ES2315034B1 - Proteina de choque termico 27 (hsp-27) como marcador de enfermedad cardiovascular. - Google Patents
Proteina de choque termico 27 (hsp-27) como marcador de enfermedad cardiovascular. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína de choque térmico 27
(HSP-27) como marcador de enfermedad
cardiovascular.
La presente invención se refiere a un método de
diagnóstico in vitro útil para identificar un perfil de
riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o para pronosticar la
evolución de un trastorno o evento cardiovascular y/o para evaluar
la eficacia de tratamiento reductor del riesgo de trastorno o
evento cardiovascular, mediante la determinación de la proteína de
choque térmico-27 (HSP27, Heat Shock
Protein-27).
Description
Proteína de choque térmico 27
(HSP-27) como marcador de enfermedad
cardiovascular.
La invención se relaciona en general con el
diagnóstico de enfermedades cardiovasculares. En particular, se
refiere a un método de diagnóstico in vitro para identificar
el riesgo de sufrir un trastorno o evento cardiovascular.
Las enfermedades cardiovasculares tienen una
gran relevancia en los países occidentales ya que además de ser la
causa principal de mortalidad (1), originan un alto grado de
discapacidad y una gran repercusión socioeconómica, por lo que su
prevención es un área de gran importancia para la salud pública. El
término enfermedad cardiovascular designa enfermedades cardíacas y
de los vasos sanguíneos incluyendo aterosclerosis, enfermedades
coronarias, cerebrovasculares e hipertensión arterial, entre
otros.
Algunos trastornos cardiovasculares como infarto
de miocardio o isquemia están asociados con la aterosclerosis. En
el proceso de aterogénesis, el acúmulo de lípidos en la pared
vascular, secundario a la disfunción endotelial, actúa como un
estímulo desencadenante de una reacción que llevará a la formación
de una cápsula fibrosa que envolverá a un núcleo lipídico central.
Las placas pueden complicarse con la formación de un trombo que, si
ocluye total ó parcialmente el vaso, dará lugar a un síndrome
coronario agudo: angina inestable, infarto agudo de miocardio ó
muerte súbita.
Es importante destacar que aunque se han hecho
grandes avances en el conocimiento de los mecanismos involucrados
en este proceso, no se está utilizado en la actualidad ningún
marcador en el diagnóstico de esta enfermedad. Se han realizado
multitud de estudios analizando diversas proteínas séricas y sólo
la proteína C reactiva (C Reactive Protein; CRP), un marcador
general de inflamación, parece tener cierto valor predictivo de
enfermedad vascular (2-7). Recientemente se ha
demostrado que durante los estadios tempranos de la aterosclerosis
carotídea, la concentración de CRP es un marcador de la actividad
más que de la extensión de la aterosclerosis (8). Además, estudios
recientes parecen sugerir que la CRP puede ser más un mediador de
la aterosclerosis que un marcador de la enfermedad
(9-13). A pesar de esto, datos recientes muestran
que su capacidad predictiva es moderada (14), y sigue sin ser usada
en la práctica habitual en la mayoría de los centros
hospitalarios.
Las proteínas de choque térmico o "Heat Shock
Proteins" (HSPs) se producen en grandes cantidades por las
células como respuesta al estrés mecánico, a la estimulación con
citoquinas o a las altas temperaturas, para protegerse de estas
condiciones adversas. (15). Las HSPs se clasifican por su tamaño
molecular, incluyendo la HSP27, HSP60, HSP70 y HSP90, entre otras
(16). En los últimos años, se ha evidenciado la participación de las
HSPs en el proceso aterosclerótico. Así, se ha observado que las
HSPs están expresadas en las lesiones ateroscleróticas
(17-19), aunque el papel que desempeñan estas
proteínas en la aterosclerosis no está totalmente aclarado.
La identificación temprana de pacientes con
riesgo de desarrollar un trastorno o evento cardiovascular sería de
gran importancia ya que disminuiría la mortalidad y morbilidad
asociada a esta enfermedad. La existencia en los servicios
hospitalarios de tests específicos para el estudio de riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, podría ser de gran ayuda para la
prevención y posible profilaxis de dicha enfermedad.
La presente invención proporciona un método
in vitro de diagnóstico y/o pronóstico para identificar un
perfil de riesgo de enfermedad cardiovascular de manera rápida,
sencilla y eficaz. Esta invención es útil para identificar
individuos con riesgo de sufrir un trastorno cardiovascular y útil
para evaluar la eficacia de los tratamientos con fármacos que
reducen el riesgo de trastorno cardiovascular.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un método de
diagnóstico in vitro para identificar un perfil de riesgo de
trastorno o evento cardiovascular y/o pronosticar la evolución de un
trastorno cardiovascular y/o un método in vitro para evaluar
la eficacia de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o
evento cardiovascular, mediante la determinación de la proteína de
choque térmico-27 (HSP27, Heat Shock
Protein-27).
Un objeto de la invención lo constituye un
método de diagnóstico in vitro para identificar un perfil de
riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o pronosticar la
evolución de un trastorno o evento cardiovascular mediante la
determinación de los niveles de la proteína HSP27, en particular la
determinación de los niveles de la proteína se realiza en una
muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la proteína
HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un método de diagnóstico in vitro para
identificar un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular
y/o pronosticar la evolución de un trastorno o evento
cardiovascular mediante la determinación de los niveles de la
proteína HSP27, en una muestra biológica, donde la alteración de los
niveles de la proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, la muestra
biológica es un fluido fisiológico, más particularmente es sangre,
suero, plasma u orina.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un método de diagnóstico in vitro para
identificar un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular
y/o pronosticar la evolución de un trastorno o evento
cardiovascular mediante la determinación de los niveles de la
proteína HSP27, en una muestra biológica, donde la alteración de los
niveles de la proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, la muestra
biológica es un extracto celular, o un cultivo celular, o
células.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un método de diagnóstico in vitro para
identificar un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular
y/o pronosticar la evolución de un trastorno o evento
cardiovascular mediante la determinación de los niveles de la
proteína HSP27, en una muestra biológica, donde la alteración de los
niveles de la proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, la muestra
biológica es un tejido o extracto tisular.
La presente invención proporciona un test de
diagnóstico in vitro para identificar un perfil de riesgo de
trastorno o evento cardiovascular y/o pronosticar la evolución de un
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27.
Un objeto de la invención lo constituye un test
de diagnóstico in vitro para identificar un perfil de riesgo
de trastorno o evento cardiovascular y/o pronosticar la evolución de
un trastorno o evento cardiovascular mediante la determinación de
los niveles de la proteína HSP27, en particular la determinación de
los niveles de la proteína se realiza en una muestra biológica,
donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27 indican un
riesgo de sufrir un trastorno o evento cardiovascular.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un test de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
fluido fisiológico, más particularmente es sangre, suero, plasma u
orina.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un test de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
extracto celular, o un cultivo celular, o células.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un test de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
tejido o extracto tisular.
La presente invención proporciona un kit de
diagnóstico in vitro para identificar un perfil de riesgo de
trastorno o evento cardiovascular y/o pronosticar la evolución de un
trastorno o evento cardiovascular, que contiene los reactivos
necesarios para llevar a cabo la determinación de la proteína
HSP27.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular,
que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo la
determinación de la proteína HSP27. Más en particular el kit
contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo la
determinación de la proteína HSP27 en una muestra biológica, donde
la alteración de los niveles de la proteína HSP27 indica un riesgo
de sufrir un trastorno o evento cardiovascular.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, el kit contiene los reactivos
necesarios para determinar la proteína HSP27 mediante un ensayo
ELISA.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, el kit contiene los reactivos
necesarios para determinar la proteína HSP27 mediante western
blot.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, el kit contiene los reactivos
necesarios para determinar la proteína HSP27 mediante
espectrometría de masas.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, el kit contiene los reactivos
necesarios para determinar la proteína HSP27 mediante anticuerpos
específicos.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, el kit contiene los reactivos
necesarios para determinar la proteína HSP27 mediante microarrays
de proteínas.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para identificar
un perfil de riesgo de trastorno o evento cardiovascular y/o
pronosticar la evolución de un trastorno o evento cardiovascular
mediante la determinación de los niveles de la proteína HSP27, en
una muestra biológica, donde la alteración de los niveles de la
proteína HSP27 indican un riesgo de sufrir un trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, el kit contiene los reactivos
necesarios para determinar la proteína HSP27 mediante un ensayo PCR
para un precursor genético de la proteína HSP27.
La presente invención proporciona un método
diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27.
Un objeto de la invención lo constituye un
método de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de
un tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo
de trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de
la proteína HSP27. En particular, el agente farmacológico es un
agente anti-hipertensivo,
anti-inflamatorio, antitrombótico, antiplaquetario,
fibrinolítico, agentes reductores de lípidos, inhibidores directos
de la trombina, inhibidores de la glicoproteína IIb/IIIa,
bloqueantes de los canales de calcio, bloqueantes de los receptores
alfa o beta adrenérgicos, inhibidores de la
cicloxigenasa-2 o sistemas inhibidores de la
angiotensina.
Otro objeto de la invención lo constituye un
método de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de
un tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo
de trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de
la proteína HSP27. En particular el trastorno cardiovascular está
asociado a la enfermedad aterosclerótica, y/o hipertensión y/o
hiperlipidemia y/o enfermedad coronaria y/o enfermedad
cerebrovascular.
Otro objeto de la invención lo constituye un
método de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de
un tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo
de trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de
la proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de
la proteína se realiza en una muestra biológica, donde la
alteración de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o
no de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular.
Otro objeto de la invención lo constituye un
método de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de
un tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo
de trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de
la proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de
la proteína se realiza en una muestra biológica, donde la
alteración de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o
no de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
fluido fisiológico, más particularmente es sangre, suero, plasma u
orina.
Otro objeto de la invención lo constituye un
método de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de
un tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo
de trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de
la proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de
la proteína se realiza en una muestra biológica, donde la
alteración de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o
no de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
extracto celular, o un cultivo celular, o células.
Otro objeto de la invención lo constituye un
método de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de
un tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo
de trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de
la proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de
la proteína se realiza en una muestra biológica, donde la
alteración de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o
no de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
tejido o extracto tisular.
La presente invención proporciona un test de
diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27.
Un objeto de la invención lo constituye un test
de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27. En particular, el agente farmacológico es un agente
anti-hipertensivo,
anti-inflamatorio, antitrombótico, antiplaquetario,
fibrinolítico, agentes reductores de lípidos, inhibidores directos
de la trombina, inhibidores de la glicoproteína IIb/IIIa,
bloqueantes de los canales de calcio, bloqueantes de los receptores
alfa o beta adrenérgicos, inhibidores de la
cicloxigenasa-2 o sistemas inhibidores de la
angiotensina.
Otro objeto de la invención lo constituye un
test de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27. En particular el trastorno cardiovascular está
asociado a la enfermedad aterosclerótica, y/o hipertensión y/o
hiperlipidemia y/o enfermedad coronaria y/o enfermedad
cerebrovascular.
Otro objeto de la invención lo constituye un
test de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de la
proteína se realiza en una muestra biológica, donde la alteración
de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o no de un
tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular.
Otro objeto de la invención lo constituye un
test de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de la
proteína se realiza en una muestra biológica, donde la alteración
de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o no de un
tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un fluido
fisiológico, más particularmente es sangre, suero, plasma u
orina.
Otro objeto de la invención lo constituye un
test de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de la
proteína se realiza en una muestra biológica, donde la alteración
de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o no de un
tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
extracto celular, o un cultivo celular, o células.
Otro objeto de la invención lo constituye un
test de diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento con agentes farmacológicos que disminuyen el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular, mediante la determinación de la
proteína HSP27. En particular la determinación de los niveles de la
proteína se realiza en una muestra biológica, donde la alteración
de los niveles de la proteína HSP27 indican la eficacia o no de un
tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular. Más en particular, la muestra biológica es un
tejido o extracto tisular.
La presente invención proporciona un kit de
diagnóstico in vitro para evaluar la eficacia de un
tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o evento
cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para llevar a
cabo la determinación de la proteína HSP27.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para evaluar la
eficacia de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o
evento cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27. Más en
particular el kit contiene los reactivos necesarios para llevar a
cabo la determinación de la proteína HSP27 en una muestra biológica,
donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27 indica la
eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno
o evento cardiovascular.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para evaluar la
eficacia de un tratamiento o evento para reducir el riesgo de
trastorno cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27 en una muestra
biológica, donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27
indica la eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, el kit
contiene los reactivos necesarios para determinar la proteína HSP27
mediante un ensayo ELISA.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para evaluar la
eficacia de un tratamiento o evento para reducir el riesgo de
trastorno cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27 en una muestra
biológica, donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27
indica la eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, el kit
contiene los reactivos necesarios para determinar la proteína HSP27
mediante western
blot.
blot.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para evaluar la
eficacia de un tratamiento o evento para reducir el riesgo de
trastorno cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27 en una muestra
biológica, donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27
indica la eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, el kit
contiene los reactivos necesarios para determinar la proteína HSP27
mediante espectrometría de masas.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para evaluar la
eficacia de un tratamiento o evento para reducir el riesgo de
trastorno cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27 en una muestra
biológica, donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27
indica la eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, el kit
contiene los reactivos necesarios para determinar la proteína HSP27
mediante anticuerpos específicos.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para evaluar la
eficacia de un tratamiento o evento para reducir el riesgo de
trastorno cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27 en una muestra
biológica, donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27
indica la eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, el kit
contiene los reactivos necesarios para determinar la proteína HSP27
mediante microarrays de proteínas.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye un kit de diagnóstico in vitro para evaluar la
eficacia de un tratamiento o evento para reducir el riesgo de
trastorno cardiovascular que contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27 en una muestra
biológica, donde la alteración de los niveles de la proteína HSP27
indica la eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de
trastorno o evento cardiovascular. Más en particular, el kit
contiene los reactivos necesarios para determinar la proteína HSP27
mediante un ensayo PCR para un precursor genético de la proteína
HSP27.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura muestra los geles de la electroforesis
bidimensional (2-DE) de los secretomas de la
arteria control A, y de la placa complicada B. Los círculos muestran
las dos bandas correspondientes a la HSP27 que se corresponden con
los diferentes estados de fosforilación.
La figura muestra los resultados del
Western-blot para HSP27 (A), HSP60 (B) y HSP70 (C).
En las muestras control (1-3) y en las muestras de
carótidas (4-6).
Cuantificación de la proteína HSP27 por ELISA:
M: mamaria, R: radial, F: femoral, NCP: placa no complicada de
carótida, CP: placa complicada de carótida.
Niveles plasmáticos de la proteína HSP27 en
pacientes ateroscleróticos e individuos control.
Niveles plasmáticos de la proteína HSP27 en
individuos sanos y en pacientes hipertensos.
Expresión de HSP27 en arterias humanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores realizaron un experimento en el
que compararon los niveles de la proteína HSP27 secretada por
placas ateroscleróticas y arterias normales. Para ello, se incubaron
muestras procedentes de endarterectomías y de arterias control en
un medio de cultivo libre de proteínas que permitía estudiar de
manera independiente las proteínas liberadas por las áreas sanas y
lesionadas. A continuación se procedió a la determinación de la
proteína HSP27 mediante diferentes técnicas conocidas por el estado
de la técnica (análisis proteómico, Western blot, ELISA y análisis
inmunohistoquímico). Sorprendentemente, los investigadores
comprobaron los niveles de HSP27 secretados por las placas
ateroscleróticas habían descendido drásticamente comparados con los
niveles de las arterias control.
Las muestras de tejido fueron obtenidas de 28
pacientes (estenosis carotídea > 70%, 21 hombres/7
mujeres;
edad = 68 \pm 9 años, 86% hipertensos, 39% diabéticos, 54% hiperlipídicos) que se sometieron a una endarterectomía. Se tomaron muestras de sangre de los pacientes endarterectomizados y de voluntarios sanos sin diferencias significativas de sexo y edad. Se recogió el medio condicionado de 36 arterias control (24 mamaria, 12 radial) y 35 endarterectomías ateroscleróticas (10 femoral, 25 carótida).
edad = 68 \pm 9 años, 86% hipertensos, 39% diabéticos, 54% hiperlipídicos) que se sometieron a una endarterectomía. Se tomaron muestras de sangre de los pacientes endarterectomizados y de voluntarios sanos sin diferencias significativas de sexo y edad. Se recogió el medio condicionado de 36 arterias control (24 mamaria, 12 radial) y 35 endarterectomías ateroscleróticas (10 femoral, 25 carótida).
Las muestras fueron cortadas e incubadas por
separado durante 24 horas en un medio PRMI libre de suero a 37ºC.
Se recogió el medio condicionado, se centrifugó y la concentración
de proteínas se determinó por el método de Bradford.
La invención puede ser mejor entendida con la
explicación de los siguientes términos:
"Enfermedad cardiovascular" designa:
enfermedades cardíacas y de los vasos sanguíneos incluye pero no
limita aterosclerosis, hipertensión arterial, enfermedades
coronarias, enfermedades cerebrovasculares o enfermedades
periféricas.
"Proteína de choque
térmico-27" designa isoformas, modificaciones
postrasduccionales, formas truncadas o fragmentos de la proteína
HSP27.
"Determinación de la proteína HSP27"
designa tanto determinación cuantitativa como cualitativa, mediante
las técnicas conocidas por el estado de la técnica, incluyendo pero
no excluyendo, análisis proteómico, Western blot, ELISA, análisis
inmunohistoquímico, espectrometría de masas, anticuerpos
específicos, microarrays o ensayo PCR (Polymerase Chain Reaction)
para un precursor genético de la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
600 \mug de proteínas se precipitaron con 10%
ácido tricloroacético en acetona con 0.07% de
2-mercaptoetanol (1 h, -20ºC) y se lavó con acetona
fría (-20ºC, 20 min) antes de que la electroforesis bidimensional
(2-DE) se realizara. Los péptidos de las proteínas
digeridas fueron analizados en un espectrómetro de masas Voyager DE
STR MALDI-TOF (Perspective Biosystem). Las
proteínas fueron identificadas utilizando el programa MASCOT y las
bases de datos de secuencias proteicas de SWISS PROT y NCBI. Los
fosfopéptidos fueron caracterizados por Liquid Chromatography
Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry
(LC-MS/MS) y por Immobilized Metal Affinity
Chromatography (IMAC)(20) combinada con MALDI Q-TOF
MS/MS (20-22).
El análisis 2-DE de los
secretomas de las muestras de endarterectomía carotídea versus
arterias mamarias control y la identificación de HSP27 por
espectrometría de masas (MS), muestran que la secreción de HSP27
era diferente en ambas muestras (figura 1). Las isoformas de HSP27
fueron caracterizadas por análisis LC-MS/MS. Las
señales correspondientes del péptido QLpS82SGVSEIR (m/z:
578.24(+2)) para la proteína HSP27 de la mancha 1 y QLS82SGVSEIR
(m/z: 538.25 (+2)) de la mancha 2, demostraron que HSP27 en el
mancha 1 estaba fosforilada. Los resultados fueron confirmados por
IMAC y MALDI MS/MS (21-22).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron 15 \mug de proteína en un gel de
poliacrilamida al 12% y se realizó la electroforesis como se
describe (23). Los Blots fueron incubados con anticuerpos
anti-HSP27 (sc-9012, Santa Cruz),
anti-HSP60 (sc-1052) y
anti-HSP70 (SPA-812 Stressgen).
Los análisis por Western blot mostraron que la
secreción de HSP27 es menor en placas ateroscleróticas (femoral: F,
placas carótidas no complicadas: NCP, placas carótidas complicadas:
CP) comparada con las arterias control (mamaria: M, radial: R) (Fig.
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron los niveles de HSP27 soluble de
tejido y plasma mediante un ELISA cuantitativo utilizando un kit
comercial (Oncogene). Los resultados demostraron que los niveles de
HSP27 secretados por las placas ateroscleróticas, eran menores que
los secretados por las placas control M: 1243
(734-1909), R: 910(505-2508);
F: 303(138-526); NCP: 315
(119-515); CP: 33 (17-111) (Fig
3).
El tejido de partida fueron células
endoteliales. Se realizó una extracción de RNA total,
posteriormente se obtuvieron los mensajeros específicos (mRNA) y
mediante RT-PCR se obtuvo el cDNA, que fue
amplificado mediante la utilización de cebadores específicos.
Una vez obtenidos los productos de PCR, se
clonaron en el plásmido pGEM (Invitrogen); a continuación,
verificamos mediante secuenciación y se continuó con el desarrollo
del proceso.
A continuación se clonaron en dos tipos de
vectores, para expresarlo en dos sistemas de expresión diferentes
(bacterias y levaduras).
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión del antígeno recombinante
se obtuvo por la inserción del antígeno, obtenido a partir del
pGEM-ANTÍGENO, en el vector pGEX4T3 (Amersham
Biosciences). El plásmido resultante fue introducido por
transformación en la cepa de Escherichia coli BL21 Codon+
RIL (Stratagen) que dio lugar a la proteína de fusión
GTS-ANTÍGENO.
Las bacterias se lisaron y se realizó la
extracción de la proteína de fusión GST-ANTÍGENO de
los cuerpos de inclusión. Posteriormente se pasó por una columna de
afinidad (Glutathione- Sepharose 4B, Amersham Biosciences) y se
digirió con trombina (Sigma).
Las proteínas fueron purificadas del
homogeneizado obtenido mediante una cromatografía de intercambio
iónico en una columna Mono Q (Amersham Biosciences) y otra posterior
de penetrabilidad (Superdex 75; Amersham Biosciences), ambas
utilizando un equipo automático FPLC.
El proceso de purificación del antígeno fue
validado mediante la realización de ensayos de inmunodetección en
cada paso utilizando para ello anticuerpos específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento obtenido por PCR fue subclonado en
el vector pBluescript y posteriormente en el vector de expresión en
levaduras pGAP za.
Una vez clonado se llevó a cabo la expresión en
Pichia pastoris en condiciones óptimas y a continuación se
realizó el proceso de purificación.
El primer paso de purificación se hizo mediante
una cromatografía de afinidad usando como soporte una matriz de
Sepharose 4B (Amersham Biosciences). El segundo paso de
purificación se llevó a cabo utilizando una cromatografía de
intercambio iónico en una columna Mono Q (Amersham Biosciences) y
posteriormente una cromatografía de pentrabilidad como en el caso
anterior (Superdex 75) utilizando el FPLC.
Al igual que en el caso de la expresión del
antígeno en bacterias, el proceso de purificación fue validado con
la realización de ensayos de inmunodetección en cada paso con la
utilización de anticuerpos específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron los niveles de HSP27 en plasma de
pacientes con estenosis carotídea y controles sanos. Los niveles de
HSP27 circulantes fueron 20 veces menores en los pacientes con
aterosclerosis carotídea en relación con los sujetos sanos (Fig. 4).
Los niveles de la proteína HSP27 se midieron también en el plasma
de individuos sanos y en pacientes hipertensos, los niveles de la
proteína HSP27 fueron significativamente menores en los pacientes
hipertensos en relación con los sujetos sanos. (Fig. 5).
Las muestras fueron fijadas con paraformaldehido
integrado en parafina y la inmunohistoquímica se realizó en
secciones de 4 \mum como se describe (23) usando un anticuerpo
policlonal de cabra anti- human HSP27 (sc-1049) y
anti-SMC-\alpha-actina
(clone 1ª4, DAKO). Los resultados mostraron que tanto las placas
ateroscleróticas como las arterias mamarias expresaron la proteína
HSP27 (Fig. 6).
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (35)
1. Método de diagnóstico in vitro para
identificar un perfil de riesgo de trastorno o evento
cardiovascular y/o pronosticar la evolución de un trastorno o evento
cardiovascular caracterizado por la determinación de la
proteína HSP27.
2. Método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende la determinación de los
niveles de la proteína HSP27 en una muestra biológica, donde la
alteración de los niveles de la proteína HSP27 indica un riesgo de
sufrir un trastorno o evento cardiovascular.
3. Método, según la reivindicación 2,
caracterizado porque la muestra biológica es un fluido
fisiológico.
4. Método, según la reivindicación 3,
caracterizado porque el fluido fisiológico es sangre.
5. Método, según la reivindicación 3,
caracterizado porque el fluido fisiológico es suero.
6. Método, según la reivindicación 3,
caracterizado porque el fluido fisiológico es plasma.
7. Método, según la reivindicación 3,
caracterizado porque el fluido fisiológico es orina.
8. Método, según la reivindicación 2,
caracterizado porque la muestra biológica es una célula o un
cultivo celular o un extracto celular.
9. Método, según la reivindicación 2,
caracterizado porque la muestra biológica es un tejido o un
extracto tisular.
10. Kit de diagnóstico in vitro para
identificar un perfil de riesgo de trastorno o evento
cardiovascular y/o pronosticar la evolución de un trastorno
cardiovascular caracterizado porque contiene los reactivos
necesarios para llevar a cabo la determinación de la proteína
HSP27.
11. Kit de diagnóstico in vitro según la
reivindicación 10, caracterizado porque la alteración de los
niveles de la proteína HSP27 indica un riesgo de sufrir un
trastorno o evento cardiovascular.
12. Kit de diagnóstico in vitro, según la
reivindicación 11, caracterizado porque la determinación de
la proteína HSP27 se lleva a cabo mediante un ensayo ELISA.
13. Kit de diagnóstico in vitro, según la
reivindicación 11, caracterizado porque la determinación de
la proteína HSP27 se lleva a cabo mediante un western blot.
14. Kit de diagnóstico in vitro, según la
reivindicación 11, caracterizado porque la determinación de
la proteína HSP27 se lleva a cabo mediante espectrometría de
masas.
15. Kit de diagnóstico in vitro, según la
reivindicación 11, caracterizado porque la determinación de
la proteína HSP27 se lleva a cabo mediante anticuerpos
específicos.
16. Kit de diagnóstico in vitro, según la
reivindicación 11, caracterizado porque la determinación de
la proteína HSP27 se lleva a cabo mediante microarrays de
proteínas.
17. Kit de diagnóstico in vitro, según la
reivindicación 11, caracterizado porque la determinación de
la proteína HSP27 se lleva a cabo mediante un ensayo PCR para un
precursor genético de la proteína HSP27.
18. Método de diagnóstico in vitro para
evaluar la eficacia de un tratamiento con agentes farmacológicos
que disminuyen el riesgo de trastorno o evento cardiovascular
caracterizado porque comprende la determinación de los
niveles de proteína HSP27 en una muestra biológica, donde la
alteración de los niveles de la proteína HSP27 indica la eficacia o
no de dicho tratamiento para reducir el riesgo de trastorno o
evento cardiovascular.
19. Método, según la reivindicación 18,
caracterizado porque el agente farmacológico es un agente
antihipertensivo, antiinflamatorio, antitrombótico,
antiplaquetario, fibrinolítico, agentes reductores de lípidos,
inhibidores directos de la trombina, inhibidores de la
glicoproteína IIb/IIIa, bloqueantes de los canales de calcio,
bloqueantes de los receptores alfa o beta adrenérgicos, inhibidores
de la cicloxigenasa-2 o sistemas inhibidores de la
angiotensina.
20. Método, según la reivindicación 18,
caracterizado porque el trastorno o evento cardiovascular
está asociado a la enfermedad aterosclerótica y/o hipertensión y/o
hiperlipidemia y/o enfermedad coronaria y/o enfermedad
cerebrovascular.
21. Método, según la reivindicación 18,
caracterizado porque la muestra biológica es un fluido
fisiológico.
22. Método, según la reivindicación 21,
caracterizado porque el fluido fisiológico es sangre.
23. Método de evaluación, según la
reivindicación 21, caracterizado porque el fluido
fisiológico es suero.
24. Método, según la reivindicación 21,
caracterizado porque el fluido fisiológico es plasma.
25. Método, según la reivindicación 21,
caracterizado porque el fluido fisiológico es orina.
26. Método, según la reivindicación 18,
caracterizado porque la muestra biológica es un extracto
celular, o un cultivo celular o células.
27. Método, según la reivindicación 18,
caracterizado porque la muestra biológica es un tejido o
extracto tisular.
28. Kit de diagnóstico in vitro para
evaluar la eficacia de un tratamiento para reducir el riesgo de
trastorno cardiovascular, caracterizado porque comprende la
determinación de la proteína HSP27 en una muestra biológica, donde
la alteración de los niveles de la proteína HSP27 indica la
eficacia o no de un tratamiento para reducir el riesgo de trastorno
cardiovascular.
29. Kit, según la reivindicación 28,
caracterizado porque contiene los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación de la proteína HSP27.
30. Kit, según la reivindicación 29,
caracterizado porque la determinación de la proteína HSP27
se lleva a cabo mediante un ensayo ELISA.
31. Kit, según la reivindicación 29,
caracterizado porque la determinación de la proteína HSP27
se lleva a cabo mediante western blot.
32. Kit, según la reivindicación 29,
caracterizado porque la determinación de la proteína HSP27
se lleva a cabo mediante espectrometría de masas.
33. Kit, según la reivindicación 29,
caracterizado porque la determinación de la proteína HSP27
se lleva a cabo mediante anticuerpos específicos.
34. Kit, según la reivindicación 29,
caracterizado porque la determinación de la proteína HSP27
se lleva a cabo mediante microarrays de proteínas.
35. Kit, según la reivindicación 29,
caracterizado porque la determinación de la proteína HSP27
se lleva a cabo mediante un ensayo PCR para un precursor genético
de la proteína HSP27.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200401621A ES2315034B1 (es) | 2004-07-02 | 2004-07-02 | Proteina de choque termico 27 (hsp-27) como marcador de enfermedad cardiovascular. |
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| ES200401621A ES2315034B1 (es) | 2004-07-02 | 2004-07-02 | Proteina de choque termico 27 (hsp-27) como marcador de enfermedad cardiovascular. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2315034A1 ES2315034A1 (es) | 2009-03-16 |
| ES2315034B1 true ES2315034B1 (es) | 2009-12-30 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200401621A Withdrawn - After Issue ES2315034B1 (es) | 2004-07-02 | 2004-07-02 | Proteina de choque termico 27 (hsp-27) como marcador de enfermedad cardiovascular. |
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| ES (1) | ES2315034B1 (es) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9911772D0 (en) * | 1999-05-21 | 1999-07-21 | Semmelweis University Of Medic | Diagnosis and treatment of atherosclerosis |
| BE1014949A3 (fr) * | 2001-08-14 | 2004-07-06 | Probiox | Procede de detection de stress oxydant et trousse pour sa mise en oeuvre. |
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2004
- 2004-07-02 ES ES200401621A patent/ES2315034B1/es not_active Withdrawn - After Issue
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XU, Q. "{}Role of heat shock proteins in atherosclerosis"{}. ARTERIOSCLER. THROMB. VASC. BIOL. 2002. Vol. 22, páginas 1547-1559, todo el documento. * |
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