JP6522606B2 - 乾燥血斑からの細胞遊離性ウイルス粒子の測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、血液中のウイルス負荷を測定する分野、より特定すると乾燥血斑から細胞遊離性ウイルス粒子を測定する方法に関する。
2013年に、世界保健機関(WHO)は、最新HIV治療及び予防ガイドラインを改訂し、HIV陽性患者の管理におけるHIVウイルス負荷(VL)試験の重要性を強調した。WHOは、HIV抗レトロウイルス療法(ART)をモニタリングするために、臨床所見及びCD4細胞カウントの代わりに、HIVウイルス負荷試験を使用することを強く推奨し、かつ治療的有効性に関するHIV血漿VLレベルのカットオフ値を5000コピー/mLから1000コピー/mLへ低下した。別の言い方をすると、ARTを受けているHIV患者が、1000コピー/mLよりも大きい血漿中ウイルス力価を有する場合、薬物治療は失敗したと考えられるであろう。密着したカウンセリング、薬物耐性試験及び第二の治療計画などの治療失敗に対する反応は、時間がかかりかつ高価であり、必要な場合にのみ使用されるべきである。
DBSの過大評価の一つの解決法は、試料から細胞−結合性RNA及びDNAの両方を除去することであり、これにより血漿試料と同様に、検出されるべき細胞遊離性ウイルスのみを残すことができる。これは、患者を治療失敗として、犠牲の大きい誤分類を行うことを防ぐことができる。かかる方法及び関連した恩恵が、本開示において説明されている。
DBSウイルス負荷測定への細胞−結合性DNAの寄与を低下する製品が利用可能であるが、本明細書に記載された方法は、細胞−結合性RNA及び細胞−結合性DNAの両方を低下することができる。説明された手順は、操作が容易であり、かつ複雑な器具及び生化学処理を必要としない。重要なことに、これらの方法は、DBSに関する現存する試料収集方法を改変せず、又、存在する下流のプロトコール、例えばRMD CAP/CTM HIV-1 DFSP製品を変更しない。
下記の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付された請求項において示される。本発明の精神から逸脱しない限りは、示された手順において変更を行うことができることは理解されるべきである。
プロトコール:
1. 血液をWhatman 903フィルターカード上にスポットし、かつこれを乾燥させるという、標準法を用い、試験されるDBS試料を収集する。
2. 乾燥血斑を、Whatmanフィルターカードから切り出し、適切にラベルされたS字チューブ及びスピンフィルターカラムに配置する。
3. DBSを含むチューブに、PBS緩衝液中の10%メタノール1000μlを添加する。スピンカラムへ添加する場合は、緩衝液500μlのみを添加する。
4. S字チューブ又はスピンフィルターカラムを、56℃、1000rpmのインキュベーター内に10分間配置する。
a.DBSが、S字チューブ内に直接配置される場合は、工程4を飛ばす。
5. カラムを、微量遠心機内で、短く遠心する(VWR 0.2μm遠心フィルターを使用する場合、最大速度5000×gで5〜10分間回転させる)。その後、スピンカラムを取り外し、ディスポーズし、かつ緩衝液500μlを収集チューブに添加する。
6. 試料を、COBAS(登録商標)AmpliPrep上に装加し、HI2DFSP96プロトコールを開始する。
Johanson, H.C.、V. Hyland、C. Wicking、R.A. Sturm、2009, 「変性メタノール固定法を使用するWhatman FTAクラシックカード上に保存された口腔細胞からのDNA溶出(DNA elution from buccal cells stored on Whatman FTA Classic Cards using a modified methanol fixation method)」、BioTechniques、第46巻4号; Medecins Sans Frontieres Access Campaign, 2013, 「試験のためのHIV治療の配置:ウイルス負荷及び治療時点でのCD4診断ツールのための製品ガイド;感染性ウイルス粒子を生じることなくAIDSウイルス抗原を産生する8E5細胞株 (Putting HIV treatment to the test: A product guide for viral load and point-of-care CD4 diagnostic tools; 8E5 cell line Producing Aids Viral Antigens without producing infectious virus particles)」:米国特許第4,752,565号;「SeraCareから培養されたウイルス粒子、分析の検定(Cultured virus particles from SeraCare, Certificate of Analysis )」(Part No: PN-227; Lot #: 51884)。
プロトコール:
1. HIV陽性EDTA全血をWhatman 903フィルターカード上にスポットし、かつこれを少なくとも3時間乾燥させるという標準法を用い、試験されるDBS試料を収集する。[Munktellカードも作業する]。
2. 乾燥血斑を、Whatmanフィルターカードから切り出し、適切にラベルされたS字チューブに配置する。
3. DBSを含むチューブに、PBS緩衝液1000μlを添加する。
4. 外界温度で少なくとも30分間インキュベーションする。
a. 加熱及び振盪(任意に)、
b. 望ましいならば、インキュベーション時間を一晩まで延長することができる。
5. 試料を、COBAS(登録商標)AmpliPrep上に装加し、HI2DFSP96プロトコールを開始する。
乾燥血斑(DBS)は、HIVウイルス負荷試験へのアクセスを改善するが、細胞−結合性ウイルス核酸のために、血漿からとは異なる結果を生じる。以下の実験を、リン酸−緩衝食塩水によるDBS試料からの血漿−結合したウイルスの優先的溶出に関する遊離ウイルス溶出(FVE)法を評価するために行った。
Claims (12)
- 乾燥血斑から細胞遊離性ウイルス粒子を測定する方法であって:
緩衝溶液を、乾燥血液試料へ適用することにより乾燥血液試料を再水和して、再水和された乾燥血液試料を作製し、細胞に付随するRNA及び/又はDNAを細胞と共に含ませ;
細胞に付随するRNA及び/又はDNAを破壊することなく、細胞遊離性ウイルス粒子を優先的に溶出する、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む溶出試薬により、再水和された乾燥血液試料から細胞遊離性ウイルス粒子を溶出し;
再水和された乾燥血液試料中に存在し得るあらゆる細胞デブリから、溶出された細胞遊離性ウイルスを分離するためのフィルターを使用し;並びに
ウイルス粒子定量技術により、細胞遊離性ウイルス粒子を測定する
を含む、方法。 - 再水和された乾燥血液試料中に存在する細胞を固定試薬により固定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子定量技術が、配列−特異的核酸定量、ELISA、PCR、等温核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、及び電子顕微鏡からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記細胞遊離性ウイルス粒子が、HIV、HTLV、HCV、HBV、CMV、及びEBVからなる群から選択されるウイルスのウイルス粒子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定試薬が、メタノール、エタノール、ホルムアルデヒド、クロロホルム、及びアセトンからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記フィルターが、遠心又は吸引によるスピンカラム濾過に用いられる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィルターが、約0.1μm〜約100μmの細孔サイズ範囲を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、固定試薬及び溶出試薬を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定試薬が、メタノールを含み、及び溶出試薬が、PBSを含む、請求項2又は8に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、溶出試薬を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、外界温度で実行される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、振盪又はボルテックスを伴わずに実行される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
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