ES2296987T3 - Procedimiento para la deteccion de estres oxidativo y kit para su implementacion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar marcadores de estrés oxidativo en un grupo de individuos, que comprende las etapas de: a. la determinación del factor de riesgo de un estrés oxidativo en dicho grupo; b. la medición de la cantidad de al menos 10 marcadores diferentes de estrés oxidativo de una muestra obtenida de cada uno de dicho grupo de individuos; y c. la comparación de la cantidad de cada uno de dichos marcadores de estrés oxidativo con la cantidad de cada uno de dichos marcadores de estrés oxidativo medidos en un grupo de individuos sanos, determinando así los marcadores de estrés oxidativo que hayan aumentado o disminuido en dicho grupo de individuos portadores de un factor de riesgo de estrés oxidativo respecto a individuos sanos.
Description
Procedimiento para la detección de estrés
oxidativo y kit para su implementación.
La presente invención se refiere a un proceso
destinado a la detección de estrés oxidativo en una muestra de
sangre y a un procedimiento para determinar marcadores de estrés
oxidativo en un grupo de individuos.
Un 98% del oxígeno absorbido por nuestro
organismo se reduce a agua a nivel de la cadena respiratoria
mitocondrial, en reacciones catalizadas por complejos citocromo
oxidasa. Una molécula de dioxígeno produce dos moléculas de agua,
por captura directa de cuatro electrones y cuatro protones. Sin
embargo, el oxígeno también puede sufrir una reducción gradual,
electrón por electrón. Esto conduce a la formación de especies
oxigenadas sumamente tóxicas, las especies de oxígeno activado
(EOA), la primera de las cuales es el radical anión superóxido,
(O_{2}\cdot^{-}). La estructura química del anión superóxido
incluye un electrón "no apareado" (simbolizado por un punto),
una característica esencial de los radicales libres. La presencia de
un electrón libre hace que el radical sea sumamente inestable y muy
reactivo como un poderoso oxidante. El anión superóxido puede a su
vez capturar un electrón para convertirse en O^{2-} el cual, ante
la presencia de dos protones, formará dos nuevas especies de
oxígeno activado sumamente oxidantes: peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}) y oxígeno puro (^{1}O_{2}). Estas dos
moléculas no son radicales libres, dado que en estas estructuras
químicas todos los electrones están apareados. El electrón
capturado por el anión superóxido puede provenir de otro anión
superóxido, lo cual conduce a una dismutación espontánea del anión
superóxido. La coexistencia del anión superóxido y el peróxido de
hidrógeno puede producir aún otra especie de oxígeno activada
sumamente reactiva: el radical hidroxilo OH\cdot. Esta reacción
requiere la presencia de un metal de transición como por ejemplo
hierro o cobre, que actúe como catalizador. En la escena de los
radicales libres, estos metales son jugadores clave que no pueden
ser ignorados.
Al formar EOA, el oxígeno puede comprometer
agresivamente la integridad celular. Las especies de oxígeno
previamente mencionadas y en particular, los radicales libres de
oxígeno, tienen un ciclo de vida extremadamente corto; interactúan
con una amplia variedad de sustratos biológicos, tales como ácidos
nucleicos, nucleótidos, proteínas, lípidos de membrana, y
lipoproteínas. Las EOA pueden producir rupturas en el ácido
desoxirribonucleico (ADN) y alterar así el mensaje genético. En el
citoplasma, las EOA transforman moléculas tales como NADH o NADPH,
y alterar así el estado redox de la célula y la actividad de los
enzimas que utilizan estos sustratos. La acción de las EOA modifica
significativamente la estructura primaria, secundaria y terciaria de
las proteínas, hasta el punto de desnaturalizarlas y de formar
agregados insolubles (residuos celulares) La despolimerización de
proteínas tales como el colágeno o la elastina constituye un buen
ejemplo de la acción nociva de las EOA. El inhibidor de proteasa
\alpha-1-antitripsina, (el cual
inhibe la elastasa y la tripsina) es rápidamente inactivado por los
radicales libres de oxígeno. Cuando los glóbulos rojos entran en
contacto con las EOA durante unos pocos minutos, su hemoglobina
queda alterada; el hierro se libera del hemo, y se produce un
aumento de la hemólisis de estas células. Las membranas de
fosfolípidos son constituyentes esenciales de la arquitectura
celular. Contienen ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), dianas
favoritas de los radicales libres de oxígeno. El hidrógeno ubicado
entre los dobles enlaces PUFA se desprende fácilmente por acción del
radical hidroxilo (OH\cdot), que de este modo convierte al ácido
graso (RH) en un radical libre (R\cdot) En presencia de oxígeno
y hierro, se induce la peroxidación lipídica que se propaga de ácido
graso en ácido graso mediante la generación de radicales libres de
alcoxilo de lípidos (RO\cdot), radicales peroxilo (ROO\cdot) y
lipoperóxidos (ROOH). El resultado es una alteración considerable
de la fluidez de la membrana, que posiblemente conduce a la muerte
celular. Ricas en PUFA, las lipoproteínas son particularmente
sensibles a la acción de las EOA. Las lipoproteínas oxidadas dejan
de transportar el colesterol en forma adecuada. Además, son
reconocidas por los macrófagos sanguíneos y se acumulan dentro de
ellos. Los macrófagos adquieren entonces el aspecto de células
espumosas, que se adhieren a las paredes arteriales. Este es el
mecanismo mediante el cual las lipoproteínas oxidadas contribuyen a
aumentar el riesgo de enfermedad cardiovascular.
Estudios recientes han demostrado que las EOA
pueden también jugar un rol a nivel molecular. Un ejemplo es su
actuación sobre el NF-kB, un factor de transcripción
especifico del linfocitos B. Inactivo en el citoplasma, el
NF-kB puede inducirse en una amplia variedad de
tipos de células por numerosos factores, incluyendo citoquinas,
agentes infecciosos, e incluso EOA que actúan como mensajeros
secundarios. La tiorredoxina (TRX), una proteína inducida por
estrés oxidativo, también aumenta la actividad del
NF-kB mediante la modificación de la regulación
redox del glutatión (GSH). Una vez activado, el
NF-kB migra hacia el núcleo de la célula, donde
puede transactivar genes diana. Por tanto, está implicado en la
síntesis de numerosos mediadores de las respuestas inmunes e
inflamatorias (citoquinas, complemento). Varios virus, tales como el
VIH, también dependen del NF-kB para replicarse en
la célula.
Nuestro organismo está siempre produciendo EOA
pero, tal y como aparecerá en la próxima sección, esta producción
está perfectamente regulada por sistemas protectores. Las EOA
desempeña, por lo tanto, un importante papel fisiológico, tal como
se ilustra en los siguientes ejemplos. Las células fagocitas,
neutrófilos, eosinófilos, y monocitos/macrófagos aseguran la
fagocitosis y la destrucción de microorganismos extraños. La
citotoxicidad de estas células se debe a su capacidad para
desplazarse de una forma inactiva a otra forma sumamente activada
caracterizada por la producción de abundante EOA intracelular capaz
de atacar la membrana del microorganismo fagocitado.
Estudios recientes han demostrado que en el
proceso de fertilización, un espermatozoide segrega grandes
cantidades de EOA para penetrar la pared membranosa del óvulo.
Bajo condiciones fisiológicas, las células endoteliales liberan una
sustancia llamada EDRF (factor de relajación derivado del
endotelio), el cual desempeña un papel importante en la regulación
del tono vascular, debido a sus propiedades relajantes del músculo.
Se ha demostrado claramente que este EDRF actúa como el radical
libre monóxido de nitrógeno NO\cdot.
La sobreproducción de EOA es atribuible a
numerosos mecanismos bioquímicos:
Ciertamente, el mecanismo más importante
consiste en la activación de glóbulos blancos mediante varios
estímulos externos, tales como endotoxinas, interleuquinas o
fragmentos complementarios, presentes en exceso en el organismo en
varias condiciones patológicas. Las EOA producidas mediante esta
activación son secretadas a continuación hacia el medio
extracelular y pueden en consecuencia atacar órganos y tejidos sanos
y desencadenar una inflamación aguda. Los glóbulos blancos también
liberan un enzima llamado mieloperoxidasa (MPO). En presencia de
peróxido de hidrógeno, este enzima cataliza la oxidación del ion
cloruro a un poderoso oxidante, el ácido hipocloroso (HOCI), más
conocido como "agua clorada".
Hemos visto que bajo condiciones fisiológicas,
las mitocondrias transforman alrededor del 2% de su oxígeno en EOA.
Incluso estudios efectuados en animales han demostrado que este
porcentaje aumenta durante el envejecimiento, como resultado de la
desregulación gradual del transporte de electrones en la cadena
respiratoria.
La desregulación del transporte de electrones
en las mitocondrias se observa también en todos los procesos de
reperfusión isquémica. La isquemia, es decir la privación de
oxígeno, en un tejido causa lesiones celulares en proporción a su
duración. Con el fin de conservar la viabilidad tisular, la
reperfusión debe acontecer dentro de un límite determinado de
tiempo, el cual depende del tejido considerado. Varios estudios
experimentales y clínicos han demostrado, no obstante, que el daño
celular más significativo ocurre cuando se restaura el flujo
sanguíneo, como resultado de la producción explosiva de EOA en los
minutos siguientes a la reperfusión. La conversión de la xantina
deshidrogenasa (XDH) en xantina oxidasa (XO), (estas dos enzimas
actúan en las últimas etapas del catabolismo de la purina) es
también una fuente principal de EOA. Desde el punto de vista
clínico, la reperfusión isquémica constituye un aspecto importante
de la apoplejía y el transplante de órgano.
En los casos de estrés oxidativo, las células
endoteliales producen en abundancia tanto anión superóxido como
radical monóxido de nitrógeno (NO\cdot). La interacción de ambos
radicales tiene un doble efecto:
producción de peroxinitritos (HOONO) de alta
toxicidad y vasoconstricción debida a la pérdida de las propiedades
vasodilatadoras del NO\cdot.
Las EOA, y especialmente el anión superóxido,
pueden "activar" el hierro, liberándolo de la proteína de
almacenamiento ferritina; el hierro liberado puede entonces iniciar
reacciones de radicales libres.
La hemoglobina puede convertirse en un oxidante
potencial ya sea mediante la formación directa de EOA, o bien,
mediante la liberación de hierro hemo en forma libre.
En las plaquetas sanguíneas, la conversión del
ácido aracidónico en prostaglandinas o leucotrienos, catalizados
respectivamente por ciclooxigenasa y lipooxigenasa, constituye una
fuente potencial de producción de EOA y de lipoperóxido.
A fin de protegerse de los efectos
potencialmente nocivos del oxígeno, nuestro organismo ha
desarrollado dos tipos de sistemas defensivos.
Un primer sistema defensivo, compuesto por
enzimas y compuestos antioxidantes. La función de estos factores
consiste en prevenir el inicio o la propagación de reacciones de
radicales libres. La protección enzimática está asegurada por la
superóxido dismutasa (SOD), que destruye el anión superóxido, la
catalasa, que elimina peróxido de hidrógeno, la glutatión
peroxidasa, un enzima dependiente de selenio, que convierte a los
peróxido lipídicos en productos inofensivos, proteínas quelantes de
hierro (ferritina, transferritina), las cuales mantienen al hierro
en estado inactivo que de otro modo, sería capaz de catalizar las
reacciones de radicales libres. Además, los radicales libres son
destruidos por atrapadores que reaccionan directamente con los
radicales para formar derivados oxidados. Por ejemplo, el glutatión
(GSH) reacciona con el radical OH\cdot para formar glutatión
oxidado (GSSG), mediante un mecanismo que implica la formación de un
radical tiilo GS\cdot, seguido por la combinación de dos de tales
radicales. Otros ejemplos de atrapadores incluyen ácido úrico,
bilirrubina, glucosa, proteínas tiol (proteínas SH), y un grupo de
cuatro vitaminas: vitamina A (\beta-caroteno), C
(ácido ascórbico), E (\alpha-tocoferol) y Q
(coenzima Q-10 o ubiquinona). De forma destacada,
estos antioxidantes pueden actuar sinergísticamente contra los
radicales libres. Un ejemplo la cooperación entre el glutatión y
las vitaminas C y E. Al reaccionar con un radical de lípido
R\cdot, el lípido se regenera y la vitamina E se convierte en un
radical tocoferilo. La vitamina E se regenera a partir de este
radical gracias a la acción de la vitamina C, la cual a su vez se
convierte en radical. Este radical reacciona entonces con glutatión
reducido, para formar vitamina C y un radical tiílo. Dos de estos
últimos se combinan para producir GSSG.
Un segundo sistema defensivo está compuesto por
enzimas proteolíticos. La función de este sistema consiste en
prevenir la acumulación de proteínas oxidadas y ADN en la célula y
en degradar sus fragmentos tóxicos. Fosfolipidasas, endonucleasas
de ADN y ligasas y macroxiproteinasas, figuran entre las principales
enzimas que conforman esta última línea defensiva contra las
EOA.
Ciertas situaciones patológicas llevan a la
sobreproducción de EOA. En dichas situaciones, los sistemas de
defensa naturales de un organismo son rápidamente sometidos. En
términos generales, el estrés oxidativo se define como un
desequilibrio significativo entre antioxidantes y prooxidantes, en
favor de estos últimos, que conduce a daño celular que a menudo
resulta irreversible.
La sobreproducción de EOA es considerada como la
responsable de aproximadamente unas cien patologías diferentes.
Estas se dividen en 6 grandes categorías: efectos debidos a
toxicidad química (ozono, paracuato) o toxicidad xenobiótica,
efectos debidos a la radiación (rayos \gamma), el síndrome de
hiperoxigenación (retinopatía del prematuro), condiciones
inflamatorias (artritis reumatoide), efectos de reperfusión
isquémica (transplante de órgano), condiciones degenerativas
(envejecimiento, cáncer). Muchas situaciones/patologías están
asociadas a la sobreproducción de
EOA:
EOA:
Riñones: transplante, nefritis glomerular.
Pulmones: síndrome de insuficiencia
respiratoria, asma.
Corazón: trombosis coronaria, transplante.
Piel: quemaduras, exposición al sol, psoriasis,
dermatosis
Cerebro: trauma, enfermedad de Atkinson,
neurotoxinas, demencia.
Articulaciones: artritis reumatoide.
Tracto gastrointestinal: diabetes, pancreatitis,
endotoxemia, isquemia intestinal.
Ojos: cataratas, retinopatía (del prematuro),
degeneración retinal.
Vasos sanguíneos: aterosclerosis
Glóbulos rojos: Anemia de Fanconi, malaria.
Órganos múltiples: inflamación, reperfusión
isquémica, toxicidad a los medicamentos, sobrecarga de hierro,
deficiencia nutricional (Se), alcohol, radiación, cáncer,
envejecimiento, SIDA.
Hígado: Hepatitis C.
El exceso de ejercicio puede también generar un
estrés oxidativo en atletas, asociado a fatiga muscular y
lesiones.
Cuando se producen en pequeñas cantidades, las
EOA desencadenan una respuesta celular adaptativa caracterizada por
un sobrecrecimiento celular, sobreexpresión de enzimas antioxidantes
(superóxido dismutasa), y expresión de genes que codifican para
muchas proteínas. Las células expuestas a dosis bajas (5 umoles) de
peróxido de hidrógeno, por ejemplo, se vuelven entonces muy
resistentes a concentraciones más altas de este oxidante. Al
producirse en exceso, las EOA atacan los sustratos previamente
mencionados y en consecuencia ocasionan daño celular frecuentemente
irreversible y la posterior necrosis tisular. Entre estas dos
situaciones extremas, hay una en la cual el estrés oxidativo lleva
a la apoptosis, es decir, a la muerte celular programada. Este
fenómeno implica la proteolisis masiva y un cambio en la
transcripción del gen, conduciendo a la condensación de cromatina y
a la fragmentación del ADN en los endosomas. La integridad celular
se conserva, contrariamente a lo que ocurre en el caso de muerte
celular necrótica patológica. Antes del nacimiento, más de una de
cada seis células muere por apoptosis. La apoptosis se caracteriza
además por una fuga de GSH, volviendo a la célula más sensible al
estrés oxidativo.
Cuando el estrés oxidativo supera
ostensiblemente los sistemas de defensa naturales, se hace
necesario recurrir a la terapia antioxidante a fin de restringir la
acción nociva de las EOA. Además de los antioxidantes naturales
mencionados anteriormente, existen antioxidantes exógenos, tanto
naturales como sintéticos.
Cada antioxidante tiene su especificidad. Son
diferentes y actúan en diferentes etapas en la producción de la
cadena EOA. Se pueden distinguir cuatro grandes categorías:
- 1.
- moléculas que interactúan con EOA tanto enzimáticamente (SOD, catalasa, glutatión, peroxidasa) o directamente (dimetilsulfóxido, vitaminas A, C y E, ubiquinona, 21-aminoesteroides, probucol, captopril, propofol, ácido lipoico, flavonoides o vitaminas P,
- 2.
- Moléculas que refuerzan las defensas antioxidantes de las células. Algunos ejemplos incluyen N-acetilcisteína (NAC), la cual aumenta la concentración GSH intracelular, y ciertos metales que actúan como cofactores. La administración de cobre y/o zinc refuerza la actividad de SOD en los glóbulos rojos, mientras que el selenio refuerza la actividad del glutatión peroxidasa en estas células;
- 3.
- Moléculas quelantes de hierro, uno de los mejores ejemplos es la desferrioxamina. Este es un compuesto notablemente usado para el tratamiento de la hemocromatosis idiopática. Tanto los 21-aminoesteroides como los flavonoides presentes en grandes cantidades en la Gingko biloba poseen esta interesante capacidad quelante del hierro;
- 4.
- Inhibidores enzimáticos responsables de la formación de radicales libres. El más conocido es el allopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa utilizado habitualmente en cirugía para restringir los efectos de la reperfusión isquémica. Asimismo, vale la pena mencionar ciertos agentes anti-inflamatorios (sulfasalasina, 5-ácido aminosalicilico) y otros productos tales como la ceftazidina y la pentoxifillina, los cuales regulan la producción de EOA mediante glóbulos blancos activados.
Los individuos no poseen un potencial
antioxidante idéntico, ya que dicho potencial es una función de los
hábitos alimenticios, del estilo de vida, de las características
genéticas, o del entorno en que uno vive. En la actualidad, la
determinación del estatus de estrés oxidativo (SSO) de un individuo
se ha convertido en un tema prioritario en términos de prevención
de enfermedades, ya que numerosos estudios muestran claramente una
fuerte relación entre la alteración del sistema defensivo
antioxidante y el efecto creciente de las enfermedades
cardiovasculares y cánceres.
En la actualidad, a partir del desarrollo de
técnicas sensibles y específicas que se pueden utilizar de forma
rutinaria (sobre una rutina basada en 20 ensayos que cubren la
medición de los anti-oxidantes de los elementos
traza, indicadores de estrés del metabolismo del hierro y de los
marcadores de estrés oxidativo a nivel de los lípidos, de las
proteínas y del ADN), es posible establecer un chequeo sanguíneo
completo del SSO de un individuo.
En el suero o plasma, el estatus del estrés
oxidativo (SSO) se calculará de cuatro modos: (i) mediante la
medición de niveles antioxidantes, (ii) mediante la determinación de
niveles de los elementos traza, (iii) mediante el análisis del
estatus del hierro en sangre, y (iv) mediante la detección de daño
oxidativo en varios sustratos biológicos.
Vitamina A: Ciertos carotenoides actúan
como precursores de la vitamina A, conduciendo a la vitamina
mediante degradación. La vitamina A desempeña un papel esencial en
la percepción visual y previene la oxidación de diversos sustratos
biológicos, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados de las
membranas celulares.
Vitamina C: Esta vitamina reacciona con
radicales libres que contienen oxígeno hidrofílico. Su nivel
plasmático cae rápidamente durante el estrés oxidativo. La vitamina
C también está implicada en la regeneración de la vitamina E. Dado
que la vitamina C es sumamente lábil, no es posible analizarla en
forma adecuada, a menos que se tomen las debidas precauciones para
conservar la muestra (estabilización del plasma con ácido
metafosfórico).
Vitamina E: Este término abarca un grupo
de compuestos llamados tocoferoles (\alpha, \beta, \gamma,
\delta). El \alpha-tocoferol es el isómero
biológicamente más activo ensayado en este estudio. Reacciona con
radicales de lípidos y por lo tanto previene la propagación de la
peroxidación lipídica de las membranas celulares. Actúa en estrecha
sinergia con la vitamina C. Su concentración plasmática debe ser
estandarizada con respecto al colesterol.
Glutatión Reducido (GSH)/glutatión oxidado
(GSSG): El glutatión es un tripéptido que actúa a varios
niveles contra el estrés oxidativo. Puede interactuar en forma
directa con especies de oxígeno activado (EOA), pero se la utiliza
principalmente como un sustrato de la glutatión peroxidasa, que
elimina los lípidos peroxidados. La relación GSH/GSSG constituye
uno de los indicadores de estrés oxidativo más sensibles en un
individuo.
Proteínas tiol (PSH): La mayoría de las
proteínas poseen grupos tioles (-SH), los cuales reaccionan muy
fácilmente con las EOA.
Glutatión peroxidasa (GPx): Ubicada en
los glóbulos rojos, la GPx requiere la presencia de selenio y
glutatión reducido para el desempeño de su actividad antioxidante.
Su rol consiste en eliminar peróxido de hidrógeno y peróxidos
lípídicos que se forman cuando las EOA reaccionan con ácidos grasos
poliinsaturados.
Superóxido dismutasa (SOD): Éstas son
metaloproteínas de las cuales se distinguen dos variedades en el
hombre, en función del metal o de los metales presentes en el sitio
activo. Un tipo contiene cobre y zinc, mientras que el otro
requiere manganeso para ser activo. El rol de estos enzimas consiste
en regular la producción del anión superóxido, la primera especie
tóxica a ser formada a partir de oxígeno.
Capacidad antioxidante plasmática total
(análisis de antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos): Este
test evalúa la capacidad del plasma para inhibir la producción de
EOA generados a partir de un sistema in vitro (el método
TRAP). Constituye por lo tanto un método de "screening" que
calcula la suma de todas las actividades antioxidantes individuales
presentes en varios entornos biológicos.
Selenio, Cobre, Zinc: Estos tres
oligoelementos son indispensables para la función de los enzimas
antioxidantes (selenio para la GPx, cobre y zinc para la SOD). La
absorción de zinc conduce a largo plazo, a la inducción de
antioxidantes tales como las metalotioninas. Asimismo, el zinc
protege también a los grupos tioles de proteínas. El zinc puede
inhibir parcialmente reacciones en las que el cobre o el hierro
inducen la formación de especies de oxígeno activado. Por esta
razón, la relación de cobre con respecto a zinc en sangre puede
proporcionar información interesante acerca del nivel de estrés
oxidativo de un individuo.
Peróxidos lípidicos - LDL Oxidada
-anticuerpos contra la LDL Oxidada: Los ácidos grasos
poliinsaturados (componentes esenciales de las membranas celulares
y las lipoproteínas) son una diana preferencial de las EOA. Estos
tres tests se utilizan para detectar la peroxidación lipídica.
Numerosos estudios muestran una relación entre, por un lado, el
aumento de la oxidación de LDL y un aumento del título de
anticuerpos contra la LDL oxidada, y por otro lado, la aparición de
enfermedad cardiovascular, la progresión de la aterosclerosis y la
presencia de diabetes.
8-hidroxi-2'-desoxiguanosina
(8-OH-dG): Las EOA reaccionan
con gran afinidad con algunas de las bases que constituyen el ADN.
La guanina se transforma fácilmente en
8-hidroxi-2'-desoxiguanosina
(8-OH-dG), que es normalmente
eliminada por los enzimas reparadores del ADN. Si estos sistemas son
deficientes, la 8-OH-dG se acumula
en el ADN, causando mutaciones implicadas en la formación de cáncer.
En caso de estar presente en muestras de orina de 24 horas, este
marcador debe ser estandarizado con respecto a la creatinina.
Ensayo de carbonilo: Se ha sugerido que
las modificaciones oxidativas de las proteínas intracelulares
desempeñan un papel clave en la causa de pérdidas asociadas a la
senescencia en las funciones fisiológicas, ya que las proteínas
oxidadas a menudo pierden su función catalítica y sufren una
degradación selectiva. Podría decirse que la adición de aducto que
contiene carbonilo a las cadenas laterales de residuos de
aminoácidos (lisina, arginina,...) es la alteración estructural
post-traduccional asociada con la edad mejor
caracterizada.
Mieloperoxidasa: Cuando están activados,
los neutrófilos aumentan su consumo de oxígeno al 400%. Esto conduce
a la producción masiva de EOA y a la liberación de enzimas
proteolíticos (elastasa) y mieloperoxidasa (MPO). La MPO interviene
en el desarrollo del estrés oxidativo, siendo responsable de la
formación del ácido hipocloroso, un poderoso oxidante. Un
incremento del nivel de MPO en plasma es por lo tanto un indicador
específico de activación neutrófila, y éste un indicador indirecto
de la presencia de EOA, que tiene lugar en todos los procesos
inflamatorios.
Glucosa: Mediante el proceso de
auto-oxidación, la glucosa produce EOA y glioxal en
grandes cantidades. El glioxal se enlaza a los grupos amino de las
proteínas y por lo tanto, conduce a la aparición de "proteínas
viejas" con residuos de carboximetillisina. Éstos tienen la
capacidad de enlazar cobre y de inducir la peroxidación lipídica,
la cual a su vez aumenta la producción de glioxal. La propia glucosa
puede enlazarse a la hemoglobina para producir hemoglobina glicada.
Estos marcadores aumentan, naturalmente, en pacientes diabéticos,
considerada una situación de gran estrés oxidativo. Incluso el
envejecimiento puede causar la acumulación de dichos marcadores.
Proteínas que enlazan iones metálicos.
Cuando el hierro o el cobre está en forma libre, éstos puede
catalizar la peroxidación lipídica y la producción de EOA. La
capacidad de algunas proteínas de enlazarse al hierro
(transferrina, ferritina) o de transportar cobre (ceruloplasmina)
constituye un factor antioxidante preventivo esencial. En ausencia
de muestras hemolíticas, un aumento de saturación de transferritina
en hierro es un indicador indirecto de estrés oxidativo.
Los niveles elevados de homocisteína en sangre
(un aminoácido que contiene azufre) han sido asociados al mayor
riesgo de enfermedad arterial coronaria prematura, infarto y
tromboembolismo (coágulos sanguíneos venosos), incluso entre
individuos con niveles normales de colesterol. Los niveles
anormales de homocisteína parecen contribuir a la aterosclerosis al
menos en tres formas: (1) un efecto tóxico directo que daña las
células que recubren la cara interior de las arterias, (2)
interferencia con factores de coagulación y (3) oxidación de
lipoproteínas de baja densidad (LDL).
La detección del estrés oxidativo in vivo
es un proceso largo, complejo y caro que limita su aplicación a la
medicina, si bien existen medios para el tratamiento de un estrés
oxidativo.
Además, estos tests de diagnóstico proporcionan
poca información acerca de lo que acontece a nivel celular,
especialmente a nivel de los linfocitos, cuyo metabolismo es muy
dependiente de las EOA. Por lo tanto, no existe hasta el momento
ningún test que permita obtener información a este nivel.
Pincernail J et al., "Determination of
plasmatic concentrations in antioxidants, antibodies against
oxidized LDL, and homocystein in a sampling of Liege
population", Annales De Biologie Clinique, Vo. 58, No. 2 Marzo
2000 (2000-03), páginas 177-185,
describe la determinación cuantitativa de marcadores de estrés
oxidativo en un grupo de 123 donantes de sangre, como, por ejemplo,
vitamina C, vitamina E, relación vitamina E/colesterol, selenio,
proteínas con sulfhidrilo, ácido úrico, superóxido dismutasa, y
glutatión peroxidasa. Además, también se han investigado
autoanticuerpos contra LDL oxidada, como marcador del estrés
oxidativo y homocisteína, como factor de riesgo de aterosclerosis
implicada en el desarrollo del estrés oxidativo.
WO9963341 A2 se refiere al uso de un gráfico de
diagnóstico del estrés oxidativo como un indicador para la
evaluación del estrés oxidativo y su control en humanos.
WO0132802 A describe un procedimiento y aparato
para la predicción de la infertilidad masculina, y más
particularmente, a un procedimiento y aparato para cuantificar el
estrés oxidativo en una muestra física obtenida de un sujeto de
prueba. Dicho procedimiento y aparato proporcionan información útil
para un profesional médico en el diagnóstico de enfermedades que
están asociadas o provocadas por el estrés oxidativo.
Napoli Claudio et al., "Múltiple role
of reactive oxygen species in the arterial wall", Journal of
Cellular Biochemistry, Vol. 82, No. 4, 19 Junio 2001
(19-06-2001), páginas
674-682 describe que el aumento de estrés oxidativo
juega un papel importante en la disfunción vascular y aterogénesis y
existe una gran evidencia que indica que las especies de oxígeno
reactivas (ROS) regulan la expresión génica mediante la modulación
de una gran número de factores de transcripción. Napoli Claudio
et al. describen además que las técnicas de microarray
ofrecen una manera de determinar un gran espectro de cambios
asociados con el aumento del estrés oxidativo.
EP0229674 A describe la determinación de la
predisposición o susceptibilidad de un individuo a enfermedades
asociadas con el daño en el ADN que comprende el estrés oxidativo de
células aisladas o el ADN celular del individuo para producir ADN
dañado, a continuación, la determinación de un valor para la
actividad del enzima celular adenosin difosfato ribosil transferasa
(ADPRT); y a continuación, la comparación del valor con un valor
estándar de actividad de ADPRT.
Kenneda C H Cueto R Belinsky S A Lechner J F
Pryor W, "Overexpression of hMTH1 mRNA: a molecular marker of
oxidative stress in lung cancer cells", FEBS Letters, Elsevier
Science Publishers, Amsterdam, NL, Vol. 429, No. 1, 5 Junio 1998
(1998-06-05), páginas
17-20 describen que la sobreexpresión de ARNm de
hMTH1 puede representar un marcador molecular del estrés oxidativo
en células de pulmón, que podría utilizarse finalmente para elucidar
las relaciones temporales entre el estrés oxidativo, la
inestabilidad genómica y el desarrollo del cáncer de
pulmón.
pulmón.
Weigel A L et al, "Microarray analysis
of tert-butyl hydroperoxide and hydrogen peroxide
induced gene expression in ARPE-19 cells", IOVS,
Vol. 42, No. 4, 15 Marzo 2001
(2001-03-15), página S754, describe
un análisis de microarray de la expresión génica inducida por
hidroperóxido de terc-butilo y peróxido de hidrógeno
en células ARPE-19. Se clasificaron 53 genes como
oxidantes específicos si estaban implicados en tBH o bien
H_{2}O_{2}, pero no ambas respuestas génicas. Este documento
describe además que existe un grupo común de genes que están
implicados en una respuesta general al estrés oxidativo.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento de evaluación diagnóstica que permita
evaluar de forma rápida y sencilla el estatus del estrés oxidativo
(SSO) (preferiblemente a nivel celular).
Además, con la presente invención se describe un
kit adecuado para realizar dicho procedimiento. Otros problemas
técnicos serán evidentes a partir de la materia de las
reivindicaciones, la descripción de los cuales se incorporan por la
presente.
De acuerdo con la presente invención, el término
"factor de riesgo" significa cualquier posible condición
fisiológica y/o patológica en la cual un individuo podría estar
afectado por estrés oxidativo. En particular, se consideran el
ejercicio físico intenso, efectos debidos a toxicidad química o
toxicidad xenobiótica, efectos debidos a la radiación, síndrome de
hiperoxigenación, condiciones inflamatorias, efectos de reperfusión
isquémica y condiciones degenerativas. Las condiciones fisiológicas
y/o patológicas caracterizadas como un factor de riesgo para estrés
oxidativo están ejemplificadas a continuación.
De acuerdo con la presente invención, el término
"anti-oxidante" significa cualquier sustancia
capaz de proteger de los efectos potencialmente nocivos del
oxígeno; en particular, capaz de prevenir el desencadenamiento de
las reacciones de radicales libres.
De acuerdo con la presente invención, el término
"pro-oxidante" significa cualquier sustancia
capaz de apoyar directa o indirectamente el inicio de la
propagación de las reacciones de radicales libres.
De acuerdo con la presente invención, el término
"marcador de estrés oxidativo" significa cualquier marcador de
estrés oxidativo conocido en la técnica o tal y como se ha descrito
en la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, el término
"proteína implicada en apoptosis" significa cualquier proteína
capaz de inducir la apoptosis, es decir, muerte celular programada,
o cualquier proteína o ARN que esté implicada en, o que regule, el
mecanismo de la apoptosis. Se consideran en particular moléculas
asociadas al ligando CD95/CD95 (ligando Fas/Fas).
De acuerdo con la presente invención, el término
"chip de ADN" debería interpretarse como sinónimo de microarray
o biochip, sin limitarse a una longitud determinada de ácidos
nucleicos u oligonucleótidos unidos al mismo.
De acuerdo con la presente invención, el término
"enzima" también abarca polipéptidos que no necesariamente
exhiben actividad catalítica.
De acuerdo con la presente invención, el término
"factores de transcripción" significa cualquier proteína de
unión a ADN o ARN o ARN que regula la transcripción y traducción
genética, o cualquier ARN, proteína o cascada de proteínas que los
regula.
De acuerdo con la presente invención, el término
"enzima reparador del ADN" significa cualquier proteína o ARN
que reconoce las modificaciones producidas en el ADN o cualquier
ARN, proteína o cascada de proteínas que los regula.
De acuerdo con la presente invención, el término
"proteína de estrés" significa cualquier proteína o ARN, cuya
expresión se modifica bajo un estrés celular inducido por
condiciones físicas, químicas o biológicas que están fuera de sus
valores fisiológicos normales.
Sorprendentemente, los presentes inventores han
descubierto que el estrés oxidativo medido en individuos expuestos
a diferentes grados y calidades de estrés oxidativo difiere en su
perfil de marcadores de estrés oxidativo, es decir, en la cantidad
de marcadores de estrés oxidativo cuando se evalúa una gran variedad
de marcadores de estrés. Por ejemplo, los perfiles de los
marcadores de estrés oxidativo se han obtenido a partir de
individuos sanos, pacientes cardíacos, pacientes en hemodiálisis,
sujetos habituados a ejercicio físico intenso (tales como atletas
de media maratón y jugadores de fútbol de élite). Aunque hubiera
sido esperable que la cantidad de marcadores de stress oxidativo
aumentase del mismo modo en pacientes y atletas mostrando
agotamiento debido al ejercicio físico, ha resultado que diferentes
marcadores de estrés oxidativo son inducidos selectivamente una vez
expuestos a diferentes fuentes de estrés oxidativo; véase Tabla III.
Tal y como se observa en las Tablas I y III, algunos marcadores de
estrés oxidativo aumentan bajo una determinada condición fisiológica
y/o patológica, mientras que bajo la misma condición, diferentes
marcadores de estrés oxidativo pueden disminuir, véase por ejemplo,
el valor correspondiente a pacientes en hemodiálisis de la Tabla
III, en la cual aumentan los valores promedios para el peróxido
lipídico y la LDL oxidada, mientras que los valores promedio para la
superóxido dismutasa (SOD) y el selenio disminuyen. Estos hallazgos
tienen importantes repercusiones en el diagnóstico y la posible
terapia de enfermedades basadas en estrés oxidativo.
La presente invención permite, por primera vez,
una reducción significativa en el número de marcadores de estrés
oxidativo a ser evaluados, dado que sólo algunos marcadores de
estrés oxidativo de la literatura, realmente han aumentado o
disminuido en individuos con una determinada condición fisiológica
y/o patológica, al compararlos con individuos sanos.
Adicionalmente, la selección de los marcadores de estrés oxidativo
en los que se han observado que aumentan o disminuyen en una
condición fisiológica y/o patológica determinada, reduce el número
de falsos negativos de tests de estrés oxidativo previos que
utilizaron ya sea marcadores que, en la condición fisiológica y/o
patológica, no han aumentado ni disminuido, o que incluyeron
aquellos marcadores en los que se han observado que aumentan o
disminuyen en una condición fisiológica y/o patológica particular en
un panel más amplio de marcadores invariables, computando un valor
promedio que permanece dentro de su rango normal. La presente
invención posibilita la evaluación del factor de riesgo específico
en individuos lo que permite un diagnóstico más afinado y
posiblemente también la terapia del síndrome de estrés oxidativo
subyacente en la condición fisiológica y/o patológica. Además, la
presente invención permite, por primera vez, una evaluación del
factor de riesgo específico de los datos obtenidos a partir de la
evaluación de los marcadores de estrés oxidativo seleccionados de
acuerdo a la presente invención, la cual también facilita al médico
la elección de un régimen de tratamiento específico para el
paciente.
En una realización, la presente invención
proporciona un procedimiento para determinar marcadores de estrés
oxidativo en un grupo de individuos, que comprende las etapas
de:
a) la determinación del factor de riesgo para el
estrés oxidativo en dicho grupo;
b) la medición de la cantidad de al menos 10
marcadores diferentes de estrés oxidativo en una muestra obtenida
de cada uno de dicho grupo de individuos; y
c) la comparación de la cantidad de cada uno de
dichos marcadores de estrés oxidativo con la cantidad de cada uno
de dichos marcadores de estrés oxidativo medida en un grupo de
individuos sanos, determinando así los marcadores de estrés
oxidativo que hayan aumentado o disminuido en dicho grupo de
individuos portadores de un factor de riesgo para el estrés
oxidativo respecto a individuos sanos.
El individuo puede ser humano o animal.
Los factores de riesgo para el estrés oxidativo
se determinan por el médico de acuerdo a una anamnesis general. Los
factores de riesgo de ejemplo se describen a continuación.
La medición de la cantidad de los marcadores de
estrés oxidativo se determina tal y como se describe a
continuación.
Preferiblemente, por razones estadísticas, el
grupo comprende por lo menos 10 individuos, preferiblemente más de
50. Posteriormente a la medición de la cantidad de los diferentes
marcadores de estrés oxidativo, se obtiene un valor promedio y se
utiliza para la posterior etapa de comparación. También para el
grupo de individuos sanos, deberían evaluarse al menos 10
individuos con el fin de obtener valores promedios fiables.
Preferiblemente, el grupo consiste en un solo género (es decir,
varón o hembra), dado que se han observado variaciones en la
cantidad de marcadores de estrés oxidativo entre hombres y mujeres.
Véase la Figura 1.
En otra realización, la presente invención
proporciona un procedimiento para la detección de estrés oxidativo
en un individuo que comprende:
- a)
- la determinación del factor de riesgo de dicho individuo;
- b)
- la selección de al menos dos marcadores de estrés oxidativo que hayan aumentado o disminuido para dicho factor de riesgo respecto a individuos sanos;
- c)
- la medición de la cantidad de al menos dos de dichos marcadores oxidativos de una muestra obtenida de dicho individuo.
Preferiblemente, los marcadores de estrés
oxidativo que aumentan o disminuyen para dicho factor de riesgo se
determinan mediante el procedimiento anterior según la presente
invención. La muestra es preferiblemente una muestra de sangre
obtenida por o bajo el control de un médico.
En una realización preferida, dicho
procedimiento para la detección de estrés oxidativo en un individuo
comprende además la etapa de evaluación del resultado en el
contexto de dicho factor de riesgo sin restringir o limitar al
médico en modo alguno. Se sugiere que los resultados para un
marcador de estrés oxidativo particular en un cierto individuo
portador de un factor de riesgo para estrés oxidativo deberían ser
observados en relación al valor promedio para dicho marcador de
estrés oxidativo del grupo de individuos portadores del mismo factor
de riesgo para estrés oxidativo, posibilitando de este modo una
estimación del grado de estrés oxidativo en dicho individuo
portador del factor de riesgo particular.
El factor de riesgo mencionado en los
procedimientos anteriores se puede seleccionar entre una dieta
desequilibrada, tabaquismo, exposición a un entorno tóxico, una
intervención quirúrgica, ejercicio físico intenso, y enfermedades
que afecten a los riñones, pulmones, corazón, piel, cerebro,
articulaciones, tracto gastrointestinal, ojos, vasos sanguíneos,
glóbulos rojos, hígado y órganos múltiples.
Preferiblemente, las enfermedades se seleccionan
entre: transplantes, nefritis glomerular, síndrome de insuficiencia
respiratoria, asma, trombosis coronaria, quemaduras, exposición al
sol, psoriasis, dermatosis, traumas, enfermedad de Parkinson,
neurotoxinas, demencia, artritis reumatoide, diabetes, pancreatitis,
endotoxemia, isquemia intestinal, cataratas, retinopatías,
degeneración de la retina, aterosclerosis, anemia de Falconi,
malaria, inflamación, reperfusión isquémica, toxicidad a los
medicamentos, sobrecarga de hierro, deficiencia nutricional,
alcoholismo, radiación, cáncer, envejecimiento, infección por VHC y
el SIDA.
Cabe destacar que el listado de enfermedades
anterior no se limita a las indicaciones para el uso de los
procedimientos según la presente invención. Además de las
enfermedades anteriores, cualquier situación fisiológica y/o
patológica que conduce a la sobreproducción de EOA está prevista
por la presente invención.
Los marcadores de estrés oxidativo de utilidad
para la práctica de los procedimientos según la presente invención
pueden seleccionarse del grupo consistente en antioxidantes,
elementos traza, indicadores de estrés oxidativo, marcadores del
metabolismo del hierro, homocisteína, enzimas con funciones
antioxidantes, enzimas con funciones prooxidantes, enzimas
reparadores del ADN, enzimas del metabolismo del glutatión,
proteínas de estrés, proteínas implicadas en la apoptosis, factores
de transcripción, citoquinas y quimioquinas.
Preferiblemente, el antioxidante se selecciona
entre la vitamina A, vitamina C y vitamina E, glutatión reducido
(GSH)/glutatión oxidado (GSSG), tioles proteicos, glutatión
peroxidasa o superóxido dismutasa.
Preferiblemente, el elemento traza se selecciona
entre el selenio, cobre o zinc.
En una realización preferida, el indicador de
estrés oxidativo se selecciona entre anticuerpos contra las LDL
(lipoproteínas de baja densidad) oxidadas,
8-hidroxi-2'-desoxiguanosina,
mieloperoxidasa, glucosa, glioxal, y proteínas oxidadas.
Preferiblemente, el marcador del metabolismo del
hierro se selecciona entre la transferrina, ferritina y
ceruloplasmina.
Preferiblemente, los enzimas con funciones
antioxidantes se pueden seleccionar entre la catalasa, superóxido
dismutasa (SOD) que contiene Mn, SOD que contiene cobre y zinc,
tiorredoxina-1, tiorredoxina
reductasa-1, peroxirredoxina-1,
metalotioneina-1, L-ferritina y
receptor de transferrina, proteína antioxidante 2, ceruloplasmina,
lactoferrina, selenoproteína P, selenoproteína W, frataxina,
paraoxonasa sérica/aristelasa 1, paraoxonasa sérica/aristelasa 2, o
paraoxonasa sérica/aristelasa 3.
Preferiblemente, los enzimas con función
prooxidante se pueden seleccionar entre la
ciclooxigenasa-2, 5-lipoxigenasa,
c-fosfolipasa A2, fosfolipasa A alfa, fosfolipasa
D-1, mieloperoxidasa, óxido nítrico sintetasa,
proteína reactiva C, elastasa, haptoglobina,
NADH-citocromo b5 reductasa o diaforasa A1.
Preferiblemente, el enzima reparador del ADN se
puede seleccionar de la 8-oxoguanina ADN
glicosilasa.
Preferiblemente, el enzima del metabolismo del
glutatión se puede seleccionar entre la glutatión peroxidasa,
fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa
no-Se, fosfolípido, gama-glutamil
cisteína sintetasa, y glucosa 6-fosfato
deshidrogenasa, glutatión peroxidasa extracelular, glutatión
peroxidasa, glutatión peroxidasa 2, glutatión peroxidasa 4,
glutatión reductasa, glutatión S-transferasa,
glutatión sintetasa, peroxidorredoxina 1, peroxidorredoxina 2,
peroxidorredoxina 3, peroxidorredoxina 5, o tiorredoxina 2.
Preferiblemente, la proteína de estrés puede ser
una proteína HSP, hemo-oxigenasa-1,
hemo-oxigenasa-2, la proteína
ORP150 de 150 kDa regulada por oxígeno, HSP27 de 27 kDa, HSP90A,
HPS17, HPS40 o HPS110.
Preferiblemente, la proteína implicada en la
apoptosis puede ser FasL, CD95, el factor 1 de necrosis tumoral,
Bcl-2, GADD153, GADD45, RAD50, RAD51 B, RAD52,
RAD54, p53 o el ligando Fas.
Preferiblemente, el factor de transcripción se
selecciona entre la NFkB-\alpha,
C-Fos, C-jun,
IkB-\alpha, monoamina oxidasa A, monoamina
oxidasa B, o el receptor alfa activado por el proliferador de
peroxisoma.
Preferiblemente, la citoquina o la quimioquina
se seleccionan entre la IL-1, IL-6,
IL-8, IL-1beta, IL-2
o la proteína asociada al receptor de TNF1.
Las investigaciones efectuadas por los presentes
inventores han revelado que determinados marcadores de estrés
oxidativo aumentan o disminuyen en individuos portadores de ciertos
factores de riesgo.
De acuerdo con una realización preferida, los
marcadores de estrés oxidativo que aumentan o disminuyen cuando
se evalúa el factor de riesgo de la hemodiálisis, son la catalasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
HSP70, 5-lipoxigenasa, vitamina C, glutatión
peroxidasa, SOD, Se, peróxido lipídico, LDL oxidadas y
homocisteína.
El aumento o disminución puede ser tanto a nivel
transcripcional y/o a nivel de la proteína expresada.
De acuerdo con otra realización preferida, los
marcadores de estrés oxidativo que aumentan o disminuyen cuando el
factor de riesgo es la cirugía cardíaca, son la superóxido dismutasa
que contiene manganeso, c-fosfolipasa A2,
H-ferritina, IL-8, óxido nítrico
sintetasa 2 (NOS2), vitamina C, vitamina E/colesterol, glutatión
peroxidasa (GPx), anticuerpos contra las LDL y homocisteína.
De acuerdo con otra realización, los marcadores
de estrés oxidativo que aumentan o disminuyen cuando se evalúa el
factor de riesgo debido al ejercicio físico son HSP70,
NFkB-\alpha, vitamina C, relación cobre/zinc,
vitamina E/colesterol, GPx y ión sérico.
En el caso de los atletas portadores de factor
de riesgo no sólo de ejercicio físico intenso, sino también
expuestos a fatiga muscular y a lesiones, se ha observado también
que los marcadores de estrés oxidativo que aumentan o disminuyen
son la vitamina E, vitamina E/colesterol, GSH, relación GSH/GSSG,
zinc, GPx, GSSG, relación cobre/zinc, anticuerpos contra las LDL
oxidadas y proteínas oxidadas.
De acuerdo con otra realización preferida, los
marcadores de estrés oxidativo que aumentan o disminuyen cuando el
factor de riesgo está representado por el tabaquismo, son la
vitamina C, Se, GPx, anticuerpos dirigidos contra las LDL oxidadas
y homocisteína.
De acuerdo con otra realización preferida, los
marcadores de estrés oxidativo que aumentan o disminuyen cuando el
factor de riesgo se debe a una dieta deficiente en consumo de
frutas son, la vitamina C, tioles proteicos, Se, GPx, y
homocisteína.
De acuerdo a la presente invención, cuando el
procedimiento para la detección de estrés oxidativo en un individuo
está determinado según los términos ya descriptos, preferiblemente
se seleccionan no más de 22 marcadores diferentes de estrés
oxidativo para efectuar la medición de la cantidad de marcadores de
estrés oxidativo de una muestra obtenida a partir de dicho
individuo. Preferiblemente, no más de 15, más preferiblemente no
más de 10, y aún más preferiblemente, no más de 5 marcadores de
estrés oxidativo que aumentan o disminuyen en el grupo de
individuos portadores del factor de riesgo particular de dichos
individuos. Tal y como se ha descrito previamente, los presentes
inventores han observado que no todos los marcadores de estrés
oxidativo conocidos en la técnica aumentan en individuos bajo
condiciones de estrés oxidativo, sino que sólo algunos que dependen
de la condición fisiológica y/o patológica, es decir, el factor de
riesgo de los individuos aumenta. Sorprendentemente, se ha visto
que varios de los marcadores de estrés oxidativo conocidos incluso
disminuyen en dichos individuos, mientras que otros marcadores de
estrés oxidativo diferentes de éstos pueden no presentar cambios
con respecto a individuos sanos.
En los procedimientos implicados según la
presente invención, la cantidad de marcador de estrés oxidativo
puede ser determinada mediante la medición de la concentración del
marcador de estrés oxidativo, o bien mediante la medición de la
concentración de transcrito/ARNm del gen o el ADNc correspondiente
que encodifica los marcadores de estrés oxidativo.
Cuando la concentración de marcador de estrés
oxidativo se determina de forma directa, se comprende entonces
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la determinación
de dicho marcador de estrés oxidativo. El procedimientos de
determinación puede comprender procedimientos enzimáticos,
inmunoquímicos o espectroscópicos. La presente invención prevé
procedimientos de determinación directos o indirectos tales como por
ejemplo, radioinmuno ensayos.
Cuando la cantidad de marcador de estrés
oxidativo se mide mediante la determinación de la concentración del
transcrito/ARNm del gen que codifica el marcador de estrés
oxidativo, cualquier procedimiento para la determinación
cuantitativa de transcritos del gen conocido en la técnica queda
comprendido por la presente invención. Para la determinación
cuantitativa, es preferible que el ARNm sea convertido al ADNc
correspondiente mediante la reacción de transcriptasa inversa. Para
determinar el producto de PCR correspondiente, se pueden aplicar
procedimientos de PCR cuantitativos o semicuantitativos. El
procedimiento de determinación puede también implicar la hibridación
a genes o fragmentos o derivados de los mismos fijados a una matriz
sólida, tal como por ejemplo, una Northern Blot. La presente
invención también prevé el uso de procedimientos
espectroscópicos.
Es particularmente preferible que la cantidad de
por lo menos dos de los marcadores de estrés oxidativo sea
determinada en paralelo. La realización en paralelo de la
determinación ofrece la ventaja de una determinación de alta
velocidad recomendada en la práctica clínica.
En lo que respecta a esta realización, es
preferible que la determinación en paralelo de los marcadores de
estrés oxidativo sea efectuada mediante el uso de un chip de ADN
(microarray o biochip) como se conoce, por ejemplo, en van Berkum y
Holstege, Current Opinión in Biotechnology 2001, 12:
48-52. El chip utilizado para la determinación
puede presentar cualquier configuración, se prefiere que permita
duplicar, triplicar o cuadruplicar las determina-
ciones.
ciones.
En la presente invención se describe un kit de
evaluación que es adecuado para realizar el procedimiento según la
presente invención comprende reactivos capaces de determinar la
cantidad de al menos dos marcadores de estrés oxidativo.
Preferiblemente, el reactivo capaz de determinar la cantidad de
dicho marcador de estrés oxidativo es específico para dicho
marcador de estrés oxidativo.
El reactivo capaz de determinar la cantidad de
dicho marcador de estrés oxidativo es un anticuerpo. Éste puede ser
monoclonal o policlonal. Los anticuerpos monoclonales pueden ser
obtenidos mediante la inmunización de animales de laboratorio,
extrayendo los esplenocitos, y fusionándolos con células tumorales,
a fines de obtener anticuerpos específicos de marcador de estrés
oxidativo por selección según los procedimientos conocidos en la
técnica. Los anticuerpos monoclonales, los fragmentos de anticuerpos
o las moléculas de enlace, se pueden seleccionar también mediante
el uso de técnicas de expresión molecular tales como la expresión de
fagos.
El reactivo capaz de determinar la cantidad de
dicho marcador de estrés oxidativo puede, en el caso en que el
marcador de estrés oxidativo se determine mediante la concentración
de transcrito/ARNm del gen o su correspondiente ADNc mediante una
sonda que sea esencialmente complementaria a dicho transcrito/ARNm
del gen o un fragmento del mismo. Es preferible que la sonda
comprenda por lo menos 10 nucleótidos complementarios al
transcrito/ARNm del gen o un fragmento del mismo. Con el fin de
permitir la detección, la sonda puede comprender además un marcador
adecuado para la detección. El marcador puede ser radiactivo o no
radiactivo.
Por consiguiente, el kit de prueba puede
comprender un anticuerpo y/o una sonda específica para dicho
marcador de estrés oxidativo.
De acuerdo con una realización preferida, se
proporciona un procedimiento para la detección de estrés oxidativo
en una muestra de sangre, que comprende:
- la extracción de ARNm de las células de la
muestra de sangre,
- la transcripción inversa de dicho ARNm en
ADNc, con marcaje de estos compuestos de ADNc,
- la puesta en contacto de estos ADNc con una
población de varios fragmentos de ADN sintético para realizar una
hibridación molecular entre los ADNc y dichos fragmentos de ADN
sintético en caso de expresión de estrés oxidativo en las células,
y la detección simultánea de las señales de dicha hibridación, las
cuales corresponden a algunos genes expresados
donde la población de los fragmentos de Adn
sintético comprende al menos algunos fragmentos génicos que
pertenecen a la familia de los genes de marcadores de estrés
oxidativo seleccionados del grupo que consiste en:
- a.
- enzimas con funciones antioxidante, enzimas con funciones prooxidante,
- b.
- enzimas reparadores de ADN,
- c.
- enzimas del metabolismo del glutatión,
- d.
- proteínas de estrés,
- e.
- proteína simplicadas en la apoptosis,
- f.
- factores de transcripción,
- g.
- citoquinas,
- h.
- quimioquinas.
De acuerdo con una realización preferida, el
ARNm se extrae de linfocitos purificados.
Este proceso resulta ventajoso para la
evaluación en una sola etapa, mediante la genética, del SSO de un
paciente.
Una realización de la presente invención tiene
por finalidad la detección de genes expresados durante el estrés
oxidativo celular con una pluralidad de dichos ADN sintéticos
dispuestos en un soporte sólido (arrays de ADN). Se han descrito
varios soportes sólidos, y se conocen procedimientos de preparación
y uso de arrays (Cheung et al. Nature Genetics Supplement
1999, 21:15-l9; Bowtell, Nature Genetics Supplement
1999, 21:25-32; Epstein and Butow, Current Opinion
in Biotechnology 2000, 11:36-41; van Berkum and
Holstege, Hedge et al., Biotechniques 2000,
29:548-560; Current Opinion in Biotechnology 2001,
12,:48-52,). Son varios los procedimientos conocidos
que se pueden utilizar para aislar el ARN de una población de
células, para preparar los ADNc, para
post-amplificar los ADNc si es necesario (bajo
cantidad de células), y para marcar los ADNc. (Ausubel et
al., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley 1999; Wang
et al., Nature Biotechnology 2000,
18:457-459; Mansfield et al., Mol Cell
Probes 1995, 9:145-56). Una serie de variables deben
ser controladas en el análisis de expresión génica (tales como la
cantidad de material inicial, eficacias enzimáticas, eficacias de
marcaje, inhomogeneidades de la lámina portaobjetos,...) con el fin
de asegurar resultados cuantitativos apropiados. Se conocen varios
métodos de calibración que utilizan controles internos (por ejemplo,
genes "domésticos" como la \beta-actina,
ciclofilina, \beta2-microglobulina, hipoxantina
fosforibosil-transferasa-1,
ubiquitina C, GAPDH, hidroximetilbilano sintasa...) o controles
externos ("de carga") (Schuchhardt et al., Nucleic Acids
Research 1990, 28:e47; Tseng et al., Nucleic Acids Research
1991, 29:2549-2557; Yue et al Nucleic Acids
Research 2001, 29:e41). El análisis de imagen, y la corrección y
análisis de datos se encuentran integrados en una serie de
herramientas de software disponibles (Bassett et al., Nature
Genetics Supplement 1999, 21 51-55; Quackenbush,
Nature Reviews Genetics 2001, 2:418-427).
Preferiblemente, la puesta en presencia se
realiza en un chip de ADN que porta dichos fragmentos de ADN
sintéticos según una topografía específica.
El proceso también se aplica a la tecnología de
microarrays.
El chip de ADN de alta densidad permite la
evaluación de la expresión de un gran número de genes (por ejemplo,
los genes completos contenidos en el genoma de un organismo),
mientras que el chip de ADN de baja densidad permite la evaluación
de la expresión de un número inferior de genes (frecuentemente
aquellos asociados a patología). Estos chips de ADN se encuentran
en pleno desarrollo tecnológico y posibilitan la determinación en
unas pocas horas de la naturaleza y la calidad de algunos ARNm
contenidos en una célula. El uso de los chips de ADN ya ha sido
considerada no sólo en un gran número de áreas de investigación
fundamental, sino también en ciencia aplicada, por ejemplo, en el
seguimiento del cuidado de pacientes oncológicos, sujetos expuestos
a acciones tóxicas ambientales, y en casos de resistencia a la
terapia triple en pacientes infectados por el virus del SIDA. De
este modo, estos chips de ADN conocidos están destinados al análisis
de una determinada patología.
En el proceso de la invención, la población de
fragmentos de ADN sintéticos puede estar compuesta de
oligonucleótidos cuyo tamaño oscila entre 25 y 100 b, de productos
de amplificación enzimática (PCR) in vitro, o una combinación
de los mismos.
Preferiblemente, la población de fragmentos de
ADN sintéticos comprende al menos unos 50 fragmentos de genes que
pertenecen a la familia de genes seleccionados del grupo
constituyente de los enzimas que codifican para:
- enzimas con funciones antioxidantes, enzimas
con funciones prooxidantes, enzimas reparadores del ADN, enzimas
del metabolismo del glutatión, proteínas de estrés, proteínas
implicadas en apoptosis, factores de transcripción, citoquinas y
quimioquinas.
Preferiblemente, la población de fragmentos de
ADN sintéticos seleccionados comprende al menos dos genes, cada
uno perteneciente a una familia distinta entre las familias
mencionadas.
Más preferiblemente, la población de fragmentos
de ADN sintéticos comprende uno o más fragmentos de cada una de
las familias de genes mencionadas.
Como dichos enzimas antioxidantes, se encuentran
los siguientes: catalasa XM006202, superóxido dismutasa X14322 que
contiene manganeso, superóxido dismutasa X81859 que contiene cobre y
zinc, tiorredoxina-1 XM-015718,
tiorredoxina reductasa-1 XM-015673,
peroxirredoxina-1 XM-011983,
metalotionena-1 X97261, L-ferritina
XM-016853, H-ferritina
XM-017556, receptor de transferrina
XM-002788, proteína antioxidante 2
NM-004905, ceruloplasmina M13699, lactoferrina
M93150, selenoproteína P 211793, selenoproteína W U6717, frataxina
U43747, paraoxonasa sérica/arilesterasa 3 L48516.
Como enzimas con funciones prooxidantes, se
encuentran por ejemplo, los siguientes:
ciclooxigenasa-2 M90100,
5-lipoxigenasa XM-005818,
c-fosfolipasa A2 XM-007544,
fosfolipasa A alfa D16234, fosfolipasa D-1
NM-002662, mieloperoxidasa
XM-008160, óxido nítrico sintetasa-2
XM-008631,
proteína-C-reactiva X56692, elastasa
M34379, haptoglobina NM-005143, NADH citocromo b5
reductasa o diaforasa A1 Y09501.
Como dicho enzima para la reparación del ADN,
puede haber, por ejemplo, 8-oxoguanina ADN
glicosilasa humana BC000657.
Como enzimas del metabolismo del glutatión
mencionados anteriormente, se puede mencionar, por ejemplo, los
siguientes: glutatión peroxidasa X58295, fosfolípido hidroperóxido
glutatión no-Se AF090194,
gamma-glutamil cisteína sintetasa
NM-001498, y
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
XM-013149, glutatión peroxidasa extracelular 2
NM-002083, glutatión peroxidasa 4
NM-002085, glutatión reductasa X1 5722, glutatión
S-transferasa J03746, glutatión sintetasa U34683,
peroxirredoxina 1 (PRDX1) NM-002574,
peroxirredoxina 2 (PRDX2) XM-009063, peroxirredoxina
3 (PRDX3) XM-055573, peroxirredoxina 5 (PRDX5)
AF197952, tiorredoxina 2 (TRX2) AF276920.
Como proteína de estrés previamente citada, se
puede mencionar las siguientes, por ejemplo: proteína de choque
térmico M1 171 7, hemo-oxigenasa-2
D21243, proteína ORP150 de 150 kDa regulada por oxígeno U65785,
proteína de choque térmico (HSP17) de 27-kDa
U15590, proteína de choque térmico 1 (HSP40) de
40-kDa D49547, proteína de choque térmico (HSP110)
de 110-kDa D89956, ubiquitina M26880.
Como dicha proteína implicada en la apoptosis,
se puede mencionar, por ejemplo, FasL AF287593, CD95 X89101,
receptor del factor de necrosis tumoral 1 M32315,
Bcl-2 NM-000633, GADD153 S40706,
GADD45 M60974, RAD50 U63139, RAD51B Dl3804, RAD52 U12134, RAD54
X97795, p53 AF307851, Ligando Fas 38122.
Como dichos factores de transcripción, se pueden
mencionar los siguientes: IkB-\alpha,
C-Fos V01512, C-Jun J04111,
IkB-\alpha-M69043, monoamina
oxidasa A (MAOA) M68840, monoamina oxidasa B (MAOB) M69177, receptor
alfa activado por el proliferador de peroxisoma
(PPAR-alfa) L02932.
Como dichas citoquinas y quimioquinas, se pueden
mencionar, por ejemplo, IL-1
BC-008678, IL-6
BC-015511, IL-8
AF-385628, 1L-1\beta M15330,
IL-2 U25676, y la proteína asociada al receptor de
TNF1 (TRAP1) U12595.
Dichas substancias son todas conocidas y algunas
han recibido un número de acceso en las bases de datos PubMed
Central y Gene Bank, citado previamente.
Cabe señalar que esta lista no es exhaustiva,
pero sí permite, durante la aplicación de varios genes que codifican
para varias de estas substancias, efectuar un solo análisis de un
grupo de patologías diversas, teniendo cada uno un efecto que puede
ser importante, dependiendo de los casos. Por consiguiente, esto
aumenta la calidad del análisis y lo hace particularmente seguro,
lo que hasta ahora era imposible sobre la base de un único test
conocido.
En otra realización de la presente invención, la
expresión de los grupos de genes identificados por el array de ADN
se cuantifica utilizando tecnologías cuantitativas de
RT-PCR que resultan más adecuadas cuando se deben
cuantificar un número limitado de genes (habitualmente menos de 10),
o bien cuando se comienza con menos materiales (por ejemplo, menos
de 1 ml de sangre). El ARNm de los linfocitos totales se purifica
tal como se ha mencionado previamente, y los genes se cuantifican
utilizando una o una combinación de las tecnologías de
RT-PCR, según se describe por S.A. Bustin (Journal
of Molecular Endocrinology, 25, 169-193, 2000), ya
sea en reacciones separadas o en formato múltiple. El diseño de los
amplímeros y de las sondas, de las condiciones del PCR y de los
controles del ARN, y las diferentes opciones de marcaje están
descritas por S.A. Bustin (ibid.), Graber et al
(Current Opinion in Biotechnology 1998, 9:14-18),
Schweitzer y Kingsmore (Current Opinion in Biotechnology 2001,
12:21-27) y Lie y Petropoulos (Current Opinion in
Biotechnology 1998, 9:43-48). Los datos se
normalizan mediante la utilización de controles internos y
externos, de modo similar a lo que se hace con los arrays de ADN.
Los resultados se describen en concentraciones absolutas (por
ejemplo, número promedio de ARNm por linfocito). El rango de
valores normales en ausencia de estrés oxidativo se determinarán tal
como se ha mencionado anteriormente.
Aunque se ha descrito como una realización
independiente, la siguiente materia debería interpretarse como una
realización preferida de la materia anterior. La presente invención
se refiere además a un proceso que comprende además, la extracción
de ARNm mencionada anteriormente, una exposición in vitro de
las células de la muestra de sangre para factores generadores de
estrés oxidativo, preferiblemente seleccionados entre
H_{2}O_{2}, HOCI, xantina/xantina oxidasa, glucosa/glucosa
oxidasa, forbol miristato acetato, componentes azo y estrés térmico
(+41ºC), lo cual permite la evaluación de la eficacia de los
fragmentos de ADN sintéticos seleccionados antes de su
implementación en un test diagnóstico.
La presente invención se refiere además a una
evaluación global del SSO mediante la realización en paralelo del
test genómico único según la presente invención, de la
cuantificación de los marcadores sanguíneos de estrés oxidativo
presentes en la muestra.
En la presente invención se describe un kit para
la detección de estrés oxidativo para la implementación del proceso
caracterizado en que comprende:
- al menos un chip de ADN portador de dicha
población de fragmentos de ADN sintéticos.
De forma ventajosa, este kit comprende además
solución de hibridación adaptada al chip de ADN implementado, así
como posiblemente, una solución de lavado adaptada. Como control,
éste puede tener al menos un gen con un nivel de expresión
constante en cada situación de estrés oxidativo, por ejemplo,
ciclofilina, GAPDH, algo de beta-actina y ARN
ribosomal o bien un promedio de varios genes. Preferiblemente, este
kit presenta además un protocolo que detalla todos los pasos
necesarios para realizar una hibridación y para proceder a la
detección de señales de hibridación obtenidas, así como una tabla
de valores de referencia de los niveles expresados de fragmentos de
ADN depositados en dicho al menos un chip de ADN, estos niveles
correspondiendo a un valor positivo de estrés oxidativo.
Otros procedimientos y formas de realización de
la invención están indicados en las reivindicaciones.
La Figura 1 muestra la curva de distribución de
anticuerpos contra las LDL oxidadas.
La Figura 2 muestra la determinación en paralelo
de los marcadores de estrés oxidativo utilizando un ensayo de
microarray.
Una muestra de sangre (1 ml) tomada con
heparina como anticoagulante o linfocitos (10^{7} células/ml)
aislados de muestras de sangre (provenientes del kit de Nycorned
Lymphoprep, In VitroGen) se ponen en contacto a 37ºC mediante varios
sistemas de producción de estrés oxidativo 1) peróxido de hidrógeno
con una concentración que oscila entre 10^{-4} a 10^{-6}M; ii)
xantina oxidasa 0,4 U/ml/hipoxantina 2 Mm; iii) clorhidrato de
2,2'-azobis (2-amidino propano) a
una concentración de 50 Mm. El período de incubación puede variar
entre 30 minutos y 3 horas. Al final del período de incubación, la
extracción del ARN mensajero se efectúa de la sangre completa o
bien, de linfocitos mediante la utilización del kit comercial:
"\muMACS^{TM} mRNA Isolation Kit from Miltenyi Biotec,
Germany".
Los chips de ADN con SSO se crean
simultáneamente utilizando productos PCR generados por
oligonucleótidos específicos a partir de secuencias candidatas de
genes seleccionadas, por ejemplo, entre aquellas detalladas
anteriormente, así como de polinucleótidos que representan
fragmentos de estos genes. El tamaño de los productos PCR estará
comprendido en este ejemplo entre 400 y 600 pares de bases y el
tamaño de los polinucleótidos estará entre 60 y 80 bases. El sistema
utilizado para la deposición de los productos en la lámina de
vidrio es EuroGridder SDDC-2.
Los ARN mensajeros extraídos se transforman en
ADN complementarios mediante transcripción inversa. La transcriptasa
inversa es la Superscript I1 comercializada por Invitrogen/Life
Technology. El protocolo de la transcripción inversa es el que
viene con la enzima. Los ADN complementarios se amplifican a
continuación mediante PCR utilizando los oligonucleótidos
específicos de los genes seleccionados y la polimerasa Silverstar
(Eurogentec) según el protocolo provisto con la enzima. El marcaje
se efectúa durante la amplificación mediante la incorporación de
dCTP acoplado a CY3 o a CY5 (de Amersham/Pharmacia). A continuación,
los ADN complementarios se agrupan y se diluyen en una solución de
hibridación "Dig Easy Hybridization solution", comercializado
por Roche Boehringer, y se depositan sobre los chips de ADN (20
\mul por lámina portaobjetos cubierta por un cubreobjetos de 24 x
32 mm.). Las láminas se distribuyen a continuación individualmente
en cámaras de hibridación comercializadas por Corning y se incuban
durante 5 a 16 horas a 42ºC.
Después de la hibridación, los chips de ADN se
lavan dos veces sucesivas durante 5 minutos en soluciones de 0,2 x
SSC-0,1% SDS y de 0,2 x SSC a (1 x SSC = 0,15 M
NaCl - 0,015 M citrato de sodio, pH: 7,5). Las señales de
hibridación se miden con el escáner GenePix 4000A y los resultados
se tratan con el software GenePix 0.3 de Axon Instruments.
Para cada gen evaluado, se establecen valores
de referencia a partir de un rango de muestras obtenidas de 50
pacientes en buena salud. La cuantificación de la expresión del gen
se efectuará en comparación con la expresión básica de genes tales
como la ciclofilina, GAPDH, la beta-actina y el ARN
ribosomal. Estos valores se comparan con aquellos obtenidos de las
muestras de sangre sometidas a estrés oxidativo in vitro,
tal y como se ha descripto previamente.
La eficacia de los chips de ADN con SSO está
siendo evaluada preferiblemente en pacientes que presentan un
estrés oxidativo que se ha manifestado y éste en base a la
dosificación clásica en sangre.
Una vez observada la eficacia de los chips de
ADN, éstos se pueden aplicar directamente para diagnosticar una
situación de estrés oxidativo en pacientes susceptibles de padecer
dicha situación.
Con el fin de observar estrés oxidativo in
vivo, se utiliza una batería de 22 ensayos. Éstos incluyen la
determinación del antioxidante y elementos traza, el análisis de
daño oxidativo a lípidos y proteínas, y la investigación sobre el
metabolismo del hierro. El rango normal para cada ensayo se
estableció sobre una población de 123 individuos sanos y
sedentarios (de 21 a 54 años). Las muestras de sangre se extrajeron
con anticoagulantes apropiados e inmediatamente fueron
centrifugadas. Las alícuotas plasmáticas se mantuvieron a -20ºC
hasta el ensayo.
Debido a su alta labilidad, la vitamina C o
ácido ascórbico plasmático se calculó espectrofotométricamente
utilizando la reducción del colorante
2,6-diclorofenolindofenol (Merck, Alemania) después
de la estabilización con una solución de ácido metafosfórico al 10%
tal y como se ha descrito previamente (Omaye S et al.,
Methods Enzimol, 62: 3-1-1;
1979).
La concentración de vitamina E o
\alpha-tocoferol plasmática se evaluó mediante
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) sobre una columna de
fase inversa C-18 120 (100 X 4,5 mm i.d.) con una
elución isocrática con metanol/agua (98:2) y detección de radiación
ultravioleta (UV) a 280 nm, según Bieri et al. (Am. J. Clin.
Nutr. 32:2143-2149; 1979). Dado que la vitamina E se
transporta en los lípidos, el estatus de la vitamina E se expresó
como la relación Vitamina E/colesterol.
La concentración de vitamina A plasmática se
analizó por HPLC y detección UV a 325 nm, utilizando el kit provisto
por Chromsystems (Munich, Alemania).
La glutatión reducida (GSH) y la glutatión
oxidada (GSSG) se evaluaron mediante la determinación colorimétrica,
utilizando el reactivo atrapador de tioles trifluorometanosulfonato
de
1-metil-2-vinilpiridinio
(Bioxytech GSH/GSSG-412, Oxis, USA).
La concentración de grupos sulfidrilos
(P-SH) de las proteínas se evaluó en plasma mediante
el método espectrofotométrico, utilizando una reducción del ácido
5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico)
(Sigma, Steinheim, Alemania), según Ellman et al. (Arch.
Biophys. 82: 70-77; 1959).
Los enzimas glutatión peroxidasa (GPx) y la
superóxido dismutasa (SOD) se evaluaron en la sangre completa
utilizando un método espectrofotométrico adaptado a ensayos de
rutina (Randox Laboratories, Antrim, UK).
El selenio, el cobre y el zinc se midieron en
plasma en forma directa, mediante un procedimiento de espectroscopia
de absorción atómica con horno de grafito en un SP
IRAA-640 (Varian, Holanda) equipado con corrección
de fondo por efecto Zeeman (Neve J. et al., in: Bratter P;
Schamer P., eds. Trace elements analytical chemistry in medicine
and biology. Berlin: Walter de Gruyter; 1987: 1-10).
La relación cobre/zinc fue utilizada como un marcador sensible de
la presencia de estrés oxidativo in vivo (Mezzetti A. et
al., Free Rad. Biol. Med., 25; 676-681;
1998).
La concentración de peróxido lípido se determinó
mediante la reacción de los peróxidos biológicos con peroxidasa y
una posterior reacción cromática, utilizando TMB como sustrato.
Después de la adición de una solución de detención, el líquido
coloreado se midió fotométricamente a 450 nm.
Las LDL oxidadas se determinaron mediante una
técnica Elisa desarrollada por Mercodia (Uppsala, Suecia). Se basó
en la técnica de sándwich directa, en la cual dos anticuerpos
monoclonales son dirigidos contra determinantes antigénicos
separados en la molécula de apolipoproteína B oxidada.
Los autoanticuerpos contra las LDL oxidadas
(ox-LDL-Ab) se determinaron con un
inmunoensayo enzimático comercialmente disponible (Biomedica
Gruppe, Viena, Austria), originalmente desarrollado por Tatzber and
Esterbauer (en: Rice-Evans, C.; Bellomo, G. eds.
Free radicals IX. London: Richelieu Press; 1995:
245-262). Las tiras de microtitulación fueron
recubiertas con LDL oxidada con cobre (Cu2+) como antígeno. En caso
de estar presentes en plasma prediluido, los autoanticuerpos se
unen específicamente al antígeno. Después de una etapa de lavado, un
anticuerpo IgG anti-humano conjugado con peroxidasa
específico detectó la presencia de autoanticuerpos ligados. Después
de la extracción del conjugado no ligado mediante lavado, se
adicionó tetrametilbenzidina a los pocillos como sustrato
cromogénico no tóxico. La concentración de IgG específica en la
muestra se cuantificó a través de un cambio de color catalizado por
una enzima, detectable en un lector ELISA estándar.
El grado de oxidación de la proteína se
monitorizó mediante el método de Levine et al. (Methods
Enzymol. 186: 464-478; 1990), el cual utiliza la
reacción de 2,4- dinitrofenilhidrazina (DNPH) con los grupos
carbonilos de proteínas oxidadas. Los carbonilos de las proteínas
se leyeron a continuación a 370 nm y se evaluaron utilizando un
coeficiente de absorción molar de 22000 M^{-1}cm^{-1}.
El ión sérico se determinó después de la
reducción de iones férricos a iones ferrosos, los cuales reaccionan
con el reactivo ferrozina para formar un complejo de coloración
roja. La absorbancia se leyó a 572 y 660 nm (kit Merck no
19725).
La medición de ADVIA Centaur Ferritina es una
inmunodosificación de dos sitios (sándwich), que utiliza una
tecnología de quimioluminiscencia directa y una cantidad constante
de anticuerpos anti-ferritina. El primer anticuerpo
es un anticuerpo policlonal de cabra anti-ferritina,
acoplado a éster de acridinio. El segundo anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-ferritina unido
de forma covalente a partículas paramagnéticas.
La transferrina se analizó mediante un test
inmunoturbidimétrico utilizando un kit de Aptec, catálogo no
53-08004011.
La homocisteína total (tHcy) (umol/L) se midió
mediante HPLC acoplada con detección de fluorescencia, tal y como
se describe por Jacob et al. (Ann. Biol. Clin. (Paris), 55:
583-591; 1997).
Cuando el parámetro observado muestra una buena
distribución normal en la población estudiada, su valor de
referencia se define como la media \pm dos veces la desviación
estándar (SD), obtenida a partir del histograma de frecuencias
absolutas después de definir las clases adecuadas (distribución
Gaussiana optimizada por iteraciones sucesivas). Las diferencias
entre las concentraciones promedio registradas para diferentes
sub-grupos (fumadores, consumidores de frutas...)
se evaluaron mediante el "testm t de Student" para variables
independientes. Las diferencias se consideraron estadísticamente
significativas a p < 0,05. Las correlaciones se calcularon
mediante regresión múltiple de las diversas variables
independientes.
El uso de arrays de ADN (microarrays de ADNc o
microarrays de oligonucleótidos) ha sido sugerida como una poderosa
tecnología para evaluar la expresión génica antioxidante y
prooxidante. Las muestras de sangre obtenidas en reposo de 16
adultos sanos se recogieron como población de control. Con respecto
al análisis de sangre clásico, no se detectó estrés oxidativo
significativo en esta población (un máximo de dos parámetros
anormales sobre seis ensayos investigados, tal y como se muestra en
la Tabla I).
Pusimos en marcha un diseño experimental para
analizar los perfiles de expresión de linfocitos en tres condiciones
in vivo de estrés oxidativo:
A. Paciente con insuficiencia renal crónica: se
tomaron muestras de sangre antes de la hemodiálisis. Esta muestra
evaluativa fue comparada con el perfil de expresión del gen hallado
en la población control.
B. Paciente sometido a cirugía cardíaca asociada
con procedimiento de bypass cardiopulmonar; se tomaron muestras de
sangre antes (ADNc de referencia en la presente situación) y 24 h
después de la cirugía cardíaca (muestra evaluativa).
C. Seis atletas bien entrenados (cinco varones y
una mujer) participaron en una media maratón de carácter oficial;
se tomaron muestras de sangre en reposo (ADNc de referencia en la
presente situación) y 1 hora después de la competición. (muestra
evaluativa).
La preparación de linfocitos se inició 1 hora
después de la recogida de sangre.
Preparación de los ADNc: se realizó una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)primaria: 10 \mul
de mezcla de cebadores específicos 1 y 2 (vol. 1:1; véase Tabla
IIa) y 90 \mul de mezcla de PCR que contenía 20 ng de un grupo de
ADNc humano, 10X tampón EuroTaq ADN Polimerasa, 2 mM de MgCl_{2},
0,8 mM de dNTP y 0,02 U/\mul de EuroTaq ADN Polimerasa
(Eurogentec, Bélgica). La amplificación se llevó a cabo a
continuación con desnaturalización durante 5 minutos a 94ºC,
seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 min,
hibridación a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 1
min.
Las PCR amino modificadas se realizaron con 30
\mul de productos PCR primarios y 70 \mul de mezcla de PCR que
contenía 10X tampón EuroTaq ADN Polimerasa, 2 mM MgCl_{2}, 0,8 mM
dNTP y 0,02 U/\mul de EuroTaq ADN Polimerasa (Eurogentec,
Bélgica), añadidos mediante 20 pmoles de cebador inverso:
5'-GTC-CGG-GAG-CCA-TG-3'
(sec75) y 20 pmoles de cebador directo:
5'-CGA-CGC-CCG-CTG-ATA-3'
(sec76). La amplificación se llevó a cabo a continuación con
desnaturalización durante 5 min a 94ºC, seguida de 40 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 1 min, con una hibridación a 45ºC
durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 1 minuto.
Los productos de PCR
amino-modificados purificados y los oligos largos
(-65 mer, a una concentración de 10 uM; véase la Tabla IIb) se
dispusieron sobre láminas portaobjetos para microscopio Diaglass
(Advanced Array technology, Namur, Bélgica), utilizando Eurogridder
SDDC-2 robotics (Esl/Virtek).
Un total de 32 ADNc y 10 oligos largos se
dispusieron en áreas de 1 cm^{2} (Tablas IIa y IIb). Los arrays
impresos se lavaron una vez con 0,2% de SDS durante 2 min, dos veces
con agua destilada durante 2 min, y se incubaron una vez durante 5
min en una solución de borohidruro de sodio (NaBH_{4} 2,5 mg/ml
disueltos en una solución PBS/EtOH (75/25)). Los arrays se lavaron
una vez con agua destilada durante 2 min y se sumergieron en agua
destilada calentada a 95ºC durante 3 min, se secaron al aire y a
continuación se almacenaron en la oscuridad a temperatura
ambiente.
La sangre con EDTA se diluyó en primer lugar en
PBS de Dulbeco (Gibco) (1:1). Diez mililitros de sangre con
EDTA-PBS se dispusieron cuidadosamente en capas
sobre 5 ml de Lymphoprep (Axis-Shield/Oslo, Noruega)
y se centrifugaron durante 20 min a 3000 rpm. Los eritrocitos se
sedimentaron en el fondo del tubo. La mayor parte de los leucocitos
permanecieron en la capa de plasma y se extrajeron. El revestimiento
se lavó dos veces con PBS y el recuento de leucocitos se realizó en
un Cell-Dyn 1600
(Sequoia-Turner).
El ARN total fue aislado de los linfocitos
utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Alemania), según la descripción
de los fabricantes. Las concentraciones finales se monitorizaron por
espectrometría. Las transcripciones inversas (RT) se efectuaron con
1 \mug de ARN total, tampón de primera hebra 5X, 0,1 pmol/\mul
de "Specific Primer Mix" (10 \mul de todos los cebadores 1 y
los cebadores 2 añadidos mediante 290 \mul de agua libre de
ARNasa), 1,5 mM de dNTP (w/o dCTP), 0,025 mM de dCTP, 1,25 nM de
dCTP marcado con biotina y marcado con fluorescente
(PerkinElmer-life sciences, USA), 0,01 M de DTT,
1,5 ug de oligo dT, 3 \mug de oligo-dT anclado, 1
\mul de enzima Transcriptasa Inversa Superscript II RNase H
(Invitrogen, USA) y 1 \mul de Rnase OUT (Invitrogen, USA). Los
ADNc marcados con fluorescencia y biotina se agruparon, se
purificaron y se concentraron con un filtro
microcon-YM30 (Milipore, MA, USA). Las sondas
marcadas se resuspendieron a continuación en 20 \mul de tampón de
hibridación (5X SSC, 2% SDS, 20% Formamida) añadidos mediante 0,5 ul
de ADN de esperma de salmón y se aplicó lentamente bajo el
cubreobjetos del microarray del ADN. La hibridación se llevó a cabo
durante la noche a 42ºC en una cámara de hibridación (Corning, NY,
USA)
Después de la hibridación, el microarray se lavó
con 30 ml 0,5 x SSC, 0,01% SDS, y a continuación con 30 ml 0,06 x
SSC, 0,01% SDS. Por último, el microarray se lavó con 0,06 x SSC. La
señal se amplifica mediante el sistema MICROMAX de amplificación de
la señal de tiramida (TSA) (Pekín Elmer-life
sciences, USA) según la descripción del fabricante. En síntesis, la
señal de hibridación del ADNc marcado con biotina se amplificó con
peroxidasa de rábano (HRP)-estreptavidina y
Cy5-tiramida, mientras que la señal de hibridación
del ADNc marcado con fluorescencia se amplificó con HRP
anti-fluorescente y Cy3-tiramida.
Después de la amplificación de la señal y del lavado
posthibridación, el microarray del ADN se secó al aire y se detectó
mediante un escáner láser.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La detección por láser de la señal Cy3 y Cy5 en
el microarray se adquirió con un GenePix 4000 (Axon Instruments,
CA, USA). Las intensidades de la señal fluorescente y las relaciones
Cy3/Cy5 se analizaron mediante el software GenePix Pro 3.0 (Axon
Instruments, CA, USA).
Las intensidades con el fondo sustraído de todas
las hibridizaciones de ADNc y oligos se normalizaron mutuamente
mediante las relaciones de los valores totales de fluorescencia Cy3
y Cy5.
Los genes domésticos (ciclofilina,
\beta-actina y GAPDH) se utilizaron como controles
internos. Por lo tanto, las señales de hibridación de dichos genes
control en dos muestras de ARN deberían ser teóricamente iguales.
Las relaciones Cy3 con respecto a Cy5 para cada uno de estos genes
control se deben aproximar a 1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\newpage
Secuencias de cebadores
seleccionados de genes humanos utilizados para detectar el estrés
oxidativo
Secuencias de oligos largos
seleccionados de genes humanos utilizados para detectar el estrés
oxidativo
Todos los antioxidantes estudiados mostraron una
distribución normal. La Tabla III enumera los valores de referencia
para todos los antioxidantes. La concentración media para la
vitamina C resultó significativamente más elevada en las mujeres
que en los varones (9,32 \pm 4,2 vs. 6,94 \pm 3,75 ug/ml; p <
0,00001), pero con inverso resultado para la SOD (710,5 \pm 94,5
IU/g Hb en los varones vs. 666,8 \pm 72,5 IU/g Hb en las mujeres;
p < 0,05) y el ácido úrico (334,37 \pm 73,78 en los varones vs.
265,72 \pm 89,83 umol/L en las mujeres). No se observó diferencia
significativa entre los sexos para cualquier otro de los parámetros
(no mostrado).
La Figura 1 muestra una distribución levemente
disimétrica para los anticuerpos contra las LDL oxidadas. La
concentración media estimada \pm SD fue 424,19 \pm 231,26
mlU/ml. No se observó diferencia significativa entre varones y
mujeres para este parámetro. Valores superiores a 650 mlU/ml fueron
registrados en el 19,5% de los sujetos (el valor más alto fue 1580
mlU/ml). En cuanto a la homocisteína, la distribución fue también
levemente disimétrica en los valores bajos. La media \pm DS fue
11,71\pm 3,58 umol/L. Se observó una concentración de
homocisteína significativamente más elevada en las mujeres que en
los varones (12,92 \pm 4,91 vs. 10,60 \pm 3,68 umol/L; p <
0,05). La mayoría de nuestros sujetos obtuvieron valores cercanos a
la media, pero el 19,5% de ellos obtuvieron niveles que oscilaron
entre 15 y 30 umol/L. Sólo un sujeto alcanzó un nivel superior a 30
umol/L.
El análisis regresivo reveló una correlación
débil aunque negativamente significativa entre la edad, por un
lado, y las vitaminas C (r^{2}= 0,042; p = 0,021) y E (r^{2} =
0,063; p < 0,005) por el otro. Mostró una correlación positiva
entre la edad y el colesterol (r^{2} = 0,10; p < 0,0003). La
edad no afectó el nivel de homocisteína o de anticuerpos contra las
LDL oxidadas (datos no mostrados). Además, no se observó
correlación alguna ya sea entre estos factores de riesgo para
enfermedad cardiovascular y cualquier nivel antioxidante, el nivel
de colesterol, o el nivel de colesterol-LDL.
La Tabla IV muestra la influencia del tabaquismo
(el 25% de los sujetos fumaba entre 5 y 20 cigarrillos por día)
sobre todos los parámetros examinados en este estudio. En los
fumadores, el nivel medio de la vitamina C fue un 31% más bajo que
en los no-fumadores. Los niveles de selenio y de GPx
fueron también significativamente menores (al 9% y al 13%
respectivamente), pero el efecto fue menos pronunciado. No se
detectó diferencia significativa para los demás antioxidantes. En
los fumadores, el nivel de anticuerpos contra las LDL oxidadas fue
también más bajo que en los no fumadores, si bien la diferencia no
fue significativa. Los fumadores mostraron, además, un nivel más
elevado de tHcy (del orden del 13,5%) que los no fumadores,
resultando esta diferencia casi significativa
(p = 0,066).
(p = 0,066).
Los sujetos respondieron a un cuestionario
relativo al consumo de frutas (véase la distribución en la Tabla V)
y la ingesta de antioxidantes. La Tabla V muestra que los sujetos
que consumen entre 1 y 4 frutas por día obtuvieron un nivel más
elevado de vitamina C (del orden del 56,9%) (significancia: p <
0,0002) que aquellos que no consumen fruta, y un nivel más elevado
que los sujetos que consumen de 3 a 4 frutas por día (del orden del
33,9%). (significancia: p < 0,05). De los parámetros bioquímicos
restantes, sólo los niveles de PSH, selenio y GPx resultaron
asimismo más elevados en los sujetos que consumen fruta en grandes
cantidades. Por otra parte, el consumo de fruta regular se
correlacionó con un nivel significativamente reducido de tHcy.
Menos del 5% de los sujetos declaró haber ingerido complejos
vitamínicos durante la semana previa a la toma de sangre. El efecto
esencial fue un nivel de vitamina C (del orden del 29%) sobre la
media, como lo muestra la Tabla I.
Los parámetros descriptos en la sección
"material y procedimientos" fueron evaluados en cuatro
categorías de personas con riesgo de desarrollar estrés oxidativo:
pacientes hospitalizados sometidos a cirugía cardiaca con
procedimiento de bypass coronario (n = 41), pacientes con enfermedad
sometidos a diálisis a razón de 3 veces por semana (n = 10),
atletas que compiten regularmente en medias maratones (n = 6), y
jugadores de fútbol de élite (n = 11), pertenecientes al equipo
nacional francés. Las muestras sanguíneas fueron tomadas estando
todos los participantes en condiciones basales y se trataron según
los procedimientos, asumiendo la mayor exigencia de calidad posible
de los parámetros a analizar. Todos los datos fueron comparados con
aquellos obtenidos de un grupo control, integrado por 123
voluntarios sanos y sedentarios. Los números subrayados representan
valores anormales medios del ensayo estudiado que son más bajos o
más altos respecto al valor correspondiente observado en el grupo
control. Los valores en negrita se encuentran dentro del rango
normal. No obstante, el análisis individual de los datos reveló la
presencia de un número considerable de valores anormales, reflejado
por el sucesivo desvío estándar (SD).
La Tabla III muestra que el estrés oxidativo se
evidenció en forma diferente respecto del grupo investigado.
En los pacientes cardíacos, se detectaron
valores bajos en la vitamina C y en la SOD. En contraste, los
niveles de la relación vitamina E/colesterol y GPx fueron
subexpresados. En menor grado, se observó además un aumento en los
anticuerpos contra las LDL oxidadas y la homocisteína.
Los pacientes en diálisis se caracterizan por
concentraciones reducidas de la vitamina C, GPx, SOD y selenio,
mientras se observaron niveles elevados en los peróxidos lípidicos,
LDL Oxidada y homocisteína.
Los competidores de media maratón presentaron
niveles elevados de vitamina C y en la relación cobre/zinc, pero
concentraciones bajas en la relación Vitamina E/colesterol, GPx y
ión sérico.
Los jugadores de fútbol de élite obtuvieron el
peor perfil, tal como lo evidencia el gran número de parámetros
anormales: disminución en la vitamina E, relación vitamina
E/colesterol, GSH, relación GSH/GSSG, zinc y aumento en GPx, GSSG,
Cu/Zn, anticuerpos contra las LDL oxidadas y proteínas oxidadas.
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Los números subrayados representan valores
medios anormales del ensayo estudiado que son inferiores o
superiores al valor correspondiente observado en el grupo de
control. Los números en negrita están dentro del rango normal. Sin
embargo, el análisis individual de los datos revelaron la presencia
de un gran número de valores anormales reflejados por la posterior
desviación estándar (SD).
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Las señales de hibridación de los genes de
domésticos de control teóricamente deberían ser las mismas. Los
experimentos revelaron que éste no es exactamente el caso. La
relación varía de 0,3 a 2,1. Tal como propone Wong KK et al.
(Biotechniques, 2001, 30: 670-675), este problema
puede ser superado si se utiliza una relación promedio de los tres
genes domésticos cercana a 1. Por lo tanto, el resultado del control
interno para la normalización de la señal fue idéntico al de los
genes que expresan a un nivel relativamente constante en
condiciones diferentes.
Al compararlo con la población control, el
paciente regularmente sometido a diálisis renal, mostró un aumento
de la expresión del ARNm de catalasa (CAT),
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH), proteína-70 de choque térmico (HSP70) y
5-lipoxigenasa (5-LPO) (véase Tabla
I).
Al compararlo con una condición basal, se
observó una subregulación de 5 genes en los linfocitos aislados 24
h. después de la cirugía. Se incluyen: superóxido dismutasa
(Mn-SOD), c-fosfolipasa A2,
H-ferritina, Interleuquina-8
(IL-8), y óxido nítrico sintetasa 2 (NOS2). Entre
estos genes, el IL-8 fue particularmente reprimido.
En cambio, el nivel de la expresión del ARNm de catalasa (CAT), se
sobrerreguló (véase Tabla VI).
La actividad física puede elevar la temperatura
basal hasta 44ºC y las temperaturas musculares hasta 45ºC. La
protección y/o tolerancia contra la oxidación inducida por el
ejercicio, calor, citoquina, y estrés inflamatorio en leucocitos,
puede ser proporcionada parcialmente por la familia de la proteínas
de choque térmico (HPSs) (Fehrenbach E. and Niess AM. Exerc.
Immunol. Rev. 5: 57-77; 1999). Mediante el uso de
nuestro ensayo de microarray, hemos mostrado una fuerte
sobrerregulación de la HSP70 (véase Tabla VI y Figura 2). En cambio,
un gran número de genes están subrregulados, y más particularmente
el IkB-\alpha.
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Las intensidades con el ruido restado de todas
las hibridaciones de ADNc y oligo se normalizaron entre sí mediante
las relaciones de los valores totales de fluorescencia Cy3 y Cy5
(sólo los valores con una intensidad de fluorescencia de más de
1000 son significativas). Se han utilizado tres genes
"domésticos" (ciclofilina, \beta-actina y
GAPDH) como controles internos. La relación de Cy3 con respecto a
Cy5 para cada uno de estos genes de control debe ser próxima a 1.
Los números subrayados representan una subrregulación de los ARNm.
Los números en negrita representan una sobrerregulación del
ARNm.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
\bullet WO 9963341 A2 [0041]
\bullet WO 0132802 A [0042]
\bullet EP 0229674 A [0044]
\bullet BE 20010545 [0169] [0170]
\bullet EP 02762445 A [0170]
\bulletPINCEMAIL J et al.
Determination of plasmatic concentrations in antioxidants,
antibodies against oxidized LDL, and homocystein in a sampling of
Liege population. Annales De Biologie Clinique, March
2000, vol. 58 (2), 177-185 [0040]
\bulletNAPOLI CALUDIO et al.
Múltiple role of reactive oxygen species in the arterial wall.
Journal of Cellular Biochemistry, 19 June 2001, vol.
82 (4), 674-682 [0043]
\bullet Overexpression of hMTH1 mRNA: a
molecular marker of oxidative stress in lung cancer cells.
KENNEDA C H; CUETO R; BELINSKY S A;
LECHNER J F; PRYOR W. FEBS Letters. Elsevier Science
Publishers, 05 June 1998, vol. 429,
17-20
\bulletWEIGEL A L et al.
Microarray analysis of tert-butyl hydroperoxide and
hydrogen peroxide induced gene expression in
ARPE-19 cells. IOVS, 15 March 2001,
vol. 42 (4), S754 [0046]
\bulletBERKUM; HOLSTEGE.
Current Opinion in Biotechnology, 2001, vol. 12,
48-52 [0098]
\bulletCHEUNG et al. Nature
Genetics Supplement, 1999, vol. 21, 15-19
[0106]
\bulletBOWTELL. Nature Genetics
Supplement, 1999, vol. 21, 25-32
[0106]
\bulletEPSTEIN; BUTOW.
Current Opinion in Biotechnology, 2000, vol. 11,
36-41 [0106]
\bullet VAN BERKUM; HOLSTEGE;
HEDGE et al. Biotechniques, 2000, vol.
29, 548-560 [0106]
\bulletCurrent Opinion in
Biotechnology, 2001, vol. 12, 48-52
[0106]
\bulletAUSUBEL et al. Short
Protocols in Molecular Biology. Wiley, 1999 [0106]
\bulletWANG et al. Nature
Biotechnology, 2000, vol. 18, 457-459
[0106]
\bulletMANSFIELD et al. Mol
Cell Probes, 1995, vol. 9, 145-56
[0106]
\bulletSCHUCHHARDT et al.
Nucleic Acids Research, 1990, vol. 28, e47 [0106]
\bulletTSENG et al. Nucleic
Acids Research, 1991, vol. 29, 2549-2557
[0106]
\bulletYUE et al. Nucleic
Acids Research, 2001, vol. 29, e41 [0106]
\bulletBASSETT et al. Nature
Genetics Supplement, 1999, vol. 21, 51-55
[0106]
\bulletQUACKENBUSH. Nature Reviews
Genetics, 2001, vol. 2, 418-427
[0106]
\bullet S. A. BUSTIN. Journal of
Molecular Endocrinology, 2000, vol. 25,
169-193 [0124]
\bulletGRABER et al. Current
Opinion in Biotechnology, 1998, vol. 9,
14-18 [0124]
\bulletSCHWEITZER; KINGSMORE.
Current Opinion in Biotechnology, 2001, vol. 12,
21-27 [0124]
\bulletLIE; PETROPOULOS.
Current Opinion in Biotechnology, 1998, vol. 9,
43-48 [0124]
\bulletOMAYE S et al.
Methods Enzymol., 1979, vol. 62, 3-11
[0138]
\bulletBIERI et al. Am. J.
Clin. Nutr., 1979, vol. 32, 2143-2149
[0139]
\bulletELLMAN et al. Arch.
Biophys., 1959, vol. 82, 70-77 [0142]
\bulletNÈVE J.; WALTER DE
GRUYTER et al. Trace elements analytical chemistry in
medicine and biology. 1987, 1-10 [0144]
\bulletMEZZETTI A. et al.
Free Rad. Biol. Med., 1998, vol. 25,
676-681 [0144]
\bulletLEVINE et al. Methods
Enzymol., 1990, vol. 186, 464-478
[0147]
\bulletJACOB et al. Ann.
Biol. Clin. (Paris, 1997, vol. 55,
583-591 [0149]
\bulletWONG KK et al.
Biotechniques, 2001, vol. 30, 670-675
[0165]
\bulletFEHRENBACH E.; NIESS AM.
Exerc. Immunol. Rev., 1999, vol. 5,
57-77 [0168]
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Probiox SA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la detección de estrés
oxidativo y el kit para la implementación de este proceso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> seqprobio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> BE 2001/0545
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-08-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipgatatggatc acatactttc aagctgg
\hfill27
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<210> 2
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill25
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<210> 3
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hskip-.1em\dddseqskipgtggtggtca tatcaatcat agcatt
\hfill26
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<210> 4
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<212> ADN
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\hfill27
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\hfill23
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<210> 6
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\hfill23
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\hfill23
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\hskip-.1em\dddseqskipccaccttttg tcccttctta aaa
\hfill23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill26
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipgggattatct gtttcactac caggt
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<212> ADN
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\hfill24
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttatacact cctgtgaatg gatctatag
\hfill29
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacatagtg atctggttct acaaag
\hfill26
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<210> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill25
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatatccag tttgatagtg aaaaagg
\hfill27
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill23
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipctcatcctgt cattggacta caacc
\hfill25
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<211> 24
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill29
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcacatcatag taagcaataa gtaagtc
\hfill27
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<210> 27
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill29
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill24
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatactgctc catcagtttc ctc
\hfill23
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<211> 28
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill28
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgtactta tccatgcaga caac
\hfill24
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill25
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgtgccaca tatggacatc cac
\hfill23
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<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacaagagaa gtcgaagatg gac
\hfill23
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcctgta gtgcattcag ttc
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagactcatgg ggcattctct tct
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaccaaa aataaacacc acac
\hfill24
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatttataga aacatttact gaggatgatg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtctattga gtcatatcgg gattt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctatgtgga gaatgagagg tggg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataaatatag gggatgggct tgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggtgct gaccaagatg aag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgatgtcc ttcttgtgtt ttc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgacgaa agacaacaat ctg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatgacctc ttgacacttg tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggcagagg gtgatagaag agg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtgtaagg acccatcgga gaa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctacactta gcctctatcc atgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaggtttt ctagtgtcag ctg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagacagacc aactagaaga tgaga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagaaggac ccagataggt cca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataaagacat actccaaacc tttcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtccactct caatcactct cag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttaaatatg tgaagctgag ttaatttatg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
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<110> Probiox SA
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<120> Proceso para la detección de estrés
oxidativo y el kit para su implementación
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<130> seqprobio
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<140> EP 02762445.1
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2002-08-13
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<150> BE 2001/0545
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<151>
2001-08-14
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<160> 76
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill27
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagggagga aaatagggtt ctc
\hfill23
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<210> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskipctcatcctgt cattggacta caacc
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill25
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill30
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtctattga gtcatatcgg gattt
\hfill25
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<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataaatatag gggatgggct tgg
\hfill23
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggtgct gaccaagatg aag
\hfill23
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<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgatgtcc ttcttgtgtt ttc
\hfill23
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgacgaa agacaacaat ctg
\hfill23
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatgacctc ttgacacttg tcc
\hfill23
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<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggcagagg gtgatagaag agg
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtgtaagg acccatcgga gaa
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctacactta gcctctatcc atgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaggtttt ctagtgtcag ctg
\hfill23
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<210> 51
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagacagacc aactagaaga tgaga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagaaggac ccagataggt cca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataaagacat actccaaacc tttcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtccactct caatcactct cag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
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\hskip-.1em\dddseqskiptttaaatatg tgaagctgag ttaatttatg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgccattt attggtataa aaacc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaagaaag taatgacaaa atacctg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 58
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\hskip-.1em\dddseqskipaaattgcatg gtgaagtcag ttata
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 59
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
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\hfill31
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
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\hskip-.1em\dddseqskipcgacgcccgc tgatatggcc tccacaatat t
\hfill31
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<210> 61
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 61
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\hskip-.1em\dddseqskipctcttccagc cttccttcct
\hfill20
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<210> 62
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
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\hskip-.1em\dddseqskipcaccttcacc gttccagttt
\hfill20
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<210> 63
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 63
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\hskip-.1em\dddseqskipcgagatccct ccaaaatcaa
\hfill20
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<210> 64
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagcttgac aaagtggtcg
\hfill20
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<210> 65
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 65
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<210> 66
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 66
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<210> 67
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<211> 62
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 67
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<210> 68
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 68
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<210> 69
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<211> 63
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
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<210> 70
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 70
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<210> 71
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 71
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<210> 72
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 72
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<210> 73
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 75
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 75
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\hfill14
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<210> 76
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacgcccgc tgata
\hfill15
Claims (37)
1. Procedimiento para determinar marcadores de
estrés oxidativo en un grupo de individuos, que comprende las
etapas de:
- a.
- la determinación del factor de riesgo de un estrés oxidativo en dicho grupo;
- b.
- la medición de la cantidad de al menos 10 marcadores diferentes de estrés oxidativo de una muestra obtenida de cada uno de dicho grupo de individuos; y
- c.
- la comparación de la cantidad de cada uno de dichos marcadores de estrés oxidativo con la cantidad de cada uno de dichos marcadores de estrés oxidativo medidos en un grupo de individuos sanos, determinando así los marcadores de estrés oxidativo que hayan aumentado o disminuido en dicho grupo de individuos portadores de un factor de riesgo de estrés oxidativo respecto a individuos sanos.
2. Procedimiento para la detección de estrés
oxidativo en un individuo portador de un factor de riesgo de estrés
oxidativo, que comprende:
- a.
- la determinación del factor de riesgo de estrés oxidativo de dicho individuo;
- b.
- la selección de al menos dos marcadores de estrés oxidativo que hayan aumentado o disminuido para dicho factor de riesgo respecto a individuos sanos; y
- c.
- la medición de la cantidad de al menos dos de dichos marcadores oxidativos de una muestra obtenida de dicho individuo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, que
comprende además la etapa de evaluación del resultado en el
contexto de dicho factor de riesgo.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en donde se seleccionan no más de 22, preferiblemente no más de 15,
más preferiblemente no más de 10, y el más preferible no más de 5
marcadores diferentes de estrés oxidativo.
5. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el factor de riesgo se selecciona
entre: una dieta desequilibrada; tabaquismo, exposición a un entorno
tóxico, una intervención quirúrgica; actividad física intensa, y
enfermedades que afecten a los riñones, pulmones, corazón, piel,
cerebro, articulaciones, tracto gastrointestinal, ojos, vasos
sanguíneos, glóbulos rojos, hígado y órganos múltiples.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
donde las enfermedades se seleccionan entre un transplante,
glomerulonefritis, síndrome de insuficiencia respiratoria, asma,
trombosis coronaria, quemaduras, exposición al sol, psoriasis,
dermatosis, traumas, enfermedad de Parkinson, neurotoxinas,
demencia, artritis reumatoide, diabetes, pancreatitis, endotoxemia,
isquemia intestinal, cataratas, retinopatía, degeneración de la
retina, aterosclerosis, anemia de Falconi, malaria, inflamación,
reperfusión isquémica, toxicidad a los medicamentos, sobrecarga de
hierro, deficiencias nutricionales, alcoholismo, radiación, cáncer,
envejecimiento, infección por VHC y el SIDA.
7. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde el marcador de estrés oxidativo se
selecciona a partir del grupo consistente de: antioxidantes,
elementos traza, indicadores de estrés oxidativo, marcadores del
metabolismo del hierro, homocisteína, enzimas con funciones
antioxidantes, enzimas con funciones prooxidantes, enzimas
reparadores del ADN, enzimas del metabolismo del glutatión,
proteínas de estrés, proteínas implicadas en apoptosis, factores de
transcripción, citoquinas y quimioquinas.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde el antioxidante se selecciona entre: la vitamina A, vitamina
C, vitamina E, glutatión reducido (GSH)/glutatión oxidado (GSSG),
tioles proteicos, glutatión peroxidasa o superóxido dismutasa.
9. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde el elemento traza se selecciona entre el selenio, cobre y
zinc.
10. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde el indicador de estrés oxidativo se selecciona entre:
anticuerpos contra la LDL oxidada, 8-hidroxi
2'-desoxiguanosina, mieloperoxidasa, glucosa y
glioxal.
11. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde el marcador del metabolismo del hierro se selecciona entre la
transferrina, ferritina y ceruloplasmina.
12. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde los enzimas con función antioxidante se pueden seleccionar
entre: la catalasa, superóxido dismutasa (SOD) que contiene Mn, la
SOD que contiene cobre y zinc, la tiorredoxina-1,
tiorredoxina reductasa-1,
peroxirredoxina-1, metalotionina-1,
L-ferritina, H- ferritina y el receptor de la
transferrina, proteína antioxidante 2, ceruloplasmina, lactoferrina,
selenoproteína P, selenoproteína W, frataxina, paraoxonasa
sérica/arilesterasa 1, paraoxonasa sérica/arilesterasa 2 o
paraoxonasa sérica/arilesterasa 3.
13. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde los enzimas con funciones prooxidantes se pueden elegir
entre: la ciclooxigenasa-2,
5-lipoxigenasa, c-fosfolipasa A2,
fosfolipasa A alfa, fosfolipasa D-1,
mieloperoxidasa, óxido nítrico sintetasa, proteína reactiva C,
elastasa, haptoglobina, NADH-citocromo b5 reductasa
o diaforasa A1.
14. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde el enzima reparador del ADN se puede seleccionar de
8-oxoguanina ADN glicosilasa.
15. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde el enzima del metabolismo del glutatión se puede seleccionar
entre la glutatión peroxidasa, fosfolípido hidroperóxido glutatión
peroxidasa no-Se, fosfolípido,
gama-glutamil cisteína sintetasa, y glucosa
6-fosfato deshidrogenasa, glutatión peroxidasa
extracelular, glutatión peroxidasa, glutatión peroxidasa 2,
glutatión peroxidasa 4, glutatión reductasa, glutatión
S-transferasa, glutatión sintetasa, peroxirredoxina
1, peroxirredoxina 2, peroxirredoxina 3, peroxirredoxina 5, o
tiorredoxina 2.
16. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde la proteína de estrés puede ser una proteína HSP, hemo
oxigenasa-1, hemo oxigenasa-2, la
proteína ORP150 regulada por oxígeno de 150 kDa, o HSP27 de kDa,
HSP90A, HPS17, HPS40 o HPS110.
17. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde la proteína implicada en la apoptosis puede ser FasL, CD95,
el receptor 1 del factor de necrosis tumoral, Bcl-2,
GADD153, GADD45, RAD50, RAD51 B, RAD52, RAD54, p53 o el ligando
Fas.
18. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde el factor de transcripción se selecciona entre
NFkB-\alpha, C-Fos, C-jun,
IkB-\alpha, monoamina oxidasa A, monoamina oxidasa B,
receptor alfa activado por el proliferador de peroxisoma.
19. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde la citoquina o la quimioquina se selecciona entre
IL-1, IL-6, IL-8,
IL-1 beta, IL-2 o la proteína
asociada al receptor de TNF1.
20. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, cuando el factor de riesgo de dicho
individuo es la hemodiálisis, el marcador oxidativo se selecciona
del grupo de: catalasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
HSP70, 5-lipoxigenasa, vitamina C, glutatión
peroxidasa, SOD, Se, peróxido lipídico, LDL oxidada y
homocisteína.
21. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, cuando el factor de riesgo de dicho
individuo es una intervención quirúrgica cardíaca, el marcador
oxidativo se selecciona entre el grupo de superóxido dismutasa que
contiene manganeso, c-fosfolipasa A2,
H-ferritina, IL-8, óxido nítrico
sintasa 2 (NOS2), vitamina C, vitamina E/colesterol, glutatión
peroxidasa (GPx), anticuerpos contra la LDL oxidada y
homocisteína.
22. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, cuando el factor de riesgo de dicho
individuo es un ejercicio físico intenso, el marcador oxidativo se
selecciona del grupo de vitamina E, vitamina E/colesterol, GSH,
relación GSH/GSSG, el zinc, GPx, GSSG, relación cobre/zinc,
anticuerpos contra la LDL oxidada y proteínas oxidadas.
23. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, cuando el factor de riesgo de dicho
individuo es la fatiga debida a un ejercicio físico y a lesiones, el
marcador oxidativo se selecciona del grupo de vitamina E, vitamina
E/colesterol, GSH, relación GSH/GSSG, zinc, GPx, GSSG, relación
cobre/zinc, anticuerpos contra la LDL oxidada y proteínas
oxidadas.
24. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, cuando el factor de riesgo de dicho
individuo es el tabaquismo, el marcador oxidativo se selecciona del
grupo de vitamina C, Se, GPx, anticuerpos contra la LDL oxidada y
homocisteína.
25. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en donde la cantidad de marcador de estrés
oxidativo está determinada por la medición de la concentración del
marcador oxidativo.
26. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en donde la cantidad se determina mediante
la medición de la concentración del producto de transcripción del
gen/ARNm que codifica el marcador oxidativo.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en
donde la cantidad de por lo menos dos de dichos marcadores de
estrés oxidativo se determina en paralelo.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en
donde la cantidad de marcador de estrés oxidativo se calcula
mediante el uso de un chip de ADN.
29. Procedimiento para la detección de estrés
oxidativo en una muestra de sangre, caracterizado porque
comprende: a. la extracción de ARNm de células de la muestra de
sangre, b. la transcripción inversa de dicho ARNm en ADNc, con
marcaje de estos compuestos de ADNc, c. la puesta en contacto de
estos ADNc con una población de varios fragmentos sintéticos de ADN
a fin de realizar una hibridación molecular entre el ADNc y dichos
fragmentos sintéticos de ADN en el caso de la expresión del estrés
oxidativo en las células, y la detección simultánea de las señales
de dicha hibridación, las cuales corresponden a ciertos genes
expresados, en donde la población de fragmentos sintéticos de ADN
comprende al menos ciertos fragmentos de genes perteneciente a la
familia de genes de marcadores de estrés oxidativo, seleccionados
del grupo consistente en:
- a.
- enzimas con funciones antioxidantes, enzimas con funciones prooxidantes,
- b.
- enzimas reparadores del ADN.
- c.
- enzimas del metabolismo del glutatión,
- d.
- proteínas de estrés,
- e.
- proteínas implicadas en apoptosis,
- f.
- factores de transcripción.
- g.
- citoquinas,
- h.
- quimioquinas.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en
donde dicha muestra de sangre es una preparación de linfocitos.
31. Procedimiento según la reivindicación 29 ó
30, caracterizado porque la puesta en presencia se realiza
sobre un conjunto de chips de ADN que transporta dichos fragmentos
sintéticos de ADN según una topografía específica.
32. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 29 a 31, caracterizado porque la población
de fragmentos sintéticos de ADN está compuesta por
oligonucleótidos de tamaño entre 25 y 100 pb.
33. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 29 a 32, caracterizado porque la población
de fragmentos sintéticos de ADN está compuesta por productos de
una amplificación enzimática (PCR) in vitro.
34. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 29 a 33, caracterizado porque la población
de fragmentos sintéticos de ADN está compuesta por oligonucleótidos
de tamaño entre 25 y 100 pb, y por productos que provienen de una
amplificación enzimática (PCR) in vitro.
35. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 29 a 34, caracterizado porque la población
de fragmentos sintéticos de ADN seleccionados comprende al menos
dos genes, cada uno de los cuales pertenece a una familia distinta
entre las familias precitadas.
36. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 29 a 35, caracterizado porque comprende
además, antes de dicha extracción de ARNm, una exposición in
vitro de células de la muestra de sangre a factores
generadores de estrés oxidativo.
37. Procedimiento según cualesquiera de las
reivindicaciones 29 a 36, caracterizado porque comprende en
paralelo una cuantificación de marcadores de estrés oxidativo en
sangre.
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| CA2507415A1 (en) * | 2002-11-21 | 2004-06-03 | The University Of Leicester | Bodily fluid markers of tissue hypoxia |
| WO2005020984A2 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Aaipharma Inc. | Method of reducing the risk of oxidative stress |
| GB0409153D0 (en) * | 2004-04-23 | 2004-05-26 | Randox Lab Ltd | Method of diagnosis |
| ES2315034B1 (es) * | 2004-07-02 | 2009-12-30 | Laboratorios Indas, S.A. | Proteina de choque termico 27 (hsp-27) como marcador de enfermedad cardiovascular. |
| US20080312128A1 (en) * | 2005-04-29 | 2008-12-18 | Edward Chaum | Cellular Biomarker Antioxidant Assay and Uses Thereof |
| FR2894030B1 (fr) * | 2005-11-30 | 2008-07-04 | Michel Brack | Procede de determination d'un score representatif du stress oxydatif d'un patient, sur une echelle de 0 a 10 |
| CN101473042A (zh) * | 2006-05-31 | 2009-07-01 | 健康研究股份有限公司 | 预测放射性肺炎易感性的方法 |
| WO2008019060A2 (en) * | 2006-08-03 | 2008-02-14 | U.S. Department Of Veterans Affairs Office Of General Counsel-Psg Iv (024) | Method for predicting onset/risk of atrial fibrillation (af) |
| FR2923609A1 (fr) | 2007-11-13 | 2009-05-15 | Thierry Patrice | Test pour la mesure de la resistance au stress oxydant et ses applications |
| AU2008326426A1 (en) * | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Bionovo, Inc. | Methods of detecting and treatment of cancers using scuttelaria barbata extract |
| WO2012094580A2 (en) * | 2011-01-07 | 2012-07-12 | High Point Pharmaceuticals, Llc | Compounds that modulate oxidative stress |
| US8937213B2 (en) | 2011-05-21 | 2015-01-20 | Christopher E. Hopkins | Transgenic biosensors |
| ES2657552T3 (es) | 2011-09-08 | 2018-03-05 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Nuevos biomarcadores de riesgo para el cáncer de pulmón |
| RU2534821C2 (ru) * | 2012-05-18 | 2014-12-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" | Способ диагностики окислительного стресса измерением экспрессии кислородчувствительных генов (варианты) |
| EP2931238A2 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | The Procter & Gamble Company | Antiperspirant and deodorant compositions |
| US20150328337A1 (en) * | 2012-12-19 | 2015-11-19 | The Johns Hopkins University | Protection from oxidative damage by gene transfer by glutamate cysteine ligase and glutathione synthase |
| JP6296667B2 (ja) * | 2013-03-15 | 2018-03-20 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 被験者のフケを診断するための非侵襲的方法 |
| RU2545900C2 (ru) * | 2013-05-07 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт кардиологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Способ диагностики апоптоза лимфоцитов |
| RU2540500C2 (ru) * | 2013-05-07 | 2015-02-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт кардиологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Способ прогнозирования ранней стадии апоптоза |
| US9995758B1 (en) * | 2014-10-31 | 2018-06-12 | Western Autotroph Company LLC | Methods and systems for controlling oxidative stress in humans and animals |
| WO2016077467A1 (en) * | 2014-11-11 | 2016-05-19 | The Johns Hopkins University | Biomarkers useful in the treatment of subjects having diseases of the eye |
| US10858422B2 (en) | 2016-05-31 | 2020-12-08 | Abcentra, Llc | Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody |
| US10434141B2 (en) | 2016-05-31 | 2019-10-08 | Abcentra, Llc | Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody |
| AU2018338103B2 (en) | 2017-09-20 | 2020-07-16 | Nacuity Pharmaceuticals, Inc. | Method for preparation of N-acetyl cysteine amide and derivatives thereof |
| US11548851B2 (en) | 2017-09-20 | 2023-01-10 | Nacuity Pharmaceuticals, Inc. | Method for preparation of n-acetyl cysteine amide and derivatives thereof |
| US11091433B2 (en) | 2017-09-20 | 2021-08-17 | Nacuity Pharmaceutials, Inc. | Method for preparation of N-acetyl cysteine amide and derivatives thereof |
| US20190135741A1 (en) | 2017-11-09 | 2019-05-09 | Nacuity Pharmaceuticals, Inc. | Methods of Making Deuterium-Enriched N-acetylcysteine Amide (D-NACA) and (2R, 2R')-3,3'-Disulfanediyl BIS(2-Acetamidopropanamide) (DINACA) and Using D-NACA and DINACA to Treat Diseases Involving Oxidative Stress |
| CN109797133A (zh) * | 2019-01-09 | 2019-05-24 | 珠海金肽生物科技有限公司 | 多潜能细胞培养组合物及制备方法和应用 |
| EP3908341A4 (en) | 2019-01-11 | 2022-03-02 | NaCuity Pharmaceuticals, Inc. | TREATMENT OF AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION, GLAUCOMA AND DIABETIC RETINOPATHY WITH N-ACETYLCYSTEINE AMIDE (NACA) OR (2R,2R')-3,3'-BIS(2-ACETAMIDOPROPANAMIDE) DISULFANEDIYL (DINACA) |
| CN112684020B (zh) * | 2020-12-01 | 2023-12-29 | 哈尔滨医科大学 | 一种用于评价个体锌营养状态的生物标志物及其应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3750093T2 (de) * | 1986-01-17 | 1995-01-26 | Daniel G Miller | Test zur Feststellung der Empfänglichkeit für DNS-assoziierte Krankheiten. |
| EP0942969A1 (en) * | 1996-11-12 | 1999-09-22 | Qbi Enterprises Ltd. | Method for identifying translationally regulated genes |
| WO1998053103A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | Clontech Laboratories, Inc. | Nucleic acid arrays |
| JP2002514441A (ja) * | 1998-05-11 | 2002-05-21 | クアーク バイオテク インコーポレイテッド | 遺伝子の同定方法 |
| WO1999060164A1 (en) * | 1998-05-15 | 1999-11-25 | Quark Biotech, Inc. | Mechanical stress induced genes, expression products therefrom, and uses thereof |
| WO1999063341A2 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-09 | Nikken Foods Co., Ltd. | Use of oxidative stress diagnostic plot as a health indicator for assessing oxidative stress and its control in humans |
| WO2000009750A1 (en) * | 1998-08-14 | 2000-02-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositons, kits, and methods for hydrodynamic stress-related regulation of gene expression |
| WO2000065095A2 (en) * | 1999-04-23 | 2000-11-02 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods and compositions for performing array based hybridization assays |
| US6607885B1 (en) * | 1999-10-15 | 2003-08-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for high-density microarray medicated gene expression profiling |
| WO2001032802A1 (en) | 1999-10-29 | 2001-05-10 | The Cleveland Clinic Foundation | Method and apparatus for predicting male infertility |
| WO2001046468A2 (en) * | 1999-12-21 | 2001-06-28 | Eirx Therapeutics Ltd | Screening method for ros-induced apoptosis in a cell |
| US6541265B2 (en) * | 2001-05-09 | 2003-04-01 | University Of Florida | Method and system to test a substance for inflammatory or oxidant properties |
| AU2003207552A1 (en) * | 2002-01-29 | 2003-09-02 | James D. Talton | Methods of collecting and analyzing human breath |
-
2001
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