JP6296667B2 - 被験者のフケを診断するための非侵襲的方法 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚サンプルから酸化的ストレス及び／又は酸化的損傷と関連付けられる１つ以上のバイオマーカーの量を測定するための方法、並びにこれらのバイオマーカーの量が哺乳類の皮膚の健康の改善に直接的に相関する際のその連係及び相関に関する。

頭皮／皮膚は、環境傷害に対する防御の第１線として機能する多数の特殊化組織からなる注目すべき器官系である。初期研究は主に皮膚のバリア機能に着目したが、この器官は動的であり、ホメオスタシスを維持する助けとなるために環境の小さな変化でさえも感知及び応答していることが明らかとなっている。環境影響、例えば太陽放射、汚染、又はスキンケア製品の適用でさえ、複雑な事象のカスケードをもたらし、これは最終的に何百又は何千もの遺伝子の発現変化を引き起こす。遺伝子発現におけるこれらの変化は、概して、化学反応を触媒するタンパク質の生成（又は蓄積、放出、修飾など）の変化に形を変え、最終的に細胞応答を引き起こす。これらの化学反応が進むにつれ、代謝副産物はしばしば、どの化学プロセスが起こったかを示す指標として残される。所与の皮膚症状、例えばフケと相関する、これらの生じたタンパク質及び小分子バイオマーカーの分析は、症状の理解並びに皮膚症状の診断及び／又は改善の目的のための製品開発において価値ある情報を提供することができる。フケは、一般によくある慢性再発性頭皮皮膚症状であり、フレーク化及び掻痒感覚を伴う。フケの病因は複雑であり、頭皮皮膚と、微生物相と、宿主免疫系との間の相互作用の結果であるように見える。この症状についての先行研究の多くは、数種の表面レベルの現象の検査に着目していた。伝統的な専門家による観察及び自己観察に基づいた評価は、生理学的レベルでの上皮構造及び機能の主に器械に基づいた評価と組み合わせられる。新しい生体分子の能力は、従来の調査手段では以前に達成できなかった病態生理学的理解の奥行きを確立するが、この症状の鍵となる症候をもたらす分子事象の全容は、まだ現れていない。鍵となるこれらの分子事象を解明するために、生体分子（bimolecular）のサンプル採取を、皮膚表面のテープストリッピングにより非侵襲的に行うことができ、これに化学又は生物分析法が続く。ヒスタミンは、頭皮の掻痒に対する感度の高いバイオマーカーとして最近特定された。追加のバイオマーカーは、フケ症状のより詳細な病態生理学的説明を可能にし、フケの治療的解決の程度及び完全さを示す関連測定値として機能するためにも必要とされる。対象となる１つのそのような領域は、酸化的ストレスである。酸化的ストレスは皮膚に有害であり、抗酸化剤が様々な酸化的損傷源からの保護効果をもたらし得ることが、文献で周知である。フリーラジカルの形成は、皮膚の加齢及び損傷を引き起こすことが広く認められた作用である。フリーラジカルは、種々の細胞組織膜、脂質、タンパク質、及びＤＮＡを直接的に損傷し得る不対電子を有する高度に反応性の分子である。これらの活性酸素種の損傷効果は、通常の代謝及び免疫応答中に内部で誘発され、日光露出、タバコの主流煙又は副流煙、環境毒素、悪い食事、ストレスなどのような種々の酸化的ストレス要因を通して外部で誘発される。これらの種々の活性酸素種は、健康な代謝機能を維持するために細胞から絶えず除去されなければならない。身体は、１）活性酸素種を除去する、２）鉄及び他の金属を隔離する、３）形成されたラジカルを除去する、並びに４）分子損傷を修復するために、これに対処するいくつかの手段を有する。酸化的ストレスは、活性酸素種の産生とそれらに対する抗酸化防御との間のバランスが妨害されたときに、生ずる。また、フリーラジカルは炎症を引き起こし、炎症は皮膚の加齢において追加の役割を果たすと考えられており、一般的な皮膚の健康にとって有害である。フリーラジカルの産生が加齢に伴って増大する一方で、それらに対抗する内的防御機構の完全性及び能力は減少する。不均衡は、細胞組織への進行性かつ累積損傷につながり、環境老化が自然な老化過程に重なる老化及び促進老化をもたらす。

酸化的ストレス、及び酸化的損傷の結果として生成される分子（例えば酸化脂質）は、非侵襲的にサンプル採取されるバイオマーカーにより評価することができ、日常的な臨床査定でのそれらの使用を可能にする。

フケ症状の酸化的ストレスを評価するために、抗体系アッセイを使用して、タンパク質ミエロペルオキシド（ＭＰＯ）を定量化した。ＭＰＯは、広範囲の微生物病原体（例えばマラセジア）に対する宿主防御機構の一部として好中球（ＰＭＮ）により分泌される炎症促進性酵素である。ＭＰＯは、過酸化水素を殺菌剤、次亜塩素酸、及び損傷性の可能性がある活性酸素種（ＲＯＳ）のアレイに変換することができる。加えて、ＭＰＯは、抗菌ペプチド又はタンパク質として機能し得る。機構は完全には理解されていないが、ＭＰＯにより生成された活性酸素種は、病原体を殺傷すると同時に、周囲の組織に付帯的損傷を引き起こし得ると仮定することが妥当である。酸化的ストレスから生じる酸化的損傷を評価するために、高速液体クロマトグラフィー及びタンデム質量分析法を使用して、いくつかの酸化脂質を定量化した。これらの方法を使用して、非フケ、フケ、及びフケ治療被験者からの頭皮テープストリップ抽出物間の相違を区別した。

非侵襲的サンプル採取法は、皮膚／頭皮ケアにおけるバイオマーカー用途のために重要である。続く分析のための、皮膚／頭皮からの酸化的ストレス及び酸化的損傷と関連付けられた小分子及びタンパク質の採集のために、テープストリップをうまく使用した。

本発明の実施形態は、被験者の皮膚の健康を診断するための非侵襲的方法を目的とし、被験者から皮膚サンプル／上皮細胞サンプルを採集することと、上皮細胞サンプル／皮膚細胞サンプルのミエロペルオキシターゼ及び酸化脂質からなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを検出することと、検出されたバイオマーカーのレベルに基づいて、被験者が酸化的ストレス及び／又は酸化的損傷を有することを診断することと、を含む。

本発明の更なる実施形態は、被験者において酸化的ストレス及び酸化的損傷を診断するための非侵襲的方法を目的とし、哺乳類の上皮に接着物品を貼付することと、上皮細胞を接着物品に接着させることと、接着物品を哺乳類の上皮から除去することと、抽出のための標準的な実験室法を用いて接着物品を調製することと、前記接着物品に接着した上皮細胞からミエロペルオキシダーゼ及び酸化脂質からなる群から選択されるバイオマーカーを抽出することと、前記接着物品に接着した上皮細胞からのバイオマーカーを測定することと、治療後の基準サンプルと比較した上皮細胞のバイオマーカーの量を決定することと、を含む。

本発明のこれら及びその他の特徴、態様、及び利点は、本発明の開示を読むことによって当業者に明白となろう。

非フケ患者対フケ患者のミエロペルオキシダーゼレベルの比較を示すグラフである。 フケ患者のフケ防止シャンプー又は非フケシャンプーのいずれかでの治療後のミエロペルオキシダーゼレベルの基準からの変化を示すグラフである。 非フケ集団と比較した、基準時及びフケ防止シャンプーでの治療後のフケ患者のミエロペルオキシダーゼレベルの正常化を示すグラフである。 非フケ対フケ患者における、（±）−９−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸及び（±）−１３−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）並びにスクアレンヒドロペルオキシドレベルの比較を示すグラフである。 フケ防止シャンプー又は非フケシャンプーのいずれかでの治療後のフケ患者の基準からの酸化脂質変化を示すグラフである。

本明細書は、本発明を特定し明確に請求する請求項により完結しているが、本発明は、以下の説明により、よりよく理解されると考えられる。

本発明は、本明細書に記載する本発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載する追加若しくは任意の成分、構成成分又は制限事項のいずれも含むことができ、これらからなることができ、又はこれらから本質的になることができる。

特に断らない限り、比率、部、及び比は全て、本発明の組成物の総重量に基づく。全てのこのような重量は、提示された成分に関する場合、活性成分の濃度に基づき、したがって市販材料に含まれ得るキャリア又は副生成物を含まない。

以下では、本発明の様々な実施形態の構成成分及び／又は工程を、任意に加えてもよいものを含めて、詳細に記載する。

引用される全ての文献は、その関連部分において参照により本明細書に組み込まれるが、いずれの文献の引用もそれが本発明に関連する先行技術であることの容認として解釈されるべきではない。

特に記載しない限り、全ての比率は重量比である。

特に記載のない限り、全ての温度は摂氏である。

特に指摘される場合を除き、分量、百分率、部分、及び割合を含む全ての量は、「約」という語により修正されていると理解され、量は有効桁を示すことを意図しない。

特に記載する場合を除き、冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、「１以上」を意味する。

本明細書において「含む」とは、最終結果に影響を与えない他の工程及び他の成分を追加できることを意味する。この用語には、「からなる」及び「から本質的になる」という用語が含まれる。本発明の組成物及び方法／プロセスは、本明細書に記載する発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加若しくは任意の成分、構成成分、工程、又は制限事項のいずれをも含むことができ、これらからなることができ、及びこれらから本質的になることができる。

本明細書において「有効な」とは、処置する症状の著しく好ましい改善をもたらすのに十分高い対象活性物質の量を意味する。対象活性物質の有効量は、処置する特定の症状、症状の重さ、処置期間、併用している処置の性質及び同様の要因により変化する。

本明細書で使用される用語、生体分子の「示差的レベル」は、任意の増大したレベル又は減少したレベルを含み得る。一実施形態では、示差的レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、又はそれより多く増大したレベルを意味する。別の実施形態では、示差的レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％減少したレベルを意味する。生体分子は、統計的に有意（即ち、スチューデントＴ試験、ウェルチＴ試験、又はマッチドペアＴ試験のいずれかを用いて決定した際に０．２未満のｐ値（両側））である示差的レベルで発現される。

「皮膚」という用語は、脊椎動物の外皮を意味し、２層の細胞、つまり厚い内層（真皮）及び薄い外層（表皮）からなる。表皮は、皮膚の外側の非血管層である。表皮は５層の上皮で構成されており、これらは、内から外へ（１）基底層（表皮基底層）、（２）有棘層（表皮有棘層）、（３）顆粒層（表皮顆粒層）、（４）透明層（表皮透明層）、及び（５）角質層（表皮角質層）である。

「サンプル」という用語は、被験者の皮膚又は表皮からの任意の標本を指す。

「非侵襲的」という用語は、診断又は治療のために皮膚又は身体開口部に器具又は装置を挿入することを必要としない手順を意味する。

「接着デバイス」とは、基材上の接着剤又は接着性物質を用いることにより皮膚の表皮層の除去に用いられるデバイスを意味する。例えば、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）（ポリアクリレートエステル接着剤、ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））、Ｄｕｒａｐｏｒ、Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）（アクリル酸ポリマーフィルム、ＣｕＤｅｒｎ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）、Ｄｕｃｔテープ（３３３ダクトテープ、Ｎａｓｈｕａテープ製品）、Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）Ｔａｐｅ（３Ｍ Ｓｃｏｔｃｈ ８１０（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）、Ｄｉａｍｏｎｄ（商標）（Ｔｈｅ Ｓｅｌｌｏｔａｐｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｓｅｎｔｅｇａ（商標）（ポリプロピレンテープ、Ｓｅｎｔｅｇａ Ｅｉｋｅｔｔｅｎ ＢＶ（Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）などの接着テープを備える皮膚サンプルを用いることができる。接着剤は、一般に用いられる感圧タイプの接着剤のいずれか又は皮膚含有物（skin content）上で直ちに凝固するもの（シアノアクリレートなど）であってよい。接着剤は、サンプル採取を容易にするために、可撓性又は固形の裏材上にあってよい。定圧装置（例えばＤｅｓｑｕａｍｅ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））を用いて、サンプル採取中に接着デバイスに圧力を加えてよい。

組織からのサンプルは、当該技術分野において周知のあらゆる方法によって分離させることができる。サンプルを分離させるための侵襲的方法には、例えば血液採取中の針の使用、並びに様々な組織の生検、ブリスター法及びレーザーポレーションが挙げられる。これらの方法の侵襲的性質が原因で、死亡及び罹患リスクが増加する。更に、侵襲的方法は、皮膚の状態に悪影響を及ぼす場合があり、不正確な結果又は誤った結果をもたらし得る。その上更に、侵襲的方法は、大規模な集団での実行が困難である。侵襲的方法は、参加者に不快感をもたらす場合があり、また感染又は他の副作用の可能性を増大させ得る。本発明は、皮膚から酸化的ストレス及び酸化的損傷のバイオマーカーを測定するための非侵襲的方法を提供する。

「客観的に」という用語は、偏り又は先入観がないことを意味する。あるいは、専門家による評価又は自己評価はいずれも、本質的に「主観的」である。

「正常化」及び／又は「正常化された」という用語は、フケ患者の集団が、正常な集団の状態に近づく程度を意味する。

「正規化」及び／又は「正規化された」という用語は、ミエロペルオキシダーゼの場合、対応する接着剤又は接着物品上で測定されたタンパク質の量に対して表されるバイオマーカーの値を意味する。酸化脂質の場合、正規化は、酸化脂質の値が対応する非酸化親脂質に対して表されることを意味する。例としては、ｎｇ酸化脂質／ｎｇ親脂質、又はｐｇミエロペルオキシダーゼ／μｇ可溶性タンパク質であるが、これらに限定されない。

「基準時」という用語は、調査開始時に収集され、調査で見出された変化を測定する基となる情報を意味する。

本発明の更なる実施形態では、使用され得る代替の「非侵襲的」サンプル採取法が多く存在する。

Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）：これは、Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）（アクリルポリマーフィルム、ＣｕＤｅｒｍ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））が極めて弱い粘着性であり、目に見えて炎症を起こしている皮膚にも不快感を与えずに貼付し、除去することができる、非侵襲的手法である。この技術により回収／アッセイされるバイオマーカーは、タンパク質（例えばサイトカイン）、ペプチド（例えば神経ペプチド）、及び小分子（脂質）を含んだ。従来このテープは、皮脂採集のために製造及び販売され、それゆえ脂質分析に有用であり得る。

Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープはポリアクリレートエステル接着剤であり、これもまたＣｕＤｅｒｍが製造している。このテープは、Ｓｅｂｕｔａｐｅ（商標）と同じバイオマーカーの回収に用いられ得るが、特定の表皮構造タンパク質（例えばケラチン、インボルクリン）も除去する。このテープは、全身炎症反応マーカーとしてのコルチゾール及び血清アルブミン、並びに小分子（ヒスタミン）及び角質層脂質の回収にも用いられてきた。

カップスクラブ：カップスクラブは通常、緩衝液、非イオン性界面活性剤、又は有機溶媒（例えばエタノール）の存在下で、皮膚の表面から直接的にタンパク質を抽出する。カップスクラブは、主にサイトカインなど可溶性バイオマーカーの回収に用いられるが、有機小分子の回収にも用いることができる。カップスクラブは、テープストリップよりも多くのサイトカインを回収し、定量化することができる。これには、いくつかの理由が考えられる。（ａ）洗剤の存在及びそれらの液体性質のため、カップスクラブは大概、テープストリップがサンプル採取するのとは異なるタンパク質集団をサンプル採取する。（ｂ）カップスクラブでは、サイトカインは、既に溶液中にあるので、サンプル採集後に更に抽出される必要はない。

毛髪プラック：毛髪を引き抜くことは、通常はピンセットで所有者の身体からその要素を機械的に引くことによりヒト又は動物の毛を除去するプロセスである。毛髪プラックの小胞領域は、通常、可溶性タンパク質バイオマーカー、例えばサイトカインの回収のために緩衝液及び非イオン性界面活性剤の存在下で抽出され、また、脂質のような小有機分子の回収のためには有機溶媒で抽出され得る。

動物（即ち、イヌ）採集法：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）：Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（商標）テープサンプルは、イヌの毛皮を（剃毛せずに）分けて、イヌの皮膚で採集される。皮膚の炎症、分化、及びバリアの完全性に関する様々なバイオマーカー、例えば、総タンパク量、可溶性タンパク質、皮膚多項目同時解析（皮膚ＭＡＰ）、皮膚サイトカイン、及び角質層脂質（セラミド、コレステロール、脂肪酸）などをテープから分析することができる。

本発明の一実施形態では、本発明は、ミエロペルオキシダーゼ及び酸化脂質の分離での使用のためのサンプルを非侵襲的に得るための方法及び分析を提供する。

ある実施形態では、かかるサンプル採取を達成するために、接着デバイスが使用されてよい。

フケサンプル採取のためのかかるサンプル採取調査に備えて、認定選別員は、基準時訪問で、被験者ごとに粘着性頭皮フレーク化スコア（ＡＳＦＳ）評価を完了させ、テープストリップサンプルの採取に関する最高フレーク化オクタントを識別する。最高フレーク化オクタントは、基準時及び様々な時点でサンプル採取される。テープストリップサンプルは、各時点で各被験者から採集される。

テープストリップによるサンプル採取は、必要に応じて同じ部位で追加回数繰り返され、各Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープディスクを前回サンプル採取した領域の上に置く。サンプル採取後のＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープは、ラベル付きプレートの適切にラベルが貼られたウェルに入れる。

サンプル採取に続いて、抽出及び定量化手順を実行する。本発明の一実施形態では、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルの抽出物からのミエロペルオキシダーゼ及び酸化脂質の定量化は、抗体系イムノアッセイ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳのいずれかによる分析により行うことができる。本発明のこの実施形態では、抗体系分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に備えたサンプル抽出が行われた。

ミエロペルオキシダーゼ法については、適切な標準抽出緩衝液を各採集管に加え、次いで３０分間の超音波処理を用いて氷上で抽出する。各抽出溶液をテープストリップから分離させ、各サンプルのアリコートを９６ウェルのポリプロピレンプレートの指定位置に入れる。次に、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルの抽出物のアリコートにアルブミンなど従来の試薬を補充して実験機器の壁に検体が付着して失われるのを防ぐのを助け、９６ウェルのポリプロピレンディープウェルプレートに移し、ミエロペルオキシダーゼ分析に備えて−８０℃で凍らせる。別個のアリコートには試薬を補充せず、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２７）を用いて可溶性タンパク質を分析する。

抽出プロセスに続いて、従来の方法を用いてミエロペルオキシダーゼ標準物質及び対照群を調製することができる。ミエロペルオキシダーゼは、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙからのミエロペルオキシダーゼイムノアッセイキットで定量化される。結果は、ミエロペルオキシダーゼの量／テープストリップとして報告するか、ミエロペルオキシダーゼの量をこれもまたテープストリップ抽出物に見られるタンパク質の量で除して正規化することができる。タンパク質法については、別途記載してある。データ分析は、標準的な統計的手法及び計算によって実行する。

本発明の更なる実施形態では、接着物品、テープストリップの抽出物からの酸化脂質の定量化は、勾配逆相高速液体クロマトグラフィー及びタンデム質量分析法（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて実行できる。

ヒト被験者の頭皮から得られたテープストリップ（単一又は多数のテープストリップ）を個々のポリプロピレン琥珀色バイアル又はガラス琥珀色バイアルに入れ、次いで、抽出溶媒（０．１％ブチル化ヒドロキシトルエンを含むメタノール、ｗ／ｖ）で１０分間の渦動により抽出する。勾配逆相高速液体クロマトグラフィーをタンデム質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）とともに用いて、頭皮テープストリップの標準物質及び抽出物を分析する。表１に列挙される検体（酸化又は非酸化脂質）及びＩＳＴＤを、陽イオン電子噴霧（ＥＳＩ）によりモニターする。シグナルをプロットすることにより標準曲線を構築し、ここで、標準曲線は、各標準対対応する標準の各検体の質量についての、ピーク面積比（ピーク面積検体／ピーク面積ＩＳＴＤ）又はピーク面積検体のみとして定義される。次に、生成した回帰式を用いて、較正標準物質及びヒト頭皮抽出サンプル中の各検体の質量を逆算する。結果は、酸化脂質の質量／テープストリップとして報告するか、又は酸化脂質の量をこれもまたテープストリップ抽出物中に見られた対応する親非酸化脂質の量で除して正規化してもよい。加えて、結果を、テープストリップ抽出物で見られる対応するタンパク質の量で酸化脂質の量を正規化することにより報告してよい。また、正規化は、除去された細胞を採集し、それらを乾燥させ、それらを計量することにより行うことができる。

方法の拡張
用いた抽出手順を上述したが、先に概略された多くの工程に用いることができる別の方法が多数存在するが、これらの方法は、論理的拡張である。テープストリップからミエロペルオキシダーゼ及び酸化脂質を分離させるために用いる抽出溶媒は、好適な回収をもたらす、任意の適切な水性、有機、又は有機／水性混合物であってよい。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及び抗体系イムノアッセイは概して、それらの高選択性及び感度のために生物学的マトリックスでの有機分子の定量分析のための最先端の手法として認識されている。しかし、要求される感度及び選択性を提供する任意の分析法及び／又は他の方法を用いてよい。例えば、キャピラリー電気泳動、超臨界流体及び他のクロマトグラフィー法、並びに／又はこれらの組み合わせを含む、生体分子を評価するための他の方法が使用されてきた。同様に、また、核磁気共鳴分光法、質量分析法、電気化学及び蛍光アッセイを含む、分離法を伴わない器具手法も使用されてきた。更に、競合及び非競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などリガンド結合法又は他の標識化スキームも用いられてきた。酵素系アッセイには、タンパク質分析において長い使用歴がある。細胞系又は組織系の手法のいずれかを用いるバイオアッセイも、検出手段として用いられてきた。本発明の一実施形態では、毛髪プラックからの酸化的ストレス及び酸化的損傷のバイオマーカーの定量化は、テープストリップサンプルで使用されるのと同じ基本的な抽出及び分析法で行うことができる。

テープストリップ抽出物のタンパク質測定：
上述の好適な方法を用いて測定した皮膚のテープストリップサンプル上のミエロペルオキシダーゼのレベルは、テープストリップ抽出物に見られるタンパク質の量を用いて正規化することができる。正規化は、テープストリップ抽出物中のタンパク質の量でミエロペルオキシダーゼの量を除して行う。

テープストリップ抽出物又は皮膚上でのミエロペルオキシダーゼレベルの測定に用いた等価マトリックス中のタンパク質の量は、文献に記載される様々なタンパク質定量法を用いて測定することができる。かかる方法の例としては、任意の比色分析法、蛍光法、発光法を使用する総窒素定量、総アミノ酸定量、及びタンパク質定量が挙げられる。これらの方法は、タンパク質定量前のテープストリップ抽出物の更なるサンプル調製を含んでも含まなくてもよい。テープストリップ抽出物中のタンパク質定量のための特定の方法の非限定例については、以下に述べる。タンパク質定量法の包括的なレビュー、適用性、及び制限は、リンクｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／Ｆｉｌｅｓ／１６０１６６９＿ＰＡｓｓａｙＦＩＮＡＬ＿Ｉｎｔｌ．ｐｄｆからダウンロードできるＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質測定に関する更なる情報は、Ｒｅｄｉｎｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ Ｔｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．（１９８６）「Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３，２６７〜２７１に見ることができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。

ヒトの皮膚からサンプル採取した接着テープについて、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質含有物を抽出し、分析する。ヒトの皮膚からサンプル採取したテープストリップは、従来の抽出緩衝液で抽出される。抽出後、テープ抽出物のアリコートを９６ウェルのポリプロピレンディープウェルプレートに移し入れ、タンパク質定量に備えて２〜８℃で保管する。

ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔは、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）によるＣｕ⁺¹の高感度かつ選択的な比色検出に加えて、アルカリ媒質中のタンパク質によるＣｕ²⁺のＣｕ¹⁺への還元に基づいている。２個のＢＣＡ分子と１個のＣｕ¹⁺イオンのキレート化によって形成された紫色の反応生成物は、波長５６２ｎｍで強い吸光度を示す。光学密度（ＯＤ）は、マイクロプレートリーダーを用いて測定する。１ミリリットル当たりのマイクログラム（μｇ／ｍＬ）で表されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度を増加させて、アッセイ中に較正曲線を生成する。ＢＳＡ原液から調製された適切なアッセイ用ＱＣを用いて、サンプル分析中のアッセイ性能をモニタリングする。

本発明の別の実施形態では、タンパク質測定は、ＳｑｕａｍｅＳｃａｎ（登録商標）８５０Ａ（ＣｕＤｅｒｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ））を用いたタンパク質測定値など接着剤又は接着物品上のタンパク質を直接測定することにより行うことができる。

本発明の更なる実施形態では、追加の酸化的ストレスマーカー（不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシド／ヒドロキシド、コレステロールヒドロペルオキシド／ヒドロキシド、及びスクアレンヒドロペルオキシド／オキシド／ヒドロキシドに加えて）としては、以下のものを含み得る。

熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）２７
Ｈｓｐ２７の細胞保護特性は、その活性酸素種を調節する能力及びグルタチオンレベルを上昇させる能力からもたらされる。

熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）は、小分子量熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ファミリー（１２〜４３ｋＤａ）に属する。ＨＳＰ２７及び小ＨＳＰファミリーの他のメンバーは、保存されたｃ末端ドメイン、α−クリスタリンドメインを共有するが、これは脊椎動物の眼のレンズのα−クリスタリンと同一である［１］。ＨＳＰ２７は最初に、損傷したタンパク質の適切な再折り畳みを促進するタンパク質シャペロンとして熱ショックに応答して特定された。ＨＳＰ２７の継続調査は、このタンパク質が熱ショック以外の細胞ストレス条件、例えば酸化的ストレス及び化学的ストレスに応答することを明らかにした。酸化的ストレス中、ＨＳＰ２７は、抗酸化剤として機能して、細胞内グルタチオンレベルを上昇させ細胞内鉄レベルを低下させることにより活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを低下させる。

タンパク質の酸化的修飾
生物系におけるタンパク質の酸化は、システイニルチオールの自発的自動酸化、タンパク質の活性酸素種（ＲＯＳ）との相互作用、及びオキシダーゼにより触媒される意図的かつ制御された反応により起こる。タンパク質のＲＯＳとの反応は、システイン、メチオニン、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファン残基の酸化をもたらし得る。メチオニン酸化はメチオニンスルホキシドの測定により、チロシンの酸化は形成されるジチロシン量により、フェニルアラニンの酸化はｏ−チロシン及びｍ−チロシンの形成によりモニターされ、トリプトファン残基の酸化は、Ｎ−ホルミルクヌレニン、キヌレニン、及び／又はキノリン酸をモニターすることにより追跡される。また、アルブミンｃｙｓ３４残基の共有結合的及び酸化的修飾は、軽い酸化的ストレスの特異的バイオマーカーであることが示唆されている。通常、これらのタンパク質修飾付加残基は、完全な酵素加水分解又は化学消化後に測定される。

タンパク質は、主にリジン、プロリン、及びアルギニン残基から形成されるタンパク質カルボニル基の形成を伴う酸化経路により修飾され得る。リジンは、酸化的脱アミノ化により２−アミノアジピン酸セミアルデヒド（ＡＡＳＡ）を形成し、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）は、プロリン及びアルギニン残基の酸化により形成される。ＡＡＳＡ及びＧＳＡは、それぞれ６−ヒドロキシ−２−アミノカプロン酸及び５−ヒドロキシ−２−アミノ吉草酸をもたらす還元後に検出することができる。タンパク質カルボニル化は、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンでの誘導後にＥＬＩＳＡ系手法によっても測定することができる。

加えて、タンパク質は、多価不飽和脂肪酸の酸化から形成されるα，β−不飽和アルケナールとの反応による酸化経路のために（「不飽和アルケナールのタンパク質との反応生成物及びメルカプツール酸経路」を参照のこと）、並びに初期糖化付加物（ＥＧＡ）及び糖との後期糖化生成物（ＡＧＥ）の形成により（「ＥＧＡ及びＡＧＥ」を参照のこと）、修飾することができる。

ＤＮＡ酸化及びヒドロキシル化ヌクレオチド¹
ＤＮＡ損傷は概して、酸化的ストレスの１つの物差しであり、主な理由は、内因性活性酸素種（ＲＯＳ）により引き起こされるフリーラジカル損傷のためである。無傷のＤＮＡへの酸化的損傷は、ＣＯＭＥＴアッセイを用いて測定することができる。酸化的損傷は、８−オキソデオキシグアノシン（８−ｏｘｏｄＧ）とも呼ばれる８−ヒドロキシデオキシグアノシン（8-hydroxydexoygaunosine）（８ＯＨｄＧ）、４，６−ジアミノ−５−ホルム−アミドピリミジン（ＦａｐｙＡｄｅ）、及び２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧｕａ）を含む、種々のヒドロキシル化ヌクレオチドをモニターすることにより測定することができる。

イソプロスタン¹
イソプロスタンは、アラキドン酸（ＡＡ）及びω−３−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）のフリーラジカル触媒酸化から形成される一連のプロスタグランジン様アイソマーであり、典型的にＰＵＦＡの酸化はリン脂質形態に起こる。ＡＡ酸化に由来するイソプロスタンは、Ｆ型プロスタン環（Ｆ₂−イソプロスタンと呼ばれる）をもたらし、５−Ｆ₂−シリーズＩｓｏＰ、８−Ｆ₂−シリーズＩｓｏＰ、１２−Ｆ₂−シリーズＩｓｏＰ、及び１５−Ｆ₂−シリーズＩｓｏＰｓ８−シリーズを生じさせる。同様に、Ｄ／Ｅ−環及びＡ／Ｊ環イソプロスタンも、ＡＡから形成される。Ｆ₃−ファミリーのイソプロスタン（Isoprosanes）はＥＰＡから同様に形成され、５−Ｆ₃−シリーズ、８−Ｆ₃−シリーズ、１１−Ｆ₃−シリーズ、１２−Ｆ₃−シリーズ、１５−Ｆ₃−シリーズ、及び１８−Ｆ₃−シリーズイソプロスタンを生じさせる。

α，β不飽和アルデヒド¹
多価不飽和脂肪酸の酸化は、酸化的ストレスに応答して起こることが多く、脂肪酸ヒドロペルオキシドのラジカル駆動形成をもたらし、これは、更なる反応を経て、生物学系で広い多様性のα，β−不飽和アルケナール、例えばマロンジアルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、４−ヒドロキシノネナール、４−ヒドロキシヘキセナール、及び４−オキソ−ノネナールを得ることができる。これらのα，β−不飽和アルケナールは、酸化的ストレスのバイオマーカーとして使用されている。

α，β−不飽和アルケナールのタンパク質との反応生成物及びメルカプツール酸経路
α，β−不飽和アルケナールは、反応性求電子試薬であり、ヘキサノイル−リジン、ヘキサノイル−ヒスチジン、Ｎｅ−（３−メチルピリジニウム）リジンなどの後期リポキシド化最終生成物（ＡＬＥ）と呼ばれる共有結合タンパク質付加物などの数多くの求核化合物と、及びメルカプツール酸化合物（グルタチオン、システイン、及びメルカプツール酸）と生成物を形成して、チオエーテル（例えば１，４−ジヒドロノンメルカプツール酸、３−ヒドロキシプロピルメルカプツール酸、及びカルボキシエチルメルカプツール酸）を形成する。

初期糖化付加物（ＥＧＡ）及び後期糖化最終生成物（ＡＧＥ）
タンパク質の糖化は、集合的にメイラード反応と呼ばれる非酵素複合体シリーズの並発及び連続反応であり、全ての組織及び体液で起こる。糖化付加物は、グルコースと、反応性α−オキソアルデヒド、例えばグリオキサール、メチルグリオキサール、及び３−デオキシグルコソン、並びにその他の糖類誘導体と、のタンパク質の反応により形成することができる。糖化の初期段階反応は、フルクトシル−リジン及びＮ−末端アミノ酸残基由来フルクトサミンの形成をもたらし、初期糖化付加物（ＥＧＡ）と呼ばれる。後期段階反応は、後期糖化最終生成物と呼ばれる安定な最終段階付加物、例えばモノリシル付加物（カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシエチルリジン（ＣＥＬ）、及びピラリン）、モノバリル付加物（カルボキシメチルバリン（ＣＭＶ）及びカルボキシエチルバリン（ＣＥＶ））、ヒドロイミダゾロン、ビス（リシル）イミダゾリウム架橋（ＧＯＬＤ、ＭＯＬＤ、ＤＯＬＤ）、及びリジンとアルギニンとの架橋に由来するペントシジンを形成する。ＥＧＡ及びＡＧＥは、タンパク質がタンパク質分解により分解されたとき又はタンパク質が化学溶解により分解されたとき、放出される。ＡＧＥの形成及び蓄積は、加齢関連疾患の進行に関係付けられてきた。ここ２０年間にわたる研究は、加齢に関連付けられる疾患のほとんどでＡＧＥを暗示している。ＣＭＬは、加齢、アテローム性動脈硬化症、及び糖尿病におけるタンパク質への酸化的ストレス及び長期損傷の一般的マーカーであり得る。

酸化的ストレスのバイオマーカーとしての抗酸化剤¹
内因性抗酸化剤は、ラジカル機構により引き起こされる酸化的損傷の制御において鍵となる防御的役割を果たす。鍵となる内因性抗酸化剤は、アスコルビン酸（ＡｓＡ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、α−トコフェロール、及びコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ）を含む。これらの内因性酸化還元（酸化及び還元形態）抗酸化剤のレベルの変化は、酸化的ストレスの測定値として使用することができる。

（¹）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｄａｍａｇｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｇ．Ａｌｄｉｎｉ，Ｋ−Ｊ Ｙｅｕｍ，Ｅ．Ｎｉｋｉ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編集（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｉｏｗａ、２０１０）、参照により本明細書に組み込まれる。

酸化的ストレス及び酸化的損傷を評価するための基本的手順
被験者を、頭皮の状態を確立するために認定検査員により評価する。フケ被験者について、認定検査員により評価される眼に見えるフレーク化のレベルを特定する。非フケの健康な頭皮の被験者は、各バイオマーカーの正常化レベルを確立するために基準時で評価される。被験者は、２つの別個の臨床研究（調査番号１及び調査番号２）において認定検査員によって認定された。調査番号１には、基準時のＭＰＯレベルで評価される６０人の非フケ被験者が含まれる。１１９人のフケ患者に１％ ＺＰＴ含有フケ防止シャンプーを適用し、１１５人のフケ患者に１％硫化セレン含有フケ防止シャンプーを適用し、６０人のフケ被験者にフケ防止有効成分を含有しない非フケシャンプーを適用した。被験者を基準時、並びに製品使用の１週間後、２週間後、及び３週間後のＭＰＯレベルについて評価する。調査番号２には、基準時の酸化脂質で評価される３０人の非フケ被験者が含まれる。６０人のフケ被験者にフケ防止シャンプーを適用し、６０人のフケ被験者にフケ防止有効成分を含有しない非フケシャンプーを適用した。被験者を基準時、及び製品使用の３週間後に再び酸化脂質について評価した。

被験者は、フケ防止シャンプーを使用する治療期間前に、コンディショニング剤を含まない従来の非フケシャンプーを使用する２週間の休薬期間を経る。フケ被験者は、フケ防止シャンプー（ジンクピリチオン又は硫化セレンを含有するシャンプー組成物）又はフケ防止有効成分を含まない非フケシャンプーで３週間の治療期間を受け、テープストリップサンプルを認定検査員による基準時訪問で決定される最高フレーク化オクタントから採集する。フケ被験者については、頭皮のテープストリップを、基準時及び製品治療後に回収する。非フケ被験者については、頭皮テープストリップは、基準時にのみ回収する。テープは、抽出されるまで−８０℃に保つ。フケが関与する部位は、髪を分け、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープ（ＣｕＤｅｒｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を貼付し、必要に応じてテープを擦りつけることによりサンプル採取される。非フケ被験者については、フレークのない部位をサンプル採取する。テープは、予めラベル付けされた１２ウェルの培養皿に入れて保管する。

サンプルは従来の抽出緩衝液を用いて抽出し、氷上で超音波処理する。次いで、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープサンプルの抽出物のアリコートを、予めラベル付けされたポリプロピレン採集管に移し、−８０℃で凍結して、ＭＰＯ及び酸化脂質について分析する。別個のアリコートを、ＭＰＯ抽出物についてのＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２７）を用いた可溶性タンパク質分析のために定める。

抽出後、サンプルを、抗体系イムノアッセイにより又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりミエロペルオキシダーゼ及び酸化脂質について分析する。次いで、化合物について定量化した相対値を、ミエロペルオキシダーゼについて上記に概略されるＢＣＡタンパク質アッセイにより決定される抽出物の可溶性タンパク質量に対して、又は酸化脂質の対応する親非酸化脂質の量により正規化した。フケ防止シャンプー治療群からのサンプルについては基準時及び治療後に、並びに非フケ群については基準時のみについて、分析を行う。マッチドペアＴ試験を非フケ（健康）、フケ基準時、及びフケ治療被験者間の相違を分析するために使用した。フケ治療被験者を、非フケと比較して、フケ防止製品で治療した際の正常化の程度を決定した。

結果の概要
データの統計分析：データは、基準時及び治療後のフケ被験者並びに基準時の非フケ被験者について収集した。被験者間並びに被験者内（基準時→治療）での検体レベルの大幅な多様性を考慮すると、分析前にデータをｌｏｇ１０スケールに変換することがより効率的である。統計分析は、同等のｌｏｇ１０比値（即ち、ｌｏｇ１０（第３週／基準時）に基づいて実行した。次に、報告された最終結果を元のスケール（又は、基準時値からの％変化）に再変換して、解釈を容易にする。全ての統計分析は、ＳＡＳ ＪＭＰ（バージョン７．０．２）ソフトウェアを用いて実行した。統計的有意性の判定には、ｐ値は≦０．２０（両側）を用いた。

図１のデータは、フケ被験者ＭＰＯレベルが、非フケ被験者レベルより著しく高かったことを示す（ｐ値は＝０．０００５）。上述の好適な方法を用いて測定したヒト頭皮のテープストリップサンプル上のＭＰＯレベルは、テープストリップの抽出物に見られるタンパク質の量を用いて正規化することができる。ＭＰＯレベルを独立した非フケ群から測定して、正常な皮膚ＭＰＯレベルを定める。ＭＰＯレベルの正規化は、ＭＰＯレベルをテープストリップ抽出物中のタンパク質の量で割ることにより行う。

図２のデータは、基準レベルと比較して、１週間のフケ防止シャンプーでの治療後にＭＰＯレベルの７７％の減少、２週間の治療後に８７％の減少、及び３週間の期間にわたり８９％の減少があったことを示す（ｐ値＜０．０００１）。ＭＰＯの減少は、レベルを非フケ集団と比較することにより示される改善と一致する。フケ防止シャンプーは、全ての治療時点で非フケシャンプーと比較して顕著な改善を示した（ｐ値＜０．０００１）。これらのＭＰＯレベルは、テープストリップ抽出物中のタンパク質の量で正規化されている。

図３のデータは、フケ防止治療が上記の図１で説明される非フケ群のレベルまでＭＰＯレベルを回復させたことを示す。フケに悩む人々は正常な状態及び／又は健康的な状態に戻ることを望むため、これは、効果を伝える有用な手段である。

図４のデータは、フケ被験者ＨＯＤＥレベルが、非フケ被験者レベルより著しく高かったことを示す（ｐ値＜０．００１）。図４のデータは、フケ被験者ＳＱＯＯＨレベルが、非フケ被験者レベルより著しく高かったことを示す（ｐ値＝０．１３）。上術の好適な方法を用いて測定されるヒト頭皮のテープストリップサンプル上の酸化脂質は、酸化脂質をテープストリップ抽出物中のその対応する親非酸化脂質で除して正規化することができる。ＨＯＤＥレベルは、ＨＯＤＥレベルをテープ抽出物中のリノール酸の量で除して正規化されており、ＳＱＯＯＨは、テープストリップ抽出物中のスクアレンの量で除して正規化されている。

図５のデータは、基準時と比較したフケ防止シャンプーでの３週間の治療後に測定された正規化酸化リノール酸（ＨＯＤＥ）の顕著な減少を示す（ｐ値＜０．０１）。減少は、レベルを非フケ集団と比較することにより示される改善と一致する。フケ防止シャンプーは、非フケシャンプーと比較して顕著な改善を示した（ｐ値＝０．００５）。図５のデータは、基準時と比較したフケ防止シャンプーでの３週間の治療後に測定された正規化スクアレンヒドロペルオキシドの顕著な減少を示す（ｐ値＜０．０１）。減少は、レベルを非フケ集団と比較することにより示される改善と一致する。フケ防止シャンプーは、非フケシャンプーと比較して顕著な改善を示した（ｐ値＝０．０１３）。

特定の実施形態では、そのような性能評価は、フケ防止組成物での治療前後の被験者の皮膚の健康状態を比較するために有利であり得る。例えば、いくつかのフケ防止組成物は、被験者が特定のフケ防止組成物又はレジメンに切り替え、それを維持する場合に、被験者が経験する軽減をより速いスピードに促進することができる。被験者の特定の皮膚の健康利益の客観的測定を可能にする評価は、特定のフケ防止組成物又はレジメンでの治療前の被験者の状態と、被験者が特定のフケ防止組成物又はレジメンに切り替えた後と、の比較を可能にすることができる。加えて、このような評価は、特定の治療又はレジメンが促進する特定の皮膚の健康利益の主張を支持する支持証明ツールとして使用することができる。例えば、特定の組成物又はレジメンが、掻痒の症状を減少させることを促進する場合、本明細書に開示される評価は、掻痒からの被験者の不快感が減少されたことを示すという、特定の健康利益の主張を支持するために使用することができる。フケ防止組成物及びレジメンにより利益を受け得る皮膚の健康の要素としては、掻痒、フレーク化、刺激、皮膚バリア完全性、乾燥、酸化的ストレス及び酸化的損傷、自己防御、自然な保護を含むが、これらに限定されない。

また、多くの分析の結果は、特定の製品、製品の組み合わせ、及び技術の有効性を促進するためのマーケティング情報又は広告情報としても使用することができる。本発明により具体化され得る製品包装上に置かれ得る広告の主張の例としては、確立の主張（例えば「臨床的に証明された」又は「試験が示す」）、前後の主張（例えば「使用後に５０％フケが減った」）、単項の主張、比較の主張、倍数の主張（例えば「フケが３倍減少」）、並びに予防及び治療の主張を含むが、これらに限定されない。例えば、製品包装は、分析について言及し、製品の客観的に証明された有効性又は比較を示してもよい。また、分析データは、異なる製品又は製品群と組み合わせて使用され得る又は使用され得ない異なるレジメンと関連した臨床情報で使用してもよい。

更なる実施形態としては、適用前のバイオマーカーの基準レベルと比較したとき、ジンクピリチオンシャンプーの適用後に正規化バイオマーカーの変化がある場合が挙げられる。別の実施形態では、適用前のバイオマーカーの基準レベルと比較したとき、硫化セレンシャンプーの適用後に正規化分子バイオマーカーの変化がある。更なる実施形態では、治療後に正常集団と比較して少なくとも５％の皮膚健康の改善を確立するバイオマーカーの測定値が存在し得る。更なる実施形態では、治療後に正常集団と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、及び更に１００％の皮膚健康の改善が存在し得る。別の実施形態では、フケ被験者と非フケ被験者（治療なし）との間で少なくとも５％の差が存在し得る。更に、フケ被験者と非フケ被験者との間の少なくとも１０％の差、フケ被験者と非フケ被験者との間の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の差、及び更にフケ被験者と非フケ被験者との間の１００％以上の差が存在し得る。

本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に断らない限り、そのような各寸法は、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。

「発明を実施するための形態」で引用する全ての文献は、関連部分において本明細書に参照により組み込まれるが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。本明細書中の用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれた文献中の同一用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本明細書においてその用語に与えられた意味又は定義を適用する。

本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。

Claims (11)

1. 被験者のフケの状態を評価するための非侵襲的方法であって、
   ａ）前記被験者から皮膚細胞サンプル／上皮細胞サンプルを採集することと、
   ｂ）前記上皮細胞サンプル／皮膚細胞サンプルの１つ以上のバイオマーカーのレベルを検出することであって、前記１つ以上のバイオマーカーが、ミエロペルオキシダーゼ、（±）−９−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸及び（±）−１３−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）、並びにこれらの混合物からなる群から選択されることと、
   ｃ）検出されたバイオマーカーの前記レベルが、被験者が酸化的ストレス及び／又は酸化的損傷を有するか否かを示すことと、
   を含む、方法。
2. 皮膚サンプルの採集が、接着物品、毛髪プラック、皮膚洗浄液、及びそれらの混合物からなる群からである、請求項１に記載の方法。
3. 前記非襲的方法が、
   ａ）哺乳類の上皮に接着物品を貼付することと、
   ｂ）上皮細胞を前記接着物品に接着させることと、
   ｃ）前記接着物品を前記哺乳類の上皮から除去することと、
   ｄ）抽出のために前記接着物品を準備することと、
   ｅ）前記接着物品に接着した前記上皮細胞からのバイオマーカーを抽出することであって、前記バイオマーカーが、ミエロペルオキシダーゼ、（±）−９−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸及び（±）−１３−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）、並びにこれらの混合物からなる群から選択されることと、
   ｆ）前記接着物品に接着した前記上皮細胞からの前記バイオマーカーを測定することと、
   ｇ）治療後の基準サンプルと比較した前記上皮細胞の前記バイオマーカーの量を決定することと、
   を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記検出されたバイオマーカーの前記レベルが、前記バイオマーカーを前記接着物品上のタンパク質の量で除して、又は前記（±）−９−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸及び前記（±）−１３−ヒドロキシ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸については対応する非酸化親脂質の量で除して正規化される、請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記上皮が角質層を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. バイオマーカーの基準レベルと比較したとき、バイオマーカーレベルのレベル変化がある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 適用前の基準レベルのバイオマーカーと比較したとき、抗真菌毛髪トリートメントの適用後に正規化バイオマーカーの基準からの変化がある、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 適用前の基準バイオマーカーと比較したとき、フケ防止シャンプーの適用後３週間の期間にわたり少なくとも４０％の正規化バイオマーカーの減少がある、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 適用前のミエロペルオキシダーゼバイオマーカーの基準レベルと比較したとき、フケ防止シャンプーの適用後３週間の期間にわたりミエロペルオキシダーゼ正規化バイオマーカーの８７％の減少がある、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 適用前のバイオマーカーの基準レベルと比較したとき、ジンクピリチオンシャンプーの適用後に正規化バイオマーカーの変化がある、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 適用前のバイオマーカーの基準レベルと比較したとき、硫化セレンシャンプーの適用後に正規化分子バイオマーカーの変化がある、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。

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