ES2313907T3

ES2313907T3 - Terapia genica para la isquemia diabetica.

Info

Publication number: ES2313907T3
Application number: ES00971697T
Authority: ES
Inventors: Ryuichi Morishita; Toshio Ogihara
Original assignee: Anges MG Inc
Current assignee: Anges Inc
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2020-10-26
Also published as: HK1041211A1; DE60040383D1; CN1182874C; JP3877148B2; AU778826B2; ATE409494T1; EP1142590B8; US20110045061A1; EP1142590A4; AU1052301A; US20080268030A1; CN1339973A; EP1142590A1; DK1142590T3; US20160250290A1; PT1142590E; CA2356701C; KR20010108053A; CA2356701A1; CY1110445T1

Abstract

Uso de un gen de HGF para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la isquemia diabética, exceptuando la neuropatía diabética.

Description

Terapia génica para la isquemia diabética.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un agente de una terapia génica y a un método de terapia génica para la isquemia diabética, utilizando el gen del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Más específicamente, la presente invención tiene que ver con un método de terapia génica para la isquemia diabética que comprende la administración no invasiva de agentes terapéuticos de isquemia diabética que comprenden un gen de HGF como ingrediente eficaz o gen de HGF.

Técnica antecedente

El HGF es una proteína descubierta primeramente como un factor de crecimiento fuerte para hepatocitos maduros y se ha clonado el gen que lo codifica (Biochem. Biophys. Res. Commun. 122, 1450 (1984); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6489 (1986); FEBS Letter 22, 231 (1987); Nature 342, 440 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3200 (1991)). Más tarde, fruto de las investigaciones, se ha manifestado que el HGF no sólo funciona para reparar y regenerar el hígado dañado como un factor de regeneración de hepatocitos in vivo, sino que también tiene función angiogénica y desempeña un importante papel en el tratamiento y la prevención de enfermedades isquémicas y arteriales (Symp. Soc. Exp. Biol. 47cell behavior, 227-234 (1983); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1937-1941 (1993); Circulation 97, 381-390 (1998)). Es decir, se ha descubierto que cuando se administra HGF al modelo isquémico de miembro inferior de conejo, se observa una angiogénesis significativa así como una mejora en el flujo sanguíneo y una represión del descenso de la presión sanguínea y tiene lugar una mejora de los síntomas isquémicos. De acuerdo con dichos informes, hoy en día se cree que el HGF se expresa y funciona como uno de los factores angiogénicos.

Como se ha mencionado anteriormente, el HGF desempeña varias funciones empezando por funciones como factor angiogénico, y se han llevado a cabo numerosos intentos de usarlo como fármaco. Sin embargo, la vida media del HGF en la sangre resulta ser un problema. La vida media es de tan sólo aproximadamente 10 minutos, haciendo extremadamente difícil mantener su concentración en la sangre. De esta forma, aparecen problemas relacionados con la forma de suministrar niveles eficaces de HGF a la zona afectada.

Por lo general, se reconoce comúnmente que las preparaciones de proteína se administran, en su mayor parte, por vía intravenosa, y en relación con el caso anterior de administración de HGF para el modelo de enfermedad isquémica, se muestran ejemplos de administración intravenosa e intraarterial (Circulation 97, 381-390 (1998)). A pesar del hecho que se pone de manifiesto la eficacia contra la enfermedad isquémica o arterial de la administración intravenosa o intraarterial del HGF a estos modelos animales, aún se están investigando los métodos específicos de administración, las dosis y similares, eficaces para HGF. Todavía quedan por determinar las dosis o métodos de administración eficaces concretos para las proteínas HGF debido a los problemas concernientes a su vida media y a su liberación en la zona afectada, como se ha descrito anteriormente.

Por otra parte, el rápido progreso observado en los últimos tiempos en la biología molecular ha hecho posible activar la función celular a través de métodos de transferencia génica y se han realizado varios intentos. Se han desarrollado algunos ensayos para la terapia génica en la región del corazón. Se han descrito varios métodos tales como el método de infusión difusional coronaria y otros más de este tipo como métodos de terapia génica, pero esto no ocurre para los métodos de transferencia génica para la zona isquémica, en particular el método de infusión intramuscular para el músculo esquelético que muestra efectos sobre la isquemia diabética específica.

Aparte, se sabe que la angiogénesis rara vez se produce y el pronóstico es desfavorable en caso de la enfermedad isquémica complicada o producida por la diabetes. A día de hoy, no se conoce si la administración del gen de HGF en dicha isquemia diabética es eficaz o no.

Descripción de la invención

El objeto de esta invención es suministrar agentes terapéuticos y métodos de tratamiento de la isquemia diabética que utilizan el gen de HGF.

Los inventores investigaron con el propósito de averiguar si el gen de HGF se puede adaptar a la isquemia diabética y pusieron de manifiesto que se obtienen resultados extremadamente eficaces cuando se administra el gen de HGF directamente a la zona isquémica afectada. Más concretamente, en lo que se refiere a la enfermedad isquémica del miembro inferior, se encontró que se obtienen resultados eficaces administrando el gen de HGF a la capa del miembro inferior. Como se ha mencionado anteriormente, se sabe que la angiogénesis rara vez ocurre y su pronóstico es desfavorable en la enfermedad isquémica agravada con o causada por la diabetes. Por lo tanto, a diferencia de la enfermedad isquémica simple, se desconoce si el gen de HGF es eficaz con respecto a la isquemia diabética. La presente invención reveló por primera vez la eficacia del gen de HGF para la isquemia diabética.

Como el presente método es un tratamiento no invasivo, tiene la ventaja de que es posible administrar el presente gen repetidamente de acuerdo con la condición.

Así, el resumen de la presente invención es como sigue:

(1): un agente terapéutico para la isquemia diabética, que comprende el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) como ingrediente eficaz;

(2): el agente terapéutico según (1), usado para administración en la zona isquémica;

(3): el agente terapéutico según (1) o (2), en el que la isquemia diabética se selecciona de un grupo consistente en isquemia diabética en miembro inferior, neuropatía isquémica diabética o infarto de miocardio asociado con isquemia diabética;

(4): el agente terapéutico según (3), en el que la isquemia diabética es isquemia diabética en miembro inferior;

(5): el agente terapéutico según (1) y (4), usado para su administración en el músculo de la zona isquémica;

(6): el agente terapéutico según cualquiera de los puntos (1) a (5), en el que el gen de HGF está en forma de un liposoma de virus Sendai (HVJ);

(7): el agente terapéutico según cualquiera de los puntos (1) a (6), que es a administrar repetidamente según necesidad;

(8): el agente terapéutico según cualquiera de los puntos (1) a (7), en el que la cantidad de gen de HGF usado es al menos 50 \mug;

(9): un método de tratamiento de la isquemia diabética, que comprende la transferencia del gen de HGF a seres humanos;

(10): el método según el punto (9), en el que el gen de HGF se administra en la zona isquémica;

(11): el método según los puntos (9) ó (10), en el que la isquemia diabética se selecciona del grupo consistente en isquemia diabética en miembro inferior, neuropatía isquémica diabética o infarto de miocardio asociado con isquemia diabética;

(12): el método según el punto (11), en el que la isquemia diabética es isquemia diabética en miembro inferior;

(13): el método según cualquiera de los puntos (9) a (12), en el que el gen de HGF se administra en el músculo de la zona isquémica;

(14): el método según cualquiera de los puntos (9) a (13), en el que el gen de HGF está en forma de un liposoma con virus Sendai (HVJ);

(15): el método según cualquiera de los puntos (9) a (14), en el que el gen de HGF se administra repetidamente según necesidad;

(16): el método según cualquiera de los puntos (9) a (15), en el que la cantidad mínima de gen de HGF a administrar es 50 \mug;

(17): uso del gen de HGF para preparar agentes terapéuticos para isquemia diabética;

(18): el uso según (17), en el que la isquemia diabética se selecciona de un grupo consistente en isquemia diabética en miembro inferior, neuropatía isquémica diabética e infarto de miocardio asociado con isquemia diabética;

(19): el uso de acuerdo con (18), en el que la isquemia diabética es isquemia diabética en miembro inferior;

(20): el uso según cualquiera de los puntos (17) a (19), en el que el gen de HGF está en forma de un liposoma con virus Sendai (HVJ); y

(21): el uso según cualquiera de los puntos (17) a (20), en el que la cantidad mínima de gen de HGF a usar es 50 \mug.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica que muestra los cambios en el índice de perfusión de sangre a lo largo del tiempo en un grupo de ratas con isquemia diabética en miembro inferior en la referencia 1 y en el grupo control, en el que se introdujo la isquemia del miembro inferior en ratas normales.

La figura 2 es una gráfica que muestra la concentración interna de HGF en músculo isquémico en un grupo de ratas con isquemia diabética en miembro inferior en la referencia 1 y en el grupo control, en el que se indujo isquemia del miembro inferior en ratas normales.

La figura 3 muestra el índice de perfusión de sangre del grupo de ratas con isquemia diabética en miembro inferior en la referencia 1, en el que el gen de HGF se administró o no, y también el índice de perfusión de sangre del grupo control, en el que se indujo isquemia en miembro inferior en ratas normales.

La figura 4 es una gráfica que muestra el resultado de la comparación del número de vasos sanguíneos del grupo de ratas con isquemia diabética en miembro inferior en la referencia 1, al cual se administró o no el gen de HGF, y del grupo control, en el cual se indujo una isquemia en miembro inferior en ratas normales mediante tinción con ALP (fosfatasa alcalina) del músculo esquelético de la zona isquémica en miembros inferiores.

La figura 5 es una gráfica que muestra la concentración de MMP-1 en el sobrenadante de cultivo de la célula angioendotelial con glucosa añadida en la referencia 2, a la cual se administró o no el HGF, y del grupo control, al cual no se añadió glucosa.

La figura 6 es una gráfica que muestra la cantidad de ARNm de factor de transcripción que se expresa en la célula angioendotelial, del grupo de la célula angioendotelial con glucosa añadida en la referencia 3, a la cual se administró o no HGF, y del grupo control, al cual no se añadió glucosa.

Mejor modo de realizar la invención

Como se usa aquí, "gen de HGF" quiere decir un gen que puede expresar HGF (la proteína HGF). Específicamente, se mencionan el ADNc de HGF descrito en Nature 342: 440 (1989); Publicación de Patente japonesa Nº 2777678; Biochem.Biophys. Res. Commun. 163: 967 (1989); y Biochem. Biophys. Res. Commun. 172; 321 (1990) y similares, integrados dentro de vectores de expresión adecuados (vector viral, vector no-viral) descritos más adelante. La secuencia base del ADNc que codifica el gen de HGF de la presente invención se ha descrito en la bibliografía mencionada anteriormente y también está registrada en bancos de datos tales como el GenBank. De esta manera, basándose en dicha información de secuencia y usando una porción adecuada de ADN como cebador de PCR, es posible clonar el ADNc de HGF, por ejemplo, llevando a cabo una reacción RT-PCR en ARNm obtenido del hígado o de los leucocitos. Un especialista en la técnica puede llevar a cabo tal clonación siguiendo un libro de texto básico, tal como Molecular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Los genes HGF de la presente invención no se restringen a los genes mencionados anteriormente, sino que también incluyen los genes que expresan proteínas con sustancialmente la misma función que el HGF. Es decir, los siguientes genes se incluyen en la categoría del gen de HGF de la presente invención: 1) ADN que híbrida con dicho ADNc en condiciones rigurosas, y 2) ADN que codifica proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos en la que 1 o más (preferiblemente varios) aminoácidos se han sustituido, delecionado y/o añadido a la proteína codificada por dicho ADNc y que codifica proteínas que tienen la función de HGF. Los ADN anteriores de 1) y 2) se pueden obtener fácilmente, por ejemplo, por mutagénesis dirigida, el método de PCR, el método de hibridación ordinal y similares. Estos métodos se pueden realizar fácilmente según el libro de texto básico citado anteriormente.

Por consiguiente, se explican los métodos de transferencia de genes, las formas de dosificación, las dosis y similares para su uso en la terapia génica de la presente invención.

La forma de dosificación del agente de terapia génica que comprende el gen mencionado anteriormente como ingrediente eficaz a administrar al paciente se clasifica en dos grupos: uno es el caso en el que se usa un vector no viral, y el otro es en el que usa un vector viral. En los manuales experimentales (Supplement of Experimental Medicine, Basic Technology in gene therapy, Yodosha (1996); Supplement of Experimental Medicine, Experimental Methods in Gene Introduction and Expression Analysis, Yodosha (1997); Handbook for Development and Research of Gene Therapy, Japan Society of Gene Therapy ed., NTS (1999)) se explican métodos de preparación y administración de los mismos. Más adelante se explican usos específicos.

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A. Uso de un vector no-viral

Puede usarse un vector de expresión recombinante en el cual se ha integrado el gen objeto de interés dentro de un vector de expresión de genes comúnmente usado, para introducir el gen objeto de interés en las células o el tejido, mediante el siguiente método etc.

Los métodos ilustrativos de transferencia génica a células incluyen el método de lipofección, el método de co-precipitación con fosfato de calcio, el método de DEAE-dextrano, métodos de introducción directa de ADN usando microtubos de vidrio y similares.

En cuanto a los métodos de transferencia génica en el tejido, se puede incorporar un vector de expresión recombinante en las células sometiéndolo a cualquier método, tal como el método de transferencia génica con liposoma de tipo interno, método de introducción génica con liposoma de tipo electrostático, el método de liposoma-HVJ, su versión mejorada (método de liposoma HVJ-AVE), el método de introducción de genes mediados por receptor, el método de introducción de moléculas de ADN junto con soportes (partículas de metal) mediante un disparador de partículas, el método de introducción directa de ADN desnudo, el método de introducción con polímeros cargados positivamente, y similares.

Entre ellos, el método liposoma-HVJ es un producto de fusión preparado encerrando ADN en un liposoma hecho de bicapa lipídica, que se fusiona con el virus Sendai inactivado (virus hemaglutinante del Japón: HVJ). El método de liposoma-HVJ se caracteriza por una gran actividad de fusión con la membrana celular, en comparación con el método de liposoma convencional, y es un modo preferido de introducción. Para más detalles sobre el método de preparación de Liposoma-HVJ, véase la bibliografía (Separate volume of Experimental Medicine, Basic Technology in gene therapy, Yodosha (1996); Experimental Methods in Gene Introduction and Expression Analysis, Yodosha (1997); J.Clin. Invest. 93: 1458-1464 (1994); Am. J. Physiol. 271: R1212-1220 (1996)) y similares, y los ejemplos experimentales descritos más adelante. En particular, se prefiere la cepa Z (disponible en la ATCC) como cepa de HVJ, pero se pueden emplear también otras cepas de HVJ (por ejemplo, ATCC VR-907 y ATCC VR-105).

Además, el método de introducir directamente ADN desnudo es el más simple entre los métodos descritos anteriormente y, a este respecto, un método de introducción preferido.

Los vectores de expresión usados aquí pueden ser cualquier vector de expresión siempre y cuando permitan la expresión in vivo del gen objeto de interés. Algunos ejemplos incluyen vectores de expresión tales como pCAGGS (Gene 108:193-200 (1991)), pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene) y similares.

B. Uso de un vector viral

Los métodos representativos que usan vectores virales incluyen aquellos que usan vectores virales tales como adenovirus recombinantes, retrovirus recombinantes y similares. Más específicamente, el gen objeto de interés puede introducirse dentro de virus de ADN tales como el retrovirus detoxificado, el adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus, virus Sindbis, virus Sendai, SV40, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y similares, que infectan a la célula para introducir el gen en la célula.

Entre los vectores virales anteriores, se sabe que la eficacia de infección del adenovirus es mucho más alta que la de los otros vectores virales. A este respecto, se prefiere utilizar un sistema de vectores de adenovirus.

Como métodos para introducir agentes de terapia génica en un paciente hay métodos in vivo que permiten una introducción directa del agente de terapia génica en el cuerpo, y también hay métodos ex-vivo, en los que se extraen ciertas células de un ser humano en las que se introduce el agente de terapia génica, y luego se devuelven al cuerpo (Nikkei Science, publicación de Abril de 1994 pp. 20-24; Monthly Yakuji 36(1)-23-48 (1994); Supplement To Experimental Medicine 12 (15) (1994); Handbook for Development and Research of Gene Therapy, NTS (1999)). Según la presente invención, es preferible el método in vivo.

Las formas de dosificación pueden tomar varias formas según los diversos regímenes de administración descritos anteriormente (por ejemplo, líquidos). Cuando, por ejemplo, se va a usar una inyección que contiene el gen como ingrediente eficaz, dicha inyección puede prepararse disolviendo los ingredientes eficaces en un disolvente convencional (un tampón tal como PBS, solución fisiológica salina, agua esterilizada, etc.). El líquido de inyección después puede esterilizarse por filtración cuando sea necesario, y posteriormente introducirse en recipientes esterilizados. Se pueden añadir a la inyección vehículos convencionales y similares. Los liposomas, tales como el liposoma-HVJ pueden tomar la forma de suspensiones, formulaciones congeladas, formulaciones congeladas concentradas por centrifugación y similares.

Se pueden usar factores conocidos que tengan funciones angiogénicas, de forma adicional o por sí solos, aparte del gen de HGF usado en esta invención. Por ejemplo, se informa de que factores tales como el factor de crecimiento del endotelio vascular, o VEGF, y el factor de crecimiento fibroblástico, o FGF, tienen funciones angiogénicas y, por lo tanto, tales genes se pueden usar. Además, se informa de que factores del crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico, o EGF, reparan lesiones celulares en diversos tejidos, de manera que también pueden usarse genes que los codifican.

La isquemia diabética aquí tratada incluye enfermedades tales como la isquemia diabética en miembro inferior, la neuropatía isquémica diabética y el infarto cardíaco asociado con isquemia diabética y similares, y el agente terapéutico de esta invención se puede aplicar a cualquiera de estas enfermedades. Además, no sólo se puede aplicar el agente terapéutico de esta invención a pacientes críticos con isquemia diabética, sino también a pacientes con síntomas progresivamente moderados.

Los métodos apropiados y las zonas adecuadas para administración para la enfermedad o síntoma a tratar se seleccionan en función del agente de terapia génica de esta invención. Respecto a los métodos de administración, son preferibles métodos de administración parenteral. Como zona preferible de administración, puede mencionarse la zona isquémica. "Zona isquémica" se refiere aquí a la zona que incluye la zona afectada de isquemia y zonas circundantes de la misma.

Específicamente, es posible la administración en el vaso sanguíneo o en el músculo de la zona isquémica. Sin embargo, se prefiere la administración en el músculo de la zona isquémica. En otras palabras, la administración en el músculo esquelético de la zona isquémica en el miembro inferior permite la estimulación de la angiogénesis en la zona afectada de isquemia y una mejora del flujo sanguíneo. De ese modo, se facilita la recuperación y normalización de las funciones en la zona isquémica. En cardiopatías, tales como el infarto cardíaco, se pueden obtener efectos similares mediante administración en el músculo cardíaco.

Los ejemplos de métodos de administración preferidos incluyen, por ejemplo, administración por catéter no invasivo, inyector no invasivo y similares. Además se pueden mencionar métodos de administración que utilizan un catéter no invasivo, inyector no invasivo y métodos similares con el uso de ecografía. Como método de uso de un catéter no-invasivo en una cardiopatía puede indicarse, por ejemplo, la inyección de genes de HGF directamente en el músculo cardíaco desde el espacio interno del ventrículo.

La aplicación del gen de HGF de la presente invención hace posible un tratamiento positivo para pacientes con isquemia diabética. Por ejemplo, permite la recuperación de función en pacientes con síntomas críticos para quienes no queda otra opción que la escisión quirúrgica de la región afectada.

La dosificación del agente terapéutico de esta invención varía dependiendo de los síntomas del paciente, pero se pueden definir dosificaciones para los genes de HGF de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 50 mg, preferiblemente de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 5 mg, y más preferiblemente de aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg por paciente adulto.

El agente terapéutico de esta invención es apto para su administración una vez cada varios días o una vez cada varias semanas y la frecuencia de administración se selecciona de manera apropiada dependiendo de los síntomas de los pacientes. De acuerdo con el tratamiento terapéutico de la invención, los genes se administran de forma no invasiva y, por lo tanto, los genes deseados se pueden administrar tanto como la condición demande.

La presente invención se explicará a continuación específicamente haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Debería apuntarse, sin embargo, que la presente invención no esta limitada por estos ejemplos de manera alguna.

Materiales y métodos Preparación del agente liposoma-HVJ

Se mezclaron 10 mg de lípido seco (mezcla 1:4:8:2 de fosfatidil serina, fosfatidil colina y colesterol) y 200 \mul de solución salina equilibrada (NaCl 137 \muM, KCl 5,4 \muM, Tris-HCl 10 \muM; pH 7,6) que contenía el gen de HGF (100 \mug) - HMGl (proteína nuclear del grupo 1 de alta movilidad, 25 \mug) y, agitando enérgicamente con ultrasonicación, se formaron liposomas. Se irradiaron virus Sendai purificados (cepa Z) con radiación ultravioleta (110 erg/mm^{2}/seg) durante tres minutos. La suspensión de liposomas se mezcló con virus Sendai (HVJ), se calentó a 4ºC durante 10 minutos y después se calentó de nuevo a 37ºC durante 30 minutos. Se desechó el HVJ libre y así se obtuvo el agente de liposoma-HVJ.

Animales experimentales

Grupo administrado: rata isquémica de rata diabética (rata-DM).

Rata Control: rata isquémica de rata normal.

Método de administración del agente de liposoma-HVJ

Mediante la escisión quirúrgica de la arteria femoral de una pata de la rata diabética (6 semanas de vida; 6 animales por grupo), en la que se provocó una diabetes por administración interperitoneal de estreptozotocina, se produjo un estado isquémico en el miembro inferior.

La preparación del liposoma-HVJ que contenía el gen de HGF se inyectó en el músculo esquelético del miembro inferior.

Detalles del examen

Después de la administración de la preparación de liposomas, se midió el flujo sanguíneo del miembro inferior mediante una cámara láser Doppler (LDI), usando un análisis por dispersión de láser como índice de formación de derivación circulatoria y de efectos de mejora del flujo sanguíneo. La media del histograma de color del miembro isquémico inferior respecto al del miembro inferior normal se tomó como índice de perfusión.

La densidad de capilares sanguíneos en la zona isquémica del miembro inferior se midió mediante tinción con fosfatasa alcalina (ALP), y se comparó el resultado del grupo de ratas diabéticas con isquemia en el miembro inferior con el resultado del grupo de control de ratas con isquemia en el miembro inferior. Alternativamente, se hizo una comparación entre los grupos a los cuales se les había administrado el gen de HGF y a los que no.

Referencia 1

Estado de expresión de HGF en la zona isquémica del miembro inferior de la rata diabética

Se produjo un estado isquémico en la zona del miembro inferior mediante la escisión quirúrgica de la arteria femoral de una pata de las ratas diabéticas (6 semanas de vida; 6 animales por grupo), en las cuales se provocó una diabetes por administración interperitoneal de estreptozotocina, y de ratas normales (6 semanas de vida; 6 animales por grupo) como grupo de control.

Después de 1 semana, se midió el índice de perfusión de la zona isquémica mediante una cámara láser Doppler. El índice de perfusión de la zona isquémica o la rata diabética con isquemia en miembro inferior era mucho menor que el de la rata de control con isquemia en el miembro inferior (véase la figura 1).

Se midió el índice de perfusión del miembro inferior 3 semanas más tarde y 5 semanas más tarde, obteniéndose los mismos resultados. Es decir, el índice de perfusión del miembro inferior de la rata diabética con isquemia en el miembro inferior fue mucho menor que el de la rata de miembro inferior de control (véase la figura 1).

La concentración interna de HGF en los músculos fue significativamente menor en los músculos de la zona isquémica de la rata diabética con isquemia en el miembro inferior que en los músculos de la rata de control con isquemia en el miembro inferior. Este resultado indica que la angiogénesis en la diabetes es pobre debido a un descenso en el HGF interno en los músculos. Por lo tanto, rara vez se produce angiogénesis en la rata diabética con isquemia en un miembro inferior, y no se desarrolla desviación circulatoria (véase la figura 2).

Experimento 1

Efecto de la terapia génica de HGF en rata diabética con isquemia en miembro inferior (I)

Se produjo un estado isquémico en la zona del miembro inferior mediante la escisión quirúrgica de la arteria femoral de una pata de las ratas diabéticas (6 meses de vida; 6 animales por grupo), en las cuales se provocó una diabetes mediante la administración interperitoneal de estreptozotocina. Después de la escisión quirúrgica de la arteria femoral, se inyectó una infusión de preparación de liposoma-HVJ que contenía el gen de HGF (50 \mug) en el músculo de la zona isquémica del miembro inferior.

Después de 3 semanas, se midió el índice de perfusión de la zona isquémica con una cámara láser Doppler. El índice de perfusión de la zona isquémica de la rata diabética con isquemia en miembro inferior, a la cual se había administrado el gen de HGF, mostró un incremento significativo en comparación con la rata con isquemia en miembro inferior de control o con la rata diabética con isquemia en miembro inferior sin administración.

Tomando el índice de perfusión de la rata con isquemia en miembro inferior de control como el 100%, el de la rata diabética con isquemia en miembro inferior no tratada con el gen de HGF fue de un 67% y el de la rata diabética con isquemia en miembro inferior que había recibido HGF fue de un 129%. Los resultados se muestran en la Figura 3 (véase la Figura 1).

Experimento 2

Efecto de la terapia con el gen de HGF en la rata con isquemia en miembro inferior (II)

Se preparó y sometió a terapia con gen de HGF a la rata diabética con isquemia en miembro inferior y a la rata con isquemia en miembro inferior de control, tratadas como se ha descrito anteriormente. 5 semanas más tarde se extrajo músculo esquelético de la zona isquémica de miembro inferior de cada animal, se sometió a tinción con ALP y se comparó el número de vasos sanguíneos por unidad de área. El número de vasos sanguíneos en la rata diabética con isquemia en miembro inferior no tratada con gen de HGF fue significativamente inferior al de la rata con isquemia en miembro inferior de control, y el de la rata diabética con isquemia en miembro inferior tratada con HGF era significativamente mayor. Los resultados se muestran en la Figura 4.

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Referencia 2

Influencia de la concentración de glucosa y de la adición de HGF contra la producción de MMP-1 de la célula angioendotelial

Se cultivaron células angioendoteliales (obtenidas a partir de aorta humana) en tres tipos de medio sin suero que contenía glucosa a una concentración de 0, 25 mM y 50 mM, respectivamente. Después de 24 horas de cultivo, se midió la concentración de MMP-1 en el sobrenadante del cultivo.

Se comparó cada muestra con aquella en la cual se añadieron 100 ng/ml de HGF 30 minutos antes de la adición de glucosa.

La concentración de MMP-1 del sobrenadante disminuyó significativamente dependiendo de la concentración de glucosa, y se demostró que el descenso de MMP-1 se debía a la inhibición causada por el tratamiento con HGF. Los resultados se muestran en la Figura 5.

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Referencia 3

Efecto del HGF contra células angioendoteliales (cambios de factor de transcripción ETS-1 relacionado con la angiogénesis)

Se llevó a cabo un cultivo de células angioendoteliales como en la referencia 2, y se detectó la expresión de ARNm del factor de transcripción ETS-1 en las células. Tomando el ARNm de ETS-1 en la célula endotelial de control como un 100%, el de la célula angioendotelial no tratada con HGF disminuyó de una forma dependiente de la glucosa. Por otra parte, células angioendoteliales tratadas con HGF expresaron el ARNm de ETS-1 a un nivel igual o mayor que las células del grupo de control (P<0,01). Los resultados se muestran en la Figura 6.

Tal y como se ha descrito anteriormente, las células angioendoteliales con una alta concentración de glucosa muestran una disminución en la expresión de MMP-1, que es una enzima de escisión de la matriz esencial para la angiogénesis, y muestran una disminución en la expresión del ARNm del factor de transcripción ETS-1, que se expresa y aumenta durante la angiogénesis.

Por consiguiente, se reveló que la angiogénesis rara vez ocurre en una situación de alto nivel de glucosa. Por otra parte, se demostró que mediante la adición de HGF a la célula angioendotelial en una condición de alto nivel de glucosa, la expresión de MMP-1 y de ARNm de ETS-1 aumenta de forma significativa. De esta forma, se puso de manifiesto que el HGF hace más fácil la angiogénesis.

Aplicabilidad industrial

El agente terapéutico para la isquemia diabética que contiene el gen de HGF como ingrediente eficaz mejora la angiogénesis deficiente específica de la zona afectada con isquemia diabética, con una disminución de la expresión de HGF y muestra un efecto angiogénico significativo. Por lo tanto, mejora la afección mediante el aumento del flujo sanguíneo en el área afectada de isquemia. Además, el agente terapéutico de esta invención se puede administrar más de una vez, dependiendo de los síntomas del paciente, estimulando de ese modo la angiogénesis. Por lo tanto, según estos efectos, el agente terapéutico de esta invención hace posible tratar la isquemia diabética en miembro inferior, la neuropatía isquémica diabética y el infarto cardíaco asociado con la diabetes.

Claims

1. Uso de un gen de HGF para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la isquemia diabética, exceptuando la neuropatía diabética.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el gen de HGF es para administración a un ser humano.

3. El uso según la reivindicación 2, en el que el medicamento se prepara para administración de aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg del gen de HGF.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que el gen de HGF es para administración en una zona isquémica o en partes circundantes de la misma.

5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la isquemia diabética es isquemia diabética en miembro inferior o infarto de miocardio asociado con la isquemia diabética.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que la isquemia diabética es isquemia diabética en miembro inferior.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que el gen de HGF es para administración en músculo esquelético.

8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el gen de HGF está en forma de un liposoma con virus Sendai (HVJ).

9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el gen de HGF es para la administración repetida según necesidad.

10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el gen de HGF incrementa los niveles de ARNm de ETS-1.

11. Un gen de HGF para el tratamiento de una isquemia diabética exceptuando la neuropatía diabética.

12. El gen de HGF según la reivindicación 11, en el que el gen de HGF es para administración a un ser humano.

13. El gen según la reivindicación 12, en el que el gen de HGF es para administración a una dosificación de aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg.

14. El gen de HGF según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el gen de HGF es para administración a una zona isquémica o partes circundantes de la misma.

15. El gen de HGF según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la isquemia diabética es isquemia diabética en miembro inferior o infarto de miocardio asociado con isquemia diabética.

16. El gen según la reivindicación 15, en el que la isquemia diabética es isquemia diabética en miembro inferior.

17. El gen de HGF según la reivindicación 16, en el que el gen de HGF es para administración en músculo esquelético.

18. El gen de HGF según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que el gen de HGF está en forma de liposoma con virus Sendai (HVJ).

19. El gen de HGF según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que el gen de HGF es para la administración repetida según necesidad.

20. El gen de HGF según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que el gen de HGF aumenta el nivel de ARNm de ETS-1.