ES2308775T3 - Variantes de dnasa i humana. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE VARIANTES DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LA ADNASA I HUMANA QUE PRESENTAN UNA BAJA AFINIDA DE UNION POR LA ACTINA. LA INVENCION DESCRIBE SECUENCIAS DE AMINOACIDOS QUE CODIFICAN DICHOS VARIANTES RESISTENTES A LA ACTINA, PERMITIENDO CON ELLO LA PRODUCCION DE ESTOS VARIANTES EN CANTIDADES SUFICIENTES PARA SU USO CLINICO. LA INVENCION TAMBIEN TRATA DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y USOS TERAPEUTICOS DE LOS VARIANTES RESISTENTES A LA ACTINA DE LA ADNASA I HUMANA.
Description
Variantes de DNasa I humana.
La presente invención se refiere a los
resultados obtenidos de la investigación sobre desoxirribonucleasa
humana I (DNasa I), una fosfodiesterasa que es capaz de hidrolizar
el ácido polidesoxirribonucleico. Se refiere en general a formas
modificadas (variantes) de DNasa I humana y su preparación mediante
procedimientos de ADN recombinante para composiciones farmacéuticas
mediante las cuales se puede explotar su utilidad clínicamente, y a
procedimientos de utilización de estas variantes de DNasa I y
composiciones de las mismas.
La DNasa I es una fosfodiesterasa capaz de
hidrolizar ácido polidesoxirribonucleico. La DNasa se ha purificado
de varias especies en varios grados.
La DNasa I bovina se ha estudiado
bioquímicamente de manera muy profunda. Véase, por ejemplo, Boyer,
P.D., ed), pág. 281-296, Academic press, Nueva York
(1981). Se conoce la secuencia de aminoácidos completa para DNasa I
bovina (Liao, et al., J. Biol. Chem. 248:
1489-1495 (1973); Oefner, et al., J. Mol.
Biol. 192: 605-632 (1986); Lahm, et al., J.
Mol. Biol. 221: 645-667 (1991)), y el ADN que
codifica DNasa I bovina se ha clonado y expresado (Worrall, et
al., J. Biol. Chem 265: 21889-21895 (1990)). La
estructura de la DNasa I bovina se ha determinado mediante
cristalografía de rayos X. Suck, et al., EMBO J. 3:
2423-2430 (1984); Suck, et al., Nature 321:
620-625 (1986); Oefner, et al., J. Mol. Biol.
192: 605-632 (1986).
El ADN que codifica la DNasa I humana ha sido
aislado y secuenciado y este ADN se ha expresado en células huésped
recombinantes, permitiendo de este modo la producción de DNasa I
humana en cantidades comercialmente útiles. Shak, et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990).
La DNasa I tiene una serie de utilidades
conocidas y se ha utilizado con fines terapéuticos. Su uso
terapéutico principal ha sido reducir la viscoelasticidad de las
secreciones pulmonares (mucosidad) en enfermedades tales como
neumonía y fibrosis quística (CF), ayudando de este modo en la
purificación de las vías respiratorias. Véase, por ejemplo,
Lourenco, et al., Arch. Intern. Med. 142:
2299-2308 (1982); Shak. et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 87: 9188-9192 (1990); Hubbard, et
al., New Engl. J. Med. 326: 812-815 (1992);
Fuchs, et al., New Engl. J. Med. 331:
637-642 (1994); Bryson, et al., Drugs 48:
894-906 (1994). La mucosidad también contribuye a la
morbidad de la bronquitis crónica, bronquitis asmática,
bronquiectasis, enfisema, sinusitis aguda y crónica, e incluso el
resfriado común.
Las secreciones pulmonares de personas que
padecen dichas enfermedades son una materia compleja que incluyen
glicoproteínas de la mucosidad, mucopolisacáridos, proteasas, actina
y ADN. En las secreciones pulmonares algunos de los materiales se
liberan de leucocitos (neutrófilos) que se infiltran en el tejido
pulmonar en respuesta a la presencia de microbios (por ejemplo,
cepas de bacterias Pseudomonas, Pneumococcus o Staphylococcus) u
otros irritantes (por ejemplo, humo de tabaco, polen). En el
transcurso de la reacción con dichos microbios o irritantes, los
leucocitos se pueden degenerar y pueden liberar sus contenidos, lo
cual contribuye a la viscoelasticidad de las secreciones
pulmonares.
La capacidad de la DNasa I para reducir la
viscoelasticidad de las secreciones pulmonares se ha atribuido a su
degradación enzimática de grandes cantidades de ADN liberado por los
neutrófilos. Shak, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:
9188-9192 (1990); Aitken et al., J. Am. Med.
Assoc. 267: 1947-1951 (1992).
Más recientemente, se ha propuesto un mecanismo
diferente para el efecto mucolítico de la DNasa I, que implica la
disgregación de actina. Vasconcellos et al, Science 263:
969-971 (1994). La actina es una de las proteínas
más abundantes en las células eucariotas (por ejemplo, la actina
comprende aproximadamente un 10% de las proteínas de leucocitos
totales) y se ha estudiado de manera amplia. Kabsch, et al.,
Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21: 49-76
(1992); Shterline, et al., Prot. Profile
1:1-121 (1994). La actina existe en dos formas, una
forma monomérica (G-actina) y una forma filamentosa
(F-actina) que se ensambla a partir de monómeros de
G-actina. Los filamentos poliméricos de actina son
altamente viscoelásticos y contribuyen de manera significativa a la
viscosidad de secreciones pulmonares. Momet et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 81: 3680-3684 (1984); Newman,
et al., Biochemistry 24: 1538-1544 (1985);
Janmey, et al., Biochemistry 27: 8218-8226
(1988); Vasconcellos et al, Science 263:
969-971 (1994).
Dado que la DNasa I es conocida por unirse a
actina (Lazarides et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71:
4742-4746 (1974); Kabsch, et al., Nature
347: 37-4 (1990)) y por despolimerizar filamentos de
actina (así como inhibir la polimerización de
G-actina en filamentos) (Mannherz et al.,
FEBS Lett. 60: 34-38 (1975); Hitchcok, et
al., Cell 7: 531-542 (1976); Pinder, et
al., Biochemistry 21: 4886-4890 (1982); Weber
et al., Biochemistry 33: 4780-4786 (1994)),
se ha sugerido que el efecto mucolítico de DNasa I en el esputo y
otras secreciones pulmonares es debido a la disgregación
(despolimerización) de actina en lugar de las hidrólisis de ADN.
Vasconcellos, et al., Science 263: 969-97
(1994). En concordancia con esta visión, se sabe que en presencia de
actina, se inhibe la actividad hidrolítica de ADN de la DNasa I.
Lazarides et al., Proc. Nat. Acd. Sci. 71:
4742-4746 (1974); Mannherz, et al., Eur. J.
Biochem. 104: 367-379 (1980). También en
concordancia con esta visión, se ha descrito que proteínas divisoras
de actina (por ejemplo, gelsolina) son eficaces en la disminución de
la viscoelasticidad del esputo de la fibrosis quística.
Vasconcellos, et al., Science 263: 969-971
(1994); Stossel, et al., Publicación de Patente PCT No. WO
94/22465 (publicada el 13 de octubre de 1994).
El documento WO 90/07572 describe extractos de
ADN que codifican DNasa humana y procedimientos para la obtención
de dicho ADN.
La presente invención se basa en parte en las
investigaciones de los inventores para determinar la base
bioquímica de la actividad mucolítica de DNasa I. Esta investigación
implicaba el diseño y síntesis de diversas variantes de DNasa I
humana y el ensayo de estas variantes para valorar su capacidad para
hidrolizar ADN, para unirse a actina y para reducir la
viscoelasticidad del esputo in vitro. Los inventores crearon
varias clases de variantes de DNasa I humana. Una clase de
variantes (variantes de resistencia a actina) disminuyó la
capacidad de unión a actina, pero aún mantuvo la actividad
mucolítica y en algunos casos disminuyó la actividad mucolítica en
comparación con DNasa I humana nativa. Estas variantes resistentes a
actina tienen aproximadamente la misma actividad hidrolítica de ADN
que la DNasa I humana nativa, pero dicha actividad es menos
susceptible de inhibición por la actina. Una segunda clase de
variantes se unen a actina con una afinidad similar a la observada
para la DNasa I humana nativa, pero tienen una menor actividad
mucolítica y actividad hidrolítica de ADN en comparación la DNasa I
humana nativa.
Estos resultados indican que la eficacia
terapéutica de la DNasa I humana en la reducción de la
viscoelasticidad de las secreciones pulmonares es debida a su
actividad catalítica, hidrolítica de ADN, en lugar de su capacidad
para despolimerizar actina filamentosa. Por consiguiente, las
variantes de DNasa I humana que se unen a actina con menor afinidad
que la DNasa I humana nativa, pero que aún poseen actividad
hidrolítica de ADN, deberían ser agentes terapéuticos útiles,
especialmente en el tratamiento de pacientes que tienen secreciones
pulmonares que comprenden cantidades relativamente grandes de
actina. Dado que dichas variantes tienen una menor afinidad por
actina, su actividad hidrolítica de ADN se encuentra menos inhibida
en presencia de actina y, de este modo, estas variantes tienen una
mayor actividad mucolítica en presencia de actina, en comparación
con la DNasa I humana nativa.
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención es proporcionar variantes de DNasa I humana que posean
actividad hidrolítica de ADN, pero que se unan a actina con menor
afinidad que la DNasa I humana nativa.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar ácidos nucleicos que codifican dichas variantes de
resistencia a actina de DNasa I humana, vectores recombinantes que
comprenden dichos ácidos nucleicos, células huésped recombinantes
transformadas con dichos ácidos nucleicos o vectores, y procesos
para la producción de variantes de DNasa I humana mediante
tecnología de ADN recombinante.
La presente invención también está dirigida a
composiciones farmacéuticas que comprenden las variantes
resistentes a actina de DNasa I humana, opcionalmente junto con un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención está dirigida
particularmente a medios para el tratamiento de un paciente que
padece una enfermedad, tal como fibrosis quística, bronquitis
crónica, neumonía, bronquiectasis, enfisema, asma o lupus
eritematoso sistémico.
Estos y otros objetivos de la presente invención
serán evidentes para un técnico en la materia después de considerar
la memoria en su totalidad.
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
de DNasa I madura humana (SEC ID No. 1). Los números indican la
posición secuencial de los residuos de aminoácidos en la
secuencia.
Las figuras 2-6 muestran los
datos para las siguientes variantes:
Las figuras 2A-2D muestran la
actividad específica relativa de DNasa I humana nativa y variantes.
Las barras de error representan la desviación estándar
(n-ponderada). La actividad específica relativa de
la DNasa I humana Pulmozyme® (Genentech, Inc., South San Francisco,
California, Estados Unidos) se define como 1,0. La actividad
específica relativa de la DNasa I humana nativa es mayor que la de
Pulmozyme® debido a la aparición en Pulmozyme® de una forma
desamidada de DNasa I humana que ha reducido la actividad
hidrolítica de ADN (Frenz et al., Publicación de Patente PCT
No. WO 93/25670, publicada el 23 de diciembre de 1993).
La figura 3 muestra la actividad hidrolítica de
ADN de DNasa I humana nativa y variantes por un único residuo de
DNasa I humana en presencia de actina, determinada en un ensayo de
hipercromicidad. "Porcentaje de actividad" es el porcentaje de
actividad hidrolítica de ADN de la DNasa I (nativa o variante)
calculada tal como se describe en el Ejemplo 3; la actividad
hidrolítica de ADN de la DNasa I en ausencia de actina se define
como el 100 por cien de actividad. Las barras de error representan
la desviación estándar.
La figura 4 muestra la actividad hidrolítica de
ADN de DNasa I humana nativa y variantes por múltiples residuos de
DNasa I humana en presencia de actina, determinada en un ensayo de
hipercromicidad o un ensayo de verde de metilo. "Porcentaje de
actividad" es el porcentaje de actividad hidrolítica de ADN de la
DNasa I (nativa o variante) calculada tal como se describe en el
Ejemplo 3; la actividad hidrolítica de ADN de la DNasa I en
ausencia de actina se define como el 100 por cien de actividad. Las
barras de error representan la desviación estándar.
Las figuras 5A-D muestran la
afinidad de unión relativa de variantes de DNasa I humana por actina
determinada en un ensayo ELISA de unión a actina (tal como se
describe en el Ejemplo 3). El valor de EC_{50} es la concentración
de la DNasa I (nativa o variante) que se requiere para obtener la
mitad de la señal máxima en el ensayo. Las barras de error
representan la desviación estándar. Los valores de EC_{50} para
Pulmozyme® y la DNasa I humana nativa son 67 \pm 23 pM (n = 31) y
87 \pm 14 pM (n = 32), respectivamente. La afinidad de unión
relativa mostrada en la figura es el valor de EC_{50} determinado
para la variante de DNasa I humana dividido entre el valor de
EC_{50} determinado para la DNasa I humana nativa. Las variantes
en las que el valor de EC_{50} era mayor de lo que podía medirse
en el ensayo se indican como una proporción (EC_{50} (variante de
DNasa I)/ EC_{50} (Dnasa I nativa)) mayor que un cierto valor (por
ejemplo, > 10, > 100, > 300, > 2000, > 20.000, >
35.000).
La figura 6 muestra la actividad mucolítica de
la DNasa I humana nativa y variantes de DNasa I humana en muestras
de esputo de pacientes con fibrosis quística, determinada mediante
un ensayo de compactación. Las barras de error representan el error
estándar de la media.
La figura 7 muestra una representación
esquemática del ensayo ELISA de unión a actina descrito en el
ejemplo 3.
Tal como se utiliza en la presente invención,
los términos "DNasa I humana", "DNasa I humana nativa" y
"DNasa I natural" se refieren al polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos de la DNasa I madura humana indicada en la
figura 1.
Una "variante" o "variante de la
secuencia de aminoácidos" de la DNasa I humana es un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos diferente de la de DNasa
I humana nativa. En general, una variante poseerá por lo menos un
80% de identidad en la secuencia (homología), preferiblemente por lo
menos un 90% de identidad en la secuencia, más preferiblemente por
lo menos un 95% de identidad en la secuencia y aún más
preferiblemente por lo menos un 98% de identidad en la secuencia con
la DNasa I humana nativa. El porcentaje de identidad en la
secuencia se determina, por ejemplo, mediante el método de Fitch,
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:
1382-1386 (1983), versión del algoritmo descrito por
Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453
(1970), después de la alineación de las secuencias para proporcionar
la máxima homología.
Los términos "variante resistente a actina de
DNasa I humana", "variante resistente a actina" y
"variante resistente a actina de DNasa I humana" se refieren a
una variante de DNasa I humana nativa que tiene (1) actividad
hidrolítica de ADN y (2) una afinidad de unión reducida por
actina.
"Actividad hidrolítica de ADN" se refiere a
la actividad enzimática de la DNasa I humana nativa o una variante
de la DNasa I humana en la hidrolización (división) del ADN sustrato
para producir productos finales oligonucleótidos
5'-fosforilados. La actividad hidrolítica de ADN se
determina fácilmente mediante cualquiera de los diferentes
procedimientos conocidos en la técnica incluyendo electroforesis
analítica en gel de poliacrilamida y gel de agarosa, ensayo de
hipercromicidad (Kunit, J. Gen. Physiol. 33: 349-362
(1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 363-377
(1950)), o ensayo con verde de metilo (Kumick, Arch. Biochem. 29:
41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal.
Biochem. 222: 351-358 (1994)).
La "afinidad de unión" de la DNasa I humana
nativa o una variante resistente a actina de DNasa I humana por
actina se refiere a la capacidad de la DNasa I para unirse no
covalentemente a actina. La afinidad de unión se puede determinar
mediante cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en la
técnica, por ejemplo, tal como se describe en Mannherz et
al., Eur. J. Biochem. 104: 367-379 (1980).
Alternativamente, las afinidades de unión relativas de diferentes
DNasas (por ejemplo, DNasa I humana nativa y variantes de la misma)
se determinan mediante la medición de la unión de las DNasas a
actina inmovilizada en un ensayo ELISA (descrito en el Ejemplo 3) o
mediante la comparación de la actividad hidrolítica de ADN de las
DNasas en presencia y ausencia de actina (también descrito en el
Ejemplo 3). Los procedimientos descritos en los Ejemplos son
especialmente convenientes para el cribado de variantes de DNasa I
humana para identificar rápidamente aquellas variantes que tienen
una afinidad de unión reducida para actina.
Una variante resistente a actina de DNasa I
humana que tiene una "afinidad de unión reducida por actina"
es la que tiene una afinidad de unión por actina que es
relativamente menor que la afinidad con la que la DNasa I humana
nativa se une a actina, determinada en condiciones comparables. Si
el ensayo ELISA de unión a actina, tal como se describe en el
ejemplo 3, se utiliza para determinar la afinidad de unión de una
DNasa I humana (nativa o variante) por actina, entonces una
variante resistente a actina que tiene una "afinidad de unión
reducida por actina" será la que tiene un valor de EC_{50} que
es superior al de la DNasa I humana nativa. En este ensayo, una
variante resistente a actina tendrá habitualmente un valor de
EC_{50} de cinco a cien veces superior al de la DNasa humana
nativa; pero las variantes resistentes a actina que tienen un valor
de EC_{50} unas 500 veces superior al de la DNasa I humana nativa
también se producen fácilmente, especialmente mediante la
alteración de múltiples residuos de aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos de DNasa I humana nativa (véase, por ejemplo, la Figura
5A, 5D).
"Actividad mucolítica" se refiere a la
reducción de la viscoelasticidad (viscosidad) de esputo u otro
material biológico, por ejemplo, observada tras el tratamiento del
material con DNAsa I humana nativa o una variante de DNAsa I
humana. La actividad mucolítica se determina fácilmente mediante
cualquiera de los diferentes procedimientos conocidos en la
técnica, incluyendo el ensayo de compactación de esputo (Publicación
de Patente PCT No. WO 94/10567, publicada el 11 de mayo de 1994),
ensayos que utilizan un péndulo de torsión (Janmey, J. Biochem.
Biophys. Methods 22: 41-52 (1991) u otras
metodologías reológicas.
"Reacción en cadena de la polimerasa" o
"PCR", se refiere en general a un procedimiento para la
amplificación de una secuencia de nucleótidos deseada in
vitro, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de
Estados Unidos No. 4.683.195. En general, el método PCR implica
ciclos repetidos de síntesis por extensión de cebadores utilizando
cebadores oligonucleótidos capaces de acoplarse preferencialmente a
un ácido nucleico plantilla.
"Célula", "células huésped", "línea
celular" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente en
la presente invención y debería entenderse que dichos términos
incluyen toda la progenie resultante del crecimiento o el cultivo
de una célula. "Transformación" y "transfección" se
utilizan indistintamente para referirse al proceso de introducción
de ADN en un célula.
"Unido operativamente" se refiere a la
unión covalente de dos o más secuencias de ADN mediante unión
enzimática o, en cualquier caso, en una configuración relativa entre
sí, de manera que se puede realizar la función normal de las
secuencias. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia
líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido
si se expresa como una preproteína que participa en la secreción
del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente
a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la
secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente
a una secuencia codificante si está situado para facilitar la
traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que
las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de
una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. La
unión se realiza mediante la unión en los sitios de restricción
convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan entonces
adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos
conjuntamente con procedimientos de ADN recombinante estándar.
Los aminoácidos se identifican en la presente
invención mediante designaciones de tres letras o de una única
letra, tal como se indica a continuación:
La presente invención se basa en el estudio de
la estructura, propiedades de unión a actina, actividad hidrolítica
de ADN y actividad mucolítica de variantes de secuencias de
aminoácidos de DNasa I humana. Las variantes resistentes a actina
de la presente invención presentan actividad hidrolítica de ADN,
pero se unen a actina con una menor afinidad que la DNasa I humana
nativa. La reducción en la unión a actina se consigue
preferiblemente realizando mutaciones en y/o alrededor de los
residuos de aminoácidos con DNasa I humana nativa que parecen
afectar a la unión de actina, incluyendo, por ejemplo, los residuos
de Dnasa I humana nativa Glu13, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52,
Asp53, Asn56, Asp58, His64, Tyr65, Val66, Val67, Ser68, Glu69,
Pro70, Ser94, Tyr96 y Ala114 (el número después de la designación
del aminoácido con tres letras indica la posición específica del
residuo de aminoácido en la secuencia de la figura 1).
Existen diversas maneras para fabricar variantes
resistentes a actina de DNasa I humana. Una variante resistente a
actina se puede preparar mediante la introducción de sustituciones,
inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos individuales o
múltiples en o adyacente a (es decir, en menos de aproximadamente
cinco residuos de aminoácidos de) los residuos de aminoácidos de
DNasa I humana nativa que afectan a la unión a actina. Algunos
ejemplos ilustrativos de dichas mutaciones son tal como se indican a
continuación: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K,
E69R, D53R:Y65A, D53R:E69R, H44A:D53R:Y65A, H44A:Y65A:E69R (véase
las figuras 2-6).
Una variante resistente a actina se puede
preparar mediante la introducción de una mutación o mutaciones que
crean un nuevo punto de glicosilación en o adyacente a (es decir, en
menos de aproximadamente cinco residuos de aminoácidos de) los
residuos de aminoácidos de DNasa I humana nativa que afectan a la
unión a actina. Por ejemplo, se utiliza la mutagénesis dirigida de
sitio para introducir una de las secuencias tripéptido,
asparagina-X-serina o
asparagina-X-treonina (en las que X
es cualquier aminoácido excepto prolina), que son secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática de un grupo carbohidrato a
la cadena lateral de asparagina. Creighton, Proteins, pág.
76-78 (W.H. Freeman, 1984). El impedimento estérico
que aparece entre el grupo carbohidrato de la variante de DNasa I
N-glicosilada resultante y actina puede reducir o
evitar la unión a actina y la consecuentemente la inhibición de la
actividad hidrolítica de ADN de la DNasa I, en comparación con la
DNasa I humana nativa. Algunos ejemplos ilustrativos de dichas
mutaciones para introducir un nuevo punto de glicosilación son los
siguientes: H44N, D58S, D58T, V66N, H44N:T46S, H64N:V66S, H64N:V66T,
Y65N:V67S, Y65N:V67T, V66N:S68T, V67N:E69S, V67N:E69T, S68N:P70S,
S68N:P70T, S94N:Y96S, S94N:Y96T.
Opcionalmente, conjuntamente con dichas
mutaciones para crear un nuevo punto de glicosilación, se puede
eliminar el sitio de glicosilación natural en las posiciones 18 y/o
106 en la secuencia de aminoácidos de DNasa I humana nativa,
dependiendo de la extensión de la glicosilación deseada en la
variante resistente a actina.
La mutagénesis dirigida de sitio se puede
utilizar para introducir residuos en o adyacente a (es decir, en
menos de aproximadamente cinco residuos de aminoácidos de) los
residuos de aminoácidos de DNasa I humana nativa, que están
implicados en la unión a actina, que son adecuados para la
modificación después de la traducción biológica o químicamente
(véase a continuación). Means et al., Chemical Modification
of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer et
al., Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and
Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, pág.
70-87 (W. H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical
Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Dichas
modificaciones después de la traducción pueden introducir
impedimento estérico o propiedades electrostáticas alteradas en el
DNasa I que reducirán o evitarán la unión a actina y la posterior
inhibición de la actividad hidrolítica de ADN, en comparación con la
DNasa I humana nativa. Por ejemplo, se puede introducir un residuo
de cisteína en o adyacente a un residuo de DNasa I nativa humana que
está implicado en la unión a actina. El tilo libre del residuo de
cisteína puede forman un enlace disulfuro intermolecular con otra
variante de DNasa I para formar un dímero de Dnasa I, o se puede
modificar, por ejemplo, con un agente alquilante específico de
tiol. Algunos ejemplos ilustrativos de dichas mutaciones son las
siguientes: H44C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C,
E69C, A114C.
Por conveniencia, las sustituciones, inserciones
y/o eliminaciones en la secuencia de aminoácidos de DNasa I humana
nativa se realizan habitualmente mediante la introducción de
mutaciones en la correspondiente secuencia de nucleótidos del ADN
que codifica la DNasa I humana nativa, por ejemplo, mediante
mutagénesis dirigida de sitio. La expresión del ADN mutado da lugar
entonces a la producción de la DNasa I humana variante, que tiene
la secuencia de aminoácidos (no nativa) deseada.
Aunque se puede utilizar cualquier técnica
conocida en el sector para realizar la mutagénesis dirigida de
sitio, por ejemplo tal como se describe en Sambrook et al.,
molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989)), la mutagénesis
dirigida por oligonucleótido es el procedimiento prefereido para
preparar las variantes de DNasa I humana de la presente invención.
Este procedimiento, que es bien conocido en la técnica (Zoller,
et al., Meth. Enz. 100: 4668-500 (1983);
Zoller, et al., Meth Enz. 154: 329-350
(1987); Carter, Meth. Enz. 154. 382-403 (1987);
Kunkel, et al., Meth. Enzymol. 154: 367-382
(1987); Horwitz, et al., Meth. Enz. 185:
599-611 (1990)), es particularmente adecuado para
producir variantes por sustitución, aunque también se puede
utilizar para preparar de manera conveniente variantes por
eliminación e inserción.
La técnica de mutagénesis dirigida de sitio
utiliza habitualmente un vector fago que existe en forma de cadena
única y cadena doble. Los vectores habituales útiles en la
mutagénesis dirigida de sitio incluyen vectores tales como el fago
M13 y vectores plásmidos que contienen un origen de replicación de
fago de cadena única (Messing et al., Meth. Enzymol. 101:
20-78 (1983); Veira et al., Meth. Enzymol.
153: 3-11 (1987); Short, et al., Nuc. Acids.
Res. 16: 7583-7600 (1988)). La replicación de estos
vectores en células huésped adecuadas da lugar a la síntesis de ADN
de cadena única que se puede utilizar para la mutagénesis dirigida
de sitio.
Brevemente, al llevar a cabo la mutagénesis
dirigida de sitio de ADN que codifica DNasa I humana nativa (o una
variante de la misma), el ADN se altera mediante la hibridación en
primer lugar de un oligonucleótido que codifica la mutación deseada
a una cadena única del ADN. Después de la hibridación, se utiliza
una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena completa
utilizando el oligonucleótido hibridado como cebador, y utilizando
la cadena única del ADN como plantilla. De este modo, el
oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el
ADN de cadena doble resultante.
Los oligonucleótidos para usar como sondas de
hibridación o cebadores se pueden preparar mediante cualquier
procedimiento adecuado, tal como mediante purificación de un ADN
natural o mediante síntesis in vitro. Por ejemplo, los
oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando varias técnicas
de química orgánica, tal como se describe en Narang, et al.,
Meth. Enzymol. 68. 90-98 (1979); Brown, et
al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979);
Caruthers, et al., Meth. Enzymol. 154:
287-313 (1985). La estrategia general para
seleccionar una sonda de hibridación o cebadores adecuados es bien
conocida. Keller et al., DNA Probes, pág.
11-18 (Stockton Press, 1989). Habitualmente, la
sonda de hibridación o cebador contendrá de 10 a 25 o más
nucleótidos, e incluirá por lo menos 5 nucleótidos en cada parte de
la secuencia que codifica la mutación deseada para asegurar que el
oligonucleótido se hibridará preferencialmente en el punto deseado a
la molécula plantilla de ADN de cadena única.
Naturalmente, la mutagénesis dirigida de sitio
se puede utilizar para introducir mutaciones múltiples por
sustitución, inserción o eliminación en un ADN de partida. Si los
sitios a mutar se localizan de forma próxima, las mutaciones se
pueden introducir de manera simultánea utilizando un único
oligonucleótido que codifica todas las mutaciones deseadas. Sin
embargo, si los sitios a mutar se localizan a cierta distancia ente
sí (separados por más de aproximadamente diez nucleótidos), es más
difícil generar un único nucleótido que codifique todos los cambios
deseados. En su lugar, se puede utilizar uno de los dos
procedimientos alternativos.
En el primer procedimiento, se genera un
oligonucleótido separado para cada mutación deseada. A continuación
los oligonucleótidos se acoplan al ADN plantilla de cadena única de
forma simultánea, y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a
partir de la plantilla codificará todas las sustituciones de
aminoácidos deseadas.
El procedimiento alternativo implica dos o más
ciclos de mutagénesis para producir la variante deseada. El primer
ciclo es tal como se describe para introducir una mutación
individual. El segundo ciclo de la mutagénesis utiliza el ADN
mutado producido en el primer ciclo de mutagénesis como plantilla.
De este modo, esta plantilla contiene ya una o más mutaciones. A
continuación, el oligonucleótido que codifica la sustitución o
sustituciones de aminoácidos deseados adicionales se acopla a esta
plantilla y la cadena resultante de ADN codifica entonces
mutaciones de tanto el primer como el segundo ciclo de la
mutagénesis. Este ADN resultante se puede utilizar como plantilla
en un tercer ciclo de mutagénesis, etcétera.
La mutagénesis por PCR (Higuchi, en PCR
Protocols, pág. 177-183 (Academic Press, 1990);
Vallette, et al., Nuc. Acids Res. 17:
723-733 (1989)) también es adecuada para producir
las variantes de DNAsa I humana. Brevemente, cuando se utilizan
pequeñas cantidades de ADN plantilla como material de partida en una
PCR, se pueden utilizar cebadores que difieren ligeramente en la
secuencia de la región correspondiente en el ADN plantilla para
generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN
específico que difiere de la secuencia plantilla sólo en las
posiciones en las que los cebadores difieren de la plantilla. Para
la introducción de una mutación en un ADN plásmido, por ejemplo, la
secuencia de uno de los cebadores incluye la mutación deseada y se
diseña para hibridarse a una cadena del ADN plásmido en la posición
de la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a
la secuencia de nucleótidos en la cadena opuesta del ADN plásmido,
pero esta secuencia se puede situar en cualquier punto a lo largo
del ADN plásmido. Sin embargo, se prefiere que la secuencia del
segundo cebador esté situada a menos de 200 nucleótidos de la del
"fust", de manera que en el extremo se pueden secuenciar
fácilmente la región amplificada completa del ADN unido por los
cebadores. La amplificación por PCR utilizando una pareja de
cebadores como la que se acaba de describir da lugar a una
población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la
mutación especificada por el cebador, y posiblemente en otras
posiciones, ya que la copia de plantillas es algo propensa a
errores. Wagner et al., en PCR Topics, pág.
69-71 (Springer-Verlag, 1991).
Si la proporción de plantilla con respecto al
producto amplificado de ADN es extremadamente baja, la mayoría de
los fragmentos del producto de ADN incorporan la mutación o
mutaciones deseadas. Este producto de ADN se utiliza para sustituir
la región correspondiente en el plásmido que servía como plantilla
para la PCR utilizando procedimientos estándar de ADN recombinante.
Las mutaciones en posiciones separadas se pueden introducir de
forma simultánea utilizando un segundo cebador mutante o realizando
una segunda PCR con cebadores mutantes diferentes y uniendo de
forma simultánea los dos fragmentos de PCR resultantes al fragmento
de plásmido en una unión de tres (o más) partes.
Otro procedimiento para la preparación de
variantes, la mutagénesis de cassette, se basa en la técnica
descrita por Wells et al., Gene, 34: 315-323
(1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que
comprende la secuencia de ADN a mutar. Se identifican el codón o
codones en el ADN de partida a mutar. Debe haber un único sitio de
restricción de endonucleasa en cada parte del sitio o sitios de
mutación identificados. Si no existen sitios de restricción, se
pueden generar utilizando el procedimiento de mutagénesis mediada
por oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlos en
los sitios adecuados en el ADN. El ADN plásmido se corta en estos
sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido de doble
cadena que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de
restricción, pero que contienen la mutación o mutaciones deseadas
utilizando procedimientos estándar, donde las dos cadenas del
oligonucleótido se sintetizan por separado y, a continuación, se
hibridan utilizando técnicas estándar. A este oligonucleótido de
doble cadena se hace referencia como cassette. Este cassette se
diseña de manera que tenga extremos 5' y 3' que son compatibles con
los extremos del plásmido linealizado, de manera que se pueda unir
directamente al plásmido. El plásmido resultante contiene la
secuencia de ADN mutada.
La presencia de una mutación o mutaciones en un
ADN se determina mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica, incluyendo el mapeo de restricción y/o la secuenciación de
ADN. Un procedimiento preferido para la secuenciación de ADN es el
procedimiento de la terminación de cadena o didesoxi de Sanger et
al., Proc. Natl. Acasd. Sci. USA 72: 3918-3921
(1979).
El ADN que codifica una variante de DNasa I
humana se inserta en un vector replicable para la posterior
clonación o expresión. Los "vectores" son plásmidos y otros
ADNs que son capaces de replicarse en una célula huésped, y como
tales, son útiles para realizar dos funciones conjuntamente con
células huésped compatibles (un sistema
vector-huésped). Una función es facilitar la
clonación del ácido nucleico que codifica una variante de DNasa I
humana, es decir, para producir cantidades utilizables del ácido
nucleico. La otra función es dirigir la expresión de una variante
de DNasa I humana. Una o ambas de estas funciones son realizadas por
el vector en la célula huésped concreta para la clonación o
expresión. Los vectores contendrán componentes diferentes
dependiendo de la función que realicen.
Para producir una variante de DNasa I humana, un
vector de expresión comprenderá ADN que codifica la variante, tal
como se ha descrito anteriormente, unido operativamente a un
promotor y un sitio de unión a ribosoma. A continuación, la
variante se expresa directamente en un cultivo celular recombinante,
o como fusión con un polipéptido heterólogo, preferiblemente una
secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división
específico en la unión entre el polipéptido heterólogo y la variante
de DNasa I humana.
Las células procariotas (por ejemplo, E.
coli y otras bacterias) son las células huésped preferidas para
las etapas de clonación iniciales de la presente invención. Son
particularmente útiles para la producción rápida de grandes
cantidades de ADN, para la producción de plantillas de ADN de cadena
única utilizadas para la mutagénesis dirigida de sitio, y para la
secuenciación de ADN de las variantes generadas. Las células huésped
procariotas también se pueden utilizar para la expresión de ADN que
codifica una variante de DNasa I humana. Los polipéptidos que se
producen en células procariotas estarán habitualmente no
glicosilados.
Además, las variantes de DNasa I humana de la
presente invención se pueden expresar en células huésped
eucariotas, incluyendo los microbios eucariotas (por ejemplo,
levadura) o células derivadas de un animal u otro organismo
multicelular (por ejemplo, células de ovario de hámster chino y
otras células de mamífero), o en animales vivos (por ejemplo,
vacas, cabras, ovejas).
Los procedimientos de clonación y expresión son
conocidos en la técnica. Ejemplos de células huésped procariotas y
eucariotas, y vectores de expresión, adecuados para su uso en la
producción de variantes de DNasa I humana de la presente invención
se describen, por ejemplo, en Shak, Publicación de Patente PCT No.
WO 90/07572 (publicada el 12 de julio de 1990).
Si la célula o células eucariotas que contienen
construcciones sustanciales de pared celular se utilizan como
huéspedes, los procedimientos preferidos de transfección de las
células con ADN es el procedimiento del tratamiento con calcio
descrito por Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69:
2110-2114 (1972) o el procedimiento del
polietilenglicol de Chung et al., Nuc. Acids. Res. 16: 3580
(1988). Si se utiliza levadura como huésped, la transfección se
realiza generalmente utilizando polietilenglicol, tal como se
describe por Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:
1929-1933 (1978). Si se utilizan células de mamífero
como células huésped, la transfección se lleva a cabo generalmente
mediante el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico,
Graham et al., Virology 52: 546 (1978), Gorman, et
al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:3-10 (1990).
Sin embargo, también son adecuados para utilizar en la presente
invención otros procedimientos conocidos para introducir ADN en
células procariotas y eucariotas, tales como inyección nuclear,
electroporación o fusión de protoplastos.
Particularmente útiles en la presente invención
son los vectores de expresión que proporcionan la expresión
transitoria en células de mamífero de ADN que codifica variantes de
DNasa I humana. En general, la expresión transitoria implica el uso
de un vector de expresión que es capaz de replicarse de manera
eficaz en una célula huésped, de manera que la célula huésped
acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza
niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector
de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden
un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la
conveniente identificación positiva de polipéptidos codificados por
ADNs clonados, así como para el rápido cribado de dichos
polipéptidos para las propiedades biológicas o fisiológicas
deseadas. Wong et al., Science 228: 810-815
(1985); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
4360-4364 (1985); Yang et al., Cell 47:
3-10 (1986). De este modo, los sistemas de
expresión transitoria se utilizan de manera conveniente para
expresar el ADN que codifica las variantes de secuencias de
aminoácidos de DNasa I humana nativa, conjuntamente con ensayos para
identificar las variantes que se unen a actina con una menor
afinidad que la DNasa I humana nativa, así como ensayos para medir
aquellas variantes con actividad hidrolítica de ADN.
La variante de DNasa I humana se secreta
preferiblemente de la célula huésped en la que se expresa, en cuyo
caso la variante se recupera del medio de cultivo en el crecen las
células huésped. En este caso, es deseable que las células crezcan
en un medio de cultivo sin suero, ya que la ausencia de proteína del
suero y otros componentes del suero en el medio pueden facilitar la
purificación de la variante. Si no se secreta, entonces la variante
de DNasa I humana se recupera de lisados de las células huésped.
Cuando la variante se expresa en una célula huésped diferente de la
de origen humano, la variante estará completamente libre de
proteínas de origen humano. En cualquier caso, será necesario
purificar la variante de las proteínas de células recombinantes con
el fin de obtener preparados sustancialmente homogéneos de la
variante de DNasa I humana. Para usos terapéuticos, la variante
purificada tendrá preferiblemente una pureza superior al 99% (es
decir, cualquier otra proteína comprenderá menos del 1% de la
proteína total en la composición purificada).
En general, la purificación de la variante de
DNasa I humana se lleva a cabo aprovechando las diferentes
propiedades físico-químicas de la variante en
comparación con los contaminantes con los que puede estar asociada.
Por ejemplo, como primera etapa, el medio de cultivo o el lisado de
la célula huésped se centrifuga para eliminar la debris celular
particulada. A continuación, la variante de DNasa I humana se
purifica de las proteínas y polipéptidos solubles contaminantes,
por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio o etanol,
filtración en gel (cromatografía de exclusión molecular),
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica,
cromatografía de inmunoafinidad (por ejemplo, utilizando una columna
que comprende anticuerpos de DNasa I anti-humano
acoplados a Sefarosa), cromatografía de intercambio catiónico
tentacular (Frenz et al., Publicación de Patente PCT No. WO
93/25670, publicada el 23 de diciembre de 1993), HPLC de fase
inversa y/o electroforesis en gel.
Naturalmente, un experto en la materia entenderá
que los procedimientos de purificación que se utilizan para la
DNasa I humana pueden requerir cierta modificación para ser útiles
en la purificación de una variante de DNasa I humana, para destacar
las diferencias estructurales y otras diferencias entre las
proteínas nativas y variantes. Por ejemplo, en algunas células
huésped (especialmente células huésped bacterianas), la variante de
DNasa I humana se puede expresar inicialmente en una forma agregada
insoluble (a la que se hace referencia en la técnica como
"cuerpos refráctiles" o "cuerpos de inclusión"), en cuyo
caso será necesario solubilizar y renaturalizar la variante de
DNasa I humana en el transcurso de su purificación. Los
procedimientos para la solubilización y renaturalización de cuerpos
refráctiles de proteínas recombinantes son conocidos en la técnica
(véase, por ejemplo, Builder et al., Patente de Estados
Unidos No. 4.511.502).
Las variantes de DNasa I humana se pueden
preparar realizando modificaciones covalentes directamente en una
proteína DNasa I humana nativa o una variante. Dichas modificaciones
se realizan para afectar la unión a actina u otra propiedad de la
proteína (por ejemplo, estabilidad, vida media biológica,
inmunogenicidad) y se pueden realizar en lugar de o adicionalmente
a mutaciones por sustitución, inserción y eliminación de la
secuencia de aminoácidos descritas anteriormente.
Las modificaciones covalentes se pueden
introducir mediante la reacción de residuos de aminoácidos diana de
la DNasa I humana nativa o variante con un agente derivatizante
orgánica que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales de
los aminoácidos seleccionados o los residuos N- o
C-terminales. Los agentes derivatizantes y
procedimientos adecuados son bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, se hacen reaccionar más
habitualmente residuos cisteinilo con
\alpha-haloacetatos (y las correspondientes
aminas), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para
producir derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos
cisteinilo también se derivan mediante la reacción con
bromotrifluoroacetona, ácido
\alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)propiónico,
fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas,
disulfuro de
3-nitro-2-piridilo,
disulfuro de metil 2-piridilo,
p-cloromercuribenzoato,
2-cloromercuri-4-nitrofenol,
o
cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Los residuos histidilo se derivan mediante la
reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 ya que
este agente es relativamente específico para la cadena lateral de
histidilo. EL bromuro de para-bromofenacilo también
es útil, la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato sódico
0,1 M a pH 6,0.
Los residuos lisinilo y amino terminales se
hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos
carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de
invertir la carga de los residuos lisinilo. Entre otros agentes
adecuados para la derivatización de residuos que contienen
\alpha-amino se incluyen imidoésteres tales como
picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal;
cloroborhidruro; ácido trinitrobencenosulfónico;
O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y
reacción con glioxilato catalizada por transaminasas.
Los residuos arginilo se modifican mediante la
reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos
fenilglioxal, 2,3-butanodiona,
1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización
de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en
condiciones alcalinas debido al pK_{a} elevado del grupo
funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con
los grupos de lisina, así como el grupo
epsilon-amino de arginina.
Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o
glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reacción con
carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), donde R
y R' son grupos alquilo diferentes, tales como
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)
carbodiimida o
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida.
Además, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten a los
residuos asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones
amonio.
El acoplamiento covalente de glicósidos a
residuos de aminoácidos de la proteína se puede utilizar para
modificar o aumentar el número o perfil de sustituyentes
carbohidrato, especialmente en o adyacentes a los residuos que
están implicados en la unión a actina. Dependiendo de la forma de
acoplamiento utilizado, el azúcar o azúcares se pueden unir a (a)
arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos
sulfhidrilo libres tales como grupos cisteína, (d) grupos hidroxilo
libres tales como grupos serina, treonina o hidroxiprolina, (e)
residuos aromáticos tales como residuos de fenilalanina, tirosina o
triptófano o (f) el grupo amida de glutamina. Se describen
procedimientos adecuados en, por ejemplo, la Publicación de Patente
PCT No. WO 87/05330 (publicada el 11 de septiembre de 1987), y en
Aplin. et al., CRC Crit. Rev. Biochem. Pág.
259-306 (1981).
La unión covalente de agentes tales como
polietilenglicol (PEG) o albúmina de suero humano a variantes de
DNasa I humana pueden reducir la inmunogenicidad y/o toxicidad de la
variante y/o prolongar su vida media, tal como se ha observado con
otras proteínas. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252:
3582-3586 (1977); Poznansky et al., FEBS
Letters 239: 18-22 (1988); Goodson, et al.,
Biotechnology 8: 343-346 (1990), Katre, J. Immunol.
144: 209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol
Chemistry (Plenum Press, 1992). Además, la modificación de DNasa I
humana nativa o una variante de la misma por estos agentes en o
adyacentes a (es decir, a menos de aproximadamente cinco residuos
aminoácidos de) un residuo de aminoácido que afecta a la unión de
actina puede dar lugar a una variante resistente a actina.
Una variante resistente a actina de la DNasa I
humana puede comprender una mutación en el residuo Asn que aparece
en la posición 74 de la secuencia de aminoácidos de la DNasa I
humana nativa (por ejemplo, mutaciones N74D, N74K, N74S) con el fin
de reducir o evitar la desamidación de la variante de DNasa I. Frenz
et al., Publicación de Patente PCT No. WO 93/25670,
publicada el 23 de diciembre de 1993. Como otro ejemplo, una
variante resistente a actina de la DNasa I humana puede comprender
una mutación en la secuencia de aminoácidos u otra modificación
covalente que reduzca la susceptibilidad de la variante a la
degradación por proteasas (por ejemplo, neutrófilo elastasa) que
pueden estar presentes en el esputo u otros materiales
biológicos.
La actividad hidrolítica de ADN y afinidad de
unión a actina de las variantes de DNasa I humana preparadas tal
como se ha descrito anteriormente se determinan fácilmente
utilizando ensayos y procedimientos conocidos en la técnica y tal
como se describen en la presente invención. Cualquier variante que
tenga actividad hidrolítica de ADN y afinidad de unión a actina
reducida (tal como se ha definido anteriormente) es una variante
resistente a actina que se encuentra dentro del alcance de la
presente invención.
Las variantes resistentes a actina de DNasa I
humana de la presente invención se utilizan para reducir la
viscoelasticidad de material que contiene ADN, tal como esputo,
mucosidad, u otras secreciones pulmonares. Dichas variantes son
particularmente útiles para el tratamiento de pacientes con
enfermedad pulmonar que presentan secreciones viscosas o espesas
anormales y condiciones tales como enfermedad pulmonar bronquial
aguda o crónica, incluyendo neumonía infecciosa, bronquitis o
traqueobronquitis, bronquiectasis, fibrosis quística, asma,
tuberculosis e infecciones fúngicas. Para dichas terapias, se
administra una solución o un preparado seco finamente dividido de
la variante resistente a actina de manera convencional en las vías
respiratorias (por ejemplo, bronquios) o pulmones de un paciente,
por ejemplo, mediante un aerosol.
Las variantes resistentes a actina también son
útiles para el tratamiento complementario de abscesos o infecciones
severas en espacios cerrados en condiciones tales como empiema,
meningitis, absceso, peritonitis, sinusitis, otitis, periodontitis,
pericarditis, pancreatitis, colelitiasis, endocarditis, y artritis
séptica, así como en tratamientos tópicos en una serie de lesiones
inflamatorias e infectadas, tales como lesiones infectadas de la
piel y/o membranas mucosas, heridas quirúrgicas, lesiones ulcerosas
y quemaduras. La variante resistente a actina puede mejorar la
eficacia de los antibióticos utilizados en el tratamiento de dichas
infecciones (por ejemplo, la actividad de gentamicina se reduce de
manera notable mediante la unión reversible a ADN intacto).
La DNasa I humana nativa y variantes resistentes
a actina de la misma también pueden ser útiles para lupus
eritematoso sistémico (SLE), una enfermedad autoinmune mortal
caracterizada por la producción de diversos autoanticuerpos. El ADN
es el componente antigénico principal de los complejos inmunes. En
este caso, la DNasa I humana (nativa o variante) se puede
administrar sistemáticamente, por ejemplo, mediante administración
intravenosa, subcutánea, intratecal o intramuscular al paciente
afectado.
La DNasa I humana nativa y variantes resistentes
a actina de la misma también pueden ser útiles para la prevención
del nuevo desarrollo y/o exacerbación de infecciones respiratorias,
tal como puede ocurrir en pacientes que padecen fibrosis quística,
bronquitis crónica, asma, neumonía u otra enfermedad pulmonar, o
pacientes cuya respiración está asistida por un respirador u otro
dispositivo mecánico, u otros pacientes con riesgo de desarrollar
infecciones respiratorias, por ejemplo, pacientes
post-quirúrgicos.
Las variantes resistentes a actina se pueden
formular según procedimientos conocidos para preparar
terapéuticamente composiciones útiles. Una composición terapéutica
preferida es una solución de una variante resistente a actina en
una solución acuosa tamponada o no tamponada y, preferiblemente, es
una solución salina isotónica tal como cloruro sódico 150 mM que
contiene cloruro cálcico 1,0 mm a pH 7. Estas soluciones son
particularmente adaptables para el uso en nebulizadores disponibles
comercialmente incluyendo nebulizadores de chorro y nebulizadores
ultrasónicos útiles para la administración directamente en las vías
respiratorias o pulmones de un paciente afectado.
En otra realización, la composición terapéutica
comprende un polvo seco de la variante resistente a actina,
preferiblemente preparado mediante el secado por pulverización de
una solución de la variante resistente a actina, esencialmente tal
como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos
pendiente de No. De Serie 08/206.020 (presentada el 4 de marzo de
1994).
En una realización adicional, la composición
terapéutica comprende células que producen de manera activa una
variante resistente a actina de DNasa I humana. Dichas células se
pueden introducir directamente en el tejido de un paciente, o se
pueden encapsular en membranas porosas que a continuación se
implantan en el paciente, en cualquier caso proporcionando la
liberación de la variante resistente a actina en áreas en el
interior del cuerpo del paciente con necesidad de aumentar las
concentraciones de actividad hidrolítica de ADN. Por ejemplo, las
propias células del paciente se podrían transformar, in vivo
o ex vivo, con ADN que codifica una variante resistente a
actina de la DNasa I humana y, a continuación, se utiliza para
producir la DNasa I directamente en el paciente.
La cantidad terapéuticamente eficaz de la
variante resistente a actina de DNasa I humana dependerá, por
ejemplo, de la cantidad de ADN y actina en el material a tratar, los
objetivos terapéuticos, la vía de administración, y la condición
del paciente. Por consiguiente, será necesario para el terapeuta
titular la dosificación y modificar la vía de administración según
sea necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo. En vista
de su menor afinidad de unión por actina y el consecuente aumento de
la actividad hidrolítica de ADN en presencia de actina en relación
con la DNasa I humana nativa, la cantidad de variante resistente a
actina requerida para conseguir un efecto terapéutico puede ser
menor que la cantidad de DNasa I humana nativa necesaria para
conseguir el mismo efecto bajo las mismas condiciones. En general,
la cantidad terapéuticamente eficaz de la variante resistente a
actina será una dosificación de desde aproximadamente 0,1 \mug
hasta aproximadamente 0,5 mg de la variante por kg de peso corporal
del paciente, administrada en composiciones farmacéuticas, tal como
se describe en la presente invención.
Una variante resistente a actina de DNasa I se
combina opcionalmente con o se administra conjuntamente con uno o
más agentes farmacológicos utilizados para tratar las condiciones
indicadas anteriormente, tales como antibióticos,
broncodilatadores, agentes antiinflamatorios, mucolíticos (por
ejemplo, n-acetil-cisteína),
proteínas de unión a actina o proteínas divisoras de actina (por
ejemplo, gelsolina; Matsudaira et al., Cell 54:
139-140 (1988); Stossel, et al., Publicación
de Patente PCT No. WO 94/22465 (publicada el 13 de octubre de
1994)), inhibidores de proteasa, o productos para terapia génica
(por ejemplo, que comprenden el gen del regulador de la
conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), Riordan,
et al., Science 245: 1066-1073 (1989)).
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo a modo
de ilustración y no pretenden limitar la presente invención de
ninguna manera. Todas las referencias de patentes y literatura
citadas en la presente invención se incorporan de manera
expresa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó la cepa CJ236 de E. coli
(BioRad Laboratories, Richmond California USA) con el
plásmido
pRK.Dnasa.3 utilizando el procedimiento de Chung et al. (Nuc. Acids. Res. 16: 3580 (1988). El plásmido pRK.Dnasa.3 utilizado en la realización de la presente invención es tal como se describe en la Publicación de Patente PCT No. WO 90/07572 (publicada el 12 de julio de 1990)), a excepción de que la secuencia de nucleótidos que codifica que codifica la DNasa I humana es tal como se muestra en la figura 1. Las células transformadas se pusieron en placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina y se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC. Se inoculó caldo 2YT (5 ml) que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y 10 \mul de fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, La Jolla, California, Estados Unidos) con una colonia individual de la placa de agar y se dejó crecer durante toda la noche a 37ºC con agitación. Se aisló el ADN de cadena única de este cultivo y se utilizó como plantilla para la mutagénesis posterior.
pRK.Dnasa.3 utilizando el procedimiento de Chung et al. (Nuc. Acids. Res. 16: 3580 (1988). El plásmido pRK.Dnasa.3 utilizado en la realización de la presente invención es tal como se describe en la Publicación de Patente PCT No. WO 90/07572 (publicada el 12 de julio de 1990)), a excepción de que la secuencia de nucleótidos que codifica que codifica la DNasa I humana es tal como se muestra en la figura 1. Las células transformadas se pusieron en placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina y se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC. Se inoculó caldo 2YT (5 ml) que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y 10 \mul de fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, La Jolla, California, Estados Unidos) con una colonia individual de la placa de agar y se dejó crecer durante toda la noche a 37ºC con agitación. Se aisló el ADN de cadena única de este cultivo y se utilizó como plantilla para la mutagénesis posterior.
Se realizó la mutagénesis dirigida de sitio
utilizando oligonucleótidos sintéticos según el procedimiento de
Kunkel et al., (Meth. Enzymol. 154: 367-382
(1987)). Los oligonucleótidos mutagénicos tenían 21 ó 24 unidades
monoméricas, con 9 ó 12 emparejamientos de bases exactas en 5' con
respecto al codón no emparejado y 9 emparejamientos de bases
exactas en 3' con respecto al codón no emparejado. Después de la
mutagénesis, se sometió el ADN de cadena única de clones
individuales a la secuenciación didesoxi (Sanger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)). A
continuación, el ADN que tenía secuencias de nucleótidos variantes
se transformó tal como se ha descrito anteriormente en la cepa XL I
Blue MRF' de E. coli (Stratagene). Después de colocar en
placas y aislar la colonia individual al igual que antes, las
colonias individuales se utilizaron para inocular 0,5 litros de
caldo LB que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina. Después del
crecimiento durante toda la noche con agitación a 37ºC, las células
se recogieron por centrifugación y el ADN variante (en el vector de
expresión) se purificó utilizando columnas Qiagen
tip-500 (Qiagen Inc., Chatsworth, California,
Estados Unidos).
Las figuras 2-6 identifican las
diferentes variantes de DNasa I humana que se produjeron. En las
figuras y a lo largo de la memoria, la descripción de la mutación o
mutaciones de sustitución de aminoácidos presentes en una variante
de DNasa I se abrevia mediante una primera letra alfabética, un
número y una segunda letra alfabética. La primera letra alfabética
es la abreviatura de una letra del residuo de aminoácido en la DNasa
I madura humana nativa (natural), el número indica la posición de
ese residuo en la DNasa I madura humana nativa (numeración tal como
se muestra en la figura 1), y la segunda letra alfabética es la
abreviatura de una letra del residuo de aminoácido en esa posición
en la DNasa I variante. Por ejemplo, en la variante de DNasa I que
tiene un mutación D53R, el residuo ácido aspártico (D) en la
posición 53 en la DNasa I madura humana nativa ha sido sustituido
por un residuo arginina (R). Las mutaciones múltiples en una única
variante se designan de forma similar, con dos puntos (:) separando
cada una de las diferentes mutaciones que están presentes en la
variante. Por ejemplo, la designación 53R:Y65A indica que la
variante tiene una mutación D53R y una mutación Y65A.
\vskip1.000000\baselineskip
Se dejaron crecer células 293 de riñón
embrionario humano (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, Estados Unidos) en medio que contenía suero en
placas de Petri de plástico de 150 mm. Las células en fase log se
cotransfectaron de forma transitoria con 22,5 \mug de ADN variante
purificado (preparado tal como se ha descrito anteriormente) y 17
\mug de ADN de adenovirus utilizando el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico (gorman et al., DNA and
Protein Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)). Aproximadamente
16 horas después de la transfección, las células se lavaron con 15
ml de solución salina tamponada con fosfato y el medio se cambió
por medio sin suero. Se hicieron dos recogidas del medio de cultivo
celular de cada placa, la primera a las 24 ó 72 horas y la última a
96 horas después del cambio por medio sin suero. De esta manera se
obtuvo un total de aproximadamente 50 ml del sobrenadante del
cultivo celular que contenía la variante de DNasa I. El total de
sobrenadante de cultivo recogido de cada placa se concentró de 5 a
50 veces utilizando concentradores Centriprep 10, y se analizaron
los concentrados para determinar las diversas actividades
bioquímicas y biológicas de las variantes de DNasa I.
El concentrado que contenía DNasa I humana
nativa se preparó mediante el mismo procedimiento que se ha
descrito anteriormente, a excepción de que las células 293 se
transfectaron de manera transitoria con el plásmido
pRK.Dnasa.3.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad específica relativa de variantes de
DNasa I se evaluó mediante la comparación de la actividad de la
variante con la de la DNasa I humana nativa en dos ensayos
diferentes. En particular, la actividad específica relativa de las
variantes se define como la concentración de la variante (en
\mug/ml) determinada en un ensayo de actividad con verde de
metilo (Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222:
351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29:
41-53 (1950)) dividida por la concentración de la
variante (en \mug/ml) determinada en un ensayo ELISA de DNasa I
(descrito a continuación). En tanto el ensayo de actividad con verde
de metilo como el ensayo ELISA de DNasa I, se determinaron las
curvas estándar utilizando DNasa I humana de Pulmozyme®. La
actividad específica relativa de la DNasa I humana nativa y las
variantes se muestran en las figuras 2A-D.
El ensayo de actividad con verde de metilo
(Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222:
351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29.
41-53 (1950)) utiliza el colorante verde de metilo
que se intercala aproximadamente cada 10 bases en el ADN, dando
lugar a un sustrato verde. Dado que el ADN es dividido por la DNasa
I, el colorante verde de metilo se libera y se oxida a una forma
incolora. De este modo, la pérdida del color verde es proporcional
a la cantidad de DNasa I añadida a la muestra de ensayo. A
continuación, se cuantifica la cantidad de DNasa I presente en este
ensayo mediante la comparación con una curva estándar que se prepara
mediante el ensayo de cantidades conocidas de
DNasa I.
DNasa I.
El ensayo ELISA de DNasa I implica el
recubrimiento de placas de microtítulos con un anticuerpo policlonal
anti-DNasa I de cabra, la adición de la muestra a
analizar, y la detección de cualquier DNasa I resultante unida con
un anticuerpo policlonal anti-DNasa I de conejo que
está conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP). Cuando se
añaden el sustrato de HRP y el reactivo para el desarrollo del
color, el color desarrollado es proporcional a la cantidad de DNasa
I presente en la muestra. A continuación, se cuantifica la cantidad
de DNasa I presente en el ensayo mediante la comparación con una
curva estándar que se prepara mediante el ensayo de cantidades
conocidas de DNasa I.
En ambos ensayos, se analizaron múltiples
diluciones de las muestras y los valores que se encontraban en la
mitad del rango de la curva estándar se promediaron y se calcularon
las desviaciones estándar.
Además, la concentración de DNasa I determinada
mediante el ensayo ELISA de DNasa I se utilizó para estandarizar
las concentraciones de DNasa I en otros ensayos en los que se
caracterizaron las variantes de DNasa I (por ejemplo, en ensayos de
inhibición por actina, descrito a continuación).
Se preparó G-actina (Kabsch
et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:
49-76 (1992)) mediante la dialización durante toda
la noche de una solución de 1 mg/ml de actina (obtenida
comercialmente (Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos) o
preparada mediante el procedimiento de Pardee, et al., Meth.
Enzymol. 85: 164-181 (1982)) frente a HEPES 5 mM,
pH 7,2, CaCl_{2} 0,2 mM, ATP 0,5 mM,
\beta-mercaptoetanol 0,5 mM a 4ºC. Después de
centrifugación a 13.000 x g durante 5 minutos, se cuantificó la
cantidad de G-actina midiendo la absorbancia a 290
nm; una solución de 1 mg/ml tiene una absorbancia de 0,66 DO. La
cantidad de preparado de G-actina necesaria para
inhibir sustancialmente (> 50% de inhibición), pero no
totalmente, la actividad hidrolítica de ADN de DNasa I humana
nativa se determinó en experimentos preliminares bajo las mismas
condiciones utilizadas para cada ensayo.
La sensibilidad a la inhibición por actina se
evaluó midiendo la actividad hidrolítica de ADN de las variantes en
presencia y ausencia de actina en cualquiera de dos ensayos
diferentes, el ensayo con verde de metilo descrito previamente y un
ensayo de hipercromicidad que se basa en el aumento de la
absorbancia a 260 nm tras la desnaturalización y despolimerización
del ADN (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 349-362
(1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 363-377
(1950)). El porcentaje de inhibición de variantes seleccionadas en
estos ensayos se muestran en las figuras 3 y 4.
En el ensayo de hipercromicidad, se incubaron
los sobrenadantes de cultivo concentrados (preparados tal como se
ha descrito anteriormente, que contienen las variantes de DNasa I)
sin actina o con de 2 a 3 veces un exceso molar de actina en tampón
A (HEPES 25 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 4 mM, MgCl_{2} 4 mM, BSA al
0,1%) durante una hora a temperatura ambiente antes de añadirse a
una cubeta que contenía 40 \mug de ADN en un volumen total de
ensayo de 1,0 ml. La concentración final de la variante de DNasa I
en el ensayo fue aproximadamente de 26 mM, determinada mediante el
ensayo ELISA de DNasa I. Se midió la velocidad de hidrólisis de ADN
por las variantes de DNasa I en presencia y ausencia de actina. El
porcentaje de la actividad mostrado en las figuras 3 y 4 se calculó
determinando la proporción de la actividad hidrolítica de ADN de la
DNasa I humana (nativa o variante) en presencia de actina con
respecto a su actividad hidrolítica de ADN en ausencia de actina y
multiplicado por 100.
En el ensayo con verde de metilo, se incubaron
los sobrenadantes de cultivo concentrados (preparados tal como se
ha descrito anteriormente, que contienen las variantes de DNasa I)
sin actina o con 1000 veces un exceso molar de actina en tampón B
(HEPES 25 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 4 mM, MgCl_{2} 4 mM, BSA al 0,1%,
timerosal al 0,01% y Tween 20 al 0,05%) durante 16 horas a 37ºC. La
concentración de enzima activa en cada caso se estimó mediante la
comparación con la curva estándar de Pulmozyme®. El "porcentaje de
la actividad" permanente de la variante se refiere a 100 veces
la proporción de la actividad en presencia de actina con respecto a
la actividad en ausencia de actina.
Tal como se muestra en las figuras 3 y 4, la
actividad hidrolítica de ADN de DNasa I humana nativa se reduce
sustancialmente en presencia de actina. Mediante comparación,
diversas variantes de residuos individuales y múltiples de DNasa
humana nativa son relativamente resistentes a la inhibición por
actina, tal como se indica por su mayor actividad hidrolítica de
ADN en presencia de actina que la DNasa I humana nativa.
Se desarrolló un ensayo basado en microtítulos
para medir la unión de DNasa I humana nativa y variantes de DNasa I
a actina inmovilizada. En primer lugar, se recubrieron pocillos de
una placa Maxisorp (Nunc, Inc., Naperville, Illinois, Estados
Unidos) con 100 \mul por pocillo de globulina GC humana
(Calbiochem, La Jolla, California, Estados Unidos), una proteína de
unión a actina (Goldschmidt-Clermont, et al.,
Biochem. J. 228: 471-477 (1985), McLeod, et
al., J. Biol. Chem. 264: 1260-1267 (1989),
Houmeida et al., Eur. J. Biochem. 203:
499-503 (1992)), a una concentración de 10 \mug/ml
en HEPES 25 mM, MgCl_{2} 4 mM, CaCl_{2} 4 mM, pH 7,2, durante
16-24 horas a 4ºC. Después de separar la globulina
GC, se bloquearon los sitios con exceso de reactivo mediante la
adición de 200 \mul por pocillo de tampón C (tampón C es el mismo
que tampón B anterior, con la adición de adenosin trifosfato 0,5
mM; el tampón C se utilizó como diluyente de ensayo en todas las
etapas posteriores a menos que se indique lo contrario) y se
incubaron las placas en un agitador durante 1-2
horas a temperatura ambiente. Cada etapa de incubación posterior se
llevó a cabo a temperatura ambiente durante una hora en un agitador
Mini Orbital (Bellco Biotechnology, Vineland, New Jersey, Estados
Unidos); entre cada una de las etapas, la placa se vació y se lavó
6 veces con solución salina tamponada con fosfato que contenía
Tween 20 al 0,05% con una composición de lavado de placas Microwash
II (Skatron A/S, Noruega). A continuación, se diluyó
G-actina, preparada tal como se ha descrito
anteriormente, hasta 50 \mug/ml en tampón C y se añadieron 100
\mul a cada pocillo; las placas se incubaron y se lavaron, y se
añadieron 100 \mul de diversas diluciones de Pulmozyme® y medio
de cultivo celular que contenía DNasa I humana nativa o variantes de
la misma a los pocillos y las placas incubadas y lavadas.
Finalmente, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de una dilución
1/25.000 de anticuerpo policlonal de conejo
anti-DNasa I humana conjugado peroxidasa de rábano
picante (concentración madre original fue de 465 \mug/ml).
Después de la incubación y el lavado, se inició el desarrollo del
color mediante la adición de 100 \mul por pocillo de reactivo
para el desarrollo del color (comprimidos de
o-fenilendiamina y urea/H_{2}O_{2} de Sigma
Fast solubilizados según la recomendación del fabricante) y se
detuvo mediante la adición de 100 \mul por pocillo de
H_{2}SO_{4} 4,5 N. Se registró la absorbancia a 492 nm y se
representó frente a la concentración de DNasa I añadida
originalmente al pocillo. Se obtuvieron curvas sigmoidales para la
DNasa I humana nativa y las variantes que se unieron a actina; estas
curvas se ajustaron a una ecuación de cuatro parámetros mediante un
análisis por regresión no lineal (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl.
Math. 11: 341-441 (1963); se calculó a partir de
las curvas la concentración de cada DNasa I (nativa o variante)
requerida para producir una señal que es la mitad del máximo en el
ensayo y a la misma se hace referencia como el valor
EC_{50}. La masa molecular de la DNasa I humana nativa y las variantes se asumió que era de 37.000 daltons.
EC_{50}. La masa molecular de la DNasa I humana nativa y las variantes se asumió que era de 37.000 daltons.
La afinidad de unión relativa de cada variante
de DNasa I humana se calculó dividiendo el valor de EC_{50} de la
variante entre el valor de EC_{50} de la DNasa I humana nativa
determinados en el ensayo ELISA, y los resultados se muestran en
las figuras 5A-D. A modo de ejemplo, si la afinidad
de unión relativa de la variante de Dnasa I humana se calculó que
era 5, este valor indicaría que el valor de EC_{50} de la
variante es 5 veces mayor que el valor de Ec_{50} de DNasa humana
nativa, o en otras palabras, que la variante tiene una afinidad por
actina que es 5 veces menor que la afinidad de la DNasa I humana
nativa por actina en este ensayo ELISA.
Se utilizó un ensayo de compactación de esputo
(Publicación de Patente PCT No. WO 94/10567, publicada el 11 de
mayo de 1994) para medir la viscoelasticidad relativa del esputo de
pacientes con fibrosis quística ("esputo de CF") antes y
después de la incubación con DNasa I humana nativa y diferentes
variantes de DNasa I. Después de mezclar el esputo de CF con una
muestra de DNasa I e incubarlo durante 20 minutos a temperatura
ambiente, las soluciones semisólidas se cargaron en tubos capilares
que, a continuación, se centrifugaron a 12.000 rpm durante 20
minutos. Después de la centrifugación, la altura del sedimento se
midió y se comparó con la altura de la solución más sedimento. A
continuación, se utilizaron las mediciones para calcular el
porcentaje de compactación del esputo que se correlaciona con la
viscoelasticidad del esputo.
El porcentaje de compactación determinado tras
el tratamiento de esputo de CF con DNasa I humana nativa y
variantes resistentes a actina de DNasa I humana se muestra en la
figura 6. Estos resultados indican que las variantes de DNasa I
humana nativa son más eficaces que la DNasa I humana nativa en la
reducción de la viscoelasticidad del esputo de CF, determinada
mediante el ensayo de compactación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
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\bulletSHORT et al. Nuc.
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[0037]
\bulletNARANG et al. Meth.
Enzymol., 1979, vol. 68, 90-98 [0039]
\bulletBROWN et al. Meth.
Enzymol., 1979, vol. 68, 109-151
[0039]
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2110-2114 [0052]
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\bulletHARRIS. Polyethylene Glycol
Chemistry. Plenum Press, 1992 [0065]
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Cell, 1988, vol. 54, 139-140
[0076]
\bulletRIORDAN et al.
Science, 1989, vol. 245, 1066-1073
[0076]
\bulletSANGER et al. Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 1977, vol. 74,
5463-5467 [0079]
\bulletKURNICK. Arch. Biochem.,
1950, vol. 29, 41-53 [0083] [0084]
\bulletPARDEE et al. Meth.
Enzymol., 1982, vol. 85, 164-181
[0088]
\bulletGOLDSCHMIDT-CLERMONT et al.
Biochem. J., 1985, vol. 228, 471-477
[0093]
\bulletMCLEOD et al. J.
Biol. Chem., 1989, vol. 264, 1260-1267
[0093]
\bulletHOUMEIDA et al. Eur.
J. Biochem., 1992, vol. 203, 499-503
[0093]
\bulletMARQUARDT. J. Soc. Indust.
Appl. Math., 1963, vol. 11, 431-441
[0093]
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genentech, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VARIANTES DE DNASA I HUMANA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 98
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 460 Point San Bruno Blvd
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: South San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 94080
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulgadas, 1, 44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WinPatin (Genetech)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLUCITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/02366
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 02/24/95
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/ REPRESENTANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Johnston, Sean A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35.910
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFRENCIA/EXPEDIENTE: P0925P1PCT1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415/225-3562
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415/952-9881
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 910/371-7168
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 6:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 8:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 18:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 25:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 30:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 38:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 39:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 40:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 42:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 43:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 44:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 50:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 51:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 52:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 53:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 55:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 60:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 63:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 65:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 67:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 69:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 70:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 73:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 74:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 75:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 76:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 79:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 81:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 82:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 84:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 86:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 88:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 89:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 90:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 97:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No. 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 260 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 98:
Claims (22)
1. Variante resistente a actina de DNasa I
humana que tiene actividad hidrolítica y por lo menos un 90% de
identidad con la secuencia de aminoácidos de la figura 1, en la que
dicha variante comprende una sustitución de aminoácidos de uno o
más de los siguientes residuos: Ser68, Pro70, Ser94 y Tyr96.
2. Variante resistente a actina de DNasa I
humana que tiene actividad hidrolítica y por lo menos un 90% de
identidad con la secuencia de aminoácidos de la figura 1, en la que
dicha variante comprende por lo menos una sustitución de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: L45C, L45K,
L45R, V48K, V48R, G49I, G49R, G49Y, G49K, L52K, L52M, L52N, L52R,
D53L, D53M, N56R, N56C, Y65K, Y65M, Y65S, Y65P, V66N, V67D, V67H,
V67M, V67P, V67R, S68K, S68R, S68M, E69A, A114E, A114H, A114K,
A114L, A114M, A114Q, A114R, A114W, A114Y, S68N:P70T, S94N:Y96T,
V67N:E69T, S68N:P70S, S94N:Y96S, V65N:V67T, D53C, E69K, G49C, H44C,
H44E, H44N, L52C, V48C, V67A, V67C, D53R:H44A, H64N:V66T.
3. Variante según la reivindicación 2, que
comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos seleccionada
del grupo que consiste en: V48K, G49I, G49R, D53M, N56R, V66N, y
A114H.
4. Variante según la reivindicación 2, que
comprende por lo menos un grupo de sustituciones de aminoácidos
seleccionadas del grupo que consiste en: S68N:P70T y S94N:Y96T.
5. Variante según la reivindicación 2, que
comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos seleccionada
del grupo que consiste en: L45K, L45R, V48K, V48R, G49R, G49Y, G49I,
G49K, L52K, L52M, L52N, L52R, D53L, D53M, N56C, N56R, Y65K, Y65M,
Y65P, Y65S, V66N, V67D, V67H, V67M, V67P, V67R, S68K, S68M, S68R,
A114E, A114H, A114K, A114L, A114M, A114Q, A114R, A114W, A114Y,
S68N:P70T, S94N:Y96T, V67N:E69T, Y65N:V67T, S68N:P70S y
S94N:Y96S.
6. Variante según la reivindicación 2, que
comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos o un grupo de
sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste
en: S68R, S68M, S68K, S68N:P70S y S94N:
Y96S.
Y96S.
7. Variante según la reivindicación 2, que
comprende por lo menos una sustitución de aminoácidos seleccionada
del grupo que consiste en S68R, S68M y S68K.
8. Variante según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que tiene una afinidad de unión por actina que es
por lo menos cinco veces inferior a la de la DNasa I humana
nativa.
9. Variante según la reivindicación 8, que
tiene una afinidad de unión por actina que es por lo menos 100
veces inferior a la de la DNasa I humana nativa.
10. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene por lo menos un 95% de identidad con la secuencia de
aminoácidos de la DNasa I humana nativa mostrada en la figura
1.
11. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 9, en la que la variante difiere en
sólo una sustitución de aminoácido de la DNasa humana nativa
mostrada en la figura 1.
12. Variante según la reivindicación 11, en la
que la sustitución de aminoácido crea un sitio de glicosilación en
la variante que no está presente en la DNasa I humana nativa.
13. Ácido nucleico aislado que codifica una
variante de DNasa I humana según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
14. Variante de DNasa I humana según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un método
de tratamiento terapéutico de un paciente que padece una enfermedad
o trastorno pulmonar.
15. Variante según la reivindicación 14, en la
que la enfermedad o trastorno es la fibrosis quística.
16. Variante según la reivindicación 14, en la
que la enfermedad o trastorno es la bronquitis crónica.
17. Uso de una variante de DNasa I humana
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece una
enfermedad o trastorno pulmonar.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que
la enfermedad o trastorno es la fibrosis quística.
19. Uso según la reivindicación 17, en el que
la enfermedad o trastorno es la bronquitis crónica.
\newpage
20. Composición farmacéutica que comprende una
variante de DNasa I humana según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
21. Composición según la reivindicación 20 en
la que la composición está en forma líquida.
22. Composición según la reivindicación 20 en
la que la composición está en forma de polvo.
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