ES2299582T3 - Vectores de expresion que codifican peptidos señal de bacteriofagos. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir una cadena de anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos de ésta, que comprende cultivar células anfitrionas de E. coli que contienen un casete de expresión en condiciones que resultan en la expresión de la cadena de anticuerpo, o del fragmento de ésta, a partir del casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende un primer ácido nucleico que codifica el péptido señal de la proteína principal de la cubierta del bacteriófago M13, unido de manera operativa a y en marco con un segundo ácido nucleico que codifica la cadena de anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos de ésta.
Description
Vectores de expresión que codifican péptidos
señal de bacteriófagos.
La presente invención se refiere a secuencias de
nucleótidos que codifican péptidos señal de bacteriófagos, a
vectores de expresión que contienen dichas secuencias y a su
utilización para la expresión y la secreción heteróloga de
polipéptidos, en particular anticuerpos, en sistemas
bacterianos.
A lo largo de esta solicitud se hace referencia
a varias publicaciones por autor y año. Las citas completas de
estas publicaciones se proporcionan después de la descripción
detallada de la invención y los Ejemplos.
La producción de proteínas recombinantes se ha
visto facilitada en gran medida por la construcción de sistemas de
expresión que son capaces de exportar la proteína de interés de la
célula en la que se expresa. Con el fin de conseguir la secreción
del producto recombinante de la célula anfitriona, estos sistemas de
expresión utilizan extensiones peptídicas amino terminales, o
péptidos señal, que se encuentran en la mayoría de las proteínas
eucariotas y procariotas cuyo destino es la exportación desde el
citoplasma. La caracterización de varios péptidos señal de diversas
fuentes ha revelado que aunque existe una pequeña homología de
secuencia entre ellos, comparten determinadas características
funcionales. Estas características comunes son una región amino
terminal cargada positivamente, un núcleo central hidrofóbico y una
región carboxi terminal más polar que normalmente termina con un
sitio de escisión para peptidasas señal.
Es bastante habitual que los péptidos señal
utilizados en dichos sistemas de expresión sean nativos respecto al
anfitrión de expresión, por ejemplo, los péptidos señal PhoA, MalB y
OmpA de Escherichia coli se han utilizado ampliamente para
secretar polipéptidos al periplasma de este organismo. Sin embargo,
algunos péptidos señal son capaces de funcionar incluso entre
especies, por ejemplo, la secreción de la hormona de crecimiento
humana al periplasma de E. coli fue más eficaz cuando se
utilizó el péptido señal nativo (Gray et al., 1985) y la
\alpha-amilasa de arroz se ha secretado
eficazmente de Saccharomyces cerevisiae utilizando su
secuencia señal nativa (Kumagai et al., 1990).
Desgraciadamente, no se puede predecir la
eficacia de péptidos señal individuales en sistemas diferentes. El
proceso es frecuentemente ineficaz, siendo habitual los rendimientos
bajos. Además, pueden aparecer problemas con el procesamiento
erróneo del péptido señal, que puede eliminarse de manera
inapropiada o escindirse de manera incompleta. Así, existe una
necesidad de péptidos señal, que puedan dirigir la secreción de
forma consistente de una manera eficaz y universal, es decir,
conseguir rendimientos altos y/o una escisión precisa.
Hemos encontrado, inesperadamente, que podemos
obtener niveles altos de polipéptidos solubles, en particular
anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de estos, a partir de
células procariotas cuando utilizamos una secuencia señal de
bacteriófago (por ejemplo, la de la proteína principal de la
cubierta del bacteriófago M13) para mediar el proceso de
secreción.
Así, según el primer aspecto de la invención,
proporcionamos un método para producir una cadena de anticuerpo, o
un fragmento de unión a antígenos de ésta, que comprende cultivar
células anfitrionas que contienen un casete de expresión, en
condiciones que resultan en la expresión de la cadena de anticuerpo,
o de un fragmento de unión a antígenos de ésta, a partir del casete
de expresión, en el que el casete de expresión comprende un primer
ácido nucleico que codifica un péptido señal de bacteriófago, o una
variante de éste, unido de manera operativa a y en marco con un
segundo ácido nucleico que codifica la cadena de anticuerpo o un
fragmento de unión a antígenos de ésta.
Los anticuerpos se construyen a partir de dos
cadenas polipeptídicas ligeras y dos pesadas, que se unen entre sí
a través de enlaces disulfuro. Así, el término "cadena de
anticuerpo" tal y como se utiliza en la presente memoria se
refiere bien a una cadena polipeptídica ligera de anticuerpo o a una
cadena polipeptídica pesada de anticuerpo.
El término "fragmento de unión a antígenos"
aplicado a una cadena de anticuerpo, se define en la presente
memoria como cualquier fragmento o dominio de una cadena de
anticuerpo que es capaz de unirse a un antígeno independientemente
y selectivamente. Los ejemplos de dichos fragmentos de unión a
antígenos, que pueden expresarse y secretarse según el método de la
invención, incluyen, por ejemplo, fragmentos V_{H} y V_{L} y
anticuerpos de cadena única tales como, por ejemplo, un scFv.
Según otro aspecto, el método de la invención
puede utilizarse para producir un anticuerpo completo que comprende
cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o fragmentos de
éstas incluyendo, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2}, y Fv. Esto puede conseguirse produciendo las
cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo o fragmentos apropiados de
éstas, según el método de la invención, en diferentes células
anfitrionas, y permitiendo posteriormente la unión de las cadenas o
fragmentos de éstas apropiados para formar un anticuerpo completo o
un fragmento de anticuerpo después de que las cadenas se hayan
expresado.
Alternativamente, puede producirse un anticuerpo
completo, o un fragmento de éste, introduciendo al menos dos
casetes de expresión en la misma célula anfitriona. Cada casete de
expresión comprenderá un primer ácido nucleico que codifica un
péptido señal de bacteriófago (o una variante de éste). Éste se
unirá de manera operativa a y en marco con un segundo ácido
nucleico, que codificará una cadena pesada de anticuerpo o un
fragmento apropiado de la cadena pesada en un casete de expresión y
una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento apropiado de la
cadena ligera en otro casete de expresión. Así, las cadenas pesadas
y ligeras, o los fragmentos de éstas, pueden coexpresarse en la
misma célula y la secreción puede estar mediada por un péptido señal
de bacteriófago. Dichos casetes de expresión pueden introducirse en
células anfitrionas como entidades distintas que están incorporadas
en una única molécula de ácido nucleico o, alternativamente, pueden
introducirse en moléculas de ácido nucleico distintas.
Los anticuerpos completos, que pueden producirse
como se ha descrito anteriormente, incluyen anticuerpos multiméricos
monoespecíficos, así como anticuerpos
bi-específicos o
multi-específicos.
Un anticuerpo o un fragmento de unión a
antígenos de éste, expresado y secretado según cualquier aspecto de
la invención, puede ser policlonal o, especialmente, monoclonal.
Puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina y puede ser,
por ejemplo, un anticuerpo IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o
IgG4), IgE, IgM o IgA. Puede ser de origen animal, por ejemplo
mamífero, por ejemplo, puede ser un anticuerpo murino, de rata o
humano o un fragmento de unión a antígenos derivado de estos.
Alternativamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos
puede ser quimérico, es decir, contiene partes derivadas de
diferentes especies animales. Los ejemplos particulares están bien
documentados en la bibliografía e incluyen anticuerpos y fragmentos
de unión a antígenos injertados con CDR.
En la invención puede utilizarse cualquier
péptido señal de origen bacteriófago, sin embargo, se prefiere que
el primer ácido nucleico codifique el péptido señal de la proteína
principal de la cubierta del bacteriófago M13 o una variante de
éste. El término "variante" tal y como se utiliza en la
presente memoria, se refiere a péptidos señal que tienen
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la descrita
más adelante para el péptido señal de la proteína principal de la
cubierta de M13 y que son capaces de funcionar al menos tan
eficientemente como el péptido señal nativo de M13. Esto engloba a
los derivados del péptido señal de la proteína principal de la
cubierta de M13 que pueden estar modificados para alterar o
incrementar características particulares tales como, por ejemplo,
el sitio de reconocimiento de la peptidasa señal. Un péptido señal
que tiene "sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos"
es uno que comparte más del 70% de identidad con la secuencia de
aminoácidos del péptido señal de la proteína principal de cubierta
de M13. Las variantes preferidas compartirán más del 75% de
identidad, más preferiblemente más del 80% de identidad y lo más
preferiblemente más del 90% de identidad con el péptido señal de la
proteína principal de la cubierta de M13.
Con el fin de evaluar la eficacia de las
variantes de los péptidos señal de la proteína principal de la
cubierta de M13, pueden utilizarse para dirigir la secreción de un
polipéptido estándar, por ejemplo, \beta-lactamasa
o fosfatasa alcalina. Puede evaluarse cualquiera de los parámetros
siguientes -rendimiento, proporción de acumulación, precisión de la
escisión- y compararse con los conseguidos con el péptido señal
nativo de la proteína principal de la cubierta de M13 cuando se
utiliza para dirigir la secreción del mismo polipéptido modelo.
Esto proporciona la base de un cribado adecuado para péptidos señal
que son capaces de funcionar al menos tan eficientemente, sino
mejor, que el péptido señal nativo de la proteína principal de la
cubierta de M13. Los métodos para estimar el rendimiento y/o la
proporción de acumulación serán obvios para el experto en la
técnica y pueden estar basados en la determinación directa del
producto polipeptídico o, alternativamente, pueden estar basados en
cualquier actividad enzimática intrínseca del polipéptido. Los
ejemplos específicos de dicha metodología se describen en la
presente memoria con más detalle en la descripción detallada de las
realizaciones preferidas.
El péptido señal nativo de la proteína principal
de la cubierta del bacteriófago M13 tiene una longitud de 23
aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos
"MKKSLVLKASVAVATLVPMLSFA". Debido a la degeneración del código
genético, una cualquiera de diferentes secuencias de nucleótidos
puede codificar un péptido señal con esa secuencia. Cualquiera de
estos ácidos nucleicos, incluyendo la secuencia nativa del
bacteriófago M13, puede utilizarse en la invención. De hecho, hemos
mostrado, mediante la alteración de la secuencia de nucleótidos
pero no de la secuencia de aminoácidos del péptido señal de la
proteína principal de la cubierta del bacteriófago M13, que puede
optimizarse la expresión y la secreción de proteínas solubles en
E. coli. Los ejemplos de dichas proteínas solubles incluyen
enzimas (tales como fosfatasa alcalina); hormonas o toxinas
proteicas; proteínas de transporte, estructurales o contráctiles
solubles y, en particular, anticuerpos.
Así, los ácidos nucleicos que codifican el
péptido señal de la proteína principal de la cubierta de M13, que
se diferencian en la secuencia de nucleótidos de la secuencia de
ácido nucleico de tipo salvaje del bacteriófago M13 pero que no se
diferencian en la secuencia de aminoácidos que codifican, forman un
aspecto más de la invención y también pueden utilizarse en los
métodos de la invención como se describe en la presente memoria. El
péptido señal de la proteína principal de la cubierta de M13,
codificado por un ácido nucleico según este aspecto de la
invención, puede utilizarse, si se desea, para dirigir la secreción
de una proteína soluble de longitud completa o un fragmento o
dominio de ésta.
Los ácidos nucleicos según este aspecto de la
invención pueden diferenciarse de la secuencia de nucleótidos de
tipo salvaje que codifica el péptido señal de la proteína principal
de la cubierta de M13 en cualquier número de posiciones de
nucleótidos siempre que no se altere la secuencia de aminoácidos que
codifica. Así, un ácido nucleico según este aspecto de la invención
puede diferenciarse respecto a la secuencia sólo en una única
posición o, alternativamente, puede diferenciarse respecto a la
secuencia (del tipo salvaje) en hasta un máximo de aproximadamente
31 posiciones. Preferiblemente, dichos ácidos nucleicos se
diferenciarán respecto a la secuencia de nucleótidos del tipo
salvaje en entre aproximadamente 18 a 25 posiciones. Más
preferiblemente, los ácidos nucleicos según este aspecto de la
invención se diferenciarán respecto a la secuencia del tipo salvaje
en un total de 20, 21, 22, ó 23 posiciones de nucleótidos.
Los ejemplos de las secuencias preferidas de
ácidos nucleicos que codifican el péptido señal de la proteína
principal de la cubierta de M13 para utilizarse en varios aspectos
de la invención incluyen la secuencia nativa de nucleótidos de M13
(MCPn) y secuencias nuevas de nucleótidos MCP1 a MCP9 proporcionadas
en la Tabla 1 siguiente. La utilización de una secuencia de
nucleótidos correspondiente a una cualquiera de MCPn, MCP1, MCP3,
MCP4, o MCP8 se prefiere particularmente.
Cuando se desee que al menos dos polipéptidos se
produzcan y secreten de una célula, es preferible que se utilicen
al menos dos secuencias codificadoras de péptidos señal descritas en
la Tabla 1 anterior: una para cada polipéptido. La secuencia
codificadora del péptido señal puede ser la misma o puede ser
diferente para cada polipéptido que se va a secretar. Según un
aspecto adicional más de la invención, se proporcionan bibliotecas
que contienen combinaciones aleatorias de secuencias codificadoras
de péptidos señal. El ejemplo 5 describe dichas bibliotecas con más
detalle.
Por el término "unido de manera operativa",
se quiere decir que los ácidos nucleicos que codifican tanto el
péptido señal como el polipéptido que se va a secretar, están bajo
el control de una única región promotora/operadora y que se
transcriben como un único mensajero. Así, un casete de expresión
para utilizarse en la invención puede ser, en su forma más
sencilla, la unidad genética más pequeña capaz de mediar la
expresión y secreción de un polipéptido de interés. Un casete de
expresión contiene generalmente una región promotora/operadora
adecuada (incluyendo, por ejemplo, los promotores/operadores
tac o lac o T7 o lambda de bacteriófagos para
utilizarse en E. coli, los promotores de respuesta a ecdisona
o de citomegalovirus humano o SV40 para utilizarse en células de
mamíferos, los promotores Gal1 o Cup1 o AOX1
para utilizarse en células de levaduras y el promotor de
polihedrina para utilizarse en baculovirus), antes del extremo 5' de
una región en 5' que no se traduce (5'UTR), a la que a su vez sigue
un ácido nucleico que codifica el péptido señal y el polipéptido
que se va a secretar. Los casetes de expresión pueden incorporar
adicionalmente las secuencias de control apropiadas de la
transcripción y de la traducción, por ejemplo, elementos
amplificadores, secuencia de parada, secuencias de estabilidad del
ARNm, codones de inicio y de parada o sitios de unión a los
ribosomas, unidos en marco con o incluidos en, cuando sea apropiado,
las moléculas de ácido nucleico de la invención. Puede ser deseable
para el casete de expresión que permanezca en una forma episomal en
la célula. Alternativamente, puede integrarse en el genoma de la
célula anfitriona. Si se desea esto último, se incluirán en el
casete de expresión secuencias que promuevan la recombinación con el
genoma. Según esto, los aspectos adicionales de la invención
proporcionan células anfitrionas que contienen ácidos nucleicos o
casetes de expresión como se describe en la presente memoria y/o
que expresan polipéptidos según los métodos descritos en la presente
memoria.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
el péptido señal de la proteína principal de la cubierta de M13, o
variantes de éste, pueden ser útiles en cualquier anfitrión. Por
ejemplo, dichas secuencias señal derivadas de bacteriófagos pueden
ser valiosas en otros sistemas de expresión basados en virus tales
como, por ejemplo, baculovirus. Sin embargo, los procariotas tales
como bacterias de las especies Streptomyces y
Bacillus y E. coli son los anfitriones de expresión
preferidos. E. coli es un anfitrión particularmente
preferido. Cuando el anfitrión de expresión es un procariota, la
región promotora/operadora de un casete de expresión será una que
sea capaz de regular la expresión en anfitriones procariotas. Como
resultará obvio para un experto en la técnica, si los péptidos
señal se van a utilizar en otros sistemas de expresión (por
ejemplo, eucariotas), las regiones promotoras/operadoras serán
capaces de regular la expresión en el anfitrión específico.
El método de la invención puede comprender
adicionalmente la recuperación del polipéptido secretado. Si el
anfitrión de expresión es una bacteria Gram negativa, el proceso de
secreción llevará al polipéptido sólo hasta el espacio
periplásmico. Cuando éste sea el caso, la primera etapa de cualquier
procedimiento de recuperación será recoger las células (por
ejemplo, mediante centrifugación) y liberar el polipéptido del
espacio periplásmico. Esto puede conseguirse rompiendo la membrana
externa, por ejemplo, mediante un choque osmótico o cualquier otro
medio de ruptura adecuado, o mediante la utilización de cepas
anfitrionas que están comprometidas genéticamente y tienen una
membrana externa "porosa" (por ejemplo, determinadas cepas de
E. coli K12, véase Atlan y Portarlier, 1984; Fognini
Lefebvre y Portarlier, 1984). En otros anfitriones de expresión, que
no tienen membrana externa, el producto polipeptídico puede
secretarse directamente al medio de cultivo.
Los polipéptidos que se han liberado desde el
espacio periplásmico o que se han secretado al medio de cultivo
pueden recuperarse y purificarse más utilizando cualquier método
adecuado. Esto incluye cualquier método que utiliza, por ejemplo,
una diferencia de solubilidad, por ejemplo, adición de sal y
precipitación con un disolvente o una diferencia de peso molecular,
por ejemplo, ultrafiltración y electroforesis en gel o una
diferencia de carga eléctrica, por ejemplo, cromatografía de
intercambio iónico o afinidad específica, por ejemplo, cromatografía
de afinidad o una diferencia de hidrofobicidad, por ejemplo,
cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa o una
diferencia de punto isoeléctrico, por ejemplo, focalización
isoeléctrica para facilitar la purificación. Los detalles
adicionales de los procedimientos de aislamiento y de las
estrategias de purificación de proteínas adecuados serán familiares
para el experto en la técnica y están bien documentados en la
técnica.
Los ácidos nucleicos para utilizarse en la
presente memoria pueden generarse utilizando cualquier procedimiento
estándar de biología molecular y/o química, como resultará evidente
para los expertos en la técnica. Las técnicas particularmente
adecuadas incluyen la mutagénesis dirigida de oligonucleótidos del
ácido nucleico nativo que codifica el péptido señal de la proteína
principal de la cubierta de M13, técnicas de síntesis dirigida de
oligonucleótidos y escisión enzimática o relleno enzimático de
huecos de oligonucleótidos. Dichas técnicas se describen en
Sambrook y Fritsch, 1989 y en los Ejemplos contenidos a continuación
en la presente memoria.
En aspectos adicionales, los ácidos nucleicos o
los casetes de expresión de la invención pueden utilizarse con un
vehículo. El vehículo puede ser un vector u otro vehículo adecuado
para la introducción del ácido nucleico/casete de expresión en una
célula anfitriona. Los ácidos nucleicos/casetes de expresión pueden
subclonarse en cualquier vector disponible comercialmente (por
ejemplo, la serie de vectores pUC o pBluescript para utilizarse en
E. coli), utilizando técnicas estándar de biología
molecular. Dichos vectores pueden incluir plásmidos, fagémidos y
virus (incluyendo tanto virus bacteriófagos como eucariotas). La
invención incluye tanto vectores de clonación como de expresión que
contienen los ácidos nucleicos y/o los casetes de expresión de la
invención. Cuando sea apropiado, dicho vector o vehículo puede
contener más de un casete de expresión según la invención, por
ejemplo, un vector de expresión Fab' puede contener un casete de
expresión que codifica una cadena ligera de anticuerpo y un casete
de expresión que codifica una cadena pesada de anticuerpo (véase,
por ejemplo, la Figura 1C).
La introducción del ácido nucleico o del casete
de expresión en una célula anfitriona puede utilizar cualquier
técnica disponible. En células bacterianas, las técnicas adecuadas
pueden incluir transformación con cloruro de calcio,
electroporación o transfección utilizando un bacteriófago. En
células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir
transfección con fosfato de calcio, DEAE Dextrano, electroporación,
bombardeo con partículas, transfección mediada por liposomas o
transducción utilizando retrovirus, adenovirus u otros virus, tales
como vaccinia o, para células de insecto; baculovirus.
Después de la introducción del ácido nucleico en
las células anfitrionas, las células pueden cultivarse en un medio
conocido per se adecuado para crecer el anfitrión (por
ejemplo, 2xYT o Medio LB para E. coli). Cualquier medio
adecuado contendrá habitualmente al menos un carbohidrato
asimilable, una fuente de nitrógeno y minerales esenciales. Los
carbohidratos están habitualmente en la forma de azúcares sencillos
tales como lactosa o glucosa, la fuente de nitrógeno puede incluir
extracto de levadura u otra fuente de aminoácidos asimilable tal
como triptona, caseína, fitona, peptona y extracto de buey. Los
minerales esenciales pueden variar entre los anfitriones de
expresión pero incluyen generalmente cantidades traza de sales de
metales de transición tales como sales de manganeso y magnesio. El
medio de cultivo puede modificarse, por ejemplo, mediante la
adición de un antibiótico u otro compuesto químico o mediante la
exclusión de un nutriente particular, con el fin de mantener la
presencia de un vector o vehículo en el organismo anfitrión.
Las condiciones de crecimiento (por ejemplo,
medio de crecimiento, temperatura, tiempo y duración de la inducción
y cantidad de compuesto químico inductor si el promotor es
inducible) variarán según el sistema de expresión individual
utilizado pero, en general, se optimizarán con el fin de incrementar
la expresión del polipéptido recombinante. Por ejemplo, pueden
manipularse con el fin de permitir la acumulación del polipéptido
expresado, por ejemplo, en el espacio periplásmico o el medio de
cultivo. El hecho de permitir la acumulación del producto
polipeptídico después de la expresión puede constituir una etapa
opcional en el método de la invención. La orientación general
respecto a las condiciones de crecimiento y de inducción, adecuadas
para la expresión del polipéptido recombinante, puede encontrarse
en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y Fritsch, 1989;
Glover, 1995a,b) y los ejemplos específicos de condiciones de
cultivo celular y regímenes de inducción se describen en la
presente memoria en los Ejemplos siguientes.
Los diferentes aspectos y realizaciones de la
presente invención se ilustrarán ahora con más detalle mediante los
ejemplos. Se apreciará que se pueden realizar modificaciones de
detalles sin apartarse del alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Representación Esquemática de los
Casetes de Expresión de Fosfatasa Alcalina, scFv y Fab'. En la
parte A) se muestra la organización del casete de expresión de la
fosfatasa alcalina con la región codificadora del péptido señal
(SP) ligada en marco con el gen estructural de la fosfatasa
alcalina. Estos están bajo el control del promotor tac
(pTac). También se muestra la posición de la región 5' no
traducida (5' UTR). En la parte B) se muestra la organización del
casete de expresión de scFv. El péptido señal (SP) se liga delante
de y en marco con la secuencia codificadora de V_{L} que se une
posteriormente en marco con la secuencia codificadora de V_{H}
mediante un conector (Gly_{4}Ser)_{4} (no mostrado). La
expresión se controla mediante el promotor tac (pTac) y
también se muestra la posición de la región 5' no traducida. En la
parte C) se muestra la organización de los casetes de expresión en
la construcción de expresión Fab' 40.4. Tanto la secuencia
codificadora de V_{L} como la de V_{H} están cada una fusionada
en marco con la misma secuencia codificadora del péptido señal
(SP). Éstas están bajo el control de promotores tac
(pTac) distintos. Se muestra la posición de las dos regiones
5' no traducidas (5'UTR) así como el espaciador intragénico cKappa
(C\kappa), que separa la expresión de la cadena ligera y pesada.
La región codificadora de C_{H1} se muestra fusionada en marco y
después del extremo 3' de la región codificadora de V_{H}.
Figura 2: Construcciones para permitir la
producción de bibliotecas de Fab'-péptidos
señal. A] La segunda copia del promotor tac se eliminó
como un fragmento Xho I-Xba I y se reemplazó con un
fragmento Xho I-Xba I que contiene un promotor
tac que había sido modificado para eliminar el Pst I
interno e incluye sitios Mfe I y Nsi I. B] muestra la
construcción modificada.
Figura 3: Producción de Fab' a partir de
construcciones con diferentes secuencias codificadoras de péptido
señal delante de cadenas Pesadas y Ligeras. La producción de
Fab' 165 a partir de diferentes miembros de la biblioteca de
péptidos señal que tienen un casete de expresión de cadena pesada
seguido de un casete de expresión de cadena ligera, se evaluó
mediante ELISA dos horas después de la inducción de la expresión.
Los resultados mostrados son la media de tres experimentos a
pequeña escala en matraces agitados \pmSD.
Figura 4: Efecto de diferentes regiones
codificadoras de péptido señal en la producción de cadenas pesadas,
cadenas ligeras y Fab' total en fermentación. La producción se
evaluó mediante resonancia de plasmón superficial para muestras
tomadas a las 2, 13, 20 y 38 horas después de la inducción de la
expresión y se representa en términos de unidades de resonancia
(RU). Los datos se muestran para diferentes miembros de las dos
bibliotecas de péptidos señal, es decir, miembros de la biblioteca
que contiene un casete de expresión de cadena ligera seguido de un
casete de expresión de cadena pesada (LC:HC) y miembros de la
biblioteca que contiene un casete de expresión de cadena pesada
seguido de un casete de expresión de cadena ligera (HC:LC). SP CDS =
secuencia codificadora del péptido señal.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen phoA se clonó a partir de la cepa
de E. coli W3110 mediante PCR, con su péptido señal propio
utilizando los cebadores PhoA1 (5'
GCGCGCGCTCTGCAGGTCGAGTTCTAGATAACGAGGCGTAAAAAATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGC
3') y PhoA2 (5'GCGCGCGCGCGGCCGCTCATTATTTCAGCCCCAGAGCGGC
TTTCATGG 3'). El codón de inicio del gen nativo de la fosfatasa alcalina se cambió de GTG al codón de inicio más común ATG. El cebador PhoA1 incorpora un sitio de endonucleasa de restricción Pst I en su extremo 5' seguido de una región "5' UTR", el codón de inicio alterado y 23 bases más del gen phoA. El cebador PhoA2 incorpora un sitio de endonucleasa de restricción Not I en el extremo 3' del producto de PCR de phoA. Esto permite clonar el producto de PCR digerido dos veces con Pst I-Not I detrás de cualquier promotor adecuado para formar un casete de expresión con el péptido señal nativo de la fosfatasa alcalina.
TTTCATGG 3'). El codón de inicio del gen nativo de la fosfatasa alcalina se cambió de GTG al codón de inicio más común ATG. El cebador PhoA1 incorpora un sitio de endonucleasa de restricción Pst I en su extremo 5' seguido de una región "5' UTR", el codón de inicio alterado y 23 bases más del gen phoA. El cebador PhoA2 incorpora un sitio de endonucleasa de restricción Not I en el extremo 3' del producto de PCR de phoA. Esto permite clonar el producto de PCR digerido dos veces con Pst I-Not I detrás de cualquier promotor adecuado para formar un casete de expresión con el péptido señal nativo de la fosfatasa alcalina.
El gen phoA maduro (sin su péptido señal)
se clonó a partir de la cepa de E. coli W3110 utilizando los
cebadores PhoA3 (5' CGGACACCAGAAATGCCTGTTCTG GAAAAC 3') y PhoA2
(como anteriormente). Esto permite clonar el gen maduro de la
fosfatasa alcalina detrás de cualquiera de los casetes de péptido
señal descritos en la presente memoria, como un fragmento
romo/Not I. Así, la eficacia de las variantes de los péptidos
señal y/o diferentes ácidos nucleicos que codifican la misma
secuencia de aminoácidos de péptido señal puede compararse
utilizando la fosfatasa alcalina como una proteína estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los casetes de ácidos nucleicos que codifican
los péptidos señal de la proteína principal de la cubierta de M13
identificados en la Tabla 1 se construyeron a partir de pares de
oligonucleótidos largos complementarios que se hibridaron a una
concentración de 1 pmol/ \mul en tampón (25 mM NaCl, 12,5 mM
Tris-HCl, 2,5 mM MgCl_{2}, 0,25 mM DTE, pH 7,5)
calentando en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y
permitiendo que se enfríen lentamente hasta temperatura
ambiente.
El diseño de estos oligos fue tal que consistían
en tres elementos: una región 5' UTR en posición 5', un núcleo que
codifica el péptido señal y una región conectora en 3' para permitir
la clonación posterior del péptido señal en un casete de expresión
delante del gen que codifica el polipéptido que se va a secretar.
Como apreciará el experto en la técnica, la secuencia de este
conector puede variarse con el fin de adaptar estos casetes de
péptido señal para utilizarse con otros polipéptidos. Los casetes
que codifican los péptidos señal que se utilizaron para dirigir la
secreción de la fosfatasa alcalina carecían del conector en posición
3' y consistían sólo en la 5' UTR y la región codificadora central
del péptido señal.
\vskip1.000000\baselineskip
Vectores de expresión de fosfatasa
alcalina: Los casetes de péptido señal que se habían construido
hibridando oligonucleótidos (véase el Ejemplo 2 anterior) se
ligaron al producto de PCR de PhoA maduro digerido con Not I
(descrito en el Ejemplo 1 anterior) produciendo un fragmento
Pst I-Not I. Éste se ligó en el vector detrás del
promotor tac (véase la Figura 1A).
Vectores de expresión de scFv: Para
permitir la introducción sencilla de regiones codificadoras nuevas
de péptido señal, se introdujo un sitio de endonucleasa de
restricción EcoR V en los primeros dos codones del dominio
V_{L} de un plásmido de expresión existente de scFv [véase, por
ejemplo, la Especificación de la Patente Internacional No. WO
01/94585]. Este plásmido contiene un scFv específico para una
citoquina humana, en la organización
V_{L}-V_{H}-His, bajo el control
del promotor tac. El scFv también contiene un conector
(Gly_{4}Ser)_{4}. Los casetes de péptido señal que se
habían construido hibridando oligonucleótidos (véase el Ejemplo 2
anterior) se ligaron en el vector de expresión de scFv digerido dos
veces con Pst I-EcoR V (véase la Figura 1 B).
Vectores de expresión de Fab': Los
vectores para expresar las cadenas ligeras y pesadas Fab' bajo el
control dual de los promotores tac se construyeron como
sigue. El casete de expresión de V_{L} en un vector de expresión
existente de Fab' [véase, por ejemplo, la Especificación de Patente
Internacional No. WO 01/94585] se escindió mediante una doble
digestión con las endonucleasas de restricción Pst I y
Spl I y se reemplazó con casetes SP-V_{L},
que habían sido escindidos de manera similar a partir de los
vectores de expresión de scFv descritos anteriormente. Los
fragmentos SP-V_{H} se crearon y se introdujeron
como fragmentos de PCR utilizando un oligonucleótido 3' corto
inverso que hibrida en la región C_{H1} y oligonucleótidos 5'
largos directos que codifican el péptido señal. Esto resultó en una
serie de vectores de expresión Fab' 40.4 que contienen los
diferentes péptidos señal delante de las cadenas ligeras y pesadas
de 40.4. Estos vectores se diseñaron ventajosamente de manera que
existen sitios de restricción únicos en los bordes 5' y 3' de las
regiones V_{L} y V_{H} (EcoR V-Spl
I, Pvu II-Apa I) respectivamente, permitiendo así un
intercambio rápido de regiones codificadoras del dominio variable
y/o del péptido señal (véase la Figura 1C).
Se construyeron vectores de expresión control
para Fab' y scFv reemplazando los péptidos señal de M13 con el
péptido señal de E. coli OmpA.
\newpage
Los experimentos con matraces agitados y la
extracción de fracciones periplásmicas se realizaron esencialmente
como se ha descrito previamente (Humphreys et al. 1996),
utilizándose tetraciclina a una concentración final de 10 \mug/ml
en el medio de crecimiento. La expresión del polipéptido se indujo
mediante la adición de IPTG a 0,2 mM y se ensayó bien mediante un
ensayo enzimático o mediante ELISA según sea apropiado, a tiempos
entre 0 y 5 horas después de la inducción.
Las fermentaciones se realizaron en medio
"SM6E": (NH_{4})_{2}SO_{4} 5,2 gL^{-1};
NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O 4,14 gL^{-1}; KCl 4,025 gL^{-1};
MgSO_{4}.7H_{2}O 1,04 gL^{-1}; ácido cítrico 5,20 gL^{-1};
glicerol 31,111 gL^{-1}; CaCl_{2}.2H_{2}O 0,0522 gL^{-1};
ZnSO_{4}.7H_{2}O 0,0206 gL^{-1}; MnSO_{4}.4H_{2}O 0,0272
gL^{-1}; CuSO_{4}.5H_{2}O 0,0081 gL^{-1};
CoSO_{4}.7H_{2}O 0,0042 gL^{-1}; FeCl_{3}.6H_{2}O 0,1006
gL^{-1}; H_{3}BO_{3} 0,0003 gL^{-1};
Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O 0,0002 gL^{-1}; MAZU DF843 como un
antiespumante a 0,02% (v/v) y el pH se llevó a 6,95 con NH_{4}OH.
Los fermentadores (Braun BiostatB 2,5L) se inocularon con una
cantidad suficiente de cultivo de siembra (en medio SM6E
suplementado con tetraciclina a 10 \mugml^{-1}) para
proporcionar una DO_{600} inicial de 0,2. El pH se controló
mediante la adición de 50% (v/v) NH_{4}OH y 1,8M H_{2}SO_{4}
según fue necesario y el oxígeno disuelto se mantuvo a 30%
utilizando agitación y flujo de aire variables. Los cultivos se
alimentaron de manera discontinua con 2 x 45ml 80% (p/p) de
glicerol a DO_{600} 20 y 40 respectivamente. La expresión de Fab'
se indujo a una DO_{600} de aproximadamente 80 mediante el
agotamiento del glicerol y la sustitución de lactosa como la fuente
de carbono. La concentración de lactosa se mantuvo entre 20 y 50
gL^{-1} a lo largo de la fase de producción y las células se
recogieron 24-36 horas después de la inducción.
Las pastas celulares de la fermentación se
resuspendieron en ½ del volumen de recogida de 100 mM Tris.HCl/10 mM
EDTA pH7,4 y se agitó a 250 rpm, 30ºC durante 16 horas. Los
extractos periplásmicos se aclararon mediante centrifugación a
25.000 g durante 30 minutos y se pasaron a través de un filtro de
0,2 \mum (Millipore) antes de purificarlos en Proteína G
Sepharosa (GammaBind Plus, Pharmacia Biotech) como se ha descrito
previamente (Humphreys et al., 1998).
Los ensayos se realizaron esencialmente como se
ha descrito previamente (Humphreys et al., 1995), con las
modificaciones siguientes: la expresión se indujo mediante 0,2 mM
IPTG y los ensayos se realizaron en 20 \mul de cultivo
aproximadamente 3 horas después de la inducción. La actividad
fosfatasa alcalina se expresó como \DeltaA_{420}
DO_{600}^{-1} min^{-1}.
Para ELISA de scFv se recubrieron placas Nunc
Maxisorp con antígeno (una citoquina humana) a 0,5 \mugml^{-1}
en 100 mM de tampón de bicarbonato sódico pH 9,0 durante 16 horas a
4ºC. Después de lavar 4 veces en tampón de bloqueo (0,1%p/v BSA en
PBS), y dos veces en tampón de recubrimiento (10%p/v trealosa, 0,1
%p/v BSA en PBS) las placas se secaron al aire y se guardaron en
bolsas de aluminio selladas a 4ºC. El estándar purificado se diluyó
hasta 250 ngml^{-1}, seguido de diluciones seriadas de dos veces
en 1%p/v BSA en PBS. Cada pocillo se incubó con 100 \mul de
muestra o estándar y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora.
Después de lavar dos veces con 0,0002%p/v Tween20 en PBS, cada
pocillo se incubó con 100 \mul de anticuerpo
anti-etiqueta His de conejo (Santa Cruz Biotech,
Cat. no. SC-803) diluido 1/500 en 1%p/v BSA en PBS y
se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de
lavar dos veces con 0,0002% p/v Tween20 en PBS, cada pocillo se
incubó con 100 \mul de HRP anti-conejo de burro
(Jackson, Cat. no. 711-035-152)
diluido 1/5.000 en 1%p/v BSA en PBS y se agitó a temperatura
ambiente durante 30 minutos. La placa se lavó 4 veces con 0,0002%p/v
Tween20 en PBS y se reveló como se ha descrito previamente
(Humphreys et al. 1996). El ELISA para evaluar la
concentración de Fab' se realizó como describen Humphreys et
al. (1996).
Los extractos periplásmicos se produjeron a
partir de E. coli que expresa y secreta fosfatasa alcalina
utilizando el péptido señal MCP3. Estos extractos se analizaron
mediante SDS-PAGE utilizando geles de
Tris-glicina 4-20% (Novex) según
las instrucciones del fabricante. Las proteínas se transfirieron
desde el gel de poliacrilamida a membrana de PVDF (PSQ, Applied
Biosystems) mediante transferencia electroforética en 10 mM CAPS
(ácido
3-ciclohexilamino-1-propanosulfónico,
Sigma) pH 11,0 y se tiñeron con Ponceau S. La banda correspondiente
a la fosfatasa alcalina se cortó y la proteína se eluyó para
análisis de secuencia N-terminal.
La expresión de la fosfatasa alcalina se observó
en las diez construcciones del péptido señal de la proteína
principal de la cubierta de M13, aunque se observaron algunas
diferencias en el nivel de expresión entre las construcciones cuyos
péptidos señal de M13 estaban codificados por variantes de los
ácidos nucleicos. En general, el nivel de expresión observado fue
similar al obtenido con el péptido señal control OmpA (véase la
Tabla 2 anterior).
Un clon que contenía MCP3 que expresaba
fosfatasa alcalina se eligió arbitrariamente para evaluar la
precisión de la escisión del péptido señal, como se ha descrito en
el Ejemplo 4 anterior. La secuenciación N-terminal
reveló que el sitio de escisión del péptido señal había sido
reconocido correctamente lo que resultó en la secuencia
N-terminal correcta en la fosfatasa alcalina
madura.
La capacidad de cuatro de las variantes así como
del péptido señal nativo de la proteína principal de la cubierta de
M13 se evaluó para determinar su capacidad de secretar scFv al
periplasma de E. coli mediante ELISA. También se utilizó el
péptido señal OmpA para fines comparativos. Los resultados se
muestran en la Tabla 3 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de las cuatro variantes evaluadas
para determinar su capacidad de secretar scFv, así como el péptido
señal nativo de la proteína principal de la cubierta de M13 también
se evaluaron para determinar su capacidad de secretar Fab' al
periplasma de E. coli. Los clones se crecieron y la expresión
se indujo en las condiciones de fermentación descritas
anteriormente. La producción de Fab' purificado se evaluó mediante
ELISA y los resultados se muestran en la Tabla 4 siguiente.
De nuevo, se mostró que la proteína principal de
la cubierta de M13 era capaz de expresar y secretar niveles altos
de Fab'. Sorprendentemente, se mostró que algunas de las variantes
de ácidos nucleicos eran más eficaces que el control OmpA. Los
resultados demuestran que el nivel de expresión puede incrementarse
aproximadamente cinco veces respecto al producido por el péptido
señal control utilizando en este caso la variante de ácido nucleico
MCP4 para codificar el péptido señal de la proteína principal de la
cubierta de M13.
El péptido señal del bacteriófago M13 puede
utilizarse para dirigir la secreción de diferentes moléculas de
Fab'. Para demostrar esto, las regiones V_{H} y V_{L} de cada
una de las construcciones MCP1, MCP3, MCP4 y MCP8 Fab' 40.4 se
escindieron como fragmentos Eco RV-Spl y Pvu
II-Apa I respectivamente y se reemplazaron con
regiones V_{H} y V_{L} digeridas de manera similar de un
anticuerpo que reconoce un antígeno diferente que el reconocido por
Fab' 40.4. Así, se produjeron cuatro construcciones madre para
permitir la expresión del nuevo Fab'; cada construcción utilizó una
secuencia de nucleótidos diferente para codificar el péptido señal
del bacteriófago M13 delante de las cadenas ligera y pesada (NB la
misma secuencia de nucleótidos se utilizó para la cadena ligera y
pesada en una única construcción) y cada una contenía un casete de
expresión de cadena ligera seguido de un casete de expresión de
cadena pesada (véase la Figura 1 C).
La expresión y secreción de la molécula Fab'
(Fab' 165) se evaluaron en las condiciones de fermentación descritas
en el Ejemplo 4 anterior. La producción de Fab' purificado se
evaluó mediante ELISA y los resultados se muestran en la Tabla 5
siguiente.
En los Ejemplos descritos anteriormente, la
secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal del
bacteriófago M13 era la misma tanto para la cadena ligera como
pesada en cada construcción de expresión de Fab'. Con el fin de
evaluar el efecto, en la expresión y secreción, de combinaciones de
las diferentes secuencias de nucleótidos que codifican el péptido
señal en la misma construcción, se construyeron dos bibliotecas de
plásmidos. Cada biblioteca contenía todas las 16 combinaciones
posibles de las secuencias MCP1, MCP3, MCP4 y MCP8 delante de las
cadenas ligera y pesada de Fab' 165.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer casete de expresión se representa a lo
largo de la parte superior y el segundo casete de expresión se
representa en la parte lateral inferior. Estas construcciones tienen
todas un casete de expresión de cadena ligera seguido de un casete
de expresión de cadena pesada.
Comenzando con las cuatro construcciones madre
Fab' 165 descritas en el Ejemplo 4 anterior, éstas se digirieron
con Pst I y Mfe I, y se dejó que los fragmentos y los
núcleos del vector recombinarán al azar, dando así como resultado
todas las 16 combinaciones posibles de secuencias que codifican el
péptido señal como se muestra en la Tabla 6.
Debido a que Pst I es compatible
con Nsi I y Mfe I es compatible con Eco RI
(véase la Figura 2), cada una de las cuatro construcciones madre
Fab' 165 producidas en el Ejemplo 4 anterior, se trató como sigue.
Una primera muestra de cada construcción se digirió con Nsi I
y Eco RI y se aisló la secuencia que codifica el péptido
señal y el fragmento de la cadena pesada. Una segunda muestra de
cada construcción se digirió con Pst I y Mfe I, y
ambos fragmentos se aislaron y purificaron. El fragmento de la
cadena pesada de la primera digestión se ligó con el núcleo del
vector (que no presentaba un fragmento de la cadena ligera) de la
segunda, para producir una construcción que contiene dos cadenas
pesadas. Esta construcción se digirió con Nsi I y Eco
RI para eliminar la segunda secuencia que codifica el péptido señal
y la cadena pesada. El fragmento pequeño de la cadena pesada se
desechó y el núcleo del vector remanente (que contiene un fragmento
5' de cadena pesada) se ligó con una mezcla de los fragmentos del
péptido señal y de la cadena ligera de la segunda digestión.
\vskip1.000000\baselineskip
El primer casete de expresión se representa a lo
largo de la parte superior y el segundo casete de expresión se
representa en la parte lateral inferior. Estas construcciones tienen
todas un casete de expresión de cadena pesada seguido de un casete
de expresión de cadena ligera.
Así, se produjo una biblioteca de 16
construcciones que tiene el orden de los casetes de expresión de la
cadena ligera y pesada invertido respecto al de la biblioteca
descrita en a) anterior. La Tabla 7 muestra las combinaciones de
los péptidos señal presentes en la biblioteca.
Los estudios de expresión se llevaron a cabo en
matraces agitados en pequeña escala como se ha descrito
anteriormente. Como consecuencia del resultado obtenido en esta
escala, se evaluó la capacidad de varios de los diferentes clones
para expresar Fab' en fermentaciones, de nuevo como se ha descrito
anteriormente. Los niveles de expresión de cadenas ligeras, cadenas
pesadas y Fab' total se evaluaron utilizando resonancia de plasmón
superficial y/o ELISA.
Los ensayos de unión por resonancia de plasmón
superficial se realizaron utilizando un instrumento BIAcore^{TM}
2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). Utilizando química
estándar NHS/EDC se inmovilizaron en chips sensores CM5 IgG2a
monoclonal murino anti-IgG Pan Fd (CH1) humano,
obtenido del hibridoma HP6045 (ATCC) y IgG2a monoclonal murino
anti-dominio constante de la cadena ligera kappa
(C\kappa) humano, obtenido del hibridoma HP6053 (ATCC). Los
ésteres NHS residuales se inactivaron con hidrocloruro de
etanolamina (1M).
Los fragmentos Fab' se capturaron bien mediante
un anticuerpo monoclonal anti-cadena pesada
inmovilizado o mediante un anticuerpo monoclonal
anti-cadena ligera inmovilizado en células de flujo
diferentes. La presencia de Fab' unido se evaluó mediante la unión
del anticuerpo monoclonal complementario
(anti-cadena ligera o anti-cadena
pesada) en una segunda etapa. Unos niveles altos de anticuerpo
inmovilizado garantizan que las determinaciones se realizan en
condiciones limitadas de transporte de masa, en las que la
contribución de la constante de velocidad de asociación a la unión
es baja comparada con la contribución realizada por la concentración
de Fab' en la muestra. La fase de disolución del anticuerpo
monoclonal utilizada en la segunda etapa se pasa sobre la
superficie a una concentración alta de manera que la unión no está
limitada por la constante de la velocidad de asociación de esta
interacción.
Los fragmentos Fab' unidos y las cadenas no
unidas plegadas correctamente se detectan durante la primera etapa
de captura. La unión del segundo anticuerpo sólo se produce con un
fragmento Fab' intacto. Por lo tanto, el análisis de la unión
relativa en la primera y segunda etapa revela la presencia bien de
un exceso de cadena ligera no unida o de un exceso de cadena pesada
no unida en la muestra de Fab' y proporciona información sobre la
estequiometría de la unión.
Los ensayos se realizaron en ambas
configuraciones para cada muestra y cada muestra se analizó en
duplicado y en un orden aleatorio.
(i) Cuando la concentración de Fab' unido se
determinaba mediante captura de cadena ligera, las muestras y los
estándares (10 \mul a 10 \mul/min) se inyectaron sobre HP6053
inmovilizado, seguido de una segunda etapa en la que se pasó HP6045
a 300 \mug/ml sobre la superficie en la fase de disolución.
(ii) Cuando la concentración de Fab' unido se
determinaba mediante captura de cadena pesada, las muestras y los
estándares (10 \mul a 10 \mul/min) se inyectaron sobre HP6045
inmovilizado, seguido de una segunda etapa en la que se pasó HP6053
a 500 \mug/ml sobre la superficie en la fase de disolución. En
ambos casos, la superficie se regeneró con 10 \mul de 30 mM HCl a
30 \mul/min.
El número de unidades de resonancia determinado
utilizando BlAevaluation 3.1 (Pharmacia Biosensor AB), se leyó
frente a una curva estándar. Hubo una respuesta lineal desde 2
\mug/ml hasta 50ng/ml de Fab' estándar purificado.
La Figura 3 muestra que el nivel de la expresión
de Fab' varía considerablemente entre las diferentes construcciones
que tienen los casetes de expresión en el orden cadena
pesada-cadena ligera. Se obtuvieron resultados
similares para la biblioteca cadena ligera-cadena
pesada (datos no mostrados). Así, las dos bibliotecas que contienen
diferentes combinaciones de secuencias que codifican péptido señal
pueden utilizarse para optimizar la expresión de Fab'. Utilizando
digestiones dobles con Eco RV -Spl I y Pvu II-Apa I,
pueden sustituirse las cadenas ligeras y pesadas de otros
anticuerpos por las de Fab' 165 y así las bibliotecas pueden
utilizarse para optimizar la expresión de cualquier molécula de
Fab'.
La Figura 4 compara la producción de cada cadena
y de Fab' total durante una fermentación en la que se utilizan
varias combinaciones de secuencias que codifican péptido señal. Es
sorprendente que la producción de Fab' total es máxima cuando los
niveles de expresión de las cadenas ligera y pesada son
aproximadamente iguales. Así, la expresión de Fab' puede
optimizarse utilizando las bibliotecas de péptido señal para
conseguir un equilibrio entre la expresión de la cadena ligera y
pesada y esto constituye un aspecto más de la invención,
particularmente cuando cada secuencia señal está bajo el control de
su propio promotor/operador.
Atlan, D. y Portarlier, R.
1984 Applied Microbiology & Biotechnology
19:5-12.
Fognini Lefebvre, N. y Portarlier,
R. FEMS Microbiology Letters 21:323 328.
Glover, D.M. 1995a. DNA
cloning: a practical approach, Volumen II: Expression systems.
IRL press.
Glover, D.M. 1995b. DNA
cloning: a practical approach, Volumen IV: Mammalian systems.
IRL press.
Humphreys, D.P., Weir, N.,
Mountain, A. y Lund, P.A. 1995. Journal of
Biological Chemistry 270:28210-28215.
Humphreys, D. P. Weir, N.,
Lawson, A., Mountain, A. y Lund, P.A.
1996 FEBS Letts: 380:194-197.
Humphreys, D.P., Vetterlein, O.M.,
Chapman, A.P., King, D.J., Antoniw, P.,
Suitters, A.J., Reeks, D.G., Parton, T.A.H.,
King, L.M., Smith, B.J., Lang, V. y
Stephens, P.E. (1998) Journal of Immunological
Methods 217:1-10.
Gray, G.L., Baldridge, J.S.,
McKeown, K.S., Heyneker, H.L. y Chang, C.N.
1985. Gene 39:247 254.
Kumagai, M.H., Shah, M.,
Terashima, M., Vrkljan, Z., Whitaker, J.R. y
Rodriguez, R.L. 1990 Gene 94:209 216.
Sambrook, J. y Fritsch, E.
1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2a
edición. Cold Spring Harbour Press, N.Y.
<110> CELLTECH R & D LIMITED
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTORES DE EXPRESIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P031127WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB02/03129
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-07-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0116460.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-07-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99, versión 1.02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago M13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Péptido señal de la proteína
principal de la cubierta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago M13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MCPn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> MCP2
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<223> MCP7
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<212> ADN
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<223> MCP8
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<223> MCP9
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<400> 11
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Cebador PhoAl
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<212> ADN
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<223> Cebador PhoA2
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<223> Cebador PhoA3
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\hfill30
Claims (12)
1. Un método para producir una cadena de
anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos de ésta, que
comprende cultivar células anfitrionas de E. coli que
contienen un casete de expresión en condiciones que resultan en la
expresión de la cadena de anticuerpo, o del fragmento de ésta, a
partir del casete de expresión, en el que dicho casete de expresión
comprende un primer ácido nucleico que codifica el péptido señal de
la proteína principal de la cubierta del bacteriófago M13, unido de
manera operativa a y en marco con un segundo ácido nucleico que
codifica la cadena de anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos
de ésta.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que el primer ácido nucleico, que codifica la secuencia de
aminoácidos nativa del péptido señal de la proteína principal de la
cubierta del bacteriófago M13, difiere en la secuencia de
nucleótidos de la secuencia de nucleótidos nativa de M13.
3. Un método según la reivindicación 2, en el
que el primer ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos de
MCP1, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, MCP7, MCP8, o MCP9, como se representa
en la Tabla 1.
4. Un método según la reivindicación 3, en el
que el primer ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos de
MCP1, MCP3, MCP4, o MCP8, como se representa en la Tabla 1.
5. Un método para producir un anticuerpo
completo o un fragmento de éste que comprende producir una cadena
pesada y ligera del anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 4 y
permitir que las cadenas se unan.
6. Un método según la reivindicación 5 en el que
la cadena pesada y ligera se producen en la misma célula anfitriona
a partir de casetes de expresión diferentes.
7. Un método según la reivindicación 6 en el que
cada casete de expresión está bajo el control de un único
promotor/operador.
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 7 en el que cada péptido señal se selecciona
para conseguir una expresión equilibrada de las cadenas pesada y
ligera.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además a) opcionalmente,
permitir que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, cadena de
anticuerpo o fragmento de unión a antígenos se acumule y b) aislar
el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, cadena de anticuerpo o
fragmento de unión a antígenos.
10. Un casete de expresión que comprende un
primer ácido nucleico que codifica el péptido señal de la proteína
principal de la cubierta del bacteriófago M13 en el que el primer
ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de
MCP1 MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, MCP7, MCP8 y MCP9, como se presenta en
la Tabla 1, unido de manera operativa a y en marco con un segundo
ácido nucleico que codifica una cadena de anticuerpo o un fragmento
de unión a antígenos de ésta.
11. Un vector que comprende un ácido nucleico
que codifica el péptido señal de la proteína principal de la
cubierta del bacteriófago M13 en el que el ácido nucleico tiene una
secuencia de nucleótidos seleccionada de MCP1, MCP3, MCP4, MCP5,
MCP6, MCP7, MCP8 y MCP9 o uno o dos casetes de expresión según la
reivindicación 10.
12. Una célula anfitriona que contiene un casete
de expresión según la reivindicación 10 o un vector según la
reivindicación 11.
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