JP4364512B2 - エンベロープウイルスからの酵素活性の回収 - Google Patents
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Description
本発明はエンベロープウイルスから酵素活性を回収する方法、すなわちエンベロープウイルスにパッケージングされている酵素の測定法に関する。この方法は詳しくはエンベロープウイルスの他に、非保護酵素を含む生体サンプル用に開発されている。
従来からのこの分野の問題の一例は細胞抽出液または細胞培養液においてレトロウイルス逆転写酵素(RT)を同定する際に直面するものである。逆転写の際、RTはウイルスRNAのDNAコピーを作る。従来のRNA活性アッセイは人工的な鋳型−プライマー構築とヌクレオチド基質としてのトリチウム化デオキシヌクレオチド三リン酸を用いることで行われる。この鋳型/プライマー対でポリ(rA)/オリゴ(dT)は最も効果的で、HIVならびにその他のレトロウイルスRT(ボルティモア−71、Lee et al−87)の同定に最もよく用いられている組合せである。早くから、いくつかの細胞DNA重合酵素が測定可能な産生量で生じることでこの種のアッセイ系の結果を不明瞭にすることが分かっている。
さらに検討したところ、健康な人からの粗EDTA血漿は比較的多量のこの活性を含んでおり、同種のサンプルのリンパ球画分からの抽出物でも豊富であることが明らかとなった。まだ分類されていないこの酵素のいくつかの特性を表1に示す。本発明者らの分離系から「ウイルス固定化」の後に回収された活性の量は血漿中の前活性の千分の1未満であったが、少量のHIV RTの検出を著しく不明瞭にするには十分なものであった。
a) 生体サンプルをシステイン修飾物質とともにインキュベートして、ウイルスエンベロープ内のウイルス酵素活性を保持しながら非保護酵素の活性を破壊し、
b1) インキュベーション混合液からエンベロープウイルス粒子を取り出すか、または
b2) システイン修飾物質を、細胞溶解からウイルスエンベロープを保持つつ、不活性物質で不活性化し、
c) ウイルスエンベロープを細胞溶解バッファーを用いて溶解してウイルス酵素を遊離させ、さらに
d) 遊離したウイルス酵素を細胞溶解バッファーから回収する
工程を含んでなる方法に向けられる。
本発明の方法のある具体例では、エンベロープウイルスはレトロウイルス科から選択され、詳しくはレンチウイルス、HTLV/BLVウイルス、哺乳類D型レトロウイルス、および哺乳類C型レトロウイルスから選択される。
以下の手順は本発明の説明を意図するものであって、その使用を限定するものではない。本発明の異なる2つの具体例は異なる目的のために用いられる。プロトコールI)は主としてウイルス酵素活性の測定前に除去しなければならない酵素活性遮断抗体を含むサンプル(すなわち、血清変換後のHIV患者の血漿)に対して用いられる。以下のプロトコール中のポリメラーゼ不活性化工程は個別のインキュベーションで行う。あるいはまた、ビリオンがゲルに結合する場合には同じ工程の中で行うこともできる。これは、システイン修飾物質を直接血漿/ゲルスラリー混合物に加えるか、またはまず上記物質をゲルに結合した後に血漿サンプルを加えるかのいずれかで行う。必要な物質濃度は手法によって異なる。プロトコールII)は酵素遮断抗体などの妨害因子を実質的に含まないサンプル、例えばHIV急性期の血清に使用できる。
1) 用いる5ml容のプラスチック試験管にラベルを付け、ナルゲンボックスに入れる。ラベルを付けた各試験管にサンプル(例えば、HIV感染者からのEDTA血漿)1mlを加える。バッファー液中66mMの5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)100μlを加え、ボルテックスにかけ、それらのサンプルを室温で1時間インキュベートする。
この洗浄工程で、この系から結合していないRT遮断抗体と5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)を除去する。
工程10からの細胞溶解液において回収されるRT活性はRT遮断抗体および細胞内ポリメラーゼ活性を実質的に含まず、高感度RT活性アッセイ、例えばEkstrand et al 1996が記載した方法に基づくCavidi HS-kit Lenti RTにより定量することができる。
注: システイン修飾物質、例えば野生型HIV1 RTに感受性のないRT酵素は必要に応じて5mMまでの5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)の存在下でアッセイすることができる。
1) 200μlのサンプル(例えば、HIV急性期血漿)にバッファー液中33mMの5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)20μlを混合する。これらのサンプルをオービタルシェーカーにて室温で1時間インキュベートする。
分離ゲル: 例えば、200mM(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)(MES)pH5.4,275mMヨウ化カリウムおよびヘパリン80IU/ml中のFractogel(商標)EMD TMAEまたは Fractogel(商標)EMD TMAE Hicap。
ミニカラム: 例えば、Biorad Poly-Prep(商標)(7311553)。
ミニカラム洗浄装置: 例えば、Supelco Visiprep固相抽出バキュームマニホールド。
プラスチック試験管: 例えば、Nunc 4.5ml低温チューブ。
システイン修飾剤: 例えば、0.4Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(pH6.8)で緩衝させた水中66mMの5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)。
弱メルカプト還元剤: 例えば、水中33mMのシステアミン。
洗浄バッファー(A): 20mM MES pH6.0、500mM酢酸カリウム(KAc)。
コンディショニングバッファー(B): RTアッセイ適合バッファー、例えば、10mM (N−(2−ヒドロキシエチル−ピペラジン−N’−(2−エタンスルホン酸)(Hepes)pH7.6、25mM KAc、20mM塩化マグネシウム(MgCl2)、0.2mメチレングリコール−ビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、2mMスペルミンおよび0.5mg/ml熱不活性化ウシ血清アルブミン。
細胞溶解バッファー(C): 界面活性剤、例えば1%t−オクトフェノキシポリエトキシエタノール(トリトンX−100)、酵素安定剤、例えば13ng/mlオリゴ(dT22)、0.025mg/ml硫酸デキストランおよびコンディショニングバッファー(B)と同様の成分を含有するRTアッセイ適合バッファー。
メルカプト還元剤: 例えば、SF酸化/修飾に感受性があるRTでウイルスを処理する場合には必要に応じて0.2mMシステアミンを加えてもよい。
プライマーを含まないRT反応混合物に対する示された成分の添加の作用(Cavidi HS kit Lenti RT)を検討した。2人の健康な血液ドナーからのEDTA血漿(1μl/アッセイ)、細胞培養起源の組換えHIV1 RTまたはFIV RTを酵素として用いた。結果は表1に示す。
ヒトEDTA血漿サンプル50μlに各物質の一連の希釈液からの50μlサンプルを混合した。これらのサンプルをオービタルシェーカーにて1時間インキュベートした。次に各サンプルを20倍希釈し、残留するポリメラーゼ活性をCavidi(商標) HS-kit Lenti RTで測定した。各物質濃度におけるポリメラーゼ活性を、修飾物質の不在下でインキュベートした血漿からなる対照に対するパーセンテージとして換算し、物質濃度に対してプロットし、そのプロットから50%活性低下に要される物質濃度を求めた。
細胞培養に由来する組換え野生型HIV1 RT(黒ぬり四角形)、ネビラピン耐性HIV1変異体(Y181C)(白ぬき菱形)、ヒツジ肺癌由来Jaagsiekteウイルス(JSV)RT(黒ぬり三角形)、ネコ白血病ウイルス(FIV)RT(白ぬき丸形)、ウシ白血病ウイルス(BLV)RT(黒ぬり菱形)およびブタ内在性レトロウイルス(PERV)RT(黒ぬり丸形)を熱不活性化ウシ胎児血清で希釈した。これら種々のウイルス酵素調製物および健康な血液ドナーからのEDTA血漿サンプル(白ぬき四角形)を示されたチメロサール濃度で室温(22℃)にて60分間インキュベートした。これらのサンプルを総てRTアッセイ適合バッファーで100倍希釈した後、各サンプルに残留するRT活性を測定した。各々測定したRTの種類に適した3種のRTアッセイを用いた:HIV1、JSV、およびFIV RTはCavidi(商標) HS kit Lenti RTで測定した、BLV RTはCavidi(商標) HS kit HTLV RTで測定し、PERVおよびヒト血漿RTはCavidi(商標) HS kit Mn2+ RTで測定した。結果は図1のグラフで示す。
リンパ球が破壊された健康な血液ドナーからのEDTA血漿不活性化したウシ胎児血清で希釈したFIV(血漿RT活性が総て排除)を室温で1時間、示された濃度のA)5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)、B)チメロサールとともにインキュベートした。これらのサンプルを「RT遮断抗体を含む材料からレトロウイルスRTを測定するプロトコール」に従って分離した。回収されたRT活性はRTアッセイ(Cavidi HS-kit Lenti RT)で測定した。各活性を、メルカプト還元剤を用いずにインキュベートした同様の調製物からなる対照を同様に処理したものに対するパーセンテージとして換算した。この対照からのFIV RTの回収率はもとのサンプルの活性の74%であり、ヒト血漿RTに対する相当値は0.015%であった。図2を参照。なおここで、左の棒は血液ドナーの血漿であり、右の棒はウシ胎児血清中のFIVウイルスである。
21人の健康な血液ドナーからのEDTA血漿サンプル1mlの2セットを「RT遮断抗体を含む材料からレトロウイルスRTを測定するプロトコール」に従って処理した。一方のサンプルセットでは5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)処理(工程A)を行わず、他方には含めた。各サンプルから回収されたRT活性の量はCavidi(商標) HS kit Lenti RTを用いた一晩のRTアッセイで測定した。図3を参照。なおここで、左側の群は本プロトコールを経た非処理サンプルを示し、右側の群は処理後にプロトコールを経た同様のサンプルである。分離対照、例えばサンプル適用バッファーの分離では、262〜1100rfu/時の間の値が得られた。蛍光計の検出範囲はおよそ1800000rfuまでであった。
HIV感染者からのEDTA血漿サンプル1mlを「RT遮断抗体を含む材料からレトロウイルスRTを測定するプロトコール」に従って処理し、各サンプルから回収されたRT活性の量をCavidi(商標) HS kit Lenti RTを用いた一晩のRTアッセイで測定した。得られたRT活性は標準曲線に従い、pg HIV1 RTとして換算した。各サンプルのHIV1 RNAの量は標準的なHIV1 RNA PCR(Roche, Amplicore)によって測定した。プロットは図4に示すが、PCR値>500コピー/mlのサンプルに限定されている。
「RT遮断抗体を含む材料からレトロウイルスRTを測定するプロトコール」のポリメラーゼ不活性化工程を次の4種類の方法で行った:A)血漿および物質の個別インキュベーション、B)ビリオンがゲルに結合するのと同時のインキュベーション、C)保存中にゲルスラリーに物質を含め、この前処理ゲルをRT単離に用いる、D)まず物質をゲルに結合させ、結合していない物質を洗浄によって除去し、このようにして処理したゲルをプロトコールに従って用いる。結果は図5に示す。血漿RT活性(黒ぬり菱形)、HIV RT活性(黒ぬり丸形)。
1セットのヒト血漿サンプル(水中60%の血漿)をまず3mMの示されたシステイン修飾物質または水(対照)とともに室温で1時間インキュベートした。次に反応性がある可能性のある物質を5段階の一連の希釈液として加え、サンプルをさらに1時間インキュベートした。最後に各サンプルを1:20希釈し、残留するRT活性をCavidi(商標) HS kit Lenti RTで測定した。サンプルインキュベーションとRTアッセイの間の物質濃度の総低下は200倍であった。回収されたRT活性は、両インキュベーション工程において添加を行わずにインキュベートした血漿からなる対照の活性に対するパーセンテージとして換算した。結果は表3に示す。
A)健康な血液ドナーからのEDTA血漿、B)不活性化したFCS(RT活性を除去)で希釈したFIVウイルス、またはC)5% FCSを含むダルベッコの最小必須培地を1:1希釈し、示された濃度の5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)とともに室温(20℃)で1時間インキュベートした。次に各サンプルに対してコンディショニングバッファー(B)で4段階の一連の希釈を行った。その後総てのサンプルにシステアミンを最終濃度20mMまで加え、このセットを室温でさらに1時間インキュベートした。次に各サンプルのRT活性をCavidi(商標) HS kit Lenti RTで測定した。反応混合物135μlに各サンプル15μlを加え、アッセイにおけるシステアミンの最終濃度を2mMとした。RTアッセイ当たり7.5、1.9および0.5μlサンプルに相当する最初の3つの希釈液において回収されたRT活性を物質の不在下でインキュベートした対照に対するパーセンテージとして換算し、その物質濃度に対してプロットした。図6を参照。
Claims (12)
- 非保護ポリメラーゼ酵素を含む生体サンプル中のエンベロープウイルスからポリメラーゼ活性を回収する方法であって、
a) 生体サンプルを水溶性非親油性のシステイン修飾物質とともにインキュベートして、ウイルスエンベロープ内のウイルスポリメラーゼ活性を保持しながら、非保護ポリメラーゼ酵素のポリメラーゼ活性を破壊し、
b1) インキュベーション混合液からエンベロープウイルス粒子を取り出すか、または
b2) ウイルスエンベロープ内のウイルスポリメラーゼ活性を保持しながら、システイン修飾物質を、不活性物質で不活性化し、
c) ウイルスエンベロープを、細胞溶解バッファーを用いて溶解してウイルスポリメラーゼを遊離させ、さらに
d) 遊離したウイルスポリメラーゼを細胞溶解バッファーから回収する
工程を含んでなる、方法。 - エンベロープウイルスがレトロウイルス科から選択される、請求項1に記載の方法。
- ウイルスが、レンチウイルス、HTLV/BLVウイルス、哺乳類D型レトロウイルス、および哺乳類C型レトロウイルスから選択される、請求項2に記載の方法。
- レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルス(HIV)である、請求項3に記載の方法。
- 回収されるウイルスポリメラーゼ活性が逆転写酵素(RT)活性である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 生体サンプルが体液サンプルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 体液サンプルが、血液、血漿または血清サンプルである、請求項6に記載の方法。
- 水溶性非親油性システイン修飾物質が、N−エチルマレイミド、チメロサール、p−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)、2’−アミノエタンチオールスルホン酸2−アミノエチル、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、酢酸フェニル水銀、2,2’−ジチオジピリジンおよびチオスルホン酸メチルメタンからなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 不活性化物質が弱還元剤である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 弱還元剤が、システイン、システアミン、メルカプトコハク酸、およびグルタチオンからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 生体サンプル中に存在するエンベロープウイルスからポリメラーゼ活性を回収する実験工程を実施するための文書および/またはデータを記録した説明書と、
システイン修飾物質と、
ウイルス結合マトリックス、または
細胞溶解からウイルスエンベロープを保持しつつ、システイン修飾物質を不活性化する物質と、
細胞溶解バッファーと
を含む、市販パッケージ。 - システイン修飾物質が、N−エチルマレイミド、チメロサール、p−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)、2’−アミノエタンチオールスルホン酸2−アミノエチル、2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸、酢酸フェニル水銀、2,2’−ジチオジピリジンおよびチオスルホン酸メチルメタンから選択され、
ウイルス結合マトリックスが陰イオン交換マトリックスであり、
不活性化する物質がシステイン、システアミン、メルカプトコハク酸、およびグルタチオンからなる群から選択され、かつ、
細胞溶解バッファーが界面活性剤を含む酵素アッセイ適合バッファーである、請求項11に記載の市販パッケージ。
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