BR0208542B1 - Método de recuperar uma atividade enzimática de vírus emvelopados em uma amostra biológica contendo enzimas não protegidas, e, pacote comercial - Google Patents

Description

“MÉTODO DE RECUPERAR UMA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE

VÍRUS ENVELOPADOS EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA CONTENDO ENZIMAS NÃO PROTEGIDAS, E, PACOTE COMERCIAL” A presente invenção diz respeito a um método de recuperar a atividade enzimática de vírus envelopados, isto é, a medição das enzimas empacotadas em vírus envelopados. O método é particularmente desenvolvido para amostras biológicas contendo enzimas não protegidas além dos vírus envelopados.

FUNDAMENTOS

Um exemplo clássico dos problemas neste campo é encontrado durante a determinação da transcriptase reversa (RT) retroviral em extratos celulares ou fluidos de cultura celular. Durante a transcrição reversa, a RT

produz uma cópia de DNA do RNA viral. Um ensaio da atividade de RT convencional é realizado utilizando-se uma construção de padrão-preparador artificial e trifosfato de desoxinucleotídeo tritiado como substrato de nucleotídeo. O par padrão / preparador poli(rA)/oligo(dT) é a combinação mais eficiente e a mais usada para a determinação de HIV assim como para outras RTs retrovirais (Baltimore-71, Lee et a/-87). Foi inicialmente reconhecido que algumas enzimas que polimerizam o DNA celular obscureceram os resultados deste tipo de sistema de ensaio pela produção de quantidades de produto mensuráveis.

Pelo menos nove tipos diferentes de DNA polimerases foram identificadas em células eucarióticas. A polimerase oc é considerada ser responsável pela replicação de DNA durante a divisão celular, a β é considerada como sendo a polimerase principal envolvida no reparo de DNA e a λ é responsável pela síntese de DNA na mitocôndria. Cada uma das polimerases celulares ocorre em formas diferentes e com proteínas associadas diferentes. As suas propriedades enzimáticas variam tanto com a sua forma molecular quanto com a origem do tipo celular (para uma revisão ver Hübscher et al 2000). Além disso, as células podem conter enzimas derivadas de vírus infecciosos ou genes de vírus endógeno que codificam a DNA polimerase viral. Das DNA polimerases celulares, a DNA polimerase α é a menos propensa a utilizar prA como padrão, mas existem certas espécies moleculares desta enzima que podem copiar eficientemente prA (Goulian &

Grimm 1990, Yoshida et al 1981).

De fato as diferentes polimerases representam um problema de especificidade durante a quantificação de RT retro viral. Muitos métodos para evitar este problema podem ser encontrados na literatura. O método mais óbvio é separar o vírus das proteínas celulares. Vários métodos tais como centrifugação ou adsorção de virions a receptores ou anticorpos específicos foram usados neste contexto. Um problema comum que ocorre quando da purificação de material contendo grandes quantidade de componentes celulares e quantidades diminutas de vírus é que a co-purificação de quantidades pequenas de polimerase celular não pode ser excluída. Além disso, de um ponto de vista prático não é atrativo processar quantidades grandes de amostras com procedimentos de separação relativamente incômodos.

Um outro método é planejar condições de ensaio de enzima específicos de isozima que mais ou menos excluem a polimerase celular, isto é a λ polimerase, de detecção. Isto pode ser obtido usando-se inibidores, íons metálicos alternativos ou pares de padrão / preparador. Por exemplo poli(2’- 0-metil-rC)n oligo(dG)i2-i8 é conhecido ser um substrato altamente específico para RTs retrovirais. A especificidade aumentada obtida por este tipo de método é, entretanto, usualmente dificultada pela diminuição correspondente na velocidade da reação e redução subsequente na sensibilidade de detecção para a enzima que é pretendida ser medida. A Requerente desenvolveu recentemente um método para a quantificação de RT do HIV no plasma amostrado de pessoas infectadas. O método é fundamentado na ligação do vírus a um gel com um trocador de íon imobilizado. Os anticorpos e substâncias perturbadoras são removidas por uma lavagem e a RT enzimaticamente ativa é recuperada pela lise do vírus imobilizado com detergente não iônico (Gatu et al 2000). A quantidade de RT recuperada é fmalmente quantificada com um ensaio de RT sensível com base no uso de preparador prA imobilizado com odT. Quando do processamento do plasma de controle de doadores de sangue saudáveis neste sistema a Requerente verificou quantidades pequenas de atividade de RT nas frações purificadas.

Outras investigações revelaram que o plasma de EDTA bruto de seres humanos saudáveis contiveram quantidades comparativamente grandes desta atividade, que também foi abundante nos extratos da fração linfocítica do mesmo tipo de amostras. Algumas características desta enzima não classificada estão descritas na Tabela 1. A quantidade de atividade recuperada a partir do nosso sistema de separação depois da “imobilização do vírus” foi menor do que uma centésima parte da atividade total no plasma mas suficiente para obscurecer severamente a detecção de quantidades pequenas de RT do HIV.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece uma solução para o problema de especificidade divulgado acima, mas também é aplicável, no geral, à detecção de todas enzimas contidas em vírus envelopados. Os exemplos de famílias de vírus envelopado e de algumas espécies humanas dentro das famílias incluem Poxviridae, por exemplo vacínia e varíola, Iridoviridae, Herpesviridae, por exemplo, Herpes simples, vírus da Varicela, citomegalovírus e vírus de Eppstein-Barr, Togaviridae, por exemplo vírus da febre amarela, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus da rubéola e vírus da encefalite tropical, Coronaviridae, por exemplo coronavírus humano, Paramyxoviridae, por exemplo Parainfluenza, vírus da cachumba, vírus do sarampo e vírus sincicial respiratório, Rabdoviridae, por exemplo, vírus da estomatite vesicular e vírus da raiva, Filoviridae, por exemplo vírus de Marburg e vírus Ebola, Orthomyxoviridae, por exemplo, vírus A e B influenza, Bunyaviridae, por exemplo, vírus Bwamba, vírus da encefalite da Califórnia, vírus da febre do mosquito pólvora e vírus da febre do Vale Rift, Arenaviridae, por exemplo, vírus LCM, vírus Lassa e vírus Juni, Hepnadnaviridae, por exemplo o vírus da hepatite B e Retroviridae, por exemplo, HTLV e HIV. O método da invenção está fundamentado no uso de um produto químico modificador de proteína para destruir a atividade de enzimas solúveis não protegidas, isto é, enzimas livres; e enzimas associadas, por exemplo, com proteínas, componentes celulares ou organelas mas não protegidas por um envoltório viral. A capacidade de um produto químico para penetrar o envoltório viral está relacionada com as suas propriedades hidrofóbicas. Contanto que o envoltório viral dê proteção para a ação do produto químico escolhido, é possível remover ou altemativamente inativar o produto químico reativo, lisar o virion e quantificar a atividade da enzima viral liberada. Existe um hospedeiro de reagentes mais ou menos específicos de sítio para a modificação de proteína disponível (para uma revisão ver Means & Feeney 1990).

Para o método da invenção, substâncias modificadoras de cisteína foram selecionadas como produtos químicos modificadores de proteína para destruir a atividade de enzimas não protegidas. A sensibilidade à N-etil maleimida foi amplamente usada para a classificação das DNA polimerases celulares. O agente é usualmente adicionado diretamente à mistura de reação e eficientemente “inibe” todas as DNA polimerases de mamífero exceto a DNA polimerase β. A quantidade de cisteínas, na seqüência de aminoácido de consenso das RTs retrovirais diferentes varia consideravelmente isto é, a RT de HIV 1 tem apenas 2, HIV 2 tem 3, o Vírus da Leucemia de Camundongo (MULV) tem 8, enquanto o vírus da mieloblastose/sarcoma aviária tem 12 cisteínas na subunidade β. A sensibilidade das RTs virais à modificação da cisteína pode ser assim esperada variar consideravelmente. Os efeitos da modificação dos resíduos de cisteína nas RTs de HIV foram explorados e pelo menos a atividade de DNA polimerase da RT tanto do HIV 1 quanto do HIV 2 foram, muito resistente (Hizi et al 1992). Levando-se em conta a enorme variação registrada entre as cepas de HIV diferentes isto não é, entretanto, provável de ser verdadeiro para todos os isolados de HIV.

Mais especificamente, a presente invenção está direcionada a um método de recuperar uma atividade enzimática a partir de vírus envelopados em uma amostra biológica contendo enzimas não protegidas, que compreende as etapas de a) incubar uma amostra biológica com uma substância modificadora de cisteína para destruir a atividade das enzimas não protegidas enquanto retém a atividade da enzima viral dentro do envoltório viral, bl) remover as partículas de vírus envelopado da mistura de incubação ou b2) inativar a substância modificadora de cisteína com uma substância inativadora que preserve o envoltório viral da lise, c) lisar o envoltório viral com um tampão de lise para liberar as enzimas virais, e d) recuperar a enzima viral liberada do tampão de lise.

Em uma forma de realização do método da invenção os vírus envelopados são selecionados da família Retroviridae, e são especialmente selecionados de Lentivírus, vírus HTLV/BLV, retrovírus do tipo D de mamífero e retrovírus do tipo C de mamífero.

Em uma forma de realização presentemente preferida o Lentivírus é o vírus da imunodeficiência humana (HIV).

Em uma outra forma de realização a atividade de enzima viral recuperada é a atividade de transcriptase reversa (RT). Já em uma outra forma de realização do método da invenção a amostra biológica é uma amostra de fluido corpóreo. Os exemplos de fluido corpóreos são urina, escarro, fluido cerebrospinhal, fluido sinovial, fluido pleural, fluido ascítico e particularmente sangue, plasma e soro.

Em uma outra forma de realização do método da invenção a substância modificadora de cisteína é uma substância não lipofilica solúvel em água, tal como N-etilmaleimida, Timerosal, p-hidroximercuribenzoato, 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico), 2’-aminoetanotiolsulfonato de 2- aminoetila, ácido 2-nitro-5-tiocianobenzóico, e metano-tiossulfonato de metila.

Ainda em outra forma de realização a substância inativadora é um agente redutor de peso molecular baixo brando, tal como cisteína, cisteamina, ácido mercaptossuccínico ou glutationa. A invenção também está direcionada a um pacote comercial contendo instruções escritas e/ou portador de dados para realizar as etapas de laboratório para a recuperação de uma atividade enzimática de vírus envelopados presentes em uma amostra biológica, e uma substância modificadora de cisteína, tal como N-etilmaleimida, acetato fenilmercúrico, Timerosal, p-hidroximercuribenzoato ou 5,5’- ditiobis-(ácido 2- nitrobenzóico). Opcionalmente o pacote também contém uma matriz de ligação de vírus, tal como uma matriz trocadora de ânion ou uma substância que inativa a substância modificadora de cisteína enquanto que preserva o envoltório viral da lise, tal como cisteína, cisteamina, ácido mercaptossuccínico ou glutationa e um tampão de lise, tal como um tampão compatível com o ensaio de enzima incluindo um detergente. A invenção será agora ilustrada por uma descrição geral dos experimentos, exemplos e desenhos, mas deve ser entendido que a invenção não é limitada pelas formas de realização divulgadas.

DESCRIÇÃO GERAL DOS EXPERIMENTOS

Os seguintes procedimentos são intencionados a ilustrar a invenção sem limitar o seu uso. Duas formas de realização diferentes da invenção podem ser usadas para propósitos diferentes. Protocolo I) é primariamente usado para amostras contendo anticorpos de bloqueio da atividade enzimática (isto é plasma de paciente HIV depois da soroconversão) que deve ser removido antes da determinação da atividade enzimática viral. A etapa de inativação da polimerase no protocolo abaixo é realizada em uma incubação separada. Altemativamente também pode ser feita durante a mesma etapa quando o virion se liga ao gel. Isto é realizado pela adição da substância modificadora de cisteína, diretamente à mistura de lama de plasma/gel ou primeiro ligando-se a substância ao gel e depois adicionando-se as amostras de plasma. A concentração da substância requerida pode variar com o procedimento. Protocolo II) pode ser usado para amostras essencialmente livres de fatores incômodos tais como anticorpos bloqueadores de enzima, por exemplo soros em estágio agudo de HIV. I) Protocolo para a determinação de RT retroviral a partir de material que contém anticorpos bloqueadores de RT, com base na destruição de enzimas celulares solúveis seguido pela isolação de RT viral a partir de mini colunas 1) Rotular os tubos plásticos de 5 ml a serem usados. Colocá-los em uma caixa Nalgene. Adicionar 1 ml de amostra (por exemplo plasma em EDTA de indivíduos infectados com HIV) a cada tubo rotulado. Adicionar 100 μΐ de uma solução 66 mM de 5,5’-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico) em água tamponada, turbilhonar e incubar as amostras durante uma hora na temperatura ambiente. A atividade das enzimas plasmáticas livres é destruída durante este procedimento enquanto as enzimas contidas dentro dos virions permanecem intactas. Os virions podem ser depois purificados do 5,5’- ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico), dos anticorpos que bloqueiam a atividade enzimática e de outras substâncias que possam interferir com a quantificação da RT viral por diversos procedimentos de separação. O protocolo abaixo está fundamentado no uso de Fractogel® EMD TMAE Hicap gel. 2) Colocar em suspensão o gel de separação cuidadosamente e transferir 1500 μΐ da lama de gel para cada tubo de pré tratamento de amostra. 3) Incubar as amostras com a lama de gel durante uma hora na temperatura ambiente com os tubos posicionados em um agitador orbital. 4) Rotular o número desejado de mini colunas plásticas de 15 ml para identificar as amostras que são analisadas. Montar as colunas em um dispositivo de lavagem de coluna por exemplo um tubo de vácuo de extração de fase sólida Supelco Visiprep. Transferir os conteúdos nos tubos de ligação para as suas colunas correspondentes. Antes de transferir turbilhonar o tubo ligeiramente para distribuir o gel uniformemente. 5) Quando todas as colunas estão cheias, aplicar o vácuo e sugar até a secura dos géis. Desligar o vácuo e iniciar a lavagem enchendo-se cada coluna com 9 ml de tampão A. Quando todas as colunas foram enchidas, aplicar o vácuo e sugar até a secura dos géis. 6) Repetir a etapa 5 três vezes mais, dando um total de quatro lavagens. Sugar até a secura dos géis depois de cada lavagem.

Depois de sugar até a secura dos géis após a 4a lavagem, desligar o vácuo e proceder a etapa 7.

A etapa de lavagem remove os anticorpos bloqueadores de RT não ligados e o 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) do sistema. 7) Adicionar a todos os géis secos 9 ml de tampão condicionador (B).

Aplicar vácuo e sugar até a secura dos géis. 8) Repetir a etapa 7. Antes de desligar o vácuo controlar que todo o tampão condicionador (B) tenha sido removido de todos os géis. 9) Levantar a parte superior do dispositivo de lavagem de coluna.

Montar o suporte de tubo com os tubos rotulados em um recipiente limpo. Recolocar a parte superior do dispositivo. Controlar que todos os tubos pequenos de cada coluna estejam em seus tubos correspondentes. 10) Adicionar 300 μΐ de tampão de lise (C) a cada coluna. Deixar o tampão repousar na coluna durante cinco minutos. Depois, aplicar o vácuo lentamente e sugar até a secura dos géis. Isto dará, aproximadamente 300 μΐ de lisado viral em cada tubo. A atividade de RT recuperada nos lisados da etapa 10 são essencialmente livres de anticorpos bloqueadores de RT; e de atividade de polimerase celular e pode ser quantificada com um ensaio de atividade de RT sensível, por exemplo o Cavidi® HS-kit Lenti RT, que está fundamentado no método descrito por Ekstrand et al 1996.

Nota: As enzimas RT que não são sensíveis às substâncias modificadora de cisteína por exemplo HIV I RT do tipo selvagem pode ser opcionalmente ensaiado na presença de até 5 mM de 5,5-ditiobis(ácido 2- nitrobenzóico).

As enzimas sensíveis tais como MuLV RT e RT de certas cepas de HIV 1 resistentes à terapia por outro lado requerem a adição de um agente redutor de sulfidrila, por exemplo cisteína ou cisteamina, ao tampão de lise. II) Protocolo para a determinação da atividade RT em amostras essencialmente livres de anticorpos bloqueadores de enzima, por exemplo plasma de estágio agudo de HIV ou sobrenadante de cultura viral, com base na inativação de enzimas celulares solúveis seguido pela inativação de 5,5-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico). 1) Amostras de 200 μΐ (por exemplo plasma de estágio agudo do HIV) é misturado com 20 μΐ de 5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) a 33 mM em água tamponada. As amostras são incubadas em um agitador orbital na temperatura ambiente durante uma hora. 2) Um agente redutor de sulfidrila, por exemplo 20 μΐ de cisteamina a 33 mM em água são adicionados e as amostras são incubadas em um agitador orbital na temperatura ambiente durante mais 30 minutos. 3) Preparar diluições em série de quatro vezes das amostras em um tampão compatível com o ensaio de RT contendo um detergente por exemplo, triton X-100. Os virions são agora lisados e a atividade RT em cada diluição pode ser determinada utilizando um ensaio de RT sensível por exemplo, o Cavidi HS-kit Lenti RT. 4) A quantidade de atividade RT na amostra original é calculada a partir dos valores na faixa de diluição onde existe um relacionamento linear entre a diluição da amostra e a quantidade de produto formado.

EXEMPLOS

Materiais Gel de separação: por exemplo, Fractogel® EMD TMAE ou Fractogel® EMD TMAE Hicap em (ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfurico) (MES) 200 mM pH 5,4, Iodeto de potássio 275 mM e Heparina 80 IU/ml.

Mini colunas por exemplo Biorad Poli-Prep® (7311553) Dispositivo de lavagem de mini coluna por exemplo tubo de vácuo de extração de fase sólida Supeko Visiprep.

Tubos plásticos por exemplo tubos criogênicos de 4,5 ml Nunc.

Agente modificador de cisteína, por exemplo 5,5’-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico) 66 mM em água tamponada com Tris(hidroximetil)- aminometano 0,4 M (pH 6,8).

Agente redutor de sulfidrila brando, por exemplo, cisteamina 33 mM em água.

Tampão de lavagem (A): MES 20 mM pH 6,0, acetato de potássio 500 mM (KAc).

Tampão condicionador (B): Um tampão compatível com o ensaio de RT por exemplo (N-(2-Hidroxietilpiperazino-N’-(ácido 2- etanossulfurico) (Hepes) 10 mM, pH 7, KAc 6,25 mM, cloreto de magnésio (MgCl2) 20 mM, Ácido EtilenoGlicol-bis(Éter β-aminoetílico) Ν,Ν,Ν’,Ν’- Tetraacético (EGTA) 0,2 mM, espermina 2 mM e 0,5 mg / ml de albumina sérica bovina inativada por calor.

Tampão de lise (C): Um tampão compatível com o ensaio de RT incluindo um detergente por exemplo 1 % de t-Octofenoxipolietoxietanol (Triton X-100), um estabilizador de enzima por exemplo 13 ng/ml de oligo(dT22), 0,025 mg/ml de sulfato de dextrano e os mesmos componentes como no tampão condicionador (B). Um agente redutor de sulfidrila, por exemplo, 0,2 mM de cisteamina, é opcionalmente adicionado quando do processamento dos vírus com RT que são sensíveis à oxidação / modificação SH.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um diagrama que mostra o efeito da pré incubação com timerosal ou atividade de polimerases diferentes em soro / plasma. RT do HIV 1 recombinante do tipo selvagem (■ ), RT recombinante de um HIV 1 mutante (Y181C) (0), RT do víms Jaigsiekte (A), RT de FIV (O), RT do Vírus da Leucemia Bovina (BLV) (♦), RT de Retrovírus Endógeno Porcino (PERV) (·) e uma amostra de plasma de um doador de sangue saudável (□). A Fig. 2. mostra dois diagramas A e B de recuperação da atividade RT viral de plasma reforçado de FIV e a destruição seletiva da atividade RT endógena. O plasma de EDTA com linfócitos rompidos de um doador de sangue saudável (as colunas esquerdas) e FIV diluído em soro de bezerro fetal inativado (as colunas direitas) incubadas com: A) 5,5’-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico) e B) timerosal. As atividades de RT recuperadas foram plotadas contra a concentração das substâncias. A Fig. 3 é um diagrama que mostra a eliminação da atividade de polimerase em amostras de plasma de doadores de sangue saudáveis. A Fig. 4 mostra um diagrama de uma correlação entre a RT de HIV recuperada de plasma humano de acordo com a invenção e RNA viral medidas com a PCR de RNA. A Fig. 5 mostra diagramas de protocolos alternativos para o tratamento de amostras de plasma de pacientes infectados com HIV. A etapa de inativação da polimerase no protocolo I foi realizada: A) Em uma incubação separada. B) Durante a mesma etapa quando o virion se liga ao gel.

C) Como em B mas o gel foi armazenado com a substância. D) Como em C mas o gel foi lavado antes do uso. Atividade RT do plasma (♦), atividade de RT do HIV (·). A Fig. 6 mostra diagramas de quantificação da RT viral em amostras com alta atividade RT endógena sem a purificação. Plasma em EDTA de um doador de sangue saudável (A), vírus FIV em FCS inativado (B) e em meio de cultura de célula (C).

Exemplo 1. Algumas propriedades de uma DNA polimerase de plasma humano. O efeito da adição dos componentes indicados à mistura de reação de RT destituída de preparador (Cavidi FIS-kit Lenti RT) foi investigado. Plasma em EDTA de dois doadores de sangue saudáveis (1 μΐ / ensaio), RT de HIV 1 recombinante ou RT de FIV da origem da cultura celular foram usados como a enzima. Os resultados estão apresentados na Tabela I. A atividade de polimerase do plasma humano foi dependente do preparador, sensível à inibição pelo ddNTP complementar ao padrão, mas não sensível aos análogos de pirofosfato.

Exemplo 2. A capacidade de vários agentes modificadores de cisteína para destruir a atividade da polimerase de plasma humano.

Amostras de 50 μΐ de plasma humano em EDTA foram misturadas com amostras de 50 μΐ de uma diluição em série de cada substância. As amostras foram incubadas durante uma hora em um agitador orbital. Cada amostra foi depois diluída vinte vezes e a atividade de polimerase residual foi medida com Cavidi® HS kit Lenti RT. A atividade de polimerase em cada concentração de substância foi recalculada em porcentagem de um controle consistindo de plasma incubado na ausência de substância modificadora, plotada contra a concentração da substância e a concentração da substância requerida para redução da atividade em 50 % foi determinada a partir da plotagem.

O vírus do HIV no plasma humano destituído de atividade RT endógena foi tratado com 5 mM da substância indicada de acordo com o “Protocol for determination of retroviral RT from material which contains RT blocking antibodies”. A recuperação da RT do HIV foi determinada com Cavidi® HS kit Lenti RT. Os resultados são dados na Tabela 2.

Exemplo 3. Efeito da incubação com timerosal em polimerases diferentes no soro / plasma.

A RT do HIV recombinante do tipo selvagem (■), RT recombinante de um mutante do HIV 1 resistente à Nevirapine (Y181C) (0), RT do vírus Jaagsiekte de um câncer pulmonar de ovelha (A), RT do vírus da leucemia felina (FIV) (O), RT do Vírus da Leucemia Bovina (BLV) (♦) e RT de Retrovírus Endógeno Porcino (PERV) (·) derivados de cultura celular foram diluídos em soro de bezerro fetal inativado por calor. As preparações virais de enzima diferente e uma amostra de plasma em EDTA de um doador de sangue saudável (□) foram incubadas com a concentração de timerosal indicada na temperatura ambiente (22°C) durante 60 minutos. Todas as amostras foram diluídas 100 vezes em um tampão compatível com o ensaio de RT e a atividade de RT residual em cada amostra foi depois determinada.

Três ensaios de RT, cada um adaptado ao tipo de RT medido foram usados: as RTs de HIV 1, JSV e FIV foram medidas com Cavidi® HS kit Lenti RT. A RT de BLV com Cavidi® HS kit HTLV RT e PERV e a RT de plasma humano com Cavidi® HS kit Mn 2+ RT. Os resultados estão apresentados em um diagrama na Fig. 1.

As sete enzimas investigadas apresentaram sensibilidade surpreendentemente diferente ao tratamento com timerosal. A RT do mutante Y181C do HIV e a RT de FIV foram as enzimas mais sensíveis. A concentração de timerosal requerida para destruição de enzima significante aumentou entre a RT de plasma humano, RT de BLV e RT de PERV. Duas enzimas, a RT do HIV 1 do tipo selvagem e a RT de JSV, foram totalmente resistentes.

Exemplo 4. Recuperação da atividade de RT viral de plasma reforçado de FIV e destruição seletiva da atividade RT endógena.

Plasma em EDTA com linfócitos rompidos de um doador de sangue saudável e FIV diluído em soro de bezerro fetal inativado (totalmente destituído de atividade RT do plasma) foram incubadas durante 1 hora na temperatura ambiente com a concentração indicada de: A) 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico), B) timerosal. As amostras foram separadas de acordo com o “Protocol for determination of retroviral RT ffom material which contains RT blocking antibodies”. As atividades de RT recuperadas foram determinadas com um ensaio de RT (Cavidi HS-kit Lenti RT). Cada atividade foi recalculada em porcentagem de um controle identicamente processado consistindo da mesma preparação incubada sem qualquer substância reativa de sulfidrila. A recuperação da RT de FIV a partir deste controle foi de 74 % da atividade na amostra original, o valor correspondente para a RT de plasma humano foi de 0,015 %. Ver a Fig. 2, em que as colunas esquerdas são plasma de doador de sangue e as colunas direitas são de vírus FIV em soro de bezerro fetal. A incubação com 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) nas concentrações acima e 0,4 mM eliminou totalmente a atividade de RT do plasma humano sem diminuir a recuperação da RT associada com o virion de FIV.

Concentrações mais altas de Timerosal (> 3 mM) foram requeridas para se alcançar um efeito similar sobre a RT do plasma. O timerosal nesta faixa de concentração reduziu significantemente a recuperação da RT do FIV.

Exemplo 5. Eliminação da atividade de polimerase em amostras de plasma de doadores de sangue saudáveis.

Dois conjuntos em duplicata de amostras de 1 ml de plasma em EDTA de 21 doadores de sangue saudáveis foram processadas de acordo com “Protocol for determination of retroviral RT ífom material which contains RT blocking antibodies”. O tratamento com 5,5’-ditiobis-(ácido 2- nitrobenzóico) (etapa A) foi omitido para um conjunto de amostra e incluído para a outra. A quantidade de atividade de RT recuperada de cada amostra foi determinada usando um ensaio de RT durante a noite usando Cavidi® HS kit Lenti RT. Ver a Fig. 3, em que os grupos do lado esquerdo indicam amostras não tratadas processadas de acordo com o protocolo. Os grupos do lado direito são as mesmas amostras processadas depois do tratamento. Os controles de separação por exemplo separação do tampão de aplicação de amostra deram valores entre 262 e 1100 rfu / hora. A faixa de detecção do fluorímetro foi de até aproximadamente 1800 000 rfu.

Exemplo 6. Correlação entre atividade de RT do HIV recuperada de plasma humano de acordo com a invenção e RNA viral medido com a PCR de RNA.

Amostras de 1 ml de plasma de EDTA de indivíduos infectados com HIV foram processadas de acordo com “Protocol for determination of retroviral RT from material which contains RT blocking antibodies” e a quantidade de atividade de RT recuperada de cada amostra foi determinada em um ensaio de RT durante a noite usando Caviti® HS kit Lenti RT. As atividades de RT obtidas foram recalculadas em pg HIV 1 RT de acordo com uma curva padrão. A quantidade de RNA do HIV 1 em cada amostra foi medida pela OCR de RNA do HIV lpadrão (Roche, Amplicore). A plotagem dada na Fig. 4 é restrita às amostras com um valor de PCR >500 cópias / ml.

Uma forte correlação foi encontrada entre a quantidade de RT do plasma recuperada de acordo com a invenção e a quantidade de RNA do HIV medida com a PCR (r = 0,93, n = 33, p « 0,001).

Exemplo 7. Protocolo alternativo para o tratamento de amostras de plasma de pacientes infectados com HIV. A etapa de inativação da polimerase em “Protocol for determination of retroviral RT from material which contains RT blocking antibodies” foi realizada de quatro modos: A) Em uma incubação separada de plasma e substância. B) Na mesma incubação como quando o virion se liga ao gel. C) A substância foi incluída na lama de gel durante a armazenagem e o gel pré tratado foi usado para a isolação da RT. D) A substância foi primeiro ligada ao gel, a substância não ligada foi removida por uma lavagem e o gel tratado foi usado de acordo com o protocolo. Os resultados estão apresentados na Fig. 5. Atividade de RT do plasma (♦), atividade de RT do HIV (·).

Todas as quatro alternativas foram verificadas serem úteis, isto é, a atividade de RT do plasma foi inativada sem afetar a atividade de RT do HIV, mas a quantidade de substância requerida para a eliminação quantitativa da atividade de polimerase do plasma humano variou.

Exemplo 8. Restabelecimento da atividade de polimerase do plasma depois do tratamento com agentes modificadores de cisteína diferentes.

Um conjunto de amostras do plasma humano (60 % de plasma em água) foi primeiro incubado com 3 mM da substância modificadora de cisteína indicada ou água (como controle) na temperatura ambiente durante 1 hora. As diluições em série de cinco substâncias potencialmente reativas foram depois adicionadas e as amostras foram incubadas durante mais uma hora. Cada amostra foi finalmente diluída 1:20 e a atividade de RT residual foi determinada com Cavidi® HS kit Lenti RT. A redução total na concentração da substância entre a incubação da amostra e o ensaio de RT foi de 200 vezes. As atividades de RT recuperadas foram recalculadas em porcentagem da atividade de um controle consistindo de plasma incubado na ausência de adições durante ambas as etapas de incubação. Os resultados estão listados na Tabela 3.

Todos os três agentes modificadores de cisteína testados tiveram a capacidade para inativar totalmente a atividade de RT do plasma.

Houve entretanto uma clara diferença nas condições requeridas para reativar a atividade de polimerase que foi tratada com agentes diferentes. A enzima tratada com Timerosal foi muito facilmente reativada enquanto a enzima tratada com 5,5’-Ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) ou Cloramina T requereu tióis de peso molecular baixo fortemente redutivos para a ativação. A partir da Tabela 3 também está evidente que é essencial não usar substâncias antagonísticas muito fortes para inativar o agente modificador de polimerase. Existe um risco para reativar a polimerase de plasma.

Exemplo 9. Quantificação de RT viral em amostras com alta atividade de RT endógena sem purificação. A) plasma em EDTA de um doador de sangue saudável, B) vírus FIV diluído em FCS inativado (destituído de atividade RT) ou C) em meio essencial mínimo de Dulbeco com 5 % de FCS foram diluídos 1:1 e incubados com a concentração indicada de 5,5’-ditiobis-(ácido 2- nitrobenzóico) durante uma hora na temperatura ambiente (20° C). Cada amostra foi depois diluída em série em etapas de quatro vezes em tampão condicionador (B). Cisteamina a uma concentração final de 20 mM foi depois adicionada a todas as amostras e o conjunto foi incubado durante mais uma hora na temperatura ambiente. A atividade de RT de cada amostra foi depois determinada usando Cavidi® HS kit Lenti RT. 15 μΐ de cada amostra foram adicionados a 135 μΐ de mistura de reação dando uma concentração de cisteamina final no ensaio de 2 mM. A atividade de RT recuperada nas três primeiras diluições correspondendo a 7,5, 1,9 e 0,5 μΐ de amostra por ensaio de RT foi recalculada em porcentagem de um controle incubadas na ausência da substância e plotada contra a concentração da substância, ver a Fig. 6. A atividade de polimerase do plasma humano foi eliminada depois da incubação com concentrações de 5,5’-ditiobis-(ácido 2- nitrobenzóico) acima de 0,47 mM. A recuperação da RT do Vírus FIV não foi adversamente afetada pela incubação com concentrações de substância abaixo de 1,88 mM. A RT de FIV pode ser assim medida seletivamente em amostras brutas depois da incubação com 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) em uma faixa de concentração em tomo de 2 mM.

Tabela 1. Algumas características de uma atividade RT não identificada de plasma humano * Condição de referência dando 100 % de atividade de RT

a Concentração final no ensaio de RT PFA = fosfonoformiato trissódico Tabela 2. Substâncias com capacidade para destruir a atividade de RT do plasma humano * ED50 Dose Eficiente 50. A concentração de substância requerida para reduzir a atividade de RT do plasma em 50 %. a Recuperação de RT do HTV de virions em plasma humano incubado com 5 mM da substância indicada e purificada de acordo com o protocolo 1.

Tabela 3. Restabelecimento da atividade de polimerase do plasma depois do tratamento com agentes modificadores de cisteína. a Controle incubado na ausência de agente destruidor. bDitiotreitol cÁcido Mercaptossuccínico. d5,5’-ditiabis-(ácido 2-nitrobenzóico).

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Claims (13)

1. Método de recuperar uma polimerase viral de vírus envelopados em uma amostra biológica contendo polimerases celulares não protegidas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) incubar a amostra biológica com uma substância reativa a sulfidrila para destruir a atividade das polimerase celulares não protegidas enquanto preserva a atividade de polimerase viral dentro do envoltório viral. bl) remover as partículas de vírus envelopado da mistura de incubação, ou b2) inativar a substância reativa a sulfidrila com um agente redutor de sulfidrila, preservando o envoltório viral da lise, c) Iisar o envoltório viral com um tampão de lise para liberar a polimerase viral, e d) recuperar a polimerase viral liberada do tampão de lise.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os vírus envelopados são selecionados da família Retroviridae.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o vírus é selecionado de Lentivírus, vírus HTLV/BLV, retrovírus do tipo D de mamífero e retrovírus do tipo C de mamífero.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o Lentivírus é o vírus da imunodeficiência humana (HIV).

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a atividade de polimerase viral recuperada é a atividade de transcriptase reversa (RT).

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de fluido corpóreo.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido corpóreo é uma amostra de sangue, plasma ou soro.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a substância reativa a sulfidrila é uma substância não lipofüica solúvel em água.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a substância não lipofílica solúvel em água é selecionada do grupo que consiste em N-etilmalemida, Timerosal, p-hidroximercuribenzoato, 5,5’- ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico), 2’-aminoetanotiolsulfonato de 2-aminoetila, ácido 2-nitro-5-tiocianobenzóico e metano-tiossulfonato de metila.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o agente redutor de sulfidrila brando é um agente redutor brando.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente redutor brando é selecionado do grupo que consiste em cisteína, cisteamina, ácido mercaptossuccínico e glutationa.

12. Pacote comercial para realizar o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de conter: uma substância reativa a sulfidrila; uma matriz de ligação viral; um agente redutor de sulfidrila brando; um tampão de lise.

13. Pacote comercial de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: a substância reativa a sulfidrila é selecionada do grupo que consiste em N-etilmalemida, Timerosal, p-hidroximercuribenzoato, 5,5’- ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico), 2-amino-etanotiolsulfonato de 2-aminoetila, ácido 2-nitro-5-tiocianobenzóico e metano-tiossulfonato de metila; a matriz de ligação viral é uma matriz de troca aniônica; agente redutor de sulfidrila brando é selecionado do grupo que consiste em cisteína, cisteamina, ácido mercaptossuccínico e glutationa; e o tampão de lise é um tampão compatível com o ensaio de enzima incluindo um detergente.