ES2263212T3 - Anticuerpo okt3 mutado. - Google Patents

Abstract

Fragmento scFv de un anticuerpo que comprende un dominio de unión, que se caracteriza por un intercambio de cisteína por otro aminoácido polar en la posición H100A según el sistema de numeración Kabat del anticuerpo conocido por la denominación OKT3, que está depositado en forma de células de hibridoma bajo el número ATCC CRL 8001.

Description

Anticuerpo OKT3 mutado.

La presente invención se refiere a un fragmento del anticuerpo OKT3 mutado mediante una mutación puntual en la posición H100A, a un procedimiento para su producción así como a su uso.

El OKT3 es un anticuerpo monoclonal que procede del ratón, del tipo IgG 2a, que reconoce un epítopo de una subunidad \varepsilon del complejo CD3 humano (Kung et al., Science 206, págs. 347-349 (1979); Van Wauwe et al., J. Immunol. 124, págs. 2708-2713 (1980); Transy et al., Eur. J. Immunol. 19, págs. 947-950 (1989)). El procedimiento, para obtener el anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma correspondiente, se describe en detalle en estos documentos. Además la titular de la patente EP 0 018 795 depositó la línea celular de hibridoma que produce OKT3 el 26 de abril de 1979 con el nº ATCC CRL 8001 en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852. El OKT3 se utiliza desde hace mucho tiempo, para inhibir una respuesta de las células T y mediante esto impedir el rechazo de trasplantes (Thistlethwaite et al., Transplantation 38, págs. 695-701 (1984); Woodle et al., Transplantation 51, págs. 1207-1212 (1991)). Por otro lado mediante el OKT3 puede desencadenarse también una proliferación y activación de las células T, que estimula células efectoras, lo cual puede utilizarse en la inmunoterapia adoptiva contra el cáncer (Yannelly et al., J. Immunol. Meth. 1, págs. 91-100 (1990)). El OKT3 se utilizó tanto solo como también como componente de un anticuerpo biespecífico, para dirigir linfocitos T citotóxicos contra células tumorales o células infectadas por virus (Nitta et al., Lancet 335, págs. 368-376 (1990); Sanna et al., Bio/Technology 13, págs. 1221-1224 (1995)). Además se conocen también versiones humanizadas del anticuerpo monoclonal OKT3, que se expresaron en células COS (Woodle et al., J. Immunol. 148, págs. 2756-2763 (1992); Adair et al., Human. Antibod. Hybridomas, págs. 41-47 (1994)). Pero hasta ahora existía el problema, que el OKT3 no presenta una estabilidad suficiente y especialmente que no puede expresarse en sistemas de expresión recombinantes conocidos de manera estable y en cantidad suficiente.

El objetivo de la presente invención consistía por tanto en expresar el OKT3 de manera recombinante y obtener un fragmento de anticuerpo, que presente una estabilidad satisfactoria.

El objetivo se resuelve mediante los objetos de las reivindicaciones.

Los inventores encontraron, que mediante la introducción de una mutación puntual en la posición
H100A de la secuencia de aminoácidos de OKT3 aumenta mucho la estabilidad. Esta mutación puntual se refiere al intercambio de cisteína por otro aminoácido polar, preferiblemente serina, en la secuencia de aminoácidos de
OKT3.

Para la producción de un fragmento de anticuerpo según la invención se parte de ARNm de células de hibridoma recién subclonadas de OKT3. El ADNc se produce según métodos conocidos por el experto, que se describieron por ejemplo en Dübel et al., J. Immunol. Methods 175, págs. 89-95 (1994). El ADN que codifica para el dominio variable de la cadena ligera puede producirse por medio de la PCR usando cebadores adecuados, por ejemplo por medio de los cebadores Bi5 y Bi8, que se hibridan en la parte aminoterminal del dominio constante de la cadena \kappa y la región "framework 1" (FR1) del dominio variable de la cadena \kappa (Dübel et al., compárese con lo citado anteriormente). Para la amplificación del ADN, que codifica para el dominio variable de la cadena pesada, pueden usarse por ejemplo el cebador Bi4, que se hibrida en la parte aminoterminal del dominio 1 constante de la cadena \gamma (Dübel et al., compárese con lo citado anteriormente) y el cebador Bi3f, que se hibrida en la región FR1 de la cadena pesada (Gotter et al., Tumor Targeting 1, págs. 107-114 (1995)).

Después se inserta el ADN amplificado en un vector adecuado para la secuenciación y para la "mutagénesis específica de sitio", tal como se conoce perfectamente por el experto. Por ejemplo puede usarse el vector pCR-Script SK(+) comercializado por la empresa Stratagene. Las mutaciones se introducen en el dominio V_{H} que procede de OKT3 mediante mutagénesis dirigida ("mutagénesis específica de sitio"). Las condiciones necesarias para ello son conocidas por el experto, por ejemplo se describen también en Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154, págs. 367-382 (1987). La sustitución de aminoácidos en la posición H100A del OKT3 (intercambio de cisteína) se realiza de manera adecuada usando el cebador SK1 5'-GTAGTCAAGGCTGTAATGATCATC, por si debe ejecutarse un intercambio por serina en esta posición.

El ADN así modificado puede clonarse después en un vector o vector de expresión. Ejemplos tales son conocidos por el experto. En el caso de un vector de expresión éstos son pGEMEX, derivados de pUC o pET3b. Para la expresión en levaduras deben mencionarse por ejemplo pY100 e Ycpad 1, mientras que para la expresión en células animales deben indicarse por ejemplo pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4. Para la expresión en células de insectos es especialmente adecuado el vector de expresión de Baculovirus pAcSGHisNT-1. Según la invención se prefiere la expresión en E. coli, para lo que se utiliza preferiblemente el vector mostrado en la figura 1 pHOG21 (Kipriyanov et al., J. Immunol. Methods 196, págs. 51-62 (1996)), en el que está insertado el gen scFv de cadenas simples de OKT3 como fragmento de ADN NcoI/BamHI. Se llega a la expresión de un anticuerpo OKT3 de cadena simple mutado en la posición 100 A (sistema de numeración Kabat), que presenta la secuencia mostrada en la figura 2.

El experto conoce células adecuadas, para expresar un ADN presente en un vector de expresión. Ejemplos de tales células comprenden las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BI21 y SG 13009, la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae y las células animales 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero y Hela así como las células de insecto sf9. Se prefiere el uso de las células de E. coli XL1-Blue comercializadas por la empresa Stratagene.

El experto sabe, de qué manera puede expresarse un ADN en un vector de expresión que el ADN en forma de una proteína de fusión, por ejemplo en forma de una proteína de fusión His. La información necesaria para ello está contenida en el plásmido pHOG21 usado preferiblemente. Además la forma mutada de OKT3 puede encontrarse en forma de un anticuerpo biespecífico, por ejemplo junto con un anticuerpo contra el complejo CD19 humano. La secuencia de un anticuerpo biespecífico tal se muestra en la figura 3.

Los fragmentos de anticuerpo según la invención se caracterizan, porque pueden producirse por medio de métodos recombinantes en cantidad suficiente y porque presentan una estabilidad mayor en comparación con los anticuerpos OKT3 monoclonales sin mutar. Ésta se muestra por ejemplo en que el fragmento de anticuerpo mutado apenas ha perdido su afinidad de unión original incluso todavía tras un mes de almacenamiento a 4ºC en PBS, mientras que el OKT3 en estas condiciones ya ha perdido claramente afinidad de unión (el 46%). Además el fragmento de anticuerpo según la invención tiene la ventaja, que como anticuerpo de cadena simple (scFv) presenta un aclaramiento en sangre más rápido y una mejor penetración en el tumor. Además los scFv son moléculas muy útiles, para conducir productos farmacéuticos, toxinas o radionucleidos a sitios de tumor, lo que es importante en el diagnóstico y tratamiento de tumores.

La presente invención se describe adicionalmente mediante las figuras.

Figura 1

Plásmido pHOG21

Teniendo las abreviaturas usadas los significados siguientes:

Ap^{R}:

gen de resistencia a la ampicilina

c-myc:

secuencia que codifica para un epítopo, que se reconoce mediante el anticuerpo 9E10 monoclonal (Cambridge Research Biomedicals, Cambridge, Reino Unido)

ColE1:

origen de la replicación de ADN

fl IG:

región intergénica del fago f1

His_{6}:

secuencia que codifica para 6 restos de histidina

ligador:

secuencia que codifica para 17 aminoácidos, que une los dominios V_{H} y V_{L}

peIB:

secuencia de péptido señal para la pectato liasa bacteriana

P/O:

promotor/operador-Lac de tipo natural

Figura 2

Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos derivada del anticuerpo de cadena simple OKT3 mutado

Figura 3

Anticuerpos biespecíficos compuestos a partir de OKT3 mutado y anti-CD19

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La invención se explica adicionalmente mediante el ejemplo.

Ejemplo 1 Producción de un fragmento de anticuerpo según la invención

Se realizaron el aislamiento de ARNm a partir de células de hibridoma recién subclonadas de OKT3 y la síntesis de ADNc tal como se describe en "Dübel et al., J. Immunol. Methods 175, págs. 89-95 (1994)". Se produjo el ADN que codifica para el dominio variable de la cadena ligera por medio de la PCR usando los cebadores Bi5 y Bi8, que se hibridan en la parte aminoterminal del dominio constante de la cadena \kappa y la región "framework 1" (FR1) del dominio variable de la cadena \kappa (Dübel et al., compárese con lo citado anteriormente). Para la amplificación del ADN, que codifica para el dominio variable de la cadena pesada, se usaron el cebador Bi4, que se hibrida en la parte aminoterminal del dominio 1 constante de la cadena \gamma (Dübel et al., compárese con lo citado anteriormente) y el cebador Bi3f, que se hibrida en la región FR1 de la cadena pesada (Gotter et al., Tumor Targeting 1, págs. 107-114 (1995). La mezcla de reacción de 50 \mul contenía 10 pmol de cada cebador y 50 ng de ADNc de hibridoma, 100 \muM de cada uno de los dNTP, 1x tampón Vent (Boehringer Mannheim), 5 \mug de BSA y 1 U de Vent ADN-polimerasa. Se realizaron 30 ciclos cada uno de 1 minuto a 95ºC, 1 min a 55ºC y 2 minutos a 75ºC en un termociclador para PCR. Se purificó el ADN amplificado con un kit de purificación para PCR Qia-quick (Qiagen, Hilden).

Después se unió en los extremos romos el ADN amplificado en el vector pCR-Script SK(+) comercializado por la empresa Stratagene, que se cortó con la enzima de restricción Srfl. Se introdujeron mutaciones en el dominio V_{H} que procede del OKT3 mediante mutagénesis dirigida ("mutagénesis específica de sitio") (Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154, págs. 367-382 (1987)). La sustitución de aminoácidos en la posición H100A de OKT3 (intercambio de cisteína por serina) se realizó usando el cebador SK1 5'-GTAGTCAAGGCTGTAATGATCATC.

Para la expresión del ADN mutado obtenido se utilizó el vector pHOG21 mostrado en la figura 1 (Kipriyanov et al., J. Immunol. Methods 196, págs. 51-62 (1996)), en el que está insertado el gen scFv de cadenas simples de OKT3 mutado como fragmento de ADN NcoI/BamHI. Se transformaron células de E. coli (Stratagene) con este vector de expresión y se dejaron crecer durante la noche en un medio 2xYT con ampicilina 50 \mug/ml y glucosa 100 mM (2xYT_{GA}) a 37ºC. Se dejaron crecer diluciones (1:50) de los cultivos que se dejaron crecer durante la noche en 2xYT_{GA} a 37ºC con agitación. En cuanto los cultivos alcanzaron una DO_{600} = 0,8, se sedimentaron las bacterias mediante centrifugación a 1.500 g durante 10 minutos y 20ºC y se resuspendieron en el mismo volumen de medio 2xYT nuevo que contenía ampicilina 50 \mug/ml y sacarosa 0,4 M. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM y se prosiguió con el crecimiento a temperatura ambiente durante 20 hrs. Se recogieron las células mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos y 4ºC. Se conservó el resto del cultivo en hielo. Para aislar proteínas periplasmáticas solubles, se absorbieron las bacterias sedimentadas en Tris-HCl 50 mM, sacarosa al 20%, EDTA 1 mM, a pH 8,0 (el 5% del volumen original) helado. Tras una hora de incubación en hielo con agitación ocasional se separaron por centrifugación esferoplastos a 30.000 g durante 30 minutos y 4ºC, presentándose el extracto periplasmático soluble como resto y los esferoplastos más el material periplasmático insoluble como sedimento. Se combinaron el resto de cultivo conservado anteriormente en hielo y el extracto periplasmático soluble y se clarificaron mediante una centrifugación adicional (30.000 g, 4ºC, 40 min). Tras filtraciones mediante filtros de vidrio con un tamaño de poro de 10-16 \mum y después 0,2 \mum se redujo el volumen 10 veces mediante la concentración con membranas Amicon YM10 (Amicon, Witten). Se clarificó el resto concentrado mediante centrifugación y se sometió a diálisis contra Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, a pH 7,0 a 4ºC. Se realizó una cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) a 4ºC usando una columna de 5 ml de Sepharosa quelante (Pharmacia) cargada con Ni^{2+} y equilibrada con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, a pH 7,0 (tampón inicial). Se eluyó el material adsorbido en la columna con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, imidazol 250 mM, a pH 7,0. Tras el cambio de tampón a MES 50 mM, a pH 6,0 se purificó adicionalmente la proteína en una columna de intercambio iónico Mono S (Pharmacia). Se sometió a diálisis el anticuerpo scFv purificado según la invención en PBS (fosfato de sodio 15 mM, NaCl 0,15 M, a pH 7,4). Para una conservación más larga se congeló el anticuerpo en presencia de BSA (concentración final 10 mg/ml) y se almacenó a -80ºC.

Claims (8)

1. Fragmento scFv de un anticuerpo que comprende un dominio de unión, que se caracteriza por un intercambio de cisteína por otro aminoácido polar en la posición H100A según el sistema de numeración Kabat del anticuerpo conocido por la denominación OKT3, que está depositado en forma de células de hibridoma bajo el número ATCC CRL 8001.

2. Fragmento según la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido polar es serina.

3. Fragmento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque éste presenta la secuencia indicada en la figura 2.

4. Procedimiento para la producción del fragmento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por las etapas siguientes:

a)

obtener ARNm a partir de células de hibridoma de OKT3 recién subclonadas y la transcripción en ADNc,

b)

amplificar el ADN que codifica para los dominios variables de la cadena ligera y pesada por medio de la PCR usando cebadores adecuados,

c)

clonar el ADN obtenido en b) en un vector adecuado para la mutagénesis dirigida así como introducir la mutación deseada usando cebadores adecuados,

d)

insertar el ADN mutado obtenido en c) en un vector de expresión y expresarlo en un sistema de expresión adecuado.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, siendo el vector usado en la etapa c) pCR-Script SK(+).

6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, usándose en la etapa c) el cebador 5'-GTAGTCAAGGCTGTAATGATCATC.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 6, teniendo lugar la expresión en células de E. coli XL1-Blue.

8. Uso del fragmento según una de las reivindicaciones 1 a 3, para la producción de un medicamento para la disminución o eliminación de un rechazo al trasplante por un receptor de un trasplante de órgano.