ES2296229T3 - Identificacion de una mutacion de jak2 implicada en la poliglobulia de vazquez. - Google Patents

Identificacion de una mutacion de jak2 implicada en la poliglobulia de vazquez. Download PDF

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Abstract

Proteína aislada JAK2 (Janus quinasa 2), caracterizada porque comprende una mutación en el aminoácido 617, más particularmente la mutación V617F, denominada a continuación "variante JAK2 V617F", cuya secuencia se representa en la SEC ID nº 1, o unos equivalentes de esta proteína mutada en posición 617 en otros mamíferos.

Description

Identificación de una mutación de JAK2 implicada en la poliglobulia de Vaquez.
La presente invención se refiere a la variante V617F de la proteína tirosina quinasa JAK2, siendo dicha variante responsable de la poliglobulia de Vaquez. La invención se refiere asimismo a un método de diagnóstico en primer lugar de la eritrocitosis y de la trombocitosis que permite relacionarlas a unos síndromes mieloproliferativos o a la detección en los síndromes mieloproliferativos de la variante JAK2 V617F que permite volver a clasificarlas en un nuevo grupo nosológico, y a la identificación de inhibidores específicos y de ARNsi.
La poliglobulia de Vaquez (Policitemia vera o PV) es un síndrome mieloproliferativo crónico, que asocia una poliglobulia real y, frecuentemente, una trombocitosis y una hiperleucocitosis. Se trata de una enfermedad adquirida, clonal, de la célula cepa hematopoiética. Los progenitores hematopoiéticos de PV son capaces de formar unas colonias eritroblásticas en ausencia de eritropoietina (Epo), denominadas "colonias espontáneas". Se ha demostrado asimismo una hipersensibilidad de los progenitores eritroblásticos de PV con otros varios factores de crecimiento: Interleuquina-3 (IL-3), Granulocyte Macrophage-Stimulating Factor (GM-CSF), Stem Cell Factor (SCF), y Insuline Like Growth Factor (IGF-1). Varios equipos se han interesado en la fisiopatología de la PV, pero la anomalía molecular origen de la enfermedad sigue siendo desconocida hoy en día (H. Pahl, 2000).
La hipersensibilidad de los progenitores de PV a varias citoquinas conduce a investigar unas anomalías que afectan a las vías de transducción de la señal comunes a los receptores de citoquinas. La existencia de un marcador molecular nunca se ha demostrado en la PV, pero debido a las similitudes entre la PV y los demás síndromes mieloproliferativos, en particular la LMC, parece probable que unos mecanismos moleculares próximos a los inducidos por Bcr-Ab1 sean responsables de la ventaja de proliferación del clon maligno y de su diferenciación terminal. Esta hipótesis se ha confirmado recientemente en dos síndromes mieloproliferativos raros, los síndromes mieloproliferativos asociados con una translocación que implica la región cromosómica 8p11 que induce una activación constitutiva del receptor del FGF, y el síndrome hipereosinofílico, en el que una deleción cromosómica críptica lleva a un gen quimérico PDGFR\alpha-FIP1L1. En los dos casos, las anomalías moleculares son origen de proteínas de fusión que tienen una actividad tirosina quinasa constitutiva.
En la PV, no se ha encontrado ninguna anomalía citogenética recurrente, aunque una deleción 20q se detecta en 10 a 15% de los pacientes, y una pérdida de heterozigosidad en 9p en aproximadamente 30% de los casos (Kralovics, 2002). Sin embargo, estas anomalías no son específicas de la enfermedad.
Presentando las células de PV una independencia a la Epo, se han emprendido unas investigaciones de la vía del receptor de la Epo (R-Epo). En primer lugar, el receptor es normal tanto en el plano estructural como funcional (Hess et al., 1994; Le Couedic et al.; 1996; Means et al., 1989). La fosfatasa SHP-1 que desfosforila R-Epo y JAK2 en la detención de la estimulación por la Epo, se expresa normalmente a nivel ARN y proteico (Andersson et al., 1997; Asimakopoulos et al., 1997). Más aguas abajo en la señalización de R-Epo, se ha buscado una activación anormal de STAT5 en los polinucleares (PNN) de pacientes que presentan una PV sin encontrar ninguna anomalía. Sin embargo, se ha demostrado una fosforilación constitutiva de STAT3 en las PNN de 4 casos de PV de 14 estudiados (Roder, 2001). Por último, la expresión de la proteína anti-apoptótica bcl-xl, diana de transcripción de STAT5, se ha estudiado en inmunohistoquímica y en citometría de flujo (Silva et al., 1998). Así, se ha demostrado que bcl-xl estaba hiperexpresado en los eritroblastos de PV, y en particular en una etapa más madura en la que esta proteína ya no se expresa.
En la poliglobulia de Vaquez, los principales criterios de diagnósticos son hoy en día clínicos (criterios del PVSG; Pearson, 2001). El diagnóstico biológico se basa esencialmente en la realización de los cultivos de progenitores eritroides en ausencia de Epo (detección de las colonias endógenas). Debido a la evaluación necesaria para su buena realización, y a la importancia del "tiempo-técnico" usado, este examen no está disponible en todos los centros, y es fiable sólo cuando se realiza por un laboratorio experimentado. Además, el ensayo necesita ser realizado sobre células medulares extraídas del paciente para una buena sensibilidad, lo que no es anodino para el
paciente.
Mediante unas técnicas de hibridación sustractiva, un equipo alemán ha clonado un gen hiperexpresado en los PNN de PV, denominado PRV1 (Policitemia Rubra Vera 1) (Temerinac et al., 2000). La proteína PRV-1 pertenece a la superfamilia de los receptores de superficie uPAR. La hiperexpresión del ARNm que codifica para PRV-1 en los polinucleares de PV es fácilmente detectable mediante RT-PCR en tiempo real, y constituye un marcador de la enfermedad de descubrimiento reciente, sin ningún papel fisiopatológico. Sin embargo, los estudios publicados recientemente muestran que no es ni muy sensible ni muy específico.
Spivak JL et al., en 2003 ("Chronic myeloproliferative disorders"; Hematology; 2003; 200 24.) describe ciertos marcadores de la PV. Los ARNm del antígeno neutrófilo NBI/CD177 están sobreexpresados en los granulocitos de pacientes PV. Sin embargo, este marcador no parece un medio fiable para detectar las PV, debido a que ciertos enfermos no presentan esta sobreexpresión o debido a que esta sobreexpresión se puede observar en sujetos que padecen síndromes mieloproliferativos distintos de la poliglobulia de Vaquez. Una expresión disminuida del receptor a la trombopoietina, Mpl, sobre las plaquetas se encuentra asimismo en las PV. Aunque esta anomalía predomina en la PV, se vuelve a encontrar en otros síndromes mieloproliferativos. Además, se trata de un examen difícil de realizar que sólo se puede efectuar en unos laboratorios especializados.
Así, no existe en el estado de la técnica ningún método que permite un diagnóstico fiable de la PV. Además, los únicos tratamientos disponibles no son específicos. Se trata de sangrías para mantener el hematocrito en los límites de la normal, o el uso de agentes citotóxicos, o también de IFN.
En el ámbito de la presente invención, no sólo se ha descubierto una mutación en el gen JAK2 en aproximadamente 90% de los pacientes ensayados sino que también se ha establecido que esta mutación es responsable de una activación constitutiva de esta tirosina quinasa, y se ha demostrado que su inhibición permite bloquear la proliferación y la diferenciación espontáneas de los eritroblastos de PV.
La secuencia de JAK2 se describe en la Database Uniprot con el número Q506Q0.
Se han descrito unas mutaciones en JAK2 un año después de la presente invención en James Chloe et al., Nature vol. 434, nº 7037, p. 1144 y Baxter et al., Lancet, vol. 365, nº 9464, p. 1054.
JAK2 pertenece a la familia de las Janus quinasas (JAK), que regrupan varias tirosina quinasas intracitoplásmicas: JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Las proteínas JAK están implicadas en la señalización intracelular de numerosos receptores membranarios que no tienen ninguna actividad de tirosina quinasa intrínseca, como algunos miembros de la superfamilia de los receptores a las citoquinas, y en particular el receptor en la Epo (R-Epo). La proteína JAK2 está codificada por un gen que comprende 23 exones. El ADN complementario tiene un tamaño de 3.500 pares de bases, y codifica para una proteína de 1.132 aminoácidos (130 kD)(Figura 1). Se ha identificado mediante PCR y secuenciación una mutación puntual adquirida y clonal en el exón 12 de JAK2 en prácticamente 90% de los pacientes que padecen PV. El codón 617 "GTC" que codifica normalmente una Valina (V), se muta en "TTC" que codifica una fenilalanina (F). Esta mutación V617F no se encuentra en los 25 controles o pacientes que padecen poliglobulia secundaria ensayados. Por el contrario se encuentra en 40% de las trombocitemias esenciales y en 50% de las mielofibrosis, si bien esta mutación define un nuevo ámbito de síndrome mieloproliferativo tal como Bcr-Abl definió la leucemia mieloide crónica.
Para estudiar si la variante de la invención JAK2 V617F podría ser eficazmente detectada con unos instrumentos extendidos ampliamente usados habitualmente en los laboratorios de diagnóstico en hematología, se han analizado 119 muestras que proceden de pacientes con una sospecha de enfermedad mieloproliferativa. Se ha mostrado que JAK2 V617F era eficazmente detectado por las tecnologías LightCycler® y TaqMan®, siendo estas últimas un poco más sensibles que la secuenciación. Después, se ha estimado el valor de detección de JAK2 V617F como ensayo de diagnóstico en primera intención en 88 pacientes con unos porcentajes de hematocritos superiores a 51%, y se ha mostrado que la mutación correspondía al diagnóstico de PV según los criterios WHO (R = 0,879) y PVSG (R = 0,717), con un valor predictivo positivo de 100% en el contexto de la eritrocitosis. En base a estos datos, se propone que la supresión de JAK2 V617F en los granulocitos esté considerada como un ensayo de diagnóstico en primer intención en unos pacientes con una eritrocitosis, evitando por lo tanto la realización de una medición de la masa de glóbulos rojos, de un aspirado de médula ósea y de un análisis in vitro de la formación de colonias eritroides endógenas. Asimismo, esta detección se podrá extender en primera intención al conjunto de los síndromes mieloproliferativos o a su sospecha. Esta detección será particularmente importante en las trombocitosis crónicas para las cuales no existe ningún ensayo biológico certero para afirmar un síndrome mieloproliferativo. Será asimismo un examen importante en el diagnóstico de las mielofibrosis y frente a unas tablas clínicas asociadas a trombosis de etiología
indeterminada.
Así, la invención aporta por primera vez una herramienta de diagnóstico y abre la vía al tratamiento dirigido de la PV, y asimismo de los síndromes mieloproliferativos asociados con esta mutación. Más específicamente, se propone la detección de la mutación JAK2 V617F como ensayo de diagnóstico en primera intención en el ámbito de la eritrocitosis, lo que permite evitar la cuantificación de la masa de glóbulos rojos y de células endógenas eritroides (EEC) de un aspirado de la médula ósea en la mayoría de los pacientes y en las trombocitosis crónicas, lo que permitirá evitar una larga investigación etiológica.
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Descripción de la invención
Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a la proteína aislada JAK2 (Janus quinasa 2), en particular la proteína de Homo sapiens Janus quinasa 2 (NCBI número de acceso NM_004972; GI:13325062), que comprende una mutación sobre el aminoácido 617 (codón 617 del ADNc a partir del ATG), más particularmente la mutación V617F, denominada a continuación variante JAK2 V617F, tal como se representa en la SEC ID nº 1
siguiente:
SEC ID nº 1 (V617F sapiens Janus quinasa 2 o JAK2 V617F) 
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1 
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La invención prevé asimismo unos equivalentes de esta proteína mutada en posición 617 en otros mamíferos, por ejemplo las JAK2 V617F en otros mamíferos tales como la rata (NM_031514), el cerdo, el ratón (NM_008413), etc., así como unas variantes de la SEC ID nº 1 que comprenden además una o varias modificaciones que no afectan a la actividad y a la estructura 3D de la variante.
La invención se refiere asimismo a una secuencia nucleotídica que codifica para la SEC ID nº 1, preferentemente la SEC ID nº 1 (secuencia del gen humano JAK2 con el codón TTC en lugar de GTC sobre el codón 617 (mutación g/t en posición 1849, denominada a continuación G1849T, a partir del ATG que marca el principio de la traducción).
Esta secuencia puede encontrarse en un vector vírico o plasmídico, o también en un ADN desnudo bajo el control de un promotor eficaz de las células de mamíferos. La invención se extiende por lo tanto a un vector que expresa la proteína JAK2 V617F.
El vector de la invención puede ser un vector de clonación y/o de expresión, y se puede usar para transfectar una célula hospedante, en particular una célula de mamífero, con la excepción de las células cepas humanas embrionarias o las células germinales humanas, preferentemente una célula progenitora CD34^{+} humana.
Animal transgénico no humano modelo de la PV y otros síndromes mieloproliferativos
La invención se refiere asimismo a un animal transgénico no humano que expresa JAK2 V617F recombinante. Este animal puede ser preferentemente un ratón o una rata. Las ratas o ratones transgénicos que sirven de modelo se pueden obtener mediante cualquier método habitualmente usado por el experto en la materia, en particular un Knock-in (inserción determinada de una secuencia) mediante recombinación homóloga o recombinación dirigida con los sistemas Cre-LoxP o FLP-FRT en las células ES. Según un modo preferido de realización de la invención, la célula transgénica según la invención se obtiene mediante reconocimiento génico ("gene targeting") de la variante JAK2 G1849T a nivel de una o de las secuencias del genoma de la célula hospedante. Más precisamente, el transgén se inserta de manera estable mediante recombinación homóloga a nivel de las secuencias homólogas en el genoma de la célula hospedante. Cuando se trata de obtener una célula transgénica con vistas a producir un animal transgénico, la célula hospedante es preferentemente una célula cepa embrionaria no humana (célula ES) (Thompson et al., 1989). El reconocimiento génico representa la modificación dirigida de un locus cromosómico mediante recombinación homóloga con una secuencia de ADN exógena que tiene una homología de secuencia con la secuencia endógena diana. Se distinguen diferentes tipos de reconocimiento genético. En este caso, el reconocimiento génico se puede usar más particularmente para sustituir el gen JAK2 salvaje mediante el gen de la variante JAK2 G1849T o cualquier otra variante genéticamente similar. En este caso, el reconocimiento génico se llama "Knock-in" (K-in). Alternativamente, el reconocimiento génico se puede usar para disminuir o aniquilar la expresión de JAK2 salvaje, y después para introducir el gen variante de JAK2. Se trata entonces de un reconocimiento génico denominado "Knock-Out" (KO) (véase Bolkey et al., 1989). La célula según la invención se caracteriza porque el transgén se integra de manera estable en el genoma de dicha célula, y porque su expresión es controlada por los elementos de regulación del gen endógeno. Mediante la expresión "integración de manera estable" se entiende la inserción del transgén en el ADN genómico de la célula según la invención. El transgén así insertado se transmite después a la descendencia celular. La integración del transgén se realiza corriente arriba, corriente abajo o en el centro del gen endógeno diana JAK2. Facultativamente, se pueden usar uno o varios genes de selección positiva o negativa. Asimismo, se puede usar unas regiones de ADN de homología con el locus diana, preferentemente en total de dos, situado en ambos lados de la porción del gen indicador o en ambos lados de la secuencia completa a insertar. Mediante la expresión "regiones de ADN de homologías" se entiende dos secuencias de ADN que, después de una alineación óptima y después de una comparación, son idénticas para habitualmente al menos aproximadamente 90% a 95% de los nucleótidos y, preferentemente, al menos aproximadamente 98 a 99,5% de los nucleótidos. La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsh (1970), mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman (1988), mediante los programas informáticos que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA y TFASTA en el paquete de programas Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Aunque tan poco como 14 pb homólogas al 100% sean suficientes para realizar la recombinación homóloga en las bacterias y las células de mamífero, se prefieren una porciones de secuencias homólogas más largas (en general estas porciones son de al menos 2.000 pb, preferentemente el menos 5.000 pb para cada porción de secuencia homóloga. Ventajosamente, la secuencia JAK variante se inserta en el conjunto de los elementos que aseguran una regulación del tipo endógeno, es decir un conjunto que comprende al menos el promotor, unas secuencias reguladoras (potenciadores, silenciadores, aisladores), las señales de terminación del gen JAK endógeno.
Según un modo de realización particular, el transgén JAK G1849T comprende al menos la secuencia codificante, un casete de selección positivo flanqueado o no por sitios específicos de la acción de las recombinasas, por ejemplo un casete Lox/Neo-TK/L.ox o lox/Neo/lox o FRT/Neo-TK/FRT o pudiendo FRT/Neo/FRT estar asimismo presente en posición 5' de dicha secuencia, y caracterizado porque un casete de selección negativa que contiene por ejemplo el o los genes DTA y/o TK está presente en al menos uno de los extremos del transgén. El transgén de la presente invención se deriva de forma preferida directamente de una secuencia de ADN exógeno presente naturalmente en una célula animal. Esta secuencia de ADN en forma nativa se puede modificar por ejemplo mediante inserción de sitios de restricción necesarios para la clonación y/o mediante inserción de sitios de recombinación de sitio específicos (secuencias lox y flp).
Para eso, la variante JAK2 G1849T se puede clonar en un vector de clonación que permite asegurar su propagación en una célula hospedante y/o facultativamente en un vector de expresión para asegurar la expresión del transgén. Las tecnologías del ADN recombinante usadas para la construcción del vector de clonación y/o de expresión según la invención son conocidas por el experto en la materia. Las técnicas estándares se usan para la clonación, el aislamiento del ADN, la amplificación y la purificación; las reacciones enzimáticas que implican el ADN ligasa, el ADN polimerasa, las endonucleasas de restricción, se efectúan según las recomendaciones del fabricante. Estas técnicas y las demás se realizan generalmente según Sambrook et al., 1989. Los vectores incluyen los plásmidos, los cósmidos, los bacteriófagos, los retrovirus y otros virus animales, los cromosomas artificiales, tales como YAC, BAC, HAC y otros vectores análogos.
Los métodos para generar unas células transgénicas según la invención se describen en Gordon et al., 1989. Diversas técnicas para transfectar unas células de mamíferos ha sido repasadas por Keon et al., 1990. El transgén según la invención, facultativamente comprendido en un vector linealizado o no, o en forma de un fragmento de vector, se puede introducir en la célula hospedante mediante métodos estándares tales como, por ejemplo, la micro-inyección en el núcleo (US nº 4.873.191), la transfección mediante precipitación con fosfato de calcio, la lipofección, la eletroporación (Lo, 1983), el choque térmico, la transformación con unos polímeros catiónicos (PEG, polibreno, DEAE-Dextran, etc.), o también la infección vírica (Van der Putten et al., 1985).
Cuando las células han sido transformadas por el transgén, éstas se pueden cultivar in vitro o bien ser usadas para producir unos animales transgénicos no humanos. Después de la transformación, las células se inoculan sobre una capa nutricional y/o en un medio apropiado. Las células que contienen la construcción se pueden detectar usando un medio selectivo. Después de un tiempo suficiente para dejar que las colonias crezcan, éstas se recuperan y se analizan para determinar si se ha producido un evento de recombinación homóloga y/o una integración de la construcción. Para realizar el reconocimiento de los clones susceptibles de satisfacer la recombinación homóloga, unos marcadores positivos y negativos, también denominados genes de selección, se pueden insertar en el vector de recombinación homóloga. Se han descrito diferentes sistemas de selección de las células que han realizado el evento de recombinación homóloga (para revisión véase la patente US nº 5.627.059). Dicho gen de selección positiva según la invención se selecciona preferentemente de entre los genes de resistencia a los antibióticos. Entre los antibióticos, se pueden citar de manera no exhaustiva la neomicina, la tetraciclina, la ampicilina, la kanamicina, la fleomicina, la bleomicina, la higromicina, el cloramfenicol, la carbenicilina, la geneticina, la puromicina. Los genes de resistencia que corresponden a estos antibióticos son conocidos por el experto en la materia; a título de ejemplo, el gen de resistencia a la neomicina hace las células resistentes a la presencia del antibiótico G418 en el medio de cultivo. El gen de selección positivo se puede seleccionar asimismo de entre el gen HisD, siendo el agente selectivo correspondiente el histidinol. El gen de selección positivo también se puede seleccionar de entre el gen de la guanina-fosforibosil-transferasa (GpT), siendo el agente selectivo correspondiente la xantina. El gen de selección positivo también se puede seleccionar de entre el gen de la hipoxantina-fosforibosil-transferasa (HPRT), siendo el agente selectivo correspondiente la hipoxantina. El marcador o los marcadores de selección usado(s) para permitir identificar los eventos de recombinación homóloga puede(n)
afectar a continuación la expresión génica, y se pueden eliminar si es necesario mediante el uso de recombinasas sitio-específicas tal como la recombinasa Cre específica de los sitos Lox (Sauer, 1994; Rajewsky et al., 1996; Sauer, 1998) o FLP específico de los sitios FRT (Kilby et al., 1993).
Las colonias positivas, es decir que contienen unas células en las que se ha producido al menos un evento de recombinación homóloga, se identifican mediante un análisis por transferencia de southern y/o por técnicas de PCR. El porcentaje de expresión en las células aisladas o las células del animal transgénico según la invención, del ARNm que corresponde al transgén, también se puede determinar mediante unas técnicas que comprenden el análisis por transferencia de northern, el análisis por hibridación in situ, por RT-PCR. Asimismo, las células o tejidos animales que expresan el transgén se pueden identificar usando un anticuerpo dirigido contra la proteína indicadora. Después, las células positivas se pueden usar para realizar las manipulaciones sobre el embrión y en particular la inyección de células modificadas mediante recombinación homóloga en los blastocistos.
En cuanto al ratón, los blastocistos se obtienen a partir de hebras superovuladas de 4 a 6 semanas. Las células se tripsinan y las células modificadas se inyectan en el blastocelo de un blastocisto. Después de la inyección, los blastocistos se introducen en el cuerno uterino de hembras seudo-gestantes. Después, se dejan las hembras llegar a término y las camadas resultantes se analizan para determinar la presencia de células mutantes que poseen la construcción. El análisis de un fenotipo diferente entre las células del embrión recién nacido y las células del blastocisto o de las células ES permite detectar los recién nacidos quiméricos. Después, los embriones quiméricos se crían hasta la edad adulta. Las quimeras o animales quiméricos no humanos son unos animales en los que sólo una subpoblación de células poseen un genoma alterado. Los animales quiméricos que presentan el gen o los genes modificados se cruzan generalmente entre sí o con un animal no humano de tipo salvaje a fin de obtener una descendencia heterocigoto u homocigoto. Después, los heterocigotos machos y hembras se cruzan para generar unos animales homocigotos. Salvo que se indique de otra manera, el animal transgénico no humano según la invención comprende unos cambios estables de la secuencia nucleotídica de las células de la línea germinal.
Según otro modo de realización de la invención, la célula transgénica no humana según la invención puede servir de célula donante de núcleo en el ámbito de una transferencia de núcleo o de transferencia nuclear. Mediante la expresión "transferencia nuclear" se entiende la transferencia del núcleo de una célula viva donante de vertebrado, de un organismo adulto o en el estado fetal, en el citoplasma de una célula receptora sin núcleo de la misma especie o de una especie diferente no humana. El núcleo transferido se reprograma para dirigir el desarrollo de los embriones clonados que se pueden transferir a continuación a unas hembras portadoras para producir los fetos y los recién nacidos, o se pueden usar para producir unas células de la masa celular interna en cultivo. Diferentes técnicas de clonación nuclear son susceptibles de ser usadas; entre éstas, conviene citar de manera no exhaustiva las que son objeto de las solicitudes de patente WO 95/17500, WO 97/07668, WO 97/07669, WO 98/30683, WO 99/01163 y WO 99/37143.
Así, la invención se extiende asimismo a un animal transgénico no humano que comprende una secuencia recombinante que codifica para JAK2 V617F. Estos animales pueden ser homocigotos o heterocigotos (JAK2 V617F/JAK2 V617F o JAK2 V617F/JAK2). Estos animales reproducen en particular la poliglobulia de Vaquez, pero asimismo cualquier síndrome mieloproliferativo inducido por JAK2 V617F. Por lo tanto, permiten realizar un reconocimiento funcional de inhibidores de tirosina quinasa, en particular un reconocimiento de inhibidores específicos de JAK2 V617F.
Otra alternativa puede consistir en inyectar un vector vírico (retrovirus o lentivirus u otros) capaz de expresar la variante JAK2 V617F en células cepas hematopoiéticas, no humanas, en células progenitoras no humanas o en células ES no humanas, para realizar asimismo unos modelos de poliglobulia de Vaquez u otros síndromes mieloproliferativos.
Herramientas de diagnóstico
En un tercer aspecto, la invención se refiere a las herramientas de diagnóstico que permiten detectar la presencia o la ausencia de la mutación JAK2 V617F en un mamífero que padece o que es susceptible de presentar un síndrome mieloproliferativo, en particular en los pacientes que muestran una poliglobulia o en los que se sospecha que presentan los síntomas de la poliglobulia de Vaquez, unas trombocitemias y/o unas mielofibrosis.
Para ello, la invención se refiere a los cebadores y sondas que permiten detectar la presencia o la ausencia de la mutación en la secuencia SEC ID nº 2 descrita anteriormente.
Más particularmente, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de al menos 10, 12, 15, 20, 30, 40 o incluso 50 nucleótidos consecutivos (por ejemplo de 10 a 30 nucleótidos o de 10 a 25 nucleótidos) del exón 12 o de la secuencia SEC ID nº 3 ó 4 siguientes, y que comprende el nucleótido mutado t^{1849}, por ejemplo de 10 a 30 nucleótidos.
SEC ID nº 3
2 
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La secuencia subrayada designa un ejemplo de zonas corriente arriba o corriente abajo que permite el diseño de sondas o de cebadores específicos de la mutación en posición 1849 (SEC ID nº 4).
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Ejemplo de diferentes cebadores y sondas preferidos de la invención En ADN, cebadores de PCR 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 JAK2EXON12-PCRF SENTIDO
5'-GGGTTTCCTCAGAACGTTGA-3'
(54804-54823) \+ (SEC ID nº 5)\cr \+\cr 
JAK2EXON12-PCRR ANTI-SENTIDO
5'-TTGCTTTCCTTTTTCACAAGA-3'
(55240-55260) \+ (SEC ID nº
6)\cr}
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En ADN, cebadores de secuenciación
JAK2EXON12SEQF SENTIDO 5'-CAGAACGTTGATGGCAGTTG-3' (54813-54832) (SEC ID nº 7)
JAIC2EXON12SEQR ANTI-SENTIDO 5'-TGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTT-3' (55207-55233)
(SEC ID nº 8) 
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En ADNC, cebadores de PCR y secuenciación
SENTIDO 5'-CAACCTCAGTGGGACAAAGAA-3' (1386-1407) (SEC ID nº 9)
ANTI-SENTIDO 5'-GCAGAATATTTTTGGCACATACA-3' (2019-2041) (SEC ID nº 10) 
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Sondas SNPS y detección de mutación y SIARN (1829-1870)
TTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGAGAATATTC (SEC ID nº 11) 
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Genotipado sobre LightCycler (ADN de PNN o de médula)
Oligo "S" (sentido) GGCAGAGAGAATTTTCTGAAC (SEC ID nº 15)
Oligo "R" (antisentido) GCTTTCCTTTTTCACAAGATA (SEC ID nº 16)
Sensor wt GTCTCCACAGACACATACTCCATAA 3'-FL (SEC ID nº 17)
Anchor JAK2 5'-LC Red640AAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCT 3' – PH (SEC ID nº 18) 
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Genotipado sobre LightCycler (por ejemplo ADNc de plaquetas)
cJAK2F GCACACAGAAACTATTCAGAGTC (SEC ID nº 19)
cJAK2S AGCAGCAAGTATGATGAGC (SEC ID nº 20)
cJAK2A CTAGTGATCCAAATTTTACAAACT (SEC ID nº 21)
cJAK2R GTTT'AGCAACTTCAAGTTTCC (SEC ID nº 22)
Sensor wt GTCTCCACAGACACATACTCCATAA3'-FL (SEC ID nº 23)
Anchor JAK2 5'-LC Red640AAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCT3'- PH (SEC ID nº 24) 
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Genotipado mediante la tecnología taqman (por ejemplo sobre ADN de células mononucleares de médula ósea)
Reconocimiento mediante sondas fluorescentes específicas de alelo y de ADN monocatenario. Reacción de PCN.
Secuencia cebador sentido: AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT (SEC ID nº 25)
Secuencia cebador antisentido: AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT (SEC ID nº 26)
Indicador 1 Secuencia (VIC): TCTCCACAGACACATAC (SEC ID nº 27)
Indicador 2 Secuencia (FAM): TCCACAGAAACATAC (SEC ID nº 28)
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro o ex vivo que permite detectar la presencia o la ausencia de mutación JAK2 V617F en una muestra.
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Ensayos con los ácidos nucleicos de la invención
En un primer modo de realización, la variante G1849T (que corresponde a la mutación JAK2 V617F) se puede detectar mediante análisis de la molécula de ácido nucleico del gen JAK2. En el ámbito de la presente invención, mediante la expresión "ácido nucleico" se entiende un ARNm, el ADN genómico o el ADNc derivado del
ARNm.
La presencia o la ausencia del ácido nucleico de la variante G1849T se puede detectar mediante secuenciación, amplificación y/o hibridación con una sonda y unos cebadores específicos, tales como se han descrito anteriormente: secuencia derivada de las SEC ID nº 3 ó 4 y SEC ID nº 5 a 11, o también SEC ID nº 15 a 24.
La invención propone por lo tanto un método ex vivo o in vitro para determinar la presencia o la ausencia de la variante G1849T del gen JAK2 en una muestra de un paciente que padece PV o susceptible de desarrollar una PV o cualquier otro síndrome mieloproliferativo, en particular eritrocitosis, trombocitemias y mielofibrosis, que comprende:
\quad
la detección de la presencia o de la ausencia de la variante G1849T del gen JAK2 en una muestra de ácido nucleico del paciente.
caracterizado porque la presencia de la variante G1849T es una indicación de PV o de cualquier otro síndrome mieloproliferativo.
La muestra de ácido nucleico se puede obtener a partir de cualquier fuente celular o biopsia de tejido. Estas células deben ser de origen hematopoiético y se pueden obtener a partir de la sangre circulante, de tejido hematopoiético o cualquier fluido contaminado en células sanguíneas. El ADN se puede extraer usando cualquier método conocido en el estado de la técnica, tales como los métodos descritos en Sambrook et al. (1989). El ARN también se puede aislar, por ejemplo a partir de tejidos obtenidos durante una biopsia, usando unos métodos estándares bien conocidos por el experto en la materia, tales como la extracción mediante guanidiotiofenato-fenol-cloroformo.
La variante G1849T del gen JAK2 se puede detectar en una muestra de ARN o de ADN, preferentemente después de la amplificación. Por ejemplo, el ARN aislado se puede someter a una transcripción reversa y después a una amplificación, tales como una reacción RT-PCR usando los oligonucleótidos específicos del sitio mutado o que permiten la amplificación de la región que contiene la mutación, por ejemplo el exón 12 o la secuencia SEC ID nº 3 ó 4. El término "oligonucleótido" se usa aquí para designar un ácido nucleico de al menos 10, preferentemente entre 15 y 25 nucleótidos, preferentemente inferior a 100 nucleótidos, y que es capaz de hibridarse con el ADN genómico de JAK2, con el ADNc o también con el ARNm.
Los oligonucleótidos de la invención se pueden marcar según cualquier técnica conocida por el experto en la materia, tales como marcadores radioactivos, fluorescentes o enzimáticos. Un oligonucleótido marcado se puede usar como sonda para detectar la presencia o la ausencia de la variante G1849T del gen JAK2.
Así, las sondas y los cebadores útiles según la invención son los que se hibridan específicamente con la región del gen JAK2 en la proximidad del nucleótido en la posición 1849 (numeración a partir de ATG que marca el principio de la transcripción).
En el método explicado anteriormente, los ácidos nucleicos se pueden amplificar mediante PCR antes de la detección de la variación alélica. Los métodos para la detección de la variación alélica se describen, por ejemplo, en "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Segunda edición, Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) y Laboratory Protocols for Mutation Detection, Ed. por U. Landegren, Oxford University Press, 1996 y PCR, 2ª edición por Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997.
Para ello, es posible combinar una etapa de amplificación seguida por una etapa de detección que permite discriminar las muestras en función de la presencia o de la ausencia de la variante buscada.
En la patente EP 1 186 672 se describen diferentes técnicas adaptadas para este fin, tales como la secuenciación de ADN, la secuenciación mediante hibridación SSCP, DGGE, TGGE, el análisis heterodúplex, CMC, la escisión enzimática de desapareamiento, "hybridization based solid phase hibridization", los chips de ADN (DNA chips), solution phase hibridization Taqman^{TM} (patentes US nº 5.210.015 y US nº 5.487.972), así como la técnica RFLP.
La detección se puede realizar usando diferentes métodos alternativos: FRET, fluorescence quenching, fluorescencia polarizada, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, radioactividad y método colorimétrico.
El método según la invención puede incluir la extracción del ácido nucleico de dicha muestra.
Como se ha indicado anteriormente, la muestra usada puede ser sangre o cualquier otro fluido corporal o tejido obtenido de un individuo. Después de las etapas de extracción y de purificación del ácido nucleico, se puede realizar la amplificación PCR mediante los cebadores descritos anteriormente para mejorar la detección de la señal.
Así, el método según la invención puede comprender la etapa de amplificación mediante dichos cebadores, seguida de una etapa de hibridación con al menos una sonda, preferentemente dos sondas que se hibridan en condición de alta astringencia con las secuencias que corresponden a la región de la mutación G1849T mencionada anteriormente, y la detección de la señal producida por los marcadores de dichas sondas.
Por ejemplo, la invención se refiere más particularmente a un método in vitro para determinar la presencia o la ausencia de la variante G1849T del gen JAK2 en una muestra de un paciente que padece PV o que es susceptible de desarrollar una PV o cualquier otro síndrome mieloproliferativo que comprende la detección de la presencia o de la ausencia de la variante G1849T del gen JAK2 en dicha muestra de ácido nucleico mediante uno o varios SNP (Single nucleotide polymorphism) específico de la mutación G1849T del gen JAK2, en particular las SEC ID nº 17, 18 o también 23 y 24; caracterizado porque la presencia de la variante G1849T es una indicación de PV o de cualquier otro síndrome mieloproliferativo.
Esta detección mediante SNP se puede realizar mediante la tecnología TaqMan® que permite una discriminación alélica. Esencialmente, este método consiste en el reconocimiento mediante unas sondas fluorescentes específicas del alelo 1849 de JAK2 en ADN monocatenario, y comprende una reacción PCR (con una polimerasa con actividad 5' exonucleásica), la detección de la emisión de fluorescencia específica del alelo de los SNP hibridados, la determinación del genotipo mediante la lectura de la fluorescencia en el punto final (obtención de una imagen que muestra los racimos de ADN mutado homocigoto, heterocigoto y normal).
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Detección de la proteína mutada JAK2 V617F
Según otro modo de realización, la variante se puede detectar directamente en el seno de la proteína JAK2.
Para ello, la invención prevé un método in vitro para detectar la presencia o la ausencia de la variante JAK2 V617F en una muestra de un paciente que padece o que es susceptible de desarrollar la PV o cualquier otro síndrome mieloproliferativo, en particular eritrocitosis, trombocitemias y mielofibrosis, que comprende:
la detección de la presencia o de la ausencia de la variante JAK2 V617F en una muestra del paciente,
caracterizado porque la presencia de dicha variante es una indicación de la PV o de cualquier otro síndrome mieloproliferativo.
Dicha variante JAK2 V617F se puede detectar mediante cualquier método apropiado conocido en el estado de la técnica.
Más particularmente, una muestra, obtenida de un individuo, se puede poner en contacto con un anticuerpo específico de la variante V617F de la proteína JAK2, por ejemplo un anticuerpo que es capaz de distinguir entre la variante V617F y la proteína JAK2 no mutada (y de cualquier otra proteína).
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales, monocatenarios o policatenarios, anticuerpos quiméricos, humanizados o porciones de moléculas de inmunoglobulina que comprenden las porciones conocidas por el estado de la técnica como correspondiendo a los fragmentos de unión al antígeno [fragmento humano, humano, F(ab')2 y F(v)].
Estos anticuerpos pueden ser inmunoconjugados, por ejemplo con una toxina o un marcador.
Los protocolos para la obtención de anticuerpos policlonales son bien conocidos por el experto en la materia. Típicamente, dichos anticuerpos se pueden obtener mediante la administración de la variante JAK2 V617F por inyección subcutánea a conejos blancos de Nueva Zelanda que fueron preparados previamente para obtener un suero pre-inmunitario. Los antígenos se pueden inyectar hasta 100 \mul por sitio en 6 sitios diferentes. Los conejos se preparan dos semanas antes de la primera inyección, y después se estimulan periódicamente mediante el mismo antígeno, aproximadamente tres veces cada seis semanas. Se obtiene entonces una muestra de suero diez días después de cada inyección. Después, los anticuerpos policlonales se purifican del suero mediante cromatografía de afinidad usando la proteína JAK2 V617F para capturar los anticuerpos.
Se prefieren los anticuerpos monoclonales a los anticuerpos policlonales debido a su alta especificidad.
La obtención de dichos anticuerpos monoclonales está al alcance del experto en la materia, sabiendo que la variante JAK2 V617F presente una estructura 3D diferente de la proteína JAK2 salvaje. La expresión "anticuerpo monoclonal" significa un anticuerpo que es capaz de reconocer sólo un epítopo de un antígeno.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante inmunización de un mamífero, por ejemplo un ratón, una rata u otros mamíferos, con la variante JAK2 V617F purificada. Se aíslan y se fusionan las células del mamífero inmunizado que producen los anticuerpos con unas células de mielomas o de heteromielomas para producir unas células híbridas (hibridomas).
Las células de hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal se usan como fuente para la producción del anticuerpo. Las técnicas de generación de anticuerpo que no implican una inmunización también son un objetivo de la invención. Se trata, por ejemplo, de la tecnología "phage display".
Los anticuerpos dirigidos contra la variante JAK2 V617F pueden, en ciertos casos, presentar una reacción cruzada con la proteína JAK2 salvaje. Si es el caso, se necesita una selección de los anticuerpos específicos de la variante V617F. Para ello, se puede usar, por ejemplo, una cromatografía de afinidad con la proteína JAK2 salvaje para capturar los anticuerpos que presentarían una reacción cruzada con JAK2 salvaje.
Así, la invención prevé un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la variante JAK2 V617F, así como las líneas de hibridomas que la producen.
La invención se refiere asimismo a un ensayo ELISA mediante dicho anticuerpo para detectar la presencia o la ausencia de la variante JAK2 V617F en una muestra.
Una alternativa al uso de los anticuerpos puede consistir, por ejemplo, en la preparación y la identificación de aptámeros que son unas clases de moléculas que permiten un reconocimiento molecular específico.
Los aptámeros son unos oligonucleótidos o unos oligopéptidos que pueden reconocer virtualmente cualquier clase de molécula diana con una alta afinidad y especificidad.
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Kits
En otro aspecto, la invención se refiere a unos kits para determinar si un paciente padece la poliglobulia de Vaquez o cualquier otro síndrome mieloproliferativo que implica la variante JAK2 V617F.
El kit de la invención puede comprender una o varias sondas o cebadores tales como se han definido anteriormente para la detección específica de la presencia o de la ausencia de la mutación G1849T en el gen JAK2.
El kit puede comprender asimismo una polimerasa termorresistente para la amplificación PCR, una o varias disoluciones para la amplificación y/o la etapa de hibridación, así como cualquier agente reactivo que permita la detección del marcador.
En otro modo de realización, el kit comprende un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente.
Los kits de la invención pueden contener además cualquier agente reactivo adaptado para la hibridación o para la reacción inmunológica sobre un soporte sólido.
El método y el kit de detección se usan ventajosamente para la subpoblación de pacientes que presentan un índice de hematocritos superior a 51%. El método y el kit de detección se usan asimismo de forma ventajosa para la subpoblación de pacientes que presentan un índice de plaquetas superior a 450.000.
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ARNsi de la invención
En un cuarto aspecto, la invención se refiere asimismo a unos ARNsi que permiten disminuir en más del 50%, 75%, 90% o 95% o también en más del 99% la expresión de JAK2 mutada en posición 617, en particular de JAK2 V617F. Estos ARNsi se pueden inyectar en las células o tejidos mediante lipofección, transducción o electroporación. Permiten destruir específicamente los ARNm que codifican JAK2 V617F, implicando numerosas aplicaciones terapéuticas posibles, en particular el tratamiento de la poliglobulia de Vaquez.
En el documento US 60/068562 (CARNEGIE), se describen unos ARNsi. El ARN se caracteriza porque posee una región con una estructura bicatenaria (db). La inhibición es específica de la secuencia diana, comprendiendo la secuencia nucleotídica de una hebra de la región db del ARN al menos 25 bases y siendo idéntica a la porción del gen diana. La secuencia nucleotídica de la otra hebra de la región db del ARN es complementaria de la de la primera hebra y de la porción del gen diana. Por otra parte, la Solicitud WO 02/44321 (MIT/MAX PLANCK INSTITUTE) describe un ARN bicatenario (o unos oligonucleótidos de la misma naturaleza sintetizados químicamente) de los que cada hebra tiene una longitud de 19 a 25 nucleótidos y que es capaz de inhibir específicamente la expresión post-transcripcional de un gen diana mediante un proceso de interferencia ARN a fin de determinar la función de un gen y a fin de modular esta función en una célula o un organismo. Por último, el documento WO 00/44895 (RIBOPHARMA) se refiere a un procedimiento de inhibición de la expresión de un gen diana dado en una célula eucariota in vitro, en el que se introduce en la célula un ARNdb formado por dos ARN monocatenarios separados, presentando una hebra del ARNdb una región complementaria del gen diana caracterizado porque la región complementaria presenta menos de 25 pares de nucleótidos sucesivos. El experto en la materia se podrá referir a la enseñanza contenida en estos documentos para la preparación de los ARNsi de la presente invención.
Más específicamente, la invención se refiere a unos ARN bicatenarios de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, 19 a 25 nucleótidos, o de manera preferida de aproximadamente 19 nucleótidos de largo complementario (hebra 1) e idénticos (hebra 2) a la secuencia SEC ID nº 3 que comprende la mutación G1849T. Estos ARNsi de la invención pueden comprender además un dinucleótido TT o UU en el extremo 3'.
Numerosos programas están disponibles para el diseño de los ARNsi de la invención:
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"siSearch Program" en http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_ 1.6.html ("Improved and automated prediction of effective ARNsi", Chalk AM, Wahlesdelt C, y Sonnhammer ELL, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004).
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"SiDirect" en http://design.rnai.jp/sidirect/index.php (Direct: highly effective, target-specific ARNsi design software for mammalian RNA interference, Yuki Naito et al., Nucleic Acids Res., Vol. 32, nº Web Server issue © Oxford University Press 2004).
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"ARNsi Target Finder" de Ambion en la dirección http://www. ambion.com/techlib/misc/ARNsi_tools.html
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Le "ARNsi design tool" del Whitehead Institute of Biomedical Research au MIT en la dirección http://jura. wi.mit.edu/pubint/http://iona.wi.mit.edu/ARNsiext/
Existen otros programas en la lista: http://web.mi t.edu/mmcmanus/www/home1.2files/ARNsis.htm, en particular http://athena.bioc.uvic. ca/cgi- bin/emboss.pl?_ action= input&_ app=sirna
Por ejemplo, para la secuencia TATGGAGTATGTT^{1849}TCTGTGGAGA (SEC ID nº 12), el ARNsi sentido es UGGAGUAUGUUUCUGUGGAdTdT (SEC ID nº 13) y el ARNsi antisentido es UCCACAGAAACAUACUCCAdTdT (SEC ID nº 14).
En un modo de realización particular, los ARNsi de la invención descritos anteriormente se ensayan y se seleccionan por su capacidad para reducir, incluso bloquear específicamente la expresión de JAK2 V617F afectando lo menos posible la expresión de JAK2 salvaje. Por ejemplo, la invención tiene por objetivo unos ARNsi que permiten una disminución superior al 80%, 90%, 95% o 99% de la expresión de JAK2 V617F y ninguna disminución o una disminución inferior al 50%, 25%, 15%, 10% o 5%, o también inferior al 1% de JAK2 salvaje.
Por ejemplo, los ARNsi de la invención se pueden seleccionar de entre el grupo constituido por:
- UGGAGUAUGUUUCUGUGGA (SEC ID nº 29)
- GGAGUAUGUUUCUGUGGAG (SEC ID nº 30)
- GAGUAUGUUUCUGUGGAGA (SEC ID nº 31)
En otro modo de realización, la invención se refiere a una molécula ddARNi tal como se describe de manera genérica en la Solicitud WO 01/70949 (Benitec) pero teniendo como diana específicamente JAK2 V617F. El ddARNi de la invención permite la extinción de la secuencia que codifica para JAK2 V617F y comprende (i) una secuencia idéntica a la SEC ID nº 3, 4 u 11; (ii) una secuencia complementaria de la secuencia definida en (i); (iii) un intrón que separa dichas secuencias (i) y (ii); produciendo la introducción de esta construcción en una célula o un tejido un ARN capaz de alterar la expresión de JAK2 V617F.
La invención se refiere asimismo a un animal no humano genéticamente modificado que comprende una o varias células que contienen una construcción genética capaz de bloquear, retrasar o reducir la expresión de JAK2 V617F en el animal. El método de producción de dicho animal genéticamente modificado se representa en el documento WO 04/022748 (Benitec).
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Métodos de reconocimiento
En un quinto aspecto, la invención tiene por objeto un método de reconocimiento de inhibidores específicos de JAK2 V617F.
Mediante la expresión "inhibidores específicos" se entiende designar unos compuestos que presentan un índice IC50 sobre JAK2/IC50 sobre JAK2 V617F superior a 5, 10, 25 o también 50. Por ejemplo, el compuesto posee un IC50 JAK2 V617F inferior a 1 \muM, preferentemente 100 nM mientras que posee un IC50 JAK2 superior a 5 \muM o 10 \muM.
Este método se puede realizar con la ayuda de la proteína de la invención, de una fracción membranaria que comprende dicha proteína, de una célula que expresa dicha proteína o también de un animal transgénico no humano tal como se ha descrito anteriormente.
Así, la invención se refiere a un ensayo que permite determinar la inhibición específica de JAK2 V617F mediante uno o varios compuestos que comprende las etapas que consisten en poner en contacto uno o varios compuestos con la proteína JAK2 V617F descrita anteriormente, una fracción membranaria que comprende JAK2 V617F o también una célula que expresa JAK2 V617F descrita anteriormente, en unas condiciones apropiadas para una fijación y una detección de la fijación específica y/o de la inhibición de JAK2 V617F.
Este procedimiento puede comprender además una medición de la fijación sobre JAK2 salvaje.
Este procedimiento puede consistir asimismo en una sucesión de ensayos de varias moléculas y comprender una etapa de selección de las moléculas que presentan un IC50 para JAK2 V617F inferior a 1 \muM, preferentemente 100 nM.
Este procedimiento puede comprender además una etapa de selección negativa de las moléculas mencionadas anteriormente, que poseen un IC50 para JAK2 inferior a 5 \muM o 1 \muM.
La invención se refiere a un reconocimiento in vitro tal como se ha descrito anteriormente en el que se determina mediante inmunoprecipitación la inhibición de la fosforilación de JAK2 V617F.
La invención se refiere asimismo a un reconocimiento in vitro sobre células progenitoras CD34+ JAK2 V617F que son capaces de diferenciarse sin eritropoietina (Epo). Dichas células aisladas de pacientes que padecen la poliglobulia de Vaquez. Las células CD34+ JAK2 V617F se pueden cultivar en un medio que comprende un SCF e IL-3. Los compuestos se añaden en el medio de cultivo y se determina la capacidad de las células en proliferar y en diferenciarse en células 36+/GPA-. Se seleccionan los compuestos para los cuales se observa una disminución del número de clones 36+/GPA-. Así, la invención se refiere al método de reconocimiento anterior mediante células primarias progenitoras CD34+ JAK2 V617F que son capaces de diferenciarse sin eritropoietina (Epo) o a las líneas celulares que se han convertido en factor independientes mediante introducción de la variante JAK2 V617F. El mismo tipo de ensayo se puede realizar sobre unos cultivos de médula de tipo CFU-E en medio semi-sólido, y ensayar directamente el compuesto sobre la inhibición del crecimiento espontáneo de las colonias.
Asimismo, se puede usar cualquier línea celular de mamífero descrita anteriormente que expresa JAK2 V617F recombinante.
La invención se refiere asimismo a un método para la identificación de candidatos medicamentos que comprenden las etapas que consisten en administrar unos compuestos a un animal transgénico no humano que expresa JAK2 V617F tal como se ha descrito anteriormente, reproduciendo dicho animal la poliglobulia de Vaquez y/o que padece un síndrome mieloproliferativo asociado a la presencia de JAK2 V617F, determinó el efecto del compuesto y seleccionó los candidatos medicamentos para los cuales se observa una disminución o un bloqueo de la proliferación y de la diferenciación espontáneas de los eritroblastos de poliglobulia de Vaquez, o una disminución o un bloqueo de la proliferación celular asociada con la presencia de JAK2 V617F.
Más particularmente, este método se realiza con un ratón K-in JAK2 V617F o una rata K-in JAK2 V617F tal como se han descrito anteriormente.
Entre estos compuestos, se pueden citar, por ejemplo, los ARNsi que toman como diana el exón 12 mutado de JAK2 mencionados anteriormente, en particular unos ARNsi que toman como diana la secuencia SEC ID nº 3, 4 o también la secuencia SEC ID nº 11 que comprende el nucleótido mutado t^{1849}.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de dichos ARNsi o ddARNi descritos anteriormente, y a unos compuestos que inhiben específicamente JAK2 V617F para la fabricación de un medicamento. Dicho medicamento se destina normalmente al tratamiento de los cánceres de la sangre, en particular los síndromes mieloproliferativos que comprenden la Poliglobulia de Vaquez, la trombocitemia esencial, la esplenomegalia mieloide o mielofibrosis primitiva y la leucemia mieloide crónica (LMC). Dicho medicamento se destina asimismo al tratamiento de otras hemopatías malignas; asociadas con la mutación JAK2 V617F y, llegado el caso de los tumores sólidos, de los carcinomas, de los melanomas y de los neuroblastomas, que expresan JAK2 V617F.
Para la continuación de la descripción y para los ejemplos, se hará referencia a las figuras cuya leyenda se indica a continuación.
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Leyendas
Figura 1: Descubrimiento de la función clave de JAK2 en la PV.
En estado basal, JAK2 está fijado en el box 1 en el estado no fosforilado. La unión a EPO modifica la conformación del receptor y permite la transfosforilación de JAK2 que a su vez fosforila los restos intracitoplásmicos de EPO-R y recluta así los diferentes efectores positivos (->) o negativos (-I) de la transducción de la señal.
Figura 2: Realización de un modelo de cultivo de progenitores CD34+ de PV que pueden diferenciarse sin eritropoietina.
2A- cultivo con Epo, SCF e IL-3
2B- cultivo son Epo.
Figura 3: La inhibición de la vías JAK-STAT, Pi3-K y Src quinasa impide la diferenciación eritroide espontánea.
Figura 4: Protocolo de la inhibición de JAK2 en los progenitores de PV.
Figura 5: Resultados de la inhibición de JAK2 en los progenitores de PV.
5A- Disminución de la capacidad de clonación de los 36+/gpa- Cultivo D1-D6 en SCF-IL3, electroporación D5, selección D6 (morfo/36+/gpa-).
Metil SCF sólo. Recuento a D13 (D7 post selección)
5B- Estructura de JAK2 con la mutación V617F (exón 12)
Figura 6: Análisis de genotipado de las SNP para detectar la mutación JAK2 V617F en el ADN genómico con las tecnologías LightCycler® y TaqMan®.
A y B: Detección de la mutación mediante la curva de análisis de fusión de LightCycler® con las sondas de hibridación FRET. A: Se representan unos experimentos con diversas diluciones de ADN HEL en el ADN TF-1. El pico JAK2 V617F (57º) se puede detectar todavía con una dilución de 1%. B: Se representan unos resultados que proceden de muestras de pacientes representativos (#1: homocigoto; #2: heterocigoto; #3: débil; #4: no mutado).
C: Detección de la mutación mediante amplificación específica del alelo TaqMan®. Se representan unos experimentos de dilución de ADN HEL (HEL de 100 a 1%: cuadritos en blanco; células TF-1: círculos en blanco) y algunas muestras de pacientes representativos (cruces negras). #a: pacientes homocigotos; #b: pacientes heterocigotos; #c: paciente débil; #d: pacientes no mutados.
Figura 7: Ficha de diagnóstico propuesto para el diagnóstico de una eritrocitosis (es decir un índice de hematocritos superior a 51%).
El número de pacientes concernidos en cada etapa de la ficha se escribe al lado cada artículo (n), estando listados en este caso únicamente los pacientes que han recibido todos los datos clínicos (n = 81). La detección de JAK2 V617F como ensayo de diagnóstico en primera intención habría evitado a 58/81 pacientes recibir otras investigaciones para diagnosticar un síndrome mieloproliferativo de tipo PV.
Figuras 8 y 9: La expresión de V617F JAK2 en unas células HEL disminuye 24 horas después del tratamiento con ARNsi específico de JAK2 V617F (ARNsi #1, 3 y 4).
0 a 6: Células HEL tratadas (1 a 6) o no tratadas (0) con ARNsi V617F JAK2.
C+: Células 293HEK transfectadas con el vector V617F JAK2 RV.
C-: 293HEK.
Figura 10: El nivel de expresión de WT JAK2 en unas células K562 no cambia 24 horas después de un tratamiento con ARNsi específico de JAK2 V617.
Je: Células K562 tratadas con ARNsi WT JAK2.
0 a 6: Células K562 tratadas con ARNsi V617F JAK2.
C-: 293HEK (ninguna expresión de JAK2).
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Ejemplo 1
Identificación de la mutación JAK2 V617F en 39/43 pacientes
La realización de un modelo de cultivo celular de los progenitores patológicos y el uso de inhibidores bioquímicos han permitido establecer que las vías JAK2-STAT5, PI3 quinasa, y Scr quinasa son necesarias para la diferenciación independiente de la Epo de los progenitores de PV (Ugo et al., 2004). Estos resultados reafirma al solicitante en su hipótesis según la cual la lesión molecular primaria origen de la PV debía ser una anomalía de una proteína clave que desemboca en la desregulación de una vía de señalización, como una mutación de una tirosina quinasa que le confiere una actividad constitutiva. Sin embargo, es el estudio de 43 pacientes que padecen la poliglobulia de Vaquez el que permitió identificar la función clave de la proteína JAK2, que es la proteína situada más corriente arriba en estas diferentes vías de señalización, y que es común a las vías de señalización de los receptores a las citoquinas para las cuales se han descrito unas anomalías de respuesta en la PV. El solicitante ha estudiado la implicación de la proteína quinasa JAK2 en la fisiopatología de PV mediante 3 enfoques complementarios:
-
un enfoque funcional (inhibición de JAK2 en las células de PV mediante interferencia de ARN),
-
un enfoque genómico (secuenciación de los 23 exones del gen), y
-
un enfoque bioquímico para la búsqueda de anomalía de fosforilación de JAK2 origen de una activación constitutiva.
El material biológico usado procede de pacientes consentidores que padecen poliglobulia y corresponde a los restos de extracción realizados con un objetivo de diagnostico dirigidos al Laboratorio Central de Hematología del Hotel Dieu, y a sangrías terapéuticas.
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1.1 Estudio funcional
Se ha realizado el estudio de la función de JAK2 en los eritroblastos de pacientes que padecen poliglobulia de Vaquez transduciendo mediante electroporación unos eritroblastos de PV con ARNsi específico de la secuencia JAK2 (AMBION, Huntingdon, Inglaterra) que reconoce como diana una secuencia situada sobre el exón 15 del ARNm de JAK2. El solicitante ha demostrado que la inhibición de JAK2 disminuía fuertemente la capacidad de clonación y la diferenciación "espontánea" de los progenitores de PV en ausencia de Epo. Los progenitores eritroblásticos normales transfectados con ARNsi JAK2 tienen un potencial clonogénico disminuido en 70% con relación a ARNsi de control, lo que confirma la eficacia de la transfección con ARNsi JAK2. En la PV, se han estudiado los efectos de inhibición de JAK2 en los progenitores eritroblásticos en un modelo de cultivo sin Epo, permitiendo estudiar las células del clon maligno. El solicitante ha comparado el potencial clonogénico, la apoptosis y la diferenciación de los progenitores eritroblásticos de PV después de la transfección mediante un ARNsi JAK2 comparado con un ARNsi de control. El estudio del potencial clonogénico de los progenitores de PV cultivados sin Epo muestra una disminución muy clara del número de colonias después de la transfección de ARNsi JAK2 con relación a ARNsi de control. El estudio de citometría de flujo de la apóptosis de estas células muestra un aumento significativo de la apóptosis en las células transfectadas mediante ARNsi JAK2 comparadas con ARNsi no era relevante (70 frente a 53%). El estudio de los efectos del ARNsi JAK2 sobre la diferenciación (adquisición de la Glucoforina A detectada en citometría de flujo), muestra sólo una ligera diferencia entre los progenitores transfectados por el ARNsi JAK2 frente al ARNsi de
control.
Los resultados de los estudios celulares han mostrado por lo tanto que JAK2 era necesario para la diferenciación independiente de la Epo de los progenitores eritroides de PV. Los primeros resultados de los estudios bioquímicos (inmunoprecipitación) muestran una fosforilación de JAK2 más prolongada después de la privación en citoquinas de los progenitores eritroides de PV con relación a unas células normales.
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1.2 Estudio genómico de JAK2
La PCR sobre los 23 exones se ha realizado en un sujeto normal a partir de ADN genómico. Después, se ha estudiado 3 pacientes que padecen PV después de haber extraído el ADN genómico de células eritroides obtenidas in vitro después del cultivo celular.
Se ha identificado una mutación puntual situada en el exón 12 de JAK2, presente en 2 de los 3 pacientes ensayados. Esta mutación afecta a la base nº 1849 de la secuencia codificante [numeración que empieza en ATG], GenBank NM_004972, y transforma el codón 617 de la proteína JAK2 (V617F).
\bullet
Codón 617 normal: gtc codifica para una valina (V)
\bullet
Codón 617 mutado: ttc codifica para una fenilalanina (F)
El solicitante ha verificado gracias a las bases de datos publicadas en Internet que no se trataba de un polimorfismo conocido. Después, han ampliado la cohorte. Hoy en día, la mutación se ha encontrado en 39 pacientes que padecen PV de los 43 casos ensayados. No se ha encontrado ningún control (15 casos ensayados) o paciente que padece poliglobulia secundaria (18 casos ensayados) portador de la mutación.
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Resultados de la secuenciación en los pacientes
\bullet
39 mutados/43 PV ensayados (90%)
\bullet
2/3 heterocigotos
\bullet
13/39 "homocigotos", es decir 30% de los casos (misma proporción que la pérdida de heterocigotia en 9p)
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Controles
\bullet
0 casos mutados de los 33 controles ensayados
-
de los cuales 15 sujetos normales, y
-
18 poliglobulias secundarias (ninguna colonia espontánea)
El descubrimiento de esta anomalía de JAK2 explica la hipersensibilidad a numerosos factores de crecimiento implicados en la PV (Epo, TPO, IL-3, IL-6, GM-CSF, insulina). En efecto, JAK2 es una proteína implicada en las vías de señalización de los receptores de estas citoquinas.
Además, la asociación de JAK2 con R-Epo es singular porque JAK2 se fija a R-Epo de manera constitutiva: la asociación JAK2/R-Epo iniciada en el aparato de Golgi, es necesaria para el procesamiento de R-Epo en la membrana de los eritroblastos. Una anomalía de JAK2 origen de modificaciones de la asociación de JAK2 con R-Epo podría explicar por lo tanto la predominancia de la hiperplasia medular en la línea eritroblástica, mientras que esta proteína está implicada en numerosas vías de señalización. Por otra parte, Moliterno et al. (Moliterno et al., 1998; Moliterno y Spivak, 1999) han demostrado un defecto de expresión membranaria de mpl, relacionado con un defecto de glucosilación. Es posible que JAK2 sea, por analogía con R-Epo, necesario para el procesamiento de c-mpl. La anomalía de JAK2 podría entonces explicar el defecto de expresión membranario de c-mpl encontrado en
PV.
JAK2 se une a R-Epo en su dominio proximal a nivel de un dominio muy conservado, el Box2. En ausencia de estimulación por Epo, JAK2 se fija constitutivamente a R-Epo, pero en forma no fosforilada y por lo tanto no activa. Después de la estimulación del receptor mediante Epo, las dos moléculas JAK2 se fosforilan, y después fosforilan R-Epo, lo que permite el reclutamiento y después la fosforilación de otras proteínas implicadas en la transducción de la señal, como las proteínas STAT5, Grb2, PI3K. La proteína JAK2 presenta, como todas las JAK, un dominio quinasa funcional (JH1), un dominio seudo-quinasa sin actividad tirosina quinasa (JH2), y varios dominios conservados (JH3-JH7), característicos de los miembros de la familia de las JAK. El dominio JH2 parece estar implicado en la regulación de la actividad tirosina quinasa de JAK2. Según los datos disponibles de cartografía proteica de JAK2 (Lindauer, 2001), el aminoácido 617 está situado en este dominio JH2, y según unos estudios de modelización, en una región particularmente importante para la regulación de la actividad de quinasa.
Más allá del interés fisiopatológico de este descubrimiento (comprensión de los mecanismos de independencia a las citoquinas, separación de los diferentes SMP), la demostración de la mutación en un paciente ofrece por primera vez un ensayo que permite afirmar el diagnóstico. En una gestión médica de diagnóstico, la búsqueda de la mutación de JAK2 se podría realizar en los polinucleares sanguíneos, que pertenecen al clon maligno.
La invención ofrece asimismo la implementación de un tratamiento específico, de tipo inhibidor de quinasa específico de la proteína mutada, o terapia génica.
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Ejemplo 2
Detección del mutante JAK2 V617F para el diagnóstico de la eritrocitosis en primera intención 2.1 Pacientes, materiales y métodos Comparación de la secuenciación y de dos técnicas de genotipado de SNP para la detección de JAK2 V617F Células del paciente
Se analizaron 119 muestras con sospecha de MPD (es decir de eritrocitosis, de trombocitosis, de hiperleucocitosis): se han tomado 58 muestras sanguíneas en perspectiva y se han analizado 61 muestras de archivo de médula ósea retrospectivamente.
Se han aislado los granulocitos periféricos usando un método de gradiente de densidad según las instrucciones del fabricante (Eurobio, Francia). Se han aislado las células mononucleares de la médula ósea mediante el uso de una centrifugación con gradiente de Ficoll. Se ha extraído el ADN genómico mediante unos procedimientos estándares. Para establecer la sensibilidad de las tecnologías LightCycler® y TaqMan®, se ha diluido en serie en un ADN normal, el ADN que procede de una muestra homocigoto con el alelo de tipo salvaje residual mínimo.
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Líneas celulares
Se han usado unas diluciones de ADN en serie (1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01) de la línea celular de eritroleucemia humana (HEL) mutada de manera homocigótic (JAK2 V617F), en un ADN de línea celular TF-1 (no mutada) como controles positivos estándares. Las líneas celulares han crecido en un medio MEM-alfa (Invitrogen) enriquecido con suero fetal de ternera.
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Detección de la mutación por análisis de la curva de fusión de LightCycler® con unas sondas de hibridación FRET
Se ha concebido unos cebadores y unas sondas para amplificar e hibridarse a la secuencia diana del exón 12 de JAK2. La posición del sitio de mutación (1849G/T) estaba cubierta por una sonda captadora donante marcada con fluoresceína en 3' y la sonda de anclaje receptora adyacente marcada con LightCycler® Red 640 (LCRed640) en su extremo 5', y se fosforiló su extremo 3' para evitar la extensión. La amplificación y el análisis de la curva de fusión se realizaron en el instrumento LightCycler® (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). El volumen de reacción final era de 20 \mul usando 10 ng de ADN, 14 \mul de mezcla LightCycler FastStart DNA Master, 3 mM de MgCl_{2}, 0,2 \muM de cebadores, 0,075 \muM de cada sonda. En resumen, se han calentado las muestras a 95ºC durante 10 minutos y se ha monitorizado una amplificación mediante PCR de 45 ciclos (10 segundos a 95ºC, 10 segundos a 53ºC, 15 segundos a 72ºC) mediante una etapa de desnaturalización a 95ºC durante 10 segundos, dos etapas de hibridación a 63ºC y 45ºC durante 30 segundos cada una y una curva de fusión que se sitúa en el dominio comprendido entre 45 y 70ºC (0,1ºC/s). El análisis en el programa LightCycler® se ha realizado mediante el trazado de la curva de la derivada de la fluorescencia con relación a la temperatura [2(dF12/F11)/dT) frente a T]. Se observaron los picos mutados y WT a 57 y 63ºC respectivamente.
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Detección de la mutación mediante amplificación específica de un alelo por TaqMan®
Se han concebido dos cebadores para amplificar un producto de 92 pb que engloba SNP en la posición 1849. Se han concebido dos sondas MGB fluorogénicas con diferentes colorantes fluorescentes, uno con diana hacia el alelo WT y uno con diana hacia el mutado. Se ha realizado el genotipado en unas placas de 96 pocillos usando el método basado en TaqMan® PCR. El volumen de reacción final era de 12,5 \mul usando 10 ng de ADN genómico, 6,25 \mul de TaqMan® Universal Master Mix y 0,31 \mul de 40X Assays-on-Demand SNP Genotyping Assay Mix (Applied Biosystems). La placa se ha calentado a 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 92ºC durante 15 segundos, y un emparejamiento/extensión a 60ºC durante 1 minuto. Se ha realizado el termociclado en el 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Se ha efectuado el análisis con el programa SDS versión 1.3. Se ha realizado el genotipado de la discriminación alélica en el punto final mediante inspección visual de una curva de la fluorescencia (Rn) que procede de la sonda WT frente a la Rn de JAK2 mutada generada a partir de la lectura de la fluorescencia post-PCR.
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Pacientes con una eritrocitosis y extracción de muestras
Se han evaluado 88 pacientes con unos porcentajes de hematocritos superiores a 51%, en el momento del diagnóstico, antes de cualquier tratamiento, y se ha estudiado la presencia de los criterios WHO y PVSG. Se ha considerado el valor de 51% para el extremo superior del dominio normal para el porcentaje de hematocrito (Pearson TC et al., A Polycythemia Vera Updated: Diagnosis, Pathobiology, and Treatment. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program.) 2000: 51 a 68). Se han recogido las células de la médula ósea para unas dosificaciones clonogénicas, y se han recogido las células excedentes para la extracción de ADN. Se ha medido la eritropoietina sérica (Epo) en diferentes laboratorios y, por consiguiente, se describe como baja cuando está por debajo del valor inferior del dominio normal de cada laboratorio, normal o elevada. Se han purificado los granulocitos periféricos que proceden de los mismos pacientes como se ha descrito anteriormente, estando las muestras sanguíneas de cada tiempo disponibles. Las muestras de médula ósea y de sangre se han recogido después que de que haya obtenido un consentimiento
claro.
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Dosificación de EEC
Todas las dosificaciones in vitro del carácter indicador eritroide de la Epo se han realizado en el mismo laboratorio (H\hat{o}tel Dieu, Paris) con una técnica de cultivo de plasma-coágulo, como se ha descrito anteriormente (Casadevall N, Dupuy E, Molho-Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P. Autoantibodies against erythropoietin in a patient with pure red-cell aplasia. N. Engl. J. Med. 1996; 334: 630 a 633).
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Análisis estadístico
La correlación de los marcadores se ha realizado usando el coeficiente de rangos Spearman (R).
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2.2 Resultados Factibilidad y sensibilidad de las técnicas de genotipado basados en la PCR para la detección de la mutación JAK2 V617F
Para evaluar la eficacia de la secuenciación de las tecnologías LightCycler® y TaqMan® para detectar la mutación JAK2 V617F, se ha buscado su presencia en 119 muestras que proceden de pacientes con una sospecha de MPD, usando las 3 técnicas en paralelo. La mutación JAK2 V617F se ha detectado eficazmente en 83/119 muestras, y 35 muestras no presentaban la mutación mediante ninguna de las 3 técnicas. En una muestra sólo, la secuenciación falló para detectar la mutación revelada por las dos tecnologías LightCycler® y TaqMan®, sugiriendo así que estas últimas puedan ser más sensibles.
Para evaluar la sensibilidad de la técnica, se han usado dos métodos diferentes: se ha ensayado unas diluciones en serie del ADN de la línea celular HEL mutada de manera homocigótica en el ADN de la línea celular TF-1 no mutada, y unas diluciones en serie del ADN genómico que procede de un paciente homocigoto para la mutación JAK2 V617F en el ADN normal. La secuenciación falló para detectar el alelo mutado por debajo de 5% de ADN de línea celular HEL diluido en un ADN de línea celular TF-1, y bajo 10% del ADN del paciente mutado de manera homocigótica diluido en un ADN normal. La sensibilidad de las técnicas LightCycler® y TaqMan® era equivalente, ligeramente superior a la secuenciación, que alcanza 0,5 a 1% del ADN de la línea celular HEL diluido en un ADN de la línea celular TF-1 (figura 6), y 2 a 4% del ADN de un paciente mutado de manera homocigótica diluido en un ADN
normal.
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Características de los pacientes con una eritrocitosis en el momento del diagnóstico
En la tabla 1 se resumen las características principales de 88 pacientes con unos porcentajes de hematocritos superiores a 51% en el momento del diagnóstico.
TABLA 1 Características de los pacientes
3
Se han diagnosticado 88 pacientes con unos porcentajes de hematocritos superiores a 51% según los criterios PVSG y WHO, en cuatro grupos: enfermedad de Vaquez (PV), eritrocitosis idiopática, eritrocitosis secundaria y "ninguna eritrocitosis absoluta" (Ninguna AE) cuando la medición de la masa de los glóbulos rojos no había aumentado. Ocho pacientes no podían recibir ningún diagnóstico definido, debido a que algunos datos clínicos no estaban disponibles. Ht: hematocritos; Hb: hemoglobina; WBC: glóbulos blancos sanguíneos; EEC: colonias eritroides endógenas; Epo: eritropoietina; \sigma: desviación estándar. Los pacientes se podían separar en 4 grupos principales, según los criterios WHO (Fierre R. et al., editores. World Health Organization Classification of Tumours; Pathology and Genetics of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press; 2001: 32 a 34) y PVSG (Pearson TC, Messinezy M. The diagnostic criteria of polycythaemia rubra vera. Leuk Lymphoma 1996: 22 Supl. 1: 87 a 93) respectivamente: 61 a 45 pacientes con el diagnóstico de PV, 5 con una eritrocitosis secundaria, 11 a 21 con una eritrocitosis idiopática y 3 sin ninguna eritrocitosis absoluta (masa de los glóbulos rojos normal). Los datos clínicos estaban incompletos para 7 pacientes, explicando porqué el diagnóstico de PV no se podía afirmar bien con los criterios WHO o bien con los PVSG. Debido a estas diferencias entre los criterios A1 de las dos clasificaciones, 6 pacientes que no tenían ninguna medición de masa de los glóbulos rojos se podían clasificar en la clasificación WHO y no en la PVSG. Un paciente tenía al mismo tiempo una hipoxia y una formación de EEC, haciendo por consiguiente difícil el diagnóstico. Se ha realizado un análisis citogenético en 35 pacientes; entre 32 pacientes PV (según el criterio WHO), 7 tenían unas anomalías citogenéticas: 5 con una trisomia 9, 1 con 7q- y 1 con material suplementario en el cromosoma 18.
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La presencia de JAK2 V617F corresponde a los criterios PVSG y WHO de PV
JAK2 V617F estaba presente en 43/45 (96%) pacientes diagnosticados como PV según los criterios PVSG y en 57/61 (93%) pacientes diagnosticados con los criterios WHO (tabla 1). Sin embargo, 8/29 pacientes clasificados como no PV según la clasificación PVSG presentaban la mutación, mientras que no la presentaba ninguno de los 19 pacientes no PV del WHO; estos 8 pacientes se consideraron IE con los criterios PVSG y PV con los WHO. Ninguno de los pacientes diagnosticados SE ni siquiera aquél con una masa de glóbulos rojos normal ("ninguna AE") tenía la mutación. La presencia o la ausencia de JAK2 V617F corresponde así al diagnóstico positivo de PV en 76/80 pacientes (95%, R = 0,879, p<0,0001) si se usan los criterios WHO y 64/74 pacientes (86,5%, R = 0,717, p<0,0001) con los criterios PVSG. Además, puesto que ninguno de los pacientes diagnosticados como no PV con los criterios WHO tenía la mutación, la detección de JAK2 V617F tiene un valor predictivo de 100% en el contexto de la eritrocitosis absoluta.
Algunos autores (Mossuz P. et al., Diagnostic value of serum erythropoietin level in patients with absolute erythrocytosis. Haematologica 2004; 89: 1194 a 1198) consideran la medición del nivel de Epo sérico como un ensayo de diagnóstico de primera intención para los pacientes con una eritrocitosis absoluta, con una especificidad de 97% y un valor predictivo de 97,8% para el diagnóstico de PV, si el nivel de Epo está por debajo del valor inferior del dominio normal. En el estudio del solicitante, la correlación entre el nivel de Epo y el diagnóstico de PV según los criterios WHO y PVSG se ha observado en 50/61 (82%, R = 0,488, p = 0,0002) y 39/56 (70%, R = 0,358, p = 0,0067) pacientes respectivamente. Después, se ha comparado el nivel de Epo sérico en presencia o en ausencia de V617F JAK2, y se ha encontrado que 52/68 pacientes (76%, R = 0,416, p = 0,0004) tenían una correlación adecuada.
La presencia de la mutación JAK2 V617F corresponde a la capacidad de formar unos EEC. Tres equipos diferentes han mostrado que unas líneas celulares dependientes de EPO transfectadas con JAK2 V617F eran independientes así como hipersensibles a Epo para su crecimiento, imitando así la independencia y la hipersensibilidad de los progenitores eritroides descritos en la PV. Por consiguiente, el solicitante ha emitido la hipótesis que los pacientes que portan JAK2 V617F presentaban también una formación de EEC. Entre los 20 pacientes con una eritrocitosis que no tenían ninguna formación de EEC, uno presentaba la mutación, provocando la cuestión del valor predictivo positivo de la detección de JAK2 V617F; sin embargo, aunque este paciente no presentaba ningún EEC, cumplía numerosos criterios WHO y PVSG positivos, permitiendo ser clasificado como PV en las dos clasificaciones. Por consiguiente, este paciente debería ser considerado como un "falso negativo a los EEC" más que como un "falso positivo para JAK2". Entre los 67 pacientes que tenían EEC, 62 portaban la mutación JAK2 V617F, no estaban mutados 5 pacientes usando unas técnicas sensibles para la detección. Entre estos 5 pacientes, 4/5 y 2/5 se podían clasificar en el grupo PV, según los criterios WHO y PVSG respectivamente. En total, de los 87 pacientes analizados, la presencia o la ausencia de la mutación JAK2 V617F correspondía a la capacidad o incapacidad de formar unos EEC en 81/87 pacientes (93,1%, R = 0,824, p<0,0001).
La presencia de la mutación JAK2 V617F en las células monoclonales de la médula ósea (BMMC) corresponde a su presencia en los granulocitos periféricos.
Para estudiar si el uso de los granulocitos de la sangre periférica para detectar la mutación JAK2 V617F en el momento del diagnóstico podría evitar la realización de la determinación sobre las células de médula ósea, el solicitante ha comparado los resultados obtenidos mediante uno u otro de los métodos de secuenciación, de LightCycler® y de TaqMan® en 50 pacientes (incluyendo 35 PV, 8 SE y 8 otros con sospecha de MPD) de los cuales al mismo tiempo estaban disponibles unas muestras de médula ósea y de sangre periférica en el momento del diagnóstico. En todos los casos (34 mutados, 16 no mutados) la mutación se ha detectado de manera idéntica.
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III - Conclusión
Así, el solicitante propone una nueva ficha de diagnóstico de PV en la que la detección de JAK2 V617F en los granulocitos con unas técnicas sensibles es la primera etapa en el diagnóstico de una eritrocitosis, salvo en el caso de una eritrocitosis secundaria evidente (figura 7). Esta postura tiene varias ventajas: evita la realización de una medición de la masa de los glóbulos rojos isotópicos, que no siempre está disponible y cuyo resultado está a veces sujeto a controversia. Asimismo, puede evitar un aspirado de médula ósea y la realización de las dosificaciones de EEC que duran tiempo y no están muy bien estandarizadas. Disminuye drásticamente el coste del diagnóstico positivo de PV, debido a que sólo los pacientes con unos porcentajes de hematocritos superiores a 51% y negativos para JAK2 V617F deberían disponer de todas las investigaciones que se efectúan realmente para caracterizar una eritrocitosis. Incluso si la sola detección de JAK2 V617F en el contexto de la eritrocitosis sostendrá el diagnóstico de PV, puede ser todavía útil la realización de una biopsia de médula ósea, puesto que puede demostrar unas señales de mielofibrosis o la presencia de células blásticas, afirmando por consiguiente la transformación leucémica de la PV. Sin embargo, parece que una biopsia de médula ósea se debería realizar en el contexto de un eventual estudio, con un análisis
citogenético.
Asimismo, se ha detectado JAK2 V617F en el 30% de los ET, 50% de los IMF y algunos MPD raros no caracterizados, que definen por consiguiente un nuevo grupo de MPD con diferentes presentaciones clínicas. Las razones de estas diferencias son todavía desconocidas y es demasiado pronto para agrupar estas enfermedades en una única entidad mieloproliferativa con una causa fisiopatológica común y diferentes fenotipos. Unos eventuales estudios clínicos precisos caracterizarían más precisamente las señales comunes entre PV, ET, IMF y otros MDP raros que portan JAK2 V617F, en particular en términos de eritrocitosis absoluta, de nivel de Epo, de mielofibrosis y de anomalías citogénicas. Así, se prevé el uso de la detección de JAK2 V617F como herramienta inicial en el diagnóstico de la hiperleucocitosis crónica, la trombocitosis y la eritrocitosis. La presencia de JAK2 V617F no permitirá sólo una nueva definición de un grupo de MPD, sino que también será la base para el desarrollo de terapias dianas
específicas.
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Ejemplo 3
Los ARNsi específicos de la mutación V617F JAK2 inhiben V617F JAK2 pero no JAK2 WT
Los ARNsi 1, 3 y 4 que corresponden a las SEC ID nº 25 a 27 inhiben la proteína mutada V617F JAK2 expresada por la línea HEL sin inhibir la proteína salvaje JAK2 expresada por la línea K562. Los resultados se indican en las figuras 8, 9 y 10.
Referencias
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- Ugo, V., Marzac, C., Teyssandier, I., Larbret, F., Lécluse, Y., Debili, N., Vainchenker, W., y Casadevall, N. (2004). Multiple signaling pathways are involved in erythropoietin-independant differentiation of erythroid progenitors in Polycytyhemia Vera. Experimental Hematology 32, 179-187.
<110> Assistance Publique - H\hat{o}pitaux de Paris (AH-HP)
\hskip1cm
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) 
\hskip1cm
Institut Gustave Roussy (IGR) 
\hskip1cm
Université de Versailles - Saint-Quentin-en-Yvelines 
\hskip1cm
Université Paris-Sud 
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<120> Identificación de una mutación de JAK2 implicada en la poliglobulia de Vásquez
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<130> D 22.707/241.699
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<140> FRO4-11480
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<141> 27-10-2004
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<160> 31
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<170> PatentIn versión 3.3
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 1132
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<212> PRT
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<213> homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> variante JAK2 V617F.
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<400> 1
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4
5
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5097
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
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<220>
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<223> mutación G1849T en el gen JAK2.
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<400> 2
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8
9
10 
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<210> 3
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<211> 554
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de la SEC ID nº 2 con la mutación G1849T.
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<400> 3
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11 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 94
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
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<220>
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<223> fragmento de la SEC ID nº 3 con la mutación G1849T.
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<400> 4
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100 
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR DE PCR (54804-54823).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
gggtttcctc agaacgttga 
\hfill
20 
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<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR DE PCR (55240-55260).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgctttcct ttttcacaag a 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR DE SECUENCIACIÓN (54813-54832).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaacgttg atggcagttg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR DE SECUENCIACIÓN (55207-55233).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaatagtcc tacagtgttt tcagttt 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR DE PCR Y SECUENCIACIÓN (1386-1407).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacctcagt gggacaaaga a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR DE PCR Y SECUENCIACIÓN (2019-2041).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcagaatatt tttggcacat aca 
\hfill
23 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial.
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<220>
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<223> SONDAS SNPS Y DETECCIÓN DE MUTACIÓN Y siRNA (1829-1870).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttttaaatta tggagtatgt gtctgtggag acgagaatat tc 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que comprende la mutación G1849T.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
tatggagtat gtttctgtgg aga 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ARN
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<213> homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (20)..(21)
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<223> n es T
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<220>
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<223> siRNA sentido
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
uggaguaugu uucuguggan n 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
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<211> 21
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<212> ARN
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<213> homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (20)..(21)
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<223> n es T
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<220>
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<223> siRNA antisentido.
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskip
uccacagaaa cauacuccan n 
\hfill
21 
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<210> 15
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo "S" (sentido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcagagaga attttctgaa c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo "R" (antisentido)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctttccttt ttcacaagat a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Sensor wt"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctccacag acacatactc cataa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador JAK2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaaccaaat gcttgtgaga aagct 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cJAK2F
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcacacagaa actattcaga gtc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cJAK2S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcagcaagt atgatgagc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cJAK2A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagtgatcc aaattttaca aact 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cJAK2R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtttagcaac ttcaagtttc c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "Sensor wt"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctccacag acacatactc cataa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador JAK2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaaccaaat gcttgtgaga aagct 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador sentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagctttctc acaagcattt ggttt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agaaaggcat tagaaagcct gtagtt 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del "Indicador 1" (VIC)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctccacaga cacatac 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del "Indicador 2" (FAM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccacagaaa catac 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
uggaguaugu uucugugga 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaguauguu ucuguggag 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> siRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaguauguuu cuguggaga 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (39)

1. Proteína aislada JAK2 (Janus quinasa 2), caracterizada porque comprende una mutación en el aminoácido 617, más particularmente la mutación V617F, denominada a continuación "variante JAK2 V617F", cuya secuencia se representa en la SEC ID nº 1, o unos equivalentes de esta proteína mutada en posición 617 en otros mamíferos.
2. Secuencia nucleotídica que codifica para la variante JAK2 V617F según la reivindicación 1, en particular la secuencia SEC ID nº 2 que posee la mutación t/g en posición 1849 a partir del ATG que marca el inicio de la transcripción.
3. Vector de clonación y/o de expresión vírica, plasmídica o en forma de ADN desnudo, caracterizado porque comprende la secuencia según la reivindicación 2 bajo el control de un promotor eficaz en las células de mamíferos.
4. Célula de mamífero, con excepción de las células cepas humanas embrionarias o células cepas germinales, que expresa la variante JAK2 V617F recombinante según la reivindicación 1.
5. Animal transgénico no humano que expresa JAK2 V617F recombinante según la reivindicación 1.
6. Animal transgénico no humano según la reivindicación 5, caracterizado porque se trata de un ratón o de una rata que ha integrado en su genoma al menos la secuencia que codifica para JAK2 V617F mediante recombinación homóloga o recombinación dirigida.
7. Animal transgénico no humano según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque es homocigoto JAK2 V617F/JAK2 V617F o heterocigoto JAK2 V617F/JAK2, reproduciendo dichos animales la poliglobulia de Vaquez y/o unos síndromes mieloproliferativos inducidos por JAK2 V617F.
8. Sondas o cebadores que comprenden entre 10 y 30 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID nº 3 ó 4, y que comprenden el nucleótido mutado t^{1849}.
9. Sondas o cebadores según la reivindicación 8, seleccionados de entre las secuencias SEC ID nº 5 a 11 y 12.
10. Oligonucleótido de al menos 10 nucleótidos, en particular entre 15 y 25 nucleótidos, capaz de hibridarse al ADN genómico de JAK2 de la secuencia SEC ID nº 4 que comprende el oligonucleótido mutado t^{1849}, al ADNc o al ARNm.
11. Método ex vivo o in vitro para determinar la presencia o la ausencia de la variante G1849T del gen JAK2 en una muestra de un paciente que padece PV o que es susceptible de desarrollar una PV o cualquier otro síndrome mieloproliferativo, en particular eritrocitosis, hiperleucocitosis, trombocitosis y mielofibrosis, que comprende:
a)
la obtención de una muestra de ácido nucleico del paciente,
b)
la detección de la presencia o de la ausencia de la variante G1849T del gen JAK2 en una muestra de ácido nucleico, obtenida del paciente
caracterizado porque la presencia de la variante G1849T es una indicación de PV o de cualquier otro síndrome mieloproliferativo.
12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende una etapa de hibridación con al menos una sonda según una de las reivindicaciones 8 a 10.
13. Método según la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque comprende una etapa de amplificación mediante reacción PCR con al menos un par de cebadores según una de las reivindicaciones 8 a 10.
14. Método según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque se efectúa sobre los ARNm de un individuo y porque comprende una reacción RT-PCR.
15. Método según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque comprende una etapa de amplificación mediante dichos cebadores, seguido de una etapa de hibridación con al menos una sonda, preferentemente dos sondas que se hibridan en condición de alta astringencia a las secuencias que corresponden a la región de la mutación G1849T y la detección de la señal producida por los marcadores de dichas sondas, estando las sondas y los cebadores definidos en las reivindicaciones 8 a 10.
16. Método ex vivo o in vitro para detectar la presencia o la ausencia de la variante JAK2 V617F en una muestra de un paciente que padece o que es susceptible de desarrollar la PV o cualquier otro síndrome mieloproliferativo, que comprende:
a)
la detección de la presencia o de la ausencia de la variante JAK2 V617F en una muestra del paciente,
caracterizado porque la presencia de dicha variante es una indicación de PV o de cualquier otro síndrome mieloproliferativo.
17. Método según la reivindicación 16, que comprende la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo específico de la variante V617F de la proteína JAK2, preferentemente un anticuerpo capaz de diferenciar entre la variante V617F y la proteína JAK2 no mutada.
18. Método según la reivindicación 17, caracterizado porque los anticuerpos son unos anticuerpos monoclonales o policlonales, monocatenarios o bicatenarios, unos anticuerpos quiméricos, humanizados o unos fragmentos de unión al antígeno F(ab')2 y F(v).
19. Método según la reivindicación 18, caracterizado porque se trata de un ensayo ELISA.
20. Método según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque se practica para la subpoblación de pacientes que presentan un porcentaje de hematocritos superior a 51%.
21. Método según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque se practica para la subpoblación de pacientes que presentan un índice de plaquetas superior a 450.000.
22. Anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la variante JAK2 V617F.
23. Hibridoma que produce un anticuerpo según la reivindicación 22.
24. Kit para detectar la variante JAK2 V617F en un tumor que comprende uno o varios cebadores o sondas tal como se han definido en las reivindicaciones 8 a 10, para la detección específica de la presencia o de la ausencia de la mutación G1849T en el gen JAK2.
25. Kit para determinar si un paciente padece la poliglobulia de Vaquez o cualquier otro síndrome mieloproliferativo que implica la variante JAK2 V617F, en particular eritrocitosis, hiperleucocitosis, trombocitosis y mielofibrosis, que comprende una o varias sondas o cebadores tal como se han definido en las reivindicaciones 8 a 10, para la detección específica de la presencia o de la ausencia de la mutación G1849T en el gen JAK2.
26. Kit según la reivindicación 24 ó 25 que comprende además al menos un elemento seleccionado de entre una polimerasa termorresistente para la amplificación PCR, una o varias disoluciones para la amplificación y/o la etapa de hibridación, así como cualquier agente reactivo que permite la detección del marcador.
27. Kit para determinar si un paciente padece la poliglobulia de Vaquez o cualquier otro síndrome mieloproliferativo que implica la variante JAK2 V617F, que comprende un anticuerpo según la reivindicación 22.
28. ARNsi capaz de disminuir en más del 50% o incluso en más del 95% la expresión de la variante JAK2 V617F, caracterizado porque posee de 19 a 25 nucleótidos, preferentemente 19 nucleótidos de largo, siendo la secuencia de una primera hebra idéntica y siendo la secuencia de una segunda hebra complementaria de la secuencia SEC ID nº 3, SEC ID nº 4 o también la secuencia SEC ID nº 11, que comprende el nucleótido mutado t^{1849}.
29. Procedimiento in vitro que permite determinar la inhibición específica de JAK2 V617F mediante uno o varios compuestos, que comprende las etapas que consisten en:
a)
poner en contacto uno o varios compuestos con la proteína JAK2 V617F según la reivindicación 1, una fracción membranaria que comprende JAK2 V617F, o también una célula que expresa JAK2 V617F según la reivindicación 4, en condiciones apropiadas para una fijación y/o inhibición, y
b)
detectar la fijación específica y/o la inhibición de JAK2 V617F.
30. Procedimiento in vitro de cribado que comprende una sucesión de ensayos según la reivindicación 29 de varias moléculas, y una etapa de selección de las moléculas que presentan una IC50 para JAK2 V617F inferior a 1 \muM, preferentemente 100 nM.
31. Procedimiento in vitro según la reivindicación 30, que comprende además una selección negativa de las moléculas que poseen una IC50 para JAK2 inferior a 5 \muM o 1 \muM.
32. Procedimiento de cribado in vitro según una de las reivindicaciones 29 a 31, en el que se determina mediante inmunoprecipitación la inhibición de la fosforilación de JAK2 V617F.
33. Procedimiento de cribado in vitro según una de las reivindicaciones 29 a 32, en células primarias progenitoras CD34+ JAK2 V617F que son capaces de diferenciarse sin eritropoietina (Epo) o en líneas celulares que se han convertido en factor independientes mediante la introducción de la variante JAK2 V617F.
\newpage
34. Procedimiento de cribado in vitro según una de las reivindicaciones 29 a 33, mediante una célula según la reivindicación 4.
35. Procedimiento para la identificación de candidatos a medicamentos que comprende las etapas que consisten en:
a)
administrar unos compuestos a un animal transgénico no humano que expresa JAK2 V617F tal como se define en una de las reivindicaciones 5 a 7, reproduciendo dicho animal la poliglobulia de Vaquez y/o padeciendo un síndrome mieloproliferativo asociado con la presencia de JAK2 V617F.
b)
determinar el efecto del compuesto y seleccionar los candidatos a medicamentos para los cuales se observa una disminución o un bloqueo de la proliferación y de la diferenciación espontáneas de los eritroblastos de poliglobulia de Vaquez o una disminución de la proliferación celular asociada con la presencia de JAK2 V617F.
36. Uso de los ARNsi según la reivindicación 29, para la fabricación de un medicamento.
37. Uso según la reivindicación 36 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las hemopatías malignas, en particular los síndromes mieloproliferativos que comprenden la poliglobulia de Vaquez, la trombocitemia esencial, la esplenomegalia mieloide o la mielofibrosis primitiva.
38. Uso según la reivindicación 36 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los síndromes mieloproliferativos asociados a la mutación JAK2 V617F, y de otras hemopatías malignas, y de tumores sólidos tales como carcinomas, melanomas y neuroblastomas, que expresan JAK2 V617F.
39. Composición que comprende un ARNsi según la reivindicación 28, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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