ES2315357T3 - Recuperacion de la actividad enzimatica de virus envueltos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de recuperación de una actividad enzimática a partir de virus envueltos en una muestra biológica que contiene enzimas no protegidas, que comprende las etapas de a) incubar la muestra biológica con una sustancia que modifica cisteínas para destruir la actividad de las enzimas no protegidas a la vez que se mantiene la actividad enzimática vírica dentro de la envoltura del virus b1) retirar las partículas del virus envuelto de la mezcla de incubación, o b2) inactivar la sustancia que modifica cisteínas con una sustancia inactivadora que evite la lisis de la envoltura del virus, c) lisar la envoltura del virus con un tampón de lisis para liberar las enzimas del virus, y d) recuperar la enzima liberada del virus del tampón de lisis.

Description

Recuperación de la actividad enzimática de virus envueltos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la recuperación de la actividad enzimática de virus envueltos, es decir, determinación de enzimas empaquetadas en virus envueltos. El procedimiento se desarrolla especialmente para muestras biológicas que contienen enzimas no protegidas además de para los virus envueltos.

Antecedentes

Un ejemplo clásico de los problemas en este campo se encuentra durante la determinación de la transcriptasa inversa (TI) retroviral en extractos celulares o en fluidos de cultivos celulares. Durante la transcripción inversa, la TI produce una copia de ADN del ARN vírico. Un ensayo convencional de la actividad TI se realiza utilizando una construcción artificial molde-cebador y un desoxinucleótido trifosfato tritiado como sustrato nucleotídico. El par molde/cebador poli(rA)/oligo(dT) es la combinación más eficaz y utilizada para la determinación del VIH, así como para otras TI retrovirales (Baltimore-71, Lee y col.-87) Inicialmente se reconoció que algunas enzimas celulares que polimerizan ADN enmascaran los resultados de este tipo de sistema de ensayo produciendo cantidades de producto cuantificables.

Se han identificado al menos nueve tipos diferentes de ADN polimerasa en células eucarióticas. La polimerasa \alpha se considera la responsable de la replicación del ADN durante la división celular, la \beta se considera como la principal polimerasa implicada en la reparación del ADN y la \lambda es responsable de la síntesis de ADN en las mitocondrias. Cada una de las polimerasas celulares aparece en formas diferentes y asociada a proteínas diferentes. Sus propiedades enzimáticas varían tanto con su forma molecular como con el tipo celular original (para una revisión, véase Hübscher y col. 2000). Además, las células pueden contener enzimas derivadas de virus infecciosos o genes de virus endógenos que codifican una ADN polimerasa vírica. Entre las ADN polimerasas celulares, la ADN polimerasa \alpha es menos propensa a utilizar prA como molde, pero existen determinadas especies moleculares de esta enzima que pueden copiar prA de forma eficaz (Goulian y Grimm 1990, Yoshida y col. 1981).

De hecho, las diferentes polimerasas representan un problema de especificidad durante la cuantificación de la TI retroviral. En la literatura pueden encontrarse muchos procedimientos para sortear este problema. La aproximación más obvia es separar el virus de las proteínas celulares. En este contexto se han usados diversos procedimientos, como centrifugación o adsorción de los viriones en receptores o anticuerpos específicos. Un problema común que aparece cuando se purifica material que contiene grandes cantidades de componentes celulares y cantidades pequeñas de virus es que no puede excluirse la purificación conjunta de pequeñas cantidades de polimerasa celular. Además, desde un punto de vista práctico, no es interesante procesar grandes cantidades de muestras con procedimientos de separación relativamente engorrosos.

Otra estrategia es diseñar condiciones de ensayos enzimáticos específicas para una isoenzima que excluyan más o menos la detección de la polimerasa celular, es decir, la polimerasa \lambda. Esto puede lograrse usando inhibidores, iones metálicos o pares molde/cebador alternativos. Por ejemplo, se sabe que el poli(2'-O-metil-rC)_{n} oligo(dG)_{12-18} es un sustrato muy específico para las TI retrovirales. El aumento de la especificidad alcanzado por este tipo de procedimiento, sin embargo, normalmente está dificultado por la correspondiente disminución de la velocidad de la reacción y la posterior reducción en la sensibilidad de detección de la enzima que se desea cuantificar.

Recientemente los autores de la invención han desarrollado un procedimiento para la cuantificación de la TI del VIH en una muestra de plasma de personas infectadas. El procedimiento se basa en la unión del virus a un gel con un intercambiador iónico inmovilizado. Los anticuerpos y las sustancias perturbadoras se eliminan mediante el lavado y la TI enzimáticamente activa se recupera mediante la lisis del virus inmovilizado con un detergente no iónico (Gatu y col., 2000). La cantidad de TI recuperada se cuantifica finalmente con un ensayo de sensibilidad para TI basado en el uso de prA inmovilizado cebado con odT. Cuando se procesó el plasma control de donantes de sangre sanos en este sistema los autores encontraron pequeñas cantidades de actividad TI en las fracciones purificadas.

Investigaciones adicionales revelaron que el plasma con EDTA sin procesar de seres humanos sanos contenía cantidades comparativamente grandes de esta actividad, que también era abundante en extractos de la fracción de linfocitos del mismo tipo de muestras. En la Tabla 1 se muestran algunas características de esta enzima sin clasificar. La cantidad de actividad recuperada a partir de del sistema de separación de los autores de la invención tras la "inmovilización del virus" era inferior a la milésima parte de la actividad total en el plasma, aunque suficiente para enmascarar gravemente la detección de cantidades pequeñas de TI del VIH.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una solución al problema de especificidad descrito anteriormente, aunque también es aplicable, a nivel general, a la detección de todas las enzimas contenidas en virus envueltos. Ejemplos de familias de virus envueltos y algunas especies que infectan al hombre dentro de las familias incluyen, Poxviridae, p. ej., virus de la variolovacuna y de la viruela, Iridoviridae, Herpesviridae, p. ej., herpes simple, virus de la varicela, citomegalovirus y virus de Epstein-Barr, Togaviridae, p. ej., virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis transmitido por la garrapata, virus de la rubéola y virus de la encefalitis tropical, Coronaviridae, p. ej., coronavirus humano, Paramyxoviridae, p. ej. virus de la parainfluenza, virus de la paperas, virus del sarampión y virus sincitial respiratorio, Rabdoviridae, p. ej., virus de la estomatitis vesicular y virus de la rabia, Filoviridae, p. ej., virus de Marburgo y virus del Ébola, Orthomyxoviridae, p. ej., virus A y B de la gripe, Bunyaviridae, p. ej., virus Bwamba, virus de la encefalitis de California, virus de la fiebre de la mosca de los arenales y virus de la fiebre del valle del Rift, Arenaviridae, p. ej., virus LCM, virus de Lassa y virus Junín, Hepnadnaviridae, p. ej., virus de la hepatitis B y Retroviridae, p. ej., HTLV y VIH.

El procedimiento de la invención se basa en el uso de un agente químico que modifica proteínas para destruir la actividad de las enzimas solubles no protegidas, es decir, enzimas libres y enzimas asociadas con, p. ej., proteínas, componentes celulares u orgánulos, pero no protegidas por una envoltura vírica. La capacidad de un agente químico para penetrar la envoltura vírica está relacionada con sus propiedades hidrófobas. Puesto que la envoltura vírica proporciona protección frente a la acción del agente químico elegido, es posible eliminar, o alternativamente inactivar el agente químico reactivo, lisar el virión y cuantificar la actividad de la enzima vírica liberada. Existen gran cantidad de reactivos más o menos específicos de sitio disponibles para la modificación de proteínas (véase Means y Feeney, 1990 para una revisión).

Para el procedimiento de la invención se han seleccionado sustancias que modifican cisteína como agentes químicos que modifican proteínas para destruir la actividad de enzimas no protegidas. La sensibilidad a N-etilmaleimida se ha utilizado ampliamente para la clasificación de las ADN polimerasas celulares. Normalmente, el agente químico se añade directamente a la mezcla de reacción e "inhibe" de forma eficaz todas las ADN polimerasas de mamíferos, excepto la ADN polimerasa \beta. La cantidad de cisteínas en la secuencia de aminoácidos de consenso de las diferentes TI retrovirales varía considerablemente, p. ej., la TI del VIH-1 tiene sólo 2, la del VIH-2 tiene 3, la del virus de la leucemia de murino (MULV) tiene 8, mientras que la del virus del sarcoma/mieloblastosis aviar tiene 12 cisteínas en las subunidad \beta. Por tanto, puede esperarse que la sensibilidad de las TI víricas a la modificación de las cisteínas varíe considerablemente. Se han explorado los efectos de la modificación de los restos de cisteína en las TI del VIH y, al menos, la actividad ADN polimerasa de las TI tanto de VIH-1 como de VIH-2 eran bastante resistentes (Hizi y col., 1992). Considerando la enorme variación registrada entre las diferentes cepas de VIH no es probable, sin embargo, que sea cierto para todos los aislados de VIH.

Más específicamente, la presente invención está dirigida a un procedimiento para la recuperación de una actividad enzimática a partir de un virus envuelto en una muestra biológica que no contiene enzimas protegidas, que comprende las etapas de:

a) incubar la muestra biológica con una sustancia que modifica cisteínas para destruir la actividad de las enzimas no protegidas mientras que se mantiene la actividad enzimática vírica dentro de la envoltura del virus,

b1) retirar las partículas del virus envuelto de la mezcla de incubación o

b2) inactivar la sustancia que modifica cisteína con una sustancia inactivadora que evita la lisis de la envoltura del virus,

c) lisar la envoltura del virus con un tampón de lisis para liberar las enzimas del virus y,

d) recuperar la enzima liberada del virus a partir del tampón de lisis.

En una realización del procedimiento de la invención, los virus envueltos se seleccionan entre el grupo seleccionado a partir de la familia Retroviridae, y se seleccionan especialmente entre lentivirus, virus HTLV/BLV, retrovirus tipo D de mamífero o retrovirus tipo C de mamíferos.

En una realización actualmente preferida, el lentivirus es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

En otra realización, la actividad enzimática vírica recuperada es la actividad transcriptasa inversa (TI).

En otra realización más del procedimiento de la invención, la muestra biológica es una muestra de fluido corporal. Los ejemplos de fluidos corporales son orina, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido pleural, líquido ascítico y, especialmente, sangre, plasma y suero.

En una realización adicional del procedimiento de la invención, la sustancia que modifica cisteína es una sustancia hidrosoluble no lipofílica, como N-etilmaleimida, timerosal, p-hidroximercuribenzoato, ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico),2-aminoetil 2'-aminoetano-tiosulfonato, ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico y metil metano-tiosulfonato.

En otra realización adicional, la sustancia inactivadora es un agente reductor débil de bajo peso molecular, como cisteína, cisteamina, ácido mercaptosuccínico o glutatión.

La invención también está dirigida a una presentación comercial para realizar en el laboratorio las etapas de recuperación de una actividad enzimática a partir de virus envueltos presentes en una muestra biológica, que opcionalmente contiene instrucciones escritas y/o datos y una sustancia que modifica cisteínas, como N-etilmaleimida, acetato fenilmercúrico, timerosal, p-hidroximercuribenzoato o ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico). La presentación también contiene una matriz de unión del virus, como una matriz de intercambio aniónico, o una sustancia inactivadora de la sustancia que modifica cisteínas mientras que impide la lisis de la envoltura del virus, como cisteína, cisteamina, ácido mercaptosuccínico o glutatión, y un tampón de lisis, como un tampón compatible con el ensayo enzimática que incluya un detergente.

A continuación, la invención se ilustrará mediante una descripción general de experimentos, ejemplos y figuras, aunque debe entenderse que la invención no se limita a las realizaciones descritas.

Descripción general de los experimentos

Los procedimientos siguientes pretenden ilustrar la invención sin limitar su uso. Pueden usarse dos realizaciones diferentes de la invención con dos propósitos diferentes. El protocolo I) se utiliza principalmente para muestras que contiene anticuerpos que bloquean la actividad enzimática (es decir, plasma de un paciente con VIH después de la seroconversión) que deben eliminarse antes de la determinación de la actividad enzimática vírica. La etapa de inactivación de la polimerasa en el protocolo siguiente se realiza en una incubación independiente. Alternativamente, también puede hacerse durante la misma etapa cuando el virión se une al gel. Esto se realiza añadiendo la sustancia que modifica cisteína directamente a la mezcla de plasma/suspensión del gel o uniendo primero la sustancia al gel y, a continuación, añadiendo las muestras de plasma. La concentración necesaria de la sustancia puede variar con el procedimiento. El protocolo II) puede utilizarse para muestras esencialmente sin factores perturbadores, como anticuerpos que bloqueen la enzima, por ejemplo, sueros en el estadio de VIH agudo.

I) Protocolo para la determinación de la TI retroviral a partir de un material que contiene anticuerpos que bloquean TI, basado en la destrucción de enzimas celulares solubles tras el aislamiento de la TI vírica en minicolumnas

1) Marcar los tubos de plástico de 5 ml que se van a usar. Colocarlos en una caja de Nalgene. Añadir 1 ml de muestra (p. ej., plasma tratado con EDTA de individuos infectados por VIH) a cada tubo marcado. Añadir 100 \mul de una solución 66 mM de ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) en agua tamponada, someter a vortización e incubar las muestras durante una hora a temperatura ambiente.

La actividad de las enzimas plasmáticas libres se destruye durante este procedimiento mientras que las enzimas contenidas en los viriones permanecen intactas. A continuación, los viriones pueden purificarse del ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico), anticuerpos que bloquean la actividad enzimática y de otras sustancias que puedan interferir con la cuantificación de la TI vírica mediante varios procedimientos de separación. El siguiente protocolo se basa en el uso de gel Fractogel® EMD TMAE Hicap.

2) Suspender cuidadosamente el gel de separación y transferir 1.500 \mul de la suspensión del gel a cada tubo de pretratamiento de muestra.

3) Incubar las muestras con la suspensión del gel durante una hora a temperatura ambiente con los tubos hacia abajo en un agitador orbital.

4) Marcar el número deseado de minicolumnas de plástico de 15 ml para identificar las muestras que se están analizando. Montar las columnas en un sistema de lavado de columnas, por ejemplo, un colector de extracción al vacío en fase sólida Supelco Visiprep. Transferir el contenido de los tubos de unión a sus columnas correspondientes. Antes de transferirlos, someter a vortización el tubo brevemente para distribuir uniformemente el gel.

5) Cuando estén llenas todas las columnas, aplicar el vacío y aspirar hasta que se sequen los geles. Desconectar el vacío e iniciar el lavado llevando cada columna con 9 ml de tampón A. Cuando todas las columnas estén llenas, aplicar el vacío y aspirar hasta que se sequen los geles.

6) Repetir la etapa 5 tres veces más, hasta un total de cuatro lavados. Aspirar hasta que los geles se sequen en cada lavado. Después del aspirado hasta sequedad del gel tras el cuarto lavado, desconectar el vacío y seguir con la etapa 7.

La etapa de lavado elimina del sistema los anticuerpos no unidos que bloquean las TI y el ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico).

7) Añadir a todos los geles secos 9 ml de tampón acondicionador (B). Aplicar vacío y secar los geles.

8) Repetir la etapa 7. Antes de desconectar el vacío, controlar que se ha eliminado todo el tampón acondicionador (B) de todos los geles.

9) Despegar la parte superior del sistema de lavado de la columna. Colocar el soporte para tubos con los tubos marcados en un recipiente limpio. Colocar de nuevo la parte superior del sistema. Controlar que las pequeñas conexiones de cada columna se insertan en sus correspondientes tubos.

10) Añadir 300 \mul de tampón de lisis (C) a cada columna. Dejar que el tampón permanezca en la columna durante cinco minutos. A continuación, aplicar lentamente el vacío y aspirar hasta que se sequen los geles. Esto proporcionará aproximadamente 300 \mul de lisado de virus en cada tubo.

La actividad TI recuperada en los lisados de la etapa 10 esencialmente no contiene anticuerpos que bloquean TI ni actividad polimerasa celular, y puede cuantificarse con una prueba sensible a la actividad TI, por ejemplo, el HS-kit Lenti RT de Cavidi, que se basa en el procedimiento descrito por Ekstrand y col., 1996.

Nota: las enzimas TI que no son sensibles a las sustancias que modifican cisteína, por ejemplo, las TI del VIH-1 de tipo natural pueden comprobarse opcionalmente en presencia de hasta 5 mM de ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico).

Las enzimas sensibles, como la TI de MuLV y TI de determinadas cepas de VIH-1 resistentes al tratamiento necesitan, por otro lado, la adición de un agente reductor de sulfhidrilo, por ejemplo, cisteína o cisteamina, al tampón de lisis.

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II) Protocolo para la determinación de la actividad TI en muestras esencialmente sin anticuerpos que bloquean la enzima, por ejemplo, plasma en estadio agudo de VIH o sobrenadante de cultivos víricos, basado en la inactivación de enzimas celulares solubles seguido de la inactivación del ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)

1) Se mezclan muestras de 200 \mul (por ejemplo, plasma en estadio de VIH agudo) con 20 \mul de ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) 33 mM en agua tamponada. Las muestras se incuban en un agitador orbital a temperatura ambiente durante una hora.

2) Se añade un agente reductor de sulfhidrilo, por ejemplo 20 \mul de cisteamina 33 mM en agua y las muestras se incuban en un agitador orbital a temperatura ambiente durante otros 30 minutos.

3) Hacer cuatro diluciones en serie 1:4 de las muestras en tampón compatible con el ensayo de TI que contiene detergente, por ejemplo tritón X-100. Ahora, los viriones se lisan y puede determinarse la actividad TI de cada dilución utilizando un ensayo sensible a TI, por ejemplo, el HS-kit Lenti RT de Cavidi.

4) La cantidad de actividad TI en la muestra original se calcula a partir de los valores del intervalo de dilución donde exista una relación lineal entre la dilución de la muestra y la cantidad de producto formado.

Ejemplos Materiales

Gel de separación: por ejemplo, Fractogel® EMD TMAE o Fractogel® EMD TMAE Hicap en ácido 2-(N Morfolino)etanosulfónico (MES) 200 mM, pH 5,4, yoduro potásico 275 mM y heparina a 80 UI/ml.

Minicolumnas, por ejemplo, Biorad Poly-Prep® (7311553)

Sistema de lavado de minicolumnas, por ejemplo, colector de extracción al vacío en fase sólida Supelco Visiprep.

Tubos de plástico, por ejemplo, tubos criogénicos de 4,5 ml de Nunc.

Agente que modifica cisteína, por ejemplo ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) 66 mM en agua tamponada con tris(hidroximetil)aminometano 0,4 M (pH 6,8).

Agente reductor de sulfhidrilo débil, por ejemplo cisteamina 33 mM en agua.

Tampón de lavado (A): MES 20 mM. pH 6,0, acetato potásico 500 mM (KAc).

Tampón acondicionador (B): un tampón compatible con el ensayo de TI, por ejemplo, ácido N-(2-hidroxietil-piperazina-N'-(2-etanosulfónico) (Hepes), pH 7,6, KAc 25 mM, cloruro de magnesio (MgCl_{2}) 20 mM, ácido etilénglicol-bis(\beta-aminoetil éter)N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 0,2 mM, espermina 2 mM y albúmina sérica bovina a 0,5 mg/ml inactivado por calor.

Tampón de lisis (C): tampón compatible con el ensayo de TI que incluye un detergente, por ejemplo, t-octofenoxipolietoxietanol (Tritón X-100) al 1%, un estabilizador enzimático, por ejemplo, oligo(dT_{22}) a 13 ng/ml, sulfato de dextrano a 0,025 mg/ml y los mismos componentes que el tampón acondicionador (B). Se añade opcionalmente un agente reductor de sulfhidrilo, por ejemplo, cisteamina 0,2 mM cuando los virus se procesan con TI que son sensibles a la oxidación/modificación de SH.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un diagrama que muestra el efecto de la preincubación con timerosal sobre la actividad de diferentes polimerasas en suero y plasma. TI recombinante del VIH-1 de tipo natural (\blacksquare), TI recombinante del VIH-1 mutante (Y181C) (\lozenge), TI del virus Jaagsiekte (\ding{115}), TI del VIF (\medcirc), TI del virus de la leucemia bovina (VLB) (\blacklozenge), TI del retrovirus endógeno porcino (RVEP) (\medbullet) y una muestra de plasma de un donante de sangre sano (\Box).

La Fig. 2 muestra dos diagramas A y B de la recuperación de la actividad TI vírica de plasma con VIF inoculado y destrucción selectiva de la actividad TI endógena. El plasma tratado con EDTA con linfocitos rotos procedentes de un donante de sangre sano (columnas de la izquierda) y VIF diluida en suero de ternera fetal (STF) inactivado (columnas de la derecha) incubados con: A) ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) y b) timerosal. Las actividades de TI recuperadas se representaron frente a la concentración de las sustancias.

La Fig. 3 es un diagrama que muestra la eliminación de la actividad polimerasa en las muestras de plasma procedentes de donantes de sangre sanos.

La Fig. 4 muestra un diagrama de una correlación entre la TI del VIH recuperada de plasma humano según la invención y ARN vírico cuantificado con PCR de ARN.

La Fig. 5 muestra diagramas de protocolos alternativos para el tratamiento de las muestras de plasma de pacientes infectados por VIH. La etapa de inactivación de la polimerasa en el protocolo I se realizó: A) en una incubación independiente, B) durante la misma etapa que la unión del virión al gel, C) como en B, pero el gel se conservó con la sustancia, D) como en C, pero el gel se lavó antes de su uso. Actividad TI en plasma (\blacklozenge), actividad TI del VIH (\medbullet).

La Fig. 6 muestra diagramas de la cuantificación de la TI viral en muestras con actividad TI elevada endógena sin purificación. El plasma tratado con EDTA procedente de donantes de sangre sanos (A), virus de VIF en STF inactivado (B) y en medio de cultivo celular (C).

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Ejemplo 1 Algunas propiedades de una ADN polimerasa de plasma humano

Se analizó el efecto de la adición de los componentes indicados a la mezcla de reacción de TI desprovista de cebador (HS-kit Lenti RT de Cavidi). Como fuente de enzima se usó el plasma con EDTA procedente de dos donantes de sangre sanos (1 \mul/ensayo), TI de VIH-1 recombinante o TI de VIF originario de cultivos celulares. Los resultados se presentan en la Tabla 1.

La actividad polimerasa del plasma humano era dependiente del cebador, sensible a la inhibición por el ddNTP complementario al molde, pero insensible a análogos de pirofosfato.

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Ejemplo 2 Capacidad de diversos agentes que modifican cisteínas para destruir la actividad de la polimerasa de plasma humano

Se mezclaron 50 \mul de muestras de plasma con EDTA humano con muestras de 50 \mul procedentes de una dilución seriada de cada sustancia. Las muestras se incubaron durante una hora en un agitador orbital. A continuación, cada muestra se diluyó veinte veces y se determinó la actividad polimerasa residual con el HS-kit Lenti RT de Cavidi®. La actividad polimerasa a cada concentración de la sustancia se recalculó en porcentajes de un control constituido por plasma incubado en ausencia de sustancia modificadora, se representó frente a la concentración de sustancia y se determinó a partir de la gráfica la concentración necesaria de sustancia para la reducción del 50% de la actividad.

El virus VIH en plasma humano desprovisto de actividad TI endógena se trató con 5 mM de la sustancia indicada según el "Protocolo para la determinación de la TI retroviral a partir de material que contiene anticuerpos bloqueantes de TI". La recuperación de la actividad TI del VIH se determinó con el HS-kit Lenti RT de Cavidi®. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

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Ejemplo 3 Efecto de la incubación con timerosal en diferentes polimerasas de suero y plasma

TI recombinante de VIH-1 de tipo natural (\blacksquare), TI recombinante de un mutante de VIH-1 resistente a nevirapina (Y181C) (\lozenge), TI del virus Jaagsiekte (JSV) procedente de un cáncer pulmonar de oveja (\ding{115}), RI del virus de la leucemia felina (VIF) (\medcirc), TI del virus de la leucemia bovina (VLB) (\blacklozenge) y TI del retrovirus endógeno porcino (RVEP) (\medbullet) derivada de un cultivo celular se diluyeron en suero de ternera fetal inactivado por calor. Las diferentes preparaciones de enzimas víricas y una muestra de plasma con EDTA procedente de un donante de sangre sano (\Box) se incubaron con la concentración indicada de timerosal a temperatura ambiente (22ºC) durante 60 minutos. Todas las muestras se diluyeron 100 veces en un tampón compatible con el ensayo de TI y, a continuación, se determinó la actividad TI residual en cada muestra. Se usaron tres ensayos de TI, adaptado cada uno al tipo de TI cuantificado: las TI de VIH-1, JSV y VIF se determinaron con el HS-kit Lenti RT de Cavidi®, la TI del VLB con el kit HS de TI de HTLV de Cavidi®, y las TI de RVEP y de plasma humano con el HS-kit Mn^{2+} RT de Cavidi®. Los resultados se muestran en un diagrama en la Fig. 1.

Las siete enzimas estudiadas mostraban diferencias notables de sensibilidad al tratamiento con timerosal. Las enzimas más sensibles eran la TI del mutante Y181C del VIH-1 y la TI del VIF. La concentración de timerosal necesaria para una destrucción significativa de la enzima aumentaba entre las TI de plasma humano, TI de BLV y TI de PERV. Dos enzimas, la TI del VIH-1 de tipo natural y la TI de JSV, eran totalmente resistentes.

Ejemplo 4 Recuperación de la actividad TI vírica de plasma con VIF inoculado y destrucción selectiva de la actividad TI endógena

El plasma con EDTA con linfocitos rotos procedente de un donante de sangre sano y VIF diluido en suero de ternera fetal inactivado (desprovisto totalmente de actividad TI del plasma) se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con la concentración indicada de: A) ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico), B) timerosal. Las muestras se separaron según el "Protocolo para la cuantificación de la TI retroviral de material que contiene anticuerpos que bloquean TI". Las actividades TI recuperadas se determinaron con un ensayo de TI (HS kit Lenti RT de Cavidi). Cada actividad se recalculó como el porcentaje de un control procesado de forma idéntica que consistía en la misma preparación incubada sin ninguna sustancia reactiva con sulfhidrilo. La recuperación de la TI del VIF a partir de este control fue el 74% de la actividad en la muestra original, el valor correspondiente para la TI en el plasma humano fue del 0,015%. Véase la Fig. 2, en la que las columnas de la izquierda pertenecen al plasma de donantes de sangre y las columnas de la derecha son de virus VIF en suero de ternera fetal.

La incubación con ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) a concentraciones superiores a 0,4 mM eliminó totalmente con la actividad TI del plasma humano sin disminuir la recuperación de la TI asociada a viriones del VIF.

Fueron necesarias concentraciones mayores de timerosal (>3 mM) para lograr un efecto similar sobre la TI del plasma. El timerosal a este intervalo de concentración redujo significativamente la recuperación de TI del VIF.

Ejemplo 5 Eliminación de la actividad polimerasa en muestras de plasma de donantes de sangre sanos

Se procesaron dos grupos duplicados de muestras de 1 ml de plasma con EDTA procedentes de 21 donantes de sangre sanos según el "Protocolo para la determinación de la TI retroviral de material que contiene anticuerpos que bloquean TI". Se omitió el tratamiento con ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (etapa A) en un grupo de muestras y se incluyó en el otro. La cantidad de actividad TI recuperada de cada muestra se determinó usando un ensayo de TI durante una noche usando el HS-kit Lenti RT de Cavidi®. Véase la Fig. 3, en la que los grupos de la izquierda se corresponden con muestras no tratadas, procesadas según el protocolo. Los grupos de la derecha son las mismas muestras procesadas después del tratamiento. Los controles de la separación, por ejemplo, la separación de la muestra de tampón de aplicación, presentaban valores de entre 262 y 1.100 urf/hora (unidades relativas de fluorescencia/hora). El intervalo de detección del fluorímetro era de hasta aproximadamente 1.800.000 urf.

Ejemplo 6 Correlación entre la actividad TI de VIH recuperada del plasma humano según la invención y ARN vírico cuantificado mediante PCR de ARN

Se procesaron muestras de 1 ml de plasma con EDTA procedente de individuos infectados por VIH según el "Protocolo para la determinación de TI retroviral a partir de material que contiene anticuerpos que bloquean TI", y la cantidad de actividad TI recuperada de cada muestra se determinó en un ensayo para TI durante toda la noche usando el HS-kit Lenti RT de Cavidi®. Las actividades TI obtenidas se recalcularon en pg de TI de VIH-1 según una curva estándar. La cantidad de ARN del VIH-1 en cada muestra se determinó mediante una PCR del ARN del VIH-1 (Roche, Amplicore). La gráfica proporcionada en la Fig. 4 se limita a las muestras con valores de PCR >500
copias/ml.

Se encontró una fuerte correlación entre la cantidad de TI recuperada del plasma según la invención y la cantidad medida de ARN del VIH con PCR (r=0,93, n=33, p<<0,001).

Ejemplo 7 Protocolo alternativo para el tratamiento de muestras de plasma de pacientes infectados por VIH

La fase de inactivación de la polimerasa del "Protocolo para la determinación de TI retroviral a partir de material que contiene anticuerpos que bloquean TI" se realizó de cuatro formas: A) en una incubación independiente del plasma y la sustancia, B) en la misma incubación en la que el virión se une al gel, C) la sustancia se incluyó en la suspensión del gel durante el almacenamiento y se usó el gel pretratado para el aislamiento de la TI. D) la sustancia se unió primero al gel, la sustancia no unida se eliminó mediante lavado y el gel tratado se usó según el protocolo. Los resultados se presentan en la Fig. 5. Actividad TI en plasma (\blacklozenge), actividad TI del VIH (\medbullet).

Se encontró que las cuatro alternativas eran útiles, es decir, la actividad TI en plasma se inactivaba sin afectar a la actividad TI del VIH, pero varió la cantidad de sustancia necesaria para la eliminación cuantitativa de la actividad polimerasa en plasma humano.

Ejemplo 8 Recuperación de la actividad polimerasa en plasma después del tratamiento con diferentes agentes que modifican cisteínas

Se incubó primero un grupo de muestras de plasma humano (60% de plasma en agua) con 3 mM de la sustancia que modifica cisteínas indicada o agua (como control) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se añadieron diluciones seriadas de cinco sustancias potencialmente reactivadoras y las muestras se incubaron durante otra hora. Finalmente, cada muestra se diluyó a 1:20 y se determinó la actividad TI residual con el HS-kit Lenti RI de Cavidi®. La reducción total en la concentración de la sustancia entre la incubación de la muestra y el ensayo de TI fue de 200 veces. Las actividades TI recuperadas se recalcularon como el porcentaje de actividad de un control constituido por plasma incubado en ausencia de adiciones durante ambas etapas de incubación. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Los tres agentes que modifican cisteínas probados mostraron capacidad para inactivar completamente la actividad TI en plasma. Sin embargo, se observó una clara diferencia en las condiciones necesarias para la reactivación de la actividad polimerasa que había sido tratada con diferentes agentes. La enzima tratada con timerosal se reactivaba bastante fácilmente mientras que la enzima tratada con ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) o cloramina T necesitaba tioles de bajo peso molecular con alta capacidad reductora para su activación.

También resulta evidente a partir de la Tabla 3 que es esencial no utilizar sustancias antagonistas demasiado fuertes para inactivar el agente que modifica la polimerasa, ya que existe el riesgo de reactivar la polimerasa plasmática.

Ejemplo 9 Cuantificación de la TI vírica en muestras con alta actividad TI endógena sin purificación

Se diluyó: (A) plasma con EDTA procedente de un donante de sangre sano, B) virus VIF diluido en STF inactivado (desprovisto de actividad TI) o C) en medio esencial mínimo de Dulbecco con STF al 5% y se incubó con la concentración indicada de ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) durante 1 hora a temperatura ambiente (20ºC). A continuación, cada muestra se diluyó de forma seriada 1:4 en tampón acondicionador (B). Después, se añadió cisteamina a todas las muestras hasta una concentración final de 20 mM y el conjunto se incubó durante otra hora a temperatura ambiente. La actividad TI de cada muestra se determinó entonces usando un HS-kit Lenti RT de Cavidi®. Se añadieron 15 \mul de cada muestra a 135 \mul de la mezcla de reacción lo que suponía una concentración final de cisteamina en el ensayo de 2 mM. La actividad TI recuperada en las tres primeras diluciones, que correspondían a las muestras de 7,5, 1,9 y 0,5 \mul por ensayo de TI, se recalculó como el porcentaje de un control incubado en ausencia de sustancias y se representó frente a la concentración de la sustancia (véase la Fig. 6).

La actividad polimerasa en plasma humano se eliminaba tras incubación con concentraciones de ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) de aproximadamente 0,47 mM. La recuperación de la TI del virus VIF no resultó afectada de forma adversa por la incubación con concentraciones de la sustancia por debajo de 1,88 mM. Por tanto, la TI de VIF puede determinarse de forma selectiva en muestras sin procesar tras incubación con ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico) en un intervalo de concentración de aproximadamente 2 Mm.

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TABLA 1 Algunas características de una actividad TI no identificada de plasma humano

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TABLA 2 Sustancias con capacidad para destruir la actividad TI de plasma humano

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Bibliografía

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Claims (13)

1. Procedimiento de recuperación de una actividad enzimática a partir de virus envueltos en una muestra biológica que contiene enzimas no protegidas, que comprende las etapas de

a) incubar la muestra biológica con una sustancia que modifica cisteínas para destruir la actividad de las enzimas no protegidas a la vez que se mantiene la actividad enzimática vírica dentro de la envoltura del virus

b1) retirar las partículas del virus envuelto de la mezcla de incubación, o

b2) inactivar la sustancia que modifica cisteínas con una sustancia inactivadora que evite la lisis de la envoltura del virus,

c) lisar la envoltura del virus con un tampón de lisis para liberar las enzimas del virus, y

d) recuperar la enzima liberada del virus del tampón de lisis.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los virus envueltos se seleccionan a partir de la familia Retroviridae.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el virus se selecciona entre lentivirus, virus HTLV/VLB, retrovirus tipo D de mamífero y retrovirus tipo C de mamífero.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el Lentivirus es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la actividad enzimática vírica es la actividad transcriptasa inversa (TI).

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra biológica es una muestra de fluido corporal.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la muestra de fluido corporal es una muestra de sangre, plasma o suero.

8. Procedimiento según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 7, en el que la sustancia que modifica cisteínas es una sustancia hidrosoluble no lipofílica.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la sustancia hidrosoluble no lipofílica se selecciona entre el grupo constituido por N-etilmaleimida, timerosal, p-hidroximercuribenzoato, ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico), 2-aminoetil 2'-aminoetanotiol-sulfonato, ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico y metil metano tiosulfonato.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la sustancia inactivadora es un agente reductor suave.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el agente reductor suave se selecciona entre el grupo constituido por cisteína, cisteamina, ácido mercaptosuccínico y glutatión.

12. Presentación comercial para realizar en el laboratorio las etapas de recuperación de una actividad enzimática a partir virus envueltos presentes en una muestra biológica, que contiene

una sustancia que modifica cisteína

una matriz de unión del virus

una sustancia inactivadora de la sustancia que modifica cisteína a la vez que se preserva la envoltura del virus de la lisis y

un tampón de lisis.

13. Presentación comercial según la reivindicación 12, en la que

la sustancia que modifica cisteína se selecciona entre el grupo constituido por N-etilmaleimida, timerosal, p-hidroximercuribenzoato, ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico), 2-aminoetil 2'-aminoetanotiosulfonato, ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico y metil metano tiosulfonato,

la matriz de unión del virus es una matriz de intercambio aniónico.

la sustancia inactivadora se selecciona entre el grupo constituido por cisteína, cisteamina, ácido mercaptosuccínico y glutatión y

el tampón de lisis es un tampón compatible con el ensayo enzimático que incluye un detergente.