WO2001032220A1

WO2001032220A1 - Therapie genique pour traiter les maladies ischemiques diabetiques

Info

Publication number: WO2001032220A1
Application number: PCT/JP2000/007502
Authority: WO
Inventors: Ryuichi Morishita; Toshio Ogihara
Original assignee: Medgene Bioscience, Inc.
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2001-05-10
Also published as: ATE409494T1; EP1142590B8; DK1142590T3; US20160250290A1; AU1052301A; CN1339973A; CN1182874C; CA2356701A1; PT1142590E; EP1142590A1; JP3877148B2; EP1142590B1; DE60040383D1; HK1041211A1; CY1110445T1; KR20010108053A; ES2313907T3; AU778826B2; EP1142590A4; US20080268030A1

Description

明細書糖尿病性虚血性疾患遺伝子治療技術分野

本発明は、肝実質細胞増殖因子（HG F) 遺伝子を用いた糖尿病性虚血性疾患の治療剤及び治療法に関する。具体的には、 HGF遺伝子を有効成分として含有する糖尿病性虚血性疾患治療剤や HG F遺伝子を虚血部位へ投与することを特徴とする糖尿病性虚血性疾患治療法などに関する：

背景技術

HG Fは、成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子として発見され、その遺伝子クローニングがなされたタンパク質である（B i o c h e m B i o p h y s

R e s C ommu n， 1 2 2, 1 45 0 (1 9 84) 、 P r o c . Na t l . Ac a d. S c i . USA, 8 3， 64 8 9, ( 1 9 8 6) 、 F E B S

L e t t e r, 2 2， 2 3 1 ( 1 9 8 7) 、 N a t u r e, 34 2, 440 ( 1 9 8 9) 、 P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U S A, 8 7， 3 2 0 0 ( 1 9 9 1 ) ) ₀ その後の研究により、 HGFは i n v i v oにおいて肝再生因子として障害肝の修復再生に働くだけでなく、血管新生作用を有し、虛血性疾患や動脈疾患の治療または予防に大きな役割を果たしていることが明らかとなつてきた（S ymp. S o c . E x p. B i o l . , 4 7 c e 1 1

b e h a v i o r , 2 2 7 - 2 34 (1 9 9 3) ， P r o c . N a t l .

A c a d. S c i . , 9 0， 1 9 3 7- 1 94 1 ( 1 9 9 3) ,

C i r c u l a t i o n. 9 7， 3 8 1— 3 90 ( 1 9 9 8) ) 。すなわち、ゥサギの下肢虚血モデルにおいて HG Fを投与すると、顕著な血管新生が見られ血流量の改善、血圧減少の抑制、虚血症状の改善が生じたとの報告がなされている。これらの報告により、今日では、血管新生因子の一つとして HG Fが発現、機能していると考えられるようになった。

二のように HGFは血管新生因子の機能を始めとして種々の機能を持っており、医薬品として活用するための色々な試みがなされてきた。しカゝし、こ二で問題となってきたのが HG Fの血中での半减期である。 HGFの半減期は約 1 0分と短く、血中濃度を維持する二とが困難であり、また、 HG F有効量の患部への移行性が問題となった

一般的にタンハク性製剤の場合は静脈内への投与の多レ、ことが常識となっており、前記虚血性疾患モデルに対する HG Fの投与に関しても、例えば静脈や動脈内への投与の例が示されている（C i r c u l a t i o n, 97. 38 1— 39 0 ( 1 998) ) ：このような動物モデルに対する静脈あるいは動脈内投与により、虚血性疾患あるいは動脈疾患に対する HG Fの有効性が明らかにされているものの、具体的な HG Fの有効な投与方法あるいは投与量等については、未だ結論が出されていない：特に HGFタンパクの場合は、前記のような半減期の問題、患部への移行性の問題もあり、 H G Fタンパクの有効な投与法あるいは投与量等については、未だ結論が出されていない。

また一方で、最近の分子生物学の飛躍的向上により、遺伝子導入法による細胞機能の賦活化が可能となり、種々の取り組みがなされており、 HGF遺伝子を用いて、心臓領域への遺伝子治療が試みられようとしている。遺伝子の導入法については、例えば冠動脈内拡散注入法等の幾つかの報告があるものの.. 虚血部位への遺伝子導入法など、特に骨格筋に対する筋肉内導入法を用いて、具体的な糖尿病性虚血性疾患に対して、効果を示した例は見出されていない:

さらに、糖尿病を併発する、または糖尿病性に惹起される虚血性疾患においては血管新生が起こりにくく、予後も不良であることが知られているが、二のような糖尿病性虚血性疾患に対して H G F遺伝子の投与が有効であるか否かについては、何ら明ら力にされていなレ、：

発明の開示

本発明の目的は、 H G F遺伝子を用いた糖尿病性虚血性疾患の治療剤及び治療法を提供することにある：

本発明者らは、 HG F遺伝子が糖尿病性の虚血性疾患に適応できるか否かを明らかにするために鋭意検討を行った結果、当該疾患に対して、直接虚血患部に H G F遺伝子を投与することにより、極めて有効な効果が得られることを明らかにした- 具体的には下肢虚血性疾患において、下肢骨格筋層に HGF遺伝子を投与することにより、有効な効果が得られることを見出した。前述のように糖尿病を併発する、または糖尿病性に惹起される虚血性疾患においては血管新生が起こりにくく、予後も不良であることが知られている。そのため単なる虚血性疾患と異なり、糖尿病性虚血性疾患に対して H G F遺伝子が有効であるか否かはこれまで明らかにされていなかつたが、本発明により初めてその有効性が示された:，このような HG F遺伝子による治療は非侵襲的な治療法であるため、病状に応じて何回でも当該遺伝子を投与することが可能であるという特徴を有する。

すなわち本発明の要旨は以下のとおりである。

(1) 肝実質細胞増殖因子（HGF) 遺伝子を有効成分として含有する、糖尿病性虚血性疾患治療剤、

(2) 虚血部位へ投与するための、上記（1) の治療剤、

(3) 糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、上記（1) 又は（2) の治療剤、

(4) 糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、上記（3) の治療剤、

(5) 虚血部位の筋肉内へ投与するための、上記（1) 〜（4) のいずれかの治療剤、

(6) HGF遺伝子がセンダイ ' ウィルス（HVJ) —リボソームの形態にある、上記（1 ) 〜（5) のいずれかの治療剤、

(7) 必要に応じて複数回投与するための、上記（1 ) 〜（6) のいずれかの治療剤、

(8) HG F遺伝子として少なくとも 50 μ gを用いる、上記（1 ) 〜（7) のいずれかの治療剤、

(9) HGF遺伝子をヒトに導入することを含む、糖尿病性虚血性疾患の治療法、

(1 0) HGF遺伝子を虚血部位へ投与する、上記（9) の治療法、

(1 1) 糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、上記（9) 又は（1 0) の治療法、

(1 2) 糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、上記（1 1) の治療法、

(1 3) HGF遺伝子を虚血部位の筋肉内へ投与する、上記（9) 〜（1 2) のいずれかの治療法、

( 1 4) HGF遺伝子がセンダイ ' ウィルス（HV J ) —リボソームの形態にある、上記（9) 〜（ 1 3) のいずれかの治療法、

( 1 5) HGF遺伝子を必要に応じて複数回投与する、上記（9) 〜（1 4) のいずれかの治療法、

( 1 6) HG F遺伝子として少なくとも 50 μ gを投与する、上記（9) 〜 ( 1 5) のいずれかの治療法、

(1 7) 糖尿病性虚血性疾患治療剤の製造のための HG F遺伝子の使用、

(1 8) 糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、上記（1 7) の使用、

(1 9) 糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、上記（1 8) の使用、

(20) HGF遺伝子がセンダイ · ウィルス（HVJ) —リボソームの形態にある、上記（1 7) 〜（1 9) のいずれかの使用、

(2 1) HG F遺伝子として少なくとも 50 / gを用いる、上記（ 1 7) 〜

(20) のいずれかの使用,：

図面の簡単な説明

図 1は、参考例 1の糖尿病の下肢虚血ラット群および、正常ラッ卜に下肢虚血を惹起したコントロール群における、血液還流比率（Perfusion ratio) の経時図 2は、参考例 1の糖尿病の下肢虚血ラット群および、正常ラッ卜に下肢虚血を惹起したコントロール群における虚血筋肉内の内在性 HGF濃度を示したダラ 'でめる。

図 3は、実施例 1の糖尿病の下肢虚血ラットへの HG F遺伝子投与群および未投与群と、正常ラットに下肢虚血を惹起したコントロール群における、血液還流比率を測定した結果を示したグラフである。

図 4は、実施例 2の糖尿病の下肢虚血ラッ卜への HG F遺伝子投与群および未投与群と、正常ラットに下肢虚血を惹起したコントロール群における、下肢虚血部の骨格筋を A L P染色し、単位当たりの血管数を比較した結果を示したグラフ

、"あ^。

図 5は、参考例 2のグルコースを添加した血管内皮細胞の HG F添加群および添加群と、グルコースを添加していないコントロール群における、培養上清の \I P - 1濃度を測定した結果を示すグラフである。

図 6は、参考例 3のグルコースを添加した血管内皮細胞の H G F添加群および未添加群と、グルコースを添加していないコントロール群における、血管内皮細胞中に発現する転写因子 ET S— 1の mRN A量を測定した結果を示すグラフで 60 - 発明の実施するための最良の形態

本発明において使用される「HG F遺伝子」とは、 HGF (HGFタンパク）を発現可能な遺伝子を指す。具体的には、 Nature, 342,440(1989)、特許第 2777678号公報、 Biochem. Biophys. Res, Commun.， 163， 967 (1989)、 Biochem.

Biophys. Res. Commun. , 172, 321 (1990)などに記載の HG Fの c DN Aを後述の如き適当な発現ベクター（非ウィルスベクター、ウィルスベクタ一）に組み込んだものが挙げられる。ここで HG Fをコードする c DNAの塩基配列は、前記文献に記載されている他、 Genbank 等のデ一々ベースにも登録されている。従ってこれらの配列情報に基づき適当な D N A部分を PCRのプライマ一として用い、例えば肝臓や白血球由来の！！！ ^^八に対して尺丁ー？じ！^反応を行うことなどにより、 HGFの c DNAをクロ一ニングすることができる。これらのクロ一ニングは、例は) molecular Cloning 2nd Edt. , し old Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。

さらに、本発明の HG F遺伝子は前述のものに限定されず、発現されるタンハク質が HGFと実質的に同じ作用を有する遺伝子である限り、本発明の HG F遺伝子として使用できる：すなわち、 1 ) 前記 c DN Aとストリンジユントな条件下でハイブリダィズする DNAや、 2) 前記 c DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して 1若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失及び Z又は付加されたァミノ酸配列からなるタンハク質をコードする D NA、などのうち、 HG Fとしての作用を有するタンパクをコードするものであれば、本発明の HGF遺伝子の範疇に含まれる。ここで前記 1) 及び 2) の DN Aは、例えば部位特異的突然変異誘発法、 PCR法、又は通常のハイブリダィゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記 Molecular Cloning等の基本書を参考にして行うことができる：

次に、本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、導入形態および導入量等について記述する。

HG F遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウィルスベクターを用いた場合と、ウィルスベクターを用いた場合の二つに大別され、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社， 1996、別冊実験医学，遺伝子導入 &発現解析実験法，羊土社， 1997、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ 'ティー 'エス， 1999) 。以下、具体的に説明する。

A. 非ウィルスベクターを用いる場合

慣用の遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現べクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。

細胞への遺伝子導入法としては、リポフエクシヨン法、リン酸カルシウム共沈法、 DEAE—デキストラン法、微小ガラス管を用いた DNAの直接注入法などが挙げられる。

また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソ一ム（internal type liposome) による遺伝子導入法、静電気型リボソーム（electrostatic type liposome) による遺伝子導入法、 HV J リボソーム法、改良型 HV J リポソ —ム法（HVJ- AVEリボソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、バーテイクル銃で担体（金属粒子）とともに DN A分子を細胞に移入する方法、 n a k e d DNAの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に供することにより、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。このうち HV J リボソームは、脂質二重膜で作られたリボソーム中に DNA を封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウィルス (Hemagglutinating virus of Japan ： HV J) とを融合させたものである。当該 HV J—リボソーム法は従来のリボソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、好ましい導入形態である。 HV J— リポソームの調製法については文献（実験医学別冊，遺伝子治療の基礎技術，羊土社， 1996、遺伝子導入 &発現解析実験法，羊土社， 1997、 J.Clin. Invest.93, 1458- 1464(1994)、 Am. J. Physiol.271, R1212 - 1220 (1996) ) などに詳しく述べられているため、それらを参照されたい,：また H V J リホソーム法とは、例えば Molecular Medicine, 30， 1440 - 1448 (1993)、実験医学， 12, 1822- 1826 (1994)、蛋白質 · 核酸 · 酵素， 42， 1806-1813(1997)等に記載の方法であり、好ましくは Circulation, 92(Suppl. II)， 479-482 (1995)に記載の方法が挙げられる。

なお HVJとしては Z株（ATCCより入手可能）が好ましいが、基本的には他の HVJ株（例えば ATCC VR- 907や ATCC VR- 105など）も用いることができる。さらに、 n a k e d— DNAの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であり、この観点から好ましい導入法である。

ここで用いられる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現べクタ一であっても良いが、例えば p CAGGS (Gene 108, 193- 200(1991)) や、 p BK— CMV、 p c DNA 3. 1、 p Z e o SV (インビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクターが挙げられる。

B. ウィルスベクターを用いる場合

ウィルスベクタ一としては、糸且換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルべスウイルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスウイノレス、センダイウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（H I V) 等の DNA ウィルスまたは RN Aウィルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。前記ウィルスベクタ一のうち、アデノウィルスの感染効率が他のウィルスべクタ一を用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、ァデノウィルスベクター系を用いることが好ましい:.

本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入する i n V 1 V o法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す e X V 1 V 0法がある (日経サイエンス、 1 994年 4月号、 20— 45頁、月刊薬事、 36 ( 1) ， 23 -48 ( 1 994) 、実験医学増刊、 1 2 ( 1 5) 、（1 994) 、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ 'ティー 'エス、 1 9 99) 。本発明では、 i n V 1 V o法が好ましレ、：

製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（PB S等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルタ一等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、 HV J—リポソ一ム等のリボソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソ一ム製剤の形態とすることができる。

本発明で用いられる HG F遺伝子以外に、血管新生作用を有する公知の因子を併用して、又は単独で用いることが可能である，例えば、 ¥£〇？ゃ 0 等の因子は血管新生作用を有することが報告されており、これらの遺伝子を使用することが出来る。また EG F等の増殖因子は、組織の種々の細胞障害を修復することが報告されており、これらの遺伝子を用いることも可能である。

本発明でレ、う糖尿病性虚血性疾患とは、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害または、糖尿病性心筋梗塞などであり、これらのいずれの疾患に対しても本発明の遺伝子治療剤を適用することができる：また本発明の遺伝子治療剤は、重症の糖尿病性虚血性疾患の患者だけでなく、進行中の軽度の患者にも使用することができる。

本発明の遺伝子治療剤は、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与方法 •投与部位が選択される。投与方法としては、非経口的に投与することが好ましい- また投与部位としては、虚血部位内に投与することが好ましい：ここで「虚血部位」とは、虚血患部及びその周辺を含む部位を指す,：

虚血部位においては、具体的には血管内や筋肉内などへの投与が可能であるが、特に、虚血部位の筋肉内に投与することが好ましい：すなわち下肢虚血性疾患においては、下肢虚血部位の骨格筋内に投与することにより、虚血患部の血管新生を促進させ血流量の改善を図り、虚血患部の機能の回復正常化を行うことが出来る。また心筋梗塞等の心疾患においては、心筋内に投与することにより、同様の効果を上げることができる。

好ましい投与方法としては、例えば、非侵襲的なカテーテルあるいは非侵襲的な注射器等による投与方法を挙げることができる。更に、エコー使用下での非侵襲的なカテーテルあるいは注射器等による投与方法を挙げる二とができる。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法としては、例えば、心疾患においては、心室内腔より心筋内に直接 H G F遺伝子を注入する方法が挙げられる。

本発明の H G F遺伝子を適用することにより、糖尿病性の虚血性疾患の患者に対して積極的な遺伝子導入による治療を行うことができ、例えば、糖尿病性下肢虚血性疾患の患者においては、従来であれば外科的な患部の切除以外には道のなかった重症の患者に対して、機能の回復が可能となる。

本発明の治療剤の投与量としては、患者の症状等によって異なるが、成人患者 1人当たり H G F遺伝子として約 1 /i g〜約 5 O m gの範囲、好ましくは約 1 0 g〜約 5 m g、より好ましくは約 5 0 〜約 5 m gの範囲から投与量が選択される：

本発明の治療剤は、数日ないし数週間に一回投与するのが好適であり、投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される：本発明の治療剤は、非侵襲的な投与に供されるものであるため、病状に応じて何回でも投与できるという特徴を有する。以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなら限定されるものではなレ、：

実験材料及び方法

H V J リボソーム製剤の作製

1 O m gの乾燥脂質（ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロ一'レの 1 : 8 : 2の混合物）と、 H G F遺伝子（ l OO g ) — HM G 1 (high mobility group 1 nuclear protein, 25 μ g) を含有する等張液（137 μΜ NaCl, 5.4μΜ KC1, 10 μ Tris-HCl; ρΗ7.6) 200 / 1を混合し、激しく攪拌して超音波を掛けてリボソームを形成させた。精製センダイウィルス（Ζ株）を 3分間 UV 照射（llOerg /画"/ sec) した。リボソーム懸濁液とセンダイウィルス（HV J ) を混合して 4 :C 1 0分間、続レ、て 37 30分間加温した。遊離の H V Jを除去して、 HV J リボソーム製剤を取得した。投与群：糖尿病ラット（DM—ラット）の下肢虚血ラット

コントロール · ラット：正常ラッ卜の下肢虚血ラット

HV J リボソーム製剤の投与法

腹腔内にストレブトゾトシンを投与することにより誘発した 16週齢の糖尿病ラット（1群 6匹）に対して、片側大腿動脈の一部外科的切除を行って、下肢部に虚血状態を作製した。

HGF遺伝子含有 HV J—リボソーム製剤を、下肢虚血骨格筋に注入した。検討内容

リポソ一ム製剤投与後、側副血行路形成および血流改善効果の指標としてレーザ一散乱光解析によるレーザー ' ドッブラ Tメージャー（LD I ) を用いて下肢血流を測定した。正常下肢に対する虚血下肢の色調ヒストグラム（colored histogram) の平均 ί直を血夜還比率 (perfusion ratio) とした。

下肢虚血部分の毛細血管密度をアルカリフォスファターゼ（ALP) 染色により測定し、糖尿病下肢虚血ラット群とコントロールの下肢虚血ラット群とで比較した。あるいは、 HGF遺伝子の投与群と未投与群とで比較した。

参考例 1

糖尿病ラットの下肢虚血部位における HGF発現状況

腹腔内にストレブトゾトシンを投与して誘発した 16週齢の糖尿病ラット（1群 6匹）およびコントロール群として 16週齢の正常のラット（1群 6匹）に対して、片側大腿動脈の一部外科的切除を行って、下肢部に虚血状態をもたらした。

1週間後、レーザー · ドップラー 'ィメージャーにより虚血部位の血液還流比率を測定した。糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の血液還流比率は、コントロールの下肢虚血ラッ卜の血液還流比率よりもはるかに低いものであった（図 1参昭、） ■—

3週間後、 5週間後にも、虚血部位の血液還流比率を測定したところ、同様に糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の血液還流比率は、コントロールの下肢虚血ラットの血液還流比率よりもはるかに低いものであった（図 1参照）：

筋肉内の内在性 H G Fの濃度は、糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の筋肉内においてコントロールの下肢虚血ラッ卜の筋肉内よりも顕著に低いものであった。この結果は、糖尿病において血管新生が不良である原因が筋肉内の内在性 H G F の減少によるものであることを示しているこのため、糖尿病下肢虚血ラットでは、血管新生が起こりにくくなり、側副血行路が発達しないと考えられる（図 2 参照）。

実施例 1

糖尿病下肢虚血ラットに対する H G F遺伝子治療の効果（ I )

腹腔内にストレブトゾトシンを投与することにより誘発した 16週齢の糖尿病ラット（1群 6匹）および 16週齢の正常ラット（1群 6匹）に対して、片側大腿動脈の一部の外科的切除を行って、下肢部に虚血状態をもたらした。大腿動脈の外科的切除後、 H G F遺伝子（5 0 μ _β ) 含有 H V J —リボソーム製剤を下肢虚血部位の筋肉内に導入した。

3週間後、レーザー · ドップラー ·ィメージャーにより虚血部位の血液還流比率を測定した。 H G F遺伝子が投与された糖尿病下肢虚血ラットの虚血部位の血液還流比率は、コントロールの下肢虚血ラットゃ未投与の上記糖尿病下肢虚血ラッ卜と比較し、顕著な増加を示した。

コントロールの下肢虚血ラットの血液還流比率を 1 0 0 %とすると、 H G F遺伝子未投与の糖尿病下肢虚血ラットでは 6 7 %であり、 H G F遺伝子を投与した糖尿病下肢虚血ラットでは 1 2 9 %であった。結果を図 3に示す（図 1参照）。実施例 2

糖尿病下肢虚血ラットに対する H G F遺伝子治療の効果（II)

上記と同じ様に処置をした糖尿病下肢虚血ラット、コントロールの下肢虚血ラットを作製し、 H G F遺伝子治療を行った。 5週間後に各ラットの下肢虚血部位の骨格筋を取り出し、 A L P染色し単位面積当たりの血管数を比較した。 HGF 遺伝子未投与の糖尿病下肢虚血ラットでは、コントロールの下肢虚血ラットと比較して有意に血管数が少なく、 HG F遺伝子投与の糖尿病下肢虚血ラットは血管数が有意に増加していた結果を図 4に示す

参考例 2

血管内皮細胞による MM P— 1の産生に対するグルコース濃度および HGF添加の影響

血管内皮細胞（ヒト大動脈由来）を無血清下で、グルコース濃度が 0、 25 mM、 50 mMとなるような 3種の培地で培養し、 24時間培養後の培養液上清の MM P— 1濃度を測定した

また各々、グルコース添付の 30分前に HGFを 1 00 n gZm 1で添加した場合と比較した。

上清中の MMP— 1濃度が、グルコースの濃度依存的に有意に減少し、 HGF 処理により MM P— 1の減少が止まり増加することが示された。結果を図 5に示す。

参考例 3

血管内皮細胞に対する HGFの効果（血管新生に係わる転写因子 ET S— 1の変化）

参考例 1 と同様に血管内皮細胞を培養し、細胞中に発現する転写因子 ETS— 1の mRN A量を測定した。コントロールの内皮細胞の、 ETS— 1の mRNA 量を 1 00%とすると、 HG F未添加の血管内皮細胞では高グルコースの条件により有意に減少していた。一方、 HG F添加の血管内皮細胞ではコントロールの発現量と比較して同等以上になっていた（Pく 0.01) 。結果を図 6に示す。

以上のように、高グルコース条件下の血管内皮細胞では、血管新生のために必須のマトリックス分解酵素である MM P— 1の産生が減少し、血管新生時に発現、増加する転写因子である E T S— 1の m R N A発現が低下していた。

上記のことから、高グルコース条件下では血管新生がおこりにくくなつている二とが明らかにされた。一方、高グルコース条件下の血管内皮細胞に HG Fを添加することにより、 — 1の産生、 E T S— 1の mRN Aの発現が顕著に増加し、 H G Fにより血管新生がおこりやすくなっていることが示された。

産業上の利用可能性

本発明の H G F遺伝子を有効成分とする糖尿病性虚血性疾患治療剤は、 H G F の発現の減少した糖尿病性虚血患部に特有の血管新生不良を改善し、顕著な血管新生作用を示すことから、虚血患部の血流量を増大させ病状を改善することができる。しかも、本発明の治療剤は患者の病状に応じて 1回以上の投与を行うことにより、その目的である血管新生を促進することができる。従ってこれらの効果により、本発明の治療剤は糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害または、糖尿病性心筋梗塞をより的確に治療することができる。

Claims

請求の範囲

1. 肝実質細胞増殖因子（HGF) 遺伝子を有効成分として含有する、糖尿病性虚血性疾患治療剤。

2. 虚血部位へ投与するための、請求項 1記載の治療剤。

3. 糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、請求項 1又は 2記載の治療剤。

4. 糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、請求項 3記載の治療剤。

5. 虚血部位の筋肉内へ投与するための、請求項 1〜4のいずれか記載の治療剤。

6. HGF遺伝子がセンダイ ' ウィルス（HVJ) —リボソームの形態にある、請求項 1〜 5のレ、ずれか記載の治療剤。

7. 必要に応じて複数回投与するための、請求項 1〜 6のいずれか記載の治療剤。

8. HGF遺伝子として少なくとも 50 gを用いる、請求項 1〜 7のいずれか記載の治療剤。

9. HGF遺伝子をヒトに導入することを含む、糖尿病性虚血性疾患の治療法。

1 0. HGF遺伝子を虚血部位へ投与する、請求項 9記載の治療法。

1 1. 糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、請求項 9又は 1 0記載の治療法。

1 2. 糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、請求項 1 1記載の治療法。

1 3. HG F遺伝子を虚血部位の筋肉内へ投与する、請求項 9〜 1 2のいずれか記載の治療法。

1 4. HGF遺伝子がセンダイ · ウィルス（HVJ) —リボソームの形態にある、請求項 9〜 1 3のいずれか記載の治療法。

1 5. HGF遺伝子を必要に応じて複数回投与する、請求項 9〜1 4のいずれか記載の治療法。

1 6. HGF遺伝子として少なくとも 5 O x gを投与する、請求項 9〜1 5のレ、ずれか記載の治療法。

1 7. 糖尿病性虚血性疾患治療剤の製造のための HGF遺伝子の使用。

1 8. 糖尿病性虚血性疾患が、糖尿病性下肢虚血性疾患、糖尿病性虚血性神経障害又は糖尿病性心筋梗塞である、請求項 1 7記載の使用。

1 9. 糖尿病性虚血性疾患が糖尿病性下肢虚血性疾患である、請求項 1 8記載の使用。

20. HG F遺伝子がセンダイ ' ウィルス（HVJ) —リボソームの形態にある、請求項 1 7〜1 9のいずれか記載の使用。

2 1. HG F遺伝子として少なくとも 50 /X gを用いる、請求項 1 7〜20のいずれか記載の使用。