WO2003103721A1 - 脳血管障害遺伝子治療剤 - Google Patents

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WO2003103721A1
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hgf
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森下　竜一
宗尚 島村
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アンジェス エムジー株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to treatment or prevention of cerebrovascular disorders using a hepatocellular growth factor (liepatocyte growth factor; HGF) gene. More specifically, the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent containing the HGF gene as an active ingredient, and a method characterized by administering the therapeutic or prophylactic agent to a target site.
  • HGF hepatocellular growth factor
  • Hepatocyte growth factor is a cytokinin found as a factor that causes hepatocytes to grow in ⁇ (Biochem. Biophys. Res. Conmmn. 122: 1450 (1984); Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 6489 (1986); FEBS Letters 22: 231 (1 987); Nature 342: 440-443 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3200 (199 l))
  • HGF Is a plasminogen-related and mesenchymal-derived pleiotropic growth factor that is known to regulate cell growth and cell motility in a variety of cells (Nature 342: 440-443 (1989); Biochem. Biophys. Res.
  • HGF has various functions including the function of an angiogenic factor
  • various attempts have been made to utilize it as a pharmaceutical (Experimental Medicine (Extra) 10 (3): 330-339 (1992)).
  • the following uses of HGF have been reported.
  • Amyotrophic lateral sclerosis therapeutic agent JP-A-2002-87983
  • Cartilage disorder therapeutic agent JP-A-8-59502
  • an inactivated virus without replication of a viral protein is used as a virus envelope, and a gene is encapsulated therein, so that it can be used as a vector for introducing a gene into cultured cells, living tissues, and the like.
  • a virus envelope vector liver, skeletal muscle, uterus, brain, eye, carotid artery, skin, blood vessels, lung, heart, kidney, spleen, cancer tissue, nerve, B lymphocyte, respiratory organ It is known that genes can be safely and efficiently introduced into tissues, floating cells, and the like.
  • Cerebral vascular diseases such as cerebral infarction and intracerebral hemorrhage are socially important diseases. Although mortality from cerebrovascular disease has declined in recent years, it still ranks high in causes of death. In addition, the number of patients with sequelae of ischemic cerebrovascular disease and the number of patients hospitalized or going to medical institutions are still increasing.
  • cerebral infarction is a condition in which brain tissue irreversibly falls into ischemia due to an ischemic lesion caused by occlusion of the cerebral artery or cervical artery or a decrease in perfusion pressure. Cerebral infarction is roughly classified into the following three types (Curve Naoto Hisao, Omae Teruo, “Cerebrovascular Disease” Life Science Publishing, p54-55 (1992); Imura, Hiroo et al. Vol. 66, Cerebrovascular Disease, Nakayama Shoten, p. 28 (1996)).
  • cerebral infarction cerebral edema appears several hours after onset, and this condition continues for about one week after onset. Thereafter, the edema gradually decreases, but is fixed as an infarct lesion between 1 and 3 months after onset. Cerebral edema causes an increase in brain volume. Because the brain is covered by a hard skull, cerebral edema can cause acute tissue and cranial pressures if the brain capacity exceeds certain limits. As a result, cerebral damage worsens, and the range of subsequent infarct lesions is determined (Kenji Inamura, Akashiro Kaku, “Clinics of Japan, Volume 51 CT, Stroke Studies in the MRI Era”, Nihon Clin. ).
  • cerebral circulation improving drugs given in the chronic phase after about one month after a stroke are considered to be unsuitable for use in the acute phase.
  • Other therapies such as thrombolytic therapy, bypass, thrombointimal detachment, and embolectomy, in the hyperacute phase after onset, in order to resume blood flow in the area if cell death has not occurred. Perfusion therapy is given.
  • An object of the present invention is to provide a drug capable of reducing the degree of cerebral ischemia-reperfusion injury associated with reperfusion following cerebral blood flow blockage to the brain.
  • the HGF gene unlike other angiogenic factors such as VEGF, does not cause increased permeability of fired blood vessels. Especially in cerebrovascular disorders, cerebral edema and brain tissue due to increased intracerebral pressure Treatment and prevention methods using HGF, which does not cause vascular hyperpermeability, are more advantageous than those using other angiogenic factors.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic or prophylactic agent for cerebrovascular disease using the HGF gene, and a method for treating and preventing cerebrovascular disease using the drug. That is, the gist of the present invention is as follows.
  • a therapeutic or preventive agent for cerebrovascular disease comprising the HGF gene.
  • Genes are transfected with the carrier using the virus-envelope method, the encapsulated ribosome method, the electrostatic liposome method, the HVJ-ribosome method, the improved HVJ-ribosome method, the receptor-mediated gene transfer method, and the particle gun.
  • a method for treating or preventing a cerebrovascular disorder which comprises a step of introducing an HGF gene into a mammal.
  • HGF gene used in the present invention means HGFCBGF protein
  • the nucleic acid molecule refers to a nucleic acid molecule such as DNA, RNA, cDNA, and mRNA.
  • cDNA encoding HGF is described in, for example, Nature 342: 440 (1989), Japanese Patent No. 2777678, Biochem. Biophys. Res. Commun. 163: 967 (1989) and the like.
  • the nucleotide sequence of cDNA encoding HGF is described in the above-mentioned literature, and is also registered in databases such as GenBank.
  • HGF cDNA can be cloned by performing RT-PCR on mRNA derived from liver or leukocytes using an appropriate sequence portion as a PCR primer based on these sequence information. Such closing can be easily performed by those skilled in the art, for example, according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Genomic DNA can also be isolated by performing
  • the HGF gene of the present invention is not limited to these cDNAs and genomic DNA, and may be used as the HGF gene of the present invention as long as the expressed protein encodes a protein having substantially the same action as HGF. be able to. That is, 1) a nucleic acid that hybridizes with the cDNA under stringent conditions, or 2) one or more (preferably several) amino acids are deleted from the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA, Among nucleic acids encoding a protein consisting of a substituted, added and / or inserted amino acid sequence, any nucleic acid that encodes a protein having the function of HGF is included in the scope of the HGF gene that can be used in the present invention. It is.
  • the nucleic acids 1) and 2) described above are, for example, site-directed mutagenesis, PCR (Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al. (1987) publish John Wiley & Sons, Section 6.1-6.4). ) Or a conventional hybridization method (see Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) publish John Wiley & Sons, Section 6.3-6.4) or the like. That is, those skilled in the art can isolate a nucleic acid that hybridizes with the known HGF gene using the known HGF gene sequence or a part thereof as a probe or an oligonucleotide that specifically hybridizes with the DNA as a primer. it can.
  • Stringent conditions for hybridization to obtain a nucleic acid encoding a protein functionally equivalent to a known HGF include conditions of about 1 ⁇ SSC, 37 ° C., and more stringent conditions include: “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C” can be cited, and more severe conditions can be “0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C”.
  • the nucleic acid having a sequence highly homologous to the prop sequence can be isolated as the conditions for hybridization are strictly set.
  • the conditions for SSC, SDS, and temperature listed here are merely examples, and those skilled in the art will recognize these conditions and other hybridization conditions such as probe concentration, probe length, and reaction time.
  • the protein encoded by the nucleic acid isolated by the hybridization method or the PCR method as described above usually has a high amino acid sequence homology to a conventionally known HGF protein.
  • High homology refers to sequence homology of at least 50% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably 90% or more (eg, 95% or more).
  • the identity of the amino acid sequence or nucleotide sequence can be determined by algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877 (1993)).
  • the HGF gene used in the present invention may be a naturally-derived or artificially produced nucleic acid as long as the protein encoded by the gene has HGF activity.
  • HGF has an activity to promote the proliferation of hepatocytes in ra'z ro. Therefore, whether a protein encoded by a nucleic acid obtained by a hybridization method or a nucleic acid obtained by modifying a natural HGF gene as described above has HGF activity is determined by, for example, the proliferation of hepatocytes in the protein in vivo. Can be tested by examining the effect on
  • Methods for administering a gene therapy agent containing an HGF gene as an active ingredient to a patient can be broadly classified into two methods: a method using a non-viral vector and a method using a viral vector.
  • the preparation method and administration method of vectors are described in detail in the experimental manuals etc. (Separate volume experimental medicine, basic technology of gene therapy, Yodosha (1996); Separate volume experimental medicine, gene transfer & expression analysis experiment method, sheep Tsuchiya (1997); Gene Therapy Development Research Handbook, edited by the Japanese Society of Gene Therapy, N.T.S (1999)).
  • those vectors and methods will be specifically described.
  • the target gene can be introduced into cells or tissues by the following method using a recombinant expression vector in which the target gene is incorporated into a conventional non-viral gene expression vector.
  • Examples of a method for introducing a gene into cells include a ribofection method, a co-precipitation method with calcium phosphate, a DEAE-dextran method, and a direct injection method of DNA using a micro glass tube.
  • Examples of the method of gene transfer into tissues include virus-envelope method, gene transfer method using internal type liposome, gene transfer method using electrostatic type liposome, HVJ-ribosome method, and improved HVJ- Liposome method (HVJ-AVE liposome method), receptor-mediated gene transfer method, Transfer the DNA expression vector into cells by using a particle gun to transfer DNA molecules together with the carrier (metal particles) into cells, direct introduction of naked-DNA, introduction using positively charged polymer, etc. Can be captured.
  • HVJ-ribosome is obtained by encapsulating DNA in ribosome made of lipid bilayer membrane, and further fusing this ribosome with inactivated Sendai virus (Hemaggulutinating virus of Japan: HVJ).
  • the HVJ-ribosome method is characterized by having a very high fusion activity with the cell membrane as compared with the conventional ribosome method, and is one of particularly preferable introduction forms.
  • For the preparation method of HVJ-ribosome see Separate Volume Experimental Medicine, Basic Technology of Gene Therapy, Yodosha (1996); Separate Volume Experimental Medicine, Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method, Yodosha (1997); Clin. Invest. 93: l458-1464 (l994); Am. J.
  • HVJ liposome method is, for example, a method described in Molecular Medicine 30: 1440-1448 (1993); Experimental Medicine 12: 1822-1826 (1994); protein, nucleic acid, enzyme 42, 1806-1813 (1997). Yes, preferably the method described in Circulation 92 (Suppl. II): 479-482 (1995).
  • a particularly preferred method for administering the HGF gene of the present invention is a method using a virus-envelope.
  • the virus-envelope can be prepared by mixing the desired expression vector with the purified virus in the presence of a detergent, or by freeze-thawing a mixture of the virus and the expression vector (particularly).
  • Viruses that can be used in the virus-envelope method include, for example, retroviruses, togaviruses, coronaviruses, flaviviruses, paramyxodinores, honoretomixinoisore, bunyainoores, ragrapeinoles, poxwinoreles, herpesviruses And viruses belonging to families such as Baculovirus, Henodonauinoles, and more preferably HVJ.
  • viruses belonging to families such as Baculovirus, Henodonauinoles, and more preferably HVJ.
  • viruses either a wild-type virus or a recombinant virus can be used.
  • HVJs include the recombinant HVJs reported by Hasan MK et al. (General Virol. 78: 2813-2820 (1997)) or Yonemitsu Y. et al. (Nature Biotech. 18: 970-973 (2000)). HVJ can also be used
  • the HVJ used in the HVJ-ribososome method and the HVJ-envelope method is preferably the Z strain (available from ATCC), but basically other HVJ strains (eg, ATCC VR-907, ATCC VR-105, etc.) Can also be used.
  • the purified virus may be inactivated by UV irradiation or the like, and then mixed with a desired expression vector.
  • Detergents that can be used when admixing the virus and the expression vector include, for example, octidalcoside,
  • the thus-prepared virus envelope vector can be introduced into a target tissue for treatment or prevention by injection or the like. Also, by freezing at -20 ° C, it can be stored for at least 2-3 months.
  • the expression vector that can be used here may be any expression vector as long as it is a vector that can express the target gene in vivo.
  • Examples include expression vectors such as pCAGGS (Genel08: 193.200 (1991)), pBK_CMV, pcDNA3.1, and pZeoSV (Invitrogen, Stratagene).
  • a virus vector a method using a virus vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus is typical.
  • detoxified retroviruses for example, detoxified retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, lentiviruses, vaccinia innoles, box innores, polioviruses, cinbisviruses, Sendai virus, SV40, DNA virus or RNA virus such as immunodeficiency virus (HIV) (Pharmacol. Ther. 80: 35-47 (1998); Front. Biosci. 4: E26-33 (1999); J-Recep. Signal. Transduct (See Res.19: 673-686), and the gene can be introduced into cells by infecting the cells with the recombinant virus. 7004
  • HIV immunodeficiency virus
  • virus vectors it is known that the adenovirus infection efficiency is much higher than when other virus vectors are used. Preferably, it is used.
  • the method of introducing the gene therapy agent of the present invention into a patient includes an in ra'ro method in which the gene therapy agent is directly introduced into the body and a method in which a certain cell is taken out from a human and the gene therapy agent is introduced into the cell outside the body.
  • the ex ⁇ ' ⁇ method which returns the cells to the body, can be cited (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45; Monthly Pharmaceutical Affairs 36 (1): 23-48 (1994); 15): (1994); Gene Therapy Development Research Handbook, edited by the Japanese Society of Genetics Therapy, NTS (1999)).
  • the ⁇ Z'TO method is particularly preferred.
  • various preparation forms for example, liquid preparations suitable for each of the above-mentioned administration forms can be taken.
  • an injection when formulated as an injection containing the gene as an active ingredient, such an injection can be prepared by a conventional method, for example, using an appropriate solvent (a buffer such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.). After dissolution, it can be prepared by, if necessary, sterilizing by filtration with a filter or the like and then filling in a sterile container. If necessary, a conventional carrier or the like may be added to the injection.
  • ribosome preparations such as HVJ-ribosome include suspensions, freezers, and centrifugal concentrate freezers.
  • the HGF gene can be used as a sole active ingredient, or can be used in combination with other known factors having an angiogenic effect.
  • factors such as VEGF and EGF have an angiogenic effect, and genes encoding these factors can be used in combination. Since it has been reported that growth factors such as EGF repair various cell damages in tissues, it is possible to use genes encoding various growth factors in combination, if necessary.
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention stabilizes or enhances other drugs having a therapeutic or preventive effect on cerebrovascular disorders to be treated or prevented, and HGF Substances (for example, heparin-like substances (particularly It is obvious to those skilled in the art that polysaccharides (JP-A-5-301824 and the like) can be used together with the HGF gene. If these drugs and substances can be encoded by a gene, the gene encoding them can be administered together with the HGF gene in the therapeutic or prophylactic agent of the present invention.
  • HGF Substances for example, heparin-like substances (particularly It is obvious to those skilled in the art that polysaccharides (JP-A-5-301824 and the like) can be used together with the HGF gene. If these drugs and substances can be encoded by a gene, the gene encoding them can be administered together with the HGF gene in the therapeutic or prophylactic agent of the present invention.
  • an appropriate administration method and administration site are selected according to the disease, symptom, and the like to be treated.
  • parenteral administration is preferred.
  • the cisternal and lumbar vertebra are particularly preferred as the site of administration.Puncture into the meninges of the cistern or lumbar vertebrae, and a proper amount of cerebrospinal fluid is collected after confirming the puncture position and avoiding an increase in intracranial pressure.
  • administer a prophylactic agent for the administration of the therapeutic or prophylactic agent of the present invention to the cistern, for example, the HVJ-liposome complex using a forcenula reported by Hayashi K. et al.
  • the treatment in the present invention means to reduce the influence of the blood flow disorder by the treatment after the blood flow disorder occurs in the brain.
  • the therapeutic effect of the agent or the method of the present invention refers to the administration of the agent or the application of the method of the present invention after the onset of cerebrovascular disorder, and the effect of the brain tissue caused by the cerebrovascular disorder. Refers to the effect of reducing damage compared to non-administration. Therefore, the treatment according to the present invention includes not only the complete recovery of the damage but also the action of reducing the degree of the damage.
  • prevention in the present invention means that the effect of blood flow disorder can be reduced by prophylactically administering the HGF gene before blood flow disorder occurs in the brain. More specifically, when administration of the HGF gene before the onset of cerebrovascular disorders such as cerebral infarction can reduce the brain tissue damage caused by cerebrovascular disorders caused after administration compared to non-administration, HGF Gene administration is said to have a protective effect. did Therefore, prevention in the present invention includes not only the complete recovery of damage but also the effect of reducing the degree of damage.
  • the term “therapeutic agent” or “prophylactic agent” in the present invention is used as a term which means a pharmaceutical preparation having the above-mentioned action.
  • the method of treatment or prevention according to the present invention is a method comprising the step of administering a pharmaceutical preparation having the above-mentioned action.
  • the cerebrovascular disorder in the present invention refers to a state in which the blood flow in the brain is inhibited. Cerebral infarction and intracerebral hemorrhage can be indicated as diseases that cause cerebral blood flow inhibition. Obstruction of blood flow is not limited to those caused by disease.
  • a cerebrovascular disorder according to the present invention also includes a state in which blood flow is reduced due to artificial closure of a blood vessel due to a surgical procedure or damage to a blood vessel due to a wound.
  • cerebrovascular disorders that cause ischemia or infarct lesions in the brain parenchyma.Cerebral infarction (cerebral thrombosis, cerebral embolism, etc.), cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, hypertensive encephalopathy, cerebrovascular dementia, Alzheimer's dementia, etc. It is included in the cerebrovascular disorder in the present invention.
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention includes an HGF gene in an amount sufficient to achieve its intended purpose, ie, a “therapeutically effective amount” or a “pharmacologically effective amount”. It is.
  • a “therapeutically effective amount” or “pharmacologically effective amount” is an amount of a drug that is effective to produce the intended pharmacological result, and may reduce the symptoms of the patient to be treated. That is enough.
  • Useful assays to determine the effective amount for a given application include those that measure the extent of recovery of the target disease.
  • the actual amount to be administered depends on the age, weight and condition of the patient to be treated, the mode of administration, etc., but is preferably optimized so that the desired effect is achieved without significant side effects. Amount.
  • a therapeutically effective amount, a pharmacologically effective amount, and toxicity can be determined by cell culture assays or any appropriate animal model. Also, such animal models are used to achieve a desired concentration range and route of administration, and those skilled in the art will recognize that Four
  • the effective dose in humans can be determined.
  • the dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio ED50 / LD50.
  • Large therapeutic index pharmaceutical compositions are preferred.
  • the determined dose is appropriately selected depending on the dosage form to be used, the sensitivity of the patient, the age and other conditions of the patient, the type of the disease, the severity of the disease, and the like.
  • the HGF gene per adult patient ranges from about 1 ⁇ g to about 50 mg, preferably from about 10 g to about 5 mg, more preferably from about 50 ⁇ g to about 5 mg.
  • the dose is selected from
  • the HGF gene when administered by the HVJ envelope method, it can be administered repeatedly, so it is not necessary to administer the HGF gene only once, but multiple times to obtain a better therapeutic or preventive effect.
  • the HGF gene can be administered two or three times.
  • Such multiple administrations using the HVJ envelope are also encompassed in the treatment and prevention methods of the present invention.
  • FIG. 1 is a photograph of a coronal section of a rat in the physiological saline group (3 out of 6 rats) subjected to TTC staining.
  • FIG. 2 is a photograph of a coronal section of TVA-stained rats of the pVAXI group (3 out of 6 rats).
  • FIG. 3 is a photograph of a coronal section of a rat in the HGF group (3 out of 6 rats) subjected to TTC staining.
  • FIG. 4 is a graph comparing the infarct area in the physiological saline group, the pVAXI group, and the HGF group.
  • a schematic diagram of the rat brain is shown in the upper right. Cuts were made at the lines indicated by 1-5, and coronal sections were made. The numbers 1 to 5 in the schematic diagram correspond to the numbers on the horizontal axis of the graph. The vertical axis indicates the ratio (%) of the area of the infarct lesion to the area of the entire coronal section.
  • Human HGF cDNA (2.2 kb) was introduced into BamHI, Notl (Invitrogen) of the pVAXl vector.
  • HVJ Sendai virus
  • strain Z purified Sendai virus
  • UV irradiation 99 mJ m 2
  • HAU hemagglutinin units
  • Wistar rats weighing 250 to 270 g were anesthetized with halothane (maintained at 4% and 1% at the time of introduction).
  • pVAXI-HGF 400 ⁇ g
  • HVJ-E l5000HAU
  • 100 1 was administered to a large tank using a 26G needle.
  • Six animals were used for each group. Three days after administration, the animals were under halothane anesthesia.
  • the right middle cerebral artery model was created by inserting a 4-0 nylon thread coated with poly-L-lysine from the right external carotid artery to the right internal carotid artery at 21 mm.
  • the body temperature was maintained at about 37 ° C, and blood pressure was measured in the tail artery. Nerve evaluation was performed 1 hour and 24 hours later.
  • NSS neurological severity score
  • HGF / HVJ pVAXI / HVJ physiological saline p-value body weight 250.4 ⁇ 2.0 253 ⁇ 2.3 251.8 ⁇ 2.4
  • Body temperature (before treatment) 37.4 ⁇ 0.1 37.3 ⁇ 0.1 37.2 ⁇ 0.2
  • Body temperature (after treatment) 37.6 ⁇ 0.1 37.1 ⁇ 0.2 37.4 ⁇ 0.2
  • HGF may play a role in regulating cerebrovascular disorders.
  • a method for treating cerebrovascular disorders including a new cerebral infarction namely, overexpression of HGF by introducing an HGF gene.
  • cerebral vascular disorders including cerebral infarction can be treated by aggressive gene transfer. Infarct lesions can be suppressed.

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Abstract

本発明により、HGF遺伝子の導入によるHGFの過剰発現という、新しい脳血管障害の治療法が提供された。本発明のHGF遺伝子を使用した方法により、脳梗塞等の脳血管障害に対して積極的な遺伝子導入による治療を行うことができ、従来、適切な治療法のなかった患者において神経機能の維持、梗塞巣の抑制が可能となる。

Description

明細 脳血管障害遺伝子治療剤 技術分野
本発明は、 肝細胞増殖因子 (liepatocyte growth factor;HGF)遺伝子を用いた脳 血管障害の治療または予防に関する。 より詳細には、 HGF遺伝子を有効成分と して含有する治療剤または.予防剤、 及び該治療剤または予防剤を標的部位へ投与 することを特徴とする方法に関する。 背景技術
肝細胞増殖因子 (HGF)は、 肝実質細胞を ώ において増殖させる因子とし て見出されたサイト力インである （Biochem.Biophys.Res.Conmmn.122: 1450 ( 1984)； Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83： 6489 (1986); FEBS Letters 22: 231 (1 987)； Nature 342： 440-443 (1989); Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 3200 (199 l)) o HGFはプラスミノーゲン関連及び間充織由来多面的成長因子であり、 多様 な細胞において細胞成長と細胞運動性を調節することが知られている （Nature 342： 440-443 (1989)； Biochem.Biophys.Res.Commun. 239： 639-644 (1997); J.Biochem.Tokyo 119： 591-600 (1996))。 さらに、胚新生及び幾つかの器官にお いては再生における形態形成工程を調節する重要な因子であることも知られてい る (Exp. Cell Res. 196: 114-120 (1991)； Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 1937-1 941 (1993)； Gene Therapy 7: 417-427 (2000))。 さらに、 HGFは ώ wVoにお いて肝再生因子として障害肝の修復 ·再生に寄与するだけでなく、 血管新生作用 を有し、 虚血性疾患や動脈疾患の治療または予防に大きな役割を果たし得ること が明らかにされている （Symp.Soc.Exp.Biol.47 cell behavior 227-234 (1993); Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 1937-1941 (l993);Circulation 97： 381-390 (199 8))。
以上のように、 HGF は血管新生因子の機能をはじめとし、 種々の機能を示す こと力 ら、 医薬品として活用するための様々な試みがなされてきた （実験医学 (増 刊) 10(3): 330-339 (1992))。 HGFには、 たとえば、 次に示すような用途が報告さ れている。
抗ガン剤 (特開平 6-25010号公報)、
肺傷害治療剤 (特開平 6-172207号公報)、
ガン治療副作用軽減剤 (特開平 6-340546号公報)、
上皮細胞増殖促進剤 （特開平 7-179356号公報）、
免疫抑制剤副作用軽減剤 (特開平 7-258111号公報)、
劇症肝炎治療剤 (特開平 10-167982号公報)、
心筋梗塞治療剤 (特開平 11-246433号公報)、
動脈疾患治療剤 (特開平 8-295634号公報)、
肥満症治療剤 (特開平 10-279500号公報)、
拡張型心筋症治療剤 （特開平 11-1439号公報)、
筋萎縮性側索硬化症治療剤 （特開 2002-87983号公報）、
肺線維症予防剤 (特開平 8-268906号公報)、
軟骨障害治療剤 (特開平 8-59502号公報)、
コラーゲン分解促進剤 (特開平 7-300426号公報)、
胃 ·十二指腸疾患治療剤 （特開平 7-138183号公報)、
脳神経障害治療剤 （特開平 7-89869号公報）、
. 急性腎不全治療剤 （特表 2001-516358号公報）、
虚血性疾患/動脈疾患治療剤 (WO00/07615号)、
糖尿病治療剤 (WO98/32458号)、
毛髪用外用剤 (特開平 5-213721号公報)、
皮膚化粧料 (特開平 5-213733号公報)、 育毛促進剤 (特開平 5-279230号公報)、
巨核球増加剤 (特開平 7-101876号公報)、
分化誘導剤 (特開 2002-78482号公報)、
腎糸球体疾患治療剤 (特開平 9-87199号公報)、
悪液質治療剤 (特開平 10-316584号公報)、
多臓器不全治療剤 (特開平 10-310535号公報)、
虚血性疾患治療剤 (WO96/32960号)、
細胞増殖 ·分化剤 (特表平 10-503923号公報)、
造血細胞増殖分化剤 (特表平 10-509951号公報)、
神経障害改善薬 (特開平 7-41429号公報)、 および
低血糖症 .グリコーゲン病治療剤 (特開平 10-7586号公報）
タンパク性製剤を用いる場合、 静脈内への投与が一般的である。 虚血性疾患モ デルに対する HGF の投与では静脈や動脈内への投与が ί列示されている
(Circulation 97： 381-390 (1998))。 このような動物モデルでの静脈または動脈内 投与による HGFの有効性は明らかにされているものの、 具体的な疾患における
HGF の有効な投与方法及ぴ投与量等については未だ結論が得られていない。 特 に、 HGF タンパク質の医薬品としての活用において問題となったのは、 その血 中における半減期の短さである。 HGFの血中半減期は 10分と短く、 その機能を 十分に発揮するような血中濃度を維持することが困難であった。 また、 有効量の
HGFを患部へどのように運搬するのかという課題も指摘されている。
分子生物学の分野における技術の飛躍的な向上により、 遺伝子を細胞内へ導入 する遺伝子治療が可能となった。 一般に遺伝子治療は多様な医学的処置において 使用することができる （Science 256： 808-813 (1992)； Anal.Biochem. 162：
156-159 (1987)) 遺伝子治療を成功させる上で特に重要なのは、遺伝子導入のた めの適当なベクターを選択することである。 従来、 アデノウイルス等のウィルス 起源ベクターの遺伝子導入における使用が提案されてきている。 しかしながら、 次のようなウィルスベクターの潜在的な危険性も指摘されてき ている。
ウィルスの有する感染毒性、
宿主の免疫機能低下に伴うウィルスの病原性の発現、 及ぴ
ウィルスの突然変異性または発ガン性等
ウィルスベクターに代わる方法として、 リポソームをウィルス外膜と共に利用 する in vivo遺伝子導入方法、 あるいは HVJ-リポソーム媒介遺伝子導入法が開発 されている （Science243:375_378(1989) ； Anal.NY Acad.Sci. 772: 126-139 (1995)) o 既に、 該方法を用いて肝臓、 腎臓、 血管壁、 心臓及ぴ脳を含む種々の組 織への in vivo での遺伝子導入が成功している （Gene Therapy 7： 417-427 (2000)； Science 243： 375-378 (1989)； Biochem.Biophys.Res.Commun. 186: 129-134 (1992)； Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 8474-8478 (1993)； Am.J.P ysiol. 271 (Regulatory Integrative Comp. Physiol.40): R1212- 1220 (1996))。
ところ力 HVJ-リボソーム法においては、 ウィルス及ぴリポソームという異な るビヒクルが必須であり、準備が複雑である。 また、 HVJをリボソームと融合す ることによってウィルス粒子よりも平均直径が 1.3倍大きくなる。 その結果、 細 胞との融合活性が野生型ウィルスの 10%以下に減少すること、遺伝子導入が不可 能な組織、 導入効率の悪い組織が存在することが知られている。 そこで、 より安 全で高効率な遺伝子治療を可能にする方法として、 ウィルスエンベロープベクタ 一を用いた遺伝子導入法が開発されている (特願 2001-026185/特開 2001-286282)。 該方法では、 ウィルス蛋白質の複製がない不活性化ウィルスをウィルスェンベロ ープとし、 その中へ遺伝子 封入することにより、 培養細胞、 生体組織等への遺 伝子導入ベクターとして用いることができる。 このようなウィルスエンベロープ ベクターを使用することにより、肝臓、骨格筋、子宮、脳、 眼部、 頸動脈、皮膚、 血管、 肺、 心臓、 腎臓、 脾臓、 癌組織、 神経、 Bリンパ球、 呼吸器官の組織、 浮 遊細胞等に安全、 且つ高効率に遺伝子を導入できることが知られている。 さて脳梗塞や脳内出血に代表される脳血管疾患は、 社会的にも重要な疾患であ る。 脳血管疾患による死亡率は近年低下してきてはいるものの、 依然としてその 死因における順位は高い。 また、 虚血性脳血管障害による後遺症を持つ有病者、 医療機関に入院または通院する受療者は依然として増えつづけている。
一般に、 脳動脈や頸部動脈における閉塞または灌流圧の低下による虚血性病変 により脳組織が不可逆的に壌死に陥っている状態を脳梗塞という。 脳梗塞は、 大 きく以下の 3つの種類に分類される （曲直部寿夫、 尾前照雄監修『脳血管障害』 ライフサイエンス出版、 p54-55 (1992) ；井村裕夫ら編『最新内科学大系第 66 巻脳血管障害』 中山書店、 p28 (1996))。
(1)脳動脈の硬化性病変を基盤として、血液粘度の上昇及び灌流圧低下等により動 脈閉塞を起こした結果、 脳組織が虚血性壊死状態となる脳血栓症、
(2)心内血栓や、稀ではあるが剥離した動脈壁血栓により脳動脈の塞栓が生じた状 態である脳塞栓症、 及ぴ
(3)頭部や頭蓋内脳動脈の狭窄または閉塞により末梢部の脳組織への血流が減少 することにより生じる血行力学的梗塞
脳梗塞においては、 脳浮腫が発症から数時間後に出現し、 発症後 1週間前後ま でこの状態が続く。 その後、 浮腫は次第に減少するが、 発症後 1ヶ月から 3ヶ月 の間に梗塞巣病変として固定する。 脳浮腫は脳の容量増大を引き起こす。 脳は固 い頭蓋に被われているため、 脳浮腫によって脳の容量がある限度を超えると、 急 激な組織圧及び頭蓋圧を生じることとなる。 その結果、 脳障害が悪化し、 その後 の梗塞巣病変の範囲が決定される （稲村憲治、赫彰郎『日本臨床第 51卷 CT,MRI 時代の脳卒中学上巻』 日本臨床、 p231-239 (1993))。脳の一部で梗塞が起こるこ とにより、 その領域が担っていた認知、 知覚、 感覚、 記憶等の機能が失われる。 従来、 神経細胞は虚血に対して弱いことが臨床的に認識されている。 神経細胞 によってはわずか数分間虚血状態に置かれただけで障害を受け、 細胞死に至る。 虚血状態の海馬体'錐体細胞では、 脱分極に伴う顕著な神経興奮の後、 伝導プロ T JP03/07004
- 6 - ックが起こる。 その後、 細胞外グルタミン酸、 細胞内カルシウムイオン、 及ぴフ リーラジカル等の増加に伴う細胞毒性により細胞機能が失われ、 細胞死に至ると されている。 このような虚血による不可逆的変化は、 急性期において適切な治療 を行うことにより、 死亡率の改善や後遺症の軽減が可能と考えられる。 現在、 脳 梗塞に対する治療法として抗血小板薬、 脳循環代謝改善薬等の投与が行われてい る。 抗血小板薬の中には脳血栓急性期の治療に有効な薬剤も存在はするが、 類似 の症状を示す脳出血患者及び脳塞栓患者では出血性脳梗塞を助長することから禁 忌であり、 その使用に当たっては慎重に病型を診断する必要がある。
脳梗塞発作から約 1ヶ月以降の慢性期に投与される脳循環改善薬は、 急性期で の使用が好ましくないと考えられている (亀山正邦編『脳卒中治療マニュアル』医 学書院、 pl72-173 (1991))。その他の治療法として、発症後の超急性期において、 細胞死に到っていな 、領域の血流を再開させるため、血栓溶解療法、バイパス術、 血栓内膜剥離術、塞栓摘出術のような再灌流療法が行われている。しかしながら、 脳梗塞において脳組織が既に不可逆的損傷を受けている場合には、 その後の血行 再開は出血性梗塞及び脳浮腫の増加等の組織障害が増幅される恐れもあり問題と なっている（岡田靖、『神経研究の進歩』第 40卷第 4号第 655-665頁、医学書院、 (1996) ;高橋明『medicina』第 32卷第 11号第 2261-2263頁、医学書院、（1991))。 現在、 脳梗塞急性期に使用される薬剤は、 出血性梗塞及ぴ虚血再灌流障害を起 こす危険性を有している。 また、 対象となる病態及び治療効果が期待できる投与 時期が限られている等の問題もあり、 十分に満足できるものではない。 発明の開示
本発明の課題は、 脳血流遮断後の再灌流に伴う脳虚血再灌流障害による脳に対 する障害の程度を小さくすることができる薬剤の提供である。 HGF遺伝子は、 VEGF等の他の血管新生因子と異なり薪生した血管の透過性亢進をもたらさなレ、。 特に脳血管障害では血管透過性の亢進により、 脳浮腫や脳内圧亢進による脳組織 への障害が危惧されるため、 血管の透過性亢進をもたらさない HGFを用いた治 療及ぴ予防方法は他の血管新生因子を用いた場合と比べて有利である。
本発明の目的は、 HGF遺伝子を用いた脳血管障害に対する治療剤または予防 剤、 及ぴ該薬剤を用いた脳血管障害の治療法及び予防法を提供することである。 即ち、 本発明の要旨は以下の通りである。
(1) HGF遺伝子を含有する、 脳血管障害の治療剤又は予防剤。
(2) 脳血管障害が脳梗塞である、 （1) 記載の治療剤または予防剤。
(3) 該治療剤又は予防剤が錠剤、 丸剤、 糖衣剤、 カプセル、 液剤、 ゲル剤、 軟 膏、 シロップ、 スラリー、 懸濁物の形態である、 上記 （1) または （2) の 治療剤又は予防剤。
(4) 遺伝子をウィルス-エンベロープ法、 内包型リボソーム法、 静電気型リポソ ーム法、 HVJ-リボソーム法、 改良型 HVJ-リボソーム法、 レセプター介在性 遺伝子導入法、 パーティクルガンで担体と共に核酸分子を細胞に移入する方 法、 naked-DNAによる直接導入法、 若しくは正電荷ポリマーによる導入法 のいずれかにより細胞に移入するための、 （1) 〜 （3) いずれかに記載の治 療剤または予防剤。
(5) 遺伝子を HVJ-エンベロープ法により細胞に移入するための、 （1) 〜 （3) いずれかに記載の治療剤または予防剤。
(6) HGF遺伝子を哺乳動物に導入する工程を含む、 脳血管障害の治療または 予防法。
(7) 脳血管障害が脳梗塞である、 （6) 記載の治療または予防法。
(8) HGF遺伝子を HVJ-エンベロープ法により 2〜3回哺乳動物に導入するこ とを含む、 （ 6 )または（ 7)記載の治療または予防法。
( 9 ) 脳血管障害の治療剤または予防剤の製造のための HGF遺伝子の使用。
(10) 脳血管障害が脳梗塞である、 （9) 記載の HGF遺伝子の使用。
本発明において使用する 「HGF遺伝子」 とは、 HGFCBGFタンパク質)を発現 可能な核酸分子を指す。 ここで、 核酸分子とは、 DNA、 RNA、 cDNA、 mRNA 等の核酸分子を指す。 具体的には、 HGFをコードする cDNAは、 例えば Nature 342: 440 (1989)、 特許第 2777678号公報、 Biochem.Biophys.Res.Commun. 163:967 (1989)等に記載されている。 HGFをコードする cDNAの塩基配列は前 記文献に記載されている他、 GenBank等のデータベースにも登録されている。 即ち、 これらの配列情報を元に適当な配列部分を PCRプライマーとして用い、 例えば、 肝臓、 白血球由来の mRNAに対して RT-PCRを行うことにより HGF の cDNAをクローニングすることができる。 このようなクローユングは、 当業者 であれば、 例えば、 Molecular Cloning第 2版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い容易に行うことができる。 また、 ゲノム DNAラ ィブラリーをスクリ一-ングすることにより、 ゲノム DNAを単離することもで さる。
さらに、 本発明の HGF遺伝子はこれらの cDNA及ぴゲノム DNAに限定され ず、 発現されるタンパク質が実質的に HGFと同じ作用を有するタンパク質をコ 一ドする限り、本発明における HGF遺伝子として利用することができる。即ち、 1)前記 cDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、または 2) 前記 cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して 1若しくは複 数 (好ましくは数個)のアミノ酸が欠失、 置換、 付加及び/または挿入されたァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする核酸のうち HGFの機能を有するタンパ ク質をコードするものであれば、 本発明において使用され得る HGF遺伝子の範 疇に含まれる。 前記 1)及び 2)の核酸は例えば、 部位特異的突然変異誘発法、 PC R法 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) p ublis . John Wiley & Sons, Section 6.1-6.4参照）、 または通常のハイブリダ ィゼーション法 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) publish John Wiley & Sons, Section 6.3-6.4参照)等の方法により容 易に得ることができる。 即ち、 当業者であれば、 公知の HGF遺伝子の配列またはその一部をプローブ として、 或いは、 該 DNAと特異的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドを プライマーとして、該 DNAとハイブリダィズする核酸を単離することができる。 公知の HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を得るためのハイブ リダィゼーシヨンのストリンジェントな条件としては、 通常 「1 X SSC、 37°C」 程度の条件が挙げられ、 より厳しい条件としては 「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」 程度、 さらに厳しい条件としては 「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」 程度の条件を 挙げることができる。 ハイプリダイゼーシヨンの条件を厳しく設定する程、 プロ ープ配列と相同性の高い配列を有する核酸を単離することができる。 但し、 ここ で挙げた SSC、 SDS及ぴ温度についての条件は単なる例示であり、 当業者であ れば、 これらの条件、 及びプローブ濃度、 プローブの長さ、 反応時間等のその他 のハイプリダイゼーシヨンのストリンジエンシーを決定する条件を加味して、 上 記と同程度のストリンジエンシーが得られる条件を容易に設定することができる。 上述のようなハイブリダィゼーシヨン法または PCR法により単離される核酸 によりコードされるタンパク質は、 従来公知の HGFタンパク質に対して通常高 いアミノ酸配列相同性を有する。高い相同性とは少なくとも 50%以上、 さらに好 ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 90%以上 (例えば 95%以上)の配列相同性 を指す。 ァミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるァルゴ リズム BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 5873-5877 (1993))によって決定す ることができる。 このアルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLASTX等のプロ グラムが開発されている (Altschul et al. J.Mol.Biol. 215： 403-410 (1990))。 BLASTに基づき BLASTNによつて塩基配列を解析する場合には、パラメーター は例えば
Figure imgf000010_0001
とする。 また、 BLASTに基づき BLASTX によってァミノ酸配列を解析する場合には、 パラメーターは例えば score=50、 wordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフオルトパラメーターを用いる。 これらの解析方法の具体的な 03 07004
- 1 o - 手法は公知である (http://www.ncbi.nlni.nih.gov)。
以上のように本発明において使用される HGF遺伝子は、 該遺伝子によりコー ドされるタンパク質が HGF活性を有する限り、 天然由来及び人工的に製造され た核酸であっても良い。 HGFは in ra'z roにおいて肝実質細胞の増殖を促進させる 活性を有する。 従って、 上述のようにしてハイブリダィズ法等により得られた核 酸または天然 HGF遺伝子を改変した核酸によりコードされるタンパク質が HGF 活性を有するかどうかは、 例えば、 該タンパク質の in における肝実質細胞 の増殖に対する影響を調べることにより検定することができる。
次に、 本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、 導入形態及ぴ 導入量等につレ、て記述する。
HGF遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する方法としては、 非ウィルスベクターを用いる方法と、 ウィルスベクターを用いる方法の 2つに大 別できる。 実験手引書等にベクターの調製法、 投与法等が詳しく解説されている (別冊実験医学,遺伝子治療の基礎技術、羊土社 (1996)；別冊実験医学,遺伝子導入 &発現解析実験法、 羊土社 (1997) ; 日本遺伝子治療学学会編遺伝子治療開発研究 ハンドブック、 ェヌ 'ティー 'エス（1999))。 以下、 それらのべクター及び方法に ついて具体的に説明する。
慣用の非ウィルス遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換 え発現ベクターを用いて、 以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導 入することができる。
細胞への遺伝子導入法としてはリボフヱクション法、リン酸-カルシウム共沈法、 D E A E—デキストラン法、 微小ガラス管を用いた D N Aの直接注入法等が挙げ られる。 また、 組織への遺伝子導入法としてはウィルス-エンベロープ法、 内包型 リボソーム (internal type liposome)による遺伝子導入法、 静電気型リボソーム (electrostatic type liposome) による遺伝子導入法、 HVJ-リボソーム法、 改良 型 HVJ-リポソーム法 (HVJ-AVEリポソーム法)、レセプター介在性遺伝子導入法、 パーティクルガンで担体 (金属粒子）と共に DNA分子を細胞に移入する方法、 naked-DNAの直接導入法、 正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に より、 糸且換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることができる。
このうち HVJ-リボソームは脂質二重膜で作られたリボソーム中に DNAを封 入し、さらにこのリボソームと不活化したセンダイウィルス（Hemaggulutinating virus of Japan:HVJ)とを融合させたものである。 当該 HVJ-リボソーム法は従来 のリボソーム法と比較して、 細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする ものであり、特に好ましい導入形態の一つである。 HVJ-リボソームの調製法につ いては、別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術、 羊土社 (1996)；別冊実験医学,遺伝 子導入 &発現解析実験法、 羊土社 (1997)； J.Clin.Invest.93:l458-1464(l994); Am.J.Physiol. 271： R1212_1220(1996)等に詳しく述べられている。 また HVJリ ポソーム法とは、例えば Molecular Medicine 30: 1440-1448(1993)； 実験医学 12: 1822— 1826(1994); 蛋白質 ·核酸 ·酵素 42,1806-1813(1997)等に記載の方法で あり、好ましくは Circulation 92(Suppl.II): 479-482(1995)に記載の方法が挙げら れる。
また、 本発明の HGF遺伝子の投与において特に好ましい方法としてウィルス- エンベロープを用いる方法を挙げることができる。ウィルス-エンベロープは精製 されたウィルスに所望の発現ベクターを界面活性剤存在下で混和するか、または、 ウィルスと発現べクタ一との混合液を凍結融解することにより調製することがで きる （特願 2001-026185/特開 2001-286282)。
ウィルス-エンベロープ法において用いることができるウィルスとしては、例え ば、 レトロウイルス、 トガウィルス、 コロナウィルス、 フラビウィルス、 パラミ クソゥイノレス、 ォノレトミクソゥイスノレ、 ブニヤゥイノレス、 ラブドウイノレス、 ポッ クスウイノレス、 ヘルぺスウィルス、 バキュロウィルス、 へノ ドナウイノレス等の科 に属するウィルス、 中でも好ましくは HVJが挙げられる。 ここで、 ウィルスと しては、 野生型及ぴ組換え型のいずれのウィルスを用いることができる。 特に HVJとしては、 Hasan M.K.ら （ General Virol. 78： 2813-2820 (1997))、 また は、 YonemitsuY.ら （Nature Biotech. 18: 970-973 (2000))等により報告されてい る組換え型の HVJを用いることもできる。
一般に、 HVJ-リボーソーム法及び HVJ-エンベロープ法において用いる HVJ としては Z株 (ATCCより入手可能)が好ましいが、 基本的には他の HVJ株 (例え ば ATCC VR-907や ATCC VR-105等）も用いることができる。 また、 ウィルスェ ンべ口ープの調製する際に、 精製されたウィルスを UV照射等により不活性化し た後に、 所望の発現ベクターを混和しても良い。 ウィルスと発現ベクターを混和 する際に用いることができる界面活性剤としては、 例えば、 ォクチダルコシド、
Triton X- 100、 CHAPS, NP'40等が挙げられる。 このようにして調製されたゥ ィルスエンベロープベクターは、 注射等により治療または予防の標的となる組織 に導入することができる。 また、 -20°Cで凍結することにより、 少なくども 2〜3 ヶ月保存することも可能である。
ここで用いることができる発現ベクターとしては、 生体内で目的遺伝子を発現 されることのできるベクターであれば如何なる発現べクタ一であっても良い。 例 えば pCAGGS (Genel08: 193.200(1991))や、 pBK_CMV、pcDNA3.1、 p ZeoSV (ィ ンビトロゲン社、 ストラタジーン社)等の発現ベクターを例示することができる。 ウィルスベクターとしては、 組換えアデノウイルス、 レトロウイルス等のウイ ルスベクターを用いた方法が代表的である。 より具体的には、 例えば、 無毒化し たレトロウイルス、 アデノウィルス、 アデノ随伴ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 レンチウィルス、 ヮクシニアゥイノレス、 ボックスゥイノレス、 ポリォウィルス、 シ ンビスウィルス、センダイウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（HIV)等の DNA ウィルスまたは RNAウィルス（Pharmacol.Ther.80: 35-47 (1998)； Front.Biosci. 4： E26-33 (1999) ； J-Recep.Signal.Transduct.Res.19： 673-686参照） に目的とす る遺伝子を導入し、 細胞に組換えウィルスを感染させることによつて細胞内に遺 伝子を導入することができる。 7004
- 1 3 - 前記ウィルスベクターのうち、 アデノウィルスの感染効率が他のウィルスべク タ一を用いた場合よりもはるかに高レ、ことが知られており、 この観点からはアデ ノウィルスベクター系を用いることが好ましい。
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、 遺伝子治療剤を直接体内に 導入する in ra'ro法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤 を該細胞に導入し、 その細胞を体内に戻す ex Ζ'ΪΌ法が挙げられる （日経サイエ ンス、 1994年 4月号： 20-45頁；月刊薬事 36( 1 ): 23-48(1994); 実験医学増刊 12(15)：(1994)； 日本遺伝学治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ - ティー .エス（1999))。 本発明では、 ώ Z'TO法が特に好ましい。
製剤形態としては、 上記の各投与形態に合った種々の製剤形態 (例えば液剤等） をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤として製剤する場合、 このような注射剤は定法により調製することができ、例えば適切な溶剤 (P B S等 の緩衝液、 生理食塩水、滅菌水等)に溶解した後、必要に応じてフィルタ一等で濾 過滅菌し、 次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。 必 要に応じて、 注射剤には慣用の担体等を加えても良い。 また、 HVJ-リボソーム等 のリボソーム製剤としては、 懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等の形態が挙 げられる。
本発明の治療剤または予防剤では、 HGF遺伝子を単独の有効成分として利用 することもできるし、 または、 その他の血管新生作用を有する公知の因子と併用 することもできる。 例えば、 VEGFや EGF等の因子は血管新生作用を有するこ とが報告されており、これらの因子をコ一ドする遺伝子を併用することもできる。 また EGF等の増殖因子は組織の種々の細胞障害を修復することが報告されてい ることから、 必要に応じ、 各種増殖因子をコードする遺伝子を併用することも可 能である。 本明細書の記載から、 本発明の ^療剤または予防剤に、 必要に応じ、 治療または予防対象とする脳血管障害に対し治療若しくは予防効果を有するその 他の薬剤、 HGF を安定化若しくは増強する物質 （例えば、 へパリン様物質 （特 開平 10-158190号公報） ；多糖類 (特開平 5-301824号公報等)を HGF遺伝子と併 用し得ることが当業者には明らかである。 これらの薬剤及び物質が遺伝子により コードされ得るものであれば、 これらをコードする遺伝子を本発明の治療剤また は予防剤において HGF遺伝子と共に投与することもできる。
本発明の遺伝子治療剤または予防剤は治療目的の疾患、 症状等に応じた適当な 投与方法及び投与部位が選択される。 特に、 非経口的な投与が好ましい。 また投 与部位としては、 大槽及び腰椎が特に好ましく、 大槽または腰椎の髄膜内に穿刺 し、 穿刺位置の確認と頭蓋内圧の上昇を避ける為に適量の髄液を採取後、 本治療 または予防剤を投与する。 本発明の治療剤または予防剤の大槽への投与について は、 例えば、 Hayashi K.ら (Gene Therapy 8: 1167-73 (2001))により報告された 力ニューレを用いた HVJ-リポソーム複合体の投与方法を応用することができる。 ところで、本発明の治療剤または予防剤の効果は、 HGF遺伝子の投与により、 脳梗塞巣周辺のいわゆる.ぺナンプラ （penumbra)領域においてアポトーシスが抑 制され、 神経細胞が維持されるとことにより得られると考えられる。 従って、 本 発明における治療とは、 脳における血流障害が起きた後の処置によつて血流障害 の影響を小さくすることを言う。
即ち、 より具体的には、 本発明の薬剤または方法による治療効果とは、 脳血管 障害発症後の本発明の薬剤の投与または方法の適用によって、 脳血管障害によつ てもたらされる脳組織の損傷を、 非投与の場合と比べて小さくする効果を指す。 したがって、 本発明における治療には、 損傷の完全な回復のみならず、 損傷の程 度を小さくする作用が含まれる。
一方本発明における予防とは、 脳における血流障害が起きる前に、 HGF遺伝 子を予防的に投与することによって、血流障害の影響を小さくできることを言う。 より具体的には、 脳梗塞等の脳血管障害発症前の HGF遺伝子の投与によって、 投与後に生じた脳血管障害によってもたらされる脳組織の損傷を、 非投与の場合 に比べて小さくできるとき、 HGF遺伝子投与には予防効果があると言う。 した がって、 本発明における予防には、 損傷の完全な回復のみならず、 損傷の程度を 小さくする作用が含まれる。
また本発明における 「治療剤」 または 「予防剤」 という用語は、 上記のような 作用を有する医薬品製剤を意味する用語として用いられる。 あるいは本発明にお ける治療方法または予防方法は、 上記のような作用を有する医薬品製剤を投与す る工程を含む方法である。
一方本発明における脳血管障害とは、 脳の血流が阻害された状態を言う。 脳の 血流阻害を生じる疾患として、 脳梗塞や脳内出血を示すことができる。 血流の阻 害は、 疾患によってもたらされたものに限られない。 たとえば、 外科的処置に伴 う人為的な血管の閉鎖や、 創傷による血管の損傷が原因となって生じる血流が低 下した状態も、 本発明における脳血管障害に含まれる。 例えば、 脳実質に虚血ま たは梗塞性病変をもたらす脳血管障害疾患 ·脳梗塞 (脳血栓、脳塞栓等)、脳出血、 くも膜下出血、 高血圧性脳症、 脳血管性痴呆、 アルツハイマー型痴呆等が本発明 における脳血管障害に含まれる。
本発明の治療剤または予防剤には、 該薬剤により意図される目的を達成するの に十分な量、 即ち 「治療的有効量」 または 「薬理学的に有効な量」 の HGF遺伝 子が含まれる。 「治療的有効量」 または 「薬理学的に有効な量」 とは、意図される 薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量であり、 処置されるべき患者の徴候 を軽減するのに十分な量である。 所定の適用における有効量を確認する有用なァ ッセィ法としては、 標的疾患の回復の程度を測定する方法が挙げられる。 実際に 投与されるべき量は、 処置される患者の年齢、 体重及び症状、 並びに投与方法等 に依存するが、 好ましくは、 所望の効果が顕著な副作用を伴うことなく達成され るよう最適化された量である。
治療的有効量、 薬理学的に有効な量、 及び、 毒性は、 細胞培養アツセィまたは 任意の適切な動物モデルにより決定することができる。 また、 そのような動物モ デルは所望の濃度範囲および投与経路を達成するのに用い、 当業者であれば、 そ 4
- 1 6 - れに基づきヒトにおける有効量を決定することができる。 治療効果と毒性効果と の間の用量比は治療係数であり、 それは比率 ED50/LD50 として表すことがで きる。 大きな治療係数の薬学的組成物が好ましい。 決定された用量は、 使用され る投与形態、 患者の感受性、 年齢やその他の患者の条件、 疾患の種類、 重篤さ等 により適宜選択され、 本発明の治療剤の投与量としては、 患者の症状等によって 異なるが、 成人患者 1人当たり H G F遺伝子として約 1 μ g〜約 5 0 mg の範囲、 好ましくは約 1 0 g〜約 5 mg、 より好ましくは約 5 0 μ g〜約 5 mg の範囲から 投与量が選択される。 特に、 HGF遺伝子を HVJエンベロープ法により投与する 場合には、 反復して投与を行うことが可能であることから、 1回のみ投与するの ではなく、 より良い治療または予防効果を得るために複数回、 例えば 2、 3回に わたって HGF遺伝子の投与を行うことができる。このような HVJエンベロープ を用いた複数回にわたる投与も本発明の治療 ·予防方法に包含される。 図面の簡単な説明
図 1は、 生理食塩水群のラット (6匹中 3匹)についての TTC染色を行った冠状 断の写真である。
図 2は、 pVAXI群のラット (6匹中 3匹)についての TTC染色を行った冠状断の 写真である。
図 3は、 HGF群のラット (6匹中 3匹)についての TTC染色を行った冠状断の 写真である。
図 4は、 生理食塩水群、 pVAXI群及び HGF群における梗塞巣面積を比較した グラフである。右上にラットの脳の模式図を示す。 1〜5で示される線において切 断し、 冠状断を作成した。 模式図の番号 1〜5はグラフ横軸の数字に対応する。 縦軸は、 冠状断全体の面積に占める梗塞巣の面積の割合 (％)を示す。 発明を実施するための最良の形態 P T/JP03/07004
- 1 7 - 以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に よりなんら限定されるものではない。
(1) HGF遺伝子発現べクターの作成
ヒ ト HGF cDNA (2.2kb) を pVAXlベクターの BamHI、 Notl (Invitrogen) に揷入した。
(2) HVJ-ェンべロープの調製
精製センダイウィルス （HVJ) (Z株） を使用直前に UV照射 （99mJん m2) す ることにより不活性化した。 次に不活性化 HVJ (15000血球凝集単位 (HAU)) と 上記 (1)において作成したベクター、 または HGF cDNAを含まな 、発現べクタ一 を 4°Cにおいて 0.3%Triton Χ-100と混和し、 4°Cで 15分間遠心分離した。 上清 を除去し、緩衝塩類溶液を加え、 再度 4°Cで 15分間遠心した。 上清を除去し、 リ ン酸緩衝整理食塩水 100 μ 1に溶解し、 脳梗塞に対する効果を調べた。
(3) HVJエンベロープ- DNA複合体のラット右中大脳動脈閉塞モデルラットへ の投与
体重 250〜270gの Wistarラットをハロセン麻酔（導入時 4%、 1%で維持）し、 1)生理食塩水群として生理食塩水 (100 1)、 2)ベクターのみを含む pVAXI群とし て pVAXI(400 β g)/HVJ-E(l5000HAU)(l00 μ 1)、 3)HGF投与群として
pVAXI-HGF(400 μ g)/HVJ-E(l5000HAU) (100 1を 26G針を用レ、大槽投与し た。 各群について 6匹の動物を用いた。 投与 3日後に、 ハロセン麻酔下で右外頸 動脈から右内頸動脈に poly-L-lysineでコーティングされた 4-0ナイロン糸を ' . 21mm挿入し、 右中大脳動脈モデルを作成した。 その際、 ヒーティングパッドに て動物の体温は約 37°C前後に維持し、 尾動脈にて血圧を測定した。 1時間後及び 24時間後に神経評価を行った。神経評価は以下の基準で行い、合計のスコアとし て各群の比較 (表 1において Neurological severity score (NSS)として表した）を 行つた。 StadtView 5.0 Jを使用し、 MamrWhitny U testにより統計処理を行つ た。 8 -
1)左前胺の屈曲の有無 4)左前肢の肢位
0 · · ·屈曲なし 0 · · ·迅速に元にもどる 0.5 · · ·軽度の屈曲 0.5 · · ·元にもどる
1 · · ·完全に屈曲 1 · · ·元に戻らない
2)側方圧迫への抵抗 5)右前肢の肢位
0 '左右同程度の抵抗 0 · · ·迅速に元にもどる
0.5 軽度の抵抗減弱 0.5 · · ·元にもどる
'完全に抵抗無し 1 · · ·元に戻らない
3)体位
0 '正常
0.5 左に軽度の屈曲
'完全に左に屈曲
HGF/HVJ pVAXI/HVJ 生理食塩水 p 値 体重 250.4±2.0 253±2.3 251.8±2.4
血圧（処置前） 88.6±1.9 88.8±3.7 88.5±2.1
血圧（処置後） 82.4±1.7 81.2±3.8 82.8±1.4
体温（処置前） 37.4±0.1 37.3±0.1 37.2±0.2
体温 (処置後） 37.6±0.1 37.1±0.2 37.4±0.2
NSS (lhr) 1.0±0.2 1.3±0.4 1.4±0.2 p<0.05*
NSS (24hr) 1.0±0.1 1.4±0.2 1.3±0.3 p<0.05*
^Mann-Whithy U testにより生理食塩水群との比較。
表 1に示すように、 生理食塩水群、 pVAXI群、 HGF群の間で術中の血圧、 体 温に差は見られなかった。 また、 神経評価では、 HGF群では他の 2つの群と比 ベてスコアが有意に低値であり、 HGF遺伝子の投与により神経機能が保たれて いることが示唆された。 24時間後に動物を殺し、前頭極から 2mm間隔 （図 4の右上の模式図において 線 1〜5として示す部位） で冠状断を作成した。 TTC染色を行い梗塞巣の面積を 比較した (図 1〜3)。梗塞巣の面積の比較のため、 Adobe Photoshop 5.0を使用し、 梗塞巣の占める Pixel数を計測した。 浮腫の影響を考慮し （健常側面積一 (梗塞側 面積—梗塞面積)） /健常側面積 X 100 (%)で評価した。 その結果を図 4に示す。.冠 状断の全体に占める梗塞巣の割合を％で示す。 図 1〜図 4より明らかなように、 HGF遺伝子導入群では梗塞巣が小さくなることが確認された。 産業上の利用の可能性
以上の結果により HGF遺伝子の投与が脳梗塞のような脳血管障害の初期段階 で有利な効果を示し、神経機能の維持し、梗塞巣を小さくすることが確認された。 即ち、 HGFが脳血管障害を調節する役割を果たすかもしれないことが示された。 本発明により、 HGF遺伝子の導入による HGFの過剰発現という、新しい脳梗塞 を含む脳血管障害の治療法が提供された。 本発明の HGF遺伝子を使用した方法 により、 脳梗塞を含む脳血管障害に対して積極的な遺伝子導入による治療を行う ことができ、 従来、 適切な治療法のなかった患者において神経機能の維持、 梗塞 巣の抑制が可能となる。

Claims

請求の範囲 HGF遺伝子を含有する脳血管障害の治療剤または予防剤。
脳血管障害が脳梗塞である、 請求項 1記載の治療剤または予防剤。
該治療剤又は予防剤が錠剤、 丸剤、 糖衣剤、 カプセル、 液剤、 ゲル剤、 軟 膏、 シロップ、 スラリー、 懸濁剤の形態である、 請求項 1または 2記載の治 療剤または予防剤。
遺伝子をウィルス-エンベロープ法、 内包型リボソーム法、 静電気型リポソ ーム法、 HVJ-リボソーム法、 改良型 HVJ-リボソーム法、 レセプター介在性 遺伝子導入法、 パーティクルガンで担体と共に核酸分子を細胞に移入する方 法、 naked-DNA による直接導入法、 若しくは正電荷ポリマーによる導入法 のいずれかにより細胞に移入するための、 請求項 1〜 3いずれかに記載の治 療剤または予防剤。
遺伝子を HVJ-エンベロープ法により細胞に移入するための、請求項 1〜 3 V、ずれかに記載の治療剤または予防剤。
HGF遺伝子を哺乳動物に導入する工程を含む、 脳血管障害の治療または 予防法。
脳血管障害が脳梗塞である、 請求項 6記載の治療または予防法。
HGF遺伝子を HVJ-エンベロープ法により 2〜3回哺乳動物に導入するェ 程を含む、 請求項 6または請求項 7記載の治療または予防法。
脳血管障害の治療剤または予防剤の製造のための HGF遺伝子の使用。 . 脳血管障害が脳梗塞である、 請求項 9記載の HGF遺伝子の使用。
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