un rango de temperatura cercano a esos 30QC y que además otorguen ventajas específicas para los procesos de elaboración de alimentos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un primer objeto de la presente invención es un polipéptido para preparar un producto alimenticio, que tiene actividad xilanasa y comprende una secuencia aminoacídica que se selecciona del grupo que consiste de: la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa.
Dicho polipéptido está codificado por una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: la secuencia nucleotídica de la SEC ID No. 3; y una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de la SEC ID No. 3.
Un segundo objeto de la presente invención es una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene actividad xilanasa para preparar un producto alimenticio, donde dicha secuencia se selecciona del grupo que consiste de: la secuencia nucleotídica de la SEC ID No. 3; y una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de la SEC ID No. 3.
Un tercer objeto de la presente invención es un ingrediente para preparar un producto alimenticio que contiene un polipéptido que tiene actividad xilanasa, cuya secuencia aminoacídica se selecciona del grupo que consiste de: la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa.
Un cuarto objeto de la presente invención es un proceso para preparar un producto alimenticio, que comprende las etapas de: proveer un ingrediente que contiene un polipéptido que tiene actividad xilanasa cuya secuencia aminoacídica se selecciona del grupo que consiste de:
• la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y
• una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa; mezclar dicho ingrediente con una harina, un líquido y cualquier otro ingrediente apropiado; amasar dicha mezcla hasta obtener una masa; y cocer dicha masa para obtener un producto alimenticio.
La harina que se utiliza en el proceso para preparar un producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste de harina de trigo, harina de mandioca, harina de cebada, harina de arroz, harina de centeno, harina de maíz, harina de quinua, y harina de sarraceno. Por otra parte, el líquido que se utiliza para preparar un producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste de agua, soluciones acuosas salinas, leche e infusiones.
En una modalidad preferida, el producto alimenticio que se obtiene a partir del proceso que se describe en la presente invención es pan.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 muestra un esquema de la estructura tridimensional de la enzima nativa con actividad xilanasa (XynA) derivado de una cepa de Cladosporium sp.
La FIG. 2 muestra un esquema de la estructura tridimensional de la enzima modificada con actividad xilanasa (XynAA29N) de la SEC ID No. 1.
La FIG. 3 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes de las enzimas recombinantes purificadas. Se muestra el perfil de migración de las proteínas junto con el estándar. (A) CarriM . PageRuler™ Prestained Protein Ladder 10-180 kDA (Thermo Scientific™) con sus masas moleculares (a la izquierda). Carril 2. XynA purificada. (B) Carril 1. PageRuler™ Prestained Protein Ladder 10-180 kDA (Thermo Scientific™) con sus masas moleculares (a la izquierda). Carril 2. XynAA29N purificada. La tinción usada fue azul de Coommasie.
La FIG. 4 muestra un gráfico con los resultados sobre el efecto del pH sobre la actividad de las enzimas. XynA (línea punteada) y XynAA29N (línea continua). Cada uno de los puntos corresponde al promedio de tres réplicas y las barras a su desviación estándar.
La FIG. 5 muestra un gráfico con los resultados sobre el perfil de actividad específica de XynA (línea punteada) y XynAA29N (línea continua) a distintas temperaturas. Los ensayos se realizaron en triplicado. Las barras correspondientes a la desviación estándar fueron muy pequeñas, por lo que no se alcanzan a ver en la figura. La FIG. 6 muestra un gráfico con los resultados de la cinética de estabilidad térmica de XynA. La enzima se pre-incubó a temperaturas entre 5 y 40°C. Luego se midió la actividad enzimática residual. La actividad enzimática se expresó como porcentaje, siendo el 100% la reacción a tiempo 0 (sin pre-incubación). Las mediciones se realizaron en triplicado y las barras corresponden a la desviación estándar.
La FIG. 7 muestra un gráfico con los resultados de la determinación de estabilidad térmica de XynAA29N.La enzima se pre-incubó a temperaturas entre 5 y 70°C. Luego se midió la actividad enzimática residual. La actividad enzimática se expresó como porcentaje, siendo el 100% la reacción a tiempo 0 (sin pre incubación). Las mediciones se realizaron en triplicado y las barras corresponden a la desviación estándar.
La FIG. 8 muestra un gráfico con la actividad las enzimas sobre distintos sustratos. Las barras corresponden a XynA (color negro) y XynAA29N (color gris). Las mediciones se realizaron en triplicado y las barras corresponden a la desviación estándar.
La FIG. 9 muestra el resultado de una cromatografía en capa fina de los productos de hidrólisis obtenidos por la acción de XynA sobre xilano. Carriles 1 y 4, estándar, mezcla de xilooligosacáridos (X1 : xilosa, X2 : xilobiosa, X3: xilotriosa y X4: xilotetraosa); carril 2, arabinoxilano de centeno; carril 3, arabinoxilano de centeno más XynA; carril 5, arabinoxilano de trigo; carril 6, arabinoxilano de trigo más XynA; carril 7, arabinoxilano de avena; carril 8, avena arabinoxilano más XynA; carril 9, xilano de haya; carril 10, xilano de haya más XynA; carril 1 1 , xilano de abedul y carril 12, xilano de abedul más XynA. Las condiciones de incubación fueron durante 20 min a 50QC.
La FIG. 10 muestra el resultado de una cromatografía en capa fina de los productos de hidrólisis de xilano por XynAA29N. Carriles 1 y 4, estándar, mezcla de xilooligosacáridos (X1 : xilosa, X2 : xilobiosa, X3: xilotriosa y X4: xilotetraosa); carril 2, arabinoxilano de centeno; carril 3, arabinoxilano de centeno más XynA; carril 5, arabinoxilano de trigo ; carril 6, arabinoxilano de trigo más XynA; carril 7, xilano de avena; carril 8, xilano de avena más XynA; carril 9, xilano de haya; carril 10, xilanos de haya más XynA; carril 1 1 , xilano de abedul; carril 12, xilano de abedul más XynA. Las condiciones de incubación fueron durante 20 min a 50QC. En el recuadro negro se destaca la liberación de xilosa por la enzima XynAA29N.
La FIG. 1 1 muestra el resultado de una cromatografía en capa fina de los productos de hidrólisis utilizando como sustrato xilooligosacáridos. Carril 1 , xilobiosa; carril 2, xilobiosa más XynA; carril 3, xilobiosa más XynAA29N; carril 4, xilotriosa; carril 5, xilotriosa más XynA; carril 6, xilotriosa mas XynAA29N; carril 7, xilotetraosa; carril 8, xilotetraosa más XynA; carril 9, xilotetraosa más XynAA29N; carril 10, mezcla de xilooligosacáridos (X1 : xilosa, X2: xilobiosa, X3: xilotriosa y X4: xilotetraosa). Las condiciones de incubación fueron durante 20 min a 50QC.
La FIG. 12 muestra fotografías de panes elaborados. (A) Pan sin enzima. (B) Pan elaborado con enzima comercial (C) Pan elaborado con adición de XynA. (D) Pan elaborado con adición de XynAA29N.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido con actividad xilanasa, adecuada específicamente para mejorar los productos derivados de la industria alimenticia, preferentemente para la industria panadera. Al agregar este nuevo polipéptido a las mezclas para generar productos alimenticios derivados de la industria panadera, permite que éstas tengan una mejor elasticidad y menor tenacidad, y obtener un producto final de mayor volumen, en comparación con polipéptidos con actividad xilanasa actualmente disponibles en el mercado.
Todos los términos técnicos y científicos utilizados para describir la presente invención tienen el mismo significado entendido para una persona con conocimientos básicos en el campo técnico en cuestión. No obstante, para definir con más claridad el alcance de la invención, a continuación se incluye una lista de la terminología utilizada en esta descripción y su significado.
Se debe entender por el término“secuencia de nucleótidos” o“secuencia nucleotídica”, una doble hebra de ADN, o una hebra simple de ADN, natural o sintética, o productos de la transcripción de dicho ADN (por ejemplo, moléculas de ARN). Se debe entender, que la presente invención no se relaciona a secuencias de nucleótidos genómicos en su estado natural, si no que se refiere a secuencias de nucleótidos en un estado aislado, o purificado, o parcialmente purificado, o recombinante, obtenida mediante cualquier método de ingeniería genética conocido en el estado de la técnica.
Se debe entender por el término“secuencia aminoacídica” o“polipéptido”, una secuencia de aminoácidos, natural o sintética, o productos de la traducción de ARN. Cuando estos polipéptidos tienen una estructura estable y tridimensional se denominan proteínas. Se debe entender, que la presente invención no se relaciona a secuencias aminoacídicas en su estado natural, si no que se refiere a secuencias aminoacídicas o polipéptidos en un estado aislado, o purificado, o parcialmente purificado, o recombinante, obtenida mediante cualquier método de ingeniería genética conocido en el estado de la técnica.
Se debe entender por el término“enzima”, un polipéptido que actúa como catalizador biológico que acelera reacciones químicas que de otra forma ocurrirían pero a velocidades muy bajas. Las enzimas convierten sustratos en moléculas diferentes denominados productos. Estas enzimas tienen afinidades específicas a sus sustratos según su estructura tridimensional. La actividad biológica de estas moléculas es sensible a las condiciones del medio, tales como pH y temperatura, o incluso otras moléculas que pueden aumentar o inhibir su actividad.
Se debe entender por el término“actividad xilanasa”, la actividad enzimática que realiza un polipéptido que produce la hidrólisis de xilano, cuando esta molécula es el sustrato.
Se debe entender por el término “recombinante”, a cualquier secuencia nucleotídica (ADN, ARN) o aminoacídica modificada mediante cualquier método de ingeniería genética conocido en el estado de la técnica, que genera como resultado una nueva secuencia nucleotídica o aminoacídica distinta a la que se encuentra en la naturaleza.
Se debe entender por el término“identidad” entre secuencias de nucleótidos, el porcentaje de nucleótidos idénticos que las secuencias comparadas comparten entre sí, en una ventana particular de comparación. El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Por ejemplo, las secuencias y porcentajes de identidad se pueden obtener utilizando recursos informáticos disponibles en Internet como el programa computacional BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) o el programa computacional FastDB. La identidad de secuencias también se puede determinar mediante ensayos de hibridación de las mismas. Mientras mayor sean los grados de astringencia de hibridación utilizados en el ensayo, mayor será la complementariedad de las secuencias requerida para que éstas hibriden. Las condiciones de alta astringencia están descritas por Sambrook y colaboradores. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Press, 1989). En el caso de las secuencias aminoacídicas, se utilizará el término“similitud” el cual incluye el porcentaje de aminoácidos idénticos y el porcentaje de aminoácidos de coincidencia conservada que las secuencias comparadas comparten entre sí, en una ventana particular de comparación. Los aminoácidos de coincidencia conservada corresponden a aquellos aminoácidos que pertenecen a la misma clasificación de acuerdo a sus características fisicoquímicas de su cadena lateral (R), y que pueden ser aminoácidos con grupos R polares pero no cargados (Ser, Thr, Asn, Gln), con grupos R cargados positivamente (Lys, Arg, His), grupos R cargados negativamente (Glu, Asp), grupos R hidrofóbicos (Ala, lie, Leu, Met, Phe, Trp, Val, Tyr), o aminoácidos especiales (Cys, Gly, Pro).
Un primer objeto de la presente solicitud corresponde a un polipéptido o enzima modificada con actividad xilanasa, cuya secuencia aminoacídica se muestra en la SEC ID No. 1 . Esta corresponde a una secuencia aminoacídica modificada a partir de una enzima nativa con actividad xilanasa (SEC ID No. 2, código de acceso GenBank MG007677), la cual se aisló del hongo Cladosporium sp., obtenidos desde esponjas marinas de la Antártica (Henríquez M, etal. Diversity of cultivable fungí associated with Antarctic marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World J Microbio! Biotechnol. 2014. Vol. 30(1 ):65-76). La modificación de la enzima nativa se realizó utilizando técnicas de ingeniería genética conocidas en el estado de la técnica. A dicha enzima se le eliminó 29 residuos aminoacídicos del extremo N-terminal (amino terminal), lo cual le otorga una ventaja sorprendente a la enzima con actividad xilanasa reivindicada en la presente invención en comparación con la enzima nativa, mejorando significativamente su actividad sobre varios sustratos, a distintas temperaturas y pHs. El polipéptido modificado con actividad xilanasa de la presente invención tiene una actividad específica en un amplio un rango de pH, siendo estable y óptima su actividad entre pH 5 a 8. Por otra parte, el polipéptido de la presente invención tiene una actividad específica en un rango de temperatura óptimo para los procesos de la industria alimenticia, en un rango entre 30 y 50QC. Dentro de todo este rango de temperatura, la enzima mantiene una actividad máxima estable, a diferencia de otras enzimas descritas en el estado de la técnica las cuales suelen tener un pico máximo de actividad en una temperatura en particular y luego decaer rápidamente en temperaturas cercanas a dicho máximo, por lo que el rango de temperatura es limitado. Esta actividad máxima en este rango de temperatura es particularmente deseada para los procesos de panificación, siendo la enzima activa durante la etapa de amasado hasta principios de la etapa de cocción.
Si bien se escogió una eliminación particular de 29 aminoácidos del extremo N-terminal de la enzima nativa, una persona con conocimientos en el estado de la técnica esperaría que la eliminación de una cantidad similar de aminoácidos de ese extremo amino terminal producirá el mismo efecto ventajoso para la enzima. En consecuencia, se encuentra dentro del alcance de la presente invención cualquier enzima xilanasa a la cual se le realice eliminaciones progresivas de aminoácidos del extremo amino terminal, y mantenga un porcentaje de similitud igual o mayor al 80%. Por ejemplo, se encuentra dentro del alcance de la presente invención cualquier enzima xilanasa que tenga 29 + 10 aminoácidos eliminados de su extremo amino terminal, sin que ese valor aproximado sea una limitante del alcance de la presente invención.
En una realización particular, el polipéptido con actividad xilanasa es capaz de degradar los polisacáridos b-(1 ,4)-xilano en xilosa. Dicho polipéptido tiene preferentemente una actividad endo- -(1 ,4)-D-xilanasa, que cataliza la hidrólisis del enlace glucosídico interno b-(1 ,4) de la cadena de xilosas del xilano. Sin embargo, la presente enzima con actividad xilanasa puede hidrolizar otros sustratos tales como, xilooligosacáridos (xilotriosa, xilotetraosa), p-nitrofenil b-d-xilopiranósido (pNPX), p-nitrofenil b-D-glucopiranósido (pNPG), p-nitrofenil-a-L-arabinofuranósido, p-nitrofenil-a-L-arabinopiranósido, p-nitrofenil^-L-arabinopiranósido, p-nitrofenil-b- D-manopiranósido, p-nitrofenil-a-D-galactopiranósido, p-nitrofenil^-D- galactopiranósido, glucanos compuestos compuestos de enlaces b-1 ,3, b-1 ,4 y b- 1 ,6, oligosacáridos compuestos de enlaces b-1 ,4 y b-1 ,6.
Por otra parte, también se encuentra dentro del alcance de la presente invención cualquier secuencia aminoacídica del nuevo polipéptido con actividad xilanasa que contenga al menos un 80% de similitud con la secuencia descrita en SEC ID No. 1 , preferentemente un 90% de similitud, más preferentemente un 95% de similitud, siempre y cuando cualquiera de las variantes mantengan su actividad xilanasa ventajosa. Cualquier persona con conocimientos en el estado de la técnica reconocerá que ciertos aminoácidos comparten sus características fisicoquímicas dependiendo de su cadena lateral, por lo que la modificación de alguno o algunos de los aminoácidos de la SEC ID No. 1 será irrelevante y no cambiará la actividad biológica de dicha enzima, por lo que dichas variantes también son objeto de la presente invención.
El polipéptido de la presente invención puede obtenerse mediante cualquier técnica biotecnológica conocida en el estado de la técnica para este fin. Por ejemplo, el presente polipéptido puede obtenerse mediante técnicas del ADN recombinante, expresando un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en un vector de expresión adecuado, el cual se introduce en un organismo apropiado para la producción de dicho polipéptido. La producción del polipéptido puede realizarse en biorreactores para su obtención a gran escala.
Un segundo objeto de la presente invención es una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido con actividad xilanasa descrito previamente, y que se muestra en la SEC ID No. 3. Esta secuencia nucleotídica se modificó a partir de la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido nativo con actividad xilanasa (SEC ID No. 4, código de acceso GenBank MG007677), el cual se aisló del hongo Cladosporium sp., obtenidos desde esponjas marinas de la Antártica (Henríquez M, et al. Diversity of cultivable fungí associated with Antarctic marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World J Microbiol Biotechnol. 2014. Vol. 30(1 ):65-76). Si bien se escogió una eliminación particular de nucleótidos que codifican 29 aminoácidos del extremo N-terminal de la enzima nativa, una persona con conocimientos en el estado de la técnica esperaría que la eliminación de una cantidad similar de nucleótidos que codifican aminoácidos de ese extremo amino terminal producirá el mismo efecto ventajoso para el polipéptido con actividad xilanasa. En consecuencia, se encuentra dentro del alcance de la presente invención cualquier secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido con actividad xilanasa que tenga, por ejemplo, 29 + 5 aminoácidos eliminados de su extremo amino terminal, sin que ese valor aproximado sea una limitante del alcance de la presente invención.
La presente invención también considera cualquier variante de dicha secuencia nucleotídica que contenga al menos un 80% de identidad con la secuencia descrita en SEC ID No. 3, preferentemente un 90% de identidad, más preferentemente un 95% de identidad, siempre y cuando cualquiera de las variantes mantengan la capacidad de codificar un polipéptido que mantenga su actividad xilanasa. Cualquier persona con conocimientos en el estado de la técnica reconocerá que el código genético es degenerado, y como tal la secuencia nucleotídica puede tener diferentes codones que codifican un mismo aminoácido. En consecuencia, ciertos cambios en la secuencia nucleotídica SEC ID No. 3 podrán ser irrelevantes y no cambiarán la actividad biológica de la enzima que es codificada por dicha secuencia.
Un tercer objeto de la presente invención es un ingrediente para preparar un producto alimenticio que contiene el polipéptido que tiene actividad xilanasa, cuya secuencia aminoacídica se selecciona del grupo que consiste de la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa.
Dicho ingrediente que contiene el polipéptido es útil para mejorar las características organolépticas de los productos alimenticios finales y/o mejora las características de estos durante su proceso fabricación. Por ejemplo, cuando la presente enzima se agrega durante el proceso de panificación, permite que la masa tenga una mayor elasticidad, menor tenacidad, se observa mayor formación de la red de gluten con menos agua, disminución de tiempo de amasado, y mayor volumen del producto final. La presente enzima también puede utilizarse en la industria de la producción de bebestibles para mejorar las propiedades de jugos, vinos y cervezas. En particular, la xilanasa de la presente invención permite aumentar el rendimiento de obtención de jugos de frutas cuando se agrega al proceso de fabricación durante el proceso de macerado de dichas frutas. Además, la presente enzima mejora la claridad de los jugos, vinos y cervezas, y disminuye la turbidez, características altamente deseadas en estos productos. Estos ejemplos deben considerarse como tal, pues cualquier persona con conocimientos en el estado de la técnica reconocerá que la enzima de la presente invención puede utilizarse para múltiples procesos industriales de fabricación de alimentos, sin limitarse a los previamente mencionados.
La composición de este ingrediente, además del polipéptido con actividad xilanasa, puede contener opcionalmente excipientes adecuados para su posterior utilización en la industria alimenticia. Dichos excipientes pueden ser estabilizantes (ej. sales, proteínas inertes, carbohidratos), preservantes, solventes, diluyentes, recubiertas, entre otros, que permiten mantener la estabilidad del polipéptido en el tiempo, aumentar su vida media en el mercado, evitar su aglomeración, etc. Por otra parte, el ingrediente puede estar en una formulación líquida o sólida. Puede formularse como una solución con el polipéptido en suspensión, o en polvo, por ejemplo, liofilizado.
Un cuarto objeto de la presente invención es un proceso para preparar un producto alimenticio, que comprende las etapas de: proveer un ingrediente que contienen un polipéptido que tiene actividad xilanasa cuya secuencia aminoacídica se selecciona del grupo que consiste de:
• la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y
• una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa; mezclar dicho ingrediente con una harina y un líquido y cualquier otro ingrediente apropiado; amasar dicha mezcla hasta obtener una masa; y cocer dicha masa para obtener un producto alimenticio. La harina que se utiliza en el proceso para preparar un producto alimenticio es cualquier polvo fino que se obtiene de cereales o granos molidos u otros alimentos ricos en almidón. Por ejemplo, la harina que se utiliza puede ser harina de trigo, harina de mandioca, harina de cebada, harina de arroz, harina de centeno, harina de maíz, harina de quinua y harina de sarraceno.
Por otra parte, el líquido que se utiliza para preparar un producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste de agua, soluciones salinas, leche e infusiones, pero también puede utilizarse cualquier otro líquido aprobado para el consumo humano. Se pueden agregar opcionalmente otros ingredientes apropiados tales como materia grasa vegetal u animal (aceites, mantequillas, margarinas, mantecas, etc.), saborizantes (sales, azúcares, especias, etc.), levaduras, polvos de hornear (ácido cítrico o tartárico mezclado con carbonato o bicarbonato de sodio), bicarbonato de sodio, granos y semillas (linaza, chía, semillas de amapola, semillas de zapallo, avena, sésamo, etc.), frutos secos (almendras, nueces, maní, pasas, etc.), frutos y vegetales frescos o deshidratados, huevo y otras proteínas, entre otros.
El amasado de la mezcla puede realizarse de forma manual o mecánica, con máquinas amasadoras. En ciertos procesos de panificación, puede agregarse opcionalmente una etapa de reposo de la masa previo a la cocción de esta.
Por otra parte, la cocción de la masa que se utiliza en el proceso de panificación descrito en la presente invención es preferentemente el horneado. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro método de cocción conocido tales como salteado, frito, al vapor, etc.
En una modalidad preferida, el producto alimenticio que se obtiene a partir del proceso que se describe en la presente invención es pan. Dicho pan puede ser de cualquier tipo y debe entenderse en su significado más amplio, como cualquier derivado de una masa cuyos ingredientes mínimos son harina y un líquido. Incluye panes dulces o salados, blancos, integrales, de cualquier forma y cocción. La presente invención no se limita estos, siendo posible utilizar la enzima en preparaciones de tortillas, o masas con texturas esponjosas, como galletas, bollos, donas, kuchen, queques, pasteles, etc. EJEMPLOS
Ejemplo 1. Aislación de la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido con actividad xilanasa desde Cladosporium sp.
Se aisló una cepa de Cladosporium sp. desde esponjas marinas de la Antártica (Henríquez M, et al. Diversity of cultivable fungí associated with Antarctic marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and antioxidant potential. World J Microbiol Biotechnol. 2014. Vol. 30(1 ):65-76). De dicha cepa se obtuvo el ARN total de acuerdo con el protocolo que se describe brevemente a continuación. En un matraz de 250 mL que contenía 100 mL de medio Czapeck con xilano de haya al 1 %, se inoculó con 5,0 x 106 esporas/mL, durante 48 horas a 15°C con agitación de 180 r.p.m. Posteriormente, el micelio se filtró y se lavó 4 veces con una solución de NaCI al 0,9% tratada con DEPC. Luego, se secó el micelio y se pulverizó. La extracción del ARN se realizó con el kit RNeasy Plant Mini kit (Qiagen®) según las indicaciones del fabricante. El ARN obtenido se cuantificó y se trató con DNasa I - RNase-free, para lo cual se siguieron las indicaciones del fabricante. El ARN se almacenó a -80°C hasta su uso.
Obtención del cDNA de la xilanasa nativa mediante RT-PCR
Para obtener el gen de la xilanasa nativa se realizó RT-PCR. La reacción con transcriptasa inversa se realizó utilizando la enzima RevertAid Reverse Transcriptase (Thermo Scientific™) y se utilizó el oligo (dT) 20 para la obtención de ADNc. Luego, se realizó un PCR utilizando Taq polimerasa recombinante (Invitrogen), donde los oligonucleótidos utilizados para dicho PCR fueron Picz-Xyl- Ecorl-Fw (SEC ID No. 5) y Picz-Xyl-Sacll-Rv (SEC ID No. 6). Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis, se purificaron, y se clonaron en pGEM®-T Easy (Promega®) para su secuenciación.
Ejemplo 2. Expresión heteróloga de las xilanasas XynA y XynAA29N en Pichia pastoris GS115
Se obtuvo la secuencia nucleotídica de la xilanasa nativa (XynA SEC ID No. 4). La estructura tridimensional de la secuencia polipeptídica codificada por la SEC ID No. 4 se muestra en la FIG 1 , la cual fue modelada por el programa Modeller®. Este esquema se obtuvo por homología de XynA. En la parte central se presentan los residuos de glutamato que posiblemente llevan a cabo la actividad catalítica. Nótese que el extremo amino terminal no es modelado por el programa Modeller®. Como templados para el modelo, se descargaron varias estructuras cristalinas de xilanasas disponibles en la base de datos Protein Data Bank (PDB).
A partir de este polipéptido se generó una enzima recombinante a la cual se eliminaron los 29 aminoácidos no modelados ubicados en el extremo amino terminal. Este nuevo modelo se denominó XynAA29N y su estructura tridimensional se presenta en la FIG. 2. En la SEC ID No. 3 se muestra la secuencia nucleotídica que codifica la xilanasa modificada de la SEC ID No. 1 .
Es importante notar que de acuerdo con el modelo tridimensional, la eliminación de los 29 aminoácidos no generó un cambio evidente en la topología general en comparación al modelo generado para XynA, ya que, a excepción de la falta de los 29 aminoácidos, la estructura (a8/b8) se conserva.
Se realizó la clonación de ADNc que se obtuvo a partir de ARN mediante transcripción inversa de acuerdo con lo descrito previamente, y posteriormente se amplificaron por PCR, utilizando los oligonucleótidos Picz-Xyl-Ecorl-Fw (SEC ID No. 5) y Picz-Xyl-Sacll-Rv (SEC ID No. 6) para el ADNc-XynA (xilanasa nativa) y los oligonucleótidos Picz-xylA29N-Ecorl fw (SEC ID No. 7) y Picz-Xyl-Sacll-Rv (SEC ID No. 6) para ADNc-XynA29N (xilanasa modificada).
Seguidamente se realizó la digestión del vector pPICZa (obtenido del kit EasySelect™ Pichia Expression, Invitrogen™) y de los ADNc (ADNc-XynA y ADNc- XynA29N) usando las enzimas EcoRI y Sacll. Las digestiones se realizaron por separado. Para la enzima Sacll, en un volumen final de 20 pL se adicionaron 2 pL de amortiguador tango 10X, 2 pL de enzima (20 Unidades), 4 pL de ADN a una concentración de 1 pg/pL y 12 pL de agua. La digestión se incubó por 2 horas a 37°C, posteriormente se purificaron los fragmentos. Posteriormente, se realizó la digestión con la enzima EcoRI. Se siguió el mismo procedimiento explicado para la digestión con Sacll, excepto que el amortiguador usado fue el amortiguador O. Para mejorar la eficiencia en la clonación, el plásmido pPICZa digerido fue desfosforilado, utilizando fosfatasa alcalina antártica. Esta reacción se realizó en conjunto con la digestión final con EcoRI, adicionando 1 mI_ de la fosfatasa alcalina antártica (10 Unidades) y 2 mI_ del amortiguador. Finalmente, todos los productos se purificaron.
Los fragmentos obtenidos luego de la doble digestión se ligaron a pPICZa (kit EasySelect™ Pichia Expression, Invitrogen™). Se usó una relación vector: inserto de 1 :3 en 10 pL como volumen final. En la reacción se agregó 1 m L del amortiguador“10X ligation buffer”, 2 m L de ligasa T4 (5 U/pL), 1 pL de vector pPICZa (50 ng/pL), 3 pL de los productos de PCR digeridos a una concentración de 150 ng/pL, y 4 pL de agua MiliQ. La reacción se incubó por 16 horas a 15°C.
Posteriormente, se procedió a la transformación bacteriana. Luego de esto, los transformantes se sembraron en medio agar LB con baja sal pH 7,5, suplementado con Zeocina 0,1 mg/mL. Se comprobó de la presencia del inserto en las colonias obtenidas luego de la transformación mediante PCR utilizando los oligonucleótidos Xyl RT Fw (SEC ID No. 5) y Xyl RT Rv (SEC ID No. 6). Los transformantes positivos se cultivaron en medio líquido LB con baja sal pH 7,5, para la posterior extracción del plásmido.
Selección de clones de Pichia pastoris GS1 15 con actividad xilanásica.
Cinco clones de P. pastoris GS1 15 resistentes a Zeocina fueron seleccionaron al azar, para determinar si poseían actividad xilanásica.
Cada clon se sembró en 20 mL de medio BMGY en matraces de 250 mL, y se incubó por 1 día a 28°C y 200 r.p.m. Luego, el cultivo se centrifugó 2400 g por 5 minutos a temperatura ambiente, y las células se resuspendieron en 50 mL de BMMY, para inducir la expresión del gen de interés con metanol durante 8 días. Cada día se tomó una alícuota de 1 mL del sobrenadante de cultivo para ensayar actividad xilanásica como se describe a continuación. Para la medición de la actividad xilanolítica se detectaron azúcares reductores mediante el ensayo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Bailey, M. J., Biely, P., & Poutanen, K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology. 1992. Vol. 23(3): 257-270). 450 pL de una solución de xilano de haya (sustrato) al 1 % se pre-incubaron en amortiguador citrato 50 mM pH 5,3 por 10 minutos a 50QC. Luego, se agregó 50 pL de las muestras, y se incubaron por 10 minutos (tiempo de reacción) a 50QC. La reacción se detuvo utilizando 750 pL de reactivo DNS (1 % ácido 3,5-dinitrosalicílico, 30% tartrato de sodio y potasio, y 1 .6% NaOH). Posteriormente, se incubó a 100QC por 10 minutos. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se centrifugaron a 8600 g para eliminar el xilano residual, y en el sobrenadante se midió la absorbancia a 540 nm. Para la curva de calibración se utilizó xilosa en concentraciones de 0 a 20 mM. Una unidad (U) de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 pmol de azúcares reductores por minuto.
Figure imgf000019_0001
Para la purificación enzimática, se realizaron cultivos de 2 litros de los transformantes XynA y XynAA29N en medio BMMY. Los cultivos se concentraron 200 veces (de 2000 mL a 10 mL), dializados en un amortiguador apropiado, y sometidos a cromatografía.
Para la purificación de XynA, se obtuvo fracciones con actividad xilanásica a través de la cromatografía utilizando la resina His Puré Ni-NTA (Thermo Scientific™), las cuales se dializaron y se sometieron a cromatografía de intercambio iónico utilizando DEAE-Sephadex®. Finalmente, las fracciones con actividad xilanásica de la cromatografía DEAE-Sephadex®, se dializaron y se sometieron a cromatografía utilizando la resina de Sulfopropil Sepharose®. De este último paso cromatográfico se obtuvo la xilanasa pura a homogeneidad. En la FIG. 3 se presenta el gel SDS-PAGE de una de las fracciones obtenidas mediante este paso cromatográfico.
Para la purificación de XynAA29N, se cargó 5 mL en la columna con la resina His Puré Ni-NTA (Thermo Scientific™). Se obtuvo la proteína pura a homogeneidad con este único paso cromatográfico, como se presenta en la FIG. 3.
Ejemplo 3. Caracterización bioquímica de las xilanasas XynA y XynAA29N.
Efecto del pH sobre la actividad enzimática
Los resultados de este experimento se presentan en la FIG. 4. XynA muestra un pH óptimo de 6,0, con una actividad específica de 457 ± 2,0 U/mg. A pH 5, la actividad específica de XynA baja a 283 ± 2,5 U/mg. A pH 4,0, pH 3,0, y pH 2,2, se observa una disminución en los valores de actividad específica a 23 ± 2,0, 19 ± 2,0 y 15 ± 8,0 U/mg respectivamente. A pH 7,0 la actividad específica obtenida fue 408 ± 8,0 U/mg, a pH 8,0 desciende a 164 ± 1 ,0 U/mg y a pH 9,0 y 10,0 la actividad obtenida fue de 32 ± 1 ,0 y 20 ± 1 ,0 U/mg.
Por otro lado, los resultados del pH óptimo para la enzima XynAA29N (FIG. 4) indican que esta enzima mutante amplió su rango de pH de actividad. En el intervalo de pH 5-8, la actividad específica promedio fue de 504 ± 4,0 U/mg, mientras que a pH 4 su actividad fue 59 ± 4,0 U/mg. Finalmente, a pH 9 el descenso en la actividad es moderado (actividad 138 ± 2,0), mientras que a pH 10 se ve una pérdida casi total de la actividad.
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Los resultados del análisis de actividad a distintas temperaturas para las enzimas XynA y XynAA29N se presentan en la FIG. 5. A 50QC se observa el máximo de actividad para la enzima XynA, con una actividad específica 445 ± 2,0 U/mg. Al aumentar la temperatura a 55QC la actividad específica de la enzima fue de 326 ± 6,0 U/mg. A 60QC y 70QC, la actividad específica disminuye a 158 ± 7,0 U/mg y 103 ± 6,0 U/mg respectivamente. Al disminuir la temperatura a 45QC la actividad obtenida es de 404 ± 7,0 U/mg, a 40QC la actividad específica es 374 ± 4,0 U/mg, y a 30QC, 20QC y 10QC la actividad específica fue 274 ± 6,0 U/mg; 190 ± 2,0 U/mg y 126 ± 2,0 U/mg, respectivamente. Finalmente, a 4QC la actividad específica de XynA fue de 106 ± 2,0 U/mg.
Por otra parte, la enzima XynAA29N posee su máxima actividad a 45QC (648 ± 3,0 U/mg). Al aumentar la temperatura a 50QC, la actividad específica fue 630 ± 1 ,0 U/mg, mientras que a temperaturas de 55QC, 60QC y 70QC las actividades específicas obtenidas fueron de 498 ± 1 ,0 U/mg; 322 ± 2,0 U/mg; y 207 ± 1 ,0 U/mg, respectivamente. A 40QC la actividad específica fue de 630 ± 1 ,0 U/mg, mientras que a temperaturas de 30QC, 20QC, 10QC se observó una disminución moderada de la actividad, reteniendo 600 ± 4,0 U/mg, 478 ± 2,0 U/mg y 415 ± 13,0 U/mg respectivamente. Finalmente, es importante destacar que a temperaturas de 4QC la enzima XynAA29N posee una actividad de 370 ± 4,0 U/mg, duplicando la actividad de XynA a la misma temperatura.
Evaluación de la estabilidad térmica La determinación de termoestabilidad de XynA se realizó en un rango de temperatura entre 5-40°C. Los resultados obtenidos se observan en la FIG. 6. La enzima pierde muy poca actividad al pre-incubarla entre 5 y 25QC durante 3 horas. Sin embargo, al realizar una pre-incubación a 35QC durante 1 hora, la enzima muestra una pérdida del 50% de su actividad. Importante, después de 20 minutos a 40QC, la enzima pierde completamente su actividad. Esto indica que XynA es una enzima muy termolábil.
En la FIG. 7 se presentan los resultados del mismo experimento para la enzima XynAA29N. Sorprendentemente, la eliminación de los 29 aminoácidos del extremo amino terminal aumentó drásticamente la estabilidad térmica de la enzima. Después de 60 minutos a 40QC, XynAA29N aún retiene en torno al 100% de su actividad, la cual va disminuyendo al realizar incubaciones a temperaturas superiores. Sin embargo, incluso a la máxima temperatura ensayada (70°C) la enzima aún retiene actividad detectable después de 20 minutos de incubación. Este resultado indica que la eliminación de los 29 aminoácidos en el extremo amino terminal de la proteína XynA resulta en un aumento en su estabilidad térmica.
Determinación de actividad usando distintos sustratos
Para la determinación de la actividad de las enzimas sobre distintos sustratos, las condiciones utilizadas fueron pH 6.0 para ambas enzimas, y temperatura de 50°C para XynA y 45°C para XynAA29N. Los sustratos utilizados fueron arabinoxilano de centeno, arabinoxilano de trigo, xilano de cascara de avena, xilano de haya y xilano de abedul. Se incubó la enzima con los sustratos al 1 % y la actividad fue determinada mediante el siguiente protocolo. Para la medición de la actividad xilanolítica se detectaron azúcares reductores mediante el ensayo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Bailey, M. J., Biely, P., & Poutanen, K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology. 1992. Vol. 23(3): 257-270). 450 pL de una solución de xilano de haya (sustrato) al 1 % se pre incubaron en amortiguador citrato 50 mM pH 5,3 por 10 minutos a 50QC. Luego, se agregó 50 pL de las muestras, y se incubaron por 10 minutos (tiempo de reacción) a 50QC. La reacción se detuvo utilizando 750 pL de reactivo DNS (1 % ácido 3,5-dinitrosalicílico, 30% tartrato de sodio y potasio, y 1 .6% NaOH). Posteriormente, se incubó a 100QC por 10 minutos. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se centrifugaron a 8.600 g para eliminar el xilano residual, y en el sobrenadante se midió la absorbancia a 540 nm. Para la curva de calibración se utilizó xilosa en concentraciones de 0 a 20 mM. Una unidad (U) de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 pmol de azúcares reductores por minuto. Los resultados se presentan en la FIG. 8.
Para ambas enzimas la mayor actividad se presentó frente a arabinoxilano de centeno, seguido de arabinoxilano de trigo y una menor actividad frente al xilano de abedul y haya, lo que indica que ambas enzimas son más activas sobre xilanos con alto contenido de arabinosa. Además, y de acuerdo con los resultados de la FIG. 8, la eliminación de los 29 aminoácidos aumentó la actividad específica de XynAA29N respecto a XynA, en algunos casos (como en xilano de haya) duplicándola. Esto es coherente con lo observado previamente en la FIG. 5.
Determinación de productos de hidrólisis generados por XynA y XynAA29N a partir de diferentes sustratos
Para la determinar los productos de hidrólisis generados por la acción de las enzimas sobre los distintos sustratos, se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina. Los resultados para XynA (FIG. 9) muestran que la enzima genera xiloooligosacáridos de distinta longitud. Los principales productos de hidrólisis observados fueron xilobiosa, xilotriosa y xilotetraosa, pero no se observó liberación del monosacárido xilosa. Estos resultados indican que XynA es una endoxilanasa clásica.
Los resultados de este experimento para la enzima XynAA29N se presentan en FIG. 10. XynAA29N también genera xilooligosacáridos de distinta longitud, pero en este caso se observó además la liberación de xilosa, lo que sugiere que la eliminación de los 29 aminoácidos en el extremo amino terminal de la proteína produce un cambio en la acción de la enzima sobre el sustrato, transformando a la xilanasa en una enzima endoxilanasa/xilohidrolasa bifuncional.
Determinación de productos de hidrólisis generados por XynA y XynAA29N a partir de xilooligosacáridos lineales. Además de xilanos, se realizaron reacciones enzimáticas con xilooligosacáridos lineales y se analizaron los productos mediante cromatografía de capa fina. Los resultados se observan en la FIG. 1 1 . La xilobiosa no es hidrolizada por ninguna de las dos enzimas. En el caso de la xilotriosa se observa una mínima hidrólisis por parte de XynA. En el caso de XynAA29N, se observa una hidrólisis completa de la xilotetraosa, con una mayor producción de xilosa. En el caso de la xilotetraosa, se observa que tanto XynA como XynAA29N la hidrolizan, generando xilotriosa, xilobiosa y xilosa, pero XynAA29N parece tener una mayor actividad hidrolítica sobre este sustrato, generando como productos mayoritarios la xilobiosa y la xilosa.
Ejemplo 4. Aplicación de XynA y XynAA29N en panificación
Para estos experimentos, además de la enzima producida en la presente invención, se usó una xilanasa fúngica comercial (DIESTRO XF 6000, de Girona S.A, Chile), cuya dosificación recomendada por el fabricante es de 2 gramos por cada 100 Kg de harina (20 ppm). Por ello, para los experimentos de panificación, la enzima nativa de esta tesis (XynA) y su versión muíante (XynAA29N) se usaron en la misma dosificación.
Efecto de XynA y XvnAA29N sobre las características reolóqicas de la masa de pan
Se evaluó el efecto de las enzimas XynA y XynAA29N sobre las masas, mediante un análisis alveográfico. Para la medición de las características reológicas de la masa se utilizó un alveógrafo (Chopin, Francia). Este alveógrafo se compone de tres elementos: una mezcladora para la preparación de la masa, la cámara de fermentación, y la registradora de la curva (manómetro estándar).
Para la preparación de la masa en la mezcladora se adicionaron 250 gramos de harina, 138 ml_ de solución de cloruro de sodio (2,5%), y xilanasa (20 ppm). Luego se procedió al amasado, mezclando por un minuto, deteniendo el motor y separando con una espátula la masa que pegada en las paredes de la mezcladora. Posteriormente, se mezcló por seis minutos más. Los dos primeros centímetros de masa se cortaron y fueron desechados. La muestra restante se cortó en cinco pedazos y se pasó por encima el rodillo. Una vez uniformado el grosor de las muestras, estas fueron cortadas con un molde circular, colocando los cinco pedazos de masa en la cámara de fermentación del alveógrafo y dejándolos reposar durante 20 minutos a 25QC. Transcurrido este tiempo se colocó la primera muestra en el plato para la formación de la burbuja. Posteriormente, se abrió la válvula hidrostática y se dejó pasar aire a la masa, tomando la forma de un globo que crece progresivamente hasta su ruptura. Este último paso se repitió con las cuatro muestras restantes. Al abrir la válvula hidrostática, la registradora dibujó un diagrama. Una vez dibujadas los cinco diagramas, se obtuvo la media de las muestras analizadas y se calculó de la tenacidad (P, correspondiente a la capacidad de la masa para resistir a la deformación) y la extensibilidad (L, correspondiente al volumen máximo de aire que puede contener la burbuja de la masa; Método 54-30A, AACC Internacional 2000).
A partir de las curvas obtenidas en el diagrama, se calcularon los valores de tenacidad (P) y extensibilidad (L). Estos valores calculados se presentan en la Tabla 1 . En dicha tabla, cada valor corresponde al promedio de tres réplicas y su desviación estándar. Cuando los superíndices (a, b, c) son iguales, indican que no hay diferencias estadísticamente significativas (Prueba de Tukey, nivel de significancia de 0,05).
Tabla 1. Efecto de las xilanasas sobre la tenacidad y elasticidad de la masa.
Figure imgf000024_0001
(*) Se estableció como 100% el tratamiento sin enzimas.
La tenacidad (P) evalúa la resistencia a la deformación de la masa. Los resultados de la Tabla 1 indican que la adición de xilanasas a la harina conlleva a una disminución en el valor de este parámetro, indicando una disminución en la rigidez y en la formación de la red del gluten. En específico, los resultados muestran que XynA disminuye la tenacidad de la masa un 8,8%, mientras que el tratamiento con CghAD29N disminuye la tenacidad en cerca de 18%, diferencia significativa comparada con los demás tratamientos.
Por otro lado, la elasticidad (L) mide la capacidad que tiene la harina para ser estirada una vez mezclada con agua. La acción de las xilanasas sobre las masas generó un cambio de elasticidad, lo cual se ve reflejado en un aumento de este parámetro (Tabla 1 ). Todos los tratamientos mostraron un aumento en la elasticidad, en el caso de XynA aumenta cerca del 10%, similar al obtenido con la enzima comercial. En el caso del tratamiento con XynAA29N, la elasticidad de la masa aumento un 21 %.
En consecuencia, la enzima comercial y la enzima XynA exhiben características similares en las mejoras de la elasticidad y tenacidad de las masas, pero la enzima XynAA29N presenta características superiores en estos parámetros. Una posible explicación para este fenómeno son las temperaturas a las que son llevados los procesos de amasado (30QC). A esta temperatura, XynAA29N es mucho más activa que XynA, ya que la enzima mutante retiene el 90% de su actividad, mientras que la enzima nativa XynA retiene el 50% de la actividad. Otro factor importante es el perfil hidrolítico de la enzima XynAA29N. De acuerdo con estos resultados (FIG. 8) XynAA29N posee una mayor actividad sobre xilanos que poseen un alto contenido de arabinosa, similares a los encontrados en las harinas. Los resultados presentados sugieren que la disminución de los arabinoxilanos insolubles de la harina, gracias a la acción de XynAA29N, condujo a cambios en las interacciones entre las proteínas, el agua y los demás componentes de la masa, haciendo que ésta sea más extensible.
Efecto de XynA y XynAA29N sobre las características farinoqráficas de las harinas
Los farinogramas de Brabender son curvas standard que permiten observar la cantidad de agua que necesita una harina para obtener la consistencia ideal, el tiempo de amasado adecuado para obtener una masa correctamente desarrollada y la estabilidad de la masa. Por tanto, este experimento permitió determinar la absorción de agua, el tiempo de desarrollo de la masa y la estabilidad.
Para evaluar el comportamiento de la masa durante el amasado, se empleó un Farinógrafo Brabender® (C.W. Brabender Instruments, Inc., Alemania). Para ello, en la amasadora del equipo se incorporó 50 gramos de harina, se añadió 30 mL de agua y xilanasa (20 ppm). La mezcla se amasó a velocidad constante de 100 r.p.m., registrando la resistencia que opone la masa al trabajo mecánico continuo en función del tiempo. En primer lugar, se determinó la cantidad de agua necesaria para que la masa alcance una consistencia previamente determinada en 500 unidades Brabender® (valor estandarizado de consistencia máxima). Luego, a partir del diagrama que se obtiene del farinograma se obtuvieron los parámetros relacionados con la aptitud industrial de la harina.
Se calculó el tiempo de desarrollo de las masas, así como su estabilidad. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Efecto de la adición de xilanasas sobre los parámetros farinográficos.
Figure imgf000026_0001
Los resultados indican que al agregar la enzima comercial y la enzima XynA, se promovió una disminución significativa en el tiempo de desarrollo y tolerancia de la masa al sobreamasado. Los resultados fueron más drásticos al adicionar la enzima XynAA29N. Con este tratamiento, se requirió menor volumen de agua en la mezcla para generar una consistencia de 500 Brabender®. De igual manera, disminuyó de manera significativa la tolerancia al amasado y el desarrollo de la red de gluten se mantuvo como en todos los tratamientos enzimáticos.
Figure imgf000027_0001
Los panes se elaboraron utilizando la siguiente formulación: 200 gramos de harina de trigo (Molino Puente Alto), 8 gramos de leche descremada en polvo (Svelty®, Nestlé), 6 gramos de manteca (Astra®), 6 gramos de levadura fresca (Lefersa®), 4 gramos de cloruro de sodio (Merck®) y 8 gramos de azúcar común (IANSA®) y 1 12 mL de agua. Para los tratamientos con las enzimas, éstas se adicionaron a 20 ppm. Los ingredientes fueron mezclados y amasados durante 7 min con una amasadora (Kitchenaid®). Posteriormente, la masa resultante se pre fermentó durante 105 min a 30QC, en una cámara con una atmósfera de 96% de humedad relativa. Luego, la masa fue desgasificada manualmente y se llevó de nuevo a la cámara de fermentación durante otros 50 minutos en las mismas condiciones. Transcurrido este tiempo, la masa desgasificada fue moldeada y porcionada en trozos de 125 gramos con ayuda de una espátula. Los trozos de masa fueron colocados en moldes para una fermentación final de 25 min. Por último, las piezas se hornearon a 215QC por 25 min en un horno a gas (Maigas®). Cada ensayo de panificación fue realizado por triplicado.
La medición del volumen del pan se determinó por desplazamiento de semillas de cañóla, después de 1 h de horneado. El volumen específico se obtuvo dividiendo el volumen de la muestra por su peso. La FIG. 12 muestra el resultado de esta elaboración de pan.
Después de 1 hora de terminado el horneado, se determinó volumen, peso, y volumen específico de los panes (razón volumen/peso). Los resultados se presentan en la Tabla 3. En dicha tabla, las columnas corresponden al promedio de tres réplicas y las barras a su desviación estándar. Los superíndices (a, b, c) iguales indican que no hay diferencias estadísticamente significativas.
Tabla 3. Efecto de las xilanasas sobre el volumen absoluto, peso y volumen especifico del pan.
Figure imgf000028_0001
(*) Se estableció como 100% el tratamiento sin enzimas.
Los resultados de la Tabla 3 indican que la adición de las xilanasas causó un incremento significativo del volumen del pan. La enzima XynA y la enzima comercial produjeron un aumento similar (4%) en el volumen del pan. Por otro lado, en los panes tratados con la enzima XynAA29N se observó un mayor volumen de 6,1 % con relación al control y un 2% más al ser comparado con la xilanasa comercial y XynA. También se obtuvo una mayor diferencia en el volumen especifico del pan, ya que el tratamiento con XynAA29N aumenta cerca del 10% más en comparación con el pan que no fue tratado con enzima, y un 2% y 5% con la xilanasa comercial y XynA respectivamente, dando origen a piezas más grandes y de menor peso.
En conclusión, el uso de xilanasa modificada XynAA29N de la presente invención, mejora los parámetros alveográficos (tenacidad y elasticidad) de las masas, lo que permite obtener panes con mayor volumen específico al ser comparado con la enzima nativa y la enzima comercial.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido para preparar un producto alimenticio, CARACTERIZADO porque tiene actividad xilanasa y comprende una secuencia aminoacídica que se selecciona del grupo que consiste de:
la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y
una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa.
2. El polipéptido de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la secuencia aminoacídica es codificada por una secuencia nucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de:
la secuencia nucleotídica de la SEC ID No. 3; y
una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de la SEC ID No. 3.
3. Una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido con actividad xilanasa para preparar un producto alimenticio, CARACTERIZADA porque dicha secuencia se selecciona del grupo que consiste de:
la secuencia nucleotídica de la SEC ID No. 3; y
una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de la SEC ID No. 3.
4. Un ingrediente para preparar un producto alimenticio, CARACTERIZADO porque contiene un polipéptido que tiene actividad xilanasa cuya secuencia aminoacídica se selecciona del grupo que consiste de:
la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y
una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa.
5. Un proceso para preparar un producto alimenticio, CARACTERIZADO porque comprende las etapas de: proveer un ingrediente que contienen un polipéptido que tiene actividad xilanasa cuya secuencia aminoacídica se selecciona del grupo que consiste de:
• la secuencia aminoacídica de la SEC ID No. 1 ; y · una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 80% de similitud con la secuencia de la SEC ID No. 1 y que mantiene su actividad xilanasa;
mezclar dicho ingrediente con una harina, un líquido y cualquier otro ingrediente apropiado;
- amasar dicha mezcla hasta obtener una masa; y
cocer dicha masa para obtener un producto alimenticio.
6. El proceso de la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque dicha harina se selecciona del grupo que consiste de harina de trigo, harina de mandioca, harina de cebada, harina de arroz, harina de centeno, harina de maíz, harina de quinua, y harina de sarraceno.
7. El proceso de la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque dicho líquido se selecciona del grupo que consiste de agua, soluciones salinas, leche e infusiones.
8. El proceso de las reivindicaciones 5 a 7, CARACTERIZADO porque dicho producto alimenticio es pan.
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